JP6284977B2

JP6284977B2 - ２’−ｏ−修飾ｒｎａ

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Publication number: JP6284977B2
Application number: JP2016097667A
Authority: JP
Inventors: 護清水; 猛和田; 浩一郎新井
Original assignee: Wave Life Sciences Japan Inc
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Filing date: 2016-05-16
Publication date: 2018-02-28
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Description

本発明は，ハロゲン原子による置換基を有する２’−Ｏ−修飾ＲＮＡに関する。より詳しく説明すると，本発明は，高い二重鎖形成能を有し，製造が容易な，ハロゲン原子による置換基を有するＲＮＡの２’−Ｏ−アルコキシメチル修飾体及びその製造方法に関する。

近年，核酸分子を医薬や機能性分子として利用することを目指し，様々な核酸類縁体が合成されている。その中で２’修飾型核酸は，適切な化学修飾を施すことで二重鎖形成能，酵素耐性を向上することが示され，有用な化学修飾型核酸であることが知られている。

２’修飾型核酸の中で，２’−Ｏ−メチル修飾体は最も単純な２’−Ｏ−アルキル型の修飾体である。非特許文献１（Inoue, H; Miura, K.; Ohtsuka, E. et al,G Nucleic Acid Res.,
1987, 15, 6131-6148）には，核酸を２’−Ｏ−メチル修飾（Ｏ^＊−ＣＨ_３）することにより，Ｔ_ｍ値を向上できることが示唆されている。一方，非特許文献２（Saneyoshi, H.; Seio, K.; Sekine, M., J. Org. Chem. 2005, 70,
10453-10460）には，核酸の１ヵ所のみに２’−Ｏ−Ｍｅ修飾を施した場合には，Ｔ_ｍ値が減少することが示されている。

特開２００９−２５６３３５号公報（下記特許文献１）には，２’位にアルキル型保護基を有するリボ核酸の製造法が開示されている。

また，非特許文献３（Martin,
P., Helv. Chim. Acta., 1995, 78, 486-504.）には，２’−Ｏ−メトキシエチル修飾体（Ｏ^＊−Ｃ_２Ｈ_４ＯＣＨ_３）が開示されている。

上述した２’−Ｏ−メチル修飾体や２’−Ｏ−メトキシエチル修飾体をはじめとする２'修飾型ＲＮＡの多くは，核酸塩基の種類によっては導入が困難である。すなわち，２’−Ｏ−メチル修飾体及び２’−Ｏ−メトキシエチル修飾体は，ピリミジン核酸塩基を有するＲＮＡの修飾体のみの合成例しか報告されていないものがある。またこれらの修飾体を製造する場合,核酸塩基の種類によって，合成方法を変えた適切な製造方法を探索する必要がある。

非特許文献４（Tereshko, V.;
Portmann, S.; Tay, E.; Martin, P; Natt, F.; Altmann, K.; Egli, M. Biochemistry, 1998, 37,
10626 -10634.）には, ２’−Ｏ−エトキシメチル修飾体（Ｏ^＊−ＣＨ_２ＯＣ_２Ｈ_５）が開示されている。しかしながら，２’−Ｏ−エトキシメチル修飾を行うと，二重鎖融解温度Ｔ_ｍが減少する。すなわち，２’−Ｏ−エトキシメチル修飾体は，二重鎖形成能が低い。このため２’−Ｏ−エトキシメチル修飾体はＲＮＡの修飾体として有用ではないと考えられていた。

特開2009-256335号公報

Inoue, H; Miura, K.; Ohtsuka, E. et al,G Nucleic Acid Res.,1987, 15, 6131-6148 Saneyoshi, H.; Seio, K.; Sekine, M., J. Org. Chem. 2005, 70,10453-10460 Martin, P., Helv.Chim. Acta., 1995, 78, 486-504 Tereshko, V.;Portmann, S.; Tay, E.; Martin, P; Natt, F.; Altmann, K.; Egli, M. Biochemistry, 1998, 37,10626 -10634.

本発明は，高い二重鎖形成能を有する新規の修飾ＲＮＡを製造することを目的とする。
本発明は，付加する核酸塩基によらずに採用できる修飾ＲＮＡの効果的な製造方法を提供することを目的とする。

本発明は，基本的には，アルコキシメチル系保護基を有するリボヌクレオシド等の修飾体について，保護基部分にハロゲン原子を置換基として導入することで，高い二重鎖形成能を付与できたという実施例による知見に基づく。先述したとおり，アルコキシメチル系保護基を有するＲＮＡの修飾体は，二重鎖形成能が低かった。しかし,本発明のハロゲン置換アルコキシメチル系保護基を有するＲＮＡの修飾体は，核酸の２’−Ｏ−メチル修飾体と同程度の高い二重鎖形成能を示した。

また,本発明は，アルコキシメチル骨格を有するリボヌクレオシド等の修飾体について，保護基部分にハロゲン原子を置換基として導入することで，ＲＮＡの核酸塩基の種類によらずＲＮＡの修飾体を容易に合成できるという実施例による知見に基づく。先述したとおり，２’−Ｏ−メチル修飾体や２’−Ｏ−メトキシエチル修飾体は，ＲＮＡに含まれる核酸塩基により適切な合成方法を検討しなければならず，合成できていない修飾体もある。一方,本発明の製造方法は，ＲＮＡに含まれる核酸塩基によらず，共通の方法で２’−修飾体を製造することができる。すなわち,本発明の製造方法は,先に説明した高い二重鎖形成能を有する２’−修飾体を，ＲＮＡ中の核酸塩基の種類によらず容易に合成できる方法であるといえる。

本発明の第１の側面は，２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体に関する。そして, リボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体の２’−位の酸素原子をＯ^＊として表現した場合，保護基が下記一般式（Ｉ）で示される。

式中，Ｏ^＊は，リボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体の２’位水酸基の酸素原子を示す。なお，上記の式（Ｉ）において，Ｏ^＊と接続されている部位が保護基部分である。このため上記一般式（Ｉ）では，リボース及び核酸塩基を含む部分をかっこで括っている。リボヌクレオチドは，ＲＮＡを構成する単位である。そして，リボヌクレオシドは，リボース及び核酸塩基を含む。リボヌクレオシドリン酸がリボヌクレオチドである。リボヌクレオシド又はリボヌクレオチドの誘導体は，ＲＮＡを構成するリボヌクレオシド又はリボヌクレオチドに１又は複数の置換基が付加したものである。置換基の例は，リボヌクレオシド又はリボヌクレオチドの水素原子と置換されるＣ_１−３アルキル基,又はＣ_１−３ハロアルキル基であるが，これらに限定されない。

一般式（Ｉ）において，Ｒ^１及びＲ^２は,同一でも異なってもよく，水素原子, Ｃ_１−３アルキル基，Ｃ_２−３アルケニル基，Ｃ_２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ_２−３アルキル基，又はＣ_１−３ハロアルキル基を示す。
Ｒ^３及びＲ^４は,同一でも異なってもよく，水素原子,ハロゲン原子，Ｃ_１−３アルキル基，Ｃ_２−３アルケニル基，Ｃ_２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ_２−３アルキル基，又はＣ_１−３ハロアルキル基を示す。
Ｒ^５及びＲ^６は,同一でも異なってもよく，水素原子，ハロゲン原子, Ｃ_１−３アルキル基，Ｃ_２−３アルケニル基，Ｃ_２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ_２−３アルキル基，Ｃ_１−３ハロアルキル基，１つ又は２つのＣ_６−１２アリール基で置換されたＣ_１−３アルキル基，又は置換基を有してもよいＣ_６−１２アリール基を示す。Ｒ^７は,ハロゲン原子又はＣ_１−３ハロアルキル基を示す。

「Ｃ_１−３アルキル基」は，１から３個の炭素原子を持つ直鎖アルキル基，３個の炭素原子を持つ分鎖アルキル基，又は３個の炭素原子を持つ環状アルキル基を意味する。Ｃ_１−３直鎖アルキル基の例は，メチル基，エチル基，及びプロピル基である。Ｃ_１−３分鎖アルキル基の例は，イソプロピル基である。Ｃ_１−３環状アルキル基の例は，シクロプロピル基である。Ｃ_１−３アルキル基は，直鎖又は分鎖アルキル基が好ましい。

「Ｃ_２−３アルケニル基」は，２個又は３個の炭素原子を有し，少なくとも１つの二重結合を有する直鎖アルケニル基，３個の炭素原子を有する分鎖アルケニル基を意味する。Ｃ_２−３アルケニル基の例は，ビニル基及びアリール基である。

「Ｃ_２−３アルキニル基」とは２個又は３個の炭素原子を有し，少なくとも１つの三重結合を有する直鎖アルキニル基を意味する。Ｃ_２−３アルキニル基の例は，２−プロピニル基である。

「ヒドロキシＣ_２−３アルキル基」は，少なくとも１つのヒドロキシ基で置換されたＣ_２−３アルキル基を意味する。ヒドロキシＣ_２−３アルキル基の例は，２−ヒドロキシエチル基及び３−ヒドロキシプロピル基である。

「Ｃ_１−３ハロアルキル基」は，「ハロゲノＣ_１−３アルキル基」と同義であり，フッ素原子，塩素原子，臭素原子及びヨウ素原子の少なくとも１つで水素原子が置換されたＣ_１−３アルキル基を意味する。Ｃ_１−３ハロアルキル基の例は，２−クロロエチル基，２−ブロモエチル基，２−ヨ−ドエチル基，及び３−クロロプロピル基である。

「１つ又は２つのＣ_６−１２アリール基で置換されたＣ_１−３アルキル基」は，Ｃ_１−３アルキル基の水素原子の１つ又は２つがＣ_６−１２アリール基で置換されたものを意味する。１つ又は２つのＣ_６−１２アリール基で置換されたＣ_１−３アルキル基の例は，ベンジル基；ジフェニルメチル基；２−フェニルエチル基；２−フェニルプロピル基；１−メチル−１−フェニルエチル基；２−ニトロベンジル基；３−ニトロベンジル基；４−ニトロベンジル基；２，４−ジニトロベンジル基；２，４，６−トリニトロベンジル基；２−フェニルベンジル基；３−フェニルベンジル基；４−フェニルベンジル基；２−ヒドロキシベンジル基；３−ヒドロキシベンジル基；４−ヒドロキシベンジル基；２−クロロベンジル基；３−クロロベンジル基；４−クロロベンジル基；２−フルオロベンジル基；３−フルオロベンジル基；４−フルオロベンジル基；２−ブロモベンジル基；３−ブロモベンジル基；４−ブロモベンジル基；２−ヨ−ドベンジル基；２，３−ジクロロベンジル基；２，４−ジクロロベンジル基；２，５−ジクロロベンジル基；２，６−ジクロロベンジル基；３，４−ジクロロベンジル基；３，５−ジクロロベンジル基；２−メチルベンジル基；３−メチルベンジル基；４−メチルベンジル基；２−エチルベンジル基；３−エチルベンジル基；４−エチルベンジル基；２−イソプロピルベンジル基；３−イソプロピルベンジル基；４−イソプロピルベンジル基；２−メトキシベンジル基；３−メトキシベンジル基；４−メトキシベンジル基；２，３−ジメトキシベンジル基；２，４−ジメトキシベンジル基；２，５−ジメトキシベンジル基；２，６−ジメトキシベンジル基；３，４−ジメトキシベンジル基；３，５−ジメトキシベンジル基；２−エトキシベンジル基；３−エトキシベンジル基；４−エトキシベンジル基；２−イソプロポキシベンジル基；３−イソプロポキシベンジル基；４−イソプロポキシベンジル基；２−メトキシメチルベンジル基；３−メトキシメチルベンジル基；４−メトキシメチルベンジル基；２−イソプロポキシメチルベンジル基；３−イソプロポキシメチルベンジル基；４−イソプロポキシメチルベンジル基；２−トリフルオロメチル基；３−トリフルオロメチル基；４−トリフルオロメチル基；２−ヒドロキカルボニルベンジル基；３−ヒドロキカルボニルベンジル基；４−ヒドロキカルボニルベンジル基；２−アミノベンジル基；３−アミノベンジル基；４−アミノベンジル基；２−アミノメチルベンジル基；３−アミノメチルベンジル基；４−アミノメチルベンジル基；２−シアノベンジル基；３−シアノベンジル基；４−シアノベンジル基；２−ヒドロキシメチルベンジル基；３−ヒドロキシメチルベンジル基；４−ヒドロキシメチルベンジル基；２−フェノキシベンジル基；３−フェノキシベンジル基；及び４−フェノキシベンジル基である。

Ｃ_６−１２アリール基は，炭素数が６〜１２の多環芳香族を意味する。Ｃ_６−１２アリール基の例は，フェニル基，１−ナフチル基及び２−ナフチル基である。「置換基を有してもよいＣ_６−１２アリール基」は，Ｃ_６−１２アリール基における１又は２以上の水素原子が，他の原子又は基により置換されたものを意味する。置換基を有してもよいＣ_６−１２アリール基における置換基の例は，ハロゲン原子，Ｃ_１−３アルキル基，Ｃ_１−３アルコキシ基，及びヒドロキシＣ_２−３アルキル基である。

ハロゲン原子の例は，フッ素原子，塩素原子，臭素原子及びヨウ素原子である。ハロゲン原子として，フッ素原子又は塩素原子が好ましく用いられる。

第１の側面の好ましい態様は，上記した２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体であって，置換基が以下の基で示されるものである。すなわち，Ｒ^１〜Ｒ^４は,同一でも異なってもよく，水素原子,メチル基又はエチル基を示す。Ｒ^５及びＲ^６は,同一でも異なってもよく，水素原子，ハロゲン原子,又はＣ_１−３ハロアルキル基を示す。そして，Ｒ^７は,ハロゲン原子を示す。

第１の側面の好ましい態様は，上記した２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体であって，置換基が以下の基で示されるものである。すなわち，Ｒ^１〜Ｒ^４は,いずれも水素原子を示す。Ｒ^５及びＲ^６は,同一でも異なってもよく，水素原子,フッ素原子，塩素原子又は臭素原子を示す。Ｒ^７は,フッ素原子，塩素原子又は臭素原子を示す。

第１の側面の好ましい態様は，上記した２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体であって，置換基が以下の基で示されるものである。すなわち，Ｒ^１〜Ｒ^５は,いずれも水素原子を示す。Ｒ^６は,水素原子,フッ素原子又は塩素原子を示す。Ｒ^７は,フッ素原子又は塩素原子を示す。

第１の側面の好ましい態様は，上記した２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体であって，置換基が以下の基で示されるものである。すなわち，Ｒ^１〜Ｒ^５は,いずれも水素原子を示す。Ｒ^６は,水素原子,又は塩素原子を示し,Ｒ^７は,塩素原子を示す。

後述する実施例により示された通り,２−クロロエトキシキメチル基及び２，２−ジクロロエトキシキメチル基を２’−位の保護基として有する核酸は,高い二重鎖形成能を有する新規物質である。

第１の側面の好ましい態様は，上記した２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体であって，上記一般式（Ｉ）において,Ｒ^７がＣ_１−３ハロアルキル基である場合，Ｃ_１−３ハロアルキル基の例は, クロロメチル基；ジクロロメチル基；トリクロロメチル基；１−クロロエチル基；２−クロロエチル基；１，１，−ジクロロエチル基；１，２−ジクロロエチル；２，２−ジクロロエチル基；１−クロロプロピル基；２−クロロプロピル基；１，１，−ジクロロプロピル基；１，２−ジクロロプロピル；又は２，２−ジクロロプロピル基であることが好ましい。Ｒ^７がＣ_１−３ハロアルキル基である場合，Ｒ^１〜Ｒ^６は，水素原子であるものが好ましい。

第１の側面の好ましい態様は，核酸塩基Ｂを,アデノシン，グアノシン，シチジン又はウリジンとしたときに,以下の化合物である。核酸塩基Ｂは，リボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体を構成する核酸塩基である。

すなわち，好ましい化合物は，
２’−Ｏ−（２−クロロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）核酸塩基Ｂ,
２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）核酸塩基Ｂ,
２’−Ｏ−（２，２−ジフルオロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）核酸塩基Ｂ，
２’−Ｏ−（２−クロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）核酸塩基Ｂ，
２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）核酸塩基Ｂ，
２’−Ｏ−２，２−ジフルオロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）核酸塩基Ｂ，
２’−Ｏ−（２−クロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）核酸塩基Ｂ３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト）,
２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）核酸塩基Ｂ３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト），又は
２’−Ｏ−（２，２−ジフルオロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）核酸塩基Ｂ３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト），である。

第１の側面の好ましい態様は，核酸塩基Ｂを,アデノシン，グアノシン，シチジン又はウリジンとしたときに,
２’−Ｏ−（２−クロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリイル）核酸塩基Ｂ３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト）,又は２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリイル）核酸塩基Ｂ３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト）である。

本発明の第２の側面は，下記一般式（Ｉ）で示される２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体の製造方法に関する。この方法において，リボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体は，第１の側面において説明したいずれの化合物をも採用できる。そして，この方法は，下記一般式（ＩＩ）で示される化合物に下記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物を作用させる工程を含む。

（一般式（Ｉ）中，Ｏ^＊は，リボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体の２’位水酸基の酸素原子を示し，
Ｒ^１〜Ｒ^７は,先に説明したと同義である。）

（一般式（ＩＩ）中,Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ^２１，Ｒ^２２,Ｒ^２３及びＲ^２４は，同一でも異なってもよく，直鎖又は分岐してもよいＣ_１−５アルキル基, Ｃ_１−５アルコキシ基又はＣ_１−５ハロアルキル基を示し，Ｒ^１及びＲ^２は一般式（Ｉ）におけるＲ^１及びＲ^２と同義である。）

「保護基で保護されてもよい核酸塩基」における核酸塩基は，ＲＮＡに含まれる塩基を含む置換基を意味し，具体的にはアデノシン，グアノシン，シチジン又はウリジンである。本発明における核酸塩基の例は，アデニン，グアニン，シトシン，ウラシル又はそれらの誘導体である。核酸塩基の誘導体の例は，５−メチルシトシン；５−ヒドロキシメチルシトシン；５−フルオロウラシル；チオウラシル；６−アザウラシル；５−ヒドロキシウラシル；２，６−ジアミノプリン；アザアデニン；アザグアニン；及びイソグアニンである。

「保護基で保護されてもよい核酸塩基」における，保護基で保護された核酸塩基の例は，核酸塩基中のアミノ基中の原子が脱離できる基により置換されたものである。核酸塩基中のアミノ基の保護基の例は，アセチル基；プロピオニル基；ブチリル基；イソブチリル基等の脂肪族アシル基；ベンゾイル基；４−メチルベンゾイル基；４−メトキシベンゾイル基；フェニルアセチル基；フェノキシアセチル基；４−ｔｅｒｔ−ブチルフェノキシアセチル基；４−イソプロピルフェノキシアセチル基等の芳香族アシル基；ハロゲン原子；Ｃ_１−１０アルキル基；Ｃ_１−１０アルキルオキシ基等の置換基を有する脂肪族アシル基又は芳香族アシル基；２−シアノエチル基；２−（ｐ−ニトロフェニル）エチル基；２−（ベンゼンスルホニル）エチル基；ジメチルアミノメチレン基；ジブチルアミノメチレン基；２−シアノエトキシカルボニル基；２−（ｐ−ニトロフェニル）エトキシカルボニル基；２−（ベンゼンスルホニル）エトキシカルボニル基である。

「Ｃ_１−５アルキル基」は，炭素数が１個〜５個のアルキル基である。Ｃ_１−５直鎖アルキル基の例はメチル基，エチル基，プロピル基，ブチル基，及びペンチル基である。Ｃ_１−５分鎖アルキル基の例はイソプロピル基，イソブチル基，１−メチルプロピル基，ｔ−ブチル基，１−メチルブチル基，２−メチルブチル基，３−メチルブチル基，１−エチルプロピル基，１，１−ジメチルプロピル基，２，２−ジメチルプロピル基，１，２−ジメチルプロピル基である。Ｃ_１−５環状アルキル基の例はシクロプロピル基，シクロブチル基，及びシクロペンチル基である。

「Ｃ_１−５アルコキシ基」は，炭素数が１個〜５個のアルコキシ基である。Ｃ_１−５アルコキシ基の例は，メトキシ基，エトキシ基，及びプロピルオキシ基である。

Ｃ_１−５ハロアルキル基は，炭素数が１個〜５個のハロアルキル基である。

Ｒ^２１〜Ｒ^２４の好ましい例は，Ｃ_２−４アルキル基であり，具体的なＲ^２１〜Ｒ^２４は，エチル基，プロピル基，イソプロピル基，ｎ−ブチル基，ｓｅｃ−ブチル基，イソブチル基，又はｔｅｒ−ブチル基である。

（一般式（ＩＩＩ）中，Ｒ^３〜Ｒ^７は，一般式（Ｉ）におけるＲ^３〜Ｒ^７と同義である。）

この工程は，たとえば，一般式（ＩＩ）で示される化合物を適切な溶媒により乾燥させた後，溶媒に溶解させる。溶媒の例は，ＴＨＦである。この溶液に，一般式（ＩＩＩ）で示される化合物を加える。そして，溶液を−５０℃以上−２０℃以下，好ましくは−４５℃以上−３０℃以下に冷却する。その後，ＮＩＳやＮＢＳといったハロゲン源及びトルエンスルホン酸やトリフロオロメタンスルホン酸等の有機酸を撹拌しつつ添加する。撹拌時間の例は，３０分以上２時間以下である。反応を中止させるためには，トリエチルアミンなどの塩基を添加すればよい。その後，精製する。このようにして後述する一般式（ＩＶ）で示されるリボヌクレオシドを得ることができる。この一般式（ＩＶ）で示される化合物を用いることで，後述するように一般式（Ｉ）で示される化合物を得ることができる。

本発明の第２の側面は，上記の工程の後に以下の工程を含むものが好ましい。すなわち，先に説明した工程で，一般式（ＩＩ）で示される化合物に一般式（ＩＩＩ）で示される化合物を作用させ，下記一般式（ＩＶ）で示される化合物を得る。その後，前記一般式（ＩＶ）で示される化合物とＣ_１−３アルコールとを反応させ，脱保護することにより，下記一般式（Ｖ）で示される化合物を得る。

一般式（ＩＶ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ^１〜Ｒ^７は，一般式（Ｉ）におけるＲ^１〜Ｒ^７と同義であり，Ｒ^２１〜Ｒ^２４は，一般式（ＩＩ）におけるＲ^２１〜Ｒ^２４と同義である。保護基で保護されてもよい核酸塩基は，一般式（ＩＩ）におけるものと同義である。

一般式（Ｖ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ^１〜Ｒ^７は，一般式（Ｉ）におけるＲ^１〜Ｒ^７と同義である。

この工程は，たとえば，一般式（ＩＶ）で示される化合物を乾燥させた後に行う。そして，Ｃ_１−３アルコール（低級アルコール）に溶解させる。低級アルコールの例は，メタノール又はエタノールである。溶液に例えばフッ化アンモニウムを添加し，撹拌する。撹拌時の温度は，３０℃以上６０℃以下であっても，４５℃以上５５℃以下であってもよい。反応時間は，３時間以上１日以下であり，４時間以上７時間以下でもよい。得られた化合物を公知の方法で濃縮又は抽出する。

次に，前記一般式（Ｖ）で示される化合物とハロゲン化ジメトキシトリフェニルメチルと反応させ，一般式（ＶＩ）で示される化合物を得る。

一般式（ＶＩ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ^１〜Ｒ^７は，一般式（Ｉ）におけるＲ^１〜Ｒ^７と同義であり，式ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を示す。

ハロゲン化ジメトキシトリフェニルメチルの例は，４，４’−ジメトキシトリチルクロライドである。

本発明の第２の側面は，先に説明した工程の後に，さらに以下の工程を有するものが好ましい。すなわち，先に説明した工程で得られた一般式（ＶＩ）で示される化合物と下記一般式（ＶＩＩ）で示される化合物を反応させ，下記一般式（ＶＩＩＩ）で示される化合物を得る工程を含む。

(一般式（ＶＩＩ）中，
Ｒ^３１〜Ｒ^３４は，同一でも異なってもよく，水素原子,Ｃ_１−３アルキル基,又はＣ_１−３ハロアルキル基を示し,
Ｒ^３５及びＲ^３６は，同一でも異なってもよく，Ｃ_１−５アルキル基又はＣ_１−５ハロアルキル基を示し,
Ｒ^３７は，ハロゲン原子を示す。）

Ｒ^３１〜Ｒ^３４の好ましい例は，同一でも異なってもよく，水素原子，又はメチル基である。なお，Ｒ^３１〜Ｒ^３４は，いずれも水素原子であるものが最も好ましい。
Ｒ^３５及びＲ^３６の好ましい例は，Ｃ_２−４アルキル基であり，具体的なＲ^２１〜Ｒ^２４は，エチル基，プロピル基，イソプロピル基，ｎ−ブチル基，ｓｅｃ−ブチル基，イソブチル基，又はｔｅｒ−ブチル基である。
Ｒ^３７の好ましい例は，フッ素原子，塩素原子又は臭素原子である。

(一般式（ＶＩＩＩ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ^１〜Ｒ^７は，一般式（Ｉ）におけるＲ^１〜Ｒ^７と同義であり,Ｒ^３１〜Ｒ^３６は，一般式（ＶＩＩ）におけるＲ^３１〜Ｒ^３６と同義であり, 式ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を示す。）

この工程は，一般式（ＶＩ）で示される化合物を適宜乾燥させる。この化合物を溶媒に溶解させ，式（ＶＩＩ）で示される化合物を滴下する。例えば，２０℃以上３０℃以下の温度で，３０分以上２時間以下撹拌する。反応を停止するためには低級アルコールを加えればよい。

本発明は，基本的には，アルコキシメチル系保護基を有するＲＮＡの修飾体について，保護基部分にハロゲン原子を置換基として導入することで，高い二重鎖形成能を付与できる。

また,本発明は，アルコキシメチル骨格を有するＲＮＡの修飾体について，保護基部分にハロゲン原子を置換基として導入することで，ＲＮＡの核酸塩基の種類によらずＲＮＡの修飾体を容易に合成できる。

図１は，アルコキシメチル骨格修飾に対する置換基の影響を示す図面に替わるグラフである。図２は，フッ素を含む修飾体の置換基の個数の影響を示す図面に替わるグラフである。図３は，塩素原子を含む修飾体の置換基の個数の影響を示す図面に替わるグラフである。図４は，塩素原子の１置換体及び２置換体と，シアノ基置換体及びメチル置換体を比較する図面に替わるグラフである。図５は，フッ素を含む修飾体のＤＮＡに対する親和性を示す図面に替わるグラフである。図６は，塩素原子を含む修飾体のＤＮＡに対する親和性を示す図面に替わるグラフである。図７は，フッ素を含む修飾体の置換基の影響を示す図面に替わるグラフである。

先に説明したとおり，本発明の第１の側面は，２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体に関する。そして,リボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体の２’−位の酸素原子をＯ^＊として表現した場合，保護基が下記一般式（Ｉ）で示される。

式中，Ｏ^＊は，リボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体の２’位水酸基の酸素原子を示す。なお，Ｏ^＊と接続されている部位が保護基部分である。このため上記一般式（Ｉ）では，リボース及び核酸塩基を含む部分をかっこで括っている。リボヌクレオチドは，ＲＮＡを構成する単位である。そして，リボヌクレオシドは，リボース及び核酸塩基を含む。リボヌクレオシドリン酸がリボヌクレオチドである。リボヌクレオシド又はリボヌクレオチドの誘導体は，ＲＮＡを構成するリボヌクレオシド又はリボヌクレオチドに１又は複数の置換基が付加したものである。置換基の例は，リボヌクレオシド又はリボヌクレオチドの水素原子と置換されるＣ_１−３アルキル基,又はＣ_１−３ハロアルキル基である。

一般式（Ｉ）において，Ｒ^１及びＲ^２は,同一でも異なってもよく，水素原子, Ｃ_１−３アルキル基，Ｃ_２−３アルケニル基，Ｃ_２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ_２−３アルキル基，又はＣ_１−３ハロアルキル基を示す。Ｒ^３及びＲ^４は,同一でも異なってもよく，水素原子,ハロゲン原子，Ｃ_１−３アルキル基，Ｃ_２−３アルケニル基，Ｃ_２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ_２−３アルキル基，又はＣ_１−３ハロアルキル基を示す。Ｒ^５及びＲ^６は,同一でも異なってもよく，水素原子，ハロゲン原子, Ｃ_１−３アルキル基，Ｃ_２−３アルケニル基，Ｃ_２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ_２−３アルキル基，Ｃ_１−３ハロアルキル基を示す。Ｒ^７は,ハロゲン原子又はＣ_１−３ハロアルキル基を示す。

本発明は，上記のリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体を含むオリゴリボ核酸（オリゴＲＮＡ）をも提供する。そして，オリゴリボ核酸（オリゴＲＮＡ）は，アンチセンスＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，及びアプタマーを含む医薬品素材となる。このため，本発明は，上記のリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体を含む試薬，アンチセンスＲＮＡ用試薬，ｓｉＲＮＡ用試薬，及びアプタマー用試薬をも提供する。

先に説明したとおり，本発明の第２の側面は，２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,リボヌクレオチド，またはそれらの誘導体の製造方法に関する。この製造方法については，後述する実施例に基づいて，当業者が公知の方法を適宜採用することで調整した者も本発明の第２の側面に含まれる。

以下，実施例を示し，本発明を具体的に説明する。しかしながら，本発明は，実施例に限定されず，当業者に自明な範囲で適宜修正したもの本発明に含まれる。

測定系
ＮＭＲ［^１Ｈ
ＮＭＲ（３００ＭＨｚ), ^３１ＰＮＭＲ
（１２１ＭＨｚ）］測定には，ヴァリアンマーキュリー３００（Varian MERCURY）３００
（３００ＭＨｚ）を用いた。^１ＨＮＭＲはＣＤＣｌ_３中テトラメチルシラン（tetramethylsilane） (TMS) (δ0.0) を外部標準として用いた。^３１ＰＮＭＲは85% Ｈ_３ＰＯ_４ (δ0.0) を外部標準として用いた。ＵＶ／ｖｉｓスペクトル測定には，ＪＡＳＣＯＶ−５５０ＵＶ／ｖｉｓスペクトロフォトメータ（spectrophotometer）を用いた。モルディタイムオブフライト質量分析（MALDI−TOF−MS）測定には，アプライドバイオシステム社製ボイジャーＤＥＳＴＲスペクトロメータ（Applied Biosystems Voyager−DE STR spectrometer）を用いた。薄相クロマトグラフィー (ＴＬＣ) には，ＴＬＣプレートシリカゲル（TLC plates Silica gel）６０
Ｆ_２５４（メルク, Ｎｏ. ５７１５）を用いた。シリカゲルカラムクロマトグラフィーには，カントーシリカゲル（Kanto silica gel ）60N （ｓｐｈｅｒｉｃａｌ, ｎｅｕｔｒａｌ, ６３−２１０マイクロm)を用いた。逆相（Reversed−phase） HPLC (RP−HPLC) には，マイクロボンドアスフェア（μBondasphere） 5 μm C18 column (100 オングストローム, 3.9 mm × 150 mm) (Waters)，またはソース 5RPC ST 4.6/150 (4.6 mm × 150
mm) (GE ヘルスケア)を用いた。反応に用いた溶媒は，市販のものを適切に蒸留し，ナトリウムまたはモレキュラーシーブ（ＭＳ）で乾燥したものを用いた。反応は全てアルゴン（Ａｒ）雰囲気下に行った。

２’−Ｏ−ハロアルコシキメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリイル）ウリジン３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト）の合成
（2´−O−haloalchoxymethyl−5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl)
uridine 3´−(2−cyanoethyl diisopropylphosphoramidite)）
以下のスキーム１〜３を,Ohgi,
T.; Kitagawa, H.; Yano, J.; Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry,
2008, 2.15.1−2.15.19.に記載の方法を参照して行った。

２’−Ｏ−ハロアルコシキメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（２ａ−ｅ）の調整
（2´−O−
haloalchoxymethyl −3´,5´−O−(1,1,3,3−tetraisopropyldisiloxane−1,3 −diyl)uridine (2a−e)）

スキーム１

スキーム１において，ＮＩＳは，Ｎ−ヨードスクシンイミドを示す。ＴｆＯＨは，トリフルオロメタンスルホン酸を示す。ＴＨＦは，テトラヒドロフランを示す。

２’−Ｏ−（２−クロロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（２ａ）
（2´−O−(2−chloro)ethoxymethyl−3´,5´−O−(1,1,3,3−tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl)uridine (2a)）
式１で示される化合物２’−Ｏ−メチルチオメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（１）（2´−O−methylthiomethyl−3´,5´−O−(1,1,3,3−tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl)uridine） (1.09 g, 2 ｍｍｏｌ)をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，THF(7 ml)に溶解させた。これに2−クロロエタノール (268 ml, 4 mmol)を加え，−４０°Cに冷却した。その後，N−ヨードスクシンイミド(540 mg, 2.4 mmol THF 5.4 ml中)を加え，トリフルオロメタンスルホン酸(351 ml, 2 mmol THF 7 ml中)を滴下した。反応混合物を−40°Cで1時間撹拌した後，トリエチルアミンを7 ml加えて反応を停止した。これにジクロロメタン(60 ml)を加え，10% Na₂S₂O₃水溶液(40 ml×2)，飽和重曹水(40 ml×2)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(60 ml)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[3×10 cm, 30g のシリカゲル, ジクロロメタン−メタノール（dichloromethane−methanol） (99.5:0.5,v/v → 99:1,v/v)]によって精製することにより，式２ａで示される化合物(1.06 g, 92%)を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 9.51 (1H, br, NH), d 7.90 (1H, d, J
= 8.1 Hz, 6−H) , d 5.75 (1H, s, 1´−H), d 5.69 (1H, d, J
= 8.4 Hz, 5−H) , d 5.05 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal) , d 4.99 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal), d 4.29−3.67 (9H, m, 2´−H, 3´−H, 4´−H, 5´−H, CH₂Cl−CH₂−O), d 1.11−0.93 (28H, m, iPr×4).

２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（２ｂ）
（2´−O−(2,2−dichloro)ethoxymethyl−3´,5´−O−(1,1,3,3−tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl)uridine (2b)）

上記式１で示される２’−Ｏ−メチルチオメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン(820 mg, 1.5 mmol) をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，THF(10 ml)に溶解させた。これに2,2−ジクロロエタノール (250 ml, 3 mmol)，モレキュラーシーブス4A (1.6 g)を加え，−40°Cに冷却した後，N−ヨードスクシンイミド(420 mg, 1.8 mmol)を加え，トリフルオロメタンスルホン酸(270 ml, 3 mmol)を滴下した。反応混合物を−40°Cで1時間撹拌した後，トリエチルアミンを5 ml加えて反応を停止した。これにジクロロメタン(40 ml)を加え，10% Na₂S₂O₃水溶液(30 ml×2)，飽和重曹水(30 ml×2)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(40 ml)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[2×10 cm, 20g of silica
gel, dichloromethane−methanol
(99.5:0.5,v/v →
97:3,v/v)]によって精製することにより，式2bで示される化合物(761 mg, 83%)を得た。

¹H
NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8.09 (1H, br, NH), d 7.89 (1H, d, J =
8.4 Hz, 6−H) , d 5.86 (1H, t, CHCl₂−CH₂−O), d 5.72 (1H, s, 1´−H), d 5.69−5.66 (1H, m, 5−H) , d 5.09 (1H, d, J =
6.6 Hz, H−C of acetal) , d 5.02 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal), d 4.29−3.96 (7H, m, 2´−H, 3´−H, 4´−H, 5´−H, CHCl₂−CH₂−O), d 1.11−0.93 (28H, m, iPr×4).

２’−Ｏ−（２，２，２−トリクロロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（２ｃ）
（2´−O−(2,2,2−trichloro)ethoxymethyl−3´,5´−O−(1,1,3,3−tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl)uridine ）
上記式１で示される２’−Ｏ−メチルチオメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン (1.09 g, 2 mmol) をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，THF(14 ml)に溶解させた。これに2,2,2−トリクロロエタノール (970 ml, 10 mmol)，モレキュラーシーブス4A (1.5 g)，及びN−ヨードスクシンイミド(545 mg, 2.4 mmol)を加え，−40°Cに冷却した後，トリフルオロメタンスルホン酸(351 ml, 4 mmol)を滴下した。反応混合物を−40°Cで1時間撹拌した後，トリエチルアミンを1.5 ml加えて反応を停止した。これにジクロロメタン(60 ml)を加え，10% Na₂S₂O₃水溶液(40 ml×2)，飽和重曹水(40 ml×2)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(40 ml×2)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[3×17 cm, 25g of silica gel, dichloromethane−methanol (99.5:0.5,v/v → 99:1,v/v)]によって精製することにより式２ｃで示される化合物(826 mg, 64%)を得た。

¹H
NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8.35 (1H, br, NH), d 7.89 (1H, d, J =
7.5 Hz, 6−H), d 5.75 (1H, s, 1´−H), d 5.68 (1H, d, J
= 7.8 Hz, 5−H) , d 5.23 (1H, d, J =
6.6 Hz, H−C of acetal) , d 5.16 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal), d 4.35−3.96 (7H, m, 2´−H, 3´−H, 4´−H, 5´−H, CCl₃−CH₂−O), d 1.11−0.96 (28H, m, iPr×4).

２’−Ｏ−（２，２−ジフルオロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（２ｄ）
（2´−O−(2,2−difluoro)ethoxymethyl−3´,5´−O−(1,1,3,3−tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl)uridine ）
上記式１で示される２’−Ｏ−メチルチオメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン(3.25 g, 6 mmol) をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，THF(38 ml)に溶解させた。これに2,2−ジフルオロエタノール (760 ml, 12 mmol)，及びモレキュラーシーブス4Aを加え，−40°Cに冷却した後，N−ヨードスクシンイミド(1.62 g, 7.2 mmol)を加え，トリフルオロメタンスルホン酸(760 ml, 12 mmol)を滴下した。反応混合物を−40°Cで1時間撹拌した後，トリエチルアミンを10 ml加えて反応を停止した。これにジクロロメタン(150 ml)を加え，10% Na₂S₂O₃水溶液(150 ml×2)，飽和重曹水(150 ml×2)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(50 ml×2)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[4×16 cm, 80g of silica gel, dichloromethane−methanol (99.5:0.5,v/v → 99:1,v/v)]によって精製することで式２ｄで示される化合物(2.85 g, 83%)を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8.90 (1H, br, NH), d 7.90 (1H, d, J
= 8.1 Hz, 6−H) , d 6.17−5.77 (1H, m, CHF₂−CH₂−O), d 5.73 (1H, s, 1´−H), d 5.69 (1H, d, J = 7.5 Hz, 5−H) , d 5.06 (1H, d, J
= 6.9 Hz, H−C of acetal) , d 4.97 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal), d 4.29−3.77 (7H, m, 2´−H, 3´−H, 4´−H, 5´−H, CHF₂−CH₂−O), d 1.14−0.91 (28H, m, iPr×4).

２’−Ｏ−（２，２，２−トリフルオロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（２ｅ）
（2´−O−(2,2,2−trifluoro)ethoxymethyl−3´,5´−O−(1,1,3,3−tetraisopropyldisiloxane−1,3−diyl)uridine )
上記式１で示される２’−Ｏ−メチルチオメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン(1.09 g, 2 mmol) をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，THF(12 ml)に溶解させた。これに2,2,2−トリフルオロエタノール (288 ml, 4 mmol)，モレキュラーシーブス4A (1 g)を加え，−40°Cに冷却した後，N−ブロモスクシンイミド(540 mg, 2．4 mmol)を加え，p−トルエンスルホン酸(288 ml, 4 mmol)を滴下した。反応混合物を−40°Cで1時間撹拌した後，トリエチルアミンを3 ml加えて反応を停止した。これにジクロロメタン(60 ml)を加え，10% Na₂S₂O₃水溶液(40 ml×2)，飽和重曹水(40 ml×2)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(40 ml×2)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[4×8 cm, 40g of silica gel, dichloromethane−methanol (99.5:0.5,v/v → 99:1,v/v)]によって精製を行なった。式２ｅで示される化合物を得ることはできたものの，アノマー異性体と考えられる副生成物の除去が困難であったため，これ以上の精製は行なわずこのまま次の反応に用いた。

２’−Ｏ−（ハロアルコシキメチル）−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリイル）ウリジン（４ａ−ｅ）の合成
（2´−O− haloalchoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl)uridine）
スキーム２

上記スキーム２において，ＭｅＯＨはメタノールを示す。ＤＭＴｒＣｌは，４，４’−ジメトキシトリチリルクロライドを示す。Ｐｙｒｉｄｉｎｅはピリジンを示す。ｒｔは室温を示す。

２’−Ｏ−（２−クロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（４ａ）
（2´−O−(2−chloro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl)uridine )
式２ａで示される２’−Ｏ−２−クロロエトシキメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン(869 mg, 1.5 mmol)をピリジン，及びによって共沸乾燥を行ない，メタノール(7.5 ｍｌ)に溶解させた。これにフッ化アンモニウム (222 mg, 6 mmol)を加え，50°Cで7時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し，アセトニトリル(30 ｍｌ)を加え，不溶物をろ過により除去した。これをヘキサン(30 ｍｌ×2)で洗浄し，集めた洗液をアセトニトリル(30 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を減圧下濃縮し，これ以上の精製は行なわず次の反応に用いた。粗精製物をピリジンによって共沸乾燥を行ない，ピリジン(15 ｍｌ)に溶解させた。これに４，４’−ジメトキシトリチリルクロライド（4,4´−dimethoxytritylchloride：ＤＭＴｒＣｌ）(730 mg, 2.25 mmol)を加え，室温で3日間撹拌した。メタノール(1.5 ｍｌ)で反応を停止した後，溶媒を減圧下留去し，ジクロロメタン(40 ｍｌ)を加えた。これを飽和重曹水(40 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(40 ｍｌ×2)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[3×14 cm, 40g of silica gel, dichloromethane−methanol− pyridine (99.5:0:0.5,v/v/v → 96.5:3:0.5,v/v/v)]によって精製することにより式４ａで示される化合物(754 mg, 79%)を得た。

¹H
NMR (300 MHz, CDCl₃) d 9.35 (1H, br, NH) , d 7.94 (1H, d, J =
8.1 Hz, 6−H) , d 7.40−6.82 (13H, m,
DMTr) , d 6.03 (1H, d, J = 2.7 Hz, 1´−H) , d 5.33−5.30 (1H, m, 5−H) , d 5.03 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal) , d 4.93 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal), d 4.50 (1H, m, 3´−H) , d 4.36−4.33 (1H, m, 2´−H) , d 4.09−4.07 (1H, m, 4´−H) , d 3.89−3.63 (8H, m, MeO×2, CH₂Cl−CH₂−O) , d 3.54−3.52 (2H, m, 5´−H), d 2.74 (1H, d, 3´−OH).

２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（４ｂ）
（2´−O−(2,2−dichloro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl)uridine )
式２ｂで示される化合物２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン(５３１ｍｇ, ８６５ｍｍｏｌ)をピリジン，及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，メタノール(5 ｍｌ)に溶解させた。これにフッ化アンモニウム (１３２ｍｇ, ３．５６ｍｍｏｌ)を加え，５０℃Ｃで４時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し，アセトニトリル(30 ｍｌ)を加え，不溶物をろ過により除去した。これをヘキサン(３０ｍｌ×２)で洗浄し，集めた洗液をアセトニトリル(２０ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を減圧下濃縮し，これ以上の精製は行なわず次の反応に用いた。粗精製物をピリジンによって共沸乾燥を行ない，ピリジン(10 ｍｌ)に溶解させた。これにＤＭＴｒＣｌ(２９０ｍｇ, ８５０ｍｍｏｌ)を加え，室温で10時間撹拌した。メタノール(２ｍｌ)で反応を停止した後，溶媒を減圧下留去し，ジクロロメタン(15 ｍｌ)を加えた。これを飽和重曹水(10 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(10 ｍｌ×2)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[3×14 cm, 40g of silica gel, dichloromethane−methanol− pyridine (99.5:0:0.5,v/v/v → 98.5:1:0.5,v/v/v)]によって精製することで式４ｂで示される化合物(470 mg, 86%)を得た。

¹H
NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8.24 (1H, br, NH) , d 7.96 (1H, d, J = 8.1
Hz, 6−H) , d 7.39−6.83 (13H, m,
DMTr) , d 6.01 (1H, d, J = 2.7 Hz, 1´−H) , d 5.80
(1H, t, CHCl₂−CH₂−O) , d 5.78−5.31 (1H, m, 5−H) , d 5.11 (1H, d, J = 6.9 Hz, H−C of
acetal) , d 4.98 (1H, d, J = 6.6 Hz, H−C of
acetal), d 4.53−4.46 (1H, m, 3´−H) , d 4.35−4.32 (1H, m, 2´−H) , d 4.06−4.04 (1H, m, 4´−H) , d 4.02−4.00 (2H, m, CHCl₂−CH₂−O) , d 3.80 (6H, s, MeO×2) , d 3.61−3.51 (2H, m, 5´−H), d 2.41 (1H, d, 3´−OH).

２’−Ｏ−２，２，２−トリクロロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（４ｃ）
（2´−O−(2,2,2−trichloro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl)uridine )
式２ｃで示される化合物２’−Ｏ−（２，２，２−トリクロロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン（６５０ｍｇ, １ｍｍｏｌ）をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，メタノール（５ｍｌ）に溶解させた。これにフッ化アンモニウム (148 mg, 4 mmol)を加え，５０°Cで７時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し，アセトニトリル(20 ｍｌ)を加え，不溶物をろ過により除去した。これをヘキサン(20 ｍｌ×2)で洗浄し，集めた洗液をアセトニトリル(20 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を減圧下濃縮し，これ以上の精製は行なわず次の反応に用いた。粗精製物をピリジンによって共沸乾燥を行ない，ピリジン(10 ｍｌ)に溶解させた。これにＤＭＴｒＣｌ(５１０ｍｇ, １．５１ｍｍｏｌ）を加え，室温で18時間撹拌した。メタノール(1 ｍｌ)で反応を停止した後，溶媒を減圧下留去し，ジクロロメタン(30 ｍｌ)を加えた。これを飽和食塩水(30 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(30 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[2×10 cm, 25g of silica gel, dichloromethane−methanol− pyridine (99.5:0:0.5,v/v/v → 98.5:1:0.5,v/v/v)]によって精製することにより式４ｃで示される化合物(621 mg, 88%)を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8.27 (1H, br, NH) , d 7.95 (1H, d, J
= 7.8 Hz, 6−H) , d 7.40−6.83 (13H, m, DMTr) , d 6.04 (1H, d, J = 3.0 Hz, 1´−H) , d 5.33−5.29 (1H, m, 5−H) , d 5.22 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal) , d 5.11 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal), d 4.52−4.48 (1H, m, 3´−H) , d 4.41−4.39 (1H, m, 2´−H) , d 4.29−4.20 (2H, m, CCl₃−CH₂−O), d 4.10−4.08 (1H, m, 4´−H), d 3.80 (6H, s,
MeO×2) , d 3.57−3.53 (2H, m, 5´−H), d 2.42
(1H, d, 3´−OH).

２’−Ｏ−２，２−ジフルオロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（４ｄ）
（2´−O−(2,2−difluoro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl)uridine )
式２ｄで示される化合物２’−Ｏ−（２，２−ジフルオロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン (1.16 g, 2 mmol)をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，メタノール(10 ｍｌ)に溶解させた。これにフッ化アンモニウム (296 mg, 8 mmol)を加え，50°Cで7時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し，アセトニトリル(40 ｍｌ)を加え，不溶物をろ過により除去した。これをヘキサン(50 ｍｌ×2)で洗浄し，集めた洗液をアセトニトリル(30 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を減圧下濃縮し，これ以上の精製は行なわず次の反応に用いた。粗精製物をピリジンによって共沸乾燥を行ない，ピリジン(20 ｍｌ)に溶解させた。これにＤＭＴｒＣｌ(1.42 g, 4.2 mmol)を加え，室温で3日間撹拌した。メタノール(2 ｍｌ)で反応を停止した後，溶媒を減圧下留去し，ジクロロメタン(30 ｍｌ)を加えた。これを飽和重曹水(30 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をクロロホルム (30 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[3×8 cm, 20g of silica gel, dichloromethane−methanol− pyridine (99.5:0:0.5,v/v/v → 96.5:3:0.5,v/v/v)]によって精製することにより，式４ｄで示される化合物(376 mg, 90%)を得た。

¹H NMR
(300 MHz, CDCl₃) d 8.25 (1H, br, NH) ,
d 7.96 (1H, d, J = 8.1 Hz, 6−H) , d 7.39−6.83 (13H, m, DMTr) , d 6.10−5.73 (1H, m, CHF₂−CH₂−O) , d 6.00 (1H, d, J = 2.7 Hz, 1´−H) , d 5.32−5.28 (1H, m, 5−H) , d 5.07 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal) , d 4.93 (1H, d, J =
6.6 Hz, H−C of acetal), d 4.53−4.47 (1H, m, 3´−H) , d 4.34−4.31 (1H, m, 2´−H) , d 4.08−4.06 (1H, m, 4´−H) , d 3.88−3.78 (8H, m, CHCl₂−CH₂−O, MeO×2) , d 3.60−3.51 (2H, m, 5´−H), d 2.39
(1H, d, 3´−OH).

２’−Ｏ−２，２，２−トリフルオロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（４ｅ）
（2´−O−(2,2,2−trifluoro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl)uridine )
式２ｅで示される化合物２’−Ｏ−（２，２，２−トリフルオロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３，−テトライソプロピルジシロキサン−１，３ジイル）ウリジン(414 mg, 692 mmol, crude)をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，メタノール(4 ｍｌ)に溶解させた。これにフッ化アンモニウム (103 mg, 2.78 mmol)を加え，50°Cで8時間撹拌した。反応混合物を減圧下濃縮し，アセトニトリル(15 ｍｌ)を加え，不溶物をろ過により除去した。これをヘキサン(15 ｍｌ×2)で洗浄し，集めた洗液をアセトニトリル(10 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を減圧下濃縮し，これ以上の精製は行なわず次の反応に用いた。粗精製物をピリジンによって共沸乾燥を行ない，ピリジン(7 ｍｌ)に溶解させた。これにＤＭＴｒＣｌ（５１０ｍｇ, １．５１ｍｍｏｌ）を加え，室温で17時間撹拌した。メタノール(1 ｍｌ)で反応を停止した後，溶媒を減圧下留去し，クロロホルム(20 ｍｌ)を加えた。これを飽和食塩水(20 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をクロロホルム(20 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[1×15 cm, 10g of silica gel, dichloro methane−methanol− pyridine (99.5:0:0.5,v/v/v → 98.5:1:0.5,v/v/v)]によって精製することにより，式４ｅで示される化合物(205 m,式１で示される化合物からの収率19%)を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8.06 (1H, br, NH) , d 7.95 (1H, d, J
= 8.4 Hz, 6−H) , d 7.39−6.84 (13H, m, DMTr) , d 6.00 (1H, d, J = 2.7 Hz, 1´−H) , d 5.1 (1H, d, J
= 8.4 Hz, 5−H) , d 5.10 (1H, d, J =
6.9 Hz, H−C of acetal) , d 4.96 (1H, d, J =
7.2 Hz, H−C of acetal), d 4.48 (1H, m, 3´−H) , d 4.35−4.33 (1H, m, 2´−H) , d 4.08−3.95 (2H, m, CF₃−CH₂−O, 4´−H) , d 3.80 (6H, s,
MeO×2) , d 3.57−3.53 (2H, m, 5´−H), d 2.33
(1H, d, 3´−OH).

２’−Ｏ−ハロアルコシキメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリイル）ウリジン３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ａ−ｅ）の調整
（2´−O−haloalchoxymethyl−5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl) uridine 3´−(2−cyanoethyl diisopropylphosphoramidite)）
スキーム３

スキーム３中，ＤＩＰＥＡは，ジイソプロピルアミンを示す。

２’−Ｏ−（２−クロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ａ）
（2´−O−(2−chloro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl) uridine 3´−(2−cyanoethyl diisopropylphosphoramidite) ）
式４ａで示される２’−Ｏ−２−クロロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（５１１ｍｇ, ８００ｍｍｏｌ）をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，ジクロロメタン(4 ｍｌ)に溶解させた。これにジイソプロピルアミン (410 ｍｌl, 2.4 ｍmol)を加え，2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジド (268 ｍｌ, 1.2 ｍmol in CH₂Cl₂ 4 ｍｌ) を滴下した。室温で1時間撹拌し，エタノール(1.5 ｍｌ)で反応を停止した。これにジクロロメタン(40 ｍｌ)を加え，飽和重曹水(40 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(40 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[2×10 ｃｍ, 15g of amino silica gel, hexane−ethylacetate (7:3,v/v → ethylacetate only)]によって精製することで，ジアステレオマー混合物の目的物である式５ａで示される化合物(469 mg, 70%)を得た。

¹H
NMR (300 MHz, CDCl₃) d 9.15 (1H, br, NH) , d 7.99−7.92 (1H, m, 6−H) , d 7.41−6.84 (13H, m, DMTr) , d 6.06 (1H, m, 1´−H) , d 5.30−5.23 (1H, m, 5−H) , d 5.06−4.93 (2H, m, H−C of acetal) , d 4.58−4.56 (1H, m, 3´−H) , d 4.47−4.42 (1H, m, 2´−H) , d 4.27−4.18 (1H, m, 4´−H) , d 3.99−3.44 (16H, m, MeO×2, 5´−H, 2×(CH₃)₂CH−N, CH₂Cl−CH₂−O, NC−CH₂CH₂−), d 2.69−2.41 (2H, m, NC−CH₂CH₂−) , d 1.17−1.02 (12H, m, 2×(CH₃)₂CH−N).
³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) d 151.35, d 150.48

２’−Ｏ−（２，２−ジクロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ｂ）
（2´−O−(2,2−dichloro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl) uridine 3´−(2−cyano ethyl diisopropylphosphoramidite) ）
式４ｂで示される２’−Ｏ−２，２−ジクロロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジンをピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，ジクロロメタン(3 ｍｌ)に溶解させた。これにジイソプロピルアミン (255 ｍｌ, 1.5 mmol)を加え，2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジド (167 ｍｌ, 1.2 mmol in CH₂Cl₂ 2 ｍｌ) を滴下した。室温で1.5時間撹拌し，エタノール(1 ｍｌ)で反応を停止した。これにジクロロメタン(30 ｍｌ)を加え，飽和重曹水(30 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(30 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[2×6 cm, 10g of amino silica gel, hexane−ethylacetate (7:3,v/v → ethylacetate only)]によって精製することで，ジアステレオマー混合物の目的物である式５ｂで示される化合物(324 mg, 77%)を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8.16 (1H, br, NH) , d 7.99−7.94 (1H, m, 6−H) , d 7.41−6.84 (13H, m, DMTr) , d 6.04−6.01 (1H, m, 1´−H) , d 5.86−5.79 (1H, m, 5−H) , d 5.29−5.20 (1H, m, CHCl₂−CH₂−O) , d 5.02−4.86 (2H, m, H−C of アセタール) , d 4.58−4.54 (1H, m, 3´−H) , d 4.44−4.41 (1H, m, 2´−H) , d 4.27−4.18 (1H, m, 4´−H) , d 4.13−3.42 (14H, m, MeO×2, 5´−H, 2×(CH₃)₂CH−N, CHCl₂−CH₂−O, NC−CH₂CH₂−), d 2.68−2.44 (2H, m, NC−CH₂CH₂−) , d 1.25−1.03 (12H, m, 2×(CH₃)₂CH−N).
³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) d 151.49, d 150.43

２’−Ｏ−（２，２，２−トリクロロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ｃ）
（2´−O−(2,2,2−trichloro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl) uridine 3´−(2−cyano ethyl diisopropylphosphoramidite) )
式４ｃで示される２’−Ｏ−２，２，２−トリクロロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン(283 mg, 400 ｍｍｏｌ)をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，ジクロロメタン(2 ｍｌ)に溶解させた。これにジイソプロピルアミン (204 ｍｌ, 1.5 mmol)を加え，2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジド (134 ｍｌ, 600 ｍｍｏｌ in CH₂Cl₂ 2 ｍｌ) を滴下した。室温で1時間撹拌し，エタノール(1 ｍｌ)で反応を停止した。これにジクロロメタン(25 ｍｌ)を加え，飽和重曹水(25 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(25 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[2×6 cm, 10g of amino silica gel, hexane−ethylacetate (8:2,v/v → ethylacetate only)]によって精製することで，ジアステレオマー混合物の目的物である式５ｃで示される化合物(285 mg, 83%)を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8.11 (1H, br, NH) , d 7.96−7.94 (1H, m, 6−H) , d 7.41−6.84 (13H, m, DMTr) , d 6.06 (1H, m, 1´−H) , d 5.30−5.06 (3H, m, 5−H, H−C
of acetal) , d 4.59−4.47 (2H, m, 3´−H, 2´−H) , d 4.29−3.41 (15H, m, 4´−H, MeO×2, 5´−H, 2×(CH₃)₂CH−N, CCl₃−CH₂−O, NC−CH₂CH₂−), d 2.68−2.42 (2H, m, NC−CH₂CH₂−) , d 1.26−1.03 (12H, m, 2×(CH₃)₂CH−N).
³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) d 151.49, d 150.43

２’−Ｏ−（２，２−ジフルオロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ｄ）
（2´−O−(2,2−difluoro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl) uridine 3´−(2−cyano ethyl diisopropylphosphoramidite) )
式４ｄで示される２’−Ｏ−２，２−ジフルオロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン(320 mg, 500 ｍｍｏｌ)をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，ジクロロメタン(5 ｍｌ)に溶解させた。これにジイソプロピルアミン (255 ｍｌ, 1.5 mmol)を加え，氷浴下で2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジド (225 ｍｌ, 1 mmol) を滴下した。室温で1時間撹拌し，反応混合物にクロロホルム(30 ｍｌ)を加えた。これをリン酸バッファー (pH 7.0, 20 ｍｌ×4)で洗浄し，集めた洗液をクロロホルム(40 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[1×8 cm, 5g of amino silica gel, hexane−ethylacetate (7:3,v/v → ethylacetate only)]によって精製することで，ジアステレオマー混合物の目的物である式５ｄで示される化合物(227 mg, 54%)を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8.10 (1H, br, NH) , d 8.00−7.94 (1H, m, 6−H) , d 7.39−6.84 (13H, m, DMTr) , d 6.10−5.73 (2H, m, 1´−H) , d 5.28−5.20 (2H, m, CHF₂−CH₂−O, 5−H) , d 5.03−4.89 (2H, m, H−C of acetal) , d 4.61−4.56 (1H, m, 3´−H) , d 4.43−4.41 (1H, m, 2´−H) , d 4.27−4.20 (1H, m, 4´−H) , d 3.93−3.42 (14H, m, MeO×2, 5´−H, 2×(CH₃)₂CH−N, CHF₂−CH₂−O, NC−CH₂CH₂−) , d 2.65−2.44 (2H, m, NC−CH₂CH₂−) , d 1.29−0.85 (12H, m, 2×(CH₃)₂CH−N).
³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) d 151.56, d 150.38

２’−Ｏ−（２，２，２−トリフルオロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ｅ）
（2´−O−(2,2,2−trifluoro)ethoxymethyl −5´−O−(4,4´−dimethoxytrityl) uridine 3´−(2−cyano ethyl diisopropylphosphoramidite) ）
式４ｅで示される２’−Ｏ−２，２，２−トリフルオロエトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン (184 mg, 280 ｍｍｏｌ)をピリジン及びトルエンによって共沸乾燥を行ない，ジクロロメタン(2 ｍｌ)に溶解させた。これにジイソプロピルアミン (143 ｍｌ, 840 ｍｍｏｌ)を加え，2−シアノエチルジイソプロピルクロロホスホロアミジド (93.7 ｍｌ, 420 ｍｍｏｌ in CH₂Cl₂ 1 ｍｌ) を滴下した。室温で1.5時間撹拌し，エタノール(500 ｍｌ)で反応を停止した。これにジクロロメタン(15 ｍｌ)を加え，飽和重曹水(15 ｍｌ×3)で洗浄し，集めた洗液をジクロロメタン(15 ｍｌ)で抽出した。集めた有機層を無水硫酸ナトリウムで乾燥後，ろ過し，減圧下濃縮乾燥したものをシリカゲルクロマトグラフィー[2×7 cm, 11g of amino silica gel, hexane−ethylacetate (8:2,v/v → ethylacetate only)]によって精製することで，ジアステレオマー混合物の目的物である式５ｅで示される化合物(188 mg, 80%)を得た。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 9.00 (1H, br, NH) , d 7.99−7.94 (1H, m, 6−H) , d 7.39−6.84 (13H, m, DMTr) , d 6.01 (1H, m, 1´−H) , d 5.30−5.21 (1H, m, 5−H) , d 5.05−4.97 (2H, m, H−C of acetal) , d 4.62−4.55 (1H, m, 3´−H) , d 4.44 (1H, m, 2´−H) , d 4.27−4.18 (1H, m, 2´−H) , d 4.10−3.42 (14H, m, MeO×2, 5´−H, 2×(CH₃)₂CH−N, CCl₃−CH₂−O, NC−CH₂CH₂−), d 2.64−2.41 (2H, m, NC−CH₂CH₂−) , d 1.26−1.02 (12H, m, 2×(CH₃)₂CH−N).
³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) d 151.74, d 150.40

２’−Ｏ−（２−フルオロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ｆ）の調整
（2´-O-(2-fluoro)ethoxymethyl-5´-O-(4,4´-dimethoxytrityl) uridine 3´-(2-cyanoethyl diisopropylphosphoramidite) (5f)）

スキーム４

スキーム４中，ＮＩＳは，Ｎ−ヨードスクシンイミドを示す。ＴｆＯＨは，トリフルオロメタンスルホン酸を示す。ＴＨＦは，テトラヒドロフランを示す。ＭｅＯＨはメタノールを示す。ＤＭＴｒＣｌは，４，４’−ジメトキシトリチリルクロライドを示す。Ｐｙｒｉｄｉｎｅはピリジンを示す。ｒｔは室温を示す。

２’−Ｏ−（２−フルオロ）エトキシメチル−３’，５’−Ｏ−（１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）ウリジン（２ｆ）
（2´-O-(2-fluoro)ethoxymethyl-3´,5´-O-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl)uridine(2f)）
2fの粗精製物は1(1.64 g, 3 mmol)と2-フルオロエタノール (1.65 ml, 30 mmol) から、2aと同様の手法により得た。シリカゲルクロマトグラフィー[3×17 cm, 50g of silica gel, hexane-ethylacetate (7:3,v/v)]によって精製を行い、2fを得た(1.13 g, 66%)。

¹H NMR (300
MHz, CDCl₃), 9.57 (1H, br, NH), 7.90 (1H, d, J = 8.1 Hz, 6-H),
5.76 (1H, s, 1´-H), 5.69 (1H, d, J
= 8.1 Hz, 5-H), 5.04 (1H, d, J = 6.9 Hz, H-C of acetal), 5.00 (1H, d, J
= 6.9 Hz, H-C of acetal), 4.68-4.53 (2H, m, CH₂F-CH₂-O)
4.29-3.86 (7H, m, 2´-H, 3´-H, 4´-H, 5´-H, CH₂F-CH₂-O),
1.10-0.91 (28H, m, iPr×4).

２’−Ｏ−（２−フルオロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン（４ｆ）
(2´-O-(2-fluoro)ethoxymethyl-5´-O-(4,4´-dimethoxytrityl)uridine (4f))
4fの粗精製物は，2´-O-(2-fluoro)ethoxymethyl-3´,5´-O-(1,1,3,3-tetraisopropyldisiloxane
-1,3-diyl)uridine 2f (1.13 g, 2.0 mmol)を原料とし、4aと同様の手法により得た。シリカゲルクロマトグラフィー[2.5×15 cm, 22g of silica gel, dichloromethane-methanol- pyridine
(99.5:0:0.5,v/v/v → 96.5:1:0.5,v/v/v)]によって精製を行い4fを得た(908 mg, 73%)。

¹H NMR (300
MHz, CDCl₃) 8.03 (1H, br, NH), 7.93 (1H, d, J = 8.4 Hz, 6-H),
7.39-6.82 (13H, m, DMTr), 6.02 (1H, d, J = 3.3 Hz, 1´-H), 5.30-5.28 (1H, m, 5-H), 5.04 (1H, d, J
= 6.6 Hz, H-C of acetal), 4.93 (1H, d, J = 6.6 Hz, H-C of acetal),
4.67-4.46 (3H, m, 3´-H, CH₂F-CH₂-O),
4.36-4.34 (1H, m, 2´-H), 4.10-4.08 (1H, m, 4´-H),3.94-3.80 (8H, m, MeO×2, CH₂F-CH₂-O),
3.53-3.52 (2H, m, 5´-H), 2.61 (1H, d, 3´-OH).

２’−Ｏ−（２−フルオロ）エトキシメチル−５’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）ウリジン３’−（２−シアノエチルジイソプロピルホスホロアミダイト）（５ｆ）
(2´-O-(2-fluoro)ethoxymethyl-5´-O-(4,4´-dimethoxytrityl) uridine 3´-(2-cyanoethyl diisopropylphosphoramidite) (5f))
2´-O-(2-fluoro)ethoxymethyl-5´-O-(4,4´-dimethoxytrityl)uridine
4f (908 mg, 1.46 mmol)を原料とし、5aと同様に合成、精製を行い、ジアステレオマー混合物の5fを得た(918 mg, 77%)。

¹H NMR (300 MHz, CDCl₃) d 8.34 (1H, br, NH) , d 7.95-7.90 (1H, m, 6-H) , d 7.41-6.84 (13H, m, DMTr)
, d 6.06 (1H, m, 1´-H) , d 5.30-5.23 (1H, m, 5-H) ,
d 5.01-4.86 (2H, m, H-C of acetal) , d 4.67-4.43 (4H, m, 2’-H, 3´-H, CH₂F-CH₂-O) , d 3.97-3.40 (14H, m, MeO×2, 5´-H, 2×(CH₃)₂CH-N, CH₂F-CH₂-O,
NC-CH₂CH₂-), d 2.68-2.41 (2H, m, NC-CH₂CH₂-) , d 1.28-1.03 (12H, m, 2×(CH₃)₂CH-N).
³¹P NMR (121 MHz, CDCl₃) d 151.1, d 150.8

ＤＮＡ合成機ＡＢＩエクセペダイト８９０９を用いた固相合成
鎖長伸長サイクルは，2´−O−TBDMS RNA 0.2 マイクロモルスケールのプロトコルにより行なった。合成試薬は全て，グレンリサーチ（Glen Research）社より購入したＡＢＩ用のものを用いた。固相担体には，グレンリサーチより購入したＵ-ＲＮＡ-ＣＰＧ (0.2 マイクロmol for Expedite)を用いた。アミダイトユニットは，ジクロロメタンに溶解させ用いた。

合成後，CPGの充填されているカラムに対しアンモニア水(1 ml)を加え，室温で3時間反応させた。溶液を減圧下濃縮し，凍結乾燥によって乾固させた。これを水に溶かし，逆相HPLCを用いて分析，精製した。

ＲＮＡ合成のプロトコル
(2´−O−TBDMS RNA 0.2 mmol scale)

合成したオリゴヌクレオチドの配列と性質

Ｕ_１２−Ａ_１２デュープレックスの融解温度解析
合成したU₁₂オリゴマーと，rA₁₂またはdA₁₂オリゴマー各々0.3 nmolを10 mM phosphate−100 mM NaCl−0.1 mM EDTA buffer (pH 7.0) 150 mlに溶かした。オリゴマー溶液を8連セルに100 ml加え，室温から5 °C / minの速度で90 °Cまで上昇させた後，90 °Cの状態を10分間保持し，−2 °Cの速度で0 °Cになるまで温度を下降させ，アニーリングを行なった。オリゴマー溶液を4 °Cで1時間静置した後，融解温度T_m値の測定を行なった。オリゴマー溶液をセルに入れ，減圧下15分間脱気した後，窒素気流下，0.5 °C / minの速度で90 °Cまで温度を上昇させながら，0.5 °C間隔で260 nmにおける吸光度を測定した。

(1)アルコキシメチル骨格修飾に対する置換基の影響 (vs RNA U₁₂−rA₁₂)
アルコキシメチル骨格修飾に対する置換基の影響を検討した。その結果を図１に示す。図１は，アルコキシメチル骨格修飾に対する置換基の影響を示す図面に替わるグラフである。図中，縦軸は相対的な吸収量を示す。Ｕは,核酸塩基がウラシルである核酸を示す。ＤＦＥＭは, 核酸の２，２−ジフルオロエトキシメチル修飾体を示す。ＤＣＥＭは，核酸の２，２−ジクロロエトキシメチル修飾体を示す。ＥＯＭは, 核酸の２’−Ｏ−エトキシメチル修飾体を示す。また,これらの特性を下表に示す。

上記の表から, ２’−Ｏ−エトキシメチル修飾により，二重鎖融解温度Ｔ_ｍが減少することが改めて示された。一方,ハロ置換２’−Ｏ−エトキシメチル修飾により, 二重鎖融解温度Ｔ_ｍが上昇することが示された。特に，２，２−ジクロロエトキシメチル修飾体は，きわめて高い二重鎖結合能を有することが示された。

(2)アルコキシメチル骨格修飾に対する置換基の個数の影響
(2−1)フッ素を含む修飾体 (vs RNA U₁₂−rA₁₂)
フッ素を含む修飾体の置換基の個数の影響を検討した。その結果を図２に示す。図２は，フッ素を含む修飾体の置換基の個数の影響を示す図面に替わるグラフである。図中，縦軸は相対的な吸収量を示す。Ｕは,核酸塩基がウラシルである核酸を示す。ＤＦＥＭは, 核酸の２，２−ジフルオロエトキシメチル修飾体を示す。ＴＦＥＭは，核酸の２，２，２−トリクロロエトキシメチル修飾体を示す。ＥＯＭは, 核酸の２’−Ｏ−エトキシメチル修飾体を示す。また,これらの特性を下表に示す。

上記の表から，フッ素原子で置換したハロエトキシメチル基を保護器とするリボヌクレオシドは，二重鎖形成能力を有するがそれほど高くないことがわかる。

(2−2)塩素を含む修飾体 (vs RNA U₁₂−rA₁₂)
塩素を含む修飾体の融解温度を測定した。その結果を図３に示す。図３は，塩素原子を含む修飾体の置換基の個数の影響を示す図面に替わるグラフである。

上記の表から，塩素原子の１置換体及び２置換体において，融解温度が極めて顕著に増加することがわかる。

(3)ハロアルコキシメチル修飾体とＣＥＭ体，Ｍｅ体との比較 (vs RNA U₁₂−rA₁₂)

次に，上記の通り，顕著な融解温度を示す塩素原子の１置換体及び２置換体と，２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）置換体及びメチル置換体とを比較した。その結果を図４に示す。図４は，塩素原子の１置換体及び２置換体と，シアノ基置換体及びメチル置換体を比較する図面に替わるグラフである。

上記のとおりであるから，塩素原子の１置換体及び２置換体は，２−シアノエトキシメチル（ＣＥＭ）置換体に比べて融解温度が優位に上昇することがわかる。また，塩素原子の１置換体及び２置換体は，メチル置換体と同程度の高い溶解温度を示すことがわかる。

(4) DNAに対する親和性の検討
(4−1)フッ素を含む修飾体 (vs DNA U₁₂−dA₁₂)
次に，フッ素を含む修飾体のＤＮＡに対する親和性を検討した。その結果を図５に示す。図５は，フッ素を含む修飾体のＤＮＡに対する親和性を示す図面に替わるグラフである。

フッ素原子を含む修飾体はＤＮＡに対する親和性を示さなかった。

(4−2)塩素を含む修飾体 (vs DNA U₁₂−dA₁₂)
次に，塩素を含む修飾体のＤＮＡに対する親和性を検討した。その結果を図６に示す。図６は，塩素原子を含む修飾体のＤＮＡに対する親和性を示す図面に替わるグラフである。

塩素原子を含む修飾体はＤＮＡに対する親和性を示さなかった。

(5)アルコキシメチル骨格修飾に対するフッ素置換基の影響 (vs RNA U₁₂−rA₁₂)
フッ素を含む修飾体の置換基の影響を検討した。その結果を図７に示す。図７は，フッ素を含む修飾体の置換基の影響を示す図面に替わるグラフである。図中，縦軸は相対的な吸収量を示す。Ｕは,核酸塩基がウラシルである核酸を示す。ＥＯＭは, 核酸の２’−Ｏ−エトキシメチル修飾体を示す。ＭＦＥＭは，核酸の２’−Ｏ−フルオロエトキシメチル修飾体を示す。また,これらの特性を下表に示す。

上記の表から，フッ素原子で置換したハロエトキシメチル基を有するリボヌクレオシドは，天然型RNAよりも高い二重鎖形成能力を有するが、安定化の効果はそれほど大きくない。

オリゴリボ核酸（オリゴＲＮＡ）は，アンチセンスＲＮＡ，ｓｉＲＮＡ，アプタマーなどの医薬品素材となる機能性分子として注目され，世界中で医薬品としての開発が進められている。したがって，本発明は医薬産業の分野で利用され得る。

Claims

２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,又はリボヌクレオチドであって，前記保護基が下記一般式（Ｉ）で示される，リボヌクレオシド,又はリボヌクレオチド。

式中，Ｏ^＊は，リボヌクレオシド,又はリボヌクレオチドの２’位水酸基の酸素原子を示し，
Ｒ^１〜Ｒ^４は,いずれも水素原子を示し,
Ｒ^５は,ハロゲン原子,Ｃ_１−３アルキル基，Ｃ_２−３アルケニル基，Ｃ_２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ_２−３アルキル基，又はＣ_１−３ハロアルキル基を示し,
Ｒ^６は,水素原子,フッ素原子又は塩素原子を示し,
Ｒ^７は,フッ素原子又は塩素原子を示す（ただし，Ｒ ^６が水素原子であり，Ｒ ^５がフッ素原子である組み合わせ，及びＲ ^６が水素原子であり，Ｒ ^５が塩素原子である組み合わせを除く。）。
下記一般式（Ｉ）で示される２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,又はリボヌクレオチドの製造方法であって，
下記一般式（ＩＩ）で示される化合物に下記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物を作用させる工程を含む，方法。

（一般式（Ｉ）中，Ｏ^＊は，リボヌクレオシド,又はリボヌクレオチドの２’位水酸基の酸素原子を示し，
Ｒ^１〜Ｒ^４は,いずれも水素原子を示し,
Ｒ^５は,ハロゲン原子,Ｃ_１−３アルキル基，Ｃ_２−３アルケニル基，Ｃ_２−３アルキニル基，ヒドロキシＣ_２−３アルキル基，又はＣ_１−３ハロアルキル基を示し,
Ｒ^６は,水素原子,フッ素原子又は塩素原子を示し,
Ｒ^７は,フッ素原子又は塩素原子を示す（ただし，Ｒ ^６が水素原子であり，Ｒ ^５がフッ素原子である組み合わせ，及びＲ ^６が水素原子であり，Ｒ ^５が塩素原子である組み合わせを除く。）。）

（一般式（ＩＩ）中,Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ^２１，Ｒ^２２,Ｒ^２３及びＲ^２４は，同一でも異なってもよく，直鎖又は分岐してもよいＣ_１−５アルキル基, Ｃ_１−５アルコキシ基又はＣ_１−５ハロアルキル基を示し，Ｒ^１及びＲ^２は一般式（Ｉ）におけるＲ^１及びＲ^２と同義である。）

（一般式（ＩＩＩ）中，Ｒ^３〜Ｒ^７は，一般式（Ｉ）におけるＲ^３〜Ｒ^７と同義である。）
請求項２に記載の２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,又はリボヌクレオチドの製造方法であって，
前記一般式（ＩＩ）で示される化合物に前記一般式（ＩＩＩ）で示される化合物を作用させ，下記一般式（ＩＶ）で示される化合物を得た後，
前記一般式（ＩＶ）で示される化合物と，Ｃ_１−３アルコールと反応させ，
下記一般式（Ｖ）で示される化合物を得る工程と，
前記一般式（Ｖ）で示される化合物とハロゲン化ジメトキシトリフェニルメチルと反応させ，一般式（ＶＩ）で示される化合物を得る工程を含む，方法。

（一般式（ＩＶ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ^１〜Ｒ^７は，一般式（Ｉ）におけるＲ^１〜Ｒ^７と同義であり，Ｒ^２１〜Ｒ^２４は，一般式（ＩＩ）におけるＲ^２１〜Ｒ^２４と同義である。）

（一般式（Ｖ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ^１〜Ｒ^７は，一般式（Ｉ）におけるＲ^１〜Ｒ^７と同義である。）

（一般式（ＶＩ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ^１〜Ｒ^７は，一般式（Ｉ）におけるＲ^１〜Ｒ^７と同義であり，式ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を示す。）
る。）
請求項３に記載の２’−位に保護基を有するリボヌクレオシド,又はリボヌクレオチドの製造方法であって，
前記一般式（ＶＩ）で示される化合物を得る工程の後に，
前記一般式（ＶＩ）で示される化合物と下記一般式（ＶＩＩ）で示される化合物を反応させ，下記一般式（ＶＩＩＩ）で示される化合物を得る工程を含む，
方法。

(一般式（ＶＩＩ）中，
Ｒ^３１〜Ｒ^３４は，同一でも異なってもよく，水素原子,Ｃ_１−３アルキル基,又はＣ_１−３ハロアルキル基を示し,
Ｒ^３５〜Ｒ^３６は，同一でも異なってもよく，Ｃ_１−５アルキル基又はＣ_１−５ハロアルキル基を示し,
Ｒ^３７は，ハロゲン原子を示す。）

(一般式（ＶＩＩＩ）中，Ｂは保護基で保護されてもよい核酸塩基を示し，Ｒ^１〜Ｒ^７は，一般式（Ｉ）におけるＲ^１〜Ｒ^７と同義であり,Ｒ^３１〜Ｒ^３６は，一般式（ＶＩＩ）におけるＲ^３１〜Ｒ^３６と同義であり, 式ＤＭＴｒは４，４’−ジメトキシトリチル基を示す。）