JP6276178B2

JP6276178B2 - シス−５−ヒドロキシ−ｌ−ピペコリン酸の生物学的な製造方法

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Publication number: JP6276178B2
Application number: JP2014521374A
Authority: JP
Inventors: 藤井　匡; 匡藤井; 圭輔田村
Original assignee: Microbiopharm Japan Co Ltd
Current assignee: Microbiopharm Japan Co Ltd
Priority date: 2012-06-13
Filing date: 2013-06-12
Publication date: 2018-02-07
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Also published as: CA2876558C; US20150211035A1; US9611490B2; JPWO2013187438A1; CN111485008A; CA2876558A1; WO2013187438A1; EP2873730A1; EP2873730A4; CN104395466A

Description

本発明は、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生産する能力を有する遺伝子組換え微生物、およびそれらの微生物を用いたシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法に関する。

シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸は、Ｌ−ピペコリン酸にヒドロキシル基が導入された構造を有する修飾アミノ酸の一種であり、医薬品の合成中間原料として有用な物質である。

一方、Ｌ−ピペコリン酸（または２−ピペリジンカルボン酸もしくはＬ−ホモプロリン）の生物学的な製造方法は既に報告されている（非特許文献１、非特許文献２、および特許文献１）。これらの報告においては、以下のポリヌクレオチド(ＤＮＡということもある)を有する大腸菌により、Ｌ−リジンからＬ−ピペコリン酸を製造している。
ａ）Ｌ−リジン６−アミノトランスフェラーゼ酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド
ｂ）ピロリン−５−カルボン酸リダクターゼ酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド

これらの報告では、上記ａ）の例としてフラボバクテリウムルテセンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｕｔｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ３０８４株由来のｌａｔ遺伝子（配列番号１）、上記ｂ）の例として大腸菌由来ｐｒｏＣ遺伝子（配列番号３）が挙げられている。大腸菌は元来ｐｒｏＣ遺伝子を有しているので、ｌａｔ遺伝子が導入されており、該遺伝子を発現する大腸菌はＬ−ピペコリン酸生産能を有する。またリジン特異的透過活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡ、例えば大腸菌由来ｌｙｓＰ遺伝子（配列番号４）をも有する大腸菌により、Ｌ−ピペコリン酸の生産速度が向上したことが報告されている。

アルファルファ根粒菌シノリゾビウム・メリロチ（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）１０２１由来のＣＡＣ４７６８６タンパク質は、Ｌ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する能力を有することが報告されている（非特許文献３）。このアミノ酸配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＣＡＣ４７６８６として登録されている。塩基配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＬ５９１７９２として登録されている（配列番号６）。

他方、ミヤコグサ根粒菌メソリゾビウム・ロチ（Ｍｅｓｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｌｏｔｉ）ＭＡＦＦ３０３０９９由来のＢＡＢ５２６０５タンパク質、またはＣＡＣ４７６８６タンパク質は、Ｌ−プロリンをシス−４−ヒドロキシプロリンに変換する能力を有することが報告されている（特許文献２）。ＢＡＢ５２６０５タンパク質のアミノ酸配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＢＡＢ５２６０５として登録されている。塩基配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＢＡ００００１２として登録されている（配列番号７：ｌｏｔｉ遺伝子）。

WO2001/048216（特許第4516712号） WO2009/139365

Biosci. Biotechnol. Biochem., 66 (3), 622-627, 2002 Biosci. Biotechnol. Biochem., 66 (9), 1981-1984, 2002 Adv. Synth. Catal., 353, 1375-1383, 2011

ＣＡＣ４７６８６タンパク質は、非天然アミノ酸合成の為の有益な酵素であると考えられるが、以下の問題点を有している。
問題点１）このタンパク質を一般的な方法を用いて大腸菌で発現させた場合、不溶化して不活化する。
問題点２）このタンパク質をｉｎｖｉｔｒｏの反応に供した場合、速やかに変性する。
問題点３）このタンパク質をｉｎｖｉｔｒｏの反応に供した場合、Ｌ−ピペコリン酸から、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸と共に、シス−３−ヒドロキシピペコリン酸もほぼ同量蓄積する。

非特許文献３中では、問題点１）を回避しつつ、ＣＡＣ４７６８６タンパク質を大腸菌で発現させるために、コールドショックプロモーターを用い、低温でタンパク質発現を誘導し、ＳｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓｃｏｅｌｉｃｏｌｏｒのＧｒｏＥＬ／ＧｒｏＥＳを共発現させるなどしている。また、問題点２）を回避する方法の一つとして、このタンパク質を発現した大腸菌の生菌体にＬ−ピペコリン酸を供して水酸化させるアイディアを挙げているが、この方法が実際に有効であったかどうかまでは明らかにしていない。問題点３）の回避方法については提示されていない。このように、ＣＡＣ４７６８６タンパク質を発現した大腸菌を用いるシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造には困難が多いと考えられた。

ＢＡＢ５２６０５タンパク質もＣＡＣ４７６８６タンパク質と同様にＬ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する能力を有する可能性が考えられたが、本明細書の実施例で示す通り、ｌｏｔｉ遺伝子にコードされたＢＡＢ５２６０５タンパク質を発現した大腸菌のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生産性は、比較的低いことが分かった。なお、ＢＡＢ５２６０５タンパク質とＣＡＣ４７６８６タンパク質とのアミノ酸配列の同一性は６６％である。

一方、ＥＦＶ１２５１７タンパク質は、セグニリパラス・ルゴサス（Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓｒｕｇｏｓｕｓ）ＡＴＣＣＢＡＡ−９７４由来のタンパク質として、そのアミノ酸配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＥＦＶ１２５１７として登録されている。塩基配列は、データベースＧｅｎＢａｎｋにアクセッション番号ＡＣＺＩ０１０００１８６（ＲＥＧＩＯＮ：１３７８．．２２２９）として登録されている（配列番号８：ｓｈｏｒｔｃｉｓ遺伝子）。ＥＦＶ１２５１７タンパク質はＧｅｎＢａｎｋではアスパルチル／アスパルギニルベータ−水酸化酵素（ａｓｐａｒｔｙｌ／Ａｓｐａｒａｇｉｎｙｌｂｅｔａ−ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ）としてアノテーションされており、本発明の実施例で示す通り、ＥＦＶ１２５１７タンパク質を発現した大腸菌にはＬ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する能力は検出できなかった。しかしながら、ＥＦＶ１２５１７タンパク質のアノテーションよりも４８塩基（１６アミノ酸相当）上流から発現させたポリヌクレオチド（配列番号２：ｃｉｓ遺伝子）にコードされたタンパク質を発現する大腸菌が、Ｌ−ピペコリン酸のシス−５位水酸化酵素活性を有しており、Ｌ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換できることを見出し、本発明を完成した。

本発明は、以下を提供する：
[１] 下記の（A）〜（F）のいずれか一のポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む微生物により、Ｌ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する工程を含む、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物の製造方法：
（A）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（C）配列番号２に記載の塩基配列と少なくとも85％以上の同一性を有し、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（D）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（E）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（F）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[２] 微生物が、Ｌ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびデルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸を基質としてＬ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、発現可能な状態でさらに含み：
Ｌ−リジンを基質として、Ｌ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成し、続いてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドがデルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸へ変換される工程；および
デルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸を基質としてＬ−ピペコリン酸を生成する工程
をさらに含む、[１]に記載の製造方法。
[３] Ｌ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、フラボバクテリウムルテセンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｕｔｅｓｃｅｎｓ）由来である、[２]に記載の製造方法。
[４] 微生物が大腸菌であり、デルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸を基質としてＬ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを元来有する、[２]または[３]に記載の製造方法。
[５] 下記の（A）〜（F）のいずれか一のポリヌクレオチド：
（A）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（C）配列番号２に記載の塩基配列と少なくとも85％以上の同一性を有し、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（D）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（E）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（F）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
[６] [５]に記載のポリヌクレオチドを含む、形質転換用ベクター。
[７] Ｌ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、[６]に記載の微生物の形質転換用ベクター。
[８] α−ケトグルタル酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質および／またはデルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸を基質としてＬ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、[６]または[７]に記載の微生物の形質転換用ベクター。
[９] [６]〜[８]のいずれか一に記載のベクターにより形質転換された、遺伝子組換え微生物。
[１０] [５]に記載のポリヌクレオチド、およびＬ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドにより形質転換され、Ｌ−リジンを出発物質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する能力を有する、遺伝子組換え大腸菌。
[１１] 下記の（d）〜（f）のいずれか一のタンパク質：
（d）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（e）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（f）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
[１２] Ｌ−ピペコリン酸に、[１１]に記載のタンパク質を作用させ、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する工程を含む、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物の製造方法。
[１３] Ｌ−リジンに、Ｌ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を作用させ、Ｌ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成し、続いてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドがデルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸へ変換される工程；および
得られたデルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸に、デルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸を基質としてＬ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を作用させ、Ｌ−ピペコリン酸を生成する工程
をさらに含む、[１２]に記載の製造方法。
[１４] シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を培養液１Ｌ当り５０ｍｇ以上生産する能力を有する、[９]または[１０]に記載の遺伝子組換え微生物または遺伝子組換え大腸菌。

本発明の製造方法の一例、Ｌ−リジンからシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸への変換経路プラスミドｐＲＳＦ−Ｃｉｓ（実施例１参照）ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−Ｃｉｓ株の生産物のＨＰＬＣチャート（実施例２参照）ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−Ｃｉｓ株の生産物のＬＣ／ＭＳチャート（実施例２参照）。上３点は２００μｇ/ｍＬ標準品、下２点はＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−Ｃｉｓ株が生産したもの。酵素ｌａｔ、酵素ｃｉｓ、変異ｃｉｓの塩基配列およびアミノ酸配列

本発明は、は、下記の式（Ｉ）構造式で表されるシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物の製造方法を提供する。
本発明のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法は下記の工程（１）〜（３）を含みうる：
（１）Ｌ−リジンを基質として、Ｌ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成し、続いてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドがデルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸へ変換される工程；
（２）デルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸を基質としてＬ−ピペコリン酸を生成する工程；および
（３）Ｌ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する工程。

本発明のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法は、上述した工程（３）を含む。工程（３）は、Ｌ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質、すなわちＬ−ピペコリン酸シス−５位水酸化酵素（Ｃｉｓ）を用いて、Ｌ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する工程である。この工程は、ｃｉｓ遺伝子を有する生物にＣｉｓを発現させ、生物学的に実施することができる。

本発明においては、ｃｉｓ遺伝子またはタンパク質として、下記の（A）〜（F）のいずれか一のポリヌクレオチド、または下記の（d）〜（f）のいずれか一のタンパク質を用いることができる。
（A）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（C）配列番号２に記載の塩基配列と少なくとも85％以上の同一性を有し、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（D）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（E）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（F）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（d）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（e）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（f）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。

配列表の配列番号２および２５に、本発明者らが特定し、本明細書の実施例で用いたｃｉｓの塩基配列およびアミノ酸配列を示した。

配列番号２５の全長のＣｉｓタンパク質のアミノ酸配列について、同一性の高い配列を検索したところ、配列番号６の塩基配列によりコードされるＣＡＣ４７６８６タンパク質（本発明では、「Ｍｅｌｉｌｏｔｉタンパク質」ということもある。）のアミノ酸配列に対して３４％、配列番号７の塩基配列によりコードされるＢＡＢ５２６０５タンパク質（本発明では、「Ｌｏｔｉタンパク質」ということもある。）のアミノ酸配列に対して３３％の同一性が認められた。詳細には、前者に関しては、Score = 163 bits (413), Expect = 6e-45, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 93/275 (34%), Positives = 146/275 (53%), Gaps = 9/275 (3%)であり、後者に関しては、Score = 159 bits (402), Expect = 3e-43, Method: Compositional matrix adjust. Identities = 87/260 (33%), Positives = 139/260 (53%), Gaps = 6/260 (2%)であった。これらより高い同一性を有する配列は認められなかった。なお、同一性の確認には、NCBIより提供されているblastpを用いた。

実施例で用いたＣｉｓタンパク質は、ＥＦＶ１２５１７タンパク質（本発明では、「Ｓｈｏｒｔｃｉｓタンパク質」ということもある。配列番号８の塩基配列によりコードされる。ＧｅｎＢａｎｋではアスパルチル／アスパルギニルベータ−水酸化酵素としてアノテーションされている。）の４８塩基、すなわち１６アミノ酸上流部分を含んで構成されるタンパク質である。しかし、Ｓｈｏｒｔｃｉｓタンパク質自体には、Ｌ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する能力は知られておらず、また実際にも検出できなかった（実施例２参照）。

また、実施例で用いたＣｉｓタンパク質と３４％のアミノ酸配列同一性を有するＭｅｌｉｌｏｔｉタンパク質は、Ｌ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する能力を有することが知られている（前掲非特許文献３）が、すでに述べたように種々の問題点を有することが分かっている。一方で、実施例で用いたＣｉｓタンパク質と３３％のアミノ酸配列同一性を有するＬｏｔｉタンパク質は、本発明者らの検討によると、大腸菌で発現させた場合に、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生産性が比較的低いことがわかっている（実施例３参照）ほか、Ｌｏｔｉ（ＢＡＢ５２６０５）タンパク質とＭｅｌｉｌｏｔｉ（ＣＡＣ４７６８６）タンパク質とのアミノ酸配列の同一性は６６％であり、Ｌｏｔｉタンパク質の大腸菌による発現、得られたタンパク質を用いたシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造には、Ｍｅｌｉｌｏｔｉタンパク質と同様の困難を抱えていることが推測される。

本発明の一態様においては、ｃｉｓ遺伝子およびタンパク質は、セグニリパラス属由来であり得、より特定すると、セグニリパラス・ルゴサス由来であり得、さらに特定すると、セグニリパラス・ルゴサス（Ｓｅｇｎｉｌｉｐａｒｕｓｒｕｇｏｓｕｓ）ＡＴＣＣＢＡＡ−９７４由来であり得る。

上述した（B）〜（F）のポリヌクレオチドおよび（e）〜（f）のタンパク質は、実施例で用いたｃｉｓ遺伝子およびＣｉｓタンパク質の変異体というべきものである。このような変異体は、当業者であれば、実施例で用いたＣｉｓタンパク質に関するモチーフ等の情報や、上流の１６アミノ酸配列が欠如している場合には所望の活性がないことに配慮し、適宜設計することができる。本発明者らの検討によると、実施例で用いたＣｉｓタンパク質は、Aspartyl/Asparaginyl beta-hydroxylase領域（Position: 26..174）とL-proline 3-hydroxylase, C-terminal領域(Position: 190..274)を有することがわかっている。なおモチーフ解析は、配列が示されていれば、公開されているwebsite、例えば、GenomeNet (http://www.genome.jp/)）におけるPfam等を利用して、当業者であれば適宜実施でき、また、あるタンパク質がＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するか否かは、当業者であれば、本明細書の記載を参照にして、適宜評価することができる。

本発明の一態様においては、変異型Ｃｉｓが用いられる。変異型Ｃｉｓの例は、本明細書の実施例で用いられている、配列番号２３の塩基配列からなるポリヌクレオチドによってコードされる、配列番号２６のアミノ酸配列からなるタンパク質である。配列番号２３の塩基配列は、実施例で用いたｃｉｓの塩基配列（配列番号２）とは２塩基（８９７塩基中）が異なり、配列番号２６のアミノ酸配列は、実施例で用いたＣｉｓのアミノ酸配列（配列番号２５）とは１アミノ酸（２９９アミノ酸中）が異なる。配列番号２６のアミノ酸配列と配列番号２５のそれとの同一性は、９９．７％である。

実施例で用いた変異型Ｃｉｓのアミノ酸配列（配列番号２６）はまた、配列番号６の塩基配列によりコードされるＭｅｌｉｌｏｔｉタンパク質のアミノ酸配列に対して３４％、配列番号７の塩基配列によりコードされるＬｏｔｉタンパク質のアミノ酸配列に対して２９％、同一である。
本発明でポリヌクレオチドに関し、「ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする」というときは、特に記載した場合を除き、いずれのポリヌクレオチドにおいても、ハイブリダイゼーションの条件は、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．２ｎｄｅｄ．（Ｓａｍｂｒｏｏｋｅｔａｌ．，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ）およびＨｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｏｆＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＩｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎｏｎＳｏｌｉｄＳｕｐｐｏｒｔｓ（ＡＮＡＬＹＴＩＣＡＬＢＩＯＣＨＥＭＩＳＴＲＹ１３８，２６７−２８４（１９８４））の記載に従い、取得しようとするポリヌクレオチドに合わせて適宜選定することができる。例えば８５％以上の同一性を有するＤＮＡを取得する場合、２倍濃度のＳＳＣ溶液および５０％ホルムアミドの存在下、４５℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる）を用い、６０℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。また９０％以上の同一性を有するＤＮＡを取得する場合、２倍濃度のＳＳＣ溶液および５０％ホルムアミドの存在下、５０℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍濃度のＳＳＣ溶液）を用い、６５℃でフィルターを洗浄する条件を用いればよい。

また、本発明でタンパク質に関し、「１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加されたアミノ酸配列」というときの置換等されるアミノ酸の個数は、特に記載した場合を除き、いずれのタンパク質においても、そのアミノ酸配列からなるタンパク質が所望の機能を有する限り特に限定されないが、１〜９個または１〜４個程度であるか、性質の似たアミノ酸への置換であれば、さらに多くの個数の置換等がありうる。このようなアミノ酸配列に係るポリヌクレオチドまたはタンパク質を調製するための手段は、当業者にはよく知られている。

本発明で塩基配列（ヌクレオチド配列ということもある。）またはアミノ酸配列に関し「「同一性」というときは、特に記載した場合を除き、いずれの塩基配列またはアミノ酸配列においても、２つの配列を最適の態様で整列させた場合に、２つの配列間で共有する一致したヌクレオチドまたはアミノ酸の個数の百分率を意味する。すなわち、同一性＝（一致した位置の数／位置の全数）×１００で算出でき、市販されているアルゴリズムを用いて計算することができる。また、このようなアルゴリズムは、Ａｌｔｓｃｈｕｌｅｔａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５（１９９０）４０３−４１０に記載されるＮＢＬＡＳＴおよびＸＢＬＡＳＴプログラム中に組込まれている。より詳細には、塩基配列またはアミノ酸配列の同一性に関する検索・解析は、当業者には周知のアルゴリズムまたはプログラム（例えば、BLASTN、BLASTP、BLASTX、ClustalW）により行うことができる。プログラムを用いる場合のパラメーターは、当業者であれば適切に設定することができ、また各プログラムのデフォルトパラメーターを用いてもよい。これらの解析方法の具体的な手法もまた、当業者には周知である。

本明細書において、塩基配列またはアミノ酸配列に関し、同一性というときは、特に記載した場合を除き、いずれの場合も、少なくとも７０％、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７．５％以上さらに好ましくは９９％以上の配列の同一性を指す。

本発明で用いるポリヌクレオチドまたは遺伝子、およびタンパク質または酵素は、当業者であれば、従来技術を利用して調製することができる。

本発明のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法は、上述した工程（１）を含んでもよい。工程（１）は、Ｌ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質、すなわちＬ−リジン６−アミノトランスフェラーゼ（Ｌａｔ）を用いて、Ｌ−リジンを基質として、Ｌ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成し；続いてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドがデルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸へ変換される工程である。この工程は、ｌａｔ遺伝子を有する生物にＬａｔを発現させ、生物学的に実施することができる。

本発明においては、ｌａｔ遺伝子またはタンパク質として、下記の（A’）〜（F’）のいずれか一のポリヌクレオチド、または下記の（d’）〜（f’）のいずれか一のタンパク質を用いることができる。
（A’）配列番号１に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（B’）配列番号１に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（C’）配列番号１に記載の塩基配列と少なくとも85％以上の同一性を有し、かつＬ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（D’）配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（E’）配列番号２４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（F’）配列番号２４に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
（d’）配列番号２４に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（e’）配列番号２４に記載のアミノ酸配列において１若しくは複数のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（f’）配列番号２４に記載のアミノ酸配列と少なくとも85％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。

配列表の配列番号１および２２に、フラボバクテリウム・ルテセンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｕｔｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ３０８４由来のｌａｔの塩基配列およびアミノ酸配列を示した。

本発明においては、ｌａｔ遺伝子またはタンパク質として、種々の生物由来のものを用いうる。本発明の一態様においては、ｌａｔ遺伝子およびタンパク質は、フラボバクテリウム属由来であり得、より特定すると、フラボバクテリウム・ルテセンス由来であり得、さらに特定すると、フラボバクテリウム・ルテセンスＩＦＯ３０８４由来であり得る。

本発明のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法は、上述した工程（２）を含んでもよい。工程（２）は、デルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸を基質としてＬ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質、すなわちピロリン酸−５−カルボン酸還元酵素（ＰｒｏＣ）を用い、デルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸を基質としてＬ−ピペコリン酸を生成する工程である。この工程は、ｐｒｏＣ遺伝子を有する生物を用い、生物学的に実施することができる。

配列表の配列番号３および２５に、大腸菌由来のｐｒｏＣの塩基配列およびアミノ酸配列を示した。また、ｐｒｏＣについては、前掲特許文献１を参照することができる。

ＰｒｏＣは、大腸菌が元来有する酵素である。本発明の製造方法を大腸菌を用いて実施する場合は、工程（２）のための酵素として、大腸菌が元来有するＰｒｏＣを利用してもよく、強化等の目的で、外来のＰｒｏＣを利用してもよい。本発明で「発現可能な状態で含む」というときは、特に記載した場合を除き、そのポリヌクレオチドは外来のものに限られず、元来有しているものも含む。

本発明のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法は、上記の工程（１）〜（３）のいずれかまたはすべてを、生物学的に実施することができる。生物学的実施の典型的な例は、必要な遺伝子を発現可能な状態で含む微生物細胞内で実施することである。シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生物学的な製造方法に用いるための微生物は、宿主微生物を適切に構成されたベクターにより形質転換することにより得ることができる。本発明は、このような遺伝子組換え微生物、ベクターをも提供する。本発明の実施のために用いられる生物の例は微生物であり、より具体的な例は、原核生物であり、さらに具体的な例は、大腸菌である。

本発明で「遺伝子組換え微生物」というときは、特に記載した場合を除き、遺伝子組換え技術を用いて特定の微生物に別の生物由来の遺伝子を導入した微生物（細菌、放線菌、酵母、糸状菌等）を意味し、それに用いる遺伝子導入の手法は、プラスミド等のベクターを用いた遺伝子組換えだけでなく、相同組換え等の手法も包含する。

本発明により、Ｌ−リジン６−アミノトランスフェラーゼ酵素活性を有するタンパク質（Ｌａｔ）、ピロリン−５−カルボン酸リダクターゼ酵素活性を有するタンパク質（ＰｒｏＣ）、およびＬ−ピペコリン酸のシス−５位水酸化酵素活性を有するタンパク質（Ｃｉｓ）それぞれをコードする遺伝子を発現可能に有しており、Ｌ−リジンからシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を直接生産することが可能な遺伝子組換え微生物を得ることができる。また、そのような遺伝子組換え微生物を培養し、培養液中から採取することによりシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を効率よく生産することができる。

本発明により提供される遺伝子組換え微生物は、いずれの態様においても、リジン特異的透過タンパク質活性を有するタンパク質（ＬｙｓＰ）をコードする遺伝子を発現可能に有していてもよい。Ｌ−ピペコリン酸の生物学的な製造方法においては、ＬｙｓＰの利用により、Ｌ−ピペコリン酸の生産速度が向上したことが報告されており、同様の観点から、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生物学的な製造方法においても、ＬｙｓＰが有用でありうる。配列番号４に大腸菌由来ｌｙｓＰ遺伝子の塩基配列を示した。

本発明により提供される遺伝子組換え微生物は、いずれの態様においても、さらにα−ケトグルタル酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子を発現可能な状態で含んでいてもよい。Ｌ−ピペコリン酸シス−５位水酸化酵素に代表されるアミノ酸水酸化酵素類は、その水酸化反応に際しα−ケトグルタル酸を要求する（非特許文献３）。また、Ｌ−リジン６−アミノトランスフェラーゼもそのアミノ基転移反応に際しα−ケトグルタル酸を要求し、それをグルタミン酸に変換することが知られている（ＥＣ２．６．１．３６）。従って、これらのタンパク質が発現可能な微生物を利用してＬ−リジンからＬ−ピペコリン酸を製造する際には、α−ケトグルタル酸を再生することが重要であることが想像される。

グルタミン酸をα−ケトグルタル酸に再生する酵素としてはグルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＥＣ１．４．１．２）が知られており、この酵素による反応はＬ−リジン６−アミノトランスフェラーゼによる反応と共役しうる。配列番号５に、枯草菌バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｕｂｔｉｌｉｓ）ｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｔｒ．１６８由来のｒｏｃＧ遺伝子の塩基配列を示した。

以下、本発明の実施態様についてさらに具体的に説明する。

本発明のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生物学的な製造方法に用いる、Ｌ−ピペコリン酸のシス−５位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは、当該技術分野で周知の方法（例えば、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．２ｎｄｅｄに記載されたコロニーハイブリダイゼーション法）に従って、適切な微生物の菌体から得ることができる。このような微生物の好ましい例として、セグニリパラス属に属する菌株、より詳細にはセグニリパラス・ルゴサスに属する菌株、より具体的には、セグニリパラス・ルゴサスＡＴＣＣＢＡＡ−９７４を挙げることができる。または、本発明の実施例のように、Ｌ−ピペコリン酸のシス−５位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするＤＮＡを人工的に合成しても良い。

実施例で人工合成した、ＥＦＶ１２５１７タンパク質のアノテーションよりも４８塩基（１６アミノ酸相当）上流から発現させたＬ−ピペコリン酸のシス−５位水酸化酵素活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドは配列表の配列番号２に示すとおりである。この配列番号２で示されるＤＮＡには、ｃｉｓ（塩基１〜塩基８９７）のオープン・リーディング・フレーム（ＯＲＦ）が含まれている。

本発明の一態様である組換え体は、Ｌ−ピペコリン酸の生合成に関与する酵素（例えば、Ｌａｔ、ＰｒｏＣ、ＬｙｓＰ、ＲｏｃＧ）をコードするポリヌクレオチド、およびＬ−ピペコリン酸シス−５位水酸化酵素（Ｃｉｓ）をコードするポリヌクレオチドを保有する遺伝子組換え微生物であり、宿主微生物にこれらのＤＮＡの両方を組み込む方法により作製することができる。

宿主は、目的のＤＮＡを組み込むことができ、目的のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生産できる微生物であれば特に制限はなく使用できる。好ましい微生物として大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に属する菌株、例えば大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株等を挙げることができる。

宿主に外来のポリヌクレオチドを組み込み発現させるための手段には、特に制限はないが、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ．２ｎｄｅｄ、ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ（ｅｄｉｔｅｄｂｙＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．Ａｕｓｕｂｅｌｅｔａｌ．，１９８７）等に記載された方法を用いて行うことができる。宿主、プラスミド−ベクター系は、目的のポリヌクレオチドが宿主中で安定に保持、発現できる系であれば特に制限はない。またプラスミドは、目的のポリヌクレオチド以外に、自律複製配列、プロモーター配列、ターミネーター配列、薬剤耐性遺伝子等を含んでいてもよく、プラスミドの種類としては、自律複製性プラスミドだけでなく、使用が予定される宿主のゲノムの一定領域と相同の配列をもつ組込み型プラスミドであってもよい。目的のポリヌクレオチドを組み込む部位は、プラスミド上または宿主微生物のゲノム上のいずれでもあってもよい。

宿主として大腸菌を用いる場合は、自律複製型ベクターとしてｐＵＣ１９やｐＲＳＦＤｕｅｔ−１等を、プロモーター配列としてはｌａｃやＴ７等を、ターミネーター配列としては、ｌａｃＺｔｅｒｍｉｎａｔｏｒやＴ７ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ等を、薬剤耐性遺伝子としてはアンピシリン耐性遺伝子やカナマイシン耐性遺伝子等を、それぞれ挙げることができる。

遺伝子組換え大腸菌で本発明を実施する場合、Ｌ−ピペコリン酸の生合成に関与するタンパク質のうちのＬａｔ、およびＣｉｓの導入は重要であるが、ＰｒｏＣ、ＬｙｓＰおよびＲｏｃＧの導入の適否は、目的生産物の量、同時に生産されるＬ−ピペコリン酸の有無および程度、出発物質であるＬ−リジンの利用率等を考慮し、適宜設計することができる。

このようにして調製した遺伝子組換え微生物を培養し、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生産性を、従来技術の方法の方法により評価し、適切な組換体を選択することにより、有用なシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生産株を得ることができる。生産物の測定方法は、本発明の実施例の記載の方法にしたがってもよい。

本発明のシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生物学的な製造方法は、典型的には遺伝子組換え微生物を培養することにより実施される。微生物の培養条件は、当業者であれば、用いる微生物に応じ、適宜設計することができる。宿主として大腸菌を用いる場合、必要に応じ、選択マーカーとしての抗生物質を含む汎用な培地に適切な量の微生物を接種し、２０℃〜４０℃で、６時間〜７２時間、好ましくは９時間〜６０時間、より好ましくは１２時間〜４８時間、必要に応じ、１００〜４００ｒｐｍで撹拌または振とうしながら培養し、菌体を増殖させることができる。この培養中または培養後に、出発物質としてのＬ−リジンまたはその塩、必要に応じ、α−ケトグルタル酸またはその塩、さらに必要に応じ、適切な誘導物質（例えば、ｉｓｏｐｒｏｐｙｌｔｈｉｏ−β−ｇａｌａｃｔｏｓｉｄｅ（ＩＰＴＧ））を供給し、さらに２０℃〜４０℃で、３時間〜７２時間、好ましくは４時間〜６０時間、より好ましくは６時間〜４８時間、必要に応じ、１００〜４００ｒｐｍで撹拌または振とうすることにより、培養液中に目的物質が得られる。Ｌ−リジン等の供給のタイミングや、培養の終点は、当業者であれば、目的物質の生産量等を勘案し、適宜決定できるが、事前に行った小スケールでの培養結果に基づいて、あらかじめ決定しておいた時間が経過した際に、Ｌ−リジン等を供給し、また培養を終了することができる。
Ｌ−リジンの初発濃度は、例えば２〜３２ｇ／Ｌ、より特定すると４〜１６ｇ／Ｌとすることができ、α−ケトグルタル酸の初発濃度は、例えば０〜１６ｇ／Ｌ、より特定すると０〜８ｇ／Ｌとすることができる。あるいはα−ケトグルタル酸の初発濃度は、例えば１〜１６ｇ／Ｌ、より特定すると２〜８ｇ／Ｌとすることができる

本発明の遺伝子組換え大腸菌の好ましい例は、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を培養液１Ｌ当り５０ｍｇ以上生産する能力を有する、遺伝子組換え大腸菌である。

本発明では、「シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物」のうち、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を例に説明することがあるが、その説明は、特に記載した場合を除き、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物にも当てはまり、また当業者であれば、適宜必要な工程を加えて、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の製造方法を、その薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物の製造方法に改変できる。なお、本発明で「薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物」というときは、塩には、アルカリ金属塩（例えばナトリウム塩、カリウム塩）、アルカリ土類金属塩（例えばマグネシウム塩、カルシウム塩）、アンモニウム塩、モノ−、ジ−またはトリ−低級（アルキルまたはヒドロキシアルキル）アンモニウム塩（例えばエタノールアンモニウム塩、ジエタノールアンモニウム塩、トリエタノールアンモニウム塩、トロメタミン塩）、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、硝酸塩、リン酸塩、硫酸塩、ギ酸塩、酢酸塩、クエン酸塩、シュウ酸塩、フマル酸塩、マレイン酸塩、コハク酸塩、リンゴ酸塩、酒石酸塩、トリクロロ酢酸塩、トリフルオロ酢酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、メシチレンスルホン酸塩およびナフタレンスルホン酸塩が含まれる。
また、塩は、無水物、または溶媒和物であってよく、溶媒和物には、水和物、メタノール和物、エタノール和物、プロパノール和物、および２−プロパノール和物が含まれる。

以下に実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

〔実施例１.ｐＲＳＦｄｕｅｔ−Ｃｉｓの構築〕
配列番号１の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｃｏＩサイトを付加したプライマーｌａｃ−ｌａｔ−ＮｃｏＦ２（配列番号９参照）および５’末端にＳｐｅＩサイトを付加したプライマーｌａｔ−ＸｈｏＲ（配列番号１０参照）を設計し、作成した。次に、この２種のプライマーとフラボバクテリウムルテセンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｕｔｅｓｃｅｎｓ）ＩＦＯ３０８４株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応は、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｖｅｒ．２（ＴＯＹＯＢＯ社）を用い、変性を９８℃２０秒間、アニーリングを６０℃２０秒間、伸長を６８℃９０秒間行う２段階の反応を３０回繰り返した。このＰＣＲ増幅反応液からｌａｔを含む約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片をＷｉｚａｒｄＰＣＲＰｒｅｐｓＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ（Ｐｒｏｍｅｇａ社）によって回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＸｈｏＩで消化したものをｌａｔ断片とした。

配列番号４の塩基配列を参考にして、５’末端にＸｈｏＩサイトを付加したプライマーｌｙｓＰ−ＳＤ−ＸｈｏＦ（配列番号１１参照）および５’末端にＫｐｎＩサイトを付加したプライマーｌｙｓＰ−ＫｐｎＲ（配列番号１２参照）を設計し作成した（ＳＩＧＭＡＧＥＮＯＳＹＳ社）。次に、この２種のプライマーと大腸菌Ｋ１２由来ＪＭ１０９株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて上記と同様にＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からｌｙｓＰを含む約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＸｈｏＩとＫｐｎＩで消化したものをｌｙｓＰ断片とした。

配列番号３の塩基配列を参考にして、５’末端にＫｐｎＩサイトを付加したプライマーｐｒｏＣ−ＳＤ−ＫｐｎＦ（配列番号１３参照）および５’末端にＢａｍＨＩサイトを付加したプライマーｐｒｏＣ−ＢａｍＲ（配列番号１４参照）を設計し作成した。次に、この２種のプライマーと大腸菌Ｋ１２ＪＭ１０９株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて上記と同様にＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からｐｒｏＣを含む約１．０ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＫｐｎＩとＢａｍＨＩで消化したものをｐｒｏＣ断片とした。

ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１（Ｎｏｖｅｒｇｅｎ社）を制限酵素ＮｃｏＩとＢａｍＨＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｌａｔ断片、ｌｙｓＰ断片、およびｐｒｏＣ断片をＤＮＡＬｉｇａｔｉｏｎＫｉｔｖｅｒ．２（タカラバイオ社）を用いて四者ライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（タカラバイオ社）を形質転換することにより、ｌａｔ、ｌｙｓＰ、およびｐｒｏＣ各遺伝子を有するプラスミドｐＲＳＦ−ＬＬＰを構築した。

次に、配列番号５の塩基配列を参考にして、５’末端にＢａｍＨＩサイトを付加したプライマーｒｏｃＧ−ＳＤ−ＢａｍＦ（配列番号１５参照）および５’末端にＸｂａＩサイトを付加したプライマーｒｏｃＧ−ＸｂａＲ（配列番号１６参照）を設計し作成した。次に、この２種のプライマーと枯草菌バチルス・サブチリスｓｕｂｓｐ．ｓｕｂｔｉｌｉｓｓｔｒ．１６８株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いて上記と同様にＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からｒｏｃＧを含む約１．３ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩで消化したものをｒｏｃＧ断片とした。

ｐＲＳＦ−ＬＬＰを制限酵素ＢａｍＨＩとＸｂａＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｒｏｃＧ断片をライゲーションし、ｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、およびｒｏｃＧ各遺伝子を有するプラスミドｐＲＳＦ−ＰＡを構築した。

配列番号８の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｄｅＩサイトを付加したプライマーｓｅｇｎｉ−ｓｈｏｒｔ−ＮｄｅＦ（配列番号１７参照）および５’末端にＢｇｌＩＩサイトを付加したプライマーｓｅｇｎｉ−ｃｉｓ−ＢｇｌＲ（配列番号１８参照）を設計し作成した。次に、配列番号８の塩基配列の通りに人工遺伝子合成を行い（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）、これをテンプレートとして用いて上記と同様にＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からｃｉｓを含む約０．９ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩで消化したものをｃｉｓＳｈｏｒｔ断片とした。

ｐＲＳＦ−ＰＡを制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｃｉｓＳｈｏｒｔ断片をライゲーションし、ｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧの各遺伝子、およびＥＦＶ１２５１７タンパク質をコードする遺伝子（ｓｈｏｒｔｃｉｓ）を有するプラスミドｐＲＳＦ−ＣｉｓＳｈｏｒｔを構築した。

配列番号２の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｄｅＩサイトを付加したプライマーｓｅｇｎｉ−ｃｉｓ−ＮｄｅＦ２（配列番号１９参照）および５’末端にＢｇｌＩＩサイトを付加したプライマーｓｅｇｎｉ−ｃｉｓ−ＢｇｌＲ（配列番号１８参照）を設計し作成した。次に、配列番号２の塩基配列の通りに人工遺伝子合成を行い（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ社）、これをテンプレートとして用いて上記と同様にＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からｃｉｓを含む約０．９ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩで消化したものをｃｉｓ断片とした。

ｐＲＳＦ−ＰＡを制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｃｉｓ断片をライゲーションし、ｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ、およびｃｉｓ各遺伝子を有するプラスミドｐＲＳＦ―Ｃｉｓ（図２）を構築した。

配列番号１の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｃｏＩサイトを付加したプライマーｌａｃ−ｌａｔ−ＮｃｏＦ２（配列番号９参照）および５’末端にＡｆｌＩＩサイトを付加したプライマーｌａｔ−（Ｓｐｅ）ＡｆｌＲ２（配列番号２０参照）を設計し作成した。次に、この２種のプライマーとプラスミドｐＲＳＦ−Ｃｉｓをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からｌａｔを含む約１．５ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｃｏＩとＡｆｌＩＩで消化したものをｌａｔ２断片とした。

ｐＲＳＦ−Ｃｉｓを制限酵素ＮｃｏＩとＡｆｌＩＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｌａｔ２断片をライゲーションし、ｌａｔおよびｃｉｓ遺伝子を有するプラスミドｐＲＳＦ−ＬａｔＣｉｓを構築した。

配列番号７の塩基配列を参考にして、５’末端にＮｃｏＩサイトを付加したプライマーｌｏｔｉ−ＳＤ−ＰａｃＦ（配列番号２１参照）および５’末端にＡｖｒＩＩサイトを付加したプライマーｌｏｔｉ−ＡｖｒＲ（配列番号２２参照）を設計し作成した。次に、この２種のプライマーとメソリゾビウム・ロチＭＡＦＦ３０３０９９株ゲノムＤＮＡをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からＢＡＢ５２６０５タンパク質をコードする遺伝子を含む約０．９ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＰａｃＩとＡｆｌＩＩで消化したものをｌｏｔｉ断片とした。

ｐＲＳＦ−Ｃｉｓを制限酵素ＰａｃＩとＡｆｌＩＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｌｏｔｉ断片をライゲーションし、ｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧの各遺伝子、およびＢＡＢ５２６０５タンパク質をコードする遺伝子（ｌｏｔｉ）を有するプラスミドｐＲＳＦ―Ｌｏｔｉを構築した。

最後に、プライマーとしてｓｅｇｎｉ−ｃｉｓ−ＮｄｅＦ２およびｓｅｇｎｉ−ｃｉｓ−ＢｇｌＲ、テンプレートとしてｐＲＳＦ−Ｃｉｓをそれぞれ用い、Ｄｉｖｅｒｓｉｆｙ^TM ＰＣＲＲａｎｄｏｍＭｕｔａｇｅｎｅｓｉｓＫｉｔ（Ｃｌｏｎｔｅｃｋ社）の条件５を用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液から約０．９ｋｂｐの大きさのＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩで消化したものをｍｕｔａｎｔ−ｃｉｓ断片とした。ｐＲＳＦ−ＰＡを制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｍｕｔａｎｔ−ｃｉｓ断片をライゲーションし、ｐＲＳＦ−ＰＡを制限酵素ＮｄｅＩとＢｇｌＩＩにより消化して得たプラスミド消化物と、ｍｕｔａｎｔ−ｃｉｓ断片をライゲーションし、ｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧの各遺伝子、および変異型ｃｉｓ遺伝子を有するプラスミドｐＲＳＦ−ＭｕｔＣｉｓＬｉｂｒａｒｙを構築した。

〔実施例２. シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生産試験１〕
プラスミドｐＲＳＦ−Ｃｉｓ（図２）、ｐＲＳＦ−ＣｉｓＳｈｏｒｔ、ｐＲＳＦ−ＰＡ、ｐＲＳＦ−ＬａｔＣｉｓおよびｐＲＳＦＤｕｅｔ−１を用いて、大腸菌ワンショットＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（ライフテクノロジーズジャパン社）を形質転換した株をそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−Ｃｉｓ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ＣｉｓＳｈｏｒｔ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ＰＡＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ＬａｔＣｉｓおよびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１とした。これらの株をカナマイシン硫酸塩（２５μｇ／ｍｌ）を含むＭ９ＳＥＥＤ液体培地（３．３９％Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１．５％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．２５％塩化カルシウム、０．５％塩化アンモニウム、１％カザミノ酸、０．００２％チミン、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｍＭ硫酸鉄、０．４％グルコース、０．００１ｍＭ塩化マグネシウム）に接種し、３０℃で２２時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。この培養液１０μＬをカナマイシン硫酸塩（３０μｇ／ｍＬ）とＯｖｅｒｎｉｇｈｔＥｘｐｒｅｓｓＡｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ（メルク社）を含むＭ９Ｃｉｓ培地（３．３９％Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１．５％ＫＨ₂ＰＯ、０．２５％塩化ナトリウム、０．５％塩化アンモニウム、１％カザミノ酸、０．００２％チミン、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｍＭ硫酸鉄、８０μｇ／ｍｌ５−アミノレブリン酸、０．０１％）に添加した後、３０℃で９時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。ここで４０％Ｌ−リジン塩酸塩１０μＬ（終濃度８ｇ／Ｌ）、２０％ α−ケトグルタル酸１０μＬ（終濃度４ｇ／Ｌ）、１００ｍＭＩＰＴＧ０．５μＬ（終濃度０．１ｍＭ）、および５０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ５μＬ（終濃度０．５％）を加え、さらに３０℃、２２０ｒｐｍで振とう培養した。培養開始後２４時間の時点で培養液の遠心上清を回収し、ＬＣ／ＭＳ分析サンプル調製に充てた。

サンプリング液についてＮα−（５−Ｆｌｕｏｒｏ−２，４−ｄｉｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）−Ｌ−ｌｅｕｃｉｎａｍｉｄｅ（Ｌ−ＦＤＬＡ）（東京化成工業社）を用い、以下の方法によりＦＤＬＡ化した。

サンプリング液の遠心上清の１０倍希釈液２０μＬに１ＭＮａＨＣＯ₃ ６．２５μＬと１％Ｌ−ＦＤＬＡアセトン溶液３０μＬとを加え３７℃で一時間保温した。１ＮＨＣＬを６．２５μＬ加え反応を停止し、アセトニトリル６０μＬを加え希釈したものをＦＤＬＡ化液とした。

得られたＦＤＬＡ化液についてＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳにてＬ−リジン、Ｌ−ピペコリン酸およびシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の量を測定した。ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳ分析チャートを図３および図４に示した。定量結果を表１に示した。また、ＨＰＬＣおよびＬＣ／ＭＳの測定条件を以下に示す。

分析条件
カラム：ＣＡＰＣＥＬＬＰＡＫＣ１８ＳＧ１２０，４．６×１５０ｍｍ，５μｍ
流速：１．０ｍＬ／ｍｉｎ
移動相：Ａ；０．１％酢酸Ｂ；アセトニトリル
グラジエント：０−９ｍｉｎ（Ｂ：３０−６５％），９．０１−１２ｍｉｎ（Ｂ：９０％），１２．０１−１５ｍｉｎ（Ｂ：３０％）
検出：３４０ｎｍ
注入量：５μＬ
カラム温度：４０℃
ＭＳ：Ａｇｉｌｅｎｔ６３２０（Ｉｏｎｔｒａｐ）
Ｍｏｄｅ：ＥＳＩ／ＡＰＣＩｐｏｓｉｔｉｖｅ
ＳｃａｎＲａｎｇｅ：ｍ／ｚ１００−９００
分析時間：１５分
保持時間：Ｌ−リジン１０．０分
Ｌ−ピペコリン酸８．５分
シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸５．８分

この結果、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦＤｕｅｔ−１株ではＬ−ピペコリン酸およびシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生産が確認できなかったのに対して、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ＣｉｓＳｈｏｒｔ株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ、ｓｈｏｒｔｃｉｓ各遺伝子含有）およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ―ＰＡ株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ各遺伝子含有）ではＬ−ピペコリン酸を生産していた。また、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−Ｃｉｓ株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ、ｃｉｓ各遺伝子含有）およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ―ＬａｔＣｉｓ株（プラスミド上にｌａｔおよびｃｉｓ遺伝子含有）ではシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸とＬ−ピペコリン酸を生産していた。

このことより、Ｌ−ピペコリン酸生産能を有する株にｃｉｓ遺伝子を導入すること（ここではｌａｔ遺伝子とｃｉｓ遺伝子の共発現）により、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を直接生産できること、さらにｌｙｓＰ、ｐｒｏＣおよびｒｏｃＧ遺伝子をも共発現することによりその生産性が向上しうることが示された。尚、Ｌ−ピペコリン酸の標品としてＬ−ＰｉｐｅｃｏｌｉｃＡｃｉｄ（東京化成工業株式会社）、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の標品として（２Ｓ，５Ｓ）−５−ＨｙｄｒｏｘｙｐｉｐｅｃｏｌｉｃＡｃｉｄ（ＳＶＣｈｅｍＢＩＯＴＥＣＨ．ＩＮＣ）を用いた。

このように、ｓｈｏｒｔｃｉｓ遺伝子にコードされたＥＦＶ１２５１７タンパク質を発現した大腸菌にはＬ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換する能力は検出できなかったが、ＥＦＶ１２５１７タンパク質のアノテーションよりも４８塩基（１６アミノ酸相当）上流から発現させたポリヌクレオチド（ｃｉｓ遺伝子）にコードされたタンパク質を発現した大腸菌は、Ｌ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換するＬ−ピペコリン酸のシス−５位水酸化酵素活性を有していた。さらに、このｃｉｓ遺伝子にコードされるタンパク質のアミノ酸配列と、ＣＡＣ４７６８６タンパク質およびＢＡＢ５２６０５タンパク質のアミノ酸配列との相同性はそれぞれ３４％および３３％であった。

以上のことから、ｃｉｓ遺伝子にコードされたタンパク質を発現した大腸菌が、Ｌ−ピペコリン酸をシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸に変換するＬ−ピペコリン酸のシス−５位水酸化酵素活性を有することは、既知情報からは推測しがたいと考えられた。

〔実施例３．シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生産試験２〕
プラスミドｐＲＳＦ−Ｃｉｓ、ｐＲＳＦ−ＬｏｔｉおよびｐＲＳＦ−ＭｕｔＣｉｓを用いて大腸菌ワンショットＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルを形質転換した株をそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ＣｉｓおよびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−Ｌｏｔｉとした。また、プラスミドｐＲＳＦ−ＭｕｔＣｉｓＬｉｂｒａｒｙを用いて大腸菌ワンショットＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルを形質転換した株のうちの一株を、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ＭｕｔＣｉｓ１とした。これらの株を実施例２と同様に培養および分析を行い、Ｌ−ピペコリン酸およびシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の量を測定した。測定結果を表２に示す。

この結果、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−Ｃｉｓ株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ、ｃｉｓ各遺伝子含有）に比べ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−Ｌｏｔｉ株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ、ｌｏｔｉ各遺伝子含有）では、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生産量は約１／３０であった。このことより、ｌｏｔｉ遺伝子がコードするＢＡＢ５２６０５タンパク質を発現した大腸菌を用いた場合、得られるシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の量が比較的少ないことが示された。

一方、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−Ｃｉｓ株に比べ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ―ＭｕｔＣｉｓ１株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ、変異型ｃｉｓ各遺伝子含有）でも、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生産量は同等以上であった。この変異型ｃｉｓ遺伝子の塩基配列をＢｉｇＤｙｅＴｅｒｍｉｎａｔｏｒｖ３．１ＣｙｃｌｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＫｉｔ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）を用いて解析した結果を配列番号２３に示した。この結果、ｃｉｓ遺伝子塩基配列とこの変異型ｃｉｓ遺伝子塩基配列は全８９７塩基中２塩基が異なる為、両遺伝子塩基配列の相同性は９９．７％であった。このことより、ｃｉｓ遺伝子塩基配列との相同性が９９．７％以上である遺伝子がコードするタンパク質を発現した大腸菌を用いたシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸製造が可能であることが示された。

〔実施例４．シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生産試験３〕
プラスミドｐＲＳＦ−Ｃｉｓ、およびｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｐｒｏＣΔｒｏｃＧを用いて大腸菌ワンショットＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセルを形質転換した株をそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ＣｉｓおよびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｐｒｏＣΔｒｏｃＧとした。これらの株を実施例２と同様に培養および分析を行い、Ｌ−ピペコリン酸およびシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の量を測定した。測定結果を表３に示す。

この結果、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−Ｃｉｓ株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｐｒｏＣ、ｒｏｃＧ、ｃｉｓ各遺伝子含有）に比べ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｐｒｏＣΔｒｏｃＧ株（プラスミド上にｌａｔ、ｌｙｓＰ、ｃｉｓ各遺伝子含有）では、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生産量は約２／３であった。このことより、ｌａｔおよびｌｙｓＰ両遺伝子に加えｐｒｏＣおよびｒｏｃＧ遺伝子をもプラスミド上に含有する場合の方が、得られるシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の量が多いことが示された。

〔実施例５．シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸生産試験４〕
プラスミドｐＲＳＦ−ＣｉｓのｐｒｏＣ遺伝子、ｒｏｃＧ遺伝子、もしくはこれら両遺伝子を削る為、以下のプライマーを作製した。
プライマーｐｒｏＣｒｏｃＧＸ−ＳｐｅＲ（配列番号２７参照）
プライマーｐｒｏＣＸ−ＳｐｅＲ（配列番号２８参照）
プライマーｒｏｃＧＸ−ＳｐｅＦ（配列番号２９参照）
プライマーｐｒｏＣＸ−ＳｐｅＦ（配列番号３０参照）

プラスミドｐＲＳＦ−ＣｉｓのｐｒｏＣ遺伝子を削ったプラスミドｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｐｒｏＣは、以下のように作製した。プライマーｐｒｏＣＸ−ＳｐｅＦとプライマーｐｒｏＣｒｏｃＧＸ−ＳｐｅＲを用い、ｐＲＳＦ−Ｃｉｓをテンプレートとして用いてＰＣＲ反応を行った。このＰＣＲ増幅反応液からプラスミドｐＲＳＦ−ＣｉｓのｐｒｏＣ遺伝子を削ったＤＮＡ断片を回収した。得られたＤＮＡ断片を制限酵素ＳｐｅＩで消化し、セルフライゲーションし、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭ１０９ＣｏｍｐｅｔｅｎｔＣｅｌｌｓ（タカラバイオ社）を形質転換することにより、ｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｐｒｏＣを構築した。同様に、プラスミドｐＲＳＦ−ＣｉｓのｒｏｃＧ遺伝子を削ったプラスミドｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｒｏｃＧはプライマーｒｏｃＧＸ−ＳｐｅＦとプライマーｐｒｏＣＸ−ＳｐｅＲを用い、プラスミドｐＲＳＦ−ＣｉｓのｐｒｏＣ遺伝子とｒｏｃＧ遺伝子遺伝子を削ったプラスミドｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｐｒｏＣΔｒｏｃＧは、プライマーｒｏｃＧＸ−ＳｐｅＦとプライマーｐｒｏＣｒｏｃＧＸ−ＳｐｅＲを用いて作製した。

プラスミドｐＲＳＦ−Ｃｉｓ、ｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｐｒｏＣ、ｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｒｏｃＧ、およびｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｐｒｏＣΔｒｏｃＧを用いて、大腸菌ワンショットＢＬ２１（ＤＥ３）コンピテントセル（ライフテクノロジーズジャパン社）を形質転換した株をそれぞれＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−Ｃｉｓ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｐｒｏＣ、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｒｏｃＧ、およびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｐｒｏＣΔｒｏｃＧとした。これらの株をカナマイシン硫酸塩（２５μｇ／ｍｌ）を含むＭ９ＳＥＥＤ液体培地（３．３９％Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１．５％ＫＨ₂ＰＯ₄、０．２５％塩化カルシウム、０．５％塩化アンモニウム、１％カザミノ酸、０．００２％チミン、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｍＭ硫酸鉄、０．４％グルコース、０．００１ｍＭ塩化マグネシウム）に接種し、３０℃で９時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。この培養液１０μＬをカナマイシン硫酸塩（３０μｇ／ｍＬ）、Ｌ−リジン塩酸塩（終濃度８ｇ／Ｌ）、α−ケトグルタル酸（終濃度２ｇ／Ｌ）およびＯｖｅｒｎｉｇｈｔＥｘｐｒｅｓｓＡｕｔｏｉｎｄｕｃｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍｓ（メルク社）を含むＭ９Ｃｉｓ培地（３．３９％Ｎａ₂ＨＰＯ₄、１．５％ＫＨ₂ＰＯ、０．２５％塩化ナトリウム、０．５％塩化アンモニウム、１％カザミノ酸、０．００２％チミン、０．１ｍＭ塩化カルシウム、０．１ｍＭ硫酸鉄、８０μｇ／ｍｌ５−アミノレブリン酸、０．０１％）に添加した後、３０℃で１５時間２２０ｒｐｍで振とう培養した。ここで４０％Ｌ−リジン塩酸塩５μＬ（終濃度４ｇ／Ｌ）、２０％ α−ケトグルタル酸５μＬ（終濃度２ｇ／Ｌ）、１００ｍＭＩＰＴＧ０．５μＬ（終濃度０．１ｍＭ）、および５０％グリセロール５μＬ（終濃度０．５％）を加え、さらに３０℃、２２０ｒｐｍで振とう培養した。培養開始後３９時間の時点で培養液の遠心上清を回収し、ＬＣ／ＭＳ分析サンプル調製に充てた。測定結果を表４に示す。

この結果、この培養条件では、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｒｏｃＧおよびＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−ＣｉｓΔｐｒｏＣΔｒｏｃＧの方が、ＢＬ２１（ＤＥ３）／ｐＲＳＦ−Ｃｉｓより、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸の生産量が多かった。

配列番号１：ｌａｔの塩基配列
配列番号２：ｃｉｓの塩基配列
配列番号３：ｐｒｏＣの塩基配列
配列番号４：ｌｙｓＰの塩基配列
配列番号５：ｒｏｃＧの塩基配列
配列番号６：ｍｅｌｉｌｏｔｉの塩基配列
配列番号７：ｌｏｔｉの塩基配列
配列番号８：ｓｈｏｒｔｃｉｓの塩基配列
配列番号９：プライマーｌａｃ−ｌａｔ−ＮｃｏＦ２
配列番号１０：プライマーｌａｔ−ＸｈｏＲ
配列番号１１：プライマーｌｙｓＰ−ＳＤ−ＸｈｏＦ
配列番号１２：プライマーｌｙｓＰ−ＫｐｎＲ
配列番号１３：ｐｒｏＣ−ＳＤ−ＫｐｎＦ
配列番号１４：プライマーｐｒｏＣ−ＢａｍＲ
配列番号１５：プライマーｒｏｃＧ−ＳＤ−ＢａｍＦ
配列番号１６：プライマーｒｏｃＧ−ＸｂａＲ
配列番号１７：プライマーｓｅｇｎｉ−ｓｈｏｒｔ−ＮｄｅＦ
配列番号１８：プライマーｓｅｇｎｉ−ｃｉｓ−ＢｇｌＲ
配列番号１９：プライマーｓｅｇｎｉ−ｃｉｓ−ＮｄｅＦ２
配列番号２０：プライマーｌａｔ−（Ｓｐｅ）ＡｆｌＲ２
配列番号２１：プライマーｌｏｔｉ−ＳＤ−ＰａｃＦ
配列番号２２：プライマーｌｏｔｉ−ＡｖｒＲ
配列番号２３：変異型ｃｉｓの塩基配列
配列番号２４：ｌａｔがコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２５：ｃｉｓがコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２６：変異型ｃｉｓがコードするタンパク質のアミノ酸配列
配列番号２７：プライマーｐｒｏＣｒｏｃＧＸ−ＳｐｅＲ
配列番号２８：プライマーｐｒｏＣＸ−ＳｐｅＲ
配列番号２９：プライマーｒｏｃＧＸ−ＳｐｅＦ
配列番号３０：プライマーｐｒｏＣＸ−ＳｐｅＦ

Claims

下記の（A）〜（F）のいずれか一のポリヌクレオチドを発現可能な状態で含む微生物により、Ｌ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する工程を含む、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物の製造方法：
（A）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、このときストリンジェントな条件が、２倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）および５０％ホルムアミドの存在下、５０℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍濃度のＳＳＣ溶液を用い、６５℃でフィルターを洗浄する条件である、ポリヌクレオチド；
（C）配列番号２に記載の塩基配列と少なくとも90％以上の同一性を有し、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（D）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（E）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において29個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（F）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
微生物が、Ｌ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド、およびデルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸を基質としてＬ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、発現可能な状態でさらに含み：
Ｌ−リジンを基質として、Ｌ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成し、続いてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドがデルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸へ変換される工程；および
デルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸を基質としてＬ−ピペコリン酸を生成する工程
をさらに含む、請求項１に記載の製造方法。
Ｌ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドが、フラボバクテリウムルテセンス（Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｌｕｔｅｓｃｅｎｓ）由来である、請求項２に記載の製造方法。
微生物が大腸菌であり、デルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸を基質としてＬ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを元来有する、請求項２または３に記載の製造方法。
下記の（A）〜（F）のいずれか一のポリヌクレオチド：
（A）配列番号２に記載の塩基配列からなるポリヌクレオチド；
（B）配列番号２に記載の塩基配列と相補的な塩基配列からなるポリヌクレオチドとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドであって、このときストリンジェントな条件が、２倍濃度のＳＳＣ溶液および５０％ホルムアミドの存在下、５０℃でハイブリダイゼーションを行った後、０．１倍濃度のＳＳＣ溶液（１倍濃度のＳＳＣ溶液の組成は、１５０ｍＭ塩化ナトリウム、１５ｍＭクエン酸ナトリウムよりなる。）を用い、６５℃でフィルターを洗浄する条件である、ポリヌクレオチド；
（C）配列番号２に記載の塩基配列と少なくとも90％以上の同一性を有し、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（D）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（E）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において29個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド；
（F）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチド。
請求項５に記載のポリヌクレオチドを含む、微生物の形質転換用ベクター。
Ｌ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６に記載の微生物の形質転換用ベクター。
α−ケトグルタル酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質および／またはデルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸を基質としてＬ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドをさらに含む、請求項６または７に記載の微生物の形質転換用ベクター。
請求項６〜８のいずれか１項に記載のベクターにより形質転換された、遺伝子組換え微生物。
請求項５に記載のポリヌクレオチド、およびＬ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドにより形質転換され、Ｌ−リジンを出発物質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する能力を有する、遺伝子組換え大腸菌。
下記の（d）〜（f）のいずれか一のタンパク質：
（d）配列番号２５に記載のアミノ酸配列からなるタンパク質；
（e）配列番号２５に記載のアミノ酸配列において29個以下のアミノ酸が置換、欠失、挿入、および／または付加したアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質；
（f）配列番号２５に記載のアミノ酸配列と少なくとも90％以上の同一性を有するアミノ酸配列からなり、かつＬ−ピペコリン酸を基質としてシス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質。
Ｌ−ピペコリン酸に、請求項１１に記載のタンパク質を作用させ、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸を生成する工程を含む、シス−５−ヒドロキシ−Ｌ−ピペコリン酸もしくはその薬理学上許容される塩またはそれらの溶媒和物の製造方法。
Ｌ−リジンに、Ｌ−リジンを基質としてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を作用させ、Ｌ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドを生成し、続いてＬ−アミノアジピン酸−デルタ−セミアルデヒドがデルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸へ変換される工程；および
得られたデルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸に、デルタ１−ピペリデイン−６−カルボン酸を基質としてＬ−ピペコリン酸を生成する反応を触媒する活性を有するタンパク質を作用させ、Ｌ−ピペコリン酸を生成する工程
をさらに含む、請求項１２に記載の製造方法。