JP6252933B2 - 構造体ならびにこれを用いた細菌の捕集および検出方法 - Google Patents

構造体ならびにこれを用いた細菌の捕集および検出方法 Download PDF

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Description

本発明は、構造体ならびにこれを用いた細菌の捕集および検出方法に関する。
食品や水の安全確保、また、食品・飲料工場、病院など様々な現場環境の衛生管理は、汚染原因の究明やバイオハザード等の観点から極めて重要な課題である。たとえば、腸菌の１つである０１５７は集団食中毒の原因菌となることが多く、子供や高齢者の場合は重症化しやすく、死亡に至る場合がある。
こうした病原性細菌による食中毒事故は、発展途上国ばかりでなく先進国でも大きな社会問題となっている。これは、どこででも簡便に細菌を検出できる要素技術が、開発されていないためである。
現在、細菌検出を行う公定試験法は培養法によるものであり、結果が出るまでに２〜１０日程度の期間を要する。
また、細菌の蛍光試薬による染色と、蛍光顕微鏡による観察は可能であったが、細菌の大きさは１μｍ程度であり、染色しても肉眼で観察することはできなかった。
一方、蛍光染色を用いる観察技術として、技術分野は異なるが、非特許文献１に記載のものがある。非特許文献１には、ガン細胞に結合する抗体を結合させた二種類の蛍光シリカナノ粒子（Fluorescent silica nanoparticles：ＦＳｉＮＰｓ）を用いてガン細胞を免疫二重染色する技術が記載されている。
Xiaoxiao He、外５名、「FSiNPs mediated improved double immunofluorescence staining for gastric cancer cells imaging」、Talanta、２００８年、第７６巻、ｐ．１１９９−１２０６
本発明は、細菌を簡便で迅速に捕集する技術を提供するものである。
本発明によれば、
ナノ粒子と、
前記ナノ粒子上に固定化されている、複数の細菌表面認識部位と、
を含み、前記細菌表面認識部位が、前記細菌と相互作用する官能基と、前記細菌との相互作用により光応答性を示す官能基と、を含み、前記細菌表面認識部位を介して細菌を連結捕集する、構造体が提供される。
また、本発明によれば、
ナノ粒子と、
前記ナノ粒子上に固定化されている、複数の細菌表面認識部位と、
を含み、前記細菌表面認識部位が、ジピコリルアミン／金属錯体、イミノ二酢酸／金属錯体、フェニルボロン酸基およびグアニジノ基からなる群から選択される一種以上を含み、前記細菌表面認識部位を介して細菌を連結捕集する、構造体が提供される。
また、本発明によれば、前記本発明における構造体を前記細菌に接触させて、前記細菌を前記構造体とともに凝集させるステップを含む、細菌の捕集方法が提供される。
また、本発明によれば、前記本発明における構造体を前記細菌に接触させて、前記細菌を前記構造体とともに凝集させるステップと、
細菌を構造体とともに凝集させる前記ステップにおける凝集物の形成の有無を検知するステップと、
を含む、細菌の検出方法が提供される。
なお、これらの各構成の任意の組み合わせや、本発明の表現を方法、装置などの間で変換したものもまた本発明の態様として有効である。
たとえば、本発明によれば、細菌を連結捕集する細菌捕集材料、あるいは、細菌を連結捕集し検出する細菌検出材料としての、前記本発明における構造体の使用が提供される。
また、本発明によれば、細菌を連結捕集する細菌捕集材料、あるいは、細菌を連結捕集し検出する細菌検出材料の製造のための、前記本発明における構造体の使用が提供される。
本発明によれば、細菌を簡便で迅速に捕集する技術を提供することができる。
実施形態における構造体の構成を示す断面図である。 実施形態における構造体が細菌を連結捕集する様子を模式的に示す図である。 実施形態における構造体の構成を示す図である。 実施形態における構造体の細菌表面認識部位の構成を示す図である。 実施例における［Ｒｕ（ｂｐｙ）3］（ＰＦ6）2の合成の際のマイクロ波照射方法を説明する図である。 実施例における逆ミセル法によるＦＳｉＮＰの合成方法を説明する図である。 実施例における逆ミセル法によるＦＳｉＮＰの合成方法を説明する図である。 実施例におけるＦＳｉＮＰの洗浄方法を説明する図である。 実施例において合成されたｄｐａ−ＨＣＣの1Ｈ ＮＭＲ測定結果を示す図である。 実施例における細菌の観察結果を示す図である。 実施例における細菌の観察結果を示す図である。
以下、実施の形態について、図面を用いて説明する。なお、すべての図面において、同様な構成要素には共通の符号を付し、適宜説明を省略する。また、図は概略図であり、実際の寸法比率とは必ずしも一致していない。
図１は、本実施形態における構造体の構成を示す断面図である。図１に示した構造体１００は、細菌を連結捕集するように構成されており、ナノ粒子１０１と、ナノ粒子１０１上に固定化されている、複数の細菌表面認識部位１０３と、を含む。構造体１００は、細菌を認識して捕集する人工の分子または超分子であって、複数の細菌表面認識部位１０３を介して細菌を連結捕集する。
図２は、構造体１００が細菌を連結捕集する様子を模式的に示す図である。
図２において、細菌１０２に構造体１００を添加すると、構造体１００に含まれる複数の細菌表面認識部位１０３がそれぞれ細菌１０２の表面に結合して細菌１０２を連結捕集し、複数の構造体１００と複数の細菌１０２とを含む凝集体１０４が形成される。
構造体１００の形状は、たとえば粒子状であり、その粒子径は、後述するナノ粒子１０１の粒子径以上である。細菌１０２内への取り込みを抑制する観点から、構造体１００の粒子径は、たとえば１０ｎｍ以上、好ましくは２０ｎｍ以上である。
一方、細菌１０２をより一層迅速に連結捕集する観点から、構造体１００の粒子径は、たとえば３００ｎｍ以下、好ましくは２００ｎｍ以下、さらに好ましくは１５０ｎｍ以下である。
以下、構造体１００の構成要素についてさらに具体的に説明する。
構造体１００において、ナノ粒子１０１は細菌を捕集するための基材として機能する。ナノ粒子１０１は、ナノメートルオーダーのサイズを有する粒状の材料により構成される。ナノ粒子１０１は、一種の材料から構成されていても二種以上の材料から構成されていてもよい。
また、ナノ粒子１０１は、一様な断面構造を有していてもよいし、コア−シェル構造等の複数の異なる構造領域を有していてもよい。また、ナノ粒子１０１は中空粒子および中実粒子のいずれであってもよく、またゲル粒子等の網目構造を有する粒子であってもよい。
ナノ粒子１０１の具体例として、シリカ、酸化チタン等の金属酸化物またはその他の無機粒子から構成される粒子；
ポリスチレン等の有機材料から構成される粒子；
ポリアミドアミンデンドリマー等のデンドリマー；
金コロイド、銀コロイド等の金属コロイド；ならびに
コロイド状の量子ドット等の半導体結晶から構成される粒子が挙げられる。
さらに具体的には、ナノ粒子１０１が、シリカナノ粒子、デンドリマー、金コロイドおよび量子ドットからなる群から選択される一種以上を含む構成が挙げられる。
また、ナノ粒子１０１は、たとえば水または水を含む分散媒に分散可能である構成とする。このような材料を用いることにより、細菌１０２との接触前の構造体１００の分散性を向上させるとともに、細菌１０２との接触による凝集体１０４の形成を確認しやすくなる。
ナノ粒子１０１の粒子径は、細菌１０２内への取り込みを抑制する観点から、たとえば１０ｎｍ以上、好ましくは２０ｎｍ以上である。
一方、細菌１０２をより一層迅速に連結捕集する観点から、ナノ粒子１０１の粒子径は、たとえば３００ｎｍ以下、好ましくは２００ｎｍ以下、さらに好ましくは１５０ｎｍ以下である。
なお、ナノ粒子１０１および構造体１００の粒子径は、たとえば数平均であり、複数のナノ粒子１０１の顕微鏡観察により得られる画像から各粒子の粒子径を測定することにより算出できる。
また、ナノ粒子１０１の粒子径または構造体１００の粒子径は、捕集対象である細菌１０２の形状、大きさ、性質等に応じて決めることもできる。
ナノ粒子１０１は、発光物質および発色物質からなる群から選択される一種以上を含んでいてもよい。このようなナノ粒子１０１の具体例として、発光物質および発色物質からなる群から選択される一種以上を内包しているシリカナノ粒子が挙げられる。
また、検出感度をさらに向上させる観点からは、蛍光物質を用いることがさらに好ましく、このときナノ粒子１０１をたとえば蛍光シリカナノ粒子（ＦＳｉＮＰ）とする。
発光物質または発色物質を粒子に内包させると、構造体１００が捕集した細菌１０２をたとえば目視等の視覚により容易に検知することができるため、細菌１０２の捕集の有無や、捕集した細菌１０２の存在位置を、より一層簡便で感度良く検知することができる。
ナノ粒子１０１に含ませる発色物質の具体例としては、アクリジンオレンジやテトラキス（４−メチルピリジニウム）ポルフィリンなどが挙げられる。
また、ナノ粒子１０１の粒子内に含ませる発光物質の具体例としては各種蛍光物質が挙げられ、たとえば、
［Ｒｕ（ｂｐｙ）3］Ｃｌ2（トリス（ビピリジン）ルテニウム（ＩＩ）錯体）等のビピリジン系金属錯体化合物およびその塩、水和物；
フルオレセインイソチオシアネート（fluorescein isothiocyanate：ＦＩＴＣ）等のフルオレセイン；
ピレン；
アントラセン；
ナフタレン；
ローダミン；
４−ニトロベンズ−２−オキサ−１，３−ジアゾール（4-nitrobenz-2-oxa-1,3-diazole：ＮＢＤ）；
クマリン；
Ｃｙ色素等のシアニン系化合物；
ポルフィリン；ならびにこれらの誘導体を用いることができる。
ナノ粒子１０１に対する発光物質の割合は、発光の強度に応じて決めることができるが、凝集体１０４の検出感度を向上させる観点からは、たとえば重量比で０．０５％以上、好ましくは０．１％以上とする。
また、凝集体１０４の検出感度を向上させる観点からは、ナノ粒子１０１に対する発光物質の割合を重量比でたとえば１００％以下、好ましくは８０％以下とする。なお、ナノ粒子１０１が発光物質により構成されていてもよく、このような材料として、量子ドットなどの半導体結晶が挙げられる。
また、ナノ粒子１０１の表面にスペーサーとして機能する物質を固定化し、スペーサーに細菌表面認識部位１０３が結合していてもよい。スペーサーについては後述する。
次に、細菌表面認識部位１０３について説明する。
細菌表面認識部位１０３は、細菌１０２の表面を認識する部位を含む。具体的には、細菌表面認識部位１０３は、細菌表面の所定の部位、官能基等と物理的または化学的に相互作用する部位であり、細菌表面の特定の部位と特異的に相互作用することが好ましい。
細菌表面認識部位１０３の具体例として、ジピコリルアミン（dipicolylamine：ｄｐａ）／金属錯体、イミノ二酢酸／金属錯体、フェニルボロン酸基およびグアニジノ基からなる群から選択される一種以上を含む構成が挙げられる。
このうち、たとえばｄｐａ／金属錯体を用いることにより、構造体１００が細菌表面のリン酸基を認識する構成とすることができる。ｄｐａ／金属錯体として、ｄｐａ／Ｃｕ錯体、ｄｐａ／Ｚｎ錯体等が挙げられる。
構造体１００中の細菌表面認識部位１０３の表面密度は、捕集する細菌１０２の種類や、細菌表面認識部位１０３の構成により決めることができる。細菌１０２を効率よく捕集する観点からは、細菌表面認識部位１０３の表面密度をたとえば１．０×１０−9ｍｏｌ／ｍ2以上、好ましくは１．０×１０−8ｍｏｌ／ｍ2以上とする。また、細菌表面認識部位１０３の周辺に好適な空間を形成して細菌１０２との相互作用を生じやすくする観点からは、細菌表面認識部位１０３の表面密度をたとえば１．０×１０−4ｍｏｌ／ｍ2以下、好ましくは１．０×１０−5ｍｏｌ／ｍ2以下とする。
また、凝集体１０４の形成をさらに好感度で簡便に検出する観点からは、細菌表面認識部位１０３が、細菌１０２と相互作用する官能基と、細菌１０２との相互作用により光応答性を示す官能基とを含む構成とすることが好ましい。
光応答性の官能基として、細菌表面に結合して発色、蛍光応答を示す官能基が挙げられる。
細菌表面認識部位１０３に導入する蛍光物質として、７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸（7-hydroxycoumarin-3-carboxylic acid：ＨＣＣ）およびその誘導体；８-(２，２' −ジピコリルアミノメチル) −７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸（(2,2'-dipicolylaminomethyl)-7-hydroxycoumarin-3-carboxylic acid）等が挙げられる。
また、ナノ粒子中の発光または発色物質として前述した例示物質を用いることもできる。このとき、細菌表面認識部位１０３に導入する蛍光物質として、ナノ粒子中の発光または発色物質と異なる発光または発色波長を有するものを用いることが好ましい。
細菌表面認識部位１０３において、細菌１０２との結合部位と光応答性を示す官能基との組み合わせの具体例として、ｄｐａ／金属錯体とＨＣＣ由来の官能基との組み合わせ、フェニルボロン酸とＨＣＣ由来の官能基との組み合わせが挙げられる。
また、構造体１００において、細菌表面認識部位１０３が、スペーサーを介してナノ粒子１０１に固定化された構成としてもよい。スペーサーを設けることにより、ナノ粒子１０１の外側に空間が形成されるため、細菌表面認識部位１０３と細菌との相互作用をより効率よく生じさせて、細菌をさらに確実に捕集することができる。
また、スペーサーとして親水性材料を用いることにより、ナノ粒子１０１の表面が親水性のスペーサー分子で覆われるため、ナノ粒子１０１の水分散性を高めたり、構造体１００が捕集対象である細菌以外の材料に非特異的に吸着することを抑制したりすることができる。
また、スペーサーとして、アルキル鎖やエチレングリコール鎖等の鎖状分子；
アゾベンゼン等を用いてもよい。
（構造体の製造方法）
次に、構造体１００の製造方法を説明する。
本実施形態において、構造体１００の製造方法は、たとえば、
ナノ粒子１０１を準備するステップと、
ナノ粒子１０１の表面に細菌表面認識部位１０３を導入するステップと、
を含む。
はじめに、ナノ粒子１０１を準備するステップについて説明する。ナノ粒子１０１は、その構成材料に応じて所定の方法で作製または入手することができる。
たとえば、ナノ粒子１０１として金属または金属酸化物の粒子を用いる場合、化学気相析出法、物理気相析出法等の気相法、金属アルコキシド法、共沈法、逆ミセル法、噴霧法等の溶液法などを用いることができる。
また、ナノ粒子１０１がシリカ粒子である場合、疎水性溶媒、界面活性剤およびアルキル水溶液により形成される逆ミセル内で、テトラエトキシシラン等の金属アルコキシドを加水分解、重合する逆ミセル法（非特許文献１）；および
シリコンアルコキシド、アルコールおよびアンモニア水を室温付近の温度で混合してアルコキシドの加水分解縮合反応によりシリカ微粒子を得るストーバー法等が挙げられる。ナノ粒子１０１の粒径のばらつきを抑制しつつ分散安定性を向上させる観点からは、逆ミセル法が好ましい。
ナノ粒子１０１が発光物質や発色物質を含む構成とするとき、発光物質または発色物質は、ナノ粒子１０１の製造工程中に粒子内に含ませてもよいし、粒子の形成後、粒子に内包させたり粒子表面に導入してもよい。
たとえば、ナノ粒子１０１をシリカナノ粒子とする場合、たとえば前述した逆ミセル法において、疎水性溶媒中にあらかじめ蛍光物質等を添加しておくことにより、得られるシリカ粒子内に蛍光物質を含ませることができる。
また、得られた粒子の表面に所定の官能基を導入してもよい。このとき、たとえば、粒子表面を、所定の官能基を有するシランカップリング剤等のカップリング剤で処理する。
粒子表面に導入する官能基は、細菌表面認識部位１０３またはスペーサーに含まれる官能基との結合に用いることができる。たとえば、細菌表面認識部位１０３またはスペーサーに含まれる、チオール基、アミノ基、カルボキシル基、アルデヒド基、水酸基等を利用するとき、これらの基との反応に用いられる官能基を有するカップリング剤で粒子を処理する。
さらに具体的には、細菌表面認識部位１０３またはスペーサーに含まれるカルボキシル基と結合させようとする場合、粒子を３−アミノプロピルエトキシシラン（ＡＰＳ）、３−アミノプロピルトリメトキシシラン等のアミノ基を有するシランカップリング剤の溶液に浸漬し、表面処理する。
また、ナノ粒子１０１が金コロイド粒子であるとき、たとえば、チオール基および細菌表面認識部位１０３との結合に用いられる官能基を有するカップリング剤で粒子の表面を処理すると、金−チオール結合により、ナノ粒子１０１の表面に細菌表面認識部位１０３との結合に用いられる官能基を導入することができる。
一方、細菌表面認識部位１０３となる物質は、その分子構造に応じて所定の方法で合成または入手することができる。細菌表面認識部位１０３が蛍光性または発色性の官能基を含む構成とするときは、たとえば細菌表面に結合する官能基と蛍光性または発色性の官能基とを所定の方法で縮合させる。
次に、得られたナノ粒子１０１と細菌表面認識部位１０３となる物質とを接触させて、ナノ粒子１０１上に細菌表面認識部位１０３を導入する。
固定化方法は、固定化反応に用いられる官能基の種類により選択される。たとえば、ナノ粒子１０１または細菌表面認識部位１０３の一方に含まれるアミノ基と他方に含まれるカルボキシル基とを用いる場合、４−（４，６−ジメトキシ−１，３，５−トリアジン−２−イル）−４−メチルモルフォリニウムクロライドｎ−ハイドレート（ＤＭＴ−ＭＭ）等のトリアジン系の縮合剤；ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−エチル−３−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド塩酸塩（ＥＤＣ）等のカルボジイミド系の縮合剤、などが用いられる。
なお、固定化の際には必要に応じて、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、ｐ−ニトロフェノール、ペンタフルオロフェノール等の活性エステル類を併用してもよい。
また、ナノ粒子１０１と細菌表面認識部位１０３との間にスペーサーを設ける場合には、ナノ粒子１０１または細菌表面認識部位１０３の一方とスペーサーの片末端とを結合させた後、ナノ粒子１０１または細菌表面認識部位１０３の他方とスペーサーの他末端とを結合させる。
以上の手順により、構造体１００が得られる。
図３は、得られる構造体１００の具体例を示す図である。図３に示した構造体１００は、ナノ粒子１０１がＦＳｉＮＰであって、細菌表面認識部位１０３が蛍光性のＨＣＣと細菌表面のリン酸基との相互作用に用いられるｄｐａとを有する例（ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ複合材料）である。
また、図４は、ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ複合材料において細菌を認識させる方法を説明する図である。図３に示したｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ複合材料中のｄｐａ部分は、図４に示すように、所定の金属イオン（２価：図４中の「Ｍ2+」）の錯体とすることにより、細菌表面のリン酸基を認識する官能基となる。
また、ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ複合材料のように、ナノ粒子１０１または細菌表面認識部位１０３の少なくとも一方に蛍光物質または蛍光を発する官能基を設けると、たとえば蛍光強度を測定し、相対値を算出することにより、細菌１０２の定量的な測定をおこなうことも可能となる。
（細菌の捕集および検出）
次に、得られた構造体１００を用いて細菌を捕集または検出する方法を説明する。
図２を参照して前述したように、本実施形態における細菌１０２の捕集方法は、たとえば、構造体１００を細菌１０２に接触させて、細菌１０２を構造体１００とともに凝集させるステップ（ステップ１０）を含む。
捕集対象である細菌１０２の形状に制限はなく、球菌、桿菌等とすることができる。
また、細菌１０２の種類に制限はなく、たとえば
大腸菌等の腸菌、緑膿菌等、その他のグラム陰性菌；および
黄色ブドウ球菌等のブドウ球菌、その他のグラム陽性菌が挙げられる。
構造体１００を細菌１０２に接触させるステップにおいて、細菌１０２の濃度は、凝集体１０４を効率よく形成する観点から、たとえば１０3個／ｍＬ以上とする。また、構造体１００と効率よく相互作用させる観点からは、細菌１０２の濃度をたとえば１０8個／ｍＬ以下とする。
また、構造体１００を細菌１０２に接触させるステップにおいて、構造体１００の濃度は、凝集体１０４を効率よく形成する観点から、たとえばＦＳｉＮｐを基準にすると５μｇ／ｍＬ以上とする。また、細菌１０２とより安定的に相互作用させる観点からは、構造体１００の濃度をたとえばＦＳｉＮｐを基準にすると１００μｇ／ｍＬ以下とする。
また、本実施形態において、細菌１０２の検出方法は、たとえば、
構造体１００を細菌１０２に接触させて、細菌１０２を構造体１００とともに凝集させるステップ（ステップ１０）、ならびに
ステップ１０における凝集物の形成の有無を検知するステップ（ステップ１２）、を含む。
細菌１０２の検出感度は、系内に添加する細菌１０２および構造体１００のそれぞれの濃度、これらの濃度比、構造体１００中の細菌表面認識部位１０３の表面密度等により変化するが、１０5〜１０6個／ｍＬの細菌濃度、またはさらに低濃度においても細菌１０２を検出することが可能となる。
次に、本実施形態の作用効果を説明する。
本実施形態において、構造体１００は、細菌表面の官能基を多点で認識して細菌１０２を連結捕集するように構成されているため、構造体１００は、細菌１０２を認識して捕集することができる新規の人工の分子として用いられる。
そして、本実施形態における細菌１０２を連結捕集する技術を用いれば、細菌１０２を大きな固まり（凝集体１０４）として簡便、迅速に捕集することができる。たとえば、細菌１０２を１０分以内、好ましくは５分以内で凝集させて、捕集することができる。また、細菌１０２を含む試料に構造体１００を添加して凝集体１０４を形成することにより、細菌１０２を試料から簡便に分離することも可能となる。
また、構造体１００を用いることにより、細菌同士を連結させて捕集できるため、細菌１０２の検出に利用することが可能となる。たとえば、構造体１００を用いて凝集体１０４を形成することにより、染色細菌を肉眼で確認できるようになる。また、未染色の細菌の場合にも、構造体１００に蛍光性等を付与することで、その場での目視検出が期待できる。また、蛍光強度を測定することにより、細菌１０２の濃度の定量をおこなうことも可能となる。
また、構造体１００を用いることにより、細菌同士を連結させて捕集できるため、除菌技術として利用することも可能となる。これにより、院内感染予防や食品や飲料水の安全衛生管理などに構造体１００を用いることも可能となる。
以上、本発明の実施形態について述べたが、本発明は前述の実施形態に限定されるものではなく、本発明の目的を達成できる範囲での変形、改良などは本発明に含まれるものである。
以下、参考形態の例を付記する。
１． ナノ粒子と、
前記ナノ粒子上に固定化されている、複数の細菌表面認識部位と、
を含み、前記細菌表面認識部位を介して細菌を連結捕集する、構造体。
２． 前記ナノ粒子の粒子径が１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である、１．に記載の構造体。
３． 前記ナノ粒子が水に分散可能である、１．または２．に記載の構造体。
４． 前記細菌表面認識部位が、前記細菌と相互作用する官能基と、前記細菌との相互作用により光応答性を示す官能基と、を含む、１．乃至３．いずれか一項に記載の構造体。
５． 前記細菌表面認識部位が、ジピコリルアミン／金属錯体、イミノ二酢酸／金属錯体、フェニルボロン酸基およびグアニジノ基からなる群から選択される一種以上を含む、１．乃至４．いずれか一項に記載の構造体。
６． 前記ナノ粒子が、シリカナノ粒子、デンドリマー、金コロイドおよび量子ドットからなる群から選択される一種以上を含む、１．乃至５．いずれか一項に記載の構造体。
７． 前記ナノ粒子が、発光物質および発色物質からなる群から選択される一種以上を内包する前記シリカナノ粒子である、６．に記載の構造体。
８． 前記細菌表面認識部位が、スペーサーを介して前記ナノ粒子に固定化された、１．乃至７．いずれか一項に記載の構造体。
９． １．乃至８．いずれか一項に記載の構造体を前記細菌に接触させて、前記細菌を前記構造体とともに凝集させるステップを含む、細菌の捕集方法。
１０． １．乃至８．いずれか一項に記載の構造体を前記細菌に接触させて、前記細菌を前記構造体とともに凝集させるステップと、
細菌を構造体とともに凝集させる前記ステップにおける凝集物の形成の有無を検知するステップと、
を含む、細菌の検出方法。
以下、本発明を実験例により説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
（実験例１）
本例では、図３に示したｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ複合体を作製した。ＦＳｉＮＰ中に含まれる蛍光物質をＲｕ（ｂｐｙ）3とした。
（［ＲｕII（ｂｐｙ）3］Ｃｌ2・６Ｈ2Ｏの合成）
以下のスキームに従い、［ＲｕII（ｂｐｙ）3］Ｃｌ2・６Ｈ2Ｏ（以下、「［Ｒｕ（ｂｐｙ）3］Ｃｌ2・６Ｈ2Ｏ」ともいう。）を合成した。
ＲｕＣｌ3・ｎＨ2Ｏ（フルヤ金属社製：Ｒｕ含有量４０．９２％）０．２００ｇ（０．７６ｍｍｏｌ）と２，２'−ビピリジン０．３６０ｇを混合し、エチレングリコール２０ｃｍ3に溶解した。アルゴンガスを通した後、図５に示すプログラムでマイクロ波照射を行った。溶液を室温（２５℃、以下同じ。）に放冷した後、ヘキサフルオロリン酸アンモニウム飽和水溶液中に注いで橙色の沈殿をろ別し、結晶を得た。この粗結晶をアセトニトリルに溶解し、ジエチルエーテルに少量ずつ滴下し、再結晶により［Ｒｕ（ｂｐｙ）3］（ＰＦ6）2を得た（収率７７．８％、水に難溶）。
続いて陰イオン交換樹脂（ダウエックス１−Ｘ２）をミニカラムに詰め、イオン交換水、１Ｍ塩酸の順に２回ずつ洗浄を繰り返した。再結晶した［Ｒｕ（ｂｐｙ）3］（ＰＦ6）2 ０．０４ｇをアセトニトリル５ｃｍ3、水１０ｃｍ3の混合溶液に溶かしカラムに通した。溶液を減圧留去し、水溶性の赤色結晶［Ｒｕ（ｂｐｙ）3］Ｃｌ2・６Ｈ2Ｏを得た。収量は０．０２９ｇ（収率：８２．９％）であった。同定は元素分析、ＦＡＢ−ＭＳにて行った。それぞれの同定結果を表１および表２に示す。
（ＦＳｉＮＰの合成）
蛍光色素として［Ｒｕ（ｂｐｙ）３］２＋を包接した蛍光シリカナノ粒子を逆ミセル法（図６）により合成した。
シクロヘキサン２２．５ｃｍ3、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００ ５．４ｃｍ3、１−ヘキサノール５．４ｃｍ3の混合溶液に、０．０２Ｍ［Ｒｕ（ｂｐｙ）3］水溶液１．５０ｃｍ3を少しずつ加え、超音波ホモジナイザーを用いて分散させた後、スターラーおよびスターラーチップを用いて室温で撹拌した（図７）。１時間後、テトラエトキシシラン（ＴＥＯＳ）０．６０ｃｍ3、３０％アンモニア水１．８０ｃｍ3を加え、室温で２４時間撹拌を続けた。その後、反応液にアセトン１．０ｃｍ3を加えて反応を終了させたところ、赤色透明であった反応液が懸濁した。懸濁液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）し、アセトン（２回）、エタノール（２回）、超純水（２回）でデカンテーションし粒子を洗った（図８）。
（ＦＳｉＮＰ−ＡＰＳの合成）
得られた粒子を以下のスキームに沿ってシランカップリング剤処理し、粒子表面にアミノ基を導入した。
合成した蛍光シリカナノ粒子０．０６０ｇをメタノール（ＭｅＯＨ）１０ｃｍ3中に分散させ、三口フラスコに入れた。これに３−アミノプロピルトリエトキシシラン（ＡＰＳ）０．２４ｇをＭｅＯＨ １０ｃｍ3に混合した溶液を加え、撹拌した。さらに酢酸を３．０ｃｍ3、イオン交換水７ｃｍ3を加え、８０°Ｃで加熱還流した。２４時間後、溶液の一部を減圧留去し、残りの溶液と粒子の混合溶液を遠心分離し（１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）、デカンテーションにより粒子をＭｅＯＨ、超純水の順に２回ずつ洗浄した。溶媒を出来る限り取り除いた後、真空乾燥し、デシケーター内で保存した。
（ｄｐａ−ＨＣＣの合成）
以下のスキームに沿って、ｄｐａ−ＨＣＣを合成した。
アセトニトリル３０ｃｍ3に２，２'−ジピコリルアミン（ｄｐａ）１．０２５ｇ（５．０４ｍｍｏｌ）を溶解後、これに３７％ホルムアルデヒド水溶液を０．４４１ｃｍ3（５．０４ｍｍｏｌ）を加え、８０℃で２時間加熱還流をおこなった。これに７−ヒドロキシクマリン−３−カルボン酸（ＨＣＣ）１．０７２ｇ（５．０９ｍｍｏｌ）をアセトニトリル３０ｃｍ3に溶解させたものを加え、激しく攪拌した。添加直後は白濁したが、攪拌をしていくことで黄色へと変化した。２時間攪拌したところ、淡黄色の沈殿物が析出した。溶媒を吸引濾過し、油状の淡黄色の沈殿物を得た。水／クロロホルム溶液で抽出をおこない、水相を取り除き有機層を回収した。回収した有機層をさらに水で２回洗浄した後、１００℃で４時間加熱乾燥をおこない、淡黄色の粉末状固体としてｄｐａ−ＨＣＣを得た。収量は１．３０６ｇ、収率は６２％であった。同定は1Ｈ ＮＭＲと元素分析にておこなった。
1Ｈ ＮＭＲ測定結果およびこれによる同定結果を図９および表３に示す。また、元素分析による同定結果を表４に示す。
（ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰの合成）
以下のスキームに沿って、粒子表面のアミノ基を介してｄｐａ−ＨＣＣを粒子に固定化した。
上述した方法で合成したｄｐａ−ＨＣＣ ４２．７ｍｇと、ＦＳｉＮＰ−ＡＰＳ １０６．０ｍｇを５０ｃｍ3三角フラスコにはかり取り、ＭｅＯＨ ３０ｃｍ3に分散させ、室温下で攪拌した。ＤＭＴ−ＭＭ（国産化学社製）２９．７ｍｇを溶液に加え、室温で１６時間攪拌した。溶液の一部を減圧留去し、残りの溶液と粒子の混合溶液を遠心分離（１００００ｒｐｍ、１０ｍｉｎ）にかけ、デカンテーションにより、粒子をＭｅＯＨ、精製水の順に２回ずつ洗浄した。溶媒を出来る限り取り除いた後真空乾燥し、デシケーター内で保存した。
（実験例２）
本例では、実験例１で得られた粒子を用いて細菌（黄色ブドウ球菌：Staphylococcus aureus（Ｓ．ａ．））の捕集および検出をおこなった。
（細菌の培養）
ＬＢ寒天培地用試薬の調製は以下の手順でおこなった。すなわち、Bacto-triptone（ＢＤ社製）１０ｇ、Bacto-yeast-extract（ＢＤ社製）５ｇ、ＮａＣｌ １０ｇをポリタンクに入れ、全量を１Ｌとし、室温でよく撹拌した。この溶液をＡｇａｒ（和光純薬工業社製、細菌培地用）７．５ｇの入った三角フラスコに５００ｍＬ加え、同じものをもう１つ調製した。
また、以下の手順でＬＢプレートを作製した。すなわち、溶液をオートクレーブに１ｈｒかけ、液体滅菌を行った。その後、７０〜６０℃まで放冷させた。この時、寒天が底に沈殿している場合もあるので軽くゆすった。溶液が冷めないうちにシャーレに入れ、固まらせた。
細菌の培養は以下のようにした。白金耳をアルコール消毒し、炎であぶって殺菌した。冷凍してある黄色ブドウ球菌の表面をつついて一部をとり、プレートの寒天培地を傷つけないように線描した。線描した部分をさらに引き伸ばすように数回おこない、適当な間隔でコロニーが形成できるようにした。これを２４ｈｒインキュベートした。
その後、５０ｃｍ3のファルコンチューブに１０ｃｍ3のＬＢ培地を加えた。これに、培養した細菌の１つのコロニーを爪楊枝でつつき、溶液にとかした。これを２４ｈｒインキュベートした。なお、この操作においても、アルコールおよびガスバーナーでの殺菌をおこなった。
培養した溶液（原液）を１／１０倍に希釈に、６００ｎｍで吸光度測定を行った。換算係数から算出されたＳ．ａ．の菌数は３．６５×１０9個であった。
（ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰとＳ．ａ．との応答評価）
実験例１で得られた構造体の分散液およびその各種金属錯体（以下、これらを「プローブ」ともいう。）とＳ．ａ．との応答を見るため、６種類の液体試料を調製した。液体試料の全量は１００μＬ（プローブ５０μＬ＋Ｓ．ａ．５０μＬ）であり、そのうち１０μを観察に使用した。
（試料１：図１０のＡ群に使用） ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ、Ｂｕｆｆｅｒ、ＤＡＰＩ
（試料２：図１０のＢ群に使用） Ｚｎ−ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ、Ｂｕｆｆｅｒ、ＤＡＰＩ
（試料３：図１１のＣ群に使用） Ｃｕ−ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ、Ｂｕｆｆｅｒ
（試料４：図１１のＤ群に使用） Ｃｕ−ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ、Ｂｕｆｆｅｒ、ＤＡＰＩ
試料１〜試料４に配合した成分は、以下の通りである。
Ｂｕｆｆｅｒ：ＬＢ培地から取り出した菌を遠心分離器により沈殿させ、溶液をＢｕｆｆｅｒ（５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３）／０．１Ｍ ＮａＣｌ）で洗浄したもの。洗浄は３回行った。
ＤＡＰＩ：4',6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride、励起波長３６０ｎｍ、蛍光波長４６０ｎｍ。
ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ：ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ複合体１ｍｇ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３）、０．１Ｍ ＮａＣｌ
Ｚｎ−ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ：ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ複合体１ｍｇ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３）、５ｍＭ Ｚｎ（ＮＯ3）2、０．１Ｍ ＮａＣｌ
Ｃｕ−ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ：ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ複合体１ｍｇ、５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ＝７．３）、５ｍＭ Ｃｕ（ＮＯ3）2、０．１Ｍ ＮａＣｌ
Ｓ．ａ．の培地に試料１〜試料４を加えて１時間インキュベートした後の様子を観察した。
結果を図１０および図１１に示す。図１０および図１１中のスケールバーは５０μｍを示す。
図１０のＡ群およびＢ群、ならびに、後述する図１１のＣ群およびＤ群において、４つの像は、左から順に、微分干渉顕微鏡（Differential interference contrast：ＤＩＣ）像、ＦＳｉＮＰによる蛍光染色像、（ＤＡＰＩによる核染色時の）蛍光観察像、および、これらの像のマージ（重ね合わせ）である。
図１０は、ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ ｃｏｍｐｌｅｘ（Ａ群、試料１）とＺｎ−ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ ｃｏｍｐｌｅｘ（Ｂ群、試料２）の結果を示す図である。
図１０より、Ｓ．ａ．にｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ ｃｏｍｐｌｅｘを加えても凝集は見られなかった（Ａ群）。一方、Ｚｎ−ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ ｃｏｍｐｌｅｘを添加すると（Ｂ群）、凝集が見られた。これは認識部位をＭ−ｄｐａと金属錯体にすることで、細菌表面のリン酸部位をとらえることができたことを意味する。
また、図１１は、Ｃｕ−ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ ｃｏｍｐｌｅｘについて結果を示す図である。図１１中のＣ群は試料３すなわちＤＡＰＩ染色しなかったもの、Ｄ群は試料４すなわちＤＡＰＩ染色したものであるが、どちらも大きな凝集体を形成した。
また、本発明者の検討により、ｄｐａ−ＨＣＣを粒子に固定化しない状態での評価において、Ｃｕ錯体はＺｎ錯体よりもリン酸誘導体の選択性が高いことが明らかになった。本例において、シリカ粒子に修飾してマクロ構造にしても、同様の傾向が認められる結果となった。
また、図１０および図１１に示したスケールバーは５０μｍであり、細菌の凝集体はかなり大きいことがわかった。
（実験例３）
本例では、実験例２で用いたＣｕ−ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰとＳ．ａ．との相互作用の経時変化を観察した。
実験例２に準じて、Ｓ．ａ．培地に試料３のＣｕ−ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰを添加し、０〜１０ｍｉｎ連続撮影をすることにより、複合体の形成の様子を観察した。
その結果、Ｃｕ−ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰの添加前ではＳ．ａはブラウン運動していた。添加後、ある粒経まで凝集するが、凝集により動きが鈍くなり成長しなくなった。変化が見られなくなったため、懸濁すると再び大きな凝集体を形成した。
この結果より、凝集メカニズムとして、Ｃｕ−ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ添加後、細菌はある小規模の集団を形成し、外部刺激によりさらに大きく成長する。この凝集は３次元のネットワークを形成しており、大きく成長しない限り沈殿しないこともわかった。なお、凝集体は大きいものは肉眼でも観察できた。
（実験例４）
本例では、実験例２で用いた試料１（ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ）および試料３（Ｃｕ−ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ ｃｏｍｐｌｅｘ）において、各試料濃度を固定するとともにＳ．ａ．の濃度を変化させて、凝集体の形成の有無を確認した。
Ｓ．ａ．の濃度（細菌数）は、以下の４種とした。
原液：４．６×１０9個（波長６００ｎｍで吸光度０．６）
１／１０：４．６×１０8個
１／１００：４．６×１０7個
１／１０００：４．６×１０6個
その結果、試料１（ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ）については、いずれの細菌濃度においても凝集体の形成は認められなかった。
一方、試料３（Ｃｕ−ｄｐａ−ＨＣＣ／ＦＳｉＮＰ ｃｏｍｐｌｅｘ）については、すべての細菌濃度において凝集体の形成が認められた。
以上の各例の結果は、人工分子が細菌を認識し、細菌同士を連結させて捕集することに成功した世界で最初の報告例と言える。
１００ 構造体
１０１ ナノ粒子
１０２ 細菌
１０３ 細菌表面認識部位
１０４ 凝集体

Claims (9)

  1. ナノ粒子と、
    前記ナノ粒子上に固定化されている、複数の細菌表面認識部位と、
    を含み、
    前記細菌表面認識部位が、前記細菌と相互作用する官能基と、前記細菌との相互作用により光応答性を示す官能基と、を含み、
    前記細菌表面認識部位を介して細菌を連結捕集する、構造体。
  2. ナノ粒子と、
    前記ナノ粒子上に固定化されている、複数の細菌表面認識部位と、
    を含み、
    前記細菌表面認識部位が、ジピコリルアミン／金属錯体、イミノ二酢酸／金属錯体、フェニルボロン酸基およびグアニジノ基からなる群から選択される一種以上を含み、
    前記細菌表面認識部位を介して細菌を連結捕集する、構造体。
  3. 前記ナノ粒子の粒子径が１０ｎｍ以上２００ｎｍ以下である、請求項１または２に記載の構造体。
  4. 前記ナノ粒子が水に分散可能である、請求項１乃至３いずれか一項に記載の構造体。
  5. 前記ナノ粒子が、シリカナノ粒子、デンドリマー、金コロイドおよび量子ドットからなる群から選択される一種以上を含む、請求項１乃至４いずれか一項に記載の構造体。
  6. 前記ナノ粒子が、発光物質および発色物質からなる群から選択される一種以上を内包する前記シリカナノ粒子である、請求項５に記載の構造体。
  7. 前記細菌表面認識部位が、スペーサーを介して前記ナノ粒子に固定化された、請求項１乃至６いずれか一項に記載の構造体。
  8. 請求項１乃至７いずれか一項に記載の構造体を前記細菌に接触させて、前記細菌を前記構造体とともに凝集させるステップを含む、細菌の捕集方法。
  9. 請求項１乃至７いずれか一項に記載の構造体を前記細菌に接触させて、前記細菌を前記構造体とともに凝集させるステップと、
    細菌を構造体とともに凝集させる前記ステップにおける凝集物の形成の有無を検知するステップと、
    を含む、細菌の検出方法。
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