JP6216251B2 - モーター蛋白デバイス - Google Patents

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Description

本発明は、所望の分子を目的地まで搬送し、搬送された分子を分離し濃縮することのできるモーター蛋白デバイスに関する。
従来、目的DNA等を高効率に輸送するために、キネシンやミオシンを固定化した基板上に、モーター蛋白と相互作用する微小管やアクチンを滑走させ、これらのモーター蛋白等を用いて目的分子を捕集する方法またはデバイス等が知られている(特許文献1乃至3参照)。
特許文献1には、キャリア分子に積載用の一本鎖DNAを結合して荷物分子を積載して滑走運動させ、目的地における二本鎖ヌクレオチドの形成により荷物分子を積み降ろす技術が記載されている。
特許文献2には、結合機能性核酸を結合した微小管、およびキネシンが塗布された基板を用いて、標的RNAを回収精製する分子モータシステムが記載されている。
特許文献3には、プローブDNAコンジュゲート微小管、およびキネシンを塗布した基板を用いて、選択的に目的の標的DNAを移動させる分子モータシステムが記載されている。
さらに、目的分子が所定領域に搬送されたことを検出するために、担体分子に蛍光標識等を設けて光学的に検出することが知られている(特許文献4参照)。
特開2007−111004号公報 特開2006−288336号公報 特開2006−204241号公報 特表2005−530517号公報
しかしながら、上述のように、特定のDNA等を搬送する報告はあるものの、特定の抗原を搬送する技術については、今までに報告がない。
本発明は、目的の抗原を効率的に搬送して濃縮・検出する技術を提供することを主目的とする。
上述した目的を達成するために鋭意研究したところ、本発明者らは、外部環境の変化に応答して生体から産出される物質を効率的に搬送して濃縮・検出することができることを見いだし、本発明を完成するに至った。
(1)本発明にかかるモーター蛋白デバイスは、抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、化学平衡を利用して担体分子から目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域を含む。
(2)また、本発明にかかるモーター蛋白デバイスは、抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、化学平衡を利用して前記担体分子から前記目的分子を含む複合体を荷降ろしする荷降ろし領域とを含む。
(3) さらに、捕集領域と荷降ろし領域の間に設けられ担体分子が目的分子を搬送可能な搬送路を含むことを特徴とする請求項(1)または(2)に記載のモーター蛋白デバイス。
(4) さらに、荷降ろし領域における目的分子の濃度変化を検出する分析部と接続することを特徴とする請求項(1)乃至(3)のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
(5) 担体分子は、所定抗原と結合可能な所定抗体としての部分構造を含むことを特徴とする請求項(1)乃至(4)のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
(6) 荷降ろし領域は、担体分子に修飾された所定抗体よりも高い補足力の、目的分子との結合能を有する物質を含むことを特徴とする請求項(1)乃至(5)のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
(7) 搬送路は、担体分子と相互作用して担体分子を移動させる蛋白が固定化されていることを特徴とする請求項(3)乃至(6)のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
(8) 担体分子は、所定抗体を修飾した分子を含み、搬送路は表面に固定化されたモーター蛋白を含むことを特徴とする請求項(3)乃至(7)のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
(9) 所定抗体は、少なくとも1つの目的分子との結合能を有することを特徴とする請求項(1)乃至(8)のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
(10) 分析部は、荷降ろし領域における目的分子の電気的検出手段を含むことを特徴とする請求項(4)乃至(9)のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
(11) 分析部は、荷降ろし領域における目的分子の光学的検出手段を含むことを特徴とする請求項(4)乃至(9)のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
(12) 前記目的分子が腫瘍マーカーである請求項(1)乃至(11)のいずれかに記載のモーター蛋白デバイス。
(13) 請求項(12)に記載のモーター蛋白デバイスを備えることを特徴とするがんセンサアレー。
これらのように構成することにより、本発明に係るモーター蛋白デバイスにおいて、捕集領域においては抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集し、荷降ろし領域においては化学平衡を利用して担体分子から目的分子を荷降ろしすることができる。荷降ろし領域は、単位表面積において担体分子に修飾された所定抗体よりも高い補足力の所定抗体を含むため、本発明に係るモーター蛋白デバイスは、担体分子が目的分子を次々と搬送して荷降ろし領域に荷降ろしすることにより、荷降ろし領域に目的分子を濃縮することができる。
本発明にかかるモーター蛋白デバイスは、目的の分子を効率的に搬送して検出することができる。また、本発明にかかるモーター蛋白デバイスは、荷降ろし領域において目的分子を濃縮することにより、目的分子を高感度に検出することができる。
本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスの基本構成を例示する図。 本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスが目的分子を濃縮することを説明する図。 本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスの搬送路の例を示す図。 本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスの別の実施形態を示す図。 本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスを備えるがんセンサアレーを例示する図。 本発明の一実施形態にかかるデバイスと従来法の、評価を示す図。
図1は、本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスの基本構成を例示する図である。
本発明にかかるモーター蛋白デバイス1は、捕集領域10、荷降ろし領域20を含む。これらの領域は、例えば、蛋白を固定化可能な基板上に設けられ、緩衝溶液等で満たされる。また、当該緩衝溶液は、必要に応じ、モーター蛋白を活性化するためのATP(アデノシン3リン酸)等を含有することができる。
捕集領域10は、抗原抗体反応を利用して担体分子50が目的分子60を捕集する領域である。担体分子50には、所定抗原との結合が可能な抗体を予め修飾することができる。
一例として、担体分子50は、所定抗体を修飾したアクチンを含み、捕集領域10および荷降ろし領域20は、固定化されたミオシンを含むことができる。
目的分子60は、抗原抗体反応を利用した濃縮・検出において、濃縮・検出の目的となる分子のことをいう。目的分子60は、担体分子50に捕集されるものであれば、特に限定されない。目的分子60は、目的分子60を化学修飾した誘導体や、所定抗体との結合が可能な抗原部位61を修飾したものを含むことができる(図2(c)参照。)。一例として、蛋白質、ペプチド、糖類、脂質類及び核酸等を含む。さらに、抗原、免疫グロブリン、腫瘍マーカー、リガンド、ウイルス、細菌等を含むことができる。
荷降ろし領域20は、化学平衡を利用して担体分子50から目的分子60を荷降ろしする領域である。荷降ろし領域20は、単位表面積において担体分子50に修飾された所定抗体よりも高い補足力または高濃度の、目的分子60又は所定抗原との結合能を有する物質を含むことができる。一例として、荷降ろし領域20は、目的分子60と結合可能な抗体80を含み、抗体80が担体分子50よりも高い補足力を有すること、または高濃度であることにより、化学平衡を利用して、目的分子60を担体分子50から荷降ろしさせることができる。
さらに、モーター蛋白デバイス1は、荷降ろし領域20における目的分子60の濃度変化を検出する分析部40と接続し、目的分子60が荷降ろし領域20に荷降ろしされたことを検出することができる。分析部40は、例えば、電気的検出手段の一部としての電極41、42を備え、これらの電極41、42を介して荷降ろし領域20のインピーダンスまたは当該インピーダンスの変化を検出することができる。すなわち、モーター蛋白デバイス1において、荷降ろし領域20のインピーダンスまたは当該インピーダンスの変化として、荷降ろし領域20における目的分子60の濃度変化を検出することができる。
一例として、上記所定抗体は、少なくとも1つの免疫グロブリンとの結合能を有することができる。
これらのように構成することにより、モーター蛋白デバイス1の担体分子50は、捕集領域10において、抗原抗体反応を利用して、目的分子60としての免疫グロブリンを捕集した後、荷降ろし領域20まで移動できる。荷降ろし領域20においては、単位表面積において担体分子50に修飾された抗体よりも高い補足力または高濃度の抗体が含まれているため、目的分子60としての免疫グロブリンは、化学平衡により、荷降ろし領域20にある抗体に結合する。すなわち、担体分子50は、目的分子60を荷降ろし領域20に荷降ろしすることができる。時間の経過により、担体分子50が次々に荷降ろし領域20において免疫グロブリンを荷降ろしし続けることにより、荷降ろし領域20には免疫グロブリンが濃縮される。この免疫グロブリンの濃縮は、分析部40により、荷降ろし領域20のインピーダンスの変化として検出することができる。
図2は、本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスが目的分子を濃縮することを説明する図である。図2(a)は、担体分子50の荷降ろし領域20への移動を説明する図であり、図2(b)及び図2(c)は、担体分子50が荷降ろし領域20において目的分子60を荷降ろしすることを説明する図である。
図2(a)において、担体分子50は、捕集した目的分子60を搬送路30に沿って搬送する。搬送路30は、例えば、前述の捕集領域10と荷降ろし領域20との間に設けられる通路であり、捕集領域10と同様に固定化されたミオシン70等を含むことができる。なお、搬送路30は、捕集領域10から独立した通路でもよく、捕集領域10または荷降ろし領域20の一部であってもよい。搬送路30は、荷降ろし領域20に到達する複数の通路からなっていてもよい。
図2(a)に例示する分析部40は、電気的検出手段としての分析回路45、46、47を含む。分析回路45は、電極41、42を介して、荷降ろし領域20のインピーダンスを測定するために用いられる。分析回路46は、電極43、44を介して、参照領域25のインピーダンスを測定するために用いられる。参照領域25は、前述の抗体80を含まないこと以外は、荷降ろし領域20と同等に設けられる。分析回路47は、分析回路45が測定した荷降ろし領域20のインピーダンスと、分析回路46が測定した参照領域25のインピーダンスとの、差分を測定するために用いられる。
図2(b)において、荷降ろし領域20には、担体分子50よりも高い補足力を有する、または高濃度の抗体80が固定化されている。したがって、荷降ろし領域20に担体分子50が到達すると、化学平衡により、担体分子50に結合する目的分子60よりも抗体80に結合する目的分子60が増加する。すなわち、目的分子60は、荷降ろし領域20において担体分子50から荷降ろしされる。荷降ろし領域20および参照領域25には、固定化されたミオシン70が含まれ、荷降ろし後の担体分子50は、荷降ろし領域20に滞留することなく、これらの領域を通過する。後続の担体分子50は、引き続き、荷降ろし領域20に到着することができる。
このようにして、荷降ろし領域20には、目的分子60が時間の経過とともに次々に荷降ろしされ、濃縮される。荷降ろし領域20における目的分子60の濃度上昇にしたがい、荷降ろし領域20のインピーダンスの容量成分が増加する。一方、参照領域25には目的分子60が濃縮されないため、参照領域25のインピーダンスは実質的に変化しない。したがって、荷降ろし領域20における目的分子60の濃度上昇は、分析回路45が測定する荷降ろし領域20のインピーダンスの変化として、あるいは分析回路47による荷降ろし領域20と参照領域25とのインピーダンスの差分の変化として、検出することができる。
また、図2(c)に例示するとおり、目的分子60に担体分子50の一部が結合する、あるいは抗原部位61を修飾した目的分子60を含む複合体であっても、荷降ろし領域20のインピーダンスの容量成分は増加するため、荷降ろし領域20における目的分子60の濃度上昇を検出することができる。
図2(a)(b)及び(c)には、一つの搬送路30、荷降ろし領域20における一対の電極41、42、および参照領域25における一対の電極43、44を例示したが、これらに限定されず、搬送路30の数およびインピーダンス測定のための電極の配置・形状等の態様は、任意に設計できる。
図3は、本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスの搬送路の例を示す図である。
図3において、搬送路30は、全体的に環状の通路の形状を有しており、この環状の通路である搬送路30には固定化されたミオシン70が全面に含まれている。捕集領域10において目的分子60を捕集した担体分子50は、荷降ろし領域20において目的分子60を荷降ろしした後、搬送路30の経路に沿って、再び捕集領域10に戻ることができる。したがって、担体分子50は、目的分子60を捕集して荷降ろし領域20に搬送して荷降ろしすることを繰り返し、目的分子60を濃縮し続けることができる。
このような担体分子50の移動は、緩衝溶液を流動させるための機構を設ける必要なく、緩衝溶液中に存在するATP等の化学エネルギー源により可能である。したがって、本発明にかかるモーター蛋白デバイスは、無動力で動作可能な目的分子60の濃縮手段として構成することが可能である。
図4は、本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスの別の実施形態を示す図である。
図4において、荷降ろし領域20は、複数のモーター蛋白デバイス11a〜hについての共通の荷降ろしのための領域として設けられる。これらのモーター蛋白デバイス11a〜hのそれぞれは、荷降ろし領域20に向かって目的分子60を搬送し、荷降ろしするよう構成される。したがって、図4に示す荷降ろし領域20には、モーター蛋白デバイス11a〜hのそれぞれが目的分子60を荷降ろしし続けることにより、短時間で目的分子60が濃縮される。
図4に示す荷降ろし領域20には、目的分子60の濃度変化を光学的に検出する所定手段を接続するための、光路26を設けることができる。光路26は、例えば、特定の波長範囲の光を通過することのできる透過材料等で構成される。目的分子60の濃度変化は、例えば、光路26を介した特定波長における荷降ろし領域20の緩衝液の吸収率変化として、検出することができる。
図4には、光学的検出手段のための光路26を例示したが、これに限定されず、図1乃至3に示した電気的検出手段としての分析部40および電極41乃至44を任意に用いて、図4に示す荷降ろし領域20における目的分子60の濃度変化を検出することも可能である。
図5は、本発明の一実施形態にかかるモーター蛋白デバイスを備えるがんセンサアレーの例を示す図である。該がんセンサアレーでは、目的分子50は腫瘍マーカーである。図5(a)は、がんセンサアレーとなるSi半導体基板の構造を説明する図であり、図5(b)は、モーター蛋白デバイスを備えるがんセンサアレーを例示する図である。
がんセンサアレーの荷積み領域90に、目的分子60が含まれると思われる検体をのせると、担体分子50のアクチンは捕集した腫瘍マーカーを搬送し、荷降ろし領域20において腫瘍マーカーを荷降ろしする。荷降ろし領域20には、腫瘍マーカーが時間の経過とともに次々に荷降ろしされ、濃縮される。一方、参照領域25には腫瘍マーカーが濃縮されないため、荷降ろし領域20における目的分子60の濃度上昇は、分析部40に含まれる分析回路45が測定する荷降ろし領域20のインピーダンスの変化として、あるいは分析回路47による荷降ろし領域20と参照領域25とのインピーダンスの差分の変化として、検出することができる。
そして、図5(b)に例示するように、該がんセンサアレーは、モーター蛋白デバイスを複数積載した構造をとることができ、複数の腫瘍マーカーを同時にかつ高感度に検出することが可能となる。
検体の一例として、血液、血清、血漿、尿、汗、痰、前立腺液、胃液、腸液、腎液、肺液、脳脊髄液、髄液、精子等あるいは脳、食道、胃、肺、小腸、大腸、すい臓、肝臓、腎臓、膀胱、脾臓、甲状腺、睾丸、子宮、骨等の組織から調製された試料を含むことができる。また、腫瘍マーカーの一例として、AFP、BCA225、CA15−3、CA19−9、CA72−4、CA125、CEA、CYFRA、DUPAN−2、NMP22、NSE、PA(PSA)、PIVKA−II、ProGRP、SCC、SLX、TPA、γ―Sm、抗p53抗体、エラスターゼ1等を含むことができる。
(Si半導体基板の作成)
本発明にかかる、がんセンサアレーについて、図5(a)を用いて説明する。まず、図5(a)に例示する、トラック状の流路を有する表面構造をもつSi半導体基板を、標準CMOSプロセスにより製作した。ここで、荷降ろし領域20と参照領域25の流路幅は1.2μm、荷積み領域90の円弧の流路幅は10μmとした。荷降ろし領域20と参照領域25の流路には、メタル配線層を利用した対向電極及び電極パッド91を形成した。
(Si半導体基板の表面処理)
得られたSi半導体基板を、イソプロピルアルコールで1時間超音波洗浄し、無塵中で、60℃2時間加熱し、乾燥させた。さらに、表面コート剤(信越化学工業製、KJC7022)を0.001mg/mLに調整し、Si半導体基板にスピンコーターでコーティングした。これを無塵中で、60℃5時間加熱して乾燥させ、Si半導体基板の表面の疎水化処理を行った。
(カバーガラスの表面処理)
荷降ろし領域20と参照領域25を覆うカバーガラスを、洗浄液(0.1M KOH+70%エタノール)で1時間超音波洗浄後、さらに純水で洗浄した。無塵中で、60℃5時間加熱して乾燥させ、カバーガラスの表面を親水化した。
(モーター蛋白の印刷)
26μg/mLの骨格筋ミオシンを、25mM KCl、3.0mM MgCl、5.0mM pH緩衝液(Tris−HCl)で希釈して得たpH=8.0のモーター蛋白溶液に、カバー蛋白質20μg/mLを加えた溶液を作製し、インクジェット方式でSi半導体基板のトラック全面に印刷した。
(荷降ろし領域20への抗体80の印刷)
初期肺がんの腫瘍マーカーである、抗ヒトCEAモノクローナル抗体(1.0mg/mL)を抗体80として選択し、荷降ろし領域20にインクジェット方式で印刷した。
(輸送ユニット蛋白の調整)
Sephadex G−25を用い、1.0mg/mLの抗ヒトCEAモノクローナル抗体0.5mLを、50mMリン酸緩衝液にて調整した。これに2000倍量の架橋剤であるSM(PEG)12(THERMO SCIENTIFIC社製)を加え、25℃で3時間反応させた。さらに、SM(PEG)12の50倍量のTris−HClを加えた後、50mMリン酸緩衝液にて調整した。これに、骨格筋アクチン繊維溶液(1.0mg/mLの骨格筋アクチン繊維を、25mM KCl、2.0mM ATP、0.1mM CaCl、10mMクレアチンリン酸ナトリウム、10mg/mLクレアチンキナーゼにて希釈)を0.5mL加え、25℃で3時間処理後、SM(PEG)12の50倍量の2−メルカプトエタノールを加え、輸送ユニット蛋白を調整した。
(担体分子50の作成とSi半導体基板への注入)
輸送ユニット蛋白と、骨格筋アクチン繊維を1:10000の割合で、溶媒(25mM KCl、25mM imidazole−HCl(pH=7.4)、2.0mM MgCl、10mM ATP、1mM DTT、10mMクレアチンリン酸、100U/mLクレアチンキナーゼ)中にて混合し、担体分子50となるナノ輸送繊維を得た。これを、Si半導体基板上に15μL滴下した。さらに、2.0μLを滴下し、表面の溶液2.0μLを吸引洗浄した。Si半導体基板上に、ジエチルアミノエチル(DEAE)イオン交換膜を装着、周囲の水分を吸引した。表面処理を行ったカバーガラスを装着し、親水性接着剤を用い、加圧して接着した。
(インピーダンス計測と従来法との比較)
がんセンサアレーに、腫瘍マーカーCEAを0.10ng/mLから100ng/mL含む人工血清を2.0μL滴下した。センサユニットの半導体回路を使い、インピーダンス計測を行った。測定は並列四端子法で行われ、流路の下に設けられた分析回路47で、荷降ろし領域20と参照領域25のインピーダンス変化を差動検出し、その出力値を電圧に変換した。また比較例として、化学発光免疫測定法を使い腫瘍マーカーCEAを検出した。両者の結果を図6に示す。この結果から、本発明による初期ガン検出能力は従来法と同等であり、電気的に測定できるため、安価で高速に行えることが判明した。
以上、実施形態を用いて本発明を説明したが、本発明の技術的範囲は上記実施形態に記載の範囲には限定されないことは言うまでもない。上記実施形態に、多様な変更または改良を加えることが可能であることが当業者に明らかである。またその様な変更または改良を加えた形態も本発明の技術的範囲に含まれ得ることが、特許請求の範囲の記載から明らかである。
1、11 モーター蛋白デバイス
10 捕集領域
20 荷降ろし領域
25 参照領域
26 光路
30 搬送路
40 分析部
41、42、43、44 電極
45、46、47 分析回路
50 担体分子
60 目的分子
61 抗原部位
70 固定化ミオシン
80 抗体
90 荷積み領域
91 電極パッド

Claims (9)

  1. 抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、
    化学平衡を利用して前記担体分子から前記目的分子を荷降ろしする荷降ろし領域と、
    前記荷降ろし領域における前記目的分子の濃度変化を検出する分析部と、
    前記捕集領域と前記荷降ろし領域の間に設けられた前記担体分子が前記目的分子を搬送可能な搬送路と、
    を含むモーター蛋白デバイスであって、
    前記荷降ろし領域は、単位表面積において、前記担体分子に修飾された所定抗体よりも高い補足力または高濃度の抗体が含まれており、
    前記分析部は、前記荷降ろし領域におけるインピーダンスの変化によって前記目的分子の濃度変化を検出し、
    前記搬送路は、前記担体分子と相互作用して前記担体分子を移動させるモーター蛋白が固定化されているモーター蛋白デバイス。
  2. 抗原抗体反応を利用して担体分子が目的分子を捕集する捕集領域と、
    化学平衡を利用して前記担体分子から前記目的分子を含む複合体を荷降ろしする荷降ろし領域と、
    前記荷降ろし領域における前記目的分子の濃度変化を検出する分析部と、
    前記捕集領域と前記荷降ろし領域の間に設けられた前記担体分子が前記目的分子を搬送可能な搬送路と、
    を含むモーター蛋白デバイスであって、
    前記荷降ろし領域は、単位表面積において、前記担体分子に修飾された所定抗体よりも高い補足力または高濃度の抗体が含まれており、
    前記分析部は、前記荷降ろし領域におけるインピーダンスの変化によって前記目的分子の濃度変化を検出し、
    前記搬送路は、前記担体分子と相互作用して前記担体分子を移動させるモーター蛋白が固定化されているモーター蛋白デバイス。
  3. 前記担体分子が、修飾されたアクチンを含み、
    前記モーター蛋白が、ミオシンである請求項1又は2に記載のモーター蛋白デバイス。
  4. 前記担体分子は、所定抗原と接合可能な所定抗体としての部分構造を含むことを特徴とする請求項1から3のいずれか一項に記載のモーター蛋白デバイス。
  5. 前記荷降ろし領域は、前記担体分子に修飾された前記所定抗体よりも高い捕捉力の、目的分子との結合能を有する物質を含むことを特徴とする請求項1から4のいずれか一項に記載のモーター蛋白デバイス。
  6. 前記担体分子は、所定抗体を修飾した分子を含むことを特徴とする請求項3から5のいずれか一項に記載のモーター蛋白デバイス。
  7. 前記所定抗体は、少なくとも1つの目的分子との結合能を有することを特徴とする請求項1から6のいずれか一項に記載のモーター蛋白デバイス。
  8. 前記目的分子が腫瘍マーカーである請求項1から7のいずれか一項に記載のモーター蛋白デバイス。
  9. 請求項に記載のモーター蛋白デバイスを備えることを特徴とするがんセンサアレー。
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