JP6283411B2 - Ｄｌｌ４とｖｅｇｆに特異的に結合する新規二重標的タンパク質とこれの用途 - Google Patents

Description

本発明は、新規なデルタ様リガンド４（Ｄｅｌｔａ ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ４，ＤＬＬ４）に特異的に結合するタンパク質および血管内皮細胞増殖因子（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）に特異的に結合する抗体を含む二重標的タンパク質に関する。

ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）シグナル伝達は、脊椎動物から無脊椎動物に至るまで進化論的によく保存されており、発生初期の細胞の運命を決定づけるのに非常に重要な役割を果たしていると報告された。ノッチシグナル伝達は、神経、眼球、リンパ、筋肉、血球などの分化過程を調節する主な因子として知られており、さらには血管発生にも関与している。哺乳類では、４つのノッチ受容体を持っており（Ｎｏｔｃｈ１、２、３、および４）、それぞれのノッチ受容体は、３００〜３５０ｋＤａサイズのタンパク質に合成され、ゴルジ体からフーリン−様変換酵素（ｆｕｒｉｎ−ｌｉｋｅ ｃｏｎｖｅｒｔａｓｅ）によってＳ１位が切断されて細胞表面でヘテロダイマー（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成する。また、哺乳類には５つのノッチリガンド（Ｊａｇｇｅｄ−１／２及びＤｅｌｔａ−様リガンド（ＤＬＬ）１／３／４）が確認された。

活性化されたノッチシグナル伝達は、いくつかの癌モデルで腫瘍形成を誘発すると知られている。活性ノッチであるＮＩＣＤをラットの造血細胞に発現させる場合、Ｔ−ｃｅｌｌ ｌｅｕｋｅｍｉａ／ｌｙｍｐｈｏｍａｓを引き起こし、Ｔ−ＡＬＬ（Ｔ−ｃｅｌｌ ａｃｕｔｅ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｉｃ ｌｅｕｋｅｍｉａ）では活性化されたノッチ１が５０％程度発見された。また、乳がんの場合でも、ＭＭＴＶ（ｍｏｕｓｅ ｍａｍｍａｒｙ ｔｕｍｏｒ ｖｉｒｕｓ）が挿入されたラット（ＣｚｅｃｈＩＩ）で活性化されたノッチ４受容体が過剰発現されたものが発見され、これらのラットで乳腺腫瘍が発生したと報告された。子宮頸がん、肺がん、膵臓がん、卵巣がん、乳がん、前立腺癌のような様々な癌でノッチ受容体とリガンドとノッチシグナル伝達のターゲットが活性化されていると報告された。ノッチ１受容体の発現と乳癌患者の良くない予後とが関連しており、前立腺癌では癌転移と関連していることが知られている。

デルタ様リガンド４（Ｄｅｌｔａ Ｌｉｋｅ Ｌｉｇａｎｄ４，ＤＬＬ４）（以下では「ＤＬＬ４」）は、血管内皮細胞で過剰発現されているノッチタンパク質を受容体とするリガンドのデルタ部類の一つであって、血管新生を調節する主な要素として知られている。ＤＬＬ４は、特に血管内皮に過剰発現されるノッチ１またはノッチ４受容体に結合する。ＤＬＬ４は、正常血管でも発現されるが、癌血管では非常に過剰発現されていることが知られている。新生血管形成過程（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）は、既存の血管から新しい血管が生成される機序を意味し、特に腫瘍における血管新生は、癌組織の低酸素（ｈｙｐｏｘｉａ）部位で酸素と栄養分の供給を受けるためにＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）のような血管新生因子によって血管新生が起こる。腫瘍における血管新生は腫瘍の成長だけでなく、転移（ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ）にも重要な作用をすることが知られている。腫瘍でＤＬＬ４によるノッチシグナル伝達を遮断すると、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）の調節が行われにくくなり、癌の成長を抑制することができる。また、ＤＬＬ４によるノッチシグナル伝達を抑制させる場合、調節Ｔ細胞（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ Ｔ ｃｅｌｌ，Ｔｒｅｇ）の数を増加させて自己免疫疾患（ａｕｔｏｉｍｍｕｎｅ ｄｉｓｅａｓｅｓ）を治療することができる（米国公開特許第２０１１−０１８９２００号）。これらの理由から、ＤＬＬ４は、がんや自己免疫疾患の治療において新たな標的となっている。

一方、新生血管形成を阻害する抗がん抗体医薬品としては、ＶＥＧＦをターゲットにするアバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ（登録商標）、Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ／Ｒｏｃｈｅ）が２００４年にＦＤＡの承認を経て、抗がん治療薬として大成功を収めている。しかし、最近の一部の臨床モデルと前臨床動物モデルの研究では、すべての固形がん（Ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ）がＶＥＧＦ阻害剤に反応するのではなく、また初期にＶＥＧＦ阻害剤で治療が行われた一部の腫瘍が一定時間経過後、抵抗性を示す場合が多数報告されているばかりか、ＶＥＧＦ阻害剤の投与により、癌細胞がより攻撃的で転移が起こりやすい癌細胞に形質変換されるとの研究結果が発表されている。このような研究報告は、アバスチン耐性に勝つかアバスチンの薬効を超える新規抗がんターゲットの研究開発を活発に推進させるようにしたが、これらの新しい抗がんターゲットとして脚光を浴びているものの一つがＤＬＬ４／Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路に関与するタンパク質である。現在までに明らかになった研究結果によると、ＶＥＧＦ／ＶＧＥＦＲシグナル経路とＤＬＬ４／Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路が互いに異なる作用機序で新生血管形成に影響を与えるため、２つのシグナル経路を同時に抑制した場合、より強い抗がん相乗効果を期待することができると予想される。

本発明者等は、ヒトＤＬＬ４とＶＥＧＦに特異的に結合してＤＬＬ４／ＮｏｔｃｈおよびＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達経路を効果的に阻害して、免疫原性の危険性を最小限に抑えることができる二重標的タンパク質を開発するために鋭意努力した結果、ヒトＶＥＧＦに特異的に結合するヒトモノクローナル抗体として、ＩｇＧ基本形態であるアバスチン類似体（Ａｖａｓｔｉｎ ｓｉｍｉｌａｒ）のＣ−末端部位にヒトＤＬＬ４に特異的に結合する新規なＳｃＦｖ（Ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）の形を連結した二重標的タンパク質を新たに製作し、これらの二重標的タンパク質がＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体タンパク質の相互作用はもちろん、ＤＬＬ４とノッチタンパク質間の相互作用も効果的に遮断して、それによって優れた抗癌効果を示すことを確認して、本発明を完成した。

本発明の一つの目的は、配列番号２１で表されるＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ４）タンパク質のアミノ酸配列で５８番〜６５番アミノ酸配列、及び１１０番〜１１５番のアミノ酸配列を含むＤＬＬ４の立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）を認知する、ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質、並びにＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）に特異的に結合する抗体を含む、二重標的タンパク質を提供することである。

本発明の他の目的は、前記二重標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記二重標的タンパク質を製造する方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記二重標的タンパク質を含む組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記二重標的タンパク質を含む癌治療用薬学的組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記二重標的タンパク質を含む癌診断用組成物を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記二重標的タンパク質を利用した癌の診断方法を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、配列番号２１で表されるＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ４）タンパク質のアミノ酸配列で５８番〜６５番アミノ酸配列、及び１１０番〜１１５番のアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ４の立体構造エピトープを提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記立体構造エピトープを認識する、ＤＬＬ４に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供することである。

本発明のさらに他の目的は、前記二重標的タンパク質を、がんが疑われる個体に投与する工程を含む、癌の治療方法を提供することである。

本発明の二重標的タンパク質は、ＶＥＧＦとＤＬＬ４に同時に結合して癌を治療することができ、ＤＬＬ４に特異的に結合する新規なタンパク質を利用することにより、結合力および抗がん効果が優れ、がんの治療および診断の分野に広く活用されることができるものである。

ＤＬＬ４とＶＥＧＦを同時に結合することができる二重標的タンパク質の構造を示したものである。 ＤＬＬ４とＶＥＧＦを同時に結合することができる二重標的タンパク質の構造を示したものである。 ＤＬＬ４とＶＥＧＦを同時に結合することができる二重標的タンパク質をＣＨＯ細胞で発現して精製した後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認した結果を示したものである。 ＤＬＬ４とＶＥＧＦを同時に結合することができる二重標的タンパク質をＣＨＯ細胞で発現して精製した後、ＳＥＣ−ＨＰＬＣクロマトグラフィー分析の結果を示したものである。 ＤＬＬ４とＶＥＧＦの二重標的タンパク質のＤＬＬ４とＶＥＧＦの結合能アッセイ（Ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）をＥＬＩＳＡ（ｅｎｚｙｍｅ−ｌｉｎｋｅｄ ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔ ａｓｓａｙ）を介して分析した結果を示したものである。 二重標的タンパク質の抗原であるＤＬＬ４に対する平衡解離定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍ ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＫＤ）の値をビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析方法を介して測定結果を示したものである。 二重標的タンパク質の抗原であるＶＥＧＦの平衡解離定数（ｅｑｕｉｌｉｂｒｉｕｍｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ，ＫＤ）の値をビアコア（Ｂｉａｃｏｒｅ）分析方法を介して測定結果を示したものである。 二重標的タンパク質のＤＬＬ４とＶＥＧＦに対する中和効果（Ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇ ａｓｓａｙ）をＥＬＩＳＡを介して分析した結果を示したものである。 クロスリンカーの有無に応じたヒトＤＬＬ４とＭＬＣＫ２抗体の複合体の形成の結果を示したものである。 ヒトＤＬＬ４ Ｃ２ドメイン（２７−１７４）の表面上で配列番号２１で表されるＤＬＬ４の５８−６５番のアミノ酸残基［ＦＲＶＣＬＫＨＦ］および配列番号２２からなる断片が連続した分子表面を構成しているモデルを示したものである。 野生型及びＤＬＬ４の細胞外ドメインの欠失断片をコードする変異タンパク質の結合力をウェスタンブロッティングを介して確認した結果を示したものである。 ＶＥＧＦをターゲットにする抗体であるアバスチンを処理した時、ＤＬＬ４の存在の有無に関係なく、濃度依存的に血管内皮細胞の増殖が抑制されることを確認した結果を示したものである。 ＤＬＬ４単独に対する抗体を処理した時、ＤＬＬ４が存在する実験群でのみＤＬＬ４抗体処理濃度に依存的に血管内皮細胞の増殖が現れることを確認した結果を示したものである。 二重標的タンパク質を処理した時、ＤＬＬ４が存在しない実験群では、アバスチン抗体処理と類似する増殖抑制効果を示し（黒色バー）、ＤＬＬ４が存在する実験群では、アバスチン対比血管増殖抑制効果が減った結果を示した（白色バー）。 ＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合する二重標的タンパク質が血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）のＤＬＬ４／Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路とＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達経路を阻害する活性を示すことを、ウェスタンブロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ）分析を介して示したものである。 ＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合する二重標的タンパク質がヌードマウスに構築したアバスチン抵抗性を持つヒト胃癌細胞株異種移植モデル（Ａｖａｓｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｕｍａｎ ＳＣＨ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）でアバスチンに比べて強い抗癌効果を有していることを確認したものである。 ＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合する二重標的タンパク質がヌードマウスに構築したアバスチン抵抗性を持つヒト肺癌細胞株異種移植モデル（Ａｖａｓｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｕｍａｎ Ａ５４９ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）でアバスチンに比べて強い抗癌効果を有していることを確認したものである。

前記目的を達成するための一つの態様として、本発明は、配列番号２１で表されるＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ４）タンパク質のアミノ酸配列で５８番〜６５番アミノ酸配列、及び１１０番〜１１５番のアミノ酸配列を含むＤＬＬ４の立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）を認知する、ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質、およびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）に特異的に結合する抗体を含む、二重標的タンパク質を提供する。

本発明において、用語「二重標的タンパク質」とは、異なる二種類の抗原（標的タンパク質）に結合することができるタンパク質を意味する。具体的には、自然には存在せず、遺伝子工学または任意の方法によって製造された形態であることが好ましい。

本発明の目的上、前記二重標的タンパク質は、癌細胞で過剰発現されるＶＥＧＦおよび内皮細胞で発現されるＤＬＬ４と結合することができる。また、前記二重標的タンパク質は、抗体の形態であってもよい。本発明の「二重標的タンパク質」は、「二重標的抗体」、「二重抗体」または「二重抗体タンパク質」と混用することができる。好ましくは、本発明の二重標的タンパク質は、ＶＥＧＦおよびＤＬＬ４を抗原とすることができる。本発明の前記二重標的タンパク質の形態は、特にこれに限定されないが、ＶＥＧＦに特異的に結合するＩｇＧ形態の抗体およびＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質がリンカーで連結された二重標的タンパク質の形を含み、その構造は、図１Ａに簡単に模式図で示した通りである。

本発明の二重標的タンパク質は、具体的に、配列番号１で表される重鎖アミノ酸配列および配列番号２０で表される軽鎖アミノ酸配列を含むものであってもよいが、これらに限定されない。

本発明において、用語「抗体」とは、免疫学的に特定の抗原と反応性を有する免疫グロブリン分子を含む、抗原を特異的に認識する受容体の役割をするタンパク質分子を意味し、ポリクローナル抗体（ｐｏｌｙｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、モノクローナル抗体（ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ）、全長（ｗｈｏｌｅ）抗体および抗体断片の両方を含む。また、前記用語は、キメラ性抗体（例えば、ヒト化マウス抗体）と異種結合抗体（例えば、二重特異性抗体）のような遺伝子工学によって生産された形態を含む。全長抗体は、２つの全体の長さの軽鎖および２つの全体の長さの重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は、重鎖とジスルフィド結合で連結されている。前記全長抗体は、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、およびＩｇＧを含み、ＩｇＧは亜型（ｓｕｂｔｙｐｅ）として、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、およびＩｇＧ４を含むことができる。また、前記抗体は、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）、ジアボディ、トリアボディ及びテトラボディを含んでもよい。具体的には、本発明のＶＥＧＦに特異的に結合する抗体は、ＩｇＧ形態であってもよい。

本発明で二重標的タンパク質は、免疫グロブリン（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ，ＩｇＧ）の形態のＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）に特異的に結合する抗体およびＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ４）に特異的に結合する全長抗体、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧまたはｓｃＦｖ形態のタンパク質がリンカーで連結された形態であってもよい。

典型的には、免疫グロブリンおよびｓｃＦｖは、重鎖および軽鎖を持ち、それぞれの重鎖および軽鎖は、不変領域と可変領域（前記部位は、ドメインとしても知られている）を含む。軽鎖および重鎖の可変領域は、相補性決定領域（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｒｉｔｙ−ｄｅｔｅｒｍｉｎｉｎｇ ｒｅｇｉｏｎ、以下「ＣＤＲ」と称する）と呼ばれる３つの高度可変領域と４つのフレームワーク領域（ｆｒａｍｅｗｏｒｋ ｒｅｇｉｏｎ）を含む。前記ＣＤＲは、主に抗原のエピトープ（ｅｐｉｔｏｐｅ）に結合する役割を果たす。それぞれの鎖のＣＤＲは、典型的にＮ−末端から始まって順次ＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３と呼ばれて、また、特定のＣＤＲが位置している鎖によって識別することができる。

本発明に係るＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質及びＶＥＧＦに特異的に結合する抗体を含む二重標的タンパク質は、ヒト由来ＤＬＬ４とＶＥＧＦに対して強い親和性を示し、ＤＬＬ４を発現している細胞（例えば、癌細胞や血管内皮細胞）がノッチ１またはノッチ４受容体に結合することを効果的に阻害するだけでなく、癌細胞で過剰発現するＶＥＧＦによってＶＥＧＦ受容体を発現している血管内皮細胞が活性化される新生血管形成作用を抑制して、癌のような病気の治療において、より強い治療効果を期待することができる。

本発明の二重標的タンパク質からＶＥＧＦに特異的に結合する抗体およびＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質は、それぞれの特異的な結合を維持し、特に二つの標的（抗原）を同時に抑制することができるので、一つの標的と結合して抑制するよりも、より効果的であり、同時に２つの信号を抑制することができる。

本発明において、用語「抗体断片」とは、抗原結合能力を有する断片、例えば、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧ及びｓｃＦｖを含む、抗体の抗原結合形態を含む。特に、前記用語は、ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔを含み、二価（ｂｉｖａｌｅｎｔ）またはジアボディ（ｄｉａｂｏｄｉｅｓ）、トリアボディ（ｔｒｉａｂｏｄｉｅｓ）及びテトラボディ（ｔｅｔｒａｂｏｄｉｅｓ）を含む。

本発明において、用語「ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）」とは、完全な抗原−認識および抗原−結合部位を有する最小抗体断片を意味して、抗体のＶＨおよびＶＬドメインを含み、ここで前記ドメインは、単一ポリペプチド鎖に存在することができる。

本発明において、用語「配列番号２１で表されるＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ４）タンパク質のアミノ酸配列で５８番〜６５番アミノ酸配列、及び１１０番〜１１５番のアミノ酸配列を含むＤＬＬ４の立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）を認知する、ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質、およびＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）に特異的に結合する抗体を含む、二重標的タンパク質」とは、ＤＬＬ４とＶＥＧＦによる二つのシグナル伝達経路を同時に抑制することができる二重標的タンパク質であれば制限なく含むことができる。前記二重標的タンパク質を構成するＶＥＧＦに特異的に結合する抗体およびＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質は、前記説明した全長抗体および抗体断片の形をいずれも含むことができる。

本発明において、用語「配列番号２１で表されるＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ４）タンパク質のアミノ酸配列で５８番〜６５番アミノ酸配列、及び１１０番〜１１５番のアミノ酸配列を含むＤＬＬ４の立体構造エピトープ（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎａｌ ｅｐｉｔｏｐｅ）を認知する、ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質」とは、配列番号２１で表されるＤＬＬ４内のアミノ酸配列で５８番〜６５番アミノ酸配列、及び１１０番〜１１５番のアミノ酸配列を含むＤＬＬ４の立体構造エピトープに特異的に結合するタンパク質を意味する。このようなタンパク質は、癌の成長を抑制して癌治療効果を示すことができるタンパク質を意味し、高親和度で前記エピトープに結合して、ＤＬＬ４活性を中和させる役割をすることができる。前記タンパク質は、ノッチ受容体に対するＤＬＬ４結合を遮断できて、ＤＬＬ４によるシグナル伝達を抑制することができる。前記ＤＬＬ４の配列番号２１および配列番号２２を含む立体構造エピトープに特異的に結合するタンパク質は、具体的には、全長抗体、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧまたはｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）形態であってもよい。

配列番号２１で表されるＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ４）タンパク質のアミノ酸配列で５８番〜６５番アミノ酸配列、及び１１０番〜１１５番のアミノ酸配列を含む立体構造エピトープに特異的に結合するタンパク質は、具体的には、前記ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質は、配列番号２で表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３で表される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域および配列番号５で表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６で示される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む形態であってもよい。

より具体的には、前記重鎖は、配列番号８で表される重鎖アミノ酸配列を含んでもよく、軽鎖は、配列番号９で表される軽鎖アミノ酸配列を含んでもよいが、前記のＣＤＲ配列を含み、ＤＬＬ４に特異的に結合して癌治療効果を示すことができるタンパク質であれば、その配列は変わってもよい。前記重鎖および軽鎖は、リンカーを介して連結することができる。

また、本発明の二重標的タンパク質の構成要素であるＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質は、ヒトＤＬＬ４だけでなく、マウスＤＬＬ４に特異的に結合して、ＤＬＬ４とノッチのタンパク質との間の相互作用を阻害することができる。

本発明の一実施例では、ＤＬＬ４とＶＥＧＦの生物学的阻害活性に優れた本発明の二重標的タンパク質のＤＬＬ４に特異的に結合する抗体のエピトープを究明した。具体的には、本発明では、ＤＬＬ４の５８番〜６５番のアミノ酸配列、及び１１０番〜１１５番のアミノ酸配列が形成するＤＬＬ４の連続した分子表面に結合することを究明した。したがって、ＤＬＬ４の５８番〜６５番のアミノ酸配列（配列番号２２）および／または１１０番〜１１５番のアミノ酸配列（配列番号２３）が、本発明に係るＤＬＬ４に特異的に結合する抗体のエピトープになってもよく、より具体的には、前記ＤＬＬ４の配列番号２２および２３番の部位が形成する分子の表面部位が立体構造エピトープになってもよい。

本発明において、用語「デルタ様リガンド４（ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ４，ＤＬＬ４）」とは、ノッチタンパク質を受容体とするリガンドのデルタ部類の一つであり、具体的には、ノッチ１またはノッチ４受容体に結合するタンパク質を意味するが、これに限定されない。前記ＤＬＬ４は、哺乳類のＤＬＬ４であれば、制限せず含んでもよいが、具体的には、ヒトまたはマウスのＤＬＬ４を意味する。ＤＬＬ４は、がんの血管（ｔｕｍｏｒ ｖａｓｃｕｌａｔｕｒｅ）をはじめとする様々な癌細胞で過剰発現されており、複数の異種移植（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ）モデルで異常血管の数を増加させてがんの成長を促すことが知られている。

そこで、本発明の配列番号２１で表されるＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ４）タンパク質のアミノ酸配列で５８番〜６５番アミノ酸配列、及び１１０番〜１１５番のアミノ酸配列を含むＤＬＬ４の立体構造エピトープに特異的に結合するタンパク質を含む二重標的タンパク質は、ＤＬＬ４の機能を抑制して癌治療に効果的に利用することができる。前記ＤＬＬ４に関する情報は、アメリカ国立衛生研究所のＧｅｎＢａｎｋなど公知のデータベースから得ることができ、その例として、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ ＮｕｍｂｅｒがＧｅｎｅ ＩＤ：５４５６７、ＮＣＢＩ Ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ：ＮＭ_０１９０７４．３であるＤＬＬ４の情報であり、前記ＤＬＬ４は、配列番号２１のアミノ酸配列を含むことができる。

本発明において、用語「ノッチ（Ｎｏｔｃｈ）受容体」とは、ノッチシグナル伝達を媒介するタンパク質を意味し、ノッチと混用して使用することができる。前記ノッチ受容体は、ノッチシグナル伝達を媒介するタンパク質であれば、制限されず含まれ、具体的には、ノッチ１またはノッチ４受容体であってもよいが、これに限定されない。

本発明において、用語「ヒトデルタ様リガンド４（ＤＬＬ４）とノッチ（Ｎｏｔｃｈ）受容体との間の相互作用を阻害」とは、本発明のＤＬＬ４に特異的に結合する二重標的タンパク質がＤＬＬ４に結合してＤＬＬ４とノッチ受容体との間の相互作用を阻害させることを意味し、具体的には、配列番号２１で表されるＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ４）タンパク質のアミノ酸配列で５８番〜６５番のアミノ酸配列、及び１１０番〜１１５番のアミノ酸配列を含むＤＬＬ４の立体構造エピトープに特異的な二重標的タンパク質がＤＬＬ４に結合してＤＬＬ４とノッチ１またはノッチ４受容体との相互作用を阻害させることを意味するが、これに限定されない。本発明の配列番号２１で表されるＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ４）タンパク質のアミノ酸配列で５８番〜６５番のアミノ酸配列、及び１１０番〜１１５番のアミノ酸配列を含むＤＬＬ４の立体構造エピトープに特異的な二重標的タンパク質の結合によってＤＬＬ４とノッチ受容体との間の相互作用が阻害され、ＤＬＬ４のノッチ受容体結合によるノッチタンパク質の構造的変化を持って来ず、加水分解することができないため、ノッチシグナル伝達をできないようにする。癌でＤＬＬ４とノッチ受容体が結合すると、血管のサイズを増大させ、血管内皮細胞間のシグナル伝達または癌細胞と血管内皮細胞との間のノッチシグナル伝達を活性化させ、がんの増殖や転移を抑制することが知られている。

したがって、癌でＤＬＬ４によるノッチシグナル伝達を遮断すると、特に血管新生の調節が行われにくくなって、がんの成長を抑制することができるようになる。また、ＤＬＬ４を遮断すると、血管新生部位の末端の細胞で外側抑制（ｌａｔｅｒａｌ ｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎ）の欠失が現れて、過度の発芽が行われるようになって、その結果として過度に多いながらも、生産性は落ちる血管新生反応が高くなり、酸素を供給する灌流が悪くなって、がんの周辺に低酸素状態が誘導されることがあり、抗がん効果をもたらすことができ、特に抗ＶＥＧＦ治療でも抵抗性を示す癌でも抗がん効果を示すことができる。

したがって、ＤＬＬ４とノッチとの間の相互作用を効果的に抑制する本発明のＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質を含む二重標的タンパク質を癌の治療において効果的に使用することができる。

本発明の用語「ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体」とは、癌細胞で広範囲にＶＥＧＦを抗原として、これに特異的に結合する抗体であればいずれも含まれる。具体的な例としては、ＶＥＧＦを標的とする治療用抗体であるベバシズマブ（Ｂｅｖａｃｉｚｕｍａｂ、商品名アバスチン（登録商標））であってもよいが、これに限定されない。このようなＶＥＧＦに特異的に結合する抗体は、前記の全長抗体または抗体断片の形をいずれも含み、ＩｇＧ抗体の形態であってもよいが、これに限定されない。ＶＥＧＦは、血管新生において重要な役割を果たすリガンドでこれを抑制すると、血管新生が行われなくて、癌を治療することができる。前記ベバシズマブは、ジェネンテク社アバスチン（Ａｖａｓｔｉｎ）で、米国ＦＤＡに承認を受けたもので、安定的に使用できる治療用抗体である。

前記ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体は、具体的に、配列番号１０で表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１１で表される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１２で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域および配列番号１３で表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４で示される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１５で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含んでもよく、より具体的には、配列番号１６で表される重鎖アミノ酸配列及び配列番号１７で表される軽鎖アミノ酸配列を含んでもよいが、ＶＥＧＦに特異的に結合して癌治療効果を示すことができるタンパク質の配列を制限なしに含んでもよい。

本発明の二重標的タンパク質の構成要素であるＶＥＧＦに特異的に結合する抗体は、癌細胞で過剰発現されるＶＥＧＦに特異的に結合して、本発明の二重標的タンパク質を、ＶＥＧＦを発現する癌細胞に集中させることができるだけでなく、ＶＥＧＦと結合してそれ自体でも抗がん活性を有することができる。

本発明において、用語「血管内皮成長因子（ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ，ＶＥＧＦ）」とは、血管内皮細胞の生長活性を増進させる成長因子の一種で、大食細胞(マクロファージ）、平滑筋細胞、腫瘍細胞などのいくつかの細胞によって分泌される。胎生期の血管生成に重要な役割を果たすだけでなく、速い生長と代謝が行われる腫瘍組織での酸素の供給のために、血管新生（ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ）を誘導する役割をする。そのＶＥＧＦタンパク質とこれの受容体によるｐａｔｈｗａｙは、成体で、特に抗がん剤のターゲットシグナル伝達経路と研究されている。

併せて、前記二重標的タンパク質のＶＥＧＦ結合部位は、ヒトＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体との間の相互作用を阻害させるものを意味し、具体的には、ＶＥＧＦに特異的な二重標的タンパク質がＶＥＧＦに結合してＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ−２受容体との相互作用を阻害させることを意味するが、これに限定されない。

本発明の目的上、前記ＶＥＧＦ受容体は、哺乳類のＶＥＧＦに結合するタンパク質であれば、制限なく含まれるが、具体的には、ヒトＶＥＧＦに結合するタンパク質を意味することができる。

本発明のＶＥＧＦに特異的な二重標的タンパク質によるＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体との間の相互作用阻害によりＶＥＧＦのＶＥＧＦ受容体結合によるＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体シグナル伝達を阻害することになる。癌でＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体が結合すると、癌組織の血管内皮細胞（ｓｔｒｏｍａｌ／ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）でＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体シグナル伝達が活性化され、これはＤＬＬ４／Ｎｏｔｃｈシグナル伝達経路の作用機序とは異なり、新生血管形成過程を強く抑制して血管の数を減少させて、腫瘍内の血管の機能（ｖａｓｃｕｌａｒ ｆｕｎｃｔｉｏｎ）を弱化させて、がんの増殖や転移を抑制することが知られている。

したがって、本発明の前記ＤＬＬ４とＶＥＧＦに特異的な二重標的タンパク質は、互いに異なる機序のがん組織新生血管形成抑制能を示して、より優れた抗癌能力を持つ治療剤として使用することができる。

具体的には、前記二重標的タンパク質は、ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質及びＶＥＧＦに特異的に結合するＩｇＧ（Ｉｍｍｕｎｉｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｇ）形態の抗体がリンカーで連結された形態であってもよい。

本発明の用語「リンカー（ｌｉｎｋｅｒ）」とは、基本的には、２つの異なる融合パートナー（例えば、生物学的高分子など）を、水素結合、静電相互作用、ファンデルワールス力、ジスルフィド結合、塩橋、疎水性相互作用、共有結合などを利用して連結することができる連結体を意味するが、具体的には、生理学的条件または他の標準的なペプチド条件（例えば、ペプチド精製条件、ペプチド貯蔵条件）下、少なくとも一つのジスルフィド結合に参加できる少なくとも一つのシステインを持つことができ、単にそれぞれの融合パートナーを連結する役割以外にも、融合パートナーの間に一定の大きさの間隔を与える役割を果たすかまたは融合体に柔軟性または剛性を提供するヒンジ（ｈｉｎｇｅ）の役割を果たすことができる。前記リンカーは、非ペプチドリンカーまたはペプチドリンカーであってもよく、ペプチド結合、ジスルフィド結合等によって直接連結されているものもいずれも含むことができる。

本発明では、前記リンカーは、特にこれに限定されないが、具体的には、ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質及びＶＥＧＦに特異的に結合する抗体を連結できるポリペプチドであってもよく、より具体的には、前記ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質とＶＥＧＦに特異的に結合する抗体のＦｃ領域のＣ−末端を連結することができるペプチドリンカーであってもよく、さらに具体的には、ＧＧＧＧＳモチーフが３回繰り返された形のアミノ酸配列で構成されたペプチドリンカーであってもよい。前記ＧＧＧＧＳモチーフは、１〜１０回繰り返してもよく、最も具体的には、下記の配列番号１８のアミノ酸配列または配列番号１９のポリヌクレオチド配列によってコードされたアミノ酸配列で構成されてもよい。

リンカーペプチド（配列番号１８）：ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ
リンカーヌクレオチド（配列番号１９）：ＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＧＣＡＧＣＧＧＴＧＧＴＧＧＣＧＧＣＡＧＴＣ ＣＣＧＧＴＧＧＣＧＧＣＴＣＣ

本発明において、用語「非ペプチドリンカー」とは、繰り返し単位が２つ以上結合された生体適合性リンカーを意味し、前記繰り返し単位は、ペプチド結合ではなく、任意の共有結合を介して互いに連結されてもよい。

本発明の非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコール（ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ；ＰＥＧ）単独重合体、ポリプロピレングリコール単独重合体、エチレングリコール−プロピレングリコール共重合体、ポリオキシエチル化ポリオール、ポリビニルアルコール、ポリサッカライド、デキストラン、ポリビニールエチルエーテルのような生分解性高分子、脂質重合体、キチン類、ヒアルロン酸、またはこれらの組み合わせであってもよい。具体的には、ポリエチレングリコール単独重合体であってもよく、当該分野で既知のこれらの誘導体および当該分野の技術水準で容易に製造することができる誘導体も、本発明の範囲に含まれる。より具体的には、分子量１〜５ｋＤａの分子量であるポリエチレングリコール単独重合体であってもよく、最も具体的には、３．４ｋＤａ程度の両末端に両機能性アルデヒド（ｂｉｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ ａｌｄｅｈｙｄｅ）の形でＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質、及びＶＥＧＦに特異的に結合する抗体を連結させることができるリンカーであってもよい。特に、両末端に反応アルデヒドグループの反応基を有する場合、非特異的反応を最小限にするために効果的である。

前記リンカーを介して直接または間接的に連結されている部位は、特にこれに限定されないが、Ｆｃ部分、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆｖなどになってもよい。前記二重標的タンパク質は、特にこれに限定されないが、前記ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質の全部または一部及びＶＥＧＦに特異的に結合する抗体の全部または一部が連結された形；またはＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質の全部または一部及びＶＥＧＦに特異的に結合する抗体全体または一部がペプチドリンカーで連結された形となってもよい。

また、ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質の全部または一部及びＶＥＧＦに特異的に結合する抗体の重鎖の全部または一部がペプチドリンカーで連結された形；ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質の全部または一部及びＶＥＧＦに特異的に結合する抗体の軽鎖の全体または一部がペプチドリンカーで連結された形；またはこれらの組み合わせであってもよい。

本発明の実施例によると、本発明者等はＩｇＧ形態のアバスチンの重鎖領域Ｃ−末端とｓｃＦｖ形態のＤＬＬ４結合タンパク質をリンカーで連結した二重標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドをベクターに挿入して、これを動物細胞に導入してアバスチン−ＤＬＬ４結合二重標的タンパク質を分離して、ＤＬＬ４とＶＥＧＦに特異的に結合する二重標的タンパク質アバスチン−ＤＬＬ４ ＢｓＡｂを作製した。前記二重標的タンパク質分子は、アバスチンＩｇＧ抗体分子とＤＬＬ４結合ｓｃＦｖをリンカーで連結した構造を持っている（図１）。前記動物細胞に導入・発現したアバスチン−ＤＬＬ４結合二重標的タンパク質を分離して発現と純度を確認した（図２Ａ及び図２Ｂ）。また、アバスチン−ＤＬＬ４結合二重標的タンパク質が標的であるＶＥＧＦおよびＤＬＬ４に特異的に結合することを確認した（図３）。また、前記二重標的タンパク質は、各抗原に対する対照抗体と類似する結合活性を示して、ヒトＤＬＬ４に対しては３０ｎＭのＫＤ値を、ヒトＶＥＧＦに対しては０．１２６ｎＭのＫＤ値を示しており（表２〜３）、血管内皮細胞のＤＬＬ４とヒトノッチ１受容体との結合およびＶＥＧＦとＶＥＧＦ受容体との結合によるそれぞれのシグナル伝達経路が二重標的タンパク質の処理によって効果的に抑制されることを確認した（図１０）。これらの結果は、本発明のＤＬＬ４とＶＥＧＦに特異的な二重標的タンパク質がそれぞれの受容体であるノッチ及びＶＥＧＦ受容体との結合を効率的に遮断して、抗癌効果をもたらすことができることを示唆するもので、アバスチン耐性を持つヒト胃がん（ＳＣＨ）と肺癌（Ａ５４９）細胞株異種移植モデル（ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）で二重抗体の抗癌効果を確認した（図１１及び図１２）。

もう一つの態様として、本発明は、前記二重標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。

本発明で提供する前記二重標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、特にこれに限定されないが、哺乳類細胞（例えば、ヒト、サル、ウサギ、ラット、ハムスター、マウス細胞など）、植物細胞、酵母細胞、昆虫細胞または細菌細胞（例えば、大腸菌など）を含んでいる真核または原核細胞において、前記ポリヌクレオチドを複製および／または発現することができるベクターであってもよく、具体的には、宿主細胞で前記ポリヌクレオチドが発現されるように、適切なプロモーターに作動可能に連結されて、少なくとも一つの選別マーカーを含むベクターであってもよく、より具体的には、ファージ、プラスミド、コスミド、ミニ−染色体、ウィルス、レトロウィルスベクターなどに前記ポリヌクレオチドが導入された形態になってもよい。

前記二重標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含む発現ベクターは、前記二重標的タンパク質の重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドをそれぞれ含む発現ベクターまたは重鎖または軽鎖をコードするポリヌクレオチドの両方を含む発現ベクターであってもよい。

本発明で提供される前記発現ベクターが導入された形質転換体は、特にこれに限定されないが、前記発現ベクターが導入されて形質転換された大腸菌、ストレプトマイセス、ラットチフス菌などのバクテリア細胞；酵母細胞；ピキア・パストリスなどの菌類細胞；ドロソフィラ、スポドプテラＳｆ９細胞などの昆虫細胞；ＣＨＯ（中国ハムスター卵巣細胞、ｃｈｉｎｅｓｅ ｈａｍｓｔｅｒ ｏｖａｒｙ ｃｅｌｌｓ）、ＳＰ２／０（マウス骨髄腫）、ヒトのリンパ芽球（ｈｕｍａｎ ｌｙｍｐｈｏｂｌａｓｔｏｉｄ）、ＣＯＳ、ＮＳＯ（マウス骨髄腫）、２９３Ｔ、ボーズ黒色腫細胞、ＨＴ−１０８０、ＢＨＫ（子ハムスター腎臓細胞、ｂａｂｙ ｈａｍｓｔｅｒ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＨＥＫ（ヒト胚性腎細胞、ｈｕｍａｎ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｃｅｌｌｓ）、ＰＥＲＣ．６（ヒト網膜細胞）などの動物細胞；または植物細胞になってもよい。本発明の一実施例によると、ＣＨＯ−Ｓ細胞を宿主細胞として利用した。

本発明において、用語「導入」とは、二重標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを含むベクターを宿主細胞に伝達する方法を意味する。このような導入は、カルシウムホスフェート−ＤＮＡ共沈殿法、ＤＥＡＥ−デキストラン−媒介トランスフェクション法、ポリブレン−媒介形質感染法、電気衝撃法、微細注射法、リポソーム融合法、リポフェクタミンおよび原形質体融合法などの当分野で公知の様々な方法によって行われてもよい。また、形質導入は、感染（ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を手段としてウィルス粒子を使用して目的物を細胞内に伝達させることを意味する。併せて、遺伝子のボンバードメント（ｂｏｍｂａｒｄｍｅｎｔ）などによりベクターを宿主細胞内に導入することができる。本発明での導入は、形質転換と混用して使用することができる。

さらに他の態様として、本発明は、前記二重標的タンパク質を製造する方法を提供する。
具体的には、（ａ）前記形質転換体を培養して、二重標的タンパク質を生産する工程；及び（ｂ）前記（ａ）工程で生産された二重標的タンパク質を回収する工程を含む、ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質及びＶＥＧＦ（Ｖａｓｃｕｌａｒ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ）に特異的に結合する抗体を含む二重標的タンパク質の製造方法であってもよい。

より具体的には、前記二重標的タンパク質の製造方法は、（ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドおよび重鎖可変領域は、配列番号２で表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３で表される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４で表される重鎖ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は、配列番号５で表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６で表される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得する工程；（ｂ）前記（ａ）工程で取得したＶＥＧＦに特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドのうちＦｃ領域をコードするポリヌクレオチドの３’−末端およびＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの５’−末端をリンカーで連結して二重標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得する工程；（ｃ）前記（ｂ）工程の二重標的タンパク質をコードするポリヌクレオチドをクローニングして発現ベクターを製造する工程；（ｄ）前記（ｃ）工程の発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を培養する工程；及び（ｅ）前記（ｄ）工程の形質転換体から二重標的タンパク質を回収する工程を含む方法であってもよい。

また、前記製造方法は、（ａ）ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体をコードするポリヌクレオチドおよび重鎖可変領域は、配列番号２で表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３で表される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４で表される重鎖ＣＤＲ３を含み、軽鎖可変領域は、配列番号５で表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６で表される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む、ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質をコードするポリヌクレオチドを取得する工程；（ｂ）前記（ａ）工程のポリヌクレオチドをクローニングして発現ベクターを製造する工程；（ｃ）前記（ｂ）工程の発現ベクターを宿主細胞に導入して形質転換体を培養する工程；及び（ｄ）前記（ｃ）工程の形質転換体からＶＥＧＦに特異的に結合する抗体およびＤＬＬ４に結合するタンパク質を取得して、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体のＦｃ領域のＣ−末端及びＤＬＬ４に結合するタンパク質のＮ−末端をリンカーで連結する工程を含む方法であってもよい。

本発明の二重標的タンパク質は、前記公知の組換え手段または生化学的方法によって製造することができ、抗体は、適切な宿主細胞に導入され、形質転換体の培養液から回収することができる。

具体的には、二重標的タンパク質は、公知の分離方法によって分離することができ、例えば、タンパク質Ａ−セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析、またはアフィニティー・クロマトグラフィーのような通常の免疫グロブリン精製手順によって培養培地から適切に分離することができるが、これに限定されない。

さらに他の態様として、本発明は、前記二重標的タンパク質を含む組成物を提供する。
さらに他の態様として、本発明は、前記二重標的タンパク質を含む癌治療用組成物を提供する。

前記二重標的タンパク質は、ＤＬＬ４とＶＥＧＦに同時に結合してノッチとＶＥＧＦ受容体との結合を阻害することにより、癌の成長抑制に関与することができる。前記ＤＬＬ４／ノッチ受容体とＶＥＧＦ／ＶＥＧＦ受容体については、前述した通りである。本発明の組成物は、ＤＬＬ４とＶＥＧＦに特異的に結合する二重標的タンパク質を含む組成物を生体内に投与して、癌の発生、増殖、または転移を抑制させたり、進行を防ぎ、がんを治療することができる。

本発明で、用語「癌」とは、癌の種類を制限されずに含むが、その例として食道癌、胃癌、大腸癌、直膓癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、睾丸癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、膵臓癌、骨癌、結合組織癌、皮膚癌、脳腫瘍、甲状腺癌、白血病、ホジキン病、リンパ腫または多発性骨髄血液癌であり得る。本発明において、用語「治療」とは、組成物の投与によって癌の症状が好転するか、有利に変更されているいずれかの行為を意味する。

また、本発明の薬学的組成物は、薬学的に許容可能な担体をさらに含んでもよい。
本発明において、用語「薬学的に許容可能な担体」とは、生物体を刺激せずに投与化合物の生物学的活性および特性を阻害しない担体または希釈剤をいう。液状溶液に製剤化される組成物において許容される薬学的担体としては、滅菌および生体に適したものであって、生理食塩水、滅菌水き、リンゲル液、緩衝食塩水、アルブミン注射溶液、デキストロース溶液、マルトデキストリン溶液、グリセロール、エタノール、およびこれらの成分のうち１成分以上を混合して使用することができ、必要に応じて、抗酸化剤、緩衝液、静菌剤などの他の通常の添加剤を添加してもよい。また、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、及び潤滑剤を付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤に製剤化することができる。

前記薬学的組成物は、経口または非経口の種々に剤形であってもよい。
製剤化する場合には、通常用いる充鎮剤、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、界面活性剤等の希釈剤または賦形剤を用いて調剤される。経口投与のための固形製剤には、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤などが含まれ、このような固形製剤は、前記化合物に少なくとも一つ以上の賦形剤、例えば、デンプン、カルシウムカーボネート（ｃａｌｃｉｕｍ ｃａｒｂｏｎａｔｅ）、スクロース（ｓｕｃｒｏｓｅ）またはラクトース（ｌａｃｔｏｓｅ）、ゼラチン等を混ぜて調製される。また、単純な賦形剤以外にマグネシウムステアレート、タルクのような潤滑剤も用いられる。経口のための液状製剤には、懸濁剤、内容液剤、油剤、シロップ剤等が該当し、よく使用される単純希釈剤である水、リキッドパラフィン以外に種々の賦形剤、例えば湿潤剤、甘味制、芳香剤、保存剤等が含まれる。非経口投与のための製剤には滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、油剤、凍結乾燥製剤、座薬が含まれる。非水性溶剤、懸濁剤としては、プロピレングリコール(ｐｒｏｐｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ)、ポリエチレングリコール、オリーブ油のような植物性油、エチルオレートのような注射可能なエステル等が用いられる。座薬の基剤としては、ウィテプゾール(ｗｉｔｅｐｓｏｌ)、マクロゴール、ツイン（ｔｗｅｅｎ）６１、カカオ脂、ラウリン脂、クリセロゼラチン等が用いられる。

前記薬学的組成物は、錠剤、丸剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、懸濁剤、内用液剤、乳剤、シロップ剤、滅菌された水溶液、非水性溶剤、懸濁剤、乳剤、凍結乾燥製剤と坐剤からなる群から選択されるいずれか一つの剤形を有してもよい。

前記本発明の組成物は、薬学的に有効な量で投与する。本発明で、用語「薬剤学的に有効な量」とは、医学的治療または予防に適用可能な合理的な受益／危険の割合で疾患を治療するのに十分な量を意味し、有効用量レベルは、個体の種類および疾患の重症度、患者の年齢、性別、疾病の種類、薬物の活性、薬物に対する敏感度、使用された本発明組成物の投与時間、投与経路および排出比率、治療期間、使用された本発明の組成物と同時使用される薬物を含んだ要素およびその他医学分野に良く知られた要素により定められる。そして、単一または多重投与してもよい。前記要素を全て考慮して副作用なしに最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定することができる。

本発明の一実施例によると、本発明の二重標的タンパク質がＶＥＧＦ及びＤＬＬ４の両方に結合し（図３、図４Ａおよび図４Ｂ）、ＤＬＬ４を中和させることができ（図５）、アバスチン耐性を持つヒト胃がん（ＳＣＨ）及び肺癌（Ａ５４９）細胞株異種移植モデルで二重標的タンパク質の抗癌効能を確認して（図１１及び図１２）、癌治療用組成物の有効成分として使用することができることを確認した。

さらに他の態様として、本発明は、前記二重標的タンパク質を含む薬学的組成物を利用して癌を治療する方法を提供する。前記方法は、薬学的組成物を薬学的に有効な量で投与することによって行われてもよい。

前記二重標的タンパク質及び薬学的に有効な量については、前述した通りである。
前記二重標的タンパク質は、薬学的に許容可能な担体をさらに含む薬学的組成物を癌が発症したか、発症の疑いがある個体に投与する工程を含む癌を治療する方法であってもよく、使用できる担体及び癌は、前述した通りである。前記個体は、牛、豚、羊、鶏、犬、ヒトなどを含む哺乳動物、鳥類などを含んでもよく、本発明の組成物の投与によって癌が治療されている個体は、制限せず含んでもよい。

この時、組成物は液剤、散剤、エアゾール、カプセル剤、腸溶剤またはカプセル剤または座薬の形態で投与することができる。投与経路は、腹腔内投与、静脈内投与、筋肉内投与、皮下内投与、内皮投与、経口投与、局所投与、鼻内投与、肺内投与、直腸内投与などを含むが、これらに制限されない。しかし経口投与時、ペプチドは消化されるので、経口用組成物は活性薬剤をコーティングしたり胃での分解から保護されるように剤形化されなければならない。また、製薬組成物は、活性物質が標的細胞に移動できる任意の装置によって投与できる。
さらに他の態様として、本発明は、前記二重標的タンパク質を含む癌診断用組成物を提供する。

前記二重標的タンパク質及び癌については、前述した通りである。
本発明において、用語「診断」とは、病理状態の存在または特徴を確認することを意味する。本発明の目的上、診断は、癌を発症したか否かを確認することである。

本発明の癌診断用組成物は、本発明の二重標的タンパク質を利用して、がんが疑われる個体の分離された試料のＶＥＧＦまたはＤＬＬ４タンパク質のレベルを測定して、測定されたＶＥＧＦまたはＤＬＬ４タンパク質のレベルが、正常対照群試料よりも高い場合、がんを判断するのに使用することができる。

これのためのタンパク質のレベルを測定する分析法としては、ウェスタンブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ）、ＥＬＩＳＡ、放射性免疫測定法（ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ）、放射性免疫拡散法（ｒａｄｉａｌｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、オクタロニー免疫拡散法（Ｏｕｃｈｔｅｒｌｏｎｙ ｉｍｍｕｎｏｄｉｆｆｕｓｉｏｎ）、ロケット免役電気泳動法（ｒｏｃｋｅｔ ｉｍｍｕｎｏｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）、免疫組織染色（ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｓｔａｉｎｉｎｇ）、免疫沈降反応分析法（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、補体固定分析法（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ ｆｉｘａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）、ＦＡＣＳ及びタンパク質チップ分析法（ｐｒｏｔｅｉｎ ｃｈｉｐ ａｓｓａｙ）を含むか、これに限定されるのではない。前記のような分析方法によって、正常対照群と癌の疑いの個体でのＶＥＧＦまたはＤＬＬ４タンパク質レベルを比較することができ、これにより、実際の癌が疑われる患者から癌が発症したか否かについて診断することができるようになる。

本発明の癌診断用組成物は、本発明の二重標的タンパク質の他に前記のタンパク質のレベルを測定する方法を実行するために必要なもので、当業界に知られていることを制限せずにさらに含んでもよい。

さらに他の態様として、本発明は、（ａ）前記の二重標的タンパク質を利用して、がんが疑われる個体の分離された試料のＶＥＧＦまたはＤＬＬ４タンパク質のレベルを測定する工程；及び（ｂ）前記（ａ）工程で測定されたＶＥＧＦまたはＤＬＬ４タンパク質のレベルが、正常対照群よりも高い場合、がんと判断する工程を含む、癌の診断方法を提供する。

前記二重標的タンパク質、癌、個体、診断、およびタンパク質のレベルを測定する工程（方法）については、前述した通りである。

本発明において、用語「試料」とは、癌患者でＶＥＧＦまたはＤＬＬ４の発現レベルの差が出る、全血、血清、血液、血漿、唾液、尿、喀痰、リンパ液、脳脊髄液、および細胞間液のような試料などを含むが、これに制限されない。

さらに他の態様として、本発明は、配列番号２１で表されるＤＬＬ４（Ｄｅｌｔａ−ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ４）タンパク質のアミノ酸配列で５８番〜６５番アミノ酸配列、及び１１０番〜１１５番のアミノ酸配列を含む、ＤＬＬ４の立体構造エピトープを提供する。

本発明の一実施例では、架橋化反応と質量分析を介して、配列番号２１のＤＬＬ４で架橋化反応が起こるアミノ酸残基を究明しており、前記残基を含む５８番〜６５番アミノ酸配列［ＦＲＶＣＬＫＨＦ］及び１１０番〜１１５番アミノ酸配列（配列番号２３）の二つの断片が図７に示すように、連続した分子表面を構成することにより、ＤＬＬ４のエピトープを形成することを確認した。

さらに他の態様として、本発明は、前記立体構造エピトープを認識する、ＤＬＬ４に特異的に結合するモノクローナル抗体を提供する。
本発明のＤＬＬ４、モノクローナル抗体、ベクター、形質転換体等は、前述した通りである。

具体的には、前記モノクローナル抗体は、配列番号２で表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３で表される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域および配列番号５で表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６で示される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む形態であってもよい。より具体的には、前記重鎖は、配列番号８で表されるアミノ酸配列を含んでもよく、前記軽鎖は、配列番号９で表されるアミノ酸配列を含んでもよい。

さらに他の態様として、本発明は、前記モノクローナル抗体をコードするポリヌクレオチド、前記ポリヌクレオチドを含む発現ベクター、及び前記発現ベクターが導入された形質転換体を提供する。

本発明のＤＬＬ４、モノクローナル抗体、ベクター、形質転換体などは、前述した通りである。
さらに他の態様として、本発明は、前記二重標的タンパク質を、がんが疑われる個体に投与する工程を含む、癌の治療方法を提供する。

前記個体は、癌の予防または治療が必要な個体であり、ヒトだけでなく、がん及びこれと類似する症状の治療を必要とする牛、馬、羊、豚、ヤギ、ラクダ、羚羊、犬、猫などの哺乳動物であってもよいが、これらに限定されない。

本発明で使用される用語「投与」とは、ある適切な方法で患者に本発明の薬学的組成物を導入することを意味し、本発明の組成物の投与経路は、目的組織に到達することができるのであれば、経口または非経口の様々な経路を通じて投与してもよい。

本発明の癌の治療方法は、二重標的タンパク質またはこれを含む薬学的組成物を治療学的に有効な量で投与することを含む。適切な計１日の使用量は、正しい医学的判断の範囲内で処置医によって決定することができることは、当業者に自明なことである。また、１回または数回に分けて投与してもよい。しかし、本発明の目的上、特定の患者のための具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって、他の製剤が使用されるか否かをはじめとする具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般健康状態、性別および食事、投与時間、投与経路、および組成物の分泌率、治療期間、具体的組成物と共に使用するか同時使用される薬物をはじめとする様々な因子と医薬分野でよく知られている類似因子に応じて異なるように適用してもよい。

以下、実施例に基づいて本発明の構成と効果をさらに詳細に説明する。これらの実施例は、単に本発明を例示するためのものであって、本発明の範囲がこれらの実施例によって制限されるものではない。

≪実施例１：抗ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ二重標的タンパク質の製造≫
実施例１−１：ＤＬＬ４抗原の製造
ヒトＤＬＬ４の細胞外ドメインの抗原は、アールアンドディシステム社から提供されたヒトＤＬＬ４タンパク質（Ｃａｔ：１５０６−Ｄ４／ＣＦ）を使用した。このＤＬＬ４抗原タンパク質は、Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ Ｎｏ．Ｑ９ＮＲ６１のＤＬＬ４アミノ酸配列の２７番目〜５２４番目のアミノ酸を含む。前記タンパク質Ｃ−末端にヒスチジン−タグ（１０−Ｈｉｓ ｔａｇ）が結紮されている。

さらに他のＤＬＬ４の細胞外ドメインの特定領域の抗原を製造した。この特定領域は、アミノ酸２７〜アミノ酸２５１を含む。この領域は、Ｎｏｔｃｈ１受容体と結合すると知られている「ＤＳＬ（デルタ／セレート（Ｓｅｒｒａｔｅ）／ｌａｇ−２）」ドメインと称されるモチーフを含有する。Ｆｃタンパク質に融合されたＤＬＬ４の細胞外ドメインの欠失断片（アミノ酸２７〜２５１）をコードするポリヌクレオチドの上流にＣＭＶプロモーターを含む哺乳類発現プラスミドベクターが、標準組換えＤＮＡ技術を使用して製造された。Ｆｃタンパク質に融合されたヒトＤＬＬ４のキメラであるＤＬＬ４の欠失断片をコードする付加的な構築物が、通常の遺伝子組換えＤＮＡ技術を使用して製造された。前記製造された構築物をＨＥＫ２９３Ｅ細胞に一時的に形質感染して、Ｆｃタンパク質に融合されたヒトＤＬＬ４のアミノ酸２７〜２５１を含む組換え融合タンパク質を発現させた。前記タンパク質を収得するために、７２時間ごとにコンディショニング培地を収集し、これを４回繰り返した。このコンディショニング培地からタンパク質Ａ親和性クロマトグラフィーを使用して精製した。

実施例１−２：ライブラリファージの製造
多様性を持つヒト由来ｓｃＦｖ（ｓｉｎｇｌｅ−ｃｈａｉｎ ｖａｒｉａｂｌｅ ｆｒａｇｍｅｎｔ）ライブラリ細胞２．７×１０^１０個を２Ｘ ＹＴ ＣＭ［Ｔｒｙｐｔｏｎｅ（ＣＯＮＤＡ，１６１２．００）１７ｇ、イースト抽出物（ＣＯＮＤＡ，１７０２．００）１０ｇ、ＮａＣｌ（ｓｉｇｍａ，Ｓ７６５３−５ｋｇ）５ｇ、クロラムフェニコール（ｓｉｇｍａ，Ｃ０８５７）３４μｇ／ｍＬ）］、２％グルコース（ｓｉｇｍａ，Ｇ５４００）及び５ｍＭ ＭｇＣｌ_２（ｓｉｇｍａ，Ｍ２３９３）を含む培地（３Ｌ）で３７℃で２〜３時間培養した後（ＯＤ_６００＝０．５〜０．７）、ヘルパーファージ（ｈｅｌｐｅｒ ｐｈａｇｅ）を感染させ２Ｘ ＹＴ ＣＭＫ（２Ｘ ＹＴ ＣＭ、カナマイシン（ｓｉｇｍａ，Ｋ１８７６）７０μｇ／ｍＬ、１ｍＭ ＩＰＴＧ（ＥＬＰＩＳＢＩＯ，ＩＰＴＧ０２５））培地に３０℃で１６時間培養した。培養した細胞を遠心分離（４５００ｒｐｍ、１５分、４℃）した後、上澄み液に４％ＰＥＧ（Ｆｌｕｋａ，８１２５３）６０００と３％ＮａＣｌ（ｓｉｇｍａ，Ｓ７６５３）を添加してよく溶かした後、氷で１時間反応させた。再度遠心分離（８０００ｒｐｍ、２０分、４℃）した後、ペレットにＰＢＳを添加して溶かした後、遠心分離（１２０００ｒｐｍ、１０分、４℃）して、ライブラリファージを含む上澄み液を新しいチューブに入れ、４℃で保管した。

実施例１−３：ファージディスプレイ（ｐｈａｇｅ ｄｉｓｐｌａｙ）によるパニング（ｐａｎｎｉｎｇ）
ヒトＤＬＬ４結合する抗ＤＬＬ４抗体を選別するために、ヒトＤＬＬ４抗原に対するパニングを３回（ｒｏｕｎｄ）進行した。

免疫試験管（ｉｍｍｕｎｏｔｕｂｅ）に１０μｇ／ｍＬの濃度の組換えヒトＤＬＬ４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍ社）溶液を添加して４℃で一晩試験管の表面にタンパク質を吸着させた後、ウシ血清アルブミン１％溶液を試験管に添加してＤＬＬ４が吸着されていない表面を保護した。試験管を空にして、１％ウシ血清アルブミン溶液に分散された１０^１２ＣＦＵの抗体ファージライブラリを入れて抗原と結合させた。非特異的に結合したファージをＰＢＳ−Ｔ（Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０）溶液に５回洗浄した後、残っている抗原特異的ファージ抗体を１００ｍＭトリエチルアミン溶液を利用して回収した。

前記回収されたファージを１Ｍトリスバッファー（ｐＨ７．４）で中和させた後、ＥＲ２５３７大腸菌に３７℃で１時間感染させ、感染した大腸菌をカルベニシリンを含有するＬＢ（Ｌｕｒｉａ−Ｂｅｒｔａｎｉ）寒天培地に塗抹して３７℃で一晩培養した。翌日、培養された大腸菌を、４ｍＬのＳＢ（ｓｕｐｅｒｂｒｏｔｈ）−カルベニシリン培養液に懸濁し、１５％グリセロールを添加して、一部は−８０℃に保管し、残りのうち５０μＬを２０ｍＬのＳＢ−カルベニシリン培養液に２％グルコース溶液（ｇｌｕｃｏｓｅ）を添加して、３７℃で培養した。

培養液の吸光度が６００ｎｍで（ＯＤ_６００）０．６になると、遠心分離して培養液を除去して、これを再び２０ｍＬのＳＢ−カルベニシリン培養液に懸濁した後、１０^１２ＰＦＵのＶＣＳＭ１３ヘルパーファージを入れて、ゆっくりと攪拌し、３７℃で培養した。翌日培養液を遠心分離した後、培養液のみ取りポリエチレングリコール８０００（ＰＥＧ８０００）を４％、塩化ナトリウム（ＮａＣｌ）を３％添加して４℃で３０分間沈殿させた後、遠心分離した。上澄み液を除去し、沈殿したファージをＰＢＳ１ｍＬに懸濁させて、これをライブラリとして使用して、前記のパニング過程を繰り返すことにより、抗原特異的クローンを増幅／濃縮させた。

ヒトＤＬＬ４タンパク質内Ｎｏｔｃｈ１と結合する部位に結合する抗体をスクリーニングするために、パニング時、ヒトＤＬＬ４タンパク質とヒトＤＬＬ４特定の領域を指す欠失断片（アミノ酸２７〜２５１）を交差してパニングを進行し、３回（ｒｏｕｎｄ）進行した。その後抗体遺伝子を含むＬＢ−カルベニシリン寒天培地に塗抹、培養して、単一コロニーを得て、これを４００μＬ ＳＢ−カルベニシリン培養液に接種、培養した後ＩＰＴＧで誘導してｓｃＦｖの形のタンパク質を大腸菌のペリプラズム（ｐｅｒｉｐｌａｓｍ）で発現した。大腸菌をＴＥＳ溶液（Ｔｒｉｓ，ＥＤＴＡ，ｓｕｃｒｏｓｅ）に懸濁した後、４℃で１時間放置した後、遠心分離してペリプラズムを抽出し、これをＥＬＩＳＡ法を使用して組換えヒトＤＬＬ４抗原とｓｃＦｖとの結合を確認するために使用した。

結合されたｓｃＦｖは、ＨＲＰ（Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ ｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ）−抗−ＨＡ抗体とテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質を用いて検出した。これから確認された抗原特異的抗体クローンは、塩基配列分析法を使用して分析した。前記選別されたｓｃＦｖの配列を分析した結果は、下記表１の通りである。

前記配列を有する抗−ＤＬＬ４抗体を「ＭＬＣＫ−２」と命名した。

実施例１−４：ＤＬＬ４とＶＥＧＦをターゲットにする二重標的タンパク質（二重抗体）の製造
前記実施例１−３で作製されたヒトＤＬＬ４と結合するｓｃＦｖの形態の抗体をリンカーを利用して、アバスチンＩｇＧ形態と連結して、ヒトＶＥＧＦとも結合することができる二重標的タンパク質の発現ベクターを製造した（図１Ｂ）。

前記製造された二重標的タンパク質は、配列番号１の重鎖アミノ酸配列（ＶＥＧＦ−ＤＬＬ４ＢｓＡｂ ｈｅａｖｙ ｃｈａｉｎ）と配列番号２０の軽鎖アミノ酸配列を有する。前記鎖は、配列番号２で表された重鎖ＣＤＲ１；配列番号３で表された重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４で表された重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域を含み、軽鎖は配列番号５で表された軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６で表され軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７で表された軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む。

二重標的タンパク質の発現ベクターをＣＨＯ細胞に抗体産生のために、細胞内の遺伝子伝達効率を高めるポリマーを利用して当該遺伝子を形質注入した浮遊動物細胞を５００ｍＬ培養用三角フラスコ（コーニング・コスタ）でボトル１本あたり２００ｍＬで培養して合計で１Ｌを培養した。ＩｇＧ含有量が非常に低い（ｕｌｔｒａ ｌｏｗ ＩｇＧ）ウシ胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，インビトロジェンコーポレーション）を含むＲＰＭＩ培地（インビトロジェンコーポレーション）とＣＨＯ細胞専用培地の混合液１Ｌを４日間細胞インキュベーター（サンヨー）で培養して組換えタンパク質を生産した。細胞培養液を収得して遠心分離を実行して、浮遊細胞と分泌された組換えタンパク質を含む上澄み液を分離して０．２２μｍ真空フィルタ装置（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で１回濾過した。

抗体精製のために、一次的に組換えプロテイン−Ａセファローズカラム（Ｈｉｔｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ Ｓｕｒｅ，５ｍＬ，ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用して、アバスチン−ＤＬＬ４ ＢｓＡｂ二重標的抗体を培養液から精製した。具体的には、前記濾過された培養培地を、組換えプロテイン−Ａセファローズカラムにロードした。カラムを５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ（ｐＨ７．５）、１００ｍＭ ＮａＣｌで２０倍カラム体積だけ洗浄し、１０倍カラム体積の５０ｍＭ Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ緩衝溶液（ｐＨ５．０）で不純物を洗浄した。５ｍＭ Ｎａ−ｃｉｔｒａｔｅ １０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝溶液（ｐＨ３．４）で抗体を溶出させて１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝溶液（ｐＨ８．０）で中和させた。

二次精製は、ＨｉＬｏａｄ ＴＭ ２６／６０ Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ Ｐｒｅｐ ｇｒａｄｅ ＧＬ（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を使用してアバスチン−ＤＬＬ４ ＢｓＡｂ二重標的抗体の沈殿物（Ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を除去する精製過程を行った。カラムを５０ｍＭ Ｎａ−Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ緩衝溶液（ｐＨ６．０）、２０ｍＭＬ−Ａｒｇで２倍カラム体積だけ平衡化させた後、一次精製済みのアバスチン−ＤＬＬ４ ＢｓＡｂ二重標的抗体を流してサイズに応じた分離精製を行った。

前記カラムを利用して分離精製した分画物をＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析（図２）して、陽性分画物を集めて遠心分離型濃縮機（アミコンウルトラ、Ａｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ、３０，０００ＭＷＣＯ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）で濃縮させた。同じ遠心分離型濃縮機を使用してリン酸化剤形緩衝溶液で緩衝剤の交換および濃縮を実施した。最後に、抗体を０．２２μｍ空隙直径のシリンジフィルターで滅菌濾過し、吸光度（Ａ２８０）を測定して抗体濃度を決定した。

≪実施例２：ＥＬＩＳＡを使用した二重標的タンパク質のＤＬＬ４とＶＥＧＦの結合力分析≫
抗ＤＬＬ４、抗ＶＥＧＦ二重標的タンパク質に対してＥＬＩＳＡベースの溶液発色試験を使用して二重標的タンパク質の結合力を評価した。９６ウェルプレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅｓ，ＮＵＮＣ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）を４℃で一晩５０ｎｇ／ｍＬ濃度のｈＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃａｔ：２９３−ＶＥ）と２００ｎｇ／ｍＬ濃度のｒｈＤＬＬ４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ，ｃａｔ：１５０６−Ｄ４／ＣＦ）でウェル当り１００μＬずつコーティングした後、非特異的結合部位をＢＳＡで２時間遮断させた。９６ウェルマイクロタイタープレート上で抗体を１２８ｎＭおよび６４ｎＭで１／５ずつ希釈を行って、ｈＤＬＬ４及びｈＶＥＧＦタンパク質でコーティングされたプレートに１００μＬずつ接種した後、２時間恒温処理して０．０５％ツイン２０（ｔｗｅｅｎ ２０）を含むＰＢＳで５回洗浄した。プレートに結合された抗体を検出するためにＨＲＰが接合された抗Ｆａｂ抗体（Ｐｉｅｒｃｅ，ｃａｔ：３１４１４）を１：４００００で希釈して洗浄された９６ウェルプレートに処理した後、１時間３７℃で反応させた後、比色用基質（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）を使用して発色させ、酵素反応を０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸で中止させた。吸光度は、ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）機器を利用して、４５０ｎｍの波長で測定した。

図３で確認できるように、本発明の二重標的タンパク質が標的であるＶＥＧＦおよびＤＬＬ４に特異的に結合することを確認した。

≪実施例３：ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ二重標的タンパク質のＤＬＬ４とＶＥＧＦの平衡解離定数（ＫＤ）の分析アッセイ≫
前記実施例１で分離精製された二重標的タンパク質（二重抗体）をアバスチン−ＤＬＬ４ ＢｓＡｂと命名し、分離精製された抗体の抗原に対する親和度を次のように分析した。アバスチン−ＤＬＬ４ ＢｓＡｂ二重標的抗体のＤＬＬ４とＶＥＧＦの結合能の差を調べるためにＢＩＡＣＯＲＥアッセイを実施した。

ＳＰＲ分析は、Ｔ２００を使用して、ｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒはＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ ＨＥＰＥＳ，ｐＨ７．４，１５０ｍＭ ＮａＣｌ，３ｍＭ ＥＤＴＡ，０．１５％ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ Ｐ２０）を使用した。表面準備はｗｉｚａｒｄ ｐｒｏｇｒａｍのｓｕｒｆａｃｅ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ＿ｔａｒｇｅｔ ｉｍｍｏｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎ：２５℃、５μＬ／ｍｉｎ）を利用して、リガンドであるｈＶＥＧＦとｈＤＬＬ４を１０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）緩衝溶液（ｐＨ４．５）に、それぞれ５μｇ／ｍＬ、４μｇ／ｍＬとなるように希釈してＣＭ５チップ表面に各実験が目標とするターゲット固定化レベルだけ固定した。固定化は、２つの流路（Ｆｃ，ｆｌｏｗ ｃｅｌｌ）が一つのセットで行われ、本実験では、一番目、三番目の流路はｂｌａｎｋ、二番目の流路はｈＶＥＧＦで固定化して、四番目の流路はｈＤＬＬ４で指定した。一番目、三番目の流路は、非特異的な結合とバッファによる変化数値を示すｒｅｆｅｒｅｎｃｅで、実験結果は、Ｆｃ２−Ｆｃ１、Ｆｃ４−Ｆｃ３の数値を使用した。ｈＶＥＧＦ、ｈＤＬＬ４と結合する物質で、アバスチン−ＤＬＬ４ ＢｓＡｂ二重標的抗体をモル濃度に換算してｒｕｎｎｉｎｇ ｂｕｆｆｅｒで１００ｎＭに希釈した後、１／２連続希釈して５濃度区間で分析した。分析試料は、最小希釈倍数１００以上になるように高純度／高濃度で準備して緩衝液の変化による影響（Ｂｕｆｆｅｒ ｅｆｆｅｃｔ）を最小限に抑えた。すべての分析は、Ｗｉｚａｒｄプログラムを利用して、一つの試料に対して２倍数で行われ、すべての分析の間に再活性化工程（ｒｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｓｔｅｐ）を置いて実験のベースラインが一定に維持されるようにした。

結果は、Ｂｉａｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｓｏｆｔｗａｒｅ ４．０ ｖｅｒｓｉｏｎで分析した。Ｆｃ２−Ｆｃ１、Ｆｃ４−Ｆｃ３の結果でベースラインを０に設定した後、緩衝液注入（ａｎａｌｙｔｅ ０ｎＭ）の部分を全ｓｅｎｓｏｒｇｒａｍから引いた後、結果をＢｉｖａｌｅｎｔ ｂｉｎｄｉｎｇ ｍｏｄｅｌを使用して結合親和度の分析を行った。分析項目は、Ｋ_ａ（Ｍ^−１ｓ^−１）、Ｋｄ（ｓ^−１）、ＫＤ（Ｍ）である。Ｋ_ａは親和度（ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ）を示す結合定数（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）であり、Ｋｄは、安全性（ｓｔａｂｉｌｉｔｙ）を示す解離定数（ｄｉｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ）である。

下記表２に二重標的タンパク質のｈＶＥＧＦの結合能分析結果を示し、下記表３に二重標的タンパク質のｈＤＬＬ４の結合能分析結果を示した。

前記表２と表３で確認できるように、平衡解離定数であるＫ_Ｄ（Ｍ）は、ｋ_ｄ／ｋ_ａに換算した。ｈＶＥＧＦの結合能分析結果、Ｋ_Ｄ値が０．１２６ｎＭレベルでアバスチンＩｇＧの平衡解離定数と類似する値を得て（図４Ａおよび表２）、ｈＤＬＬ４に対する結合能分析結果、Ｋ_Ｄ値が３０ｎＭレベルの値を得た（図４Ｂと表３）。これは、本発明の二重標的タンパク質がそれぞれの抗原に対する結合能が妨害されずに高いレベルを維持していることを示唆する。

≪実施例４：ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ二重標的タンパク質の中和効果アッセイ≫
前記アバスチン−ＤＬＬ４ ＢｓＡｂ二重標的抗体について、ＥＬＩＳＡ−ベースの溶液競争実験を介して中和効果を評価した。９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ−Ｉｍｍｕｎｏ Ｐｌａｔｅｓ，ＮＵＮＣ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ）にＰＢＳで希釈された５００ｎｇ／ｍＬ濃度のｈＮｏｔｃｈ−１−ｈＦｃタンパク質（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）をウェル当り１００μＬずつ添加した後、４℃で一晩コーティングした後、ＢＳＡで２時間処理して、非特異的結合部位を遮断させた。

９６ウェルマイクロタイタープレート上でアバスチン−ＤＬＬ４ ＢｓＡｂ二重標的抗体（精製されたタンパク質）を０ｎＭ〜１４０ｎＭの範囲の濃度で抗体を抗原タンパク質（ヒトＤＬＬ４−Ｈｉｓ，６００ｎｇ／ｍＬ）の系列希釈液と予備混合させた。前記抗原と抗体を３０分間恒温処理した後、遊離抗体の測定のために前記混合溶液をＤＬＬ４受容体であるｈＮｏｔｃｈ−１−ｈＦｃタンパク質で予めコーティング（５０ｎｇ／ウェル）されたマイクロタイタープレートに移した。その後、前記プレートを２時間恒温処理して０．０５％ツイン２０（ｔｗｅｅｎ ２０）を含むＰＢＳで５回洗浄し、プレートに結合されたＤＬＬ４抗原をＨＲＰ−接合されたＨｉｓ抗−マウスＩｇＧポリクローナル抗体試薬（Ｒｏｃｈｅ ａｐｐｌｉｅｄ ｓｃｉｅｎｃｅ）で検出するために、１：８００の割合で前記ＨＲＰ−接合されたＨｉｓ抗−マウスＩｇＧポリクローナル抗体を洗浄されたマイクロタイタープレートに処理した後、１時間３７℃で反応させた。その次に、比色用基質（３，３’，５，５’−Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｂｅｎｚｉｄｉｎｅ；Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ ｃｏ．）を使用して発色させて、酵素反応を０．５ｍｏｌ／Ｌ硫酸で停止させた。４５０ｎｍで吸光度を記録して、その結果を図５に示して、プレート−コーティングされたｈＮｏｔｃｈ−１−ｈＦｃタンパク質に結合されたヒトＤＬＬ４−Ｈｉｓの５０％減少を達成するために必要な抗体の量（ＩＣ_５０）を下記表４に示した。

前記表４のように、本発明の二重標的タンパク質は、ＤＬＬ４に対して１．１２ｎＭの低いＩＣ_５０値を有して、単独項−ＤＬＬ４抗体に劣らないＤＬＬ４阻害活性を有することを確認した。

≪実施例５：架橋化反応と質量分析によるエピトープ地図作成≫
複数の不連続的な配列で構成された、しかし立体構造的に単一である分子表面を形成する構造的エピトープを究明するために、架橋反応と質量分析による架橋化反応の位置を確認するための手法を使用した。

実施例５−１：架橋複合体の形成
抗原タンパク質ヒトデルタ様リガンド４（ｈｕｍａｎ ＤＬＬ４，ｈＤＬＬ４，Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）と実施例１−３のＭＬＣＫ２抗体をモル比が２：１となるように混合した後、Ｋ２００クロスリンカー（ＣｏｖａｌＸＡＧ．）を終濃度０．２ｍｇ／ｍＬとなるように入れた。この混合物を室温で３時間反応させて抗原−抗体複合体を作製した後、Ｕｌｔｒａｆｌｅｘ ＩＩ ＭＡＬＤＩ ＴｏＦ（Ｂｒｕｋｅｒ Ｄａｌｔｏｎｉｃｓ）装置を利用して反応生成物の分子量を分析した。図６に示すように、クロスリンカーを使用しない対照実験に比べてクロスリンカーを使用した場合、ヒトＤＬＬ４とＭＬＣＫ２抗体との間の１：１及び２：１複合体が形成されたことが分かった。一方、ヒトＤＬＬ４もしくはＭＬＣＫ２抗体単独でクロスリンカーと反応させた場合には、いかなる多量体や複合体も検出されなく、このことから、前記ヒトＤＬＬ４及びＭＬＣＫ２抗体複合体の形成が相互特異的な反応であることを知ることができた。

実施例５−２：加水分解酵素による断片の形成
架橋されたペプチド切片を区分するために、重水素で標識されていないｄ０−ＤＳＳ（ｄｉｓｕｃｃｉｎｉｍｉｄｙｌ ｓｕｂｅｒａｔｅ）と１２個の重水素で標識されたｄ１２−ＤＳＳを１：１で混合して、ＤＭＦで溶かして、２ｍｇ／ｍＬ溶液を作った。この溶液を、ヒトＤＬＬ４：ＭＬＣＫ２＝２：１混合溶液に終濃度０．２ｍｇ／ｍＬになるように入れて、常温で３時間架橋化反応をさせた。反応物は、効果的な分解反応のためにＤＴＴ（ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ）とヨードアセトアミド（ｉｏｄｏａｃｅｔａｍｉｄｅ）を利用して、還元およびアルキル化をさせて変性させて、トリプシン、アルファ−キモトリプシン、ＡＳＰ−Ｎプロテアーゼなどのタンパク質加水分解酵素をそれぞれ使用して断片化をさせた。生成された断片化反応物は、Ｕｌｔｉｍａｔｅ ３０００ ｎａｎｏ−ｌｉｑｕｉｄクロマトグラフィシステム（Ｄｉｏｎｅｘ）とＬＴＱ Ｏｒｂｉｔｒａｐ ＸＬ質量分析器（Ｔｈｅｒｍｏ）で質量分析して、得られた質量分析データは、Ｘｑｕｅｓｔ（バージョン２．０）ソフト、Ｓｔａｖｒｏｘ（バージョン２．１）ソフトを用いて架橋化されたペプチドの対を分別した。その結果、表５に示されたように、ｈＤＬＬ４とＭＬＣＫ２との間の架橋化されたペプチドの対を検出することができた。

ヒトＤＬＬ４上の架橋化反応が起こった地点は、５９、６３、６４、および１１０番のアミノ酸残基であり、これらの残基を含む［５８−６５，ＦＲＶＣＬＫＨＦ］（配列番号２２）および［１１０−１１５，ＴＷＰＧＴＦ］（配列番号２３）の二つの断片は、ヒトＤＬＬ４ Ｃ２ ドメイン（２７−１７４）モデル上で７に示すように、連続した分子表面を構成しており、この二つの配列をＭＬＣＫ２抗体に対するヒトＤＬＬ４のエピトープと推定することができる。

≪実施例６：ウェスタンブロッティングによるエピトープ地図確認≫
ヒトＤＬＬ４のアラニン置換突然変異体のパネルを、以下のように製造したが、これらのパネルでは、ヒトＤＬＬ４細胞外タンパク質の領域の６４番（Ｈｉｓｔｉｄｉｎｅ、ヒスチジン）、６５番（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅ、フェニルアラニン）、および６９番（Ｖａｌｉｎｅ、バリン）アミノ酸をそれぞれのアミノ酸をアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）で置換した。アラニン置換突然変異体のための発現ベクターは、前記実施例１−１に示すようにＤＬＬ４細胞外ドメインの特定領域に対する抗原の製造に使用したベクターを利用した。具体的に、前記ベクターは、ヒトＤＬＬ４特定領域のアミノ酸２７〜アミノ酸２５１の遺伝子を含むベクターであり、この領域は、Ｎｏｔｃｈ１受容体と結合すると知られている「ＤＳＬ（デルタ／セレート（Ｓｅｒｒａｔｅ）／ｌａｇ−２）」ドメインと称されるモチーフを含有する。

標準組換えＤＮＡ技術を使用して、Ｆｃタンパク質に融合されたＤＬＬ４の細胞外ドメインの欠失断片（アミノ酸２７〜２５１）をコードするポリヌクレオチドの上流にＣＭＶプロモーターを含む哺乳類発現プラスミドベクターを製造した。このベクターでアミノ酸６４番、６５番及び６９番を、それぞれアラニン（Ａｌａｎｉｎｅ）で置換することができるように、組換えＤＮＡ技術（ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ，Ａｇｉｌｅｎｔ）を活用して、突然変異体をＨＥＫ２９３Ｅ動物細胞にリポフェクタミン２０００（インビトロジェン、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してトランスクションをさせて４日間培養した後、発現培地を取得した。この時、対照群として野生型（Ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）ＤＬＬ４の細胞外ドメインの欠失断片（アミノ酸２７〜２５１）をコードするタンパク質を使用した。

４日間培養した突然変異体の発現培地を１０００ｒｐｍ、常温で１０分間遠心分離して浮遊物を除去した後、０．４５μｍシリンジ濾過（ｓｙｒｉｎｇｅ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）した。ウェスタンブロッティング実験のために突然変異体発現培地での発現程度をＯｃｔｅｔ（登録商標）ｓｙｓｔｅｍ（ＦｏｒｔｅＢｉｏ）を使用して定量して、これを利用して、ＳＤＳ−Ｇｅｌロード時、一定のタンパク質の量になるようにした。以来、Ｎｏｖｅｘ４〜１２％Ｂｉｓ／Ｔｒｉｓゲルに同様に突然変異体発現培地２０μＬずつ２つのゲルにロードしＭＯＰＳ緩衝液を使用し、１４０Ｖで５０分間ゲル電気泳動を行った。この時、対照群として野生型のＤＬＬ４の細胞外ドメインの欠失断片（アミノ酸２７〜２５１）をコードするタンパク質を使用した。電気泳動が終わった後、ポリビニリデンジフルオライド膜にタンパク質バンドをトランスファー（ｔｒａｎｓｆｅｒ）した。合わせて２つの方法で進行するが、一つはＤＬＬ４の細胞外ドメインの欠失断片（アミノ酸２７〜２５１）のＳＤＳ−Ｇｅｌロード時、一定量の突然変異及び野生型タンパク質をロードしたかを確認するために、ＨＲＰ−コンジュゲーションされた抗ヒトＦｃ抗体（１：１００００）（Ｐｉｅｒｃｅ Ｃａｔ：３１４１３）を活用して、トランスファーされた膜に結合させた後、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄を行って、もう一つは、突然変異体に対するＭＬＣＫ２抗体の結合力を調べるためＭＬＣＫ２抗体（１μｇ／ｍＬ）をトランスファーされた膜に一次結合させ、ＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した後、再度ＨＲＰ−コンジュゲーションされた抗ヒトＦａｂ抗体（１：１００００）を用いて二次結合させてＰＢＳ−Ｔで３回洗浄した。その後、膜にＡｍｅｒｓｈａｍ ＥＣＬウェスタブロッティング検出試薬（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を塗布し、ＩｍａｇｅＱｕａｎｔ ＬＡＳ ４０００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）装置を使用して信号を検出した。

図８に示すように、ウェスタブロッティング分析結果を基に見ると、野生型およびＤＬＬ４の細胞外ドメインの欠失断片（アミノ酸２７〜２５１）をコードする突然変異タンパク質を一定量でロードしたことを確認した。また、ＭＬＣＫ２抗体の突然変異体に対する結合力を確認した際に、６４番のアミノ酸の突然変異体の場合、ＭＬＣＫ２抗体の結合力が喪失され、６５番のアミノ酸突然変異体もＭＬＣＫ２抗体の結合力が著しく低下したこと分かった。また、６９番のアミノ酸の突然変異体の場合には、ＭＬＣＫ２抗体の結合力に影響を及ぼさないことを確認した。

≪実施例７：ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ二重抗体の血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖に対する影響分析≫
ＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合する二重抗体の血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ）の増殖に対する影響を分析するために、血管内皮細胞（ＨＵＶＥＣ，Ｈｕｍａｎ ｕｍｂｉｌｉｃａｌ ｖｅｉｎ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌ）をＬｏｎｚａ社から購入して実験に使用した。

ＨＵＶＥＣの培養は、１％ゼラチン（Ｓｉｇｍａ）が溶解されたＰＢＳ緩衝溶液（Ｇｉｂｃｏ）でＴ−フラスコ（Ｎｕｎｃ）を、室温で４〜６時間コーティングした後、ＰＢＳで洗浄して使用した。使用された培地は、ＥＧＭ−２ Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕｏｔ（Ｌｏｎｚａ）が含まれたＥＢＭ−２（Ｌｏｎｚａ）であり、細胞の培養は、密集度が８０％を超えない限度で、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで継代培養を進めており、パッセージ（ｐａｓｓａｇｅ）６以内の細胞を用いて実験した。

血管内皮細胞増殖アッセイ（ＨＵＶＥＣ ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎ ａｓｓａｙ）は、次のような方法で行った。ｈＤＬＬ４がコーティングされたプレートを準備するために、実験前日９６ウェルプレート（ＢＤ）にｒｈＤＬＬ４（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を１ｍｇ／ｍＬでＣａｒｂｏｎａｔｅ緩衝溶液を使用して希釈させた後、１００ｍＬ／ウェルで接種して４℃で一夜静置させた。また、ＨＵＶＥＣは０．１％ＦＢＳが添加されたＥＢＭ−２最小培地で２４時間放置して血清による影響を最小限にしようとした。実験当日ｒｈＤＬＬ４がコーティングされたプレートは、それぞれのウェルをＰＢＳで２回洗浄した後、それぞれの実験群ごとにｈＶＥＧＦ（５０ｎｇ／ｍＬ）、抗体（アバスチン：２０ｍｇ／ｍＬ、ＤＬＬ４単独抗体：２０ｍｇ／ｍＬ、アバスチン−ＤＬＬ４ ＢｓＡｂ二重抗体：２６ｍｇ／ｍＬ）を先に使用したＥＢＭ−２最小培地で希釈して処理（ｔｒｉｐｌｉｃａｔｅ）して、常温で２０分間静置させた。前日から２４時間スターベションされたＨＵＶＥＣは、単一細胞化させた後、ＥＢＭ−２最小培地を使用して４×１０^３ｃｅｌｌｓ／ウェルになるように希釈して抗体が処理されたウェルに接種し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで９６時間静置した。細胞増殖が終了した時、ｃｅｌｌ ｃｏｕｎｔｉｎｇ ｋｉｔ−８（ＣＣＫ−８，Ｄｏｊｉｎｏ）を各ウェルに１０ｍＬずつ処理し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで５時間静置した。ＳｐｅｃｔｒａＭａｘ１９０（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ）機器を利用して、４５０ｎｍの波長で吸光度を測定して、細胞の増殖程度を各群毎に比較した（図９）。

図９のすべての図面（ＰＢＳ処理群）で示すように、ＤＬＬ４／Ｎｏｔｃｈシグナル伝達が活性化されると、血管内皮細胞の増殖が約３０％程度抑制され、これはＶＥＧＦによって血管内皮細胞増殖が活性化される作用と反対となる現象といえる。Ｉｎ ｖｉｖｏ機序も、先に説明したようにＶＥＧＦ抗体は、腫瘍の血管形成が抑制されて腫瘍成長と転移を防ぐ一方で、ＤＬＬ４抗体は、腫瘍の異常血管（非活性型血管）の生成を過度に誘導することにより、腫瘍の成長を抑制すると明らかになっており、図９の結果は、ＶＥＧＦとＤＬＬ４の互いに異なる新生血管形成作用機序をｉｎ ｖｉｔｒｏで反映していると言える。

図９Ａで確認できるように、血管内皮細胞の増殖に重要な役割を果たすＶＥＧＦとその受容体、ＶＥＧＦＲのシグナル伝達経路をＶＥＧＦ−ｔａｒｇｅｔｉｎｇ抗体（アバスチン、Ａｖａｓｔｉｎ）を処理する場合は、ＤＬＬ４の存在の有無に関係なく、濃度依存的に血管内皮細胞の増殖が抑制されることを確認した。一方、図９Ｂの場合、ＤＬＬ４単独抗体を処理した実験結果で、ＤＬＬ４が存在しない実験群では、抗体処理濃度に関係なく、血管内皮細胞の増殖にほとんど影響を与えなく、ＤＬＬ４がある実験群では、ＤＬＬ４抗体処理濃度に依存的に血管内皮細胞の増殖が再開される現象を明らかにした。二重標的タンパク質を処理した場合は、ＤＬＬ４が存在しない実験群では、アバスチン抗体処理と類似した増殖抑制効果を示したが（図９Ｃ、黒色バー）、ＤＬＬ４が存在する実験群では、アバスチン対比血管増殖抑制効能が減っていることを確認することができた（図９Ａ、９Ｃ、白色バー）。

ＤＬＬ４処理群でＶＥＧＦ単独の抗体処理だけの増殖抑制効果を示さなかったことは、本発明の二重抗体がＶＥＧＦおよびＤＬＬ４のシグナル伝達体系を共に効果的に抑制しているとの実験結果と解釈することができる。

≪実施例８：ＤＬＬ４／ＶＥＧＦ二重抗体のＤＬＬ４／ＮｏｔｃｈおよびＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達経路抑制活性の分析≫
ＤＬＬ４とＶＥＧＦに結合する二重抗体のＤＬＬ４／ＮｏｔｃｈおよびＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達経路抑制活性を調べるために、実施例４と同様の方法でＨＵＶＥＣを利用した。実験前日６ウェルプレート（ＢＤ）に組換えヒトＤＬＬ４（ｒｈＤＬＬ４，ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｈｕｍａｎ ＤＬＬ４，Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を１ｍｇ／ｍＬでＣａｒｂｏｎａｔｅ緩衝溶液を使用して希釈させた後、１ｍＬ／ウェルで添加した後、４℃で一夜静置させた。ｒｈＤＬＬ４を処理しない対照実験群では、Ｃａｒｂｏｎａｔｅ緩衝溶液単独で１ｍＬ／ウェルで処理して同様に４℃で一夜静置させた。翌日、４℃の冷蔵庫からＤＬＬ４がコーティングされたプレートを取り出し、ＰＢＳで１回洗浄した後、ＥＧＭ−２培地を各ウェルに１ｍＬずつ処理して、各ウェル毎に抗体（アバスチン：２０ｍｇ／ｍＬ、ＤＢＺ：０．０８ｍＭ、ＤＬＬ４単独抗体：２０ｍｇ／ｍＬ、Ｏｎｃｏｍｅｄ社ＤＬＬ４単独抗体：２０ｍｇ／ｍＬ、アバスチン−ＤＬＬ４ ＢｓＡｂ二重抗体：２６ｍｇ／ｍＬ）を処理した。最終培養液の量は２ｍＬであるため、抗体処理を２倍にして、常温で２０分間静置した。抗体処理時間の間パッセージ＃２〜＃５（ｐａｓｓａｇｅ＃２〜＃５）の７５Ｔプレートで培養されたＨＵＶＥＣを取り出して培地除去後、単一細胞化させた。遠心分離過程を介して細胞を洗浄し、新鮮なＥＧＭ−２培地を使用して再浮遊させて、細胞の数をカウントして５×１０^５ｃｅｌｌｓ／ｍＬに希釈した後、それぞれのウェルに１ｍＬずつ接種して、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで一日中培養した。０．２％ＦＢＳが含まれたＥＢＭ−２最小培地を準備して、一日中培養されたＨＵＶＥＣの各ウェルから培地を除去して、ＰＢＳ１回洗浄した後、０．２％ＦＢＳが含まれたＥＢＭ−２最小培地を２ｍＬ処理した。また、それぞれのウェルに前日処理した同じ濃度の抗体（アバスチン：２０ｍｇ／ｍＬ、ＤＢＺ：０．０８ｍＭ、ＤＬＬ４単独抗体：２０ｍｇ／ｍＬ、Ｏｎｃｏｍｅｄ社ＤＬＬ４単独抗体：２０ｍｇ／ｍＬ、アバスチン−ＤＬＬ４ ＢｓＡｂ二重抗体：２６ｍｇ／ｍＬ）を処理し、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで一日中培養した。抗体が処理されたＨＵＶＥＣの各ウェルにｈＶＥＧＦ（Ｒ＆Ｄ ｓｙｓｔｅｍｓ）を１００ｎｇ／ｍＬで処理して、３７℃、５％ＣＯ_２インキュベーターで５分間反応させた後、プレートを取り出して、直ちに培地を捨て、ＰＢＳで１回洗浄した後、細胞溶解緩衝液（１％ＮＰ−４０，２０ｍＭ Ｔｒｉｓ，１３７ｍＭ ＮａＣｌ，１０％Ｇｌｙｃｅｒｏｌ，２ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ Ｓｏｄｉｕｍ ｏｒｔｈｏｖａｎａｂａｔｅ，１ｘ Ｐｒｏｔｅａｓｅ ＆ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｔａｉｌ）を準備し、それぞれのウェルに１５０ｍＬを添加した後、満遍なく広がるように振った。

このプレートを氷の上にのせてスクレイパーでそれぞれのウェルのＨＵＶＥＣを掻き集めた後、１．５ｍＬチューブに集めた後、氷の上に静置させた。５分単位で氷で１．５ｍＬチューブを取り出してボルテックシング（Ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）３回後、再度氷に浸し置いて細胞溶解を進行した後、これを遠心分離（４℃、１４０００ｒｐｍ、１０分）して上澄み液を新しいチューブに移した後、定量を行い、５ｘＳＤＳ ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒに混合し、１００℃で１０分間沸騰させた後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析を行った。準備されたタンパク質試料を４％〜１２％ｂｉｓ−ＴＲＩＳゲルを介してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行ってサイズ毎に分離させた後、ＮＩＣＤ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｐ−ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＥＲＫ（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、ＶＥＧＦＲ２（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ｐ−ＶＥＧＦＲ２（Ｃｅｌｌ ｓｉｇｎａｌｉｎｇ）、Ａｃｔｉｎ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ）抗体を用いてウェスタンブロットを行った（図１０）。

図１０のように、本発明の二重標的タンパク質は、ＤＬＬ４／ＮｏｔｃｈおよびＶＥＧＦ／ＶＥＧＦＲシグナル伝達経路をそれぞれの単独の抗体程度抑制することができることを確認した。

≪実施例９：アバスチン抵抗性を持つヒト胃癌細胞株異種移植モデル（Ａｖａｓｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｕｍａｎ ＳＣＨ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）での二重抗体抗がん活性の分析≫
報告された文献によると、ＳＣＨヒト胃がん細胞株（ｈｕｍａｎ ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）は、アバスチンの耐性を持っていると開示されており、ＳＣＨ細胞株を用いたヌードマウス異種移植モデル（ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）で二重抗体の抗癌効能試験を行った。

具体的には、アバスチン耐性ＳＣＨ胃癌細胞株を雌ヌードマウス（ｆｅｍａｌｅ ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ）に接種した後、腫瘍サイズ（ｔｕｍｏｒ ｓｉｚｅ）が平均２００ｍｍ^３に達したときに、週に１回、各抗体を投与して、本発明に係る二重ターゲット抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌活性を確認した（図１１）。本ヌードマウス異種移植モデル（Ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）のｉｎ ｖｉｖｏ試験では、ヒトＤＬＬ４を標的するアバスチン−ＤＬＬ４二重抗体の代わりにヒトＤＬＬ４エピトープ（ＤＳＬドメイン）と同じマウスＤＬＬ４エピトープ（ＤＳＬドメイン）に結合する二重抗体であるアバスチン−マウスＤＬＬ４ ｓｕｒｒｏｇａｔｅ二重標的タンパク質を投与して、二重抗体の優れた抗癌効果の検証を立証した。

図１１のように、アバスチンに対して耐性を有する胃癌細胞株に対して、本発明の二重標的タンパク質が抗癌効果を著しく増加させることをｉｎ ｖｉｖｏ実験で確認した。

≪実施例１０：アバスチン抵抗性を持つヒトの肺癌細胞株異種移植モデル（Ａｖａｓｔｉｎ−ｒｅｓｉｓｔａｎｔ ｈｕｍａｎ Ａ５４９ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ ｍｏｄｅｌ）での二重抗体抗がん活性の分析≫
Ａ５４９細胞株をヌードマウスに接種した後、アバスチン（２．５ｍｇ／ｋｇ／ｗｅｅｋ）を３ヶ月間処理してアバスチン処理後にも腫瘍の大きさが減らず、腫瘍が成長するアバスチン投与に耐性を持ったＡ５４９癌細胞を確保した。この腫瘍を剥ぎ取った後、アバスチン耐性Ａ５４９細胞をＥｘ−ｖｉｖｏ培養を行って、二重ターゲット抗体の効能分析のために使用した。

具体的には、アバスチン耐性Ａ５４９肺癌細胞株を雌ヌードマウス（ｆｅｍａｌｅ ｎｕｄｅ ｍｏｕｓｅ）に接種した後、腫瘍サイズが平均２００ｍｍ^３に達した時に、週に２回、各抗体を投与して、二重ターゲット抗体のｉｎ ｖｉｖｏ抗癌活性を確認した（図９）。アバスチン抵抗性Ａ５４９細胞を用いたｉｎ ｖｉｖｏ試験でも、ヒトＤＬＬ４を標的するアバスチン−ＤＬＬ４二重抗体の代わりにヒトＤＬＬ４エピトープと同じ部位のマウスＤＬＬ４に結合する二重抗体であるアバスチン−マウスＤＬＬ４ ｓｕｒｒｏｇａｔｅを投与して、二重抗体の優れた抗癌効能の検証を立証した。
図１２に示すように、アバスチンに対して耐性を有する肺癌細胞株に対して、本発明の二重標的タンパク質が抗癌効果を著しく増加させることをｉｎ ｖｉｖｏ実験で確認した。

以上の説明から、本発明が属する技術分野の当業者は、本発明がその技術的思想や必須特徴を変更することなく他の具体的な形態で実施可能であることが理解できるはずである。これと関連して、以上で記述した実施例はすべての面で例示的なものであり、限定的なものではないものとして理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導出されるいずれの変更または変形された形態が、本発明の範囲に含まれると解釈されなければならない。

Claims (19)

1. 配列番号２１で表されるＤＬＬ４タンパク質のアミノ酸配列で５８番〜６５番のアミノ酸配列、及び１１０番〜１１５番のアミノ酸配列を含むＤＬＬ４の立体構造エピトープを認知する、ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質、並びにＶＥＧＦに特異的に結合する抗体を含む、二重標的タンパク質であって、
   前記ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質は、配列番号２で表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号３で表される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号４で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号５で表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号６で表される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号７で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含む、前記二重標的タンパク質。
2. 前記二重標的タンパク質は、ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質及びＶＥＧＦに特異的に結合するＩｇＧ形態の抗体が、リンカーで連結された形態であることを特徴とする請求項１に記載の二重標的タンパク質。
3. 前記リンカーは、非ペプチドリンカーまたはペプチドリンカーであることを特徴とする請求項２に記載の二重標的タンパク質。
4. 前記ペプチドリンカーは、配列番号１８で表されるペプチドであることを特徴とする請求項３に記載の二重標的タンパク質。
5. 前記ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質は、配列番号８で表される重鎖アミノ酸配列及び配列番号９で表される軽鎖アミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の二重標的タンパク質。
6. 前記ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体は、配列番号１０で表される重鎖ＣＤＲ１；配列番号１１で表される重鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１２で表される重鎖ＣＤＲ３を含む重鎖可変領域、並びに配列番号１３で表される軽鎖ＣＤＲ１；配列番号１４で表される軽鎖ＣＤＲ２；及び配列番号１５で表される軽鎖ＣＤＲ３を含む軽鎖可変領域を含むことを特徴とする請求項１に記載の二重標的タンパク質。
7. 前記ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体は、配列番号１６で表される重鎖アミノ酸配列及び配列番号１７で表される軽鎖アミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の二重標的タンパク質。
8. 前記ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体は、ベバシズマブであることを特徴とする請求項７に記載の二重標的タンパク質。
9. 配列番号１で表される重鎖アミノ酸配列および配列番号２０で表される軽鎖アミノ酸配列を含むことを特徴とする請求項１に記載の二重標的タンパク質。
10. 前記ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質は、全長抗体、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）_２、Ｆａｂ、Ｆｖ、ｒＩｇＧまたはｓｃＦｖ形態であることを特徴とする請求項１に記載の二重標的タンパク質。
11. 請求項１から請求項１０のいずれかに記載の二重標的タンパク質をコードするポリヌクレオチド。
12. 請求項１１に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
13. 請求項１２に記載の発現ベクターが導入された形質転換体。
14. （ａ）請求項１３に記載の形質転換体を培養して、二重標的タンパク質を生産する工程；及び
    （ｂ）前記（ａ）工程で生産された二重標的タンパク質を回収する工程を含む、ＤＬＬ４に特異的に結合するタンパク質及びＶＥＧＦに特異的に結合する抗体を含む二重標的タンパク質の製造方法。
15. 請求項１から請求項１０のいずれかに記載の二重標的タンパク質を含む組成物。
16. 請求項１から請求項１０のいずれかに記載の二重標的タンパク質を含む癌治療用薬学組成物。
17. 前記癌は、食道癌、胃癌、大腸癌、直膓癌、口腔癌、咽頭癌、喉頭癌、肺癌、結腸癌、乳癌、子宮頸部癌、子宮内膜癌、卵巣癌、前立腺癌、睾丸癌、膀胱癌、腎臓癌、肝臓癌、膵臓癌、骨癌、結合組織癌、皮膚癌、脳腫瘍、甲状腺癌、白血病、ホジキン病、リンパ腫及び多発性骨髄血液癌よりなる群から選ばれることを特徴とする請求項１６に記載の組成物。
18. 請求項１から請求項１０のいずれかに記載の二重標的タンパク質を含む、癌診断用組成物。
19. 癌の治療用医薬の製造における、請求項１から請求項１０のいずれかに記載の二重標的タンパク質の使用。