JP6322652B2 - Ｈ−ｎｏｘタンパク質の重合体形態 - Google Patents

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Description

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、助成金番号２ Ｒ４４ＣＡ１３８００６−０２によって支援された。米国政府は、本願に関わる任意の特許における権利を有する。
本願は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質およびこれを使用して酸素を送達する方法に関する。重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｏ２をヒトに、獣医学目的では動物に送達するための新たな治療ツールを提供する。
Ｈ−ＮＯＸタンパク質（ヘム−一酸化窒素および酸素（Ｈｅｍｅ−Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｎｄ ＯＸｙｇｅｎ）結合ドメインにちなみ命名）は、ヘムタンパク質の高度に保存され十分に特徴付けされたファミリーのメンバーである（Ｉｙｅｒ， ＬＭら（２００３年）ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４巻（１号）：５頁；Ｋａｒｏｗ， ＤＳら（２００４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３巻（３１号）：１０２０３〜１０２１１頁；Ｂｏｏｎ， ＥＭら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．１巻：５３〜５９頁；Ｂｏｏｎ， ＥＭら（２００５年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．９巻（５号）：４４１〜４４６頁；Ｂｏｏｎ， ＥＭら（２００５年）Ｊ． Ｉｎｏｒｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９巻（４号）：８９２〜９０２頁；Ｃａｒｙ， ＳＰら（２００５年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２巻（３７号）：１３０６４〜９頁；Ｋａｒｏｗ ＤＳら（２００５年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４巻（４９号）：１６２６６〜７４頁；Ｃａｒｙ， ＳＰら（２００６年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ３１巻（４号）：２３１〜９頁；Ｂｏｏｎ， ＥＭら（２００６年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１巻（３１号）：２１８９２〜９０２頁；Ｗｉｎｇｅｒ， ＪＡら（２００７年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８２巻（２号）：８９７〜９０７頁）。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、以前のヘモグロビンに基づく酸素キャリアとは異なり一酸化窒素にニュートラル（ｎｅｕｔｒａｌ）であり、Ｈ−ＮＯＸは循環一酸化窒素をスキャベンジせず、よって、高血圧性または腎性の副作用を伴わない。内在性ＮＯによるＨ−ＮＯＸタンパク質の不活性化の確率がより低く、Ｈ−ＮＯＸタンパク質により内在性ＮＯをスキャベンジする確率がより低いことによる内因性低ＮＯ反応性（および高ＮＯ安定性）は、野生型および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質を望ましい代用血液とする。重要なことに、一部のＨ−ＮＯＸタンパク質における遠位ポケットチロシンの存在（Ｐｅｌｌｉｃｅｎａ， Ｐ．ら（２００４年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１巻（３５号）：１２８５４〜１２８５９頁）は、望ましくない高ＮＯ反応性を示唆し、代用血液としての使用を禁忌とする。例えば、類推により、構造的に類似の遠位ポケットチロシンを有するＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓヘモグロビンタンパク質は、ＮＯと極度に迅速に反応し、感染宿主によって産生される防御的ＮＯを効果的にスキャベンジおよび回避するためにＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍによって使用される（Ｏｕｅｌｌｅｔ， Ｈ．ら（２００２年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ ９９巻（９号）：５９０２〜５９０７頁）。しかし、驚くべきことに、Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、実際にはヘモグロビンのＮＯ反応性よりもはるかに低いＮＯ反応性を有することが発見され、代用血液としてのその使用を可能にする。
ＮＯに結合するがＯ２に結合しないＨ−ＮＯＸタンパク質が、単一アミノ酸変異の導入により、ＮＯおよびＯ２の両方に結合するＨ−ＮＯＸタンパク質へと変換され得ることが発見された（ＷＯ２００７／１３９７９１およびＷＯ２００７／１３９７６７を参照）。よって、Ｏ２およびＮＯに対するＨ−ＮＯＸタンパク質の親和性ならびにＯ２およびＮＯリガンドの間を識別するＨ−ＮＯＸタンパク質の能力は、１個または複数のアミノ酸変異を導入することにより変更され得、所望の親和性でＯ２またはＮＯに結合するようＨ−ＮＯＸタンパク質を調整することができる。Ｏ２および／またはＮＯに対する親和性をさらに変更するために、追加の変異が導入され得る。したがって、Ｈ−ＮＯＸタンパク質ファミリーを操作して、Ｏ２送達に関して改善されたまたは最適な動力学的特性および熱力学的特性を示させることができる。例えば、種々の臨床および産業上の利用に対するＨ−ＮＯＸタンパク質の有用性を改善する、Ｏ２結合の解離定数および／または解離速度（ｏｆｆ ｒａｔｅ）が変更された変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質が作製された。Ｏ２に結合し送達するようＨ−ＮＯＸタンパク質を調整する能力は、現在のＯ２キャリアの中心的な弱点に取り組みこれを克服する治療手段である。
Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、サイズが相対的に小さく、腎臓を通って濾過され、短い循環半減期を生じ得る。ある特定の治療用途に必要とされるのは、十分な期間Ｏ２および／またはＮＯに結合し遠位組織へとＯ２および／またはＮＯを送達することができる、より長い循環半減期を有するＨ−ＮＯＸである。より長い循環半減期を有する重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が本明細書に提供される。その上、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、腫瘍へと血管外遊出し、そこで異なる速度で蓄積する。重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、腫瘍の正常酸素圧領域を通って酸素を輸送し、腫瘍内の低酸素ゾーンの深部で酸素を放出するよう調整される。このような特色の組合せは、腫瘍細胞の酸素化に依存する放射線療法、化学療法および他の抗がん処置の有効性を増加させるための、腫瘍の低酸素ニッチのモディファイヤーとしての酸素キャリアの使用における有意な前進を表す。
特許出願および刊行物を含む、本明細書に引用されている全ての参考文献は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
国際公開第２００７／１３９７９１号 国際公開第２００７／１３９７６７号
Ｉｙｅｒ， ＬＭら（２００３年）ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４巻（１号）：５頁 Ｋａｒｏｗ， ＤＳら（２００４年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３巻（３１号）：１０２０３〜１０２１１頁 Ｂｏｏｎ， ＥＭら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．１巻：５３〜５９頁 Ｂｏｏｎ， ＥＭら（２００５年）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．９巻（５号）：４４１〜４４６頁 Ｂｏｏｎ， ＥＭら（２００５年）Ｊ． Ｉｎｏｒｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９巻（４号）：８９２〜９０２頁 Ｃａｒｙ， ＳＰら（２００５年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０２巻（３７号）：１３０６４〜９頁 Ｋａｒｏｗ ＤＳら（２００５年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４４巻（４９号）：１６２６６〜７４頁 Ｃａｒｙ， ＳＰら（２００６年）Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ３１巻（４号）：２３１〜９頁 Ｂｏｏｎ， ＥＭら（２００６年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８１巻（３１号）：２１８９２〜９０２頁 Ｗｉｎｇｅｒ， ＪＡら（２００７年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２８２巻（２号）：８９７〜９０７頁 Ｐｅｌｌｉｃｅｎａ， Ｐ．ら（２００４年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１巻（３５号）：１２８５４〜１２８５９頁 Ｏｕｅｌｌｅｔ， Ｈ．ら（２００２年）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ．Ｕ Ｓ Ａ ９９巻（９号）：５９０２〜５９０７頁
一部の態様において、本発明は、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。一部の実施形態において、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインは、同種Ｈ−ＮＯＸドメインである。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、異種Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、二量体、三量体、四量体または五量体である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、共有結合により連結されている。
本発明の一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、単量体を含み、該単量体が、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、重合ドメインに共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインに共有結合により連結されている。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインに共有結合により連結されている。一部の実施形態において、単量体が会合して、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成する。
本発明の一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、１個または複数の三量体形成ドメイン（ｔｒｉｍｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）を含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個の単量体を含み、該単量体は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび三量体形成ドメインを含む。一部の実施形態において、三量体形成ドメインは、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである。一部の実施形態において、三量体形成ドメインは、フォルドン（ｆｏｌｄｏｎ）ドメインである。一部の実施形態において、フォルドンドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、三量体形成ドメインに共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、三量体形成ドメインのＮ末端に共有結合により連結されている。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、三量体形成ドメインのＮ末端に共有結合により連結されている。
上述の実施形態のうちいずれかの一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。
上述の実施形態のうち一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、少なくとも１個のタグを含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、少なくとも１個のＨｉｓ６タグを含む。
上述の実施形態のうちいずれかの一部の実施形態において、アミノ酸リンカーは、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび／または重合ドメインおよび／またはタグの間に位置する。一部の実施形態において、アミノ酸リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列である。
上述の実施形態のうちいずれかの一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応する。
上述の実施形態のうちいずれかの一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、１個または複数の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、１４４位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、１４４位におけるアミノ酸置換は、Ｌ１４４Ｆ置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも２個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも２個は、１４４位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、１４４位におけるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのうち少なくとも１個のアミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、少なくとも２個の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、少なくとも２個の遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９およびＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、９位および１４４位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、９位におけるアミノ酸置換は、Ｗ９Ｆ置換であり、１４４位におけるアミノ酸置換は、Ｌ１４４Ｆ置換である。
一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓの野生型Ｈ−ＮＯＸドメインを３個含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインのそれぞれは、そのＣ末端において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカーによって、Ｔ４バクテリオファージフォルドンドメインのＮ末端に共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈｉｓ６タグが、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸リンカーを介して、フォルドンドメインのＣ末端に連結されている。
一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインを３個含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインのそれぞれは、そのＣ末端において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカーによって、Ｔ４バクテリオファージフォルドンドメインのＮ末端に共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈｉｓ６タグが、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸リンカーを介して、フォルドンドメインのＣ末端に連結されている。
上述の実施形態のうちいずれかの一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、ヘモグロビンのＯ２解離定数の２桁以内であり、該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低い。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１ｎＭ〜約１０００ｎＭの間である。他の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１μＭ〜約１０μＭの間である。さらに他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１０μＭ〜約５０μＭの間である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃において約７００ｓ−１未満である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い。さらなる実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１，０００倍低い。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約０．６５ｓ−１以下である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約１．３５ｓ−１〜約２．９ｓ−１の間である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、３７℃において約１ｈ−１未満である。
上述の実施形態のうち一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、５０ｋＤａｌを超える、１００ｋＤａｌを超える、または１５０ｋＤａｌを超える。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、単一のＨ−ＮＯＸドメインを含む対応する単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較して、該哺乳動物における１種または複数の組織に優先的に蓄積する。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、該哺乳動物に１、２、３、４、６、１２または２４時間にわたって存続する。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸの１０％未満は、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後の約１時間、２時間または３時間未満以内に、腎臓によって該哺乳動物から排除される。
一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２６または配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様において、本発明は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む組換えＨ−ＮＯＸタンパク質を提供する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、重合ドメインに共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインに連結されている。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインに連結されている。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、重合ドメインのＮ末端に連結されている。他の一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、重合ドメインのＣ末端に連結されている。一部の実施形態において、重合ドメインは、三量体形成ドメインである。さらなる実施形態において、三量体形成ドメインは、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである。なおさらなる実施形態において、三量体形成ドメインは、フォルドンドメインである。一部の実施形態において、フォルドンドメインは、配列番号４を含む。
上述の実施形態のうち一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。
上述の実施形態のうち一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質は、タグを含む。一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈｉｓ６タグを含む。
上述の態様の一部の実施形態において、アミノ酸リンカーは、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび／または重合ドメインおよび／またはタグの間に位置する。一部の実施形態において、アミノ酸リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列である。
上述の実施形態のうち一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応する。
上述の実施形態のうち一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、１個または複数の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、１４４位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、１４４位におけるアミノ酸置換は、Ｌ１４４Ｆ置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、少なくとも２個の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、少なくとも２個の遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９およびＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、９位および１４４位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、９位におけるアミノ酸置換は、Ｗ９Ｆ置換であり、１４４位におけるアミノ酸置換は、Ｌ１４４Ｆ置換である。
一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質は、そのＣ末端においてＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカーによってＴ４バクテリオファージフォルドンドメインのＮ末端に共有結合により連結された、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓの野生型Ｈ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、Ｈｉｓ６タグが、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸リンカーを介して、フォルドンドメインのＣ末端に連結される。
一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質は、そのＣ末端においてＧｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカーによってＴ４バクテリオファージフォルドンドメインのＮ末端に共有結合により連結された、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、Ｈｉｓ６タグが、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸リンカーを介して、フォルドンドメインのＣ末端に連結される。
上述の実施形態のうち一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、ヘモグロビンのＯ２解離定数の２桁以内であり、該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低い。一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１ｎＭ〜約１０００ｎＭの間である。他の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１μＭ〜約１０μＭの間である。さらに他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１０μＭ〜約５０μＭの間である。一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃において約７００ｓ−１未満である。一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い。さらなる実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１，０００倍低い。一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約０．６５ｓ−１以下である。一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約１．３５ｓ−１〜約２．９ｓ−１の間である。一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、３７℃において約１ｈ−１未満である。
上述の態様の一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２６または配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様において、本発明は、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、医薬組成物は、上述の実施形態のうちいずれか１種の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む。一部の実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。一部の実施形態において、医薬組成物は滅菌されている。一部の実施形態において、医薬組成物は、エンドトキシンを本質的に含まない。一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２６または配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の実施形態において、医薬組成物は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓの野生型Ｈ−ＮＯＸドメインを３個含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインのそれぞれは、そのＣ末端において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカーによって、Ｔ４バクテリオファージフォルドンドメインのＮ末端に共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈｉｓ６タグが、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸リンカーを介して、フォルドンドメインのＣ末端に連結されている。
一部の実施形態において、医薬組成物は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインを３個含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインのそれぞれは、そのＣ末端において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカーによって、Ｔ４バクテリオファージフォルドンドメインのＮ末端に共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈｉｓ６タグが、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸リンカーを介して、フォルドンドメインのＣ末端に連結されている。
一部の態様において、本発明は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む組換えＨ−ＮＯＸタンパク質を含む医薬組成物を提供する。一部の実施形態において、医薬組成物は、上述の実施形態のうちいずれか１種のＨ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む組換えＨ−ＮＯＸタンパク質を含む。一部の実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される賦形剤をさらに含む。一部の実施形態において、医薬組成物は滅菌されている。一部の実施形態において、医薬組成物は、エンドトキシンを本質的に含まない。一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２６または配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様において、本発明は、脳がんを有する個体における脳腫瘍へとＯ２を送達する方法であって、有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を該個体に投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与は、放射線療法または化学療法と組み合わせて使用される。
一部の態様において、本発明は、脳がんを有する個体における脳がんを処置する方法であって、有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を該個体に投与するステップと、有効量の放射線を該個体に投与するステップとを含む方法を提供する。
一部の態様において、本発明は、脳がんを有する個体における脳腫瘍成長を低下させる方法であって、有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を該個体に投与するステップと、有効量の放射線を該個体に投与するステップとを含む方法を提供する。
上述の態様の一部の実施形態において、放射線または化学療法は、Ｈ−ＮＯＸが投与されてから１、２、３、４、５または６時間後に上記個体に投与される。一部の実施形態において、放射線は、Ｘ線照射である。一部の実施形態において、Ｘ線照射は、約０．５グレイ〜約７５グレイで投与される。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与および／または放射線の投与は反復される。一部の実施形態において、投与は、２、３または４回反復される。一部の実施形態において、投与は、１週間、２週間、３週間または４週間後に反復される。
上述の態様の一部の実施形態において、脳がんは神経膠芽腫である。一部の実施形態において、個体は哺乳動物である。一部の実施形態において、哺乳動物はヒトである。他の実施形態において、哺乳動物は、ペット、実験研究用動物または家畜である。さらなる実施形態において、ペット、研究用動物または家畜は、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ブタまたはウシである。
上述の態様の一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質および放射線の投与は、別の療法と組み合わせて使用される。
上述の態様の一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ β１、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸ、Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸまたはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸである。一部の態様において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応するＨ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸは、１個または複数の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸは、１４４位にアミノ酸置換を含むＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸである。一部の実施形態において、１４４位におけるアミノ酸置換は、Ｌ１４４Ｆ置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸは、少なくとも２個の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、少なくとも２個の遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９およびＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸは、９位および１４４位にアミノ酸置換を含むＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸである。一部の実施形態において、９位におけるアミノ酸置換は、Ｗ９Ｆ置換であり、１４４位におけるアミノ酸置換は、Ｌ１４４Ｆ置換である。
上述の態様の一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。
上述の態様の一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、タグを含む。一部の態様において、タグは、Ｈｉｓ６タグである。
上述の態様の一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、ヘモグロビンのＯ２解離定数の２桁以内であり、該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低い。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１ｎＭ〜約１０００ｎＭの間である。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１μＭ〜約１０μＭの間である。さらに他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１０μＭ〜約５０μＭの間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃において約７００ｓ−１未満である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い。さらなる実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１，０００倍低い。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約０．６５ｓ−１以下である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約１．３５ｓ−１〜約２．９ｓ−１の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、３７℃において約１ｈ−１未満である。
一部の態様において、本発明は、酸素の送達を必要とする個体へと酸素を送達する方法であって、該個体に有効量の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む方法を提供する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与は、放射線療法または化学療法と組み合わせて使用される。
一部の態様において、本発明は、がんの処置を必要とする個体におけるがんを処置する方法であって、有効量の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を該個体に投与するステップと、有効量の放射線を該個体に投与するステップとを含む方法を提供する。
一部の態様において、本発明は、腫瘍成長の低下を必要とする個体における腫瘍成長を低下させる方法であって、有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を該個体に投与するステップと、有効量の放射線を該個体に投与するステップとを含む方法を提供する。
上述の態様の一部の実施形態において、放射線または化学療法は、Ｈ−ＮＯＸが投与されてから１、２、３、４、５または６時間後に上記個体に投与される。一部の実施形態において、放射線は、Ｘ線照射である。一部の実施形態において、Ｘ線照射は、約０．５グレイ〜約７５グレイで投与される。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与および／または放射線の投与は反復される。一部の実施形態において、投与は、２、３または４回反復される。一部の実施形態において、投与は、１週間、２週間、３週間または４週間後に反復される。
上述の実施形態の一部の実施形態において、がんは、脳がん、肺がん、結腸直腸がんまたは皮膚がんである。一部の実施形態において、個体は哺乳動物である。さらなる実施形態において、哺乳動物はヒトである。他のさらなる実施形態において、哺乳動物は、ペット、実験研究用動物または家畜である。なおさらなる実施形態において、ペット、研究用動物または家畜は、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ブタまたはウシである。
上述の態様の一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質および放射線の投与は、別の療法と組み合わせて使用される。
上述の態様の一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインは、同種Ｈ−ＮＯＸドメインである。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、異種Ｈ−ＮＯＸドメインである。
上述の態様の一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、二量体、三量体、四量体または五量体である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、共有結合により連結されている。
上述の態様の一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、単量体を含み、該単量体は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、重合ドメインに共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインに共有結合により連結されている。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインに共有結合により連結されている。一部の実施形態において、単量体は会合して、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成する。
上述の態様の一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、１個または複数の三量体形成ドメインを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個の単量体を含み、該単量体は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび三量体形成ドメインを含む。一部の実施形態において、三量体形成ドメインは、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである。一部の実施形態において、三量体形成ドメインは、フォルドンドメインである。一部の実施形態において、フォルドンドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、三量体形成ドメインに共有結合により連結されている。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、三量体形成ドメインのＮ末端に共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、三量体形成ドメインのＮ末端に共有結合により連結されている。
上述の態様の一部の実施形態において、タグは、三量体形成ドメインのＣ末端に共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈｉｓ６タグは、三量体形成ドメインのＣ末端に共有結合により連結されている。
上述の態様の一部の実施形態において、アミノ酸リンカーは、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび／または重合ドメインおよび／またはタグの間に位置する。一部の実施形態において、アミノ酸リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列である。
上述の態様の一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。
上述の態様の一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃ．ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応する。上述の態様の一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ β１、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸ、Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸまたはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応するＨ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸは、１個または複数の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸは、１４４位にアミノ酸置換を含むＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸである。一部の実施形態において、１４４位におけるアミノ酸置換は、Ｌ１４４Ｆ置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸは、少なくとも２個の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、少なくとも２個の遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９およびＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸは、９位および１４４位にアミノ酸置換を含むＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸである。一部の実施形態において、９位におけるアミノ酸置換は、Ｗ９Ｆ置換であり、１４４位におけるアミノ酸置換は、Ｌ１４４Ｆ置換である。
一部の実施形態において、本方法の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓの野生型Ｈ−ＮＯＸドメインを３個含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインのそれぞれは、そのＣ末端において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカーによって、Ｔ４バクテリオファージフォルドンドメインのＮ末端に共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈｉｓ６タグが、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸リンカーを介して、フォルドンドメインのＣ末端に連結されている。
一部の実施形態において、本方法の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインを３個含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインのそれぞれは、そのＣ末端において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカーによって、Ｔ４バクテリオファージフォルドンドメインのＮ末端に共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈｉｓ６タグが、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸リンカーを介して、フォルドンドメインのＣ末端に連結されている。
上述の態様の一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、ヘモグロビンのＯ２解離定数の２桁以内であり、該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低い。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１ｎＭ〜約１０００ｎＭの間である。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１μＭ〜約１０μＭの間である。さらに他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１０μＭ〜約５０μＭの間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃において約７００ｓ−１未満である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い。さらなる実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１，０００倍低い。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約０．６５ｓ−１以下である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約１．３５ｓ−１〜約２．９ｓ−１の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、３７℃において約１ｈ−１未満である。
上述の態様の一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、５０ｋＤａｌを超える、１００ｋＤａｌを超える、または１５０ｋＤａｌを超える。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、単一のＨ−ＮＯＸドメインを含む対応する単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較して、該哺乳動物における１種または複数の組織に優先的に蓄積する。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、哺乳動物へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、該哺乳動物に１、２、３、４、６、１２または２４時間にわたって存続する。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸの１０％未満は、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後の約１時間、２時間または３時間未満以内に、腎臓によって該哺乳動物から排除される。
一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２６または配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様において、本発明は、本明細書に記載されている実施形態のうちいずれかの重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする組換え核酸を提供する。一部の実施形態において、核酸はベクター内に存在する。本発明は、また、本明細書に記載されている重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質または単量体型Ｈ−ＮＯＸサブユニットをコードする核酸またはベクターを含む細胞を提供する。一部の実施形態において、核酸は、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号２５または配列番号２７に示される核酸配列を含む。
一部の態様において、本発明は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を産生する方法であって、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の産生に適した条件下で、重合体型Ｈ−ＮＯＳタンパク質または単量体型Ｈ−ＮＯＸサブユニットをコードする核酸を含む細胞を培養するステップを含む方法を提供する。さらなる実施形態において、本方法は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質を精製するステップを含む。
一部の態様において、本発明は、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むキットを提供する。一部の実施形態において、本キットは、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の使用のための指示をさらに含む。一部の実施形態において、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインは、同種Ｈ−ＮＯＸドメインである。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、異種Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、二量体、三量体、四量体または五量体である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、共有結合により連結されている。
本発明の一部の実施形態において、本キットの重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、単量体を含み、該単量体は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、重合ドメインに共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインに共有結合により連結されている。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインに共有結合により連結されている。一部の実施形態において、単量体は会合して、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成する。
本発明の一部の実施形態において、本キットの重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、１個または複数の三量体形成ドメインを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個の単量体を含み、該単量体は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび三量体形成ドメインを含む。一部の実施形態において、三量体形成ドメインは、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである。一部の実施形態において、三量体形成ドメインは、フォルドンドメインである。一部の実施形態において、フォルドンドメインは、配列番号４のアミノ酸配列を含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、三量体形成ドメインに共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、三量体形成ドメインのＮ末端に共有結合により連結されている。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、三量体形成ドメインのＮ末端に共有結合により連結されている。
上述の実施形態のうちいずれかの一部の実施形態において、本キットの重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。
上述の実施形態の一部の実施形態において、本キットの重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、少なくとも１個のタグを含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、少なくとも１個のＨｉｓ６タグを含む。
上述の実施形態のいずれかの一部の実施形態において、アミノ酸リンカーは、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび／または重合ドメインおよび／またはタグの間に位置する。一部の実施形態において、アミノ酸リンカーは、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列またはＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列である。
上述の実施形態のうちいずれかの一部の実施形態において、本キットのＨ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応する。
上述の実施形態のうちいずれかの一部の実施形態において、本キットのＨ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、１個または複数の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、１４４位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、１４４位におけるアミノ酸置換は、Ｌ１４４Ｆ置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも２個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも２個は、１４４位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、１４４位におけるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのうち少なくとも１個のアミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、少なくとも２個の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、少なくとも２個の遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９およびＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、９位および１４４位にアミノ酸置換を含む。一部の実施形態において、９位におけるアミノ酸置換は、Ｗ９Ｆ置換であり、１４４位におけるアミノ酸置換は、Ｌ１４４Ｆ置換である。
一部の実施形態において、本キットの重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓの野生型Ｈ−ＮＯＸドメインを３個含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインのそれぞれは、そのＣ末端において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカーによって、Ｔ４バクテリオファージフォルドンドメインのＮ末端に共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈｉｓ６タグが、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸リンカーを介して、フォルドンドメインのＣ末端に連結されている。
一部の実施形態において、本キットの重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインを３個含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインのそれぞれは、そのＣ末端において、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカーによって、Ｔ４バクテリオファージフォルドンドメインのＮ末端に共有結合により連結されている。一部の実施形態において、Ｈｉｓ６タグが、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸リンカーを介して、フォルドンドメインのＣ末端に連結されている。
上述の実施形態のうちいずれかの一部の実施形態において、本キットの重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、ヘモグロビンのＯ２解離定数の２桁以内であり、該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低い。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１ｎＭ〜約１０００ｎＭの間である。他の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１μＭ〜約１０μＭの間である。さらに他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃において約１０μＭ〜約５０μＭの間である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃において約７００ｓ−１未満である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い。さらなる実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１，０００倍低い。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約０．６５ｓ−１以下である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃において約１．３５ｓ−１〜約２．９ｓ−１の間である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、３７℃において約１ｈ−１未満である。
上述の実施形態のうち一部の実施形態において、本キットの重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、５０ｋＤａｌを超える、１００ｋＤａｌを超える、または１５０ｋＤａｌを超える。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、単一のＨ−ＮＯＸドメインを含む対応する単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較して、該哺乳動物における１種または複数の組織に優先的に蓄積する。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、該哺乳動物に１、２、３、４、６、１２または２４時間にわたって存続する。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸの１０％未満は、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後の約１時間、２時間または３時間未満以内に、腎臓によって該哺乳動物から排除される。
一部の実施形態において、本キットは、本明細書に記載されている重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のうちいずれかを含む。一部の実施形態において、本キットは、本明細書に記載されている単量体型Ｈ−ＮＯＸサブユニットのうちいずれかを含む。一部の実施形態において、本キットの重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２６または配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。
一部の態様において、本発明は、本明細書に記載されている重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む製造品を提供する。一部の実施形態において、製造品は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質およびバッグを含む。一部の実施形態において、バッグは、ＩＶバッグである。一部の実施形態において、本製造品のＨ−ＮＯＸタンパク質は、Ｏ２の送達を必要とする個体へとＯ２を送達するためのものである。一部の実施形態において、個体は、脳腫瘍を有する。一部の実施形態において、脳腫瘍は、神経膠芽腫である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、放射線療法と併せて使用される。
一部の態様において、本発明は、本明細書に記載されている重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単位用量を提供する。一部の実施形態において、単位用量のＨ−ＮＯＸタンパク質は、Ｏ２の送達を必要とする個体へとＯ２を送達するためのものである。一部の実施形態において、個体は、脳腫瘍を有する。一部の実施形態において、脳腫瘍は、神経膠芽腫である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、放射線療法と併せて使用される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目２）
前記２個以上のＨ−ＮＯＸドメインが、同種Ｈ−ＮＯＸドメインである、項目１に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目３）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、異種Ｈ−ＮＯＸドメインである、項目１に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目４）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、二量体、三量体、四量体または五量体である、項目１から３のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目５）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、共有結合により連結されている、項目４に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目６）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、単量体を含み、該単量体が、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む、項目４に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目７）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目６に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目８）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端が、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目７に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目９）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端が、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目７に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目１０）
単量体が会合して、前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成する、項目７に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目１１）
三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、項目１から１０のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目１２）
前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、１個または複数の三量体形成ドメインを含む、項目１１に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目１３）
前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、３個の単量体を含み、該単量体が、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび三量体形成ドメインを含む、項目１１または１２に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目１４）
前記三量体形成ドメインが、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである、項目１３に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目１５）
前記三量体形成ドメインが、フォルドンドメインである、項目１３または１４に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目１６）
前記フォルドンドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、項目１５に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目１７）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、前記三量体形成ドメインに共有結合により連結されている、項目１３から１６のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目１８）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端が、前記三量体形成ドメインのＮ末端に共有結合により連結されている、項目１７に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目１９）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端が、前記三量体形成ドメインのＮ末端に共有結合により連結されている、項目１７に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目２０）
グアニリルシクラーゼドメインを含まない、項目１から１９のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目２１）
少なくとも１個のタグを含む、項目１から２０のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目２２）
少なくとも１個のＨｉｓ ６ タグを含む、項目１から２１のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目２３）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインである、項目１から２２のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目２４）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応する、項目１から２３のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目２５）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、１個または複数の遠位ポケット変異を含む、項目１から２４のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目２６）
前記遠位ポケット変異が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目２５に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目２７）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、１４４位にアミノ酸置換を含む、項目２５に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目２８）
１４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目２７に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸドメイン。
（項目２９）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも２個が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも２個が、１４４位にアミノ酸置換を含む、項目２５に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目３０）
１４４位における前記Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのうち少なくとも１個の前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目２９に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目３１）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、少なくとも２個の遠位ポケット変異を含む、項目２５に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目３２）
前記少なくとも２個の遠位ポケット変異が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９およびＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目３１に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目３３）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、９位および１４４位にアミノ酸置換を含む、項目３１に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目３４）
９位における前記アミノ酸置換が、Ｗ９Ｆ置換であり、１４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目３３に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目３５）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、ヘモグロビンのＯ ２ 解離定数の２桁以内であり、該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低い、項目１から３４のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目３６）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約１ｎＭ〜約１０００ｎＭの間である、項目１から３４のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目３７）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約１μＭ〜約１０μＭの間である、項目１から３４のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目３８）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約１０μＭ〜約５０μＭの間である、項目１から３４のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目３９）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、２０℃において約７００ｓ −１ 未満である、項目１から３８のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目４０）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い、項目１から３９のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目４１）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１，０００倍低い、項目４０に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目４２）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約０．６５ｓ −１ 以下である、項目１から４１のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目４３）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約０．２１ｓ −１ 〜約０．６５ｓ −１ の間である、項目１から４２のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目４４）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約１．３５ｓ −１ 〜約２．９ｓ −１ の間である、項目１から４３のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目４５）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度が、３７℃において約１ｈ −１ 未満である、項目１から４４のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目４６）
５０ｋＤａｌを超える、１００ｋＤａｌを超える、または１５０ｋＤａｌを超える、項目１から４５のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目４７）
項目１から４６のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であって、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、単一のＨ−ＮＯＸドメインを含む対応する単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較して、該哺乳動物における１種または複数の組織に優先的に蓄積する、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目４８）
項目４７に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であって、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、該哺乳動物に１、２、３、４、６、１２または２４時間にわたって存続する、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目４９）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸの１０％未満が、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後の約１時間、２時間または３時間未満以内に、腎臓によって該哺乳動物から排除される、項目４７に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
（項目５０）
Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目５１）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目５０に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目５２）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端が、前記重合ドメインに連結されている、項目５０または５１に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目５３）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端が、前記重合ドメインに連結されている、項目５０または５１に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目５４）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、前記重合ドメインのＮ末端に連結されている、項目５０から５３のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目５５）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、前記重合ドメインのＣ末端に連結されている、項目５０から５３のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目５６）
前記重合ドメインが、三量体形成ドメインである、項目５０から５５のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目５７）
前記三量体形成ドメインが、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである、項目５６に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目５８）
前記三量体形成ドメインが、フォルドンドメインである、項目５６または５７に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目５９）
前記フォルドンドメインが、配列番号４を含む、項目５８に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目６０）
グアニリルシクラーゼドメインを含まない、項目５０から５９のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目６１）
タグを含む、項目５０から６０のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目６２）
Ｈｉｓ ６ タグを含む、項目５０から６１のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目６３）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインである、項目５０から６２のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目６４）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応する、項目５０から６３のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目６５）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、１個または複数の遠位ポケット変異を含む、項目５０から６４のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目６６）
前記遠位ポケット変異が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目６５に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目６７）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、１４４位にアミノ酸置換を含む、項目６５に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目６８）
１４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目６７に記載の組換えＨ−ＮＯＸドメイン。
（項目６９）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、少なくとも２個の遠位ポケット変異を含む、項目６５に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目７０）
前記少なくとも２個の遠位ポケット変異が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９およびＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目６９に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目７１）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、９位および１４４位にアミノ酸置換を含む、項目６９に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目７２）
９位における前記アミノ酸置換が、Ｗ９Ｆ置換であり、１４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目７１に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目７３）
前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、ヘモグロビンのＯ ２ 解離定数の２桁以内であり、該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低い、項目５０から７２のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目７４）
前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約１ｎＭ〜約１０００ｎＭの間である、項目５０から７２のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目７５）
前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約１μＭ〜約１０μＭの間である、項目５０から７２のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目７６）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約１０μＭ〜約５０μＭの間である、項目５０から７２のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目７７）
前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、２０℃において約７００ｓ −１ 未満である、項目５０から７６のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目７８）
前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い、項目５０から７７のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目７９）
前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１，０００倍低い、項目７８に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目８０）
前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約０．６５ｓ −１ 以下である、項目５０から７９のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目８１）
前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約０．２１ｓ −１ 〜約０．６５ｓ −１ の間である、項目５０から８０のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目８２）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約１．３５ｓ −１ 〜約２．９ｓ −１ の間である、項目５０から８１のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目８３）
前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度が、３７℃において約１ｈ −１ 未満である、項目５０から８２のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
（項目８４）
２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む医薬組成物。
（項目８５）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、項目１から４９のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、項目８４に記載の医薬組成物。
（項目８６）
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目８４または８５に記載の医薬組成物。
（項目８７）
滅菌されている、項目８４から８６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目８８）
エンドトキシンを本質的に含まない、項目８４から８７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目８９）
Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む組換えＨ−ＮＯＸタンパク質を含む医薬組成物。
（項目９０）
前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質が、項目５０から８３のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質である、項目８９に記載の医薬組成物。
（項目９１）
薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、項目８９または９０に記載の医薬組成物。
（項目９２）
滅菌されている、項目８９から９１のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目９３）
エンドトキシンを本質的に含まない、項目８９から９２のいずれか一項に記載の医薬組成物。
（項目９４）
脳がんを有する個体における脳腫瘍へとＯ ２ を送達する方法であって、有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を該個体に投与するステップを含む方法。
（項目９５）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の前記投与が、放射線療法または化学療法と組み合わせて使用される、項目９４に記載の方法。
（項目９６）
脳がんを有する個体における脳がんを処置する方法であって、
ａ）有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を該個体に投与するステップと、
ｂ）有効量の放射線を該個体に投与するステップと
を含む方法。
（項目９７）
脳がんを有する個体における脳腫瘍成長を低下させる方法であって、
ａ）有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を該個体に投与するステップと、
ｂ）有効量の放射線を該個体に投与するステップと
を含む方法。
（項目９８）
前記放射線または化学療法が、前記Ｈ−ＮＯＸが投与されてから１、２、３、４、５または６時間後に前記個体に投与される、項目９５から９７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９９）
前記放射線が、Ｘ線照射である、項目９４から９８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１００）
前記Ｘ線照射が、約０．５グレイ〜約７５グレイで投与される、項目９９に記載の方法。
（項目１０１）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の前記投与および／または前記放射線の前記投与が反復される、項目９５から１００のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０２）
前記投与が、２、３または４回反復される、項目１０１に記載の方法。
（項目１０３）
前記投与が、１週間、２週間、３週間または４週間後に反復される、項目１０１または１０２に記載の方法。
（項目１０４）
前記脳がんが神経膠芽腫である、項目９４から１０３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０５）
前記個体が哺乳動物である、項目９４から１０４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０６）
前記哺乳動物がヒトである、項目１０５に記載の方法。
（項目１０７）
前記哺乳動物が、ペット、実験研究用動物または家畜である、項目１０５に記載の方法。
（項目１０８）
前記ペット、研究用動物または家畜が、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ブタまたはウシである、項目１０７に記載の方法。
（項目１０９）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質および前記放射線の前記投与が、別の療法と組み合わせて使用される、項目９４から１０８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１０）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ β１、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１、Ｃ．ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ
β１、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸ、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸ、Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸまたはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸである、項目９４から１０９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１１）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応するＨ−ＮＯＸドメインを含む、項目９４から１１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１２）
前記Ｈ−ＮＯＸが、１個または複数の遠位ポケット変異を含む、項目９４から１１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１１３）
前記遠位ポケット変異が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目１１２に記載の方法。
（項目１１４）
前記Ｈ−ＮＯＸが、１４４位にアミノ酸置換を含むＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸである、項目１１３に記載の方法。
（項目１１５）
１４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目１１４に記載の方法。
（項目１１６）
前記Ｈ−ＮＯＸが、少なくとも２個の遠位ポケット変異を含む、項目１１２に記載の方法。
（項目１１７）
前記少なくとも２個の遠位ポケット変異が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９およびＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目１１６に記載の方法。
（項目１１８）
前記Ｈ−ＮＯＸが、９位および１４４位にアミノ酸置換を含むＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸである、項目１１６に記載の方法。
（項目１１９）
９位における前記アミノ酸置換が、Ｗ９Ｆ置換であり、１４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目１１８に記載の方法。
（項目１２０）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、グアニリルシクラーゼドメインを含まない、項目９５から１１９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２１）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、ヘモグロビンのＯ ２ 解離定数の２桁以内であり、該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低い、項目９５から１２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２２）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約１ｎＭ〜約１０００ｎＭの間である、項目９５から１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２３）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約１μＭ〜約１０μＭの間である、項目９５から１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２４）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約１０μＭ〜約５０μＭの間である、項目９５から１２１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２５）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、２０℃において約７００ｓ −１ 未満である、項目９５から１２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２６）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い、項目９５から１２５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２７）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１，０００倍低い、項目１２６に記載の方法。
（項目１２８）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約０．６５ｓ −１ 以下である、項目９５から１２７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２９）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約０．２１ｓ −１ 〜約０．６５ｓ −１ の間である、項目９５から１２８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３０）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約１．３５ｓ −１ 〜約２．９ｓ −１ の間である、項目９５から１２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３１）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度が、３７℃において約１ｈ −１ 未満である、項目９５から１３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３２）
酸素の送達を必要とする個体へと酸素を送達する方法であって、該個体に有効量の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を投与するステップを含む方法。
（項目１３３）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の前記投与が、放射線療法または化学療法と組み合わせて使用される、項目１３２に記載の方法。
（項目１３４）
がんの処置を必要とする個体におけるがんを処置する方法であって、
ａ）有効量の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を該個体に投与するステップと、
ｂ）有効量の放射線を該個体に投与するステップと
を含む方法。
（項目１３５）
腫瘍成長の低下を必要とする個体における腫瘍成長を低下させる方法であって、
ａ）有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を該個体に投与するステップと、
ｂ）有効量の放射線を該個体に投与するステップと
を含む方法。
（項目１３６）
前記放射線または化学療法が、前記Ｈ−ＮＯＸが投与されてから１、２、３、４、５または６時間後に前記個体に投与される、項目１３３から１３５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３７）
前記放射線が、Ｘ線照射である、項目１３３から１３６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３８）
前記Ｘ線照射が、約０．５グレイ〜約７５グレイで投与される、項目１３７に記載の方法。
（項目１３９）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の前記投与および／または前記放射線の前記投与が反復される、項目１３３から１３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４０）
前記投与が、２、３または４回反復される、項目１３９に記載の方法。
（項目１４１）
前記投与が、１週間、２週間、３週間または４週間後に反復される、項目１３９または１４０に記載の方法。
（項目１４２）
がんが脳がんである、項目１３４から１４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４３）
前記個体が哺乳動物である、項目１３２から１４２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４４）
前記哺乳動物がヒトである、項目１４３に記載の方法。
（項目１４５）
前記哺乳動物が、ペット、実験研究用動物または家畜である、項目１４３に記載の方法。
（項目１４６）
前記ペット、研究用動物または家畜が、イヌ、ネコ、ウマ、サル、ウサギ、ラット、マウス、モルモット、ハムスター、ブタまたはウシである、項目１４５に記載の方法。
（項目１４７）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質および前記放射線の前記投与が、別の療法と組み合わせて使用される、項目１３２から１４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４８）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを含む、項目１３２から１４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４９）
前記２個以上のＨ−ＮＯＸドメインが、同種Ｈ−ＮＯＸドメインである、項目１４８に記載の方法。
（項目１５０）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、異種Ｈ−ＮＯＸドメインである、項目１４８に記載の方法。
（項目１５１）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、二量体、三量体、四量体または五量体である、項目１３２から１５０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５２）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、共有結合により連結されている、項目１３２から１５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５３）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、単量体を含み、該単量体が、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む、項目１３２から１５１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５４）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目１５３に記載の方法。
（項目１５５）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端が、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目１５４に記載の方法。
（項目１５６）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端が、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目１５４に記載の方法。
（項目１５７）
単量体が会合して、前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成する、項目１５３から１５６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５８）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、項目１３２から１５７のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５９）
前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、１個または複数の三量体形成ドメインを含む、項目１５８に記載の方法。
（項目１６０）
前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、３個の単量体を含み、該単量体が、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび三量体形成ドメインを含む、項目１５９に記載の方法。
（項目１６１）
前記三量体形成ドメインが、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである、項目１６０に記載の方法。
（項目１６２）
前記三量体形成ドメインが、フォルドンドメインである、項目１６０または１６６に記載の方法。
（項目１６３）
前記フォルドンドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、項目１６２に記載の方法。
（項目１６４）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、前記三量体形成ドメインに共有結合により連結されている、項目１６０から１６３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１６５）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端が、前記三量体形成ドメインのＮ末端に共有結合により連結されている、項目１６４に記載の方法。
（項目１６６）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端が、前記三量体形成ドメインのＮ末端に共有結合により連結されている、項目１６４に記載の方法。
（項目１６７）
タグが、前記三量体形成ドメインのＣ末端に共有結合により連結されている、項目１６５に記載の方法。
（項目１６８）
Ｈｉｓ ６ タグが、前記三量体形成ドメインのＣ末端に共有結合により連結されている、項目１６７に記載の方法。
（項目１６９）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、グアニリルシクラーゼドメインを含まない、項目１３２から１６８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７０）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃ．ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１
Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインである、項目１３２から１６９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７１）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応する、項目１３２から１７０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７２）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、１個または複数の遠位ポケット変異を含む、項目１３２から１７１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７３）
前記遠位ポケット変異が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目１７２に記載の方法。
（項目１７４）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、１４４位にアミノ酸置換を含む、項目１７２に記載の方法。
（項目１７５）
１４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目１７４に記載の重合体型Ｈ−ＮОＸドメイン。
（項目１７６）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも２個が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも２個が、１４４位にアミノ酸置換を含む、項目１７２に記載の方法。
（項目１７７）
１４４位における前記Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのうち少なくとも１個の前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目１７６に記載の方法。
（項目１７８）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、少なくとも２個の遠位ポケット変異を含む、項目１７２に記載の方法。
（項目１７９）
前記少なくとも２個の遠位ポケット変異が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９およびＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目１７８に記載の方法。
（項目１８０）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、９位および１４４位にアミノ酸置換を含む、項目１７９に記載の方法。
（項目１８１）
９位における前記アミノ酸置換が、Ｗ９Ｆ置換であり、１４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目１８０に記載の方法。
（項目１８２）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、ヘモグロビンのＯ ２ 解離定数の２桁以内であり、該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低い、項目１３２から１８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８３）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約１ｎＭ〜約１００ｎＭの間である、項目１３２から１８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８４）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約１００ｎＭ〜約５００ｎＭの間である、項目１３２から１８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８５）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約５００ｎＭ〜約１０００ｎＭの間である、項目１３２から１８１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８６）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、２０℃において約７００ｓ −１ 未満である、項目１３２から１８５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８７）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い、項目１３２から１８６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８８）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１，０００倍低い、項目１８７に記載の方法。
（項目１８９）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約０．６５ｓ −１ 以下である、項目１３２から１８８のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９０）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約０．２１ｓ −１ 〜約０．６５ｓ −１ の間である、項目１３２から１８９のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９１）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約１．３５ｓ −１ 〜約２．９ｓ −１ の間である、項目１３２から１９０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９２）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度が、３７℃において約１ｈ −１ 未満である、項目１３２から１９１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９３）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、５０ｋＤａｌを超える、１００ｋＤａｌを超える、または１５０ｋＤａｌを超える、項目１３２から１９２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９４）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、単一のＨ−ＮＯＸドメインを含む対応する単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較して、該哺乳動物における１種または複数の組織に蓄積する、項目１３２から１９３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１９５）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、該哺乳動物に１、２、３、４、６、１２または２４時間にわたって存続する、項目１９４に記載の方法。
（項目１９６）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸの１０％未満が、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後の約１時間、２時間または３時間未満以内に、腎臓によって該哺乳動物から排除される、項目１９４に記載の方法。
（項目１９７）
項目１から５のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする組換え核酸。
（項目１９８）
項目１９７に記載の核酸を含むベクター。
（項目１９９）
項目１９７に記載の核酸または項目１９８に記載のベクターを含む細胞。
（項目２００）
重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を産生する方法であって、該重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の産生に適した条件下で、項目１９９に記載の細胞を培養するステップを含む方法。
（項目２０１）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質を精製するステップをさらに含む、項目２００に記載の方法。
（項目２０２）
項目５０から８３のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質をコードする組換え核酸。
（項目２０３）
項目２０２に記載の核酸を含むベクター。
（項目２０４）
項目２０２に記載の核酸または項目２０３に記載のベクターを含む細胞。
（項目２０５）
重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を産生する方法であって、項目２０４に記載の細胞を、該細胞の前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質が発現され、会合して重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成する条件下で、培養するステップを含む方法。
（項目２０６）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を精製するステップをさらに含む、項目２０５に記載の方法。
（項目２０７）
重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むキット。
（項目２０８）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の使用のための指示をさらに含む、項目２０７に記載のキット。
（項目２０９）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを含む、項目２０７または２０８に記載のキット。
（項目２１０）
前記２個以上のＨ−ＮＯＸドメインが、同種Ｈ−ＮＯＸドメインである、項目２０９に記載のキット。
（項目２１１）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、異種Ｈ−ＮＯＸドメインである、項目２０９に記載のキット。
（項目２１２）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、二量体、三量体、四量体または五量体である、項目２１７から２１１のいずれか一項に記載のキット。
（項目２１３）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、共有結合により連結されている、項目２０９から２１２のいずれか一項に記載のキット。
（項目２１４）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、単量体を含み、該単量体が、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む、項目２０７から２１２のいずれか一項に記載のキット。
（項目２１５）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目２１４に記載のキット。
（項目２１６）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端が、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目２１５に記載のキット。
（項目２１７）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端が、前記重合ドメインに共有結合により連結されている、項目２１５に記載のキット。
（項目２１８）
単量体が会合して、前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成する、項目２１４から２１７のいずれか一項に記載のキット。
（項目２１９）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である、項目２１４から２１８のいずれか一項に記載のキット。
（項目２２０）
前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、１個または複数の三量体形成ドメインを含む、項目２１９に記載のキット。
（項目２２１）
前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、３個の単量体を含み、該単量体が、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび三量体形成ドメインを含む、項目２１９または２２０に記載のキット。
（項目２２２）
前記三量体形成ドメインが、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである、項目２２１に記載のキット。
（項目２２３）
前記三量体形成ドメインが、フォルドンドメインである、項目２２０から２２２のいずれか一項に記載のキット。
（項目２２４）
前記フォルドンドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、項目２２３に記載のキット。
（項目２２５）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、前記三量体形成ドメインに共有結合により連結されている、項目２２０から２２４のいずれか一項に記載のキット。
（項目２２６）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端が、前記三量体形成ドメインのＮ末端に共有結合により連結されている、項目２２５に記載のキット。
（項目２２７）
タグが、前記三量体形成ドメインのＣ末端に共有結合により連結されている、項目２２６に記載のキット。
（項目２２８）
Ｈｉｓ ６ タグが、前記三量体形成ドメインのＣ末端に共有結合により連結されている、項目２２６に記載のキット。
（項目２２９）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端が、前記三量体形成ドメインのＮ末端に共有結合により連結されている、項目２２５に記載のキット。
（項目２３０）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、グアニリルシクラーゼドメインを含まない、項目２０７から２２９のいずれか一項に記載のキット。
（項目２３１）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃ．ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１
Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃ．ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓ．ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインである、項目２０７から２３０のいずれか一項に記載のキット。
（項目２３２）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対応する、項目２０７から２３１のいずれか一項に記載のキット。
（項目２３３）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、１個または複数の遠位ポケット変異を含む、項目２０７から２３２のいずれか一項に記載のキット。
（項目２３４）
前記遠位ポケット変異が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目２３３に記載のキット。
（項目２３５）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、１４４位にアミノ酸置換を含む、項目２３３に記載のキット。
（項目２３６）
１４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目２３５に記載の重合体型Ｈ−ＮОＸドメイン。
（項目２３７）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも２個が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも２個が、１４４位にアミノ酸置換を含む、項目２３３に記載のキット。
（項目２３８）
１４４位における前記Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのうち少なくとも１個の前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目２３７に記載のキット。
（項目２３９）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、少なくとも２個の遠位ポケット変異を含む、項目２３３に記載のキット。
（項目２４０）
前記少なくとも２個の遠位ポケット変異が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９およびＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である、項目２３３に記載のキット。
（項目２４１）
前記Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個が、９位および１４４位にアミノ酸置換を含む、項目２４０に記載のキット。
（項目２４２）
９位における前記アミノ酸置換が、Ｗ９Ｆ置換であり、１４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、項目２４１に記載のキット。
（項目２４３）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、ヘモグロビンのＯ ２ 解離定数の２桁以内であり、該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低い、項目２０７から２４２のいずれか一項に記載のキット。
（項目２４４）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約１ｎＭ〜約１０００ｎＭの間である、項目２０７から２４３のいずれか一項に記載のキット。
（項目２４５）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約１μＭ〜約１０μＭの間である、項目２０７から２４３のいずれか一項に記載のキット。
（項目２４６）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において約１０μＭ〜約５０μＭの間である、項目２０７から２４３のいずれか一項に記載のキット。
（項目２４７）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、２０℃において約７００ｓ −１ 未満である、項目２０７から２４６のいずれか一項に記載のキット。
（項目２４８）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い、項目２０７から２４７のいずれか一項に記載のキット。
（項目２４９）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１，０００倍低い、項目２４８に記載のキット。
（項目２５０）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約０．６５ｓ −１ 以下である、項目２０７から２４９のいずれか一項に記載のキット。
（項目２５１）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約０．２１ｓ −１ 〜約０．６５ｓ −１ の間である、項目２０７から２５０のいずれか一項に記載のキット。
（項目２５２）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋ ｏｆｆ が、２０℃において約１．３５ｓ −１ 〜約２．９ｓ −１ の間である、項目２０７から２５１のいずれか一項に記載のキット。
（項目２５３）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度が、３７℃において約１ｈ −１ 未満である、項目２０７から２５２のいずれか一項に記載のキット。
（項目２５４）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、５０ｋＤａｌを超える、１００ｋＤａｌを超える、または１５０ｋＤａｌを超える、項目２０７から２５３のいずれか一項に記載のキット。
（項目２５５）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、単一のＨ−ＮＯＸドメインを含む対応する単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較して、該哺乳動物における１種または複数の組織に蓄積する、項目２０７から２５４のいずれか一項に記載のキット。
（項目２５６）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、該哺乳動物に１、２、３、４、６、１２または２４時間にわたって存続する、項目２５５に記載のキット。
（項目２５７）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸの１０％未満が、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後の約１時間、２時間または３時間未満以内に、腎臓によって該哺乳動物から排除される、項目２５５に記載のキット。
（項目２５８）
項目１から４９のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むキット。
（項目２５９）
項目５０から８３のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質を含むキット。
（項目２６０）
使用のための指示を含む、項目２５８または２５９に記載のキット。
（項目２６１）
項目１から４９のいずれか一項に記載の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む製造品。
（項目２６２）
Ｈ−ＮＯＸタンパク質およびバッグを含む、項目２６１に記載の製造品。
（項目２６３）
前記バッグがＩＶバッグである、項目２６２に記載の製造品。
（項目２６４）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｏ ２ の送達を必要とする個体へとＯ ２ を送達するためのものである、項目２６２または２６３に記載の製造品。
（項目２６５）
前記個体が脳腫瘍を有する、項目２６４に記載の製造品。
（項目２６６）
前記脳腫瘍が神経膠芽腫である、項目２６５に記載の製造品。
（項目２６７）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、放射線療法と併せて使用される、項目２６５に記載の製造品。
（項目２６８）
重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単位用量。
（項目２６９）
前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｏ ２ の送達を必要とする個体へとＯ ２ を送達するためのものである、項目２６８に記載の単位用量。
（項目２７０）
前記個体が脳腫瘍を有する、項目２６９に記載の単位用量。
（項目２７１）
前記脳腫瘍が神経膠芽腫である、項目２６９に記載の単位用量。
（項目２７２）
前記重合体型Ｈ−ＮＯＸが、放射線療法と併せて使用される、項目２７１に記載の単位用量。
図１は、バクテリオファージＴ４フィブリチン（ｆｉｂｒｉｔｉｎ）のフォルドンドメインの核酸（配列番号３）およびアミノ酸配列（配列番号４）を示す。
図２Ａは、Ｈｉｓ６タグを含む、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ配列のＣ末端に融合されたバクテリオファージＴ４フィブリチンのフォルドンドメインの核酸（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図２Ｂは、Ｈｉｓ６タグなしの、Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン単量体の核酸（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
図２Ａは、Ｈｉｓ６タグを含む、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ配列のＣ末端に融合されたバクテリオファージＴ４フィブリチンのフォルドンドメインの核酸（配列番号５）およびアミノ酸配列（配列番号６）を示す。図２Ｂは、Ｈｉｓ６タグなしの、Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン単量体の核酸（配列番号７）およびアミノ酸配列（配列番号８）を示す。
図３Ａは、野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−Ｈｉｓ６キメラタンパク質のＤＮＡ配列（上；配列番号９）と、融合されたフォルドンおよびＨｉｓ６配列を有するＨ−ＮＯＸのＬ１４４Ｆバリアントをコードするクローン３Ｉ−Ａの配列決定データ（下；配列番号５）とのアライメントを示す。Ｌ１４４Ｆ置換ならびに融合に使用したＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を強調表示する。図３Ｂは、野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−Ｈｉｓ６単量体のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。図３Ｃは、Ｈｉｓ６タグなしの野生型Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−単量体の核酸（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。図３Ｄは、Ｃ末端においてバクテリオファージＴ４フォルドンドメインに融合された、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸ（１〜３８５）の核酸（配列番号２５）およびアミノ酸（配列番号２６）を示す。図３Ｅは、Ｃ末端においてバクテリオファージＴ４フォルドンドメインに融合された、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸ（１〜１９４）の核酸（配列番号２７）およびアミノ酸（配列番号２８）を示す。
図３Ａは、野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−Ｈｉｓ６キメラタンパク質のＤＮＡ配列（上；配列番号９）と、融合されたフォルドンおよびＨｉｓ６配列を有するＨ−ＮＯＸのＬ１４４Ｆバリアントをコードするクローン３Ｉ−Ａの配列決定データ（下；配列番号５）とのアライメントを示す。Ｌ１４４Ｆ置換ならびに融合に使用したＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を強調表示する。図３Ｂは、野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−Ｈｉｓ６単量体のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。図３Ｃは、Ｈｉｓ６タグなしの野生型Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−単量体の核酸（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。図３Ｄは、Ｃ末端においてバクテリオファージＴ４フォルドンドメインに融合された、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸ（１〜３８５）の核酸（配列番号２５）およびアミノ酸（配列番号２６）を示す。図３Ｅは、Ｃ末端においてバクテリオファージＴ４フォルドンドメインに融合された、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸ（１〜１９４）の核酸（配列番号２７）およびアミノ酸（配列番号２８）を示す。
図３Ａは、野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−Ｈｉｓ６キメラタンパク質のＤＮＡ配列（上；配列番号９）と、融合されたフォルドンおよびＨｉｓ６配列を有するＨ−ＮＯＸのＬ１４４Ｆバリアントをコードするクローン３Ｉ−Ａの配列決定データ（下；配列番号５）とのアライメントを示す。Ｌ１４４Ｆ置換ならびに融合に使用したＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を強調表示する。図３Ｂは、野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−Ｈｉｓ６単量体のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。図３Ｃは、Ｈｉｓ６タグなしの野生型Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−単量体の核酸（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。図３Ｄは、Ｃ末端においてバクテリオファージＴ４フォルドンドメインに融合された、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸ（１〜３８５）の核酸（配列番号２５）およびアミノ酸（配列番号２６）を示す。図３Ｅは、Ｃ末端においてバクテリオファージＴ４フォルドンドメインに融合された、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸ（１〜１９４）の核酸（配列番号２７）およびアミノ酸（配列番号２８）を示す。
図３Ａは、野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−Ｈｉｓ６キメラタンパク質のＤＮＡ配列（上；配列番号９）と、融合されたフォルドンおよびＨｉｓ６配列を有するＨ−ＮＯＸのＬ１４４Ｆバリアントをコードするクローン３Ｉ−Ａの配列決定データ（下；配列番号５）とのアライメントを示す。Ｌ１４４Ｆ置換ならびに融合に使用したＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を強調表示する。図３Ｂは、野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−Ｈｉｓ６単量体のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。図３Ｃは、Ｈｉｓ６タグなしの野生型Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−単量体の核酸（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。図３Ｄは、Ｃ末端においてバクテリオファージＴ４フォルドンドメインに融合された、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸ（１〜３８５）の核酸（配列番号２５）およびアミノ酸（配列番号２６）を示す。図３Ｅは、Ｃ末端においてバクテリオファージＴ４フォルドンドメインに融合された、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸ（１〜１９４）の核酸（配列番号２７）およびアミノ酸（配列番号２８）を示す。
図３Ａは、野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−Ｈｉｓ６キメラタンパク質のＤＮＡ配列（上；配列番号９）と、融合されたフォルドンおよびＨｉｓ６配列を有するＨ−ＮＯＸのＬ１４４Ｆバリアントをコードするクローン３Ｉ−Ａの配列決定データ（下；配列番号５）とのアライメントを示す。Ｌ１４４Ｆ置換ならびに融合に使用したＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を強調表示する。図３Ｂは、野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−Ｈｉｓ６単量体のアミノ酸配列（配列番号１０）を示す。図３Ｃは、Ｈｉｓ６タグなしの野生型Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−単量体の核酸（配列番号１１）およびアミノ酸配列（配列番号１２）を示す。図３Ｄは、Ｃ末端においてバクテリオファージＴ４フォルドンドメインに融合された、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸ（１〜３８５）の核酸（配列番号２５）およびアミノ酸（配列番号２６）を示す。図３Ｅは、Ｃ末端においてバクテリオファージＴ４フォルドンドメインに融合された、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸ（１〜１９４）の核酸（配列番号２７）およびアミノ酸（配列番号２８）を示す。
図４は、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合タンパク質の初期精製におけるステップのＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。ラダーは、３．５ｋＤａバンドがゲル下端から流れ出たＮｏｖｅｘ Ｓｈａｒｐタンパク質標準（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）である。Ｓｔｄレーンは、公知の量のＨｉｓ６タグ付けされた単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質（２３ｋＤａ）である。Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合体の誘導は、レーン４および５を比較することにより確かめることができる（融合単量体は、２６．７ｋＤａの分子量を有する）。レーン１１、１３、１４および１５に認められる二重バンドは、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ試料バッファーにおける、この含量のタンパク質には不十分なＤＴＴに起因する。レーン１：ラダー；レーン２：０．５μｇ標準；レーン３：１．０μｇ標準；レーン４：誘導前；レーン５：収集上清；レーン６：収集ペレット：レーン７：溶解後：レーン８；遠心分離後：レーン９：遠心分離後ペレット；レーン１０：ＮｉＮＴＡ素通り画分；レーン１１：ＮｉＮＴＡプール；レーン１２：ＮｉＮＴＡ不良（ｎｏ−ｇｏｏｄ）プール；レーン１３：ＤＥＡＥ前試料；レーン１４；ＤＥＡＥ後プール；レーン１５：最終産物。
図５は、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合タンパク質の発現および精製におけるステップのＳＤＳ ＰＡＧＥゲルを示す。Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合タンパク質は、精製後に＞９５％純粋である。ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおける相対移動度は、２６．７ｋＤａ単量体と一致している。レーン１：Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｐｌｕｓタンパク質２色マーカー；レーン２：誘導前；レーン３：誘導；レーン４：溶解後；レーン５：加熱後；レーン６：スピン後；レーン７：Ｎｉカラム素通り画分；レーン８：Ｎｉカラム洗浄液；レーン９：Ｎｉカラム後；レーン１０：ＤＥＡＥカラム前；レーン１１：ＤＥＡＥカラム後。
図６は、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合タンパク質の解析から得たデコンボリューションしたＬＣ−ＭＳデータを示すグラフである。最終質量は、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン単量体単位の予測分子質量２６，６７７ＡＭＵと一致している。
図７は、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドンタンパク質の分析的サイズ排除クロマトグラフィーのクロマトグラムを示す。クロマトグラムは、３波長（２５４、２８０および４１８ｎｍ）を追跡して、タンパク質およびヘム構成物の両方をモニターする。Ｈ−ＮＯＸ−フォルドンタンパク質は、１４．２４ｍＬ保持容量で溶出し、推定分子サイズは７５．６ｋＤａである（Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン三量体に予測される８０．０ｋＤａと同様）。
図８は、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドンタンパク質の分光学的解析を示す。フォルドンドメインの融合は、Ｈ−ＮＯＸドメインの三次構造、適切な配位でのポルフィリンＩＸの結合またはポルフィリンへの酸素の結合に干渉しない。ソーレー（Ｓｏｒｅｔ）ピーク（４１５ｎｍ）およびα／βピーク（５５０〜６００ｎｍ）を含む特徴的なスペクトルピークは全て、Ｈ−ＮＯＸ単量体およびＨ−ＮＯＸ−フォルドン融合タンパク質の間で保存されている。
図９は、三量体形成したフォルドンドメインを中心に有する、三量体形成したＨ−ＮＯＸタンパク質のモデルである。ポルフィリンＩＸ補助因子および結合した酸素を球で示す。
図１０は、２匹の異なるラットにおける、静脈内ボーラス（１００ｍｇ／ｋｇ）後のＨ−ＮＯＸ三量体の血漿プロファイルを示す。
図１１は、ラットにおいて、Ｈ−ＮＯＸ三量体（５０ｍｇ／ｋｇ）投薬に応答してＩｇＧおよびＩｇＭ抗体が産生されることを示す。１、３、５および２２日目に５０ｍｇ／ｋｇ Ｈ−ＮＯＸ三量体を静脈内投薬したラットの血漿（１：１０，０００希釈）における、ＩｇＧまたはＩｇＭ抗体（個々のラットの曲線を示す）。血漿試料のＥＬＩＳＡアッセイを３連で行った。平均、＋／−ＳＥＭ。
図１２は、Ｈ−ＮＯＸ単量体およびＨ−ＮＯＸ三量体が、ＨＣＴ−１１６結腸由来腫瘍を有するマウスにおいて分布および保持されることを示す。Ａ）Ｈ−ＮＯＸタンパク質抗体による腫瘍の免疫組織化学染色は、６０分で部分的に排除されたＨ−ＮＯＸ単量体と比較して、腫瘍における６０分間のＨ−ＮＯＸ三量体の残留性を示した。Ｂ）ＨＣＴ−１１６腫瘍切片におけるＨ−ＮＯＸタンパク質染色強度の定量化。Ｎ＝６、全群。平均値＋／−ＳＥＭ。Ｃ）ＲＩＦ１同系肉腫腫瘍におけるＨ−ＮＯＸの体内分布。
図１２は、Ｈ−ＮＯＸ単量体およびＨ−ＮＯＸ三量体が、ＨＣＴ−１１６結腸由来腫瘍を有するマウスにおいて分布および保持されることを示す。Ａ）Ｈ−ＮＯＸタンパク質抗体による腫瘍の免疫組織化学染色は、６０分で部分的に排除されたＨ−ＮＯＸ単量体と比較して、腫瘍における６０分間のＨ−ＮＯＸ三量体の残留性を示した。Ｂ）ＨＣＴ−１１６腫瘍切片におけるＨ−ＮＯＸタンパク質染色強度の定量化。Ｎ＝６、全群。平均値＋／−ＳＥＭ。Ｃ）ＲＩＦ１同系肉腫腫瘍におけるＨ−ＮＯＸの体内分布。
図１３は、Ｈ−ＮＯＸ単量体およびＨ−ＮＯＸ三量体が、ＨＣＴ−１１６結腸由来腫瘍を有するマウスにおける腫瘍低酸素を低下させたことを示す。Ａ）媒体、Ｈ−ＮＯＸ単量体またはＨ−ＮＯＸ三量体で処置したマウスから単離された１２５ｍｍ３腫瘍の代表的腫瘍切片。Ｂ）腫瘍切片における抗ピモニダゾール抗体（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１）強度の定量化。Ｎ＝６、全群。平均値＋／−ＳＥＭ。＊は、腫瘍全体にわたる低酸素を示し、＊＊は、腫瘍における低酸素なしを示す。
図１４は、ＨＣＴ−１１６結腸由来腫瘍を有するマウスにおけるＨ−ＮＯＸ単量体による腫瘍浸透および酸素化を示す。Ａ）抗Ｈ−ＮＯＸタンパク質抗体で染色した腫瘍切片。Ｂ）Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１で染色した腫瘍切片。Ｃ）１群当たり６匹のマウスの腫瘍における血管系からの距離の関数としての、Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１の定量化。＊は、腫瘍全体にわたる低酸素を示し、￥は、腫瘍における低酸素なしを示す。
図１５は、ＲＩＦ−１同系肉腫腫瘍を有するマウスにおいてＨ−ＮＯＸ三量体が分布および保持されたことを示す。Ａ）７５０ｍｇ／ｋｇ Ｈ−ＮＯＸ三量体またはＣ）バッファーの投与１２０分後のマウスから単離された４００ｍｍ３腫瘍と、Ｂ）７５０ｍｇ／ｋｇ Ｈ−ＮＯＸ三量体またはＤ）バッファーの投与１２０分後のマウスから単離された８００ｍｍ３腫瘍の代表的な切片の免疫蛍光画像。Ｈ−ＮＯＸタンパク質染色は、抗Ｈ−ＮＯＸ抗体を用いて行った。パネルＥおよびＦは、ＲＩＦ−１同系肉腫腫瘍を有するマウスにおけるＨ−ＮＯＸ三量体による腫瘍酸素化を示す。Ｅ）Ｈ−ＮＯＸまたはバッファー対照投与の２時間後の抗ピモニダゾール抗体で染色した腫瘍切片。腫瘍全体写真を示す。Ｆ）Ｈ−ＮＯＸまたはバッファー対照投与の２時間後の、抗ピモニダゾール抗体（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１）および抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した腫瘍切片。高拡大率写真を示す。Ｇ）ＲＩＦ１同系肉腫腫瘍におけるＨ−ＮＯＸの体内分布。静脈内注射２時間後に、Ｈ−ＮＯＸ三量体は、血管系から腫瘍組織へと拡散する。Ｈ−ＮＯＸ抗体およびＣＤ３１抗体（血管系マーカー、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）による腫瘍切片の免疫組織化学染色。バッファーを注射したマウスにおいて、蛍光染色は検出されない。
図１５は、ＲＩＦ−１同系肉腫腫瘍を有するマウスにおいてＨ−ＮＯＸ三量体が分布および保持されたことを示す。Ａ）７５０ｍｇ／ｋｇ Ｈ−ＮＯＸ三量体またはＣ）バッファーの投与１２０分後のマウスから単離された４００ｍｍ３腫瘍と、Ｂ）７５０ｍｇ／ｋｇ Ｈ−ＮＯＸ三量体またはＤ）バッファーの投与１２０分後のマウスから単離された８００ｍｍ３腫瘍の代表的な切片の免疫蛍光画像。Ｈ−ＮＯＸタンパク質染色は、抗Ｈ−ＮＯＸ抗体を用いて行った。パネルＥおよびＦは、ＲＩＦ−１同系肉腫腫瘍を有するマウスにおけるＨ−ＮＯＸ三量体による腫瘍酸素化を示す。Ｅ）Ｈ−ＮＯＸまたはバッファー対照投与の２時間後の抗ピモニダゾール抗体で染色した腫瘍切片。腫瘍全体写真を示す。Ｆ）Ｈ−ＮＯＸまたはバッファー対照投与の２時間後の、抗ピモニダゾール抗体（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１）および抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した腫瘍切片。高拡大率写真を示す。Ｇ）ＲＩＦ１同系肉腫腫瘍におけるＨ−ＮＯＸの体内分布。静脈内注射２時間後に、Ｈ−ＮＯＸ三量体は、血管系から腫瘍組織へと拡散する。Ｈ−ＮＯＸ抗体およびＣＤ３１抗体（血管系マーカー、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）による腫瘍切片の免疫組織化学染色。バッファーを注射したマウスにおいて、蛍光染色は検出されない。
図１５は、ＲＩＦ−１同系肉腫腫瘍を有するマウスにおいてＨ−ＮＯＸ三量体が分布および保持されたことを示す。Ａ）７５０ｍｇ／ｋｇ Ｈ−ＮＯＸ三量体またはＣ）バッファーの投与１２０分後のマウスから単離された４００ｍｍ３腫瘍と、Ｂ）７５０ｍｇ／ｋｇ Ｈ−ＮＯＸ三量体またはＤ）バッファーの投与１２０分後のマウスから単離された８００ｍｍ３腫瘍の代表的な切片の免疫蛍光画像。Ｈ−ＮＯＸタンパク質染色は、抗Ｈ−ＮＯＸ抗体を用いて行った。パネルＥおよびＦは、ＲＩＦ−１同系肉腫腫瘍を有するマウスにおけるＨ−ＮＯＸ三量体による腫瘍酸素化を示す。Ｅ）Ｈ−ＮＯＸまたはバッファー対照投与の２時間後の抗ピモニダゾール抗体で染色した腫瘍切片。腫瘍全体写真を示す。Ｆ）Ｈ−ＮＯＸまたはバッファー対照投与の２時間後の、抗ピモニダゾール抗体（Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１）および抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）で染色した腫瘍切片。高拡大率写真を示す。Ｇ）ＲＩＦ１同系肉腫腫瘍におけるＨ−ＮＯＸの体内分布。静脈内注射２時間後に、Ｈ−ＮＯＸ三量体は、血管系から腫瘍組織へと拡散する。Ｈ−ＮＯＸ抗体およびＣＤ３１抗体（血管系マーカー、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）による腫瘍切片の免疫組織化学染色。バッファーを注射したマウスにおいて、蛍光染色は検出されない。
図１６は、Ｈ−ＮＯＸ三量体が、肉腫由来の腫瘍を有するマウスにおいて腫瘍に浸透し、腫瘍低酸素を低下させたことを示す。Ａ）ウエスタンブロットメンブランは、Ｈ−ＮＯＸ三量体の検出のために抗Ｈ−ＮＯＸ抗体で、低酸素関連タンパク質の検出のためにＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１で、あるいは総タンパク質レベルの評価のために抗アクチン抗体で試験した。Ｂ）腫瘍切片におけるピモニダゾール染色強度の定量化。Ｃ）腫瘍切片における抗ＨＩＦ−１α染色強度の定量化。
図１７は、Ｕ２５１同所性脳腫瘍を有するマウスにおけるＨ−ＮＯＸ三量体による腫瘍浸透および脳腫瘍低酸素の低下を示す免疫組織化学画像のパネルである。Ａ）Ｈ−ＮＯＸ三量体または食塩水（対照）投与２時間後のＵ２５１腫瘍における抗Ｈ−ＮＯＸ抗体によるＨ−ＮＯＸ三量体染色。Ｂ）Ｈ−ＮＯＸ三量体または食塩水（対照）投与２時間後のＵ２５１腫瘍におけるＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１染色。腫瘍の一部の拡大画像を示す。
図１８は、Ｕ２５１同所性脳腫瘍を有するマウスにおけるＨ−ＮＯＸ三量体による腫瘍浸透および脳腫瘍低酸素の低下を示す。Ａ）Ｈ−ＮＯＸ三量体（右パネル）または食塩水（バッファー、左パネル）投与２時間後のＵ２５１腫瘍におけるＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１染色の免疫蛍光画像。Ｂ）免疫蛍光画像のＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１染色の定量化（Ｈ−ＮＯＸ三量体−右パネル、または食塩水−左パネル）。Ｃ）Ｈ−ＮＯＸ三量体または食塩水（バッファー）投与２時間後のＵ２５１腫瘍におけるＨＩＦ−１α染色の免疫蛍光画像。Ｄ）免疫蛍光画像のＨＩＦ−１α染色の定量化。
図１９は、Ｕ２５１同所性脳腫瘍および健常脳におけるＨ−ＮＯＸ三量体の体内分布を示す。Ａ）Ｈ−ＮＯＸ三量体投与２時間後のＵ２５１腫瘍における抗Ｈ−ＮＯＸ抗体によるＨ−ＮＯＸ三量体染色。Ｂ）脳における腫瘍局在化を示す、Ｕ２５１腫瘍における核ＤＡＰＩ染色。Ｃ）およびＤ）Ａ）の腫瘍の一部の拡大画像は、腫瘍内部のＨ−ＮＯＸの拡散したパターンと、腫瘍外部の血管に制限されたパターンを示す。Ｅ）健常マウス脳における、抗Ｈ−ＮＯＸ抗体によるＨ−ＮＯＸ三量体染色および抗ＣＤ３１抗体（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）による血管系染色。
図２０は、マウスＵ２５１同所性神経膠芽腫腫瘍におけるＨ−ＮＯＸ単量体またはＨ−ＮＯＸ三量体のリアルタイム蛍光画像を示す。Ａ）Ｈ−ＮＯＸ単量体は、２時間までに排除された。Ｂ）Ｈ−ＮＯＸ三量体は、腫瘍に残り、１〜４時間でピークとなった。ＩＶＩＳにより画像を取得した；矢印は、固有の閾値を超える蛍光の区域を示す；星印は、蛍光強度のピークレベルを示す。
図２１は、マウスＢＴ−１２同所性神経膠芽腫腫瘍におけるＨ−ＮＯＸ単量体またはＨ−ＮＯＸ三量体のｅｘ ｖｉｖｏ蛍光画像を示す。Ａ）７５０ｍｇ／ｋｇ Ｈ−ＮＯＸ単量体投与の３０分後に、Ｂ）７５０ｍｇ／ｋｇ Ｈ−ＮＯＸ単量体投与の６０分後に、Ｃ）７５０ｍｇ／ｋｇ Ｈ−ＮＯＸ三量体投与の６０分後に、あるいはＤ）媒体投与の６０分後に、ＢＴ−１２腫瘍を有する脳を切除した。
図２２は、マウスＵ２５１同所性神経膠芽腫腫瘍におけるＨ−ＮＯＸ単量体のリアルタイム蛍光画像を示す。Ｈ−ＮＯＸ単量体投与のＡ）３０分後、Ｂ）６０分後、Ｃ）１２０分後およびＤ）２４０分後に、イメージングを取得した。
図２３は、マウスＵ２５１同所性神経膠芽腫腫瘍におけるＨ−ＮＯＸ三量体のリアルタイム蛍光画像を示す。Ｈ−ＮＯＸ三量体投与のＡ）３０分後、Ｂ）６０分後、Ｃ）１２０分後およびＤ）２４０分後に、イメージングを取得した。矢印は、蛍光の区域を示す；星印は、蛍光強度のピークレベルを示す。
図２４は、マウスＵ２５１同所性神経膠芽腫腫瘍におけるＨ−ＮＯＸ単量体のリアルタイム蛍光画像を示す。Ｈ−ＮＯＸ単量体投与のＡ）３０分後およびＢ）６０分後の腎臓におけるＨ−ＮＯＸ単量体の蓄積。
図２５は、マウスＧＢＭ−４３同所性神経膠芽腫頭蓋内および脊髄性腫瘍におけるＨ−ＮＯＸ三量体のリアルタイム蛍光画像を示す。Ａ）Ｈ−ＮＯＸ三量体投与前、ならびにＨ−ＮＯＸ三量体投与のＢ）０．５時間、Ｃ）１時間、Ｄ）２時間、Ｅ）４時間およびＦ）６時間後の、脊柱におけるＨ−ＮＯＸ三量体の分布。
図２６は、マウスＵ２５１同所性神経膠芽腫頭蓋内腫瘍におけるＨ−ＮＯＸ三量体のリアルタイム蛍光画像を示す。上パネルは、Ｈ−ＮＯＸ三量体投与前（０分）、ならびにＨ−ＮＯＸ三量体投与の３０分後、１時間後、２時間後、４時間後、６時間後および７２時間後の、脳におけるＨ−ＮＯＸ三量体の分布を示す。下パネルは、Ｈ−ＮＯＸ単量体の分布を示す。
図２７は、マウスＵ２５１同所性神経膠芽腫頭蓋内および脊髄性腫瘍におけるＨ−ＮＯＸ三量体のリアルタイム生物発光画像を示す。Ａ）Ｈ−ＮＯＸ三量体投与前、ならびに２９５ｍｇ／ｋｇの用量のＨ−ＮＯＸ三量体投与のＢ）３０分後、Ｃ）１時間後、Ｄ）２時間後、Ｅ）４時間後およびＦ）６時間後のＨ−ＮＯＸ三量体分布。
図２８は、マウスＵ２５１同所性神経膠芽腫腫瘍におけるＨ−ＮＯＸ三量体のリアルタイム蛍光画像を示す。Ａ）Ｈ−ＮＯＸ三量体投与前、ならびに３０ｍｇ／ｋｇの用量のＨ−ＮＯＸ三量体投与のＢ）３０分後、Ｃ）１時間後、Ｄ）２時間後、Ｅ）４時間後およびＦ）６時間後のＨ−ＮＯＸ三量体分布。
図２９は、小型の頭蓋内腫瘍を含有するＵ２５１同所性神経膠芽腫マウスモデルにおけるＨ−ＮＯＸ三量体Ｌ１４４Ｆバリアント分布のリアルタイム蛍光画像を示す。Ａ）Ｈ−ＮＯＸ三量体投与前、ならびに３０ｍｇ／ｋｇの用量のＨ−ＮＯＸ三量体Ｌ１４４Ｆバリアント投与のＢ）３０分後、Ｃ）１時間後、Ｄ）２時間後、Ｅ）４時間後およびＦ）６時間後のＨ−ＮＯＸ三量体Ｌ１４４Ｆバリアント分布。生物発光（ＢＬＩ）スコアによって決定される通り、小型の腫瘍は、大型の腫瘍よりも１０００×倍小型であった。
図３０は、Ｈ−ＮＯＸ三量体分布の蛍光画像を示す。Ａ）３０ｍｇ／ｋｇ Ｈ−ＮＯＸ三量体またはＢ）７５０ｍｇ／ｋｇ Ｈ−ＮＯＸ三量体を投与したＧＢＭ４３同所性神経膠芽腫マウスモデルのｅｘ ｖｉｖｏ蛍光画像。２９５ｍｇ／ｋｇ Ｈ−ＮＯＸ三量体の投与後の、Ｃ）大型頭蓋内腫瘍またはＤ）小型頭蓋内腫瘍を含有するＵ２５１同所性神経膠芽腫マウスモデルにおけるリアルタイム生物発光イメージング。
図３１は、同所性神経膠芽腫腫瘍（Ｕ２５１およびＧＢＭ−４３）の２種のマウスモデルおよび非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＡＴ／ＲＴ）の１種のモデルにおけるＨ−ＮＯＸ三量体分布のリアルタイム蛍光画像を示す。Ｈ−ＮＯＸ三量体投与の６０分後に撮像し、画像毎のカラースケールを最適化した。
図３２は、同所性神経膠芽腫腫瘍の３種のマウスモデルの腫瘍を有する半球におけるＨ−ＮＯＸタンパク質分布のｅｘ ｖｉｖｏ蛍光画像を示す。Ａ）ＧＢＭ４３同所性神経膠芽腫マウスモデルにおける投与の６０分後のＨ−ＮＯＸ三量体分布、Ｂ）Ｕ２５１同所性神経膠芽腫マウスモデルにおける投与の６日後のＨ−ＮＯＸ三量体分布、Ｃ）ＢＴ−１２非定型奇形腫様／ラブドイド腫瘍（ＡＴ／ＲＴ）マウスモデルにおける投与の３０分後のＨ−ＮＯＸ単量体分布、Ｄ）ＢＴ−１２同所性ＡＴ／ＲＴマウスモデルにおける投与の６０分後のＨ−ＮＯＸ三量体分布およびＥ）ＢＴ−１２同所性ＡＴ／ＲＴマウスモデルにおける媒体投与の３０分後のＨ−ＮＯＸタンパク質シグナルの欠如。
図３３は、同所性神経膠芽腫腫瘍マウスモデルにおける血管系からのＨ−ＮＯＸ三量体の漏出およびＵ２５１脳腫瘍の全体にわたる拡散を示す免疫蛍光画像である。抗Ｈ−ＮＯＸ抗体（上パネル）および抗ＣＤ３１抗体（血管系）（下パネル）で腫瘍切片を染色した。
図３４は、健常マウスの脳におけるＨ−ＮＯＸ三量体のサンドイッチＥＬＩＳＡアッセイを示す。Ａ）Ｈ−ＮＯＸ三量体（７５０ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射後の脳におけるＥＬＩＳＡアッセイ。Ｂ）Ｈ−ＮＯＸ三量体（２００ｍｇ／ｋｇ）の静脈内注射後の脳におけるＥＬＩＳＡアッセイ。Ｃ）Ｈ−ＮＯＸ三量体（７５０ｍｇ／ｋｇ）の脳／血漿比。Ｄ）Ｈ−ＮＯＸ三量体（２００ｍｇ／ｋｇ）の脳／血漿比。Ｈ−ＮＯＸ三量体投与の３０、６０、９０および１２０分後に血漿および脳を採取した。Ｎ＝３、全群。平均値＋／−ＳＥＭ。
図３５は、Ｈ−ＮＯＸ三量体が、ヒト神経膠芽腫のＵ２５１マウスモデルにおいて分割放射線療法に対し頭蓋内異種移植片を感受性にしたことを示す一連のグラフである。Ａ）両処置群と共に未処置対照群（Ｈ−ＮＯＸなし、ＲＴなし）におけるマウスの平均生物発光イメージング（ＢＬＩ）スコア＋／−ＳＥＭ。Ｎ＝９、全群。Ｂ）２９日目におけるＲＴおよびＲＴ＋Ｈ−ＮＯＸ三量体群の個々のＢＬＩスコア（Ａにおけるボックス）。線は、群平均、＋／−ＳＥＭを示す。ＲＴ＋Ｈ−ＮＯＸ三量体マウスのＢＬＩスコアは、ＲＴ単独で処置したマウスのスコアよりも有意に低かった（ｐ＝０．０３９、スチューデントｔ検定）。Ｃ）Ｈ−ＮＯＸ三量体群は、放射線療法のみを与えたマウスと比較して、有意に増強された生存を示した（ｐ＝０．０２５、ログランク検定）。
図３６は、Ｈ−ＮＯＸ三量体が、ヒト神経膠芽腫の２種のマウスモデルにおいて分割放射線療法に対し頭蓋内異種移植片を感受性にしたことを示す一連のグラフである。Ａ）２Ｇｙ放射線療法（２Ｇｙ）、Ｈ−ＮＯＸ三量体Ｌ１４４Ｆバリアント（Ｌ１４４Ｆ三量体）、Ｈ−ＮＯＸ三量体Ｌ１４４Ｆバリアントと組み合わせた２Ｇｙ放射線療法（２Ｇｙ＋Ｌ１４４Ｆ三量体）または処置バッファー（ＴＢ）を投与したＵ２５１同所性神経膠芽腫マウスモデルにおける生存パーセント。ログランクｐ値：２Ｇｙ対２Ｇｙ＋Ｌ１４４Ｆ三量体（ｐ＝０．１５８）、２Ｇｙ対ＴＢ（ｐ＝０．０６１２）およびＬ１４４Ｆ三量体対ＴＢ（ｐ＝０．３２６）。Ｂ）２Ｇｙ放射線療法（２Ｇｙ）、４Ｇｙ放射線療法（４Ｇｙ）、８Ｇｙ放射線療法（８Ｇｙ）、２サイクルの４Ｇｙ放射線療法（４Ｇｙ×２）、Ｈ−ＮＯＸ三量体と組み合わせた４Ｇｙ放射線療法（４Ｇｙ＋Ｈ−ＮＯＸ）または処置バッファー（未処置）を投与したＧＢＭ４３同所性神経膠芽腫マウスモデルにおける生存パーセント。ログランクｐ値：４Ｇｙ対４Ｇｙ＋Ｈ−ＮＯＸ（ｐ＝０．５９７）、４Ｇｙ対４Ｇｙ×２（ｐ＝０．０３８）および４Ｇｙ×２対４Ｇｙ＋Ｈ−ＮＯＸ（ｐ＝０．１１１）。
図３７は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。Ａ．野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１および２）。Ｂ．野生型Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｒｆ２ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１３および１４）。Ｃ．野生型Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｒｆ１ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１５および１６）。Ｄ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１（１〜３８５）Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１７および１８）。Ｅ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β２（１〜２１７）Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１９および２０）。Ｆ．Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号２１および２２）。Ｇ．Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β２ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号２３および２４）。 図３７は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。Ａ．野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１および２）。Ｂ．野生型Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｒｆ２ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１３および１４）。Ｃ．野生型Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｒｆ１ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１５および１６）。Ｄ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１（１〜３８５）Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１７および１８）。Ｅ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β２（１〜２１７）Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１９および２０）。Ｆ．Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号２１および２２）。Ｇ．Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β２ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号２３および２４）。 図３７は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。Ａ．野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１および２）。Ｂ．野生型Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｒｆ２ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１３および１４）。Ｃ．野生型Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｒｆ１ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１５および１６）。Ｄ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１（１〜３８５）Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１７および１８）。Ｅ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β２（１〜２１７）Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１９および２０）。Ｆ．Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号２１および２２）。Ｇ．Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β２ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号２３および２４）。 図３７は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。Ａ．野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１および２）。Ｂ．野生型Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｒｆ２ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１３および１４）。Ｃ．野生型Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｒｆ１ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１５および１６）。Ｄ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１（１〜３８５）Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１７および１８）。Ｅ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β２（１〜２１７）Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１９および２０）。Ｆ．Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号２１および２２）。Ｇ．Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β２ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号２３および２４）。 図３７は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。Ａ．野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１および２）。Ｂ．野生型Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｒｆ２ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１３および１４）。Ｃ．野生型Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｒｆ１ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１５および１６）。Ｄ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１（１〜３８５）Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１７および１８）。Ｅ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β２（１〜２１７）Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１９および２０）。Ｆ．Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号２１および２２）。Ｇ．Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β２ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号２３および２４）。 図３７は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。Ａ．野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１および２）。Ｂ．野生型Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｒｆ２ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１３および１４）。Ｃ．野生型Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｒｆ１ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１５および１６）。Ｄ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１（１〜３８５）Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１７および１８）。Ｅ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β２（１〜２１７）Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１９および２０）。Ｆ．Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号２１および２２）。Ｇ．Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β２ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号２３および２４）。 図３７は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の核酸配列およびアミノ酸配列を示す。Ａ．野生型Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１および２）。Ｂ．野生型Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｒｆ２ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１３および１４）。Ｃ．野生型Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ Ｏｒｆ１ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１５および１６）。Ｄ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１（１〜３８５）Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１７および１８）。Ｅ．Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β２（１〜２１７）Ｈ−ＮＯＸ（配列番号１９および２０）。Ｆ．Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号２１および２２）。Ｇ．Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β２ Ｈ−ＮＯＸ（配列番号２３および２４）。
本発明は、一部には、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、優先的に血管外遊出して脳等の組織に蓄積し、これにより、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較して、より長い酸素化ウィンドウおよびより長い循環半減期をもたらすという驚くべき発見に基づく。Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ由来の３個のＨ−ＮＯＸドメインを含み、Ｌ１４４Ｆ変異を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、神経膠芽腫腫瘍組織等、低酸素腫瘍組織への酸素の送達に有用であり、これにより、がんの放射線療法を増強することが示された。したがって、本発明は、例えば、放射線療法に対するアジュバントとしての、酸素の送達のためのタンパク質、組成物、キットおよび方法を提供する。
定義
他に特段の定めがなければ、本明細書に使用されているあらゆる技術および科学用語の意味は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味である。当業者であれば、本明細書に記載されている方法および材料と同様または均等ないずれかの方法および材料を使用して、本発明を実施または試験してよいことも十分に理解されよう。
本明細書における使用のため、それ以外のことが明らかに指示されていなければ、「ａ」、「ａｎ」などの用語の使用は、１個または複数を指す。
本願において、「または」の使用は、明確に記述されていない限り、あるいは当業者によって理解されない限り、「および／または」を意味する。複数の従属クレームの文脈において、「または」の使用は、２項以上の先行する独立または従属クレームを遡って指す。
「約」による値またはパラメータへの言及は、本明細書において、値またはパラメータそれ自体に関する実施形態を含む（記載する）。例えば、「約Ｘ」を指す記載は、「Ｘ」の記載を含む。
本明細書に記載されている本発明の態様および実施形態が、態様および実施形態「を含む」、「からなる」および「から本質的になる」ことを含むことが理解される。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は、アミノ酸残基の重合体を指すよう互換的に使用されており、最小の長さに限定されない。このようなアミノ酸残基の重合体は、天然または非天然アミノ酸残基を含有することができ、その例として、ペプチド、オリゴペプチド、アミノ酸残基の二量体、三量体および重合体が挙げられるがこれらに限定されない。この定義によって、全長タンパク質およびその断片の両方が包含される。この用語は、ポリペプチドの発現後改変、例えば、グリコシル化、シアリル化（ｓｉａｌｙｌａｔｉｏｎ）、アセチル化、リン酸化なども含む。さらに、本発明のために、「ポリペプチド」は、タンパク質が所望の活性を維持するのであれば、ネイティブ配列に対する欠失、付加および置換（一般に、保存的な性質）等の改変を含むタンパク質を指す。これらの改変は、部位特異的変異誘発によるなど、計画的であってもよいし、あるいはタンパク質を産生する宿主の変異またはＰＣＲ増幅によるエラーによるなど、偶発的であってもよい。本明細書において使用する場合、タンパク質は、共有結合または非共有結合により会合した２個以上のサブユニットを含むことができる；例えば、タンパク質は、２個以上の会合した単量体を含むことができる。
用語「核酸分子」、「核酸」および「ポリヌクレオチド」は、互換的に使用することができ、ヌクレオチドの重合体を指す。このようなヌクレオチドの重合体は、天然および／または非天然ヌクレオチドを含有することができ、その例として、ＤＮＡ、ＲＮＡおよびＰＮＡが挙げられるがこれらに限定されない。「核酸配列」は、核酸分子またはポリヌクレオチドを含むヌクレオチドの直鎖状配列を指す。
本明細書において使用する場合、「Ｈ−ＮＯＸタンパク質」は、Ｈ−ＮＯＸドメイン（ヘム−一酸化窒素および酸素（Ｈｅｍｅ−Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｎｄ ＯＸｙｇｅｎ）結合ドメインにちなみ命名）を有するタンパク質を意味する。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインに加えて１個または複数の他のドメインを含有しても含有しなくてもよい。一部の例において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、重合ドメインを含んでも含まなくてもよい。
本明細書において使用する場合、「重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質」は、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを含むＨ−ＮＯＸタンパク質である。Ｈ−ＮＯＸドメイン同士は、共有結合または非共有結合により会合され得る。
本明細書において使用する場合、「Ｈ−ＮＯＸドメイン」は、ヘムによって一酸化窒素および／または酸素に結合するタンパク質の全体または一部である。Ｈ−ＮＯＸドメインは、ヘムを含むことができる、あるいはヘムに結合することができるアポプロタンパク質（ａｐｏｐｒｏｐｒｏｔｅｉｎ）として見出すことができる。一部の例において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、６個のアルファ−ヘリックスと、続く２個のベータ鎖と、続く１個のアルファ−ヘリックスと、続く２個のベータ鎖を含む。一部の例において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、配列番号２に示されるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＨ−ＮＯＸドメインに対応する。例えば、Ｈ−ＮＯＸドメインは、配列番号２に示されるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＨ−ＮＯＸドメインに対し、少なくとも約１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％または９９％同一であり得る。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、配列番号２に示されるＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＨ−ＮＯＸドメインに対し、１０％〜２０％、２０％〜３０％、３０％〜４０％、４０％〜５０％、５０％〜６０％、６０％〜７０％、７０％〜８０％、８０％〜９０％、９０％〜９５％、９５％〜９９％または１００％同一であり得る。
本明細書において使用する場合、「重合ドメイン」は、単量体部分の会合を促進して、重合体構造を形成させるドメイン（例えば、ポリペプチドドメイン）である。例えば、重合ドメインは、単量体型Ｈ−ＮＯＸドメインの会合を促進して、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を作製することができる。例示的な重合ドメインは、三量体型ポリペプチドの形成を促進する、Ｔ４バクテリオファージのフォルドンドメインである。重合ドメインの他の例として、Ａｒｃ、ＰＯＺ、コイルドコイルドメイン（ＧＣＮ４、ロイシンジッパー、Ｖｅｌｃｒｏを含む）、ウテログロビン、コラーゲン、３本鎖コイルドコイル（ｃｏｌｉｓ）（マトリリン−１）、トロンボスポリン（ｔｈｒｏｍｂｏｓｐｏｒｉｎ）、ＴＲＰＶ１−Ｃ、Ｐ５３、Ｍｎｔ、アビジン（ａｖａｄｉｎ）、ストレプトアビジン、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＣＯＭＰ、ベロ毒素サブユニットＢ、ＣａｍＫＩＩ、ＲＣＫおよびＮエチルマレイミド感受性融合タンパク質由来のドメイン、ＳＴＭ３５４８、ＫａｉＣ、ＴｙｒＲ、Ｈｃｐ１、ＣｃｍＫ４、ＧＰ４１、炭疽菌防御抗原、アエロリジン、ａ−ヘモリジン、Ｃ４ｂ結合タンパク質、Ｍｉ−ＣＫ、アリールスルファターゼ（ａｒｙｌｓｕｒｆａｔａｓｅ）Ａおよびウイルスカプシドタンパク質が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において使用する場合、「アミノ酸リンカー配列」または「アミノ酸スペーサー配列」は、タンパク質の２個のドメインの連結に使用することができる短いポリペプチド配列である。一部の実施形態において、アミノ酸リンカー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のアミノ酸の長さである。例示的なアミノ酸リンカー配列として、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列およびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列が挙げられるがこれらに限定されない。
本明細書において使用する場合、「Ｈｉｓ６タグ」は、ポリペプチドに結合した６個のＨｉｓ残基を含むペプチドを指す。Ｈｉｓ６タグを使用して、タンパク質精製を容易にすることができる；例えば、Ｈｉｓ６タグに特異的なクロマトグラフィーを使用する。精製後に、Ｈｉｓ６タグは、エキソペプチダーゼを使用して切断することができる。
用語「実質的に類似」または「実質的に同じ」は、本明細書において使用する場合、当業者が、２種以上の数値の間の差に、該値によって評価される（ｍｅａｓｕｒｅｄ）生物学的特徴の文脈の範囲内で、生物学的および／または統計学的有意性が殆どないまたは全くないとみなすような、該２種以上の数値の間の十分に高度な類似性を表す。一部の実施形態において、２種以上の実質的に類似の値は、約５％、約１０％、約１５％、約２０％、約２５％または約５０％のうちいずれか１種以下だけ異なる。
語句「実質的に低下した」または「実質的に異なる」は、本明細書において使用する場合、当業者が、２種の数値の間の差に、該値によって評価される生物学的特徴の文脈の範囲内で、統計学的有意性があるとみなすような、該２種の数値の間の十分に高度な差を表す。一部の実施形態において、２種の実質的に異なる数値は、約１０％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、約４５％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％または約９０％のうちいずれか１種を超えて異なる。一部の実施形態において、２種の実質的に異なる数値は、約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９９％または約１００％のうちいずれか１種だけ異なる。
「ネイティブ配列」のポリペプチドは、自然に見出されるポリペプチドと同じアミノ酸配列を有するポリペプチドを含む。よって、ネイティブ配列のポリペプチドは、いずれかの生物由来の天然起源のポリペプチドのアミノ酸配列を有することができる。このようなネイティブ配列のポリペプチドは、自然から単離することができる、あるいは組換えまたは合成手段により生成することができる。用語「ネイティブ配列」のポリペプチドは、天然起源のトランケートまたは分泌型のポリペプチド（例えば、細胞外ドメイン配列）、天然起源のバリアント型（例えば、選択的スプライス型）および天然起源のアレルバリアントのポリペプチドを特に包含する。
ポリペプチド「バリアント」は、配列を整列し、必要であればギャップを導入して、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せず、最大パーセント配列同一性を達成した後に、ネイティブ配列のポリペプチドと少なくとも約８０％アミノ酸配列同一性を有する生物活性ポリペプチドを意味する。このようなバリアントは、例えば、ポリペプチドのＮまたはＣ末端において１個または複数のアミノ酸残基が付加または欠失されたポリペプチドを含む。一部の実施形態において、バリアントは、ネイティブ配列のポリペプチドと、少なくとも約８０％、約９０％または約９５％アミノ酸配列同一性のうちいずれか１種を有する。一部の実施形態において、バリアントは、ネイティブ配列のポリペプチドと、約８０％〜約９０％、約９０％〜約９５％または約９５％〜約９９％アミノ酸配列同一性のうちいずれか１種を有する。
本明細書において使用する場合、「変異体タンパク質」は、自然に存在するタンパク質と比較して、１個または複数の変異を有するタンパク質を意味する。一実施形態において、変異体タンパク質は、自然に存在するあらゆるタンパク質の配列とは異なる配列を有する。様々な実施形態において、変異体タンパク質のアミノ酸配列は、自然に存在するタンパク質の対応する領域の配列に対し、少なくとも約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約９５、約９７、約９８、約９９または約９９．５％同一のうちいずれかである。一部の実施形態において、変異体タンパク質のアミノ酸配列は、自然に存在するタンパク質の対応する領域の配列に対し、少なくとも約１０％〜約２０％、約２０％〜約３０％、約３０％〜約４０％、約４０％〜約５０％、約５０％〜約６０％、約６０％〜約７０％、約７０％〜約８０％、約８０％〜約９０％、約９０％〜約９５％、約９５％〜約９９％または約１００％同一のうちいずれかである。一部の実施形態において、変異体タンパク質は、全長タンパク質から少なくとも約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約３００または約４００個の連続アミノ酸のうちいずれかを含有するタンパク質断片である。一部の実施形態において、変異体タンパク質は、全長タンパク質から約２５〜約５０、約５０〜約７５、約７５〜約１００、約１００〜約１５０、約１５０〜約２００、約２００〜約３００または約３００〜約４００個の連続アミノ酸のうちいずれかを含有するタンパク質断片である。配列同一性は、例えば、配列解析ソフトウェアを使用して、その中で指定されたデフォルトパラメータにより測定することができる（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ ５３７０５）。このソフトウェアプログラムは、様々なアミノ酸置き換え、欠失および他の改変に相同性の程度を割り当てることにより、類似の配列をマッチさせる。
本明細書において使用する場合、「変異」は、自然に存在する参照核酸配列またはアミノ酸配列の変更を意味する。例示的な核酸変異は、挿入、欠失、フレームシフト変異、サイレント変異、ナンセンス変異またはミスセンス変異を含む。一部の実施形態において、核酸変異は、サイレント変異ではない。例示的なタンパク質変異は、１個もしくは複数のアミノ酸の挿入（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の挿入）、１個もしくは複数のアミノ酸の欠失（例えば、少なくとも約５、約１０、約１５、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約３００個以上のアミノ酸のうちいずれかの欠失、または約５〜約１０、約１０〜約１５、約１５〜約２５、約２５〜約５０、約５０〜約７５、約７５〜約１００、約１００〜約１５０、約１５０〜約２００、約２００〜約３００もしくは約３００〜約４００個のアミノ酸のうちいずれかの欠失等、Ｎ末端、Ｃ末端および／または内側残基の欠失）、１個もしくは複数のアミノ酸の置き換え（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の置き換え）、または上記の２種以上の組合せを含む。特定のアミノ酸変異の言及に使用される命名法は、先ず野生型アミノ酸、続いて残基番号、最後に置換アミノ酸を同定する。例えば、Ｙ１４０Ｌは、残基番号１４０のチロシンがロイシンに置き換えられたことを意味する。同様に、バリアントＨ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のアミノ酸変種（ｖａｒｉａｔｉｏｎ）により参照することができる。例えば、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｙ１４０Ｌ Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、位置番号１４０のチロシン残基がロイシン残基に置き換えられたＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸタンパク質を指し、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｗ９Ｆ／Ｙ１４０Ｌ Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、９位のトリプトファン残基がフェニルアラニン残基に置き換えられ、位置番号１４０のチロシン残基がロイシン残基に置き換えられたＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸタンパク質を指す。
「進化的に保存された変異」は、あるタンパク質におけるアミノ酸の、同じタンパク質ファミリーの別のタンパク質の対応する位置におけるアミノ酸による置き換えである。
本明細書において使用する場合、「に由来する」は、１個または複数の変異が導入されるタンパク質の供給源を指す。例えば、「哺乳動物タンパク質に由来する」タンパク質は、野生型（即ち、自然に存在する配列）哺乳動物タンパク質の配列への１個または複数の変異の導入から結果として生ずる目的のタンパク質を指す。
本明細書において使用する場合、ペプチド、ポリペプチドまたは抗体配列に関する「パーセント（％）アミノ酸配列同一性」および「相同性」は、配列を整列し、必要であればギャップを導入して、配列同一性の一部としていかなる保存的置換も考慮せず、最大パーセント配列同一性を達成した後に、特定のペプチドまたはポリペプチド配列におけるアミノ酸残基と同一である、候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアライメントは、当業者の技能範囲内の様々な仕方で達成することができ、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ−２、ＡＬＩＧＮまたはＭＥＧＡＬＩＧＮＴＭ（ＤＮＡＳＴＡＲ）ソフトウェア等、公開されているコンピュータソフトウェアを使用する。当業者であれば、比較されている配列の全長にわたる最大アライメントの達成に必要とされるいずれかのアルゴリズムを含む、アライメントの測定に適切なパラメータを決定することができる。
本明細書において使用する場合、「ｋｏｆｆ」は、タンパク質からのＯ２またはＮＯの放出速度等、解離速度を指す。数値的により低いｋｏｆｆは、より遅い解離速度を示す。
本明細書において使用する場合、「ｋｏｎ」は、タンパク質へのＯ２またはＮＯの結合速度等、会合速度を指す。数値的により低いｋｏｎは、より遅い会合速度を示す。
本明細書において使用する場合、「解離定数」は、「動力学的解離定数」または「計算された解離定数」を指す。「動力学的解離定数」または「ＫＤ」は、動力学的解離速度（ｋｏｆｆ）の動力学的結合速度（ｏｎ−ｒａｔｅ）（ｋｏｎ）に対する比であり、例えば、当業者に公知のおよび／または本明細書に記載されている方法を含む標準方法（例えば、標準分光学的方法、ストップトフロー法または閃光光分解法）を使用して絶対値として決定されるＫＤ値である。「計算された解離定数」または「計算されたＫＤ」は、測定されたｋｏｆｆに基づく動力学的解離定数の近似値を指す。ｋｏｎの値は、本明細書に記載されている動力学的ＫＤおよびｋｏｆｆの間の相関によって導かれる。
本明細書において使用する場合、「酸素親和性」は、タンパク質のヘム部分への酸素結合の強度を指す定性的用語である。この親和性は、酸素に対するｋｏｆｆおよびｋｏｎの両方によって影響される。数値的により低い酸素ＫＤ値は、より高い親和性を意味する。
本明細書において使用する場合、「ＮＯ親和性」は、タンパク質へのＮＯ結合の強度を指す定性的用語である（タンパク質と会合したヘム基へのまたはヘム基に結合した酸素への結合等）。この親和性は、ＮＯに対するｋｏｆｆおよびｋｏｎの両方によって影響される。数値的により低いＮＯ ＫＤ値は、より高い親和性を意味する。
本明細書において使用する場合、「ＮＯ安定性」は、酸素の存在下におけるＮＯによる酸化に対するタンパク質の安定性または抵抗性を指す。例えば、酸素の存在下においてＮＯに結合したときに酸化されないタンパク質の能力は、タンパク質のＮＯ安定性を示す。一部の実施形態において、約１、約２、約４、約６、約８、約１０、約１５または約２０時間のうちいずれかの間、２０℃でインキュベーションした後に、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約１０％未満または約５％未満のうちいずれかが酸化される。
本明細書において使用する場合、「ＮＯ反応性」は、酸素の存在下においてＮＯによってヘム結合タンパク質のヘムにおける鉄が酸化される速度を指す。ｓ−１単位で表すＮＯ反応性のより低い数値は、より低いＮＯ反応性を示す。
本明細書において使用する場合、「自動酸化速度」は、ヘム結合タンパク質のヘムにおける鉄が自動酸化される速度を指す。ｓ−１の単位で表すより低い数値の自動酸化速度は、より低い自動酸化速度を示す。
用語「ベクター」は、宿主細胞において増やすことができる、クローニングされたポリヌクレオチド（単数または複数）を含有するよう操作する（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）ことができるポリヌクレオチドを記載するために使用される。ベクターは、次のエレメントのうち１種または複数を含むことができる：複製起点、目的のポリペプチドの発現を調節する１種もしくは複数の調節配列（例えば、プロモーターおよび／またはエンハンサー等）および／または１種もしくは複数の選択可能マーカー遺伝子（例えば、抗生物質抵抗性遺伝子および比色分析アッセイにおいて使用することができる遺伝子、例えばβ−ガラクトシダーゼ等）。用語「発現ベクター」は、宿主細胞における目的のポリペプチドの発現に使用されるベクターを指す。
「宿主細胞」は、ベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであり得るまたはベクターまたは単離されたポリヌクレオチドのレシピエントであった細胞を指す。宿主細胞は、原核細胞または真核細胞であり得る。例示的な真核細胞は、霊長類または非霊長類の動物細胞等の哺乳動物細胞；酵母等の真菌細胞；植物細胞；および昆虫細胞を含む。例示的な原核細胞は、細菌細胞；例えば、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞を含む。
用語「単離された」は、本明細書において使用する場合、典型的に自然に見出されるまたは産生される構成成分の少なくとも一部から分離された分子を指す。例えば、ポリペプチドは、該ポリペプチドが産生された細胞の構成成分の少なくとも一部から分離される場合、「単離された」と称される。発現後に細胞によってポリペプチドが分泌され、産生した細胞から該ポリペプチドを含有する上清を物理的に分離する場合、それは、ポリペプチドを「単離すること」とみなされる。同様に、ポリヌクレオチドは、該ポリヌクレオチドが典型的に自然に見出されるより大型のポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡポリヌクレオチドの場合、ゲノムＤＮＡまたはミトコンドリアＤＮＡ等）の一部ではない場合、あるいは該ポリヌクレオチドが産生された細胞の構成成分の少なくとも一部から分離される場合、例えば、ＲＮＡポリヌクレオチドの場合、「単離された」と称される。よって、宿主細胞内部のベクターに含有されるＤＮＡポリヌクレオチドは、「単離された」と称することができる。
用語「個体」または「被験体」は、動物；例えば、哺乳動物を指すよう、本明細書において互換的に使用される。一部の実施形態において、ヒト、齧歯類、サル、ネコ、イヌ、ウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、哺乳動物の実験動物、哺乳動物の家畜、哺乳動物の競技（ｓｐｏｒｔ）動物および哺乳動物のペットが挙げられるがこれらに限定されない、哺乳動物を処置する方法が提供される。一部の例において、「個体」または「被験体」は、疾患または障害の処置を必要とする個体または被験体を指す。
「疾患」または「障害」は、本明細書において使用する場合、処置が必要とされる状態を指す。
用語「がん」は、制御できない細胞増殖、無制限の細胞成長およびアポトーシスによる細胞死の減少と関連する悪性増殖性障害を指す。
用語「腫瘍」は、異常に高レベルの増殖および成長を示す細胞の群を指すよう本明細書において使用される。腫瘍は、良性、前悪性または悪性であり得る；悪性腫瘍細胞はがん性である。腫瘍細胞は、固形腫瘍細胞または白血病性腫瘍細胞であり得る。用語「腫瘍成長」は、腫瘍サイズの対応する増加をもたらす、腫瘍を含む細胞（単数または複数）による増殖または成長を指すよう本明細書において使用される。
本明細書において使用する場合、「処置」は、有益なまたは所望の臨床結果を得るためのアプローチである。「処置」は、本明細書において使用する場合、ヒトを含む哺乳動物における疾患のための療法のいずれかの投与または適用を網羅する。本発明のために、有益なまたは所望の臨床結果として、次のうちいずれか１種または複数が挙げられるがこれらに限定されない：１種または複数の症状の軽減、疾患の程度の縮小、疾患の伝播（例えば、転移、例えば、肺またはリンパ節への転移）の防止または遅延、疾患の再発の防止または遅延、疾患進行の遅延または遅くすること、疾患状態の寛解、疾患または疾患進行の阻害、疾患またはその進行の阻害または遅くすること、その発症の抑止、および寛解（部分的であれ完全であれ）。「処置」には、増殖性疾患の病理学的意義の低下も包含される。本発明の方法は、処置の上述の態様のうちいずれか１種または複数を企図する。
がんの文脈において、用語「処置する」は、次のうちいずれかまたは全てを含む：腫瘍細胞またはがん細胞の成長の阻害、腫瘍細胞またはがん細胞の複製の阻害、全体的な腫瘍負荷を和らげること、および疾患に関連する１種または複数の症状の寛解。
用語「阻害」または「阻害する」は、いずれかの表現型特徴の減少もしくは休止または該特徴の発生率、程度もしくは見込みの減少もしくは休止を指す。「低下する」または「阻害する」は、参照と比較して、活性、機能および／または量を減少、低下または抑止することである。ある特定の実施形態において、「低下する」または「阻害する」とは、２０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。別の実施形態において、「低下する」または「阻害する」とは、５０％以上の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。さらに別の実施形態において、「低下する」または「阻害する」とは、７５％、８５％、９０％、９５％または９９％の全体的な減少を引き起こす能力を意味する。
本明細書において使用する場合、「疾患の発症の遅延」は、疾患（がん等）の発症を延期する、妨害する、遅くする、減速する、安定化する、抑制するおよび／または先送りすることを意味する。この遅延は、疾患の病歴および／または処置されている個体に応じて時間の長さを変えることができるというものである。当業者に明らかな通り、十分なまたは有意な遅延は、事実上、個体が疾患を発症しないという点において、防止を包含することができる。例えば、転移の発症等、後期がんを遅延させることができる。
「参照」は、本明細書において使用する場合、比較目的で使用されるいずれかの試料、標準またはレベルを指す。参照は、健常および／または非罹患試料から得ることができる。一部の例において、参照は、未処置試料から得ることができる。一部の例において、参照は、被験体個体の非罹患または無処置試料から得られる。一部の例において、参照は、被験体または患者ではない１名または複数の健常個体から得られる。
「防止」は、本明細書において使用する場合、疾患の素因を有する可能性があるが該疾患であるとは未だ診断されていない被験体における該疾患の発生または再発に関する予防の提供を含む。
薬剤の「有効量」は、必要とされる投薬量および期間において、所望の治療的または予防的結果の達成に有効な量を指す。
本発明の物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの「治療有効量」は、個体の疾患状態、年齢、性別および体重、ならびに個体において所望の応答を誘発する物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの能力等の因子に応じて変動し得る。治療有効量は、また、物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストの治療に有益な効果が、その物質／分子、アゴニストまたはアンタゴニストのいかなる毒性または有害効果をも上回る量である。治療有効量は、１回または複数の投与において送達することができる。
「予防有効量」は、必要とされる投薬量および期間において、所望の予防的結果の達成に有効な量を指す。典型的には、但し、必ずしもそうではないが、予防的用量は、疾患に先立ちまたはその初期に被験体において使用されるため、予防有効量は、治療有効量に満たない。
用語「医薬製剤」および「医薬組成物」は、活性成分（複数可）の生物活性を有効にするような形態の、かつ製剤が投与される被験体に許容できない毒性を有する追加の構成成分を含有しない調製物を指す。このような製剤は、滅菌されエンドトキシンを本質的に含まないものとし得る。
「薬学的に許容されるキャリア」は、無毒性固体、半固体もしくは液体充填剤、希釈剤、カプセル封入材料、製剤補助剤、または被験体への投与のための「医薬組成物」を共に含む治療剤と使用するための当技術分野における従来のキャリアを指す。薬学的に許容されるキャリアは、用いられている投薬量および濃度において、レシピエントに対し無毒性であり、製剤の他の成分と適合性である。薬学的に許容されるキャリアは、用いられている製剤に適切である。
「滅菌」製剤は、無菌であるまたは生きた微生物およびその胞子を本質的に含まない。
１種または複数のさらに別の治療剤「と組み合わせた」投与は、同時（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓ）（同時（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔ））およびいずれかの順序の継続的または逐次投与を含む。
用語「同時に」は、投与の少なくとも一部が時間的に重複する、または一方の治療剤の投与が他方の治療剤の投与と比べて短い期間内に収まる、２種以上の治療剤の投与を指すよう本明細書において使用される。例えば、２種以上の治療剤は、約３０分間以下、約１５分間以下、約１０分間以下、約５分間以下または約１分間以下のうちいずれか等、約６０分間以下の時間的な隔たりで投与される。
用語「逐次的に」は、１種または複数の薬剤の投与が１種または複数の他の薬剤の投与の中断後に続く、２種以上の治療剤の投与を指すよう本明細書において使用される。例えば、２種以上の治療剤の投与は、約２０、約３０、約４０、約５０もしくは約６０分間、約１日間、約２日間、約３日間、約１週間、約２週間または約１カ月間のうちいずれか等、約１５分間を超える時間的な隔たりで投与される。
本明細書において使用する場合、「と併せて」は、ある処置様式の、別の処置様式に加えた投与を指す。そのようなものとして、「と併せて」は、個体へのある処置様式の、他の処置様式の投与の前、最中または後における投与を指す。
用語「添付文書」は、このような治療製品の使用に関する適応症、利用法、投薬量、投与、併用療法、禁忌および／または警告に関する情報を含有する、治療製品の商業的パッケージに習慣的に含まれる指示を指すよう使用される。
「製造品」は、少なくとも１種の試薬、例えば、疾患もしくは障害（例えば、がん）の処置のための医薬、または本明細書に記載されているバイオマーカーを特異的に検出するためのプローブを含むいずれかの製造物（例えば、パッケージまたは容器）またはキットである。ある特定の実施形態において、製造物またはキットは、本明細書に記載されている方法を実施するための単位として販売促進、配給または販売される。
Ｈ−ＮＯＸタンパク質
Ｈ−ＮＯＸタンパク質ファミリーの概要
他に特段の断りがなければ、本明細書に記載されている組成物、キットおよび方法において、いかなる野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質を使用してもよい。本明細書において使用する場合、「Ｈ−ＮＯＸタンパク質」は、Ｈ−ＮＯＸドメイン（ヘム−一酸化窒素および酸素（Ｈｅｍｅ−Ｎｉｔｒｉｃ ｏｘｉｄｅ ａｎｄ ＯＸｙｇｅｎ）結合ドメインにちなみ命名）を有するタンパク質を意味する。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインに加えて１個または複数の他のドメインを含有しても含有しなくてもよい。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘムタンパク質の高度に保存され十分に特徴付けされたファミリーのメンバーである（Ｉｙｅｒ， Ｌ． Ｍ．ら（２００３年２月３日）ＢＭＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４巻（１号）：５頁；Ｋａｒｏｗ， Ｄ． Ｓ．ら（２００４年８月１０日）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３巻（３１号）：１０２０３〜１０２１１頁；Ｂｏｏｎ， Ｅ． Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．１巻：５３〜５９頁；Ｂｏｏｎ， Ｅ． Ｍ．ら（２００５年１０月）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．９巻（５号）：４４１〜４４６頁；Ｂｏｏｎ， Ｅ． Ｍ．ら（２００５年）Ｊ． Ｉｎｏｒｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９巻（４号）：８９２〜９０２頁）。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｐｆａｍ ０７７００タンパク質またはＨＮＯＢタンパク質とも称される（Ｐｆａｍ − タンパク質ドメインファミリーアライメントおよび隠れマルコフモデルのデータベース、著作権（Ｃ）１９９６〜２００６年、Ｔｈｅ Ｐｆａｍ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ；ＧＮＵ ＬＧＰＬ Ｆｒｅｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ，Ｉｎｃ．、５９ Ｔｅｍｐｌｅ Ｐｌａｃｅ − Ｓｕｉｔｅ ３３０、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ ０２１１１−１３０７、ＵＳＡ）。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、６個のアルファ−ヘリックスと、続く２個のベータ鎖と、続く１個のアルファ−ヘリックスと、続く２個のベータ鎖を含む二次構造を有するまたは有すると予測される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘムに結合することができるアポタンパク質またはヘムが結合したホロタンパク質であり得る。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘム基に共有結合または非共有結合により結合することができる。一部のＨ−ＮＯＸタンパク質は、ＮＯに結合するが、Ｏ２には結合せず、その他は、ＮＯおよびＯ２の両方に結合する。単離された通性好気性菌由来のＨ−ＮＯＸドメインは、ＮＯに結合するが、Ｏ２には結合しない。偏性好気性原核生物、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓおよびＤ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ由来のＨ−ＮＯＸタンパク質は、ＮＯおよびＯ２に結合する。哺乳動物は、２種のＨ−ＮＯＸタンパク質：β１およびβ２を有する。マウス、ラット、ウシおよびヒトＨ−ＮＯＸ配列のアライメントは、これらの種が、＞９９％同一性を共有することを示す。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインまたはＨ−ＮＯＸタンパク質全体は、天然起源のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、配列番号２）または天然起源のｓＧＣタンパク質（例えば、天然起源のｓＧＣ β１タンパク質）の対応する領域のそれに対し、少なくとも約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約９５、約９７、約９８、約９９または約９９．５％同一のうちいずれかである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインまたはＨ−ＮＯＸタンパク質全体は、天然起源のＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、配列番号２）または天然起源のｓＧＣタンパク質（例えば、天然起源のｓＧＣ β１タンパク質）の対応する領域のそれに対し、少なくとも約１０〜約２０％、約２０〜約３０％、約３０〜約４０％、約４０〜約５０％、約５０〜約６０％、約６０〜約７０％、約７０〜約８０％、約８０〜約９０％、約９０〜約９５％、約９５〜約９９または約９９〜約９９．９％同一のうちいずれかである。本明細書にさらに記述されている通り、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、対応する天然起源のＨ−ＮＯＸタンパク質と比べて、１個または複数の変異を必要に応じて含有することができる。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインに加えて１個または複数のドメインを含む。特定の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、別のタンパク質由来の１個もしくは複数のドメインまたは配列全体を含む。例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインと、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミン）等の別のタンパク質の一部または全体とを含む融合タンパク質であり得る。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのみが存在する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、タグ；例えば、Ｈｉｓ６タグを含む。
重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質
一部の態様において、本発明は、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。２個以上のＨ−ＮＯＸドメインは、共有結合により連結または非共有結合により連結されていてよい。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、二量体、三量体、四量体、五量体、六量体、七量体、八量体（ｏｃｔｏｍｅｒ）、九量体（ｎａｎｏｍｅｒ）または十量体の形態である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、同種Ｈ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、異種Ｈ−ＮＯＸドメインを含む；例えば、Ｈ−ＮＯＸドメインは、特定の種のＨ−ＮＯＸドメインのアミノ酸バリアントを含むことができる、あるいは異なる種由来のＨ−ＮＯＸドメインを含むことができる。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、１個または複数の重合ドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、少なくとも１個の三量体形成ドメインを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸドメインは、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸドメインは、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインを含む。
本発明の一部の態様において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、２個以上の会合した単量体を含む。単量体は、共有結合により連結または非共有結合により連結され得る。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体サブユニットが産生され、単量体サブユニットは、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで会合して、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成する。一部の実施形態において、単量体は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む。一部の実施形態において、重合ドメインは、Ｈ−ＮＯＸドメインに共有結合により連結される；例えば、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＮ末端またはＣ末端に共有結合により連結される。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＮ末端またはＣ末端に共有結合により連結される。一部の実施形態において、アミノ酸スペーサーは、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインの間に共有結合により連結される。「アミノ酸スペーサー」および「アミノ酸リンカー」は、本明細書において互換的に使用される。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体サブユニットのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体サブユニットのうち少なくとも１個は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体は、Ｈ−ＮＯＸドメインと、Ｔ４バクテリオファージのフォルドンドメインとを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインと、フォルドンドメインとを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインと、フォルドンドメインとを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインと、フォルドンドメインとを含む。一部の実施形態において、三量体Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個の単量体を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインと、フォルドンドメインとを含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、アミノ酸リンカー；例えば、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙリンカーによりフォルドンドメインに連結される。一部の実施形態において、少なくとも１個のＨ−ＮＯＸドメインは、タグを含む。一部の実施形態において、少なくとも１個のＨ−ＮＯＸドメインは、Ｈｉｓ６タグを含む。一部の実施形態において、Ｈｉｓ６タグは、アミノ酸リンカー；例えば、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーによりフォルドンドメインに連結される。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインの全てが、Ｈｉｓ６タグを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号２６または配列番号２８に示されるアミノ酸配列を含む。
Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ由来の例示的なＨ−ＮＯＸドメインは、およそ２６．７ｋＤａｌである。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、約５０ｋＤａｌ、７５ｋＤａｌ、１００ｋＤａｌ、１２５ｋＤａｌまたは約１５０ｋＤａｌのうちいずれかを超える原子質量を有する。
本発明は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であって、個体への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、単一のＨ−ＮＯＸドメインを含む対応する単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較して、該個体の１種または複数の組織においてより多くの蓄積を示す重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。対応するＨ−ＮＯＸタンパク質は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインのうちの少なくとも１個を含むＨ−ＮＯＸタンパク質の単量体形態を指す。優先的な重合体型Ｈ−ＮＯＸ蓄積組織として、腫瘍および血管系が損傷した組織が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、哺乳動物に少なくとも約１、２、３、４、６、１２または２４時間にわたって存続する。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、哺乳動物に約１〜２、２〜３、３〜４、４〜６、６〜１２または１２〜２４時間にわたって存続する。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸの約１０％未満が、個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、約１時間、２時間または３時間のうちいずれか未満以内に、腎臓によって哺乳動物から排除される。
Ｈ−ＮＯＸタンパク質およびＨ−ＮＯＸドメインの供給源
本明細書に記載されている組成物、キットおよび方法において、いかなる属または種由来のＨ−ＮＯＸタンパク質およびＨ−ＮＯＸドメインを使用することもできる。様々な実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、哺乳動物（例えば、霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザル等）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌまたはネコ）、昆虫、酵母または細菌由来のタンパク質またはドメインである、あるいはこのようなタンパク質に由来する。例示的な哺乳動物Ｈ−ＮＯＸタンパク質として、野生型ヒトおよびラット可溶性グアニル酸シクラーゼ（β１サブユニット等）が挙げられる。Ｈ−ＮＯＸタンパク質の例として、野生型哺乳動物Ｈ−ＮＯＸタンパク質、例えば、Ｈ．ｓａｐｉｅｎｓ、Ｍ．ｍｕｓｃｕｌｕｓ、Ｃ．ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ、Ｂ．Ｔａｕｒｕｓ、Ｃ．ｌｕｐｕｓおよびＲ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ；ならびに野生型非哺乳動物脊椎動物Ｈ−ＮＯＸタンパク質、例えば、Ｘ．ｌａｅｖｉｓ、Ｏ．ｌａｔｉｐｅｓ、Ｏ．ｃｕｒｉｖａｔｕｓおよびＦ．ｒｕｂｒｉｐｅｓが挙げられる。非哺乳動物野生型ＮＯ結合Ｈ−ＮＯＸタンパク質の例として、Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ、Ａ．ｇａｍｂｉａｅおよびＭ．ｓｅｘｔａの野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が挙げられる；非哺乳動物野生型Ｏ２結合Ｈ−ＮＯＸタンパク質の例として、Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ ｇｃｙ−３１、ｇｃｙ−３２、ｇｃｙ−３３、ｇｃｙ−３４、ｇｃｙ−３５、ｇｃｙ−３６およびｇｃｙ−３７；Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５、ＣＧ１４８８６およびＣＧ４１５４；ならびにＭ．ｓｅｘｔａベータ−３の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が挙げられる；原核生物野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の例として、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ、Ｖ．ｃｈｏｌｅｒａ、Ｖ．ｆｉｓｃｈｅｒｉｉ、Ｎ．ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ、Ｄ．ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ １、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ２およびＣ．ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍが挙げられる。
例示的なＨ−ＮＯＸタンパク質のＮＣＢＩ受託番号として、次のものが挙げられる：Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１［ｇｉ：２７４６０８３］、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１［ｇｉ：２７１２７３１８］、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１［ｇｉ：８６１２０３］、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ［ｇｉ：２３１７１４７６］、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５［ｇｉ：５２７８２８０６］、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ［ｇｉ：２３１２９６０６］、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ［ｇｉ：１６１２７２２２］、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ［ｇｉ：２４３７３７０２］、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ （ＯＲＦ ２）［ＣＵＣＧＣ＿２７２６２４］、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ［ｇｉ：１５８９６４８８］、およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ［ｇｉ：２０８０７１６９］。Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸは、ＧｅｎＢａｎｋ受託番号ＤＱ００８５７６により提供される。例示的なＨ−ＮＯＸタンパク質およびドメインの核酸およびアミノ酸配列を図３７に提示する。
例示的なＨ−ＮＯＸタンパク質として、その遺伝子名と、続くその種の略称およびＧｅｎｂａｎｋ識別子によって記載される次のＨ−ＮＯＸタンパク質も挙げられる（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００６年５月２１日；２００６年５月２２日；２００７年５月２１日；または２００７年５月２２日現在、利用できる次のタンパク質配列等）：Ｎｐｕｎ５９０５＿Ｎｐｕ＿２３１２９６０６、ａｌｒ２２７８＿Ａｎａ＿１７２２９７７０、ＳＯ２１４４＿Ｓｏｎｅ＿２４３７３７０２、Ｍｄｅｇ１３４３＿Ｍｄｅ＿２３０２７５２１、ＶＣＡ０７２０＿Ｖｃｈ＿１５６０１４７６、ＣＣ２９９２＿Ｃｃｒ＿１６１２７２２２、Ｒｓｐｈ２０４３＿Ｒｈｓｐ＿２２９５８４６３（ｇｉ：４６１９２７５７）、Ｍｍｃ１０７３９＿Ｍｃｓｐ＿２２９９９０２０、Ｔａｒ４＿Ｔｔｅ＿２０８０７１６９、Ｄｄｅｓ２８２２＿Ｄｄｅ＿２３４７５９１９、ＣＡＣ３２４３＿Ｃａｃ＿１５８９６４８８、ｇｃｙ−３１＿Ｃｅ＿１７５６８３８９、ＣＧ１４８８５＿Ｄｍ＿２４６４７４５５、ＧＵＣＹ１Ｂ３＿Ｈｓ＿４５０４２１５、ＨｐＧＣＳ−ｂｅｔａ１＿Ｈｐｕｌ＿１４２４５７３８、Ｇｙｃｂｅｔａ１００Ｂ＿Ｄｍ＿２４６５１５７７、ＣＧ４１５４＿Ｄｍ＿２４６４６９９３（ｇｉ：ＮＰ＿６５０４２４．２、ｇｉ：６２４８４２９８）、ｇｃｙ−３２＿Ｃｅ＿１３５３９１６０、ｇｃｙ−３６＿Ｃｅ＿１７５６８３９１（ｇｉ：３２５６６３５２、ｇｉ：８６５６４７１３）、ｇｃｙ−３５＿Ｃｅ−１７５０７８６１（ｇｉ：７１９９０１４６）、ｇｃｙ−３７＿Ｃｅ＿１７５４０９０４（ｇｉ：７１９８５５０５）、ＧＣＹ１ａ３＿Ｈｓ＿２０５３５６０３、ＧＣＹ１ａ２−Ｈｓ＿８９９４７７、またはＧＹＣａ−９９Ｂ＿Ｄｍ＿７２９２７０（ｇｉ：６８０６７７３８）（Ｌａｋｓｈｍｉｎａｒａｙａｎら（２００３年）ＢＭＧ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４巻：５〜１３頁）。これらの名称に使用されている種の略称は、Ａｎａ−Ａｎａｂａｅｎａ Ｓｐ；Ｃｃｒ−Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ；Ｃａｃ−Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ；Ｄｄｅ−Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ；Ｍｃｓｐ−Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．；Ｍｄｅ−Ｍｉｃｒｏｂｕｌｂｉｆｅｒ ｄｅｇｒａｄａｎｓ；Ｎｐｕ−Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ；Ｒｈｓｐ−Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ；Ｓｏｎｅ−Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ；Ｔｔｅ−Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ；Ｖｃｈ−Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ；Ｃｅ−Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ；Ｄｍ−Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ；Ｈｐｕｌ−Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ；Ｈｓ−Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓを含む。
他の例示的なＨ−ＮＯＸタンパク質として、その生物名とＰｆａｍデータベース受託番号によって記載される次のＨ−ＮＯＸタンパク質が挙げられる（それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、２００６年５月２１日；２００６年５月２２日；２００７年５月１７日；２００７年５月２１日；または２００７年５月２２日現在、利用できる次のタンパク質配列等）：Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｂｒｉｇｇｓａｅ Ｑ６２２Ｍ５＿ＣＡＥＢＲ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｂｒｉｇｇｓａｅ Ｑ６１Ｐ４４＿ＣＡＥＢＲ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｂｒｉｇｇｓａｅ Ｑ６１Ｒ５４＿ＣＡＥＢＲ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｂｒｉｇｇｓａｅ Ｑ６１Ｖ９０＿ＣＡＥＢＲ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｂｒｉｇｇｓａｅ Ｑ６１Ａ９４＿ＣＡＥＢＲ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｂｒｉｇｇｓａｅ Ｑ６０ＴＰ４＿ＣＡＥＢＲ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｂｒｉｇｇｓａｅ Ｑ６０Ｍ１０＿ＣＡＥＢＲ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ３７＿ＣＡＥＥＬ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ３１＿ＣＡＥＥＬ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ３６＿ＣＡＥＥＬ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ３２＿ＣＡＥＥＬ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ３５＿ＣＡＥＥＬ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ３４＿ＣＡＥＥＬ、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｔｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ３３＿ＣＡＥＥＬ、Ｏｒｙｚｉａｓ ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ Ｑ７Ｔ０４０＿ＯＲＹＣＵ、Ｏｒｙｚｉａｓ ｃｕｒｖｉｎｏｔｕｓ Ｑ７５ＷＦ０＿ＯＲＹＣＵ、Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ Ｐ７９９９８＿ＯＲＹＬＡ、Ｏｒｙｚｉａｓ ｌａｔｉｐｅｓ Ｑ７ＺＳＺ５＿ＯＲＹＬＡ、Ｔｅｔｒａｏｄｏｎ ｎｉｇｒｏｖｉｒｉｄｉｓ Ｑ４ＳＷ３８＿ＴＥＴＮＧ、Ｔｅｔｒａｏｄｏｎ ｎｉｇｒｏｖｉｒｉｄｉｓ Ｑ４ＲＺ９４＿ＴＥＴＮＧ、Ｔｅｔｒａｏｄｏｎ ｎｉｇｒｏｖｉｒｉｄｉｓ Ｑ４Ｓ６Ｋ５＿ＴＥＴＮＧ、Ｆｕｇｕ ｒｕｂｒｉｐｅｓ Ｑ９０ＶＹ５＿ＦＵＧＲＵ、Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ Ｑ６ＩＮＫ９＿ＸＥＮＬＡ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ Ｑ５Ｔ８Ｊ７＿ＨＵＭＡＮ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＧＣＹＡ２＿ＨＵＭＡＮ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＧＣＹＢ２＿ＨＵＭＡＮ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ ＧＣＹＢ１＿ＨＵＭＡＮ、Ｇｏｒｉｌｌａ ｇｏｒｉｌｌａ Ｑ９Ｎ１９３＿９ＰＲＩＭ、Ｐｏｎｇｏ ｐｙｇｍａｅｕｓ Ｑ５ＲＡＮ８＿ＰＯＮＰＹ、Ｐａｎ ｔｒｏｇｌｏｄｙｔｅｓ Ｑ９Ｎ１９２＿ＰＡＮＴＲ、Ｍａｃａｃａ ｍｕｌａｔｔａ Ｑ９Ｎ１９４＿ＭＡＣＭＵ、Ｈｙｌｏｂａｔｅｓ ｌａｒ Ｑ９Ｎ１９１＿ＨＹＬＬＡ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｑ８ＢＸＨ３＿ＭＯＵＳＥ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ ＧＣＹＢ１＿ＭＯＵＳＥ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｑ３ＵＴＩ４＿ＭＯＵＳＥ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｑ３ＵＨ８３＿ＭＯＵＳＥ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｑ６ＸＥ４１＿ＭＯＵＳＥ、Ｍｕｓ ｍｕｓｃｕｌｕｓ Ｑ８０ＹＰ４＿ＭＯＵＳＥ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｑ８０ＷＸ７＿ＲＡＴ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｑ８０ＷＸ８＿ＲＡＴ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｑ９２０Ｑ１＿ＲＡＴ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｑ５４Ａ４３＿ＲＡＴ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｑ８０ＷＹ０＿ＲＡＴ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｑ８０ＷＹ４＿ＲＡＴ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｑ８ＣＨ８５＿ＲＡＴ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｑ８０ＷＹ５＿ＲＡＴ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ＧＣＹＢ１＿ＲＡＴ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｑ８ＣＨ９０＿ＲＡＴ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｑ９１ＸＪ７＿ＲＡＴ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ Ｑ８０ＷＸ９＿ＲＡＴ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ＧＣＹＢ２＿ＲＡＴ、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ ＧＣＹＡ２＿ＲＡＴ、Ｃａｎｉｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ Ｑ４ＺＨＲ９＿ＣＡＮＦＡ、Ｂｏｓ ｔａｕｒｕｓ ＧＣＹＢ１＿ＢＯＶＩＮ、Ｓｕｓ ｓｃｒｏｆａ Ｑ４ＺＨＲ７＿ＰＩＧ、Ｇｒｙｌｌｕｓ ｂｉｍａｃｕｌａｔｕｓ Ｑ５９ＨＮ５＿ＧＲＹＢＩ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ Ｏ７７１０６＿ＭＡＮＳＥ、Ｍａｎｄｕｃａ ｓｅｘｔａ Ｏ７６３４０＿ＭＡＮＳＥ、Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ Ｑ５ＵＡＦ０＿ＡＰＩＭＥ、Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ Ｑ５ＦＡＮ０＿ＡＰＩＭＥ、Ａｐｉｓ ｍｅｌｌｉｆｅｒａ Ｑ６Ｌ５Ｌ６＿ＡＰＩＭＥ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ ｓｔｒ ＰＥＳＴ Ｑ７ＰＹＫ９＿ＡＮＯＧＡ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ ｓｔｒ ＰＥＳＴ Ｑ７Ｑ９Ｗ６＿ＡＮＯＧＡ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ ｓｔｒ ＰＥＳＴ Ｑ７ＱＦ３１＿ＡＮＯＧＡ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ ｓｔｒ ＰＥＳＴ Ｑ７ＰＳ０１＿ＡＮＯＧＡ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ ｓｔｒ ＰＥＳＴ Ｑ７ＰＦＹ２＿ＡＮＯＧＡ、Ａｎｏｐｈｅｌｅｓ ｇａｍｂｉａｅ Ｑ７ＫＱ９３＿ＡＮＯＧＡ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｑ２４０８６＿ＤＲＯＭＥ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＧＣＹＨ＿ＤＲＯＭＥ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＧＣＹ８Ｅ＿ＤＲＯＭＥ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＧＣＹＤＡ＿ＤＲＯＭＥ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ ＧＣＹＤＢ＿ＤＲＯＭＥ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ Ｑ９ＶＡ０９＿ＤＲＯＭＥ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｃｕｒａ Ｑ２９ＣＥ１＿ＤＲＯＰＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｃｕｒａ Ｑ２９６Ｃ７＿ＤＲＯＰＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｃｕｒａ Ｑ２９６Ｃ８＿ＤＲＯＰＳ、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｐｓｅｕｄｏｏｂｓｃｕｒａ Ｑ２９ＢＵ７＿ＤＲＯＰＳ、Ａｐｌｙｓｉａ ｃａｌｉｆｏｒｎｉｃａ Ｑ７ＹＷＫ７＿ＡＰＬＣＡ、Ｈｅｍｉｃｅｎｔｒｏｔｕｓ ｐｕｌｃｈｅｒｒｉｍｕｓ Ｑ９５ＮＫ５＿ＨＥＭＰＵ、Ｃｈｌａｍｙｄｏｍｏｎａｓ ｒｅｉｎｈａｒｄｔｉｉ、Ｑ５ＹＬＣ２＿ＣＨＬＲＥ、Ａｎａｂａｅｎａ ｓｐ Ｑ８ＹＵＱ７＿ＡＮＡＳＰ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ ＢＢＦＬ７ Ｑ２６ＧＲ８＿９ＢＡＣＴ、Ｐｓｙｃｈｒｏｆｌｅｘｕｓ ｔｏｒｑｕｉｓ ＡＴＣＣ ７００７５５ Ｑ１ＶＱＥ５＿９ＦＬＡＯ、海洋ガンマプロテオバクテリアＨＴＣＣ２２０７ Ｑ１ＹＰＪ５＿９ＧＡＭＭ、海洋ガンマプロテオバクテリア ＨＴＣＣ２２０７ Ｑ１ＹＴＫ４＿９ＧＡＭＭ、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｑ９Ａ４５１＿ＣＡＵＣＲ、Ａｃｉｄｉｐｈｉｌｉｕｍ ｃｒｙｐｔｕｍ ＪＦ−５ Ｑ２ＤＧ６０＿ＡＣＩＣＹ、Ｒｈｏｄｏｂａｃｔｅｒ ｓｐｈａｅｒｏｉｄｅｓ Ｑ３Ｊ０Ｕ９＿ＲＨＯＳ４、Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｐｏｍｅｒｏｙｉ Ｑ５ＬＰＶ１＿ＳＩＬＰＯ、Ｐａｒａｃｏｃｃｕｓ ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｎｓ ＰＤ１２２２、Ｑ３ＰＣ６７＿ＰＡＲＤＥ、Ｓｉｌｉｃｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ ＴＭ１０４０ Ｑ３ＱＮＹ２＿９ＲＨＯＢ、Ｊａｎｎａｓｃｈｉａ ｓｐ Ｑ２８ＭＬ８＿ＪＡＮＳＣ、Ｍａｇｎｅｔｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ ＭＣ−１ Ｑ３ＸＴ２７＿９ＰＲＯＴ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ Ｑ５ＷＸＰ０＿ＬＥＧＰＬ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ Ｑ５ＷＴＺ５＿ＬＥＧＰＬ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ Ｑ５Ｘ２６８＿ＬＥＧＰＡ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ Ｑ５Ｘ２Ｒ２＿ＬＥＧＰＡ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ｓｕｂｓｐ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ Ｑ５ＺＷＭ９＿ＬＥＧＰＨ、Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ ｓｕｂｓｐ ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌａ Ｑ５ＺＳＱ８＿ＬＥＧＰＨ、Ｃｏｌｗｅｌｌｉａ ｐｓｙｃｈｒｅｒｙｔｈｒａｅａ Ｑ４７Ｙ４３＿ＣＯＬＰ３、Ｐｓｅｕｄｏａｌｔｅｒｏｍｏｎａｓ ａｔｌａｎｔｉｃａ Ｔ６ｃ Ｑ３ＣＳＺ５＿ＡＬＴＡＴ、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｑ８ＥＦ４９＿ＳＨＥＯＮ、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ Ｑ２１Ｅ２０＿ＳＡＣＤ２、Ｓａｃｃｈａｒｏｐｈａｇｕｓ ｄｅｇｒａｄａｎｓ Ｑ２１ＥＲ７＿ＳＡＣＤ２、Ｖｉｂｒｉｏ ａｎｇｕｓｔｕｍ Ｓ１４ Ｑ１ＺＷＥ５＿９ＶＩＢＲ、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ Ｑ８ＤＡＥ２＿ＶＩＢＶＵ、Ｖｉｂｒｉｏ ａｌｇｉｎｏｌｙｔｉｃｕｓ １２Ｇ０１ Ｑ１ＶＣＰ６＿ＶＩＢＡＬ、Ｖｉｂｒｉｏ ｓｐ ＤＡＴ７２２ Ｑ２ＦＡ２２＿９ＶＩＢＲ、Ｖｉｂｒｉｏ ｐａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ Ｑ８７ＮＪ１＿ＶＩＢＰＡ、Ｖｉｂｒｉｏ ｆｉｓｃｈｅｒｉ Ｑ５Ｅ１Ｆ５＿ＶＩＢＦ１、Ｖｉｂｒｉｏ ｖｕｌｎｉｆｉｃｕｓ Ｑ７ＭＪＳ８＿ＶＩＢＶＹ、Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ ＳＫＡ３４ Ｑ２Ｃ６Ｚ５＿９ＧＡＭＭ、Ｈａｈｅｌｌａ ｃｈｅｊｕｅｎｓｉｓ Ｑ２ＳＦＹ７＿ＨＡＨＣＨ、Ｏｃｅａｎｏｓｐｉｒｉｌｌｕｍ ｓｐ ＭＥＤ９２ Ｑ２ＢＫＶ０＿９ＧＡＭＭ、Ｏｃｅａｎｏｂａｃｔｅｒ ｓｐ ＲＥＤ６５ Ｑ１Ｎ０３５＿９ＧＡＭＭ、Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ ｄｅｓｕｌｆｕｒｉｃａｎｓ Ｑ３１０Ｕ７＿ＤＥＳＤＧ、Ｈａｌｏｔｈｅｒｍｏｔｈｒｉｘ ｏｒｅｎｉｉ Ｈ １６８ Ｑ２ＡＩＷ５＿９ＦＩＲＭ、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｑ８ＲＢＸ６＿ＴＨＥＴＮ、Ｃａｌｄｉｃｅｌｌｕｌｏｓｉｒｕｐｔｏｒ ｓａｃｃｈａｒｏｌｙｔｉｃｕｓ ＤＳＭ ８９０３ Ｑ２ＺＨ１７＿ＣＡＬＳＡ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｑ９７Ｅ７３＿ＣＬＯＡＢ、Ａｌｋａｌｉｐｈｉｌｕｓ ｍｅｔａｌｌｉｒｅｄｉｇｅｎｅｓ ＱＹＭＦ Ｑ３Ｃ７６３＿９ＣＬＯＴ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｔｅｔａｎｉ Ｑ８９９Ｊ９＿ＣＬＯＴＥ、およびＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｂｅｉｊｅｒｉｎｃｋｉ ＮＣＩＭＢ ８０５２ Ｑ２ＷＶＮ０＿ＣＬＯＢＥ。これらの配列は、本明細書に記載されているＰｆａｍデータベースを使用して、これらのタンパク質がＨ−ＮＯＸタンパク質ファミリーに属するという同定に基づき、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードすると予測される。
本明細書に記載されている医薬組成物および方法における使用に適し得る追加のＨ−ＮＯＸタンパク質、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインおよび核酸は、標準方法を使用して同定することができる。例えば、標準配列アライメントおよび／または構造予測プログラムを使用して、追加のＨ−ＮＯＸタンパク質および核酸であって、それらの一次構造および／または予測されるタンパク質二次構造の、公知Ｈ−ＮＯＸタンパク質および核酸のそれとの類似性に基づき、該追加のＨ−ＮＯＸタンパク質および核酸を同定することができる。例えば、Ｐｆａｍデータベースは、定義されたアライメントアルゴリズムおよび隠れマルコフモデル（Ｐｆａｍ ２１．０等）を使用して、タンパク質をＨ−ＮＯＸタンパク質ファミリー等のファミリーにカテゴリー化する（Ｐｆａｍ − タンパク質ドメインファミリーアライメントおよび隠れマルコフモデルのデータベース、著作権（Ｃ）１９９６〜２００６年、Ｔｈｅ Ｐｆａｍ Ｃｏｎｓｏｒｔｉｕｍ；ＧＮＵ ＬＧＰＬ Ｆｒｅｅ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ， Ｉｎｃ．、５９ Ｔｅｍｐｌｅ Ｐｌａｃｅ − Ｓｕｉｔｅ ３３０、Ｂｏｓｔｏｎ、ＭＡ ０２１１１−１３０７、ＵＳＡ）。ｓｗｉｓｓｐｒｏｔ−ｔｒｅｍｂｌデータベース（「ｅｘｐａｓｙ．ｏｒｇ」のワールドワイドウェブ、Ｓｗｉｓｓ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ ｇｒｏｕｐ ＣＭＵ − １ ｒｕｅ Ｍｉｃｈｅｌ Ｓｅｒｖｅｔ ＣＨ−１２１１ Ｇｅｎｅｖａ ４、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）等の標準データベースを使用して、Ｈ−ＮＯＸタンパク質ファミリーのメンバーを同定することもできる。ＰｒｅｄｉｃｔＰｒｏｔｅｉｎ（６３０ Ｗｅｓｔ、１６８ Ｓｔｒｅｅｔ、ＢＢ２１７， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ． １００３２、ＵＳＡ）等の標準構造予測プログラムのデフォルト設定を使用して、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の二次および／または三次構造を予測することができる。あるいは、標準方法を使用して、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の実際の二次および／または三次構造を決定することができる。
一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸにおける次の遠位ポケット残基のいずれかと同じアミノ酸を対応する位置に有する：Ｔｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０、Ｌｅｕ１４４または上記の２種以上のいずれかの組合せ。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、そのアミノ酸配列の配列アライメントに基づき、それぞれＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＰｒｏ１１５またはＡｒｇ１３５の位置に対応する位置にプロリンまたはアルギニンを有する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｒ．ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸのＨｉｓ１０５に対応するヒスチジンを有する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、６個のアルファ−ヘリックスと、続く２個のベータ鎖と、続く１個のアルファ−ヘリックスと、続く２個のベータ鎖を含む二次構造を有するまたはそれを有すると予測される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質についてのこの二次構造が報告されている。
必要な場合、新たに同定されたＨ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインを試験して、これがヘムに結合するかどうかを、標準方法を使用して決定することができる。Ｏ２キャリアとして機能するＨ−ＮＯＸドメインの能力は、本明細書に記載されている方法等の標準方法を使用して、Ｈ−ＮＯＸドメインがＯ２に結合するかどうかを決定することにより試験することができる。必要な場合、本明細書に記載されている変異のうち１種または複数をＨ−ＮＯＸドメインに導入して、Ｏ２キャリアとしてのその特徴を最適化することができる。例えば、１個または複数の変異を導入して、酸素に対するそのＯ２解離定数ｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性または上記のうち２種以上のいずれかの組合せを変更することができる。本明細書に記載されている技法等の標準技法を使用して、これらのパラメータを測定することができる。
変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質
本明細書にさらに記述されている通り、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、対応する野生型タンパク質のＨ−ＮＯＸドメインと比較して、Ｏ２解離定数、酸素に対するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性または上記のうち２種以上のいずれかの組合せを変更する変異等、１個または複数の変異を含有することができる。一部の実施形態において、本発明は、Ｏ２解離定数、酸素に対するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性または上記のうち２種以上のいずれかの組合せを、対応する野生型タンパク質のそれと比較して、変更する変異等の１個または複数の変異を含有し得る１個または複数のＨ−ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。操作されたＨ−ＮＯＸドメインのパネルは、本明細書に提供されている教示を考慮して、本明細書に記載の、当業者に公知の技法を使用して、ランダム変異誘発と、続く必要なまたは所望の解離定数、解離速度、ＮＯ反応性、安定性、生理的適合性または上記のうち２種以上のいずれかの組合せに関する経験的スクリーニングによって作製することができる。あるいは、変異誘発は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の実験的に決定されるもしくは予測される三次元構造から明らかとなる遠位ポケット残基（特に、野生型および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質の配列に関して、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｏｎ， Ｅ． Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １巻：５３〜５９頁を参照）または配列アライメントから同定される進化的に保存された残基（特に、野生型および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質の配列に関して、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｏｎ Ｅ．Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １巻：５３〜５９頁を参照）等の特定の領域または残基を選択的に標的化することができる。
本発明の一部の実施形態において、変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の変異体Ｈ−ＮＯＸドメインは、自然に存在するいかなるＨ−ＮＯＸタンパク質またはドメインの配列とも異なる配列を有する。様々な実施形態において、変異体タンパク質のアミノ酸配列は、自然に存在するＨ−ＮＯＸタンパク質の対応する領域の配列に対し、少なくとも約１０、約１５、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、約６０、約７０、約８０、約９０、約９５、約９７、約９８、約９９または約９９．５％同一のうちいずれかである。様々な実施形態において、変異体タンパク質のアミノ酸配列は、自然に存在するＨ−ＮＯＸタンパク質の対応する領域の配列に対し、約１０〜２０％、２０〜３０％、３０〜４０％、４０〜５０％、５０〜６０％、６０〜７０％、７０〜８０％、８０〜９０％、９０〜９５％、９５〜９９％または９９．５％同一である。一部の実施形態において、変異体タンパク質は、全長タンパク質由来の少なくとも約２５、約５０、約７５、約１００約、１５０、約２００、約３００または約４００個の連続アミノ酸のうちいずれかを含有するタンパク質断片である。一部の実施形態において、変異体タンパク質は、全長タンパク質由来の２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜３００または３００〜４００個の連続アミノ酸を含有するタンパク質断片である。配列同一性は、例えば、配列解析ソフトウェアを使用して、それに指定されたデフォルトパラメータにより測定することができる（例えば、Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ ｏｆ ｔｈｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｅｎｔｅｒ、１７１０ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ａｖｅｎｕｅ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ ５３７０５）。このソフトウェアプログラムは、様々なアミノ酸置き換え、欠失、および他の改変に相同性の程度を割り当てることにより、類似の配列をマッチさせる。
本発明の一部の実施形態において、変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の変異体Ｈ−ＮＯＸドメインは、１個または複数のアミノ酸の挿入を含む（例えば、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の挿入）。本発明の一部の実施形態において、変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質または変異体Ｈ−ＮＯＸドメインは、１個または複数のアミノ酸の欠失を含む（例えば、少なくとも約５、約１０、約１５、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約３００個以上のアミノ酸のうちいずれかの欠失または５〜１０、１０〜１５、１５〜２５、２５〜５０、５０〜７５、７５〜１００、１００〜１５０、１５０〜２００、２００〜３００または３００〜４００個のアミノ酸の欠失等、Ｎ末端、Ｃ末端および／または内側残基の欠失）。本発明の一部の実施形態において、変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質または変異体Ｈ−ＮＯＸドメインは、１個または複数のアミノ酸の置き換え（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のアミノ酸の置き換え）、または上記のうち２種以上の組合せを含む。一部の実施形態において、変異体タンパク質は、自然に存在するタンパク質と比較して、少なくとも１個のアミノ酸変更を有する。一部の実施形態において、変異体核酸配列は、自然に存在するタンパク質と比較して、少なくとも１個のアミノ酸変更を有するタンパク質をコードする。一部の実施形態において、核酸は、自然に存在するタンパク質と同一のアミノ酸配列を有するタンパク質をコードする自然に存在する核酸の縮重バージョンではない。
一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインにおける変異は、進化的に保存された変異である（クラスＩ変異とも表される）。クラスＩ変異の例は、表１Ａに記載されている。表１Ａにおいて、変異は、ヒトβ１ Ｈ−ＮＯＸの配列に従って番号をつけられている／アノテートされているが、あらゆるＨ−ＮＯＸ配列に対し類似である。よって、他のいずれかのＨ−ＮＯＸタンパク質における対応する位置を表示の残基へと変異させることができる。例えば、ヒトβ１ Ｈ−ＮＯＸのＰｈｅ４をチロシンへと変異させることができるが、その理由として、他のＨ−ＮＯＸタンパク質が、この位置にチロシンを有するためである。他のいずれかのＨ−ＮＯＸタンパク質において、対応するフェニルアラニン残基をチロシンへと変異させることができる。特定の実施形態において、１個または複数の変異は、進化的に保存された残基に限定される。一部の実施形態において、１個または複数の変異は、少なくとも１個の進化的に保存された変異および少なくとも１個の進化的に保存されていない変異を含むことができる。必要な場合、これらの変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、本明細書に提供される教示を考慮して、ＮＯ／Ｏ２解離定数、ＮＯ反応性、安定性および生理的適合性に関する経験的スクリーニングに付される。
一部の実施形態において、変異は、アルファ−ヘリックスＡ、Ｄ、ＥまたはＧにおける残基の変異等の遠位ポケット変異である（Ｐｅｌｌｉｃｅｎａ， Ｐ．ら（２００４年８月３１日）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １０１巻（３５号）：１２８５４〜１２８５９頁）。例示的な遠位ポケット変異（クラスＩＩ変異とも表される）は、表１Ｂに記載されている。表１Ｂにおいて、変異は、ヒトβ１ Ｈ−ＮＯＸの配列に従って番号をつけられている／アノテートされているが、あらゆるＨ−ＮＯＸ配列に対して類似である。列挙された残基それぞれにおいて、いくつかの置換は生存可能な変異をもたらすため、示された位置それぞれにおける残基は、他のいずれかの天然または非天然起源のアミノ酸（「Ｘ」と表される）に交換することができる。このような変異は、種々の所望の親和性、安定性および反応性の特徴を有するＨ−ＮＯＸタンパク質を産生することができる。
特定の実施形態において、変異は、ヘム遠位ポケット変異である。本明細書に記載されている通り、Ｈ−ＮＯＸファミリーのＮＯ結合メンバーにおけるＯ２結合を防止する重大な分子決定要因は、ヘムの遠位ポケットにおけるＨ結合ドナーの欠如である。したがって、一部の実施形態において、変異は、遠位ポケット内のＨ−ＮＯＸドメインおよびリガンドの間のＨ結合を変更する。一部の実施形態において、変異は、遠位ポケットのＨ結合ドナーを破壊する、および／または対応する野生型Ｈ−ＮＯＸドメインと比べて低下したＯ２リガンド結合を付与する。例示的な遠位ポケット残基として、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＴｈｒ４、Ｉｌｅ５、Ｔｈｒ８、Ｔｒｐ９、Ｔｒｐ６７、Ａｓｎ７４、Ｉｌｅ７５、Ｐｈｅ７８、Ｐｈｅ８２、Ｔｙｒ１４０およびＬｅｕ１４４ならびに他のいずれかのＨ−ＮＯＸタンパク質における対応する残基が挙げられる。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、１個または複数の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４Ｆ変異に対応する。一部の実施形態において、遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４Ｆ変異である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、２個の遠位ポケット変異を含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異に対応する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異である。
遠位ポケットに存在しない残基も、ヘム基の三次元構造に影響を与え得る；この構造は次に、ヘム基における鉄へのＯ２およびＮＯの結合に影響を与える。したがって、一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質または重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインは、遠位ポケットを除く１個または複数の変異を有する。変異させることができるが遠位ポケットに存在しない残基の例として、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＰｒｏ１１５およびＡｒｇ１３５が挙げられる。一部の実施形態において、変異は、ヘム鉄にライゲーションする残基としてＨｉｓ１０５を含む近位ポケットに存在する。
一部の実施形態において、２個以上の変異が存在する場合；少なくとも１個の変異は、遠位ポケットに存在し、少なくとも１個の変異は、遠位ポケット以外にある（例えば、近位ポケットにおける変異）。一部の実施形態において、全変異が遠位ポケットに存在する。
ヒト以外の供給源に由来するＨ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインの免疫原性を低下させるために、Ｈ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインにおけるアミノ酸を、ヒトＨ−ＮＯＸにおける対応するアミノ酸へと変異させることができる。例えば、非ヒトＨ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインの三次構造の表面における１個または複数のアミノ酸を、ヒトＨ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインにおける対応するアミノ酸へと変異させることができる。一部の変種において、１個または複数の表面アミノ酸の変異は、２個以上の遠位ポケット残基の変異、遠位ポケットを除く１個もしくは複数の残基の変異（例えば、近位ポケットにおける変異）または上記のうち２種以上の組合せと組み合わせることができる。
本発明は、また、二重、三重またはより高次の多重変異等、本明細書に記載されている変異のいずれかの組合せに関する。例えば、本明細書に記載されている変異のいずれかの組合せは、同じＨ−ＮＯＸタンパク質で為すことができる。他の哺乳動物または非哺乳動物Ｈ−ＮＯＸタンパク質における均等な位置における変異も、本発明によって包含されることに留意されたい。例示的な変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質または変異体Ｈ−ＮＯＸドメインは、対応する野生型Ｈ−ＮＯＸドメインと比べて変更されたＯ２またはＮＯリガンド結合を付与し、生理学的に適合性の哺乳動物Ｏ２血液ガスキャリアとして働く（ｏｐｅｒａｔｉｖｅ）、１個または複数の変異を含む。
変異の残基番号は、記載されている特定のＨ−ＮＯＸタンパク質の配列における位置を示す。例えば、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｉ５Ａは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸの第５の位置における、アラニンによるイソロイシンの置き換えを指す。同じイソロイシンからアラニンへの変異は、他のいずれかのＨ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインにおける対応する残基において為され得る（この残基は、他のＨ−ＮＯＸタンパク質の配列における第５の残基であってもよいし、それでなくてもよい）。哺乳動物β１ Ｈ−ＮＯＸドメインのアミノ酸配列は、せいぜい２個のアミノ酸が異なるため、野生型ラットβ１ Ｈ−ＮＯＸタンパク質に導入されると望ましい変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインを産生する変異は、ヒト等、他の哺乳動物由来の野生型β１ Ｈ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインに導入されると望ましい変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインを産生するとも予想される。
一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインおよび３個のフォルドンドメインを含む三量体である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインおよび３個のフォルドンドメインを含む三量体である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ野生型Ｈ−ＮＯＸドメインおよび３個のフォルドンドメインを含む三量体である。
Ｈ−ＮＯＸタンパク質への改変
重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む、野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質のいずれかは、治療上または産業上の利用を増強するための標準方法を使用して改変および／または製剤化することができる。例えば、そして特に、異種の操作されたＨ−ＮＯＸタンパク質に適用される場合、架橋、ペグ化、炭水化物デコレーション等を含む、免疫監視機構からこのような薬剤を遮蔽するための種々の方法（特に、タンパク質の改変に関して、例えば、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｏｈｌｆｓ， Ｒ． Ｊ．ら（１９９８年５月１５日）Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ．２７３巻（２０号）：１２１２８〜１２１３４頁；Ｍｉｇｉｔａ， Ｒ．ら（１９９７年６月）Ｊ． Ａｐｐｌ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．８２巻（６号）：１９９５〜２００２頁；Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ， Ｋ． Ｄ．ら（２００４年８月１５日）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３８２巻（Ｐｔ １）：１８３〜１８９頁）と共に当業者に公知の他の技法が、当技術分野において公知である。ヒト血清アルブミン等のヒトタンパク質と、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質との融合は、血清半減期、粘性およびコロイド性膠質浸透圧を増加させることができる。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、その合成の最中または後に改変されて、その免疫原性を減少させる、および／またはその血漿保持時間を増加させる。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、カプセル封入することもできる（リポソームまたはナノ粒子内へのカプセル封入等）。
一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、例えば、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の精製を助ける、１個または複数のタグを含む。タグの例として、Ｈｉｓ６、ＦＬＡＧ、ＧＳＴおよびＭＢＰが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、１個または複数のＨｉｓ６タグを含む。１個または複数のＨｉｓ６タグは、例えば、エキソペプチダーゼ処理により、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の使用に先立ち除去することができる。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメイン、３個のフォルドンドメインおよび３個のＨｉｓ６タグを含む三量体である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメイン、３個のフォルドンドメインおよび３個のＨｉｓ６タグを含む三量体である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ野生型Ｈ−ＮＯＸドメイン、３個のフォルドンドメインおよび３個のＨｉｓ６タグを含む三量体である。
重合ドメイン
一部の態様において、本発明は、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインと、１個または複数の重合ドメインとを含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。重合ドメインは、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを連結して、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成するために使用される。１個または複数の重合ドメインは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の二量体、三量体、四量体、五量体等を産生するために使用することができる。Ｔ４バクテリオファージフィブリチンのフォルドン、Ａｒｃ、ＰＯＺ、コイルドコイルドメイン（ＧＣＮ４、ロイシンジッパー、Ｖｅｌｃｒｏを含む）、ウテログロビン、コラーゲン、３本鎖コイルドコイル（ｃｏｌｉｓ）（マトリリン−１）、トロンボスポリン、ＴＲＰＶ１−Ｃ、Ｐ５３、Ｍｎｔ、アビジン（ａｖａｄｉｎ）、ストレプトアビジン、Ｂｃｒ−Ａｂｌ、ＣＯＭＰ、ベロ毒素サブユニットＢ、ＣａｍＫＩＩ、ＲＣＫおよびＮエチルマレイミド感受性融合タンパク質由来のドメイン、ＳＴＭ３５４８、ＫａｉＣ、ＴｙｒＲ、Ｈｃｐ１、ＣｃｍＫ４、ＧＰ４１、炭疽菌防御抗原、アエロリジン、ａ−ヘモリジン、Ｃ４ｂ−結合タンパク質、Ｍｉ−ＣＫ、アリールスルファターゼ（ａｒｙｌｓｕｒｆａｔａｓｅ）Ａならびにウイルスカプシドタンパク質等、重合ドメインは、当技術分野において公知である。重合ドメインは、Ｈ−ＮＯＸドメインに共有結合または非共有結合により連結され得る。一部の実施形態において、複数の単量体サブユニット由来の重合ドメインが会合して、重合体型Ｈ−ＮＯＸドメインを形成するように、重合ドメインがＨ−ＮＯＸドメインに連結されて、単量体サブユニットを形成する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端が、重合ドメインのＮ末端に連結される。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端が、重合ドメインのＮ末端に連結される。さらに他の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔ）において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端が、重合ドメインのＣ末端に連結される。一部の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔ）において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端が、重合ドメインのＣ末端に連結される。
リンカーを使用して、重合ドメインをＨ−ＮＯＸドメインに繋ぐことができる。例えば、例えば、アミノ酸リンカー。一部の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のアミノ酸のうちいずれか１種を含むリンカーを重合ドメインおよびＨ−ＮＯＸドメインの間に置くことができる。例示的なリンカーとして、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＧｌｙリンカーおよびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーが挙げられるがこれらに限定されない。
バクテリオファージＴ４フィブリチン三量体形成ドメイン
例示的な重合ドメインは、バクテリオファージＴ４のフォルドンドメインである。バクテリオファージＴ４由来のｗａｃ遺伝子は、Ｃ末端三量体形成ドメイン（残基４５７〜４８３）を有する４８６アミノ酸のタンパク質である、フィブリチンタンパク質をコードする（Ｅｆｉｍｏｖ， Ｖ． Ｐ．ら（１９９４年）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２４２巻：４７０〜４８６頁）。このドメインは、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方でフィブリチンを三量体形成させることができる（Ｂｏｕｄｋｏ， Ｓ． Ｐ．ら（２００２年）Ｅｕｒ Ｊ Ｂｉｏｃｈｅｍ ２６９巻：８３３〜８４１頁；Ｌｅｔａｒｏｖ， Ａ． Ｖ．，ら（１９９９年）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ （Ｍｏｓｃ）６４巻：８１７〜８２３頁；Ｔａｏ， Ｙ．，ら（１９９７年）Ｓｔｒｕｃｔｕｅ ５巻：７８９〜７９８頁）。多くの場合「フォルドンドメイン」と称される、単離された２７残基の三量体形成ドメインは、多数の異なるタンパク質においてキメラ三量体の構築に使用されてきた（ＨＩＶ外被糖タンパク質（Ｙａｎｇ， Ｘ．ら（２００２年）Ｊ Ｖｉｒｏｌ ７６巻：４６３４〜４６４２頁）、アデノウイルスアドヘシン（Ｐａｐａｎｉｋｏｌｏｐｏｕｌｏｕ， Ｋ．，ら（２００４年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９巻：８９９１〜８９９８頁；Ｐａｐａｎｉｋｏｌｏｐｏｕｌｏｕ， Ｋ．ら（２００４年）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３４２巻：２１９〜２２７頁）、コラーゲン（Ｚｈａｎｇ， Ｃ．，ら（２００９年）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｐｒｏｇ ２５巻：１６６０〜１６６８頁）、ファージＰ２２ ｇｐ２６（Ｂｈａｒｄｗａｊ， Ａ．，ら（２００８年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １７巻：１４７５〜１４８５頁）および狂犬病ウイルス糖タンパク質（Ｓｉｓｓｏｅｆｆ， Ｌ．，ら（２００５年）Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ ８６巻：２５４３〜２５５２頁）を含む）。フォルドンドメインの例示的な配列を図１に示し、配列番号４に提示する。
単離されたフォルドンドメインは、単一のβ−ヘアピン構造へと折り畳まれ、３個のヘアピンを含むβ−プロペラ構造へと三量体形成する（Ｇｕｔｈｅ， Ｓ．ら（２００４年）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３７巻：９０５〜９１５頁）。フォルドンドメイン単独の構造は、ＮＭＲによって決定され（Ｇｕｔｈｅ， Ｓ．ら（２００４年）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３７巻：９０５〜９１５頁）、フォルドンドメインにより三量体形成した数種のタンパク質の構造は、Ｘ線結晶学によって解析した（Ｐａｐａｎｉｋｏｌｏｐｏｕｌｏｕ， Ｋ．，ら、（２００４年）Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２７９巻：８９９１〜８９９８頁；Ｓｔｅｔｅｆｅｌｄ， Ｊ．ら（２００３年）Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ １１巻：３３９〜３４６頁；Ｙｏｋｏｉ， Ｎ．ら（２０１０年）Ｓｍａｌｌ ６巻：１８７３〜１８７９頁）。このドメインは、迅速に折り畳まれ、三量体形成し、ミスフォールディング中間体または経路を外れた（ｏｆｆ−ｐａｔｈｗａｙ）オリゴマー形成産物の機会を低下させる（Ｇｕｔｈｅ， Ｓ．ら（２００４年）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３３７巻：９０５〜９１５頁）。フォルドンドメインは、非常に安定的であり、＞１０％ＳＤＳ、６．０Ｍ塩酸グアニジンまたは８０℃において三次構造およびオリゴマー形成を維持することができ（Ｂｈａｒｄｗａｊ， Ａ．，ら（２００８年）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ １７巻：１４７５〜１４８５頁；Ｂｈａｒｄｗａｊ， Ａ．，ら（２００７年）Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ３７１巻：３７４〜３８７頁）、フォルドンドメインに融合された配列の安定性を改善することができる（Ｄｕ， Ｃ．ら（２００８年）Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ７９巻：１９５〜２０２頁）。
一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、フォルドンドメインのＮ末端に連結される。他の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、フォルドンドメインのＮ末端に連結される。さらに他の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔ）において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、フォルドンドメインのＣ末端に連結される。一部の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔ）において、Ｈ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、フォルドンドメインのＣ末端に連結される。
一部の実施形態において、リンカーが使用されて、フォルドンドメインをＨ−ＮＯＸドメインに繋ぐ。一部の実施形態において、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のアミノ酸のうちいずれか１種を含むリンカーを、重合ドメインおよびＨ−ＮＯＸドメインの間に置くことができる。例示的なリンカーとして、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−ＧｌｙおよびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカーが挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端へと：Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカーおよびフォルドンドメインを含む、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。一部の実施形態において、本発明は、Ｎ末端からＣ末端へと：Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー、フォルドンドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒアミノ酸リンカーおよびＨｉｓ６タグを含む、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｌ１４４Ｆ変異を含む。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｗ９Ｆ変異およびＬ１４４Ｆ変異を含む。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインは、野生型Ｈ−ＮＯＸドメインである。
単量体型Ｈ−ＮＯＸドメインサブユニット
一態様において、本発明は、会合して、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成することができる、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質（即ち、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の単量体型Ｈ−ＮＯＸサブユニット）を提供する。一部の実施形態において、本発明は、本明細書に記載されているＨ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質を提供する。Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインは、共有結合により連結または非共有結合により連結され得る。一部の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＮ末端に連結される。他の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＮ末端に連結される。さらに他の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔ）において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、重合ドメインのＣ末端に連結される。一部の実施形態（ｅｍｏｄｉｍｅｎｔ）において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＨ−ＮＯＸドメインのＮ末端は、重合ドメインのＣ末端に連結される。一部の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、グアニリルシクラーゼドメインを含まない。
一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、野生型Ｈ−ＮＯＸドメインを含む。本発明の一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインに１個または複数の変異を含む。一部の実施形態において、１個または複数の変異は、Ｏ２解離定数、酸素に対するｋｏｆｆ、ヘム自動酸化の速度、ＮＯ反応性、ＮＯ安定性（ｓｔａｂｉｌｔｙ）または上記のうち２種以上のいずれかの組合せを、対応する野生型Ｈ−ＮＯＸドメインのそれと比較して、変更する。一部の実施形態において、変異は、遠位ポケット変異である。一部の実施形態において、変異は、遠位ポケットに存在しない変異を含む。一部の実施形態において、遠位ポケット変異は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＬ１４４変異に対応する（例えば、Ｌ１４４Ｆ変異）。一部の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＷ９およびＬ１４４変異に対応する２個の遠位ポケット変異を含む（例えば、Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異）。
一部の態様において、本発明は、会合して三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成する、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。一部の実施形態において、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび三量体形成ドメインを含む。一部の実施形態において、三量体形成ドメインは、本明細書に記述されているフォルドンドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、フォルドンドメインのＮ末端に共有結合により連結される。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインのＣ末端は、フォルドンドメインのＣ末端に共有結合により連結される。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓドメインは、Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓドメインは、Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓドメインは、野生型Ｈ−ＮＯＸドメインである。
一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、アミノ酸リンカー配列を使用して、重合ドメインに共有結合により連結される。一部の実施形態において、アミノ酸リンカー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のアミノ酸の長さである。例示的なアミノ酸リンカー配列として、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列およびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＨ−ＮＯＸドメインおよび３個の三量体形成配列を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であり、Ｈ−ＮＯＸドメインは、アミノ酸リンカー配列を介して三量体形成ドメインに共有結合により連結されている。一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、次のものを含む：Ｌ１４４Ｆ Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列およびフォルドンドメイン。一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、次のものを含む：Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列およびフォルドンドメイン。一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、次のものを含む：野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列およびフォルドンドメイン。
一部の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、タグ；例えば、Ｈｉｓ６、ＦＬＡＧ、ＧＳＴまたはＭＢＰタグを含む。一部の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｈｉｓ６タグを含む。一部の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、タグを含まない。一部の実施形態において、タグ（例えば、Ｈｉｓ６タグ）は、アミノ酸スペーサー配列を使用して、重合ドメインに共有結合により連結される。一部の実施形態において、アミノ酸リンカー配列は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０または１１個以上のアミノ酸の長さである。例示的なアミノ酸リンカー配列として、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ配列およびＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ配列が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個のＨ−ＮＯＸドメイン、３個の三量体形成配列および３個のＨｉｓ６タグを含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であり、Ｈ−ＮＯＸドメインは、アミノ酸リンカー配列を介して三量体形成ドメインに共有結合により連結されており、三量体形成ドメインは、アミノ酸リンカー配列を介してＨｉｓ６タグに共有結合により連結されている。一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、次のものを含む：Ｌ１４４Ｆ Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列およびＨｉｓ６タグ。一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、次のものを含む：Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列およびＨｉｓ６タグ。一部の実施形態において、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｎ末端からＣ末端へと、次のものを含む：野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列およびＨｉｓ６タグ。
一部の実施形態において、組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、配列番号６、配列番号８、配列番号１０または配列番号１２のアミノ酸配列を含む。
野生型および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質の特徴
本明細書に記載されている通り、様々なＮＯおよびＯ２解離定数、Ｏ２ ｋｏｆｆ、ＮＯ反応性および安定性をもたらす、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む多数の多様なＨ−ＮＯＸ変異体タンパク質が作製された。実働性の血液ガスキャリアを提供するために、Ｈ−ＮＯＸタンパク質を使用して、ヘモグロビン等の内在性Ｏ２キャリアを機能的に置き換えるまたは補充することができる。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質等のＨ−ＮＯＸタンパク質は、放射線療法または化学療法に対するアジュバントとして、低酸素腫瘍組織（例えば、神経膠芽腫）へのＯ２の送達に使用される。したがって、一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘモグロビン等の内在性Ｏ２キャリアと比較して、同様のまたは改善されたＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合に対する解離定数、ＮＯ安定性、ＮＯ反応性、自動酸化速度、血漿保持時間または上記のうち２種以上のいずれかの組合せを有する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であり、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であり、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であり、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質のＯ２に対するｋｏｆｆは、約０．１〜約２００ｓ−１、約０．１〜１００ｓ−１、約１．０〜約１６．０ｓ−１、約１．３５〜約２３．４ｓ−１、約１．３４〜約１８ｓ−１、約１．３５〜約１４．５ｓ−１、約０．２１〜約２３．４ｓ−１、約１．３５〜約２．９ｓ−１、約２〜約３ｓ−１、約５〜約１５ｓ−１または約０．１〜約１ｓ−１等、２０℃において約０．０１〜約２００ｓ−１の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、２０℃において約０．６５ｓ−１以下の酸素に対するｋｏｆｆを有する（２０℃における約０．２１ｓ−１〜約０．６５ｓ−１の間等）。
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質のＯ２に対するｋｏｎは、約６〜約６０μＭ−１ｓ−１、約６〜１２μＭ−１ｓ−１、約１５〜約６０μＭ−１ｓ−１、約５〜約１８μＭ−１ｓ−１または約６〜約１５μＭ−１ｓ−１等、２０℃において約０．１４〜約６０μＭ−１ｓ−１の間である。
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質によるＯ２結合に対する動力学的ＫＤまたは計算されたＫＤは、約１ｎＭ〜１ｍＭ、約１μＭ〜約１０μＭまたは約１０μＭ〜約５０μＭの間である。一部の実施形態において、Ｏ２結合に対する計算されたＫＤは、２０℃において約２ｎＭ〜約２μＭ、約２μＭ〜約１ｍＭ、約１００ｎＭ〜約１μＭ、約９μＭ〜約５０μＭ、約１００μＭ〜約１ｍＭ、約５０ｎＭ〜約１０μＭ、約２ｎＭ〜約５０μＭ、約１００ｎＭ〜約１．９μＭ、約１５０ｎＭ〜約１μＭまたは約１００ｎＭ〜約２５５ｎＭ、約２０ｎＭ〜約２μＭ、２０ｎＭ〜約７５ｎＭ、約１μＭ〜約２μＭ、約２μＭ〜約１０μＭ、約２μＭ〜約９μＭまたは約１００ｎＭ〜５００ｎＭのうちいずれか１種である。一部の実施形態において、Ｏ２結合に対する動力学的ＫＤまたは計算されたＫＤは、２０℃において約１００ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約５０ｎＭ未満、約３０ｎＭ未満、約２５ｎＭ未満、約２０ｎＭ未満または約１０ｎＭ未満のうちいずれかである。
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質によるＯ２結合に対する動力学的ＫＤまたは計算されたＫＤは、同じ条件下における（２０℃等）ヘモグロビンのそれの約０．１〜約１０倍の間または約０．５〜約２倍の間等、同じ条件下における（２０℃等）ヘモグロビンのそれの約０．０１〜約１００倍以内である。様々な実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質によるＮＯ結合に対する動力学的ＫＤまたは計算されたＫＤは、同じ条件下における（２０℃等）ヘモグロビンのそれの約０．１〜約１０倍の間または約０．５〜約２倍の間等、同じ条件下における（２０℃等）ヘモグロビンのそれの約０．０１〜約１００倍以内である。
一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質の約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約１０％未満または約５％未満のうちいずれかは、２０℃における約１、約２、約４、約６、約８、約１０、約１５または約２０時間のうちいずれかのインキュベーション後に酸化される。
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃における約６００ｓ−１、５００ｓ−１、４００ｓ−１、３００ｓ−１、２００ｓ−１、１００ｓ−１、７５ｓ−１、５０ｓ−１、２５ｓ−１、２０ｓ−１、１０ｓ−１、５０ｓ−１、３ｓ−１、２ｓ−１、１．８ｓ−１、１．５ｓ−１、１．２ｓ−１、１．０ｓ−１、０．８ｓ−１、０．７ｓ−１または０．６ｓ−１未満等、２０℃における約７００ｓ−１未満である。様々な実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃における約０．５〜約４００ｓ−１、約０．５〜約１００ｓ−１、約０．５〜約５０ｓ−１、約０．５〜約１０ｓ−１、約１〜約５ｓ−１または約０．５〜約２．１ｓ−１の間等、２０℃における約０．１〜約６００ｓ−１の間である。様々な実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の反応性は、２０℃において等の同じ条件下におけるヘモグロビンのそれよりも少なくとも約１０、１００、１，０００または１０，０００倍低い。
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、３７Ｃにおける約０．９ｈ−１未満、約０．８ｈ−１未満、約０．７ｈ−１未満、約０．６ｈ−１未満、約０．５ｈ−１未満、約０．４ｈ−１未満、約０．３ｈ−１未満、約０．２ｈ−１未満、約０．１ｈ−１未満または約０．０５ｈ−１未満のうちいずれか等、３７℃における約１．０ｈ−１未満である。様々な実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、３７℃における約０．００６〜約１．０ｈ−１、０．００６〜約０．９ｈ−１または約０．０６〜約０．５ｈ−１等、３７℃における約０．００６〜約５．０ｈ−１の間である。
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、（ａ）Ｏ２またはＮＯ解離定数、会合速度（Ｏ２またはＮＯに対するｋｏｎ）または解離速度（Ｏ２またはＮＯに対するｋｏｆｆ）がヘモグロビンのそれの２桁以内である、（ｂ）ＮＯ親和性が、それぞれｓＧＣ β１のＮＯ親和性よりも弱い（例えば、少なくとも約１０倍、１００倍または１０００倍弱い）、（ｃ）結合したＯ２とのＮＯ反応性が、ヘモグロビンよりも少なくとも１０００倍低い、（ｄ）ｉｎ ｖｉｖｏ血漿保持時間が、ヘモグロビンのｉｎ ｖｉｖｏ血漿保持時間よりも少なくとも２、１０、１００または１０００倍高い、あるいは（ｅ）上記のうち２種以上のいずれかの組合せを有する。
例示的な適したＯ２キャリアは、ヘモグロビンの解離定数の２桁以内、即ち、ヘモグロビンの解離定数の約０．１〜１０倍の間または約０．５〜２倍の間等、約０．０１〜１００倍の間の解離定数をもたらす。本明細書に記載されている技法（特に解離定数の測定に関して、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｏｎ， Ｅ． Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．１巻：５３〜５９頁；Ｂｏｏｎ， Ｅ． Ｍ．ら（２００５年１０月）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．９巻（５号）：４４１〜４４６頁；Ｂｏｏｎ， Ｅ． Ｍ．ら（２００５年）Ｊ． Ｉｎｏｒｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９巻（４号）：８９２〜９０２頁）、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ， Ｋ． Ｄ．ら（２００４年８月１５日）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３８２巻（Ｐｔ １）：１８３〜１８９頁）と共に当業者に公知の技法等、種々の確立された技法を使用して、解離定数を定量化することができる。例示的なＯ２キャリアは、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも低いＮＯ反応性等、結合したＯ２を有するＨ−ＮＯＸタンパク質の低いまたは最小化されたＮＯ反応性をもたらす。一部の実施形態において、上記ＮＯ反応性は、ヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも約１０、１００、１，０００または１０，０００倍低い等、さらにより低い。種々の確立された技法（特にＮＯ反応性の測定に関して、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｏｎ， Ｅ． Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．１巻：５３〜５９頁；Ｂｏｏｎ， Ｅ． Ｍ．ら（２００５年１０月）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．９巻（５号）：４４１〜４４６頁；Ｂｏｏｎ， Ｅ． Ｍ．ら（２００５年）Ｊ． Ｉｎｏｒｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９巻（４号）：８９２〜９０２頁）、Ｖａｎｄｅｇｒｉｆｆ， Ｋ． Ｄ．ら（２００４年８月１５日）Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ．３８２巻（Ｐｔ １）：１８３〜１８９頁）と共に当業者に公知の技法を使用して、ＮＯ反応性を定量化することができる。野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸは、このように低いＮＯ反応性を有するため、他の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質も同様の低いＮＯ反応性を有し得る。例えば、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ Ｙ１４０Ｈは、野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＮＯ反応性と同様のＮＯ反応性を有する。
加えて、適したＯ２キャリアは、高いまたは最大化された安定性、特に、ｉｎ ｖｉｖｏ安定性をもたらす。酸化的安定性（例えば、自動酸化またはＮＯによる酸化に対する安定性）、温度安定性およびｉｎ ｖｉｖｏ安定性等、種々の安定性測定基準（ｍｅｔｒｉｃ）を使用することができる。本明細書に記載されている技法（Ｂｏｏｎ， Ｅ． Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．１巻：５３〜５９頁；Ｂｏｏｎ， Ｅ． Ｍ．ら（２００５年１０月）Ｃｕｒｒ． Ｏｐｉｎ． Ｃｈｅｍ． Ｂｉｏｌ．９巻（５号）：４４１〜４４６頁；Ｂｏｏｎ， Ｅ． Ｍ．ら（２００５年）Ｊ． Ｉｎｏｒｇ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．９９巻（４号）：８９２〜９０２頁）と共に当業者に公知の技法等、種々の確立された技法を使用して、安定性を定量化することができる。血漿、血液または組織におけるｉｎ ｖｉｖｏ安定性に関して、安定性の例示的な測定基準は、保持時間、クリアランスの速度および半減期を含む。好熱性生物由来のＨ−ＮＯＸタンパク質は、高温で安定的であると予想される。様々な実施形態において、血漿保持時間は、ヘモグロビンの血漿保持時間よりも少なくとも約２、１０、１００または１０００倍長い（例えば、Ｂｏｂｏｆｃｈａｋ， Ｋ． Ｍ．ら（２００３年８月）Ａｍ． Ｊ． Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｈｅａｒｔ Ｃｉｒｃ． Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８５巻（２号）：Ｈ５４９〜Ｈ５６１）。当業者に認められる通り、ヘモグロビンに基づく代用血液は、血漿から無細胞ヘモグロビンを除去するヘモグロビンの受容体の存在による、血漿からの無細胞ヘモグロビンの急速なクリアランスによって制限される。血漿にはＨ−ＮＯＸタンパク質の受容体が存在しないため、野生型および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘモグロビンの血漿保持時間よりも長い血漿保持時間を有すると予想される。所望の場合、標準方法（本明細書に記載されている方法および当業者に公知の方法等）を使用して、Ｈ−ＮＯＸタンパク質をペグ化もしくは架橋することまたはＨ−ＮＯＸタンパク質を別のタンパク質と融合させることにより、血漿保持時間を増加させることができる。
様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質は、２０℃における約１ｎＭ〜約１ｍＭの間のＯ２解離定数および２０℃等の同じ条件下におけるヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも約１０倍低いＮＯ反応性を有する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、２０℃における約１ｎＭ〜約１ｍＭの間のＯ２解離定数および２０℃における約７００ｓ−１未満のＮＯ反応性（例えば、２０℃における約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１または１．８ｓ−１未満）を有する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘモグロビンのＯ２解離定数の２桁以内のＯ２解離定数および２０℃等の同じ条件下におけるヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも約１０倍低いＮＯ反応性を有する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、２０℃における約０．０１〜約２００ｓ−１の間の、酸素に対するｋｏｆｆおよび２０℃等の同じ条件下におけるヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも約１０倍低いＮＯ反応性を有する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、２０℃における約０．６５ｓ−１未満の、酸素に対するｋｏｆｆ（２０℃における約０．２１ｓ−１〜約０．６４ｓ−１の間等）および２０℃等の同じ条件下におけるヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも約１０倍低いＮＯ反応性を有する。本発明の一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、約１ｎＭ〜約１μＭ（１０００ｎＭ）、約１μＭ〜約１０μＭまたは約１０μＭ〜約５０μＭの間である。特定の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃における約２ｎＭ〜約５０μＭ、約５０ｎＭ〜約１０μＭ、約１００ｎＭ〜約１．９μＭ、約１５０ｎＭ〜約１μＭまたは約１００ｎＭ〜約２５５ｎＭの間である。様々な実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃における約２０ｎＭ〜約７５ｎＭの間等、２０℃における約８０ｎＭ未満である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃等の同じ条件下におけるヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも約１００倍低いまたは約１，０００倍低い。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃における約６００ｓ−１、５００ｓ−１、４００ｓ−１、３００ｓ−１、２００ｓ−１、１００ｓ−１、７５ｓ−１、５０ｓ−１、２５ｓ−１、２０ｓ−１、１０ｓ−１、５０ｓ−１、３ｓ−１、２ｓ−１、１．８ｓ−１、１．５ｓ−１、１．２ｓ−１、１．０ｓ−１、０．８ｓ−１、０．７ｓ−１または０．６ｓ−１未満等、２０℃における約７００ｓ−１未満である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、約０．１〜約２００ｓ−１、約０．１〜１００ｓ−１、約１．３５〜約２３．４ｓ−１、約１．３４〜約１８ｓ−１、約１．３５〜約１４．５ｓ−１、約０．２１〜約２３．４ｓ−１、約２〜約３ｓ−１、約５〜約１５ｓ−１または約０．１〜約１ｓ−１等、２０℃における０．０１〜２００ｓ−１の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数は、２０℃における約１００ｎＭ〜約１．９μＭの間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃における約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、約０．９ｈ−１未満、約０．８ｈ−１未満、約０．７ｈ−１未満、約０．６ｈ−１未満、約０．５ｈ−１未満、約０．４ｈ−１未満、約０．３ｈ−１未満、約０．２ｈ−１未満または約０．１ｈ−１未満のうちいずれか等、３７℃における約１ｈ−１未満である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃における約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、３７℃における約１ｈ−１未満である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆは、２０℃における約１．３５ｓ−１〜約１４．５ｓ−１の間であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃における約７００ｓ−１未満である（例えば、２０℃における約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１または１．８ｓ−１未満）。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度は、３７℃における約１ｈ−１未満であり、Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性は、２０℃における約７００ｓ−１未満である（例えば、２０℃における約６００ｓ−１、５００ｓ−１、１００ｓ−１、２０ｓ−１または１．８ｓ−１未満）。
一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質溶液を含むＨ−ＮＯＸタンパク質溶液の粘性は、１〜４センチポアズ（ｃＰ）の間である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質溶液のコロイド膠質浸透圧は、２０〜５０ｍｍＨｇの間である。
Ｏ２および／またはＮＯ結合の測定
当業者であれば、当技術分野において公知の方法および後述する非限定的な例示的な方法によって、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質等、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むいずれかのＨ−ＮＯＸタンパク質の酸素および一酸化窒素結合の特徴を容易に決定することができる。
動力学的ＫＤ：ｋｏｆｆのｋｏｎに対する比
重合体型Ｈ−ＮＯＳタンパク質を含む野生型および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質の動力学的ＫＤ値は、特にＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合に対する解離定数、自動酸化速度およびＮＯ解離速度の測定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｏｎ， Ｅ．Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １巻：５３〜５９頁に本質的に記載されている通りに決定される。
ｋｏｎ（Ｏ２会合速度）
ヘムへのＯ２会合は、２０℃において閃光光分解を使用して測定される。非常に速い対再結合動力学の結果としてのＦｅＩＩ−Ｏ２複合体を閃光除去する（ｆｌａｓｈ ｏｆｆ）ことは不可能である；よって、ＦｅＩＩ−ＣＯ複合体は、５６０ｎｍのレーザー光による閃光光分解に付され（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）、５配位ＦｅＩＩ中間体を産生し、これに対し、分子Ｏ２の結合が様々な波長で追跡される。タンパク質試料は、１０ｍＭ亜ジチオン酸塩による嫌気的還元と、続くＰＤ−１０カラム（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ， Ｉｎｃ．、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）における脱塩によって作製される。次に、１００μＬ〜１ｍＬサイズで１ｃｍ路長のガス制御（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ａｔｍｏｓｐｈｅｒｅ）石英キュベット内で５０ｍＭ ＴＥＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５バッファーにおける２０μＭヘムへと試料を希釈する。このキュベットのヘッドスペースを通して１０分間ＣＯガスを流動させて、ＦｅＩＩ−ＣＯ複合体を形成させ、この形成をＵＶ−可視分光法により確かめる（ソーレー最大４２３ｎｍ）。次に、この試料は、１気圧のＣＯガス下のままで閃光光分解後のＣＯ−再結合動態の測定に使用される、あるいは開放して、空気中で３０分間撹拌して、閃光光分解前にバッファーを完全に酸素化して、Ｏ２再結合事象を観察する。ヘムへのＯ２会合は、時間に対して複数の波長でモニターされる。Ｉｇｏｒ Ｐｒｏソフトウェア（Ｗａｖｅｍｅｔｒｉｃｓ， Ｉｎｃ．、Ｏｓｗｅｇｏ、ＯＲ；最新２００５年バージョン）を使用した単一指数関数により、これらのトレースを適合させる。この速度は、観察波長に非依存性であるが、Ｏ２濃度に依存性である。全体を通してＵＶ−可視分光法が使用されて、あらゆる複合体および中間体を確認する（Ｃａｒｙ ３Ｋ、Ｖａｒｉａｎ， Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）。特に機器使用に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｄｍｏｃｈｏｗｓｋｉ， Ｉ． Ｊ．ら（２０００年８月３１日）Ｊ Ｉｎｏｒｇ Ｂｉｏｃｈｅｍ．８１巻（３号）：２２１〜２２８頁に記載されている機器を使用して、一過性吸収データが収集される。この機器は、２０ｎｓの応答時間を有し、データは２００メガ試料ｓ−１でデジタル化される。
ｋｏｆｆ（Ｏ２解離速度）
ｋｏｆｆを測定するために、タンパク質（５μＭヘム）のＦｅＩＩ−Ｏ２複合体を嫌気的５０ｍＭ ＴＥＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５バッファーに希釈し、様々な濃度の亜ジチオン酸塩および／または飽和ＣＯガスを含有する等体積の同じバッファー（嫌気的）と迅速に混合する。２０℃に設定したＮｅｓｌａｂ ＲＴＥ−１００恒温槽を備えるＨＩ−ＴＥＣＨ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＦ−６１ストップトフロー分光光度計においてデータを取得する（ＴＧＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＤ．、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｏｎ Ａｖｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）。４３７ｎｍ（ＦｅＩＩ−ＦｅＩＩ−Ｏ２差スペクトルにおける最大）、または４２５ｎｍ（ＦｅＩＩ−ＦｅＩＩ−ＣＯ差スペクトルにおける最大）における吸光度の増加として、ヘムからのＯ２の解離をモニターする。機器の一部であるソフトウェアを使用して、最終トレースを単一指数関数に適合させる。各実験を最小で６回行い、得られた速度を平均化する。測定された解離速度は、亜ジチオン酸塩濃度に非依存性であり、１０ｍＭ亜ジチオン酸塩の存在および非存在の両方において、還元種のトラップとしての飽和ＣＯに非依存性である。
動力学的ＫＤ
動力学的ＫＤは、上述のｋｏｆｆおよびｋｏｎの測定値を使用して、ｋｏｆｆのｋｏｎに対する比を計算することにより決定される。
計算されたＫＤ
計算されたＫＤを測定するために、上述の通りに得られるｋｏｆｆおよび動力学的ＫＤの値をグラフにする。ｋｏｆｆおよび動力学的ＫＤの間の直線関係性は、等式（ｙ＝ｍｘ＋ｂ）によって定義される。次に、Ｅｘｃｅｌ：ＭＡＣ ２００４（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）を使用して、ｋｏｆｆ値を線に沿って内挿して、計算されたＫＤを導く。測定されたｋｏｎの非存在下において、この内挿は、ｋｏｆｆをＫＤに関係付ける仕方をもたらす。
自動酸化の速度
自動酸化の速度を測定するために、タンパク質試料を嫌気的に還元し、続いて好気的５０ｍＭ ＴＥＡ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５バッファーにおける５μＭヘムへと希釈した。次に、３７℃に設定したＮｅｓｌａｂ ＲＴＥ−１００恒温槽を備えるＣａｒｙ ３Ｅ分光光度計において、これらの試料をインキュベートし、定期的に走査する（Ｃａｒｙ ３Ｅ、Ｖａｒｉａｎ， Ｉｎｃ．、Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ、ＣＡ）。自動酸化の速度は、Ｅｘｃｅｌ：ＭＡＣ ２００４（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ＷＡ）を使用して、時間に対してプロットされ、単一指数関数と適合されたＦｅＩＩＩ−ＦｅＩＩ差スペクトルの最大および最小の間の差から決定される。
ＮＯとの反応速度
ＮＯ反応性は、バッファーＡにおいて２μＭとなるよう調製された精製タンパク質（Ｈ−ＮＯＸ、重合体型Ｈ−ＮＯＸ、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓヘモグロビン（Ｈｓ Ｈｂ）等）およびバッファーＡにおいて２００μＭとなるよう調製されたＮＯを使用して測定される（バッファーＡ：５０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ７．５、５０ｍＭ ＮａＣｌ）。２０℃に設定したＮｅｓｌａｂ ＲＴＥ−１００恒温槽を備えるＨＩ−ＴＥＣＨ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＳＦ−６１ストップトフロー分光光度計において、データを取得する（ＴＧＫ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ＬＴＤ．、Ｂｒａｄｆｏｒｄ Ｏｎ Ａｖｏｎ、Ｕｎｉｔｅｄ Ｋｉｎｇｄｏｍ）。０．００１２５秒の積分時間を伴い、タンパク質をＮＯと１：１比で迅速に混合する。ＮＯによる酸化の律速段階を本質的に測定して、分光計の一部であるソフトウェアを使用して、最大変化の波長を単一指数関数に適合させる。反応の最終産物は、ＨＮＯＸタンパク質に関しては三価鉄（ｆｅｒｒｉｃ）−ＮＯであり、Ｈｓ Ｈｂに関しては三価鉄−水和（ａｑｕｏ）である。
ｐ５０測定
所望の場合、特にｐ５０値の測定に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｇｕａｒｎｏｎｅ， Ｒ．ら（１９９５年９月／１０月）Ｈａｅｍａｔｏｌｏｇｉｃａ ８０巻（５号）：４２６〜４３０頁に記載されている通り、変異体または野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のｐ５０値を測定することができる。ｐ５０値は、ＨｅｍＯｘ分析計を使用して決定される。測定チャンバーは、０％酸素で開始し、１００％酸素に向けてゆっくりと徐々に上げる。チャンバーにおける酸素プローブは、酸素飽和％を測定する。第２のプローブ（ＵＶ−Ｖｉｓ光）は、ヘムタンパク質（例えば、ヘムと複合体形成したＨ−ＮＯＸ等のタンパク質）ＵＶ−Ｖｉｓスペクトルのアルファおよびベータピークに調整される、吸収の２波長を測定する。これらの吸収ピークは、ヘムタンパク質が酸素に結合するにつれて直線的に増加する。次に、非結合から１００％結合へのパーセント変化を％酸素値に対しプロットして、曲線を作成する。ｐ５０は、ヘムタンパク質の５０％が酸素に結合する、曲線上の点である。
詳細には、Ｈｅｍｏｘ分析計（ＴＣＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｎｅｗ Ｈｏｐｅ、ＰＡ）は、５０μＬの血液またはヘムタンパク質を増加する酸素分圧に曝露し、これを窒素ガスで脱酸素化することにより、オキシヘムタンパク質解離曲線（ＯＤＣ）を決定する。Ｃｌａｒｋ酸素電極は、酸素圧の変化を検出し、これをｘ−ｙ記録計のｘ軸に記録する。５６０ｎｍおよび５７６ｎｍの二重波長分光光度法によって、得られたオキシヘムタンパク質画分の増加を同時にモニターし、ｙ軸に表示する。前内側（ａｎｔｅｍｅｄｉａｌ）静脈から血液試料を採取し、ヘパリンで抗凝固剤処置し、アッセイするまで湿った氷上で４℃にて維持する。溶液のｐＨを７．４±０．０１の値に維持する製造業者提供のバッファーである５μＬのＨｅｍｏｘ溶液に、５０μＬの全血を希釈する。Ｈｅｍｏｘ分析計の一部であるキュベットに試料−バッファーを引き入れ、混合物の温度を平衡化し、３７℃にする；次に、試料を空気により１００％まで酸素化する。ｐＯ２値の調整後に、試料を窒素で脱酸素化する；脱酸素化プロセスの間に、曲線をグラフ用紙に記録する。Ｈｅｍｏｘ分析計の一部であるソフトウェアを使用して、Ｏ２飽和が５０％である点として、Ｐ５０値をｘ軸に外挿する。完全な記録に要求される時間は、およそ３０分間である。
Ｈ−ＮＯＸ核酸
本発明は、また、本明細書に記載されている変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質、重合体型Ｈ−ＮＯＸまたは組換え単量体Ｈ−ＮＯＸタンパク質サブユニットのうちいずれかをコードする核酸を特色とする。
特定の実施形態において、核酸は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインをコードする核酸のうちいずれかのセグメントまたはその核酸配列全体を含む。一部の実施形態において、核酸は、Ｈ−ＮＯＸ核酸由来の少なくとも約５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００個以上の連続ヌクレオチドを含み、これが由来するＨ−ＮＯＸ核酸と比較して、１個または複数の変異（例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個の変異）を含有する。様々な実施形態において、変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸は、これが由来するＨ−ＮＯＸ核酸と比較して、約２０、１５、１２、１０、９、８、７、６、５、４、３または２個未満の変異を含有する。本発明は、また、変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードするいずれかの核酸の縮重バリアントを特色とする。
一部の実施形態において、核酸は、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインを含む核酸は、該核酸から重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が発現されるように連結される。さらなる実施形態において、核酸は、１個または複数の重合ドメインをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、２個以上のＨ−ＮＯＸドメインおよび１個または複数の重合ドメインを含む核酸は、該核酸から重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が発現されるように連結される。
一部の実施形態において、核酸は、重合ドメインをコードするいずれかの核酸のセグメントまたは該核酸の核酸配列全体を含む。一部の実施形態において、核酸は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインをコードする核酸および重合ドメインをコードする核酸は、産生されたポリペプチドが、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む融合タンパク質となるように連結される。
一部の実施形態において、核酸は、１個または複数のＨｉｓ６タグをコードする核酸を含む。一部の実施形態において、核酸は、Ｈ−ＮＯＸドメイン、重合ドメインおよび／またはＨｉｓ６タグをコードする核酸の間に位置する、リンカー配列をコードする核酸をさらに含む。
一部の実施形態において、本発明は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインをコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、野生型Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインである。
一部の実施形態において、本発明は、５’から３’へと、次のもの：Ｌ１４４Ｆ Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列およびフォルドンドメインをコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、本発明は、５’から３’へと、次のもの：Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列およびフォルドンドメインをコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、本発明は、５’から３’へと、次のもの：野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列およびフォルドンドメインをコードする核酸を提供する。
一部の実施形態において、本発明は、５’から３’へと、次のもの：Ｌ１４４Ｆ Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列およびＨｉｓ６タグをコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、本発明は、５’から３’へと、次のもの：Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列およびＨｉｓ６タグをコードする核酸を提供する。一部の実施形態において、本発明は、５’から３’へと、次のもの：野生型Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙアミノ酸リンカー配列、フォルドンドメイン、Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒリンカー配列およびＨｉｓ６タグをコードする核酸を提供する。
一部の実施形態において、核酸は、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１に示される核酸配列を含む。
本発明は、また、本明細書に記載されている変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする少なくとも１種の核酸を含有する細胞または細胞の集団を含む。例示的な細胞として、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞、細菌細胞および哺乳動物細胞が挙げられる。これらの細胞は、本明細書に記載されている方法等、標準方法を使用した変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質の産生に有用である。
一部の実施形態において、本発明は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインをコードする核酸を含む細胞を提供する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、野生型Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、本発明は、配列番号５、配列番号７、配列番号９または配列番号１１に示される核酸配列を含む核酸を含む細胞を提供する。
Ｈ−ＮＯＸタンパク質の製剤
本明細書に記載されている重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むいずれかの野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質を、医薬組成物または非医薬組成物の製剤に使用することができる。一部の実施形態において、製剤は、単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質がｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで会合して、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を産生するように、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む。さらに後述する通り、これらの製剤は、種々の治療上および産業上の利用において有用である。
一部の実施形態において、医薬組成物は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む本明細書に記載されている１種または複数の野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質と、薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤とを含む。薬学的に許容されるキャリアまたは賦形剤の例として、リン酸緩衝食塩水溶液、水、油／水エマルション等のエマルションおよび様々な種類の湿潤剤等、標準医薬品キャリアまたは賦形剤のうちいずれかが挙げられるがこれらに限定されない。エアロゾルまたは非経口的投与のための例示的な希釈剤は、リン酸緩衝食塩水またはノーマル（０．９％）セーラインである。このようなキャリアを含む組成物は、周知の従来方法によって製剤化される（例えば、特に製剤に関して、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、第１８版、Ａ． Ｇｅｎｎａｒｏ編、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．、Ｅａｓｔｏｎ、ＰＡ、１９９０年；およびＲｅｍｉｎｇｔｏｎ， Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｙ、第２０版、Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ、２０００年を参照）。一部の実施形態において、製剤は、滅菌されている。一部の実施形態において、製剤は、エンドトキシンを本質的に含まない。
本発明の医薬組成物において、当業者に公知のいかなる適したキャリアを用いることもできるが、キャリアの種類は、投与モードに応じて変動する。例えば、静脈内、動脈内、小胞内、吸入、腹腔内、肺内、筋肉内、皮下、気管内、経粘膜、眼内、髄腔内または経皮投与を含むいずれかの適切な投与様式のために、組成物を製剤化することができる。皮下注射等の非経口的投与のために、キャリアは、例えば、水、食塩水、アルコール、脂肪、ワックスまたはバッファーを含むことができる。経口投与のために、上述のキャリアまたはマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、タルカム、セルロース、グルコース、スクロースもしくは炭酸マグネシウム等の固体キャリアのうちいずれかを用いることができる。生分解性マイクロスフェア（例えば、ポリラクテート、ポリグリコレート）をキャリアとして使用することもできる。
一部の実施形態において、医薬組成物または非医薬組成物は、バッファー（例えば、中性緩衝食塩水、リン酸緩衝食塩水等）、炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、スクロース、デキストラン等）、抗酸化剤、キレート剤（例えば、ＥＤＴＡ、グルタチオン等）、保存料、酸素の結合および／または輸送に有用な別の化合物、不活性成分（例えば、安定剤、充填剤等）または上記のうち２種以上の組合せを含む。一部の実施形態において、組成物は、凍結乾燥物として製剤化される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、周知の技術を使用して、リポソームまたはナノ粒子内にカプセル封入することもできる。Ｈ−ＮＯＸタンパク質に使用することができる他の例示的な製剤は、例えば、特にタンパク質の製剤に関して、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９７４，７９５号および同第６，４３２，９１８号に記載されている。
本明細書に記載されている組成物は、徐放製剤（例えば、投与後に化合物の緩慢放出を生じるカプセルまたはスポンジ等の製剤）の一部として投与することができる。このような製剤は、一般に、周知の技術を使用して調製し、例えば、経口、直腸もしくは皮下植え込みによってまたは所望の標的部位における植え込みによって投与することができる。徐放製剤は、キャリアマトリックス中に分散されたおよび／または速度制御膜に囲まれたリザーバー内に含有されたＨ−ＮＯＸタンパク質を含有することができる。このような製剤内における使用のためのキャリアは、生体適合性であり、生分解性となることもできる。一部の実施形態において、製剤は、相対的に一定レベルのＨ−ＮＯＸタンパク質放出をもたらす。徐放製剤内に含有されるＨ−ＮＯＸタンパク質の量は、植え込み部位、放出の速度および予想される持続時間ならびに処置または防止しようとする状態の性質に依存する。
一部の実施形態において、医薬組成物は、有効量の野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含有する。一部の実施形態において、医薬組成物は、２個以上の野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸドメインを含む有効量の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含有する。一部の実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載されている野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む有効量の組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含有する。一部の実施形態において、製剤は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、製剤は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、製剤は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。
代用血液としてのヘモグロビンの例示的な用量は、患者体重１キログラム当たり約１０ｍｇ〜約５グラム以上の細胞外ヘモグロビンである。よって、一部の実施形態において、ヒトへの投与のための有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質は、数グラム〜約３５０グラム超の間である。Ｈ−ＮＯＸタンパク質の他の例示的な用量は、約０．５ｍｌ／分等の適切な注入速度における約４．４、約５、約１０または約１３Ｇ／ＤＬ（Ｇ／ＤＬは、循環への注入前のＨ−ＮＯＸタンパク質溶液の濃度である）のうちいずれかを含む（例えば、Ｗｉｎｓｌｏｗ， Ｒ．、第１２章、Ｂｌｏｏｄ Ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅｓを参照）。複数の投与の効果の組み合わせによって必要な有効量に達することができるため、各剤形の個々の用量に含有される活性成分の単位含有量それ自体が、有効量を構成する必要がないことが認められよう。医薬組成物に含まれるＨ−ＮＯＸタンパク質の量の選択は、当該分野の当業者の決定に従って、利用される剤形、処置されている状態および達成しようとする特定の目的に依存する。
例示的な組成物は、単離または精製することができる、遺伝子操作された組換えＨ−ＮＯＸタンパク質を含み、該Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、対応する野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比べて、変更されたＯ２またはＮＯリガンド結合をまとめて付与する１個または複数の変異を含み、生理学的に適合性の哺乳動物血液ガスキャリアとして働く。例えば、本明細書に記載されている変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、本明細書に記載されている野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質である。一部の実施形態において、組成物は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、組成物は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、組成物は、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。
医薬組成物を投与されたヒト被験体における免疫応答を低下または防止するために、ヒトＨ−ＮＯＸタンパク質もしくはドメイン（野生型ヒトタンパク質または１個もしくは複数の変異が導入されたヒトタンパク質のいずれか）または他の非抗原性Ｈ−ＮＯＸタンパク質もしくはドメイン（例えば、哺乳動物Ｈ−ＮＯＸタンパク質）を使用することができる。ヒト以外の供給源に由来するＨ−ＮＯＸタンパク質の免疫原性を低下または排除するために、Ｈ−ＮＯＸタンパク質またはＨ−ＮＯＸドメインにおけるアミノ酸を、ヒトＨ−ＮＯＸにおける対応するアミノ酸へと変異させることができる。例えば、非ヒトＨ−ＮＯＸタンパク質の三次構造の表面における１個または複数のアミノ酸を、ヒトＨ−ＮＯＸタンパク質における対応するアミノ酸へと変異させることができる。
Ｈ−ＮＯＸタンパク質の治療適用
本明細書に記載されている重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質のいずれかまたは医薬組成物を治療適用において使用することができる。
処置されている特定の適応症のために、所望のＯ２会合速度、Ｏ２解離速度、Ｏ２結合に対する解離定数、ＮＯ安定性、ＮＯ反応性、自動酸化速度、血漿保持時間または上記のうち２種以上のいずれかの組合せに基づき、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む特定のＨ−ＮＯＸタンパク質をこのような適用のために選択することができる。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、心血管疾患、神経学的疾患、腫瘍低酸素、失血または創傷の処置に使用することができる。例えば、Ｏ２結合Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、赤血球または血漿増量剤が現在利用されている状況の多くにおいて使用することができる。特に、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、外傷（例えば、戦場、災害救助または事故）、出血、出血性ショック、外科手術（例えば、腹部動脈瘤外科手術、股関節置換手術等の整形外科手術または大量失血を伴う他のいずれかの外科手術）、血液希釈、血液の拡張的使用（例えば、自己供血（ａｕｔｏ−ｄｏｎａｔｉｏｎ）の補充）および血液体積が失われるまたはＯ２運搬能が低下する他のいずれかの状況の処置のための赤血球代替物として使用することができる。創傷修復適用の例として、照射後創傷修復（例えば、高圧酸素効果）、術後修復、糖尿病性潰瘍修復および熱傷修復が挙げられる。
酸素結合（ｂｉｎｇｉｎｇ）重合体型Ｈ−ＮＯＸを使用して、自家血液の前供血（ｐｒｅ−ｄｏｎａｔｉｏｎ）の間またはその後に、該自家血液を個体に戻す前に、Ｏ２送達を一時的に増大化させることもできる（個体の血液が除去され、外科手術の終わりまたは回復の際に再注入するために保存される、外科手技の際に除去された血液の交換等）。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、大型のＨ−ＮＯＸタンパク質分子の存在により膠質浸透圧をもたらす単純な体積増量剤としても機能する。
細胞外Ｈ−ＮＯＸタンパク質の血管系における分布は、赤血球のサイズによって制限されないため、本発明の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を使用して、赤血球が浸透できない区域へとＯ２を送達することができる。これらの区域は、１個または複数の血栓、鎌状赤血球閉塞、動脈閉塞、末梢脈管閉塞、血管形成術バルーン、外科的機器の下流区域等の赤血球流動に対する障害物の下流に位置するいずれかの組織の区域、酸素欠乏を患うまたは低酸素である組織などを含むことができる。その上、Ｈ−ＮＯＸタンパク質を使用して、あらゆる種類の組織虚血を処置することができる。このような組織虚血は、例えば、周術期虚血、脳卒中、新興脳卒中（ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｓｔｒｏｋｅ）、一過性虚血性発作、心筋気絶および冬眠、急性または不安定狭心症、新興狭心症ならびに心筋梗塞（例えば、ＳＴセグメント上昇心筋梗塞）を含む。Ｈ−ＮＯＸタンパク質を使用して処置することができる他の例示的な心血管適応症は、心筋保護および鎌状赤血球貧血症を含む。例示的な標的適応症は、失血、低酸素等を含む、代用血液またはＯ２キャリアが適応であるなどの、機能的ヘモグロビン欠損の状態を含む。
重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質は、がんの処置のための放射線または化学療法の補助として使用することもできる。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、固形腫瘍における放射線療法アジュバントとして（例えば、前転移性予後不良の個体）または表面腫瘍におけるＰＤＴ療法アジュバントとして（例えば、結腸、肺もしくは皮膚がんまたは別の接触表面もしくは位置におけるがん）使用される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質を使用して、貧血症を患う患者において追加の酸素運搬能を提供することにより、貧血症を処置することができる。例示的な神経学的適応症は、虚血性脳卒中、外傷性脳傷害および脊髄傷害を含む。本方法および組成物は、急性（組織または特異的部位へと迅速に酸素を供給する、例えば、急性心筋梗塞、急性局所性もしくは全身性組織酸素化または輸血）および慢性状況（例えば、心臓梗塞からの急性回復後）の両方に適用可能である。
特定の態様において、本発明は、Ｈ−ＮＯＸタンパク質を使用して、脳腫瘍（例えば、神経膠芽腫）へとＯ２を送達する方法を提供する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸの投与は、放射線療法または化学療法の補助として使用される。一部の実施形態において、本発明は、個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与し、有効量の放射線を投与することにより、該個体における脳がん（例えば、神経膠芽腫）を処置する方法を提供する。一部の実施形態において、本発明は、個体に有効量のＨ−ＮＯＸタンパク質を投与し、有効量の放射線を投与することにより、該個体における脳腫瘍成長（例えば、神経膠芽腫成長）を低下させる方法を提供する。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質）である。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する位置に変異を含む１個または複数のＨ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む１個または複数のＨ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９およびＬ１４４に対応する位置に変異を含む１個または複数のＨ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＷ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ変異に対応する変異を含む１個または複数のＨ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、ヒトＨ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸドメインは、イヌＨ−ＮＯＸドメインである。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｌ１４４Ｆ Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。
様々な実施形態において、本発明は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質を、個体へのＯ２の送達に十分な量で、Ｏ２の送達を必要とする個体へと投与することにより、個体（例えば、霊長類（例えば、ヒト、サル、ゴリラ、類人猿、キツネザル等）、ウシ、ウマ、ブタ、イヌまたはネコ等の哺乳動物）へとＯ２を送達する方法を特色とする。一部の実施形態において、本発明は、Ｈ−ＮＯＸ組成物のうち１種または複数を個体（例えば、哺乳動物）の血液へと送達する（例えば、輸血する等）ステップを含む、哺乳動物等の個体へと血液ガスを運搬または送達する方法を提供する。血液または組織（例えば、哺乳動物の血液または組織）へとＯ２キャリアを送達するための方法は、当技術分野において公知である。様々な実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヘムに結合することができるアポタンパク質である、あるいはヘムが結合したホロタンパク質である。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与に先立ち、ヘムが結合していてもしていなくてもよい。一部の実施形態において、Ｏ２は、個体へと送達される前にＨ−ＮＯＸタンパク質に結合している。他の実施形態において、Ｏ２は、個体へのＨ−ＮＯＸタンパク質の投与に先立ち該タンパク質に結合しておらず、該Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、個体内のある位置から個体内の別の位置へとＯ２を輸送する。
Ｏ２に対する相対的に低いＫＤを有する（約８０ｎＭ未満または約５０ｎＭ未満等）重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む野生型および変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、低い酸素圧を有する組織（腫瘍、一部の創傷または１ｍｍＨｇを下回るｐ５０等、酸素圧が非常に低い他の区域等）の処置に特に有用であると予想される。Ｏ２に対するこのようなＨ−ＮＯＸタンパク質の高親和性は、Ｏ２がＨ−ＮＯＸタンパク質と結合し続ける時間の長さを増加し、これにより、処置しようとする組織にＨ−ＮＯＸタンパク質が達する前に放出されるＯ２の量を低下させることができる。
身体内の特定の部位（神経膠芽腫等）へとＯ２結合したＨ−ＮＯＸタンパク質を直接送達するための一部の実施形態において、Ｏ２は、該タンパク質に既に結合しており（ｋｏｎの重要性を低くする）、酸素は、身体内の特定の部位でまたはその付近で放出される必要がある（ｋｏｆｆにより影響される速度で）ため、Ｏ２に対するｋｏｆｆは、ＫＤ値よりも重要である。一部の実施形態において、ｋｏｆｆは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質が循環における赤血球の存在下にある場合にも重要であり得、この場合、Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、赤血球からのＯ２の拡散を容易にし、恐らく、血管系のさらに別のポイントへとＯ２を輸送する希釈赤血球の能力を延ばす。
個体の血流中を循環するＨ−ＮＯＸタンパク質を送達するための一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、肺でＯ２に結合し、身体内の１種または複数の他の部位においてＯ２を放出する。これらの適用の一部に関して、Ｏ２結合は、平衡であるまた平衡に近いため、ＫＤ値は、ｋｏｆｆよりも重要である。一部の実施形態において、極度血液希釈に関して、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、循環中を移動する際に絶えずＯ２に結合および放出するため、Ｈ−ＮＯＸタンパク質が主要なＯ２キャリアである場合、ＫＤはｋｏｆｆよりも重要である。ヘモグロビンは、１４ｍｍＨｇのｐ５０を有するため、赤血球（キャパシタ（ｃａｐａｃｉｔｏｒ）の様に作用する）は、ほぼ３０ｍｍＨｇのｐ５０を有し、５ｍｍＨｇ〜９０ｍｍＨｇの間の範囲を有するＨＢＯＣが開発され、したがって、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の最適ＫＤ範囲は、一部の適用のために約２ｍｍＨｇ〜約１００ｍｍＨｇの間であり得る。
重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、イメージングに使用することもできる。特に、光イメージング（例えば、光干渉断層撮影；例えば、特に光干渉断層撮影に関して、その全体が参照により組み込まれる、Ｖｉｌｌａｒｄ， Ｊ． Ｗ．（２００２年）Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｏｎ １０５巻：１８４３〜１８４９頁を参照）は、赤血球により暗黒化される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、赤血球よりもはるかに小さいため、Ｈ−ＮＯＸ溶液による灌流は、循環および血管壁のよりクリアな画像を可能にする。
本発明の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むＨ−ＮＯＸタンパク質および医薬組成物は、経口、外用、眼内、髄腔内、肺内、気管内またはエアロゾル投与；経皮もしくは粘膜（ｍｕｃｕｓ ｍｅｍｂｒａｎｅ）吸着；または注射（例えば、皮下、静脈内、動脈内、小胞内または筋肉内注射）による等、いずれかの従来手段により個体に投与することができる。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、代用血液としての使用のために大容量非経口的溶液に含まれてもよい。例示的な実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、個体の血液（例えば、静脈、動脈または毛細血管等の血管への投与）、創傷、腫瘍、低酸素組織または低酸素臓器に投与される。
一部の実施形態において、組成物の持続性連続的放出製剤が使用される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与は、例えば、投与の目的に応じて数秒間から数時間の期間行われ得る。例えば、血液送達媒体として、投与の例示的な時間経過は、可能な限り迅速である。他の例示的な時間経過は、約１０、約２０、約３０、約４０、約６０、約９０または約１２０分間のうちいずれかを含む。血液代替物としてのＨ−ＮＯＸ溶液の例示的な注入速度は、約１００ｍＬ／時間〜約３，０００ｍＬ／時間等、約３０ｍＬ／時間〜約１３，２６０ｍＬ／時間である。Ｈ−ＮＯＸタンパク質の例示的な総用量は、１３，２６０ｍＬ／時間で２０分間にわたって投与される約９００ｍｇ／ｋｇである。ブタのためのＨ−ＮＯＸタンパク質の例示的な総用量は、約１８．９グラムである。
例示的な投薬頻度として、１週間に少なくとも１、２、３、４、５、６または７回（即ち、毎日）が挙げられるがこれらに限定されない。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、１日少なくとも２、３、４または６回投与される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、例えば、数日間または数週間の期間にわたり投与することができる。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、数カ月間または数年間等、より長期間投与される。組成物の投薬頻度は、投与担当の医師の判断に基づき、処置の経過にわたり調整することができる。
本発明の一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質）は、放射線療法または化学療法の補助として使用される。例えば、神経膠芽腫の処置のために。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸは、放射線または化学療法の投与の少なくとも１、２、３、４、５または６時間前のうちいずれかにおいて個体に投与される。一部の実施形態において、放射線は、Ｘ線照射である。一部の実施形態において、Ｘ線照射の線量は、約０．５ｇｙ〜約７５ｇｙのうちいずれかである。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ投与および放射線投与のサイクルは、１、２、３、４、５または６回のうちいずれか１種の回数、反復される。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸ投与および放射線投与のサイクルは、約１週間、２週間、３週間、４週間、５週間または６週間のうちいずれか１種の後に反復される。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸおよび放射線療法の投与（ａｄｍｉｒａｔｉｏｎ）は、別の療法；例えば、化学療法と併せて使用される。
上に記す通り、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投薬量の選択は、当該分野の当業者の決定に従って、利用されている剤形、投与の頻度および回数、処置されている状態ならびに達成しようとする特定の目的に依存する。一部の実施形態において、ヒトへの投与のためのＨ−ＮＯＸタンパク質の有効量は、数グラム〜３５０グラム超の間である。
一部の実施形態において、２種以上の異なるＨ−ＮＯＸタンパク質は、同時に、逐次的にまたは同時に投与される。一部の実施形態において、Ｏ２の送達に有用な別の化合物または療法は、１種または複数のＨ−ＮＯＸタンパク質の投与と同時に、逐次的にまたは同時に投与される。
Ｈ−ＮＯＸタンパク質を使用することができる他の例示的な治療適用は、例えば、特にＯ２キャリアの治療適用に関して、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第６，９７４，７９５号および同第６，４３２，９１８号に記載されている。
Ｈ−ＮＯＸタンパク質を有するキット
重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む本明細書に記載されているＨ−ＮＯＸタンパク質のうちいずれかと、適したパッケージングとを含む製造品およびキットも提供される。一部の実施形態において、本発明は、（ｉ）Ｈ−ＮＯＸタンパク質（本明細書に記載されている野生型もしくは変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質または本明細書に記載されているその製剤等）と、（ｉｉ）個体へのＯ２の送達にキットを使用するための指示とを有するキットを含む。様々な実施形態において、本発明は、（ｉ）Ｈ−ＮＯＸタンパク質（本明細書に記載されている野生型もしくは変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質または本明細書に記載されているその製剤等）と、（ｉｉ）本明細書に記載されている産業使用のうちいずれかにキットを使用するための指示（例えば、参照標準を必要とする分析的機器使用のための参照標準としてのＨ−ＮＯＸタンパク質の使用、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＯ２レベルを維持もしくは増加させることによる細胞培養における細胞成長の増強、溶液へのＯ２の添加、または溶液からのＯ２の除去）とを有するキットを特色とする。
一部の実施形態において、脳がん（例えば、神経膠芽腫）の処置における使用のためのキットが提供される。一部の実施形態において、キットは、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む。一部の実施形態において、キットは、２個以上の野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸドメインを含む有効量の重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む。一部の実施形態において、キットは、本明細書に記載されている野生型または変異体Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む有効量の組換え単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む。一部の実施形態において、キットは、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ変異に対応する変異および三量体形成ドメインを含む。一部の実施形態において、キットは、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ変異に対応する変異および三量体形成ドメインを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、ヒトＨ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、イヌＨ−ＮＯＸドメインを含む。一部の実施形態において、キットは、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、キットは、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｗ９Ｆ／Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。一部の実施形態において、キットは、３個の単量体を含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、各単量体は、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸドメインおよびフォルドンドメインを含む。
本明細書に記載されている組成物に適したパッケージングは、当技術分野において公知であり、例えば、バイアル（例えば、密封されたバイアル）、容器、アンプル、瓶、ジャー、可撓性パッケージング（例えば、密封されたＭｙｌａｒまたはプラスチック袋）などを含む。これらの製造品は、さらに滅菌および／または密封されていてよい。本明細書に記載されている組成物を含む単位剤形も提供される。これらの単位剤形は、適したパッケージングにおいて単一または複数の単位投薬量で貯蔵することができ、さらに滅菌および密封することもできる。本発明のキットに供給される指示は、典型的には、ラベルまたは添付文書における書面の指示である（例えば、キットに含まれる紙面）が、機械可読指示（例えば、磁気または光学式記憶ディスクに入力された指示）も許容される。Ｈ−ＮＯＸタンパク質の使用に関する指示は、一般に、企図される処置または産業使用のための投薬量、投薬スケジュールおよび投与経路に関する情報を含む。キットは、処置に適した個体の選択に関する記述をさらに含むことができる。
容器は、単位用量、バルクパッケージ（例えば、マルチ用量パッケージ）またはサブユニット用量であってよい。例えば、約１週間、約２週間、約３週間、約４週間、約６週間、約８週間、約３カ月間、約４カ月間、約５カ月間、約６カ月間、約７カ月間、約８カ月間、約９カ月間以上のうちいずれか等、延長された期間個体に有効な処置を提供するのに十分な投薬量の本明細書に開示されているＨ−ＮＯＸタンパク質を含有するキットを提供することもできる。キットは、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の複数の単位用量および使用のための指示を含み、薬局、例えば、病院内薬局および調剤薬局における貯蔵および使用に十分な含量でパッケージされ得る。一部の実施形態において、キットは、再構成、再懸濁または再度水分補給させて、一般にＨ−ＮＯＸタンパク質の安定的な水性懸濁液を形成することができる乾燥（例えば、凍結乾燥した）組成物を含む。
Ｈ−ＮＯＸタンパク質の産生のための例示的な方法
本発明は、また、本明細書に記載されている重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のいずれかの産生のための方法を提供する。一部の実施形態において、本方法は、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の産生に適した条件下で、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする核酸を有する細胞を培養するステップを包含する。様々な実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸはまた、精製される（細胞または培養培地からのＨ−ＮＯＸタンパク質の精製等）。一部の実施形態において、本方法は、Ｈ−ＮＯＸドメインおよび重合ドメインを含む単量体Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする核酸を有する細胞を培養するステップを包含する。続いてこの単量体は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで会合して、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成する。異種Ｈ−ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、所望のＨ−ＮＯＸドメインを有する単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする２種以上の核酸を共導入することにより作製することができ、該２種以上の単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、同じ重合ドメインを含む。
一部の実施形態において、異種Ｈ−ＮＯＸドメインを含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、所望のＨ−ＮＯＸドメインおよび共通重合ドメインを含む同種単量体型Ｈ−ＮＯＸサブユニットを含む重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を別々に調製することにより調製される。異なる同種Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、異種Ｈ−ＮＯＸサブユニットの所望の比で混合され、同種重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は解離され（例えば、熱、変性剤、高塩等により）、続いて会合させて、異種重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成させる。異種重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の混合物は、所望の比で所望のサブユニットの存在を選択することによりさらに精製することができる。例えば、異なるＨ−ＮＯＸ単量体のそれぞれは、異種重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の精製ならびに異種サブユニットの同定および定量化に役立つ別個のタグを有することができる。
上に記す通り、数種類の野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質および核酸の配列は公知であり、本発明の変異体Ｈ−ＮＯＸドメインおよび核酸の作製に使用することができる。組換えＨ−ＮＯＸタンパク質の変異、発現および精製のための技法は、例えば、特に組換えＨ−ＮＯＸタンパク質の変異、発現および精製に関して、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｏｎ， Ｅ．Ｍ．ら（２００５年）Ｎａｔｕｒｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ １巻：５３〜５９頁およびＫａｒｏｗ， Ｄ． Ｓ．ら（２００４年８月１０日）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ４３巻（３１号）：１０２０３〜１０２１１頁に記載されている。これらの技法または他の標準技法を使用して、いずれかの変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質を作製することができる。
特に、本明細書に記載されている変異体Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、当技術分野において公知の多数の方法により作製することができる。変異は、アミノ酸の化学修飾によるアミノ酸レベルで、あるいは所定のアミノ酸をコードするヌクレオチド配列の変更によるコドンレベルでのいずれかで起こり得る。タンパク質におけるいずれかの所定の位置におけるアミノ酸の置換は、該アミノ酸をコードするコドンを変更することにより達成することができる。これは、例えば：（ｉ）Ｔａｙｌｏｒ， Ｊ．Ｗ．ら（１９８５年１２月２０日）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３巻（２４号）：８７４９〜８７６４頁；Ｔａｙｌｏｒ， Ｊ．Ｗ．ら（１９８５年１２月２０日）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１３巻（２４号）：８７６５〜８７８５頁；Ｎａｋａｍａｙｅ， Ｋ． Ｌ．ら（１９８６年１２月２２日）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１４巻（２４号）：９６７９〜９６９８頁；およびＤｅｎｔｅら（１９８５年）、ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｇｌｏｖｅｒ編、ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ、７９１〜８０２頁の方法に基づくＡｍｅｒｓｈａｍ技法（Ａｍｅｒｓｈａｍ変異誘発キット、Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｉｎｃ．、Ｃｌｅｖｅｌａｎｄ、Ｏｈｉｏ）、（ｉｉ）Ｐｒｏｍｅｇａキット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｉｎｃ．、Ｍａｄｉｓｏｎ、Ｗｉｓ．）または（ｉｉｉ）特にタンパク質の変異誘発に関して、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｋｕｎｋｅｌ， Ｔ． Ａ．（１９８５年１月）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８２巻（２号）：４８８〜４９２頁；Ｋｕｎｋｅｌ， Ｔ． Ａ．（１９８７年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５４巻：３６７〜３８２頁；Ｋｕｎｋｅｌ、米国特許第４，８７３，１９２号の方法に基づくＢｉｏｒａｄキット（Ｂｉｏｒａｄ Ｉｎｃ．、Ｒｉｃｈｍｏｎｄ、Ｃａｌｉｆ．）を使用した部位特異的変異誘発により達成することができる。変異誘発は、変異体オリゴヌクレオチドによる部位特異的変異誘発を利用する手段等、他の市販のまたは非商業的手段により達成することもできる。
部位特異的変異誘発は、特にタンパク質の変異誘発に関して、それぞれ、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｚｈｅｎｇｂｉｎら（１９９２年）２０５〜２０７頁、ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ；Ｊｏｎｅｓ， Ｄ． Ｈ．ら（１９９０年２月）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ８巻（２号）：１７８〜１８３頁；Ｊｏｎｅｓ， Ｄ． Ｈ．ら（１９９１年１月）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０巻（１号）：６２〜６６頁に記載のもの等、ＰＣＲに基づく変異誘発を使用して達成することもできる。部位特異的変異誘発は、当業者に公知の技法によるカセット変異誘発を使用して達成することもできる。
変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸および／または重合ドメインは、標準技法を使用して、発現ベクター等のベクターに組み入れることができる。例えば、制限酵素を使用して、変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸およびベクターを切断することができる。次に、切断された変異体Ｈ−ＮＯＸ核酸および切断されたベクターの適合性末端をライゲーションすることができる。コードされたＨ−ＮＯＸタンパク質の発現のため、標準技法（例えば、エレクトロポレーション）を使用して、得られたベクターを細胞（例えば、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞または細菌細胞）に挿入することができる。
特に、昆虫細胞、植物細胞、酵母細胞および細菌細胞等、多数の生物学的発現系において、異種タンパク質が発現されてきた。よって、いずれかの適した生物学的タンパク質発現系を利用して、多量の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質を産生することができる。一部の実施形態において、Ｈ−ＮＯＸタンパク質（例えば、変異体または野生型Ｈ−ＮＯＸタンパク質）は、単離されたタンパク質である。
所望の場合、Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、標準技法を使用して精製することができる。一部の実施形態において、上記タンパク質は、少なくとも約６０重量％であり、該タンパク質が産生される際に存在する他の構成成分を含まない。様々な実施形態において、上記タンパク質は、少なくとも約７５重量％、９０重量％または９９重量％純粋である。精製されたタンパク質は、例えば、天然の供給源、組換え発現系または化学合成の反応混合物からの精製（例えば、抽出）により得ることができる。例示的な精製方法として、免疫沈降、免疫親和性クロマトグラフィー等のカラムクロマトグラフィー、磁気ビーズ免疫親和性精製およびプレート結合抗体によるパニング、ならびに当業者に公知の他の技法が挙げられる。純度は、いずれかの適切な方法により、例えば、カラムクロマトグラフィー、ポリアクリルアミドゲル電気泳動またはＨＰＬＣ解析によりアッセイすることができる。一部の実施形態において、精製されたタンパク質は、本発明の医薬組成物に取り込まれる、あるいは本発明の方法において使用される。本発明の医薬組成物は、精製されたタンパク質に加えて、添加物、キャリアまたは他の構成成分を有し得る。
一部の実施形態において、重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、１個または複数のＨｉｓ６タグを含む。少なくとも１個のＨｉｓ６タグを含むＨ−ＮＯＸタンパク質は、クロマトグラフィーを使用して；例えば、Ｎｉ２＋親和性クロマトグラフィーを使用して精製することができる。精製後に、Ｈｉｓ６タグは、例えば、エキソペプチダーゼを使用することにより除去することができる。一部の実施形態において、本発明は、Ｈｉｓ６タグの使用により精製された、精製された重合体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を提供する。一部の実施形態において、精製されたＨ−ＮＯＸタンパク質は、エキソペプチダーゼで処理されて、Ｈｉｓ６タグを除去する。
本実施例は、本発明を純粋に例示するものとして企図されており、したがって、決して本発明を限定するものと考慮するべきではなく、また、上述の本発明の態様および実施形態を説明および詳述する。本実施例は、後述する実験が、実施される全てまたは唯一の実験であることを表すようには企図されていない。他に断りがなければ、温度は、セ氏温度で表されており、圧力は大気圧またはその前後である。
（実施例１）
三量体形成されたＨ−ＮＯＸタンパク質の作製および発現
Ｈ−ＮＯＸタンパク質の循環半減期を増加させるために、キメラ融合タンパク質をデザインして、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ配列を、バクテリオファージＴ４フィブリチンタンパク質由来の三量体形成ドメインと組み合わせた。この融合戦略は、分子量の３倍を超える増加を生じ、完全にモジュラーである（三量体形成ドメインは、いかなるＨ−ＮＯＸ配列に付加してもよく、さらには単一の三量体分子における複数のＨ−ＮＯＸ配列の組み合わせに使用してもよい）。
Ｈ−ＮＯＸへのフォルドンドメインの融合
Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ配列のＣ末端のＸｈｏＩ制限部位およびフォルドンドメインの最初のグリシンの間に３アミノ酸（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｙ）リンカーを使用して、フォルドンドメインを該Ｈ−ＮＯＸ配列のＣ末端に遺伝子融合した。フォルドンドメインおよびＨｉｓ６タグの間に３アミノ酸（Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）リンカーを使用して、Ｈｉｓ６タンパク質精製タグをフォルドンドメインのＣ末端に付加した。完全融合タンパク質のＤＮＡおよびアミノ酸配列を図２に示す。全長融合タンパク質は、２６，６７７ＡＭＵ（単量体として）の分子量を有する２２９アミノ酸のタンパク質をコードする。
Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合タンパク質配列の構築
Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合配列の構築をデザインして、制限エンドヌクレアーゼを使用して親Ｈ−ＮＯＸプラスミドからＨｉｓ６および終止コドンをコードするＤＮＡセグメントを切除し、これをフォルドン配列、Ｈｉｓ６タグおよび終止コドンをコードするカセットに置き換えた。制限酵素部位（５’端にＸｈｏＩならびにＨｉｓ６タグおよび終止コドン後の３’端にＨｉｎｄＩＩＩ）に挟まれたフォルドンドメイン、Ｈｉｓ６タグおよび終止コドンをコードするＤＮＡをＧｅｎＳｃｒｉｐｔ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）から購入した。この配列をＧｅｎＳｃｒｉｐｔクローニングベクターｐＵＣ５７に送達した。
制限酵素ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩを使用して、ｐＵＣ５７プラスミドを消化して、フォルドン−Ｈｉｓ６断片（１４７塩基対の長さ）を放出させた。Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４ＦバリアントをコードするｐＣＷベクターもＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩで消化して、Ｈ−ＮＯＸ配列からＨｉｓ６タグおよび終止コドンをコードする４８塩基対断片を除去した。調製用アガロースゲル電気泳動により、制限消化反応由来の所望の断片を単離し、アガロースからＤＮＡ断片を精製した。Ｔ４リガーゼを使用して、Ｈ−ＮＯＸ配列をコードする断片およびフォルドン−Ｈｉｓ６タグをライゲーションし、ライゲーション反応物を使用して、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ細胞を形質転換した。ｐＣＷ特異的配列決定プライマーによる配列決定により、Ｅ．ｃｏｌｉクローンのうち１個（クローン３Ｉ−Ａ）が、所望の融合配列とマッチし、完全Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン−Ｈｉｓ６キメラタンパク質をコードしたことを確認した（図３Ａは、所望の配列と整列させた配列決定データを示す）。クローン３Ｉ−Ａ配列は、融合したフォルドンドメイン（ｆ）を有するＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ配列（００２）をコードするｐＣＷベクター（ｖ０１）を示すように、新たにｖ０１−ｆ００２と命名した。Ｈｉｓ６タグありおよびなしの野生型Ｔ．ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン単量体の配列、ならびにＣ．ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン単量体の配列を図３に示す。
Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合タンパク質の発現および精製
ｐＣＷ親ベクター（Ｇｅｇｎｅｒ， ＪＡ ＆ Ｄａｈｌｑｕｉｓｔ， ＦＷ（１９９１年）Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８８巻、７５０〜７５頁；Ｍｕｃｈｍｏｒｅ， ＤＣら（１９８９年）Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １７７巻：４４〜７３頁）に由来するｖ０１−ｆ００２プラスミドは、複数のｔａｃ（ハイブリッドｔｒｐ−ｌａｃ）プロモーターによるｆ００２オープンリーディングフレームの発現をコードする。ヘム結合Ｈ−ＮＯＸタンパク質の効率的な発現のために、コンピテントＥ．ｃｏｌｉ株ＲＰ５２３（Ｌｉ， ＪＭら（１９８８年）Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ １７０巻：１０２１〜１０２５頁）をプラスミドｖ０１−ｆ００２で形質転換した。様々な誘導温度において（３７℃、３０℃、１８℃）、また、Ｒｏｓｅｔｔａ２細胞（Ｍｅｒｃｋ Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｄａｒｍｓｔａｄｔ、Ｇｅｒｍａｎｙ）においても、発現を試験した。
１００ｍｇ／Ｌアンピシリンおよび３０ｍｇ／Ｌヘミンを補充したルリアブロス（Ｌｕｒｉａ Ｂｒｏｔｈ）にて３０℃で成長させた初期一晩スターター培養物を使用して、ＲＰ５２３細胞におけるｖ０１−ｆ００２プラスミドの頑強な発現を達成した。次に、スターター培養物を使用して、１００ｍｇ／Ｌアンピシリン、３０ｍｇ／Ｌヘミンおよび１．５％グルコースを補充したテリフィックブロス（Ｔｅｒｒｉｆｉｃ Ｂｒｏｔｈ）の６Ｌ発現培養物に接種した。発現培養物を３０℃で成長させて、約０．５のＯＤ６００とし、続いて最終濃度０．１ｍＭとなるようＩＰＴＧを添加することによりタンパク質発現を誘導した。３０℃で一晩（２４．５時間の誘導）発現を続け、その後、遠心分離により細胞を収集し、精製のために−８０℃で凍結した。
熱処理ステップおよび２回のクロマトグラフィーステップを使用して、発現した細胞ペレットから融合タンパク質を精製した。先ず、発現した細胞ペレットを、５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾールおよび５％グリセロールバッファー、ｐＨ７．９に再懸濁した。ＥｍｕｌｓｉＦｌｅｘ Ｃ−５０ホモジナイザー（Ａｖｅｓｔｉｎ、Ｏｔｔａｗａ、Ｃａｎａｄａ）を使用してこの溶液をホモジナイズして、細菌細胞を溶解させた。細胞ライセートを１５分間７５℃で加熱して、熱安定性でないタンパク質を沈殿させた。２７，０００ｇ、１５分間の遠心分離によりこの沈殿物を除去して、清澄化された上清を得た。清澄化された上清をＨｉｓＴｒａｐ ＦａｓｔＦｌｏｗカラム（ＧＥ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）にアプライして、Ｈｉｓ６タグ付き融合タンパク質を結合させた。５０ｍＭリン酸ナトリウム、５００ｍＭ ＮａＣｌ、２５０ｍＭイミダゾールおよび５％グリセロールバッファー、ｐＨ７．９のバッファーにより、結合したタンパク質を溶出させた。溶出されたタンパク質のバッファーを、ＤＥＡＥセファロースＦａｓｔＦｌｏｗカラム（ＧＥ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）へのアプライのために、３０ｍＭトリエタノールアミン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４バッファーに交換した。宿主細胞夾雑物およびエンドトキシンはカラムに保持されつつ、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合タンパク質は、ＤＥＡＥカラムを素通りした。次に、−８０℃における貯蔵のために、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合タンパク質を濃縮することができる。初期精製からの精製プロセスの各ステージにおけるＨ−ＮＯＸ−フォルドン融合タンパク質を示すＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを図４に示す。
精製されたＨ−ＮＯＸ−フォルドン融合タンパク質の特徴付け
多数の技法を使用して、精製されたＨ−ＮＯＸ−フォルドンタンパク質を特徴付けた。最終精製タンパク質の純度をＳＤＳ−ＰＡＧＥにより解析した（図４および図５を参照）。ゲル電気泳動は、熱処理および２回のクロマトグラフィーステップの後に、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合タンパク質が、＞９５％純粋であることを示す。変性ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにおいて、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合体は、単量体として泳動し、移動度は、単量体の分子量２６．７ｋＤａと一致した。
単量体単位の正確な質量を決定するためのＬＣ−ＭＳならびに標準バッファー溶液における三量体のサイズおよび分散を推定するための分析的サイズ排除クロマトグラフィーの両方を使用して、融合タンパク質のサイズのより定量的な推定値を得た。図６は、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合タンパク質のＬＣ−ＭＳ解析を示す。ＬＣ−ＭＳが導く質量２６，６７８ＡＭＵは、単量体型Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合体に予測される質量２６，６７７ＡＭＵと一致する。図７は、Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００ ＧＬ（ＧＥ、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ＮＪ）カラムおよび３０ｍＭトリエタノールアミン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４バッファーを使用した分析的サイズ排除クロマトグラフィーを示す。分析的ＳＥＣ条件下において、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合体は、三量体形成を維持する筈であり、得られる保持容量は、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン三量体に予測される分子量８０．０ｋＤａと一致する。
ヘムタンパク質の分光法を使用して、結合したリガンドの性質およびヘムにおける鉄原子の酸化状態を特徴付ける。Ｈ−ＮＯＸ−フォルドンタンパク質のＵＶ−ｖｉｓ分光学的解析は、フォルドンドメインの融合が、特徴的Ｈ−ＮＯＸスペクトルを変更しないことを示す。ソーレーピーク（４１５ｎｍ）およびα／βピーク（５５０〜６００ｎｍ）を含む特徴的スペクトルピークは全て、Ｈ−ＮＯＸ単量体およびＨ−ＮＯＸ−フォルドン融合タンパク質の間で保存されており、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン融合体が、元のＨ−ＮＯＸ単量体と同様の様式でヘム補因子および二原子酸素ガスに結合することを示す（図８）。
ＲＣＳＢタンパク質データバンクに見出されるフォルドンドメイン（１Ｖ１Ｈ）およびＴｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸ単量体（１Ｕ４Ｈ）の結晶構造を使用して、Ｈ−ＮＯＸ−フォルドン三量体の構造的モデルを構築した（図９）。
（実施例２）
半減期の延長および様々な酸素親和性を実証するＨ−ＮＯＸ三量体のパネルの生成
構造に基づく計算的デザインを使用して、Ｈ−ＮＯＸアミノ酸を体系的に変異させて、様々な親和性で酸素に結合するＨ−ＮＯＸ単量体バリアントのパネルを作製した。小型の２３ｋＤａ Ｈ−ＮＯＸ単量体が、３０分間の半減期でラット循環系から排除されることが決定された。腎臓濾過限界を上回るよう分子量を上げることにより、恐らくＨ−ＮＯＸタンパク質の循環半減期を増加させることができ、したがって、より長期の持続時間にわたる持続的な酸素化を可能にすると仮定された。分子量の増加が、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の循環半減期を増加し得るかを決定するために、低酸素組織の酸素化が成功したＨ−ＮＯＸ単量体の三量体形成により、より大型の分子量を有するＨ−ＮＯＸバリアントを作製した。三量体形成したバリアントのパネルを作製するために、「フォルドン」ドメインと呼ばれるフィブリチンタンパク質由来の小型のアミノ酸三量体形成モチーフを、１〜２０ｍｍＨｇに及ぶ異なる酸素親和性を有する数種類のＨ−ＮＯＸ単量体のＣ末端に遺伝子連結した。パネルは、野生型Ｈ−ＮＯＸ、Ｈ−ＮＯＸバリアントＬ１４４Ｆ、Ｃ末端にＨｉｓ６タグなしのＨ−ＮＯＸバリアントＬ１４４Ｆ、Ｈ−ＮＯＸバリアントＬ１４４Ｆ／Ｌ１８９Ｃ、Ｈ−ＮＯＸおよびフォルドンの間にリンカーなしのＨ−ＮＯＸバリアントＬ１４４Ｆ、Ｈ−ＮＯＸおよびフォルドンの間に３アミノ酸リンカーありのＨ−ＮＯＸバリアントＬ１４４Ｆ、Ｈ−ＮＯＸおよびフォルドンの間に９アミノ酸リンカーありのＨ−ＮＯＸバリアント、またはＨ−ＮＯＸバリアントＷ９Ｆ／Ｌ１４４ＦとアセンブルしたＨ−ＮＯＸ三量体を含んだ。フォルドンドメインは、フィブリチンのアミノ酸残基４５７〜４８３に対応する２７アミノ酸残基、ＧＹＩＰＥＡＰＲＤＧＱＡＹＶＲＫＤＧＥＷＶＬＬＳＴＦＬ（配列番号４）からなり、３．０８ｋＤａの予測質量を有した。上述の通り、フォルドンドメインは以前にタンパク質安定性を増加させることが示され、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方におけるタンパク質の三量体形成に広く使用されている。簡潔に説明すると、それぞれ５’および３’端にＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限部位を有するフォルドンドメインをコードする遺伝子を含有するプラスミドを、ＸｈｏＩおよびＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素で消化して、Ｈ−ＮＯＸタンパク質単量体をコードするプラスミドへとフォルドンドメイン遺伝子をクローニングした。細菌細胞（Ｅ．ｃｏｌｉ）におけるプラスミドの発現後に、Ｈ−ＮＯＸ＋フォルドンタンパク質を精製および試験して、Ｈ−ＮＯＸ＋フォルドン単量体が三量体形成して、Ｈ−ＮＯＸ＋フォルドン三量体（例えば、Ｈ−ＮＯＸ三量体）となることを確かめた。精製のために、細菌細胞をリゾチームで溶解し、ホモジナイズした。上清を採取し、７５℃で１５分間熱処理し、その後、ＪＡ−１７ローターにおいて１４ｋｒｐｍで遠心分離して、不溶性タンパク質を除去した。可溶性Ｈ−ＮＯＸ＋フォルドンをＨｉｓＴｒａｐ（ＩＭＡＣ）カラムに結合させ、イミダゾールで溶出し、溶出された試料をバッファー交換に供して、イミダゾールを含まない低塩バッファーでタンパク質試料を提供した。タンパク質試料をＤＥＡＥイオン交換カラムに供することにより、試料におけるさらなる混入タンパク質を除去し、解析に先立ち溶出されたタンパク質試料を濃縮した。質量分析法およびサイズ排除クロマトグラフィーを使用して、それぞれ単量体の分子量（およそ２６．７ｋＤａ）および三量体の分子量（およそ８０．１ｋＤａ）を確かめた。各三量体形成バリアントを試験して、次の項目を含む生化学的パラメータを満たすかを決定した：均質な（ｈｏｍｏｇｅｎｏｕｓ）分子量、１〜２０ｍｍＨｇの間の酸素結合親和性、これは、ｋｏｆｆによって測定され、公知ｋｏｎ値を内挿して、ｍｍＨｇに対応するＫｄに達する。ｋｏｆｆによって測定される場合、ホモ三量体のＫｏｆｆは、対応する単量体ついてのもの、最小一酸化窒素（ＮＯ）反応性、低い自動酸化速度および３時間以上の循環残留時間、と本質的に同じである（表２）。分光法を使用して、ＳＴＰにおいて結合したガスの性質を決定し、ストップトフロー分光法を使用して、酸素解離の動力学的速度定数を決定した。この解析から、２μＭの酸素親和性を有するＨ−ＮＯＸ三量体を同定し、この親和性は恐らく、低い酸素レベルを有する組織における酸素の放出を可能にする。Ｈ−ＮＯＸ三量体はまた、約１μＭ−１ｓ−１未満の一酸化窒素反応性を実証し、この値は、血管作用性および毒性であると以前に判明した５８μＭ−１ｓ−１の一酸化窒素反応性を有するヘモグロビンと比較して最小と考えられた。
ラットにおけるクリアランス試験のために、高純度かつ低エンドトキシンレベルの三量体を生成した。１５０ｍＭ ＮａＣｌ、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳバッファー（ｐＨ７．４）の生理的バッファーで、ｉｎ ｖｉｖｏ注射のためのＨ−ＮＯＸ三量体を製剤化し、最大１００ｍｇ／ｋｇの用量での使用のために１００ｍｇ／ｍＬに濃縮した。Ｈ−ＮＯＸ三量体の循環残留時間の延長を確かめるために、４匹の雄ウィスター（Ｗｉｓｔｅｒ）ラットの群を使用して、三量体候補をそれぞれ試験した。Ｎ２Ｏ：Ｏ２（２：１）中２〜３％イソフルランにより導入チャンバー内で麻酔を導入し、ノーズコーン（ｎｏｓｅ ｃｏｎｅ）による１〜１．５％イソフルランにより維持した。後肢をつねることに対する引込めの欠如および目隠し（ｅｙｅ ｂｌｉｎｄ）反射の損失により、麻酔の適切な深さを評価した。動物に腹腔内注射により４０ｍｇ／ｋｇのセファゾリンナトリウムおよび０．１ｍｇ／ｋｇの皮下ブプレノルフィンを与えた。クリアランス試験の１日前に、各動物に大腿静脈および動脈カテーテルを外科的に植え込み、それぞれ注射および血液除去を可能にした。静脈カテーテルへの静脈内ボーラス注射により１００ｍｇ／ｋｇの用量の候補Ｈ−ＮＯＸ三量体を時間０の時点で注射した。候補Ｈ−ＮＯＸ三量体またはバッファー対照の注射の５分、３０分、１時間、１．５時間、２時間、３時間、４時間、６時間、８時間および２４時間後に、各ラットの動脈カテーテルから約２５０μＬの血液を採取した。採取した血液を処理して血清および血漿にし、その後、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に対するポリクローナル抗体を用いたＥＬＩＳＡおよびＳＤＳ−ＰＡＧＥアッセイを使用して、Ｈ−ＮＯＸ三量体の存在について解析した。
三量体毎のクリアランス時間の測定に加えて、動物における予備的安全性もモニターした。Ｈ−ＮＯＸ単量体による優良試験所基準（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）（ＧＬＰ）様安全性試験は、１ｇ／ｋｇの最大実行可能用量であっても、４８時間に主要有害または免疫学的事象を示さなかった。初期注射４週間後まで総毒性、血液化学および抗治療抗体をモニターすることにより、候補Ｈ−ＮＯＸ三量体を同様に試験した。予備的安全性試験のため、６匹のマウスの群に時間０の時点で、尾静脈への静脈内ボーラス注射により７５０ｍｇ／ｋｇの用量の候補Ｈ−ＮＯＸ三量体またはバッファー対照を投与した。Ｈ−ＮＯＸ三量体の投与前に、各ラットの頸静脈から血液試料を採取し、Ｈ−ＮＯＸ三量体の投与４週間後まで各週に採取した血液と比較した。採取した血液を処理して血清および血漿にし、その後、臨床化学解析およびＥＬＩＳＡによって検出される抗治療抗体産生に供した。全動物を毎日観察して、総毒性のいかなる証拠もモニターした。
２匹の異なるラットにおける静脈内ボーラス（１００ｍｇ／ｋｇ）後のＨ−ＮＯＸ三量体の血漿プロファイルを図１０に示す。Ｈ−ＮＯＸ三量体投与後のＩｇＧおよびＩｇＭ抗体応答を図１１に示す。
（実施例３）
虚血のｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルにおける脳組織浸透および低酸素の低下を実証するＨ−ＮＯＸ三量体候補の同定
灌流し脳組織に存続するＨ−ＮＯＸ三量体の同定のために、虚血性脳卒中の一時的ＭＣＡ閉塞齧歯類モデル（ｔＭＣＡＯ）において、少なくとも３時間の循環半減期を有するＨ−ＮＯＸ三量体候補を試験した。２４匹の雄ウィスターラットの群を使用して、リードＨ−ＮＯＸ三量体候補をそれぞれ試験した。Ｎ２Ｏ：Ｏ２（２：１）中２〜３％イソフルランにより導入チャンバー内で麻酔を導入し、ノーズコーンを介した１〜１．５％イソフルランにより維持した。後肢をつねることに対する引込めの欠如および目隠し反射の損失により、麻酔の適切な深さを評価した。動物に、腹腔内注射により４０ｍｇ／ｋｇのセファゾリンナトリウムおよび０．１ｍｇ／ｋｇの皮下ブプレノルフィンを与えた。標準的な縫合に基づく外科的技法を使用して、０日目に一時的中大脳動脈閉塞を開始した。簡潔に説明すると、右総頸動脈（ＣＣＡ）の上で皮膚切開を行って、ＣＣＡの一時的クランプと、外頸動脈（ＥＣＡ）の遠位セグメントの結紮を可能にした。近位ＥＣＡを通してナイロン縫合糸を挿入し、内頸動脈（ＩＣＡ）へと進め、脳への血流を閉塞した。ＣＣＡクリップを除去し、外科的ステープルで皮膚切開を閉鎖し、動物を覚醒させた。中大脳動脈閉塞の３０分後に、７５０ｍｇ／ｋｇ用量のＨ−ＮＯＸ三量体候補を尾静脈注射によりラットに注入した。組織低酸素を解析するために、Ｈ−ＮＯＸ三量体注射の約１５分後に、６０ｍｇ／ｋｇの低酸素マーカーのピモニダゾールを腹腔内注射して、虚血性組織を不可逆的に標識した。ラットに麻酔を施して、創傷を再び開き、ＥＣＡから血管内縫合糸を除去し、その後、再び創傷を閉鎖して、再灌流前に総計１時間の閉塞を施し、Ｈ−ＮＯＸ三量体注入の３０分後に閉塞を解除した。Ｈ−ＮＯＸ三量体の組織分布を解析し、低酸素の低下を定量化するために、再灌流の２、４、１２および２４時間後にラットを屠殺し（時点当たりＨ−ＮＯＸ三量体当たりＮ＝６匹のラット）、脳組織および血液を採取した。安楽死させた動物から得た脳の切片を作製し、その後の免疫組織化学的解析のために、それぞれＨ−ＮＯＸに対するポリクローナル抗体およびピモニダゾール低酸素マーカーに対するＨｙｄｒｏｘｙｐｒｏｂｅ抗体（Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｂｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ）を使用することにより、Ｈ−ＮＯＸ分布および組織低酸素を染色した。カメラを備える顕微鏡を使用して撮像し、染色を定量化した。虚血および再灌流は、神経細胞の細胞死の引き金を引き、虚血後損傷をもたらす炎症応答を開始することが公知である。二次エンドポイントとして、ＴＵＮＥＬアッセイ染色（Ｒｏｃｈｅ）を行ってＴＵＮＥＬ陽性細胞を計数することにより、また、切断カスパーゼ（Ｃｌｅａｖｅｄ Ｃａｓｐａｓｅ）−１、−３、ＢａｘおよびＢｃｌ−２を含むアポトーシスマーカーを染色することにより、脳組織におけるアポトーシスを測定した。複数の時点で採取した試料における血液化学検査を行って、Ｈ−ＮＯＸ三量体候補の使用に起因する炎症マーカーの低下ならびにいずれかの造血性および全身性効果を評価した。ＥＬＩＳＡ（Ｓｉｇｎｏｓｉｓラット炎症ＥＬＩＳＡキット）およびＲＴ−ＰＣＲを使用して、ラット血清のＴＮＦα、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−６、ＭＣＰ−１、ランテス（Ｒａｎｔｅｓ）およびＭＩＰを含む炎症促進性サイトカインの上方調節を定量化した。虚血性組織に浸透し、低酸素を有意に低下させたＨ−ＮＯＸ三量体候補を同定した。
（実施例４）
Ｈ−ＮＯＸ三量体は、虚血のｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルにおいて梗塞体積を低下させ、神経学的転帰を改善した
虚血および再灌流後の延長された時点における臨床的に意義のある評価に着目して、ラットｔＭＣＡＯ脳卒中齧歯類モデルにおいて、脳組織浸透および組織低酸素の低下を実証したＨ−ＮＯＸ三量体候補をさらに評価した。１２匹の雄ウィスターラットの群を使用して、リードＨ−ＮＯＸ三量体候補をそれぞれ試験した。Ｎ２Ｏ：Ｏ２（２：１）中２〜３％イソフルランにより導入チャンバー内で麻酔を導入し、ノーズコーンを介した１〜１．５％イソフルランにより維持した。後肢をつねることに対する引込めの欠如および目隠し反射の損失により、麻酔の適切な深さを評価した。動物に、腹腔内注射による４０ｍｇ／ｋｇのセファゾリンナトリウムおよび０．１ｍｇ／ｋｇの皮下ブプレノルフィンを与えた。標準的な縫合に基づく外科的技法を使用して、０日目に一時的中大脳動脈閉塞を開始した。簡潔に説明すると、右総頸動脈（ＣＣＡ）の上で皮膚切開を行って、ＣＣＡの一時的クランプと、外頸動脈（ＥＣＡ）の遠位セグメントの結紮を可能にした。近位ＥＣＡを通してナイロン縫合糸を挿入し、内頸動脈（ＩＣＡ）へと進めて、脳への血流を閉塞した。ＣＣＡクリップを除去し、外科的ステープルで皮膚切開を閉鎖し、動物を覚醒させた。中大脳動脈の閉塞開始３０分後に、７５０ｍｇ／ｋｇ用量のＨ−ＮＯＸ三量体候補またはバッファー対照を尾静脈注射によりラットに注入した。ラットに麻酔を施して、創傷を再び開き、ＥＣＡから血管内縫合糸を除去し、その後、再び創傷を閉鎖して、再灌流前に総計１時間の閉塞を施し、Ｈ−ＮＯＸ三量体注入の３０分後に閉塞を解除した。神経学的検査のため、再灌流の７２時間、１週間、２週間、３週間および４週間後に各動物を評価した。０〜４スケールでスコア化することにより、神経学的欠損に関して動物を評価し、以前に記載された通り、該スケールは、０が欠損なしを示し、１が置かれたときに前肢を伸ばすことができないことを示し、２が旋回を示し、３が片側性脱力を示し、４が自発運動活性の欠如を示す。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｂｏｒｌｏｎｇａｎ， Ｃ．Ｖ．ら（１９９８年）Ｅｘｐ Ｎｅｕｒｏｌ．、１４９巻：３１０〜３２１頁を参照されたい。再灌流後４週間目に動物を屠殺し、Ｈ＆Ｅ染色およびその後の組織学的解析のために脳組織を採取して、梗塞体積を評価した。梗塞体積測定のために、各動物脳から得た７枚の切片（＋４．７、＋２．７、＋０．７、−１．３、−３．３、−５．３および−７．３、それぞれブレグマと比較）をデジタルカメラにより撮影した。脳浮腫を補正するための「間接的方法」（インタクト対側性［左］半球の区域 − 同側性［右］半球のインタクト領域の区域）を使用して、Ｉｍａｇｅ Ｊにより各スライスの梗塞（ｉｎｆｒａｃｔ）区域を定量化した。スライス間の梗塞区域を合計し、スライスの厚さを乗じて、インタクト対側性半球体積のパーセンテージとして表される総梗塞体積を得た。バッファー対照動物との比較のために梗塞体積を測定し、０．０５レベルの有意性によるＡＮＯＶＡおよびＮｅｗｍａｎ−Ｋｅｕｌｓ多重範囲検定により、群毎のスコアを比較した。再灌流４週間後までの長期評価は、神経学的機能の改善または梗塞体積の低下のいずれも、Ｈ−ＮＯＸタンパク質の神経保護効果に起因し、単に、梗塞の遅い成熟による神経学的結果の発病の遅延によるものではないことを保証した。
（実施例５）
Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、がんのｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルにおける腫瘍浸透および酸素化を実証した
酸素は、放射線誘導性ＤＮＡ損傷および腫瘍死滅化を増強する決定的な因子である。固形腫瘍内の低い酸素レベルまたは低酸素は、腫瘍療法の治療効果を鈍らせ得る。例えば、腫瘍の低酸素領域において、放射線療法は、正常酸素レベルを有する腫瘍領域と比較して、有効性が３倍低いことが見出された。その結果、低酸素の領域を含有する腫瘍を有する多くの患者は、多くの場合、従来の腫瘍療法に対し不完全応答を示し、生存の予後が不良となる。患者転帰不良と低酸素との相関は、とりわけ、前立腺がん、肉腫、膵臓がん、頭頸部がん、子宮頸部がんおよび脳がんから生じる広範囲の腫瘍において観察されてきた。全てその全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｅｌｌｅｒ， ＢＪら（２００７年）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ ２６巻：２４１〜２４８頁；Ｖａｕｐｅｌ， Ｐ（２００４年）Ｓｅｍｉｎ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ、１４巻：１９８〜２０６頁；Ｖａｒｌｏｔｔｏ， Ｊら（２００５年）Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ、６３巻：２５〜３６頁；Ｒｏｃｋｗｅｌｌ， Ｓら（２００９年）Ｃｕｒｒ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．９巻：４４２〜４５８頁を参照されたい。
腫瘍に浸透するＨ−ＮＯＸタンパク質の能力を決定するために、皮下ＨＣＴ１１６結腸由来腫瘍を有する６匹のマウスの群に、尾静脈を介して７５０ｍｇ／ｋｇのＨ−ＮＯＸ単量体、７５０ｍｇ／ｋｇのＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体または食塩水対照を注射した。その後、注射後３０分または６０分にマウスを屠殺した。腫瘍を切除し、切片を作製し、抗Ｈ−ＮＯＸ抗体で染色し、Ｈ−ＮＯＸ染色強度を撮像した（図１２Ａ）。染色されたＨＣＴ−１１６腫瘍切片の定量化は、２３ｋＤａ Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ単量体が、３０分までに腫瘍に蓄積し、６０分までに部分的クリアランスを示したことを実証した（図１２Ｂ）。比較すると、８０ｋＤａ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体は、３０分までに腫瘍に蓄積し、注射後６０分で腫瘍に存続し、蓄積は注射後４時間にピークとなった（図１２Ｂ）。静脈内注射２時間後に、Ｈ−ＮＯＸ三量体は、血管系から腫瘍組織へと拡散する（図１２Ｃ）。Ｈ−ＮＯＸ抗体およびＣＤ３１抗体（血管系マーカー、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）による腫瘍切片の免疫組織化学染色。バッファーを注射したマウスにおいて蛍光染色は検出されない。
Ｈ−ＮＯＸタンパク質が腫瘍における低酸素を低下させたかを決定するために、皮下ＨＣＴ１１６結腸由来腫瘍を有する６匹のマウスの群に、尾静脈を介して７５０ｍｇ／ｋｇのＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ単量体、７５０ｍｇ／ｋｇのＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体または食塩水対照を注射した。安楽死に先立ち、腹腔内注射により低酸素マーカー、ピモニダゾールおよび静脈内注射により活性血管系マーカー、ＤｉＯＣ７３をマウスに与えた。Ｈ−ＮＯＸタンパク質注射の３０分または６０分後のいずれかに腫瘍を収集し、免疫組織化学検査により、ピモニダゾールについてＨｙｄｒｏｘｙｐｒｏｂｅ−１モノクローナル抗体により、総血管系を抗ＣＤ３１抗体によりアッセイした（図１３Ａ）。染色されたＨＣＴ−１１６腫瘍切片の定量化は、対照処置マウスとは対照的に、２３ｋＤａ Ｈ−ＮＯＸ単量体が、注射後３０分で低酸素を減少させたが、注射後６０分で低酸素における回復がないことを実証した（図１３Ｂ）。比較すると、８０ｋＤａ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体は、注射後３０分で低酸素を低下させるようではなかったが、注射後６０分で低酸素を実質的に低下させた（図１３Ｂ）。さらに別の実験は、皮下ＨＣＴ１１６結腸由来腫瘍を有するマウスにおいて、Ｈ−ＮＯＸ単量体が、腫瘍組織の至るところに分布し（図１４Ａ、下パネル）、抗ピモニダゾール抗体によって検出されるとおり血管系から離れた距離における腫瘍低酸素を軽減した（図１４Ｂ、下パネル）ことを確認した。血管系からの距離の関数としての染色量により、６匹のマウスから単離した腫瘍組織におけるＨｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１（抗ピモニダゾール抗体）染色を定量化した。最も近い血管から約１５０μｍの距離において、食塩水処置マウスの約１３μＭからＨ−ＮＯＸ単量体処置マウスの５μＭへと平均Ｈｙｐｏｘｙｐｒｏｂｅ−１染色が低下したことが判明した（図１４Ｃ）。マウスＲＩＦ−１肉腫異種移植片を有するマウスにおいて、これらの結果をさらに確認した。
ＲＩＦ−１肉腫腫瘍を有するマウスに、尾静脈を介して７５０ｍｇ／ｋｇのＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体または食塩水対照を注射した。安楽死に先立ち、腹腔内注射により低酸素マーカー、ピモニダゾールをマウスに与えた。Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体注射の１２０分後に腫瘍を収集し、免疫蛍光イメージングによりＨ−ＮＯＸ三量体分布をアッセイした（図１５）、あるいはウエスタンブロットにより、Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｂｅ−１モノクローナル抗体でピモニダゾールを、抗ＨＩＦ−１α抗体で低酸素誘導性因子１（ＨＩＦ−１α）を、抗Ｈ−ＮＯＸ抗体でＨ−ＮＯＸタンパク質を、抗アクチン抗体で総タンパク質をアッセイした（図１６）。免疫蛍光染色は、およそ４００ｍｍ３および８００ｍｍ３のサイズの大型の単離された腫瘍から調製された腫瘍切片におけるＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体の分布を実証した（図１５）。処置マウスの収集された腫瘍から得た細胞ライセートのウエスタンブロット解析は、Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体が腫瘍組織に局在化し、これらの腫瘍が、未処置マウスと比較して減少したピモニダゾールタンパク質付加物を有したことを実証した（図１６Ａ）。ウエスタンブロットの定量化は、食塩水処置マウスと比較して、処置マウスの腫瘍における低レベルのピモニダゾールタンパク質付加物と共に低レベルのＨＩＦ−１αタンパク質をさらに確認した（図１６Ｂおよび図１６Ｃ）。
（実施例６）
Ｈ−ＮＯＸタンパク質は、神経膠芽腫のｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルにおける腫瘍浸透および酸素化を実証した
腫瘍組織に浸透するＨ−ＮＯＸタンパク質の能力をさらに特徴付けるため、神経膠芽腫の３種のマウスモデルを使用して、脳腫瘍におけるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ単量体およびＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体の分布を評価した。脊柱に高度に浸潤性である、ＢＴ−１２細胞（小児期非定型奇形腫様／ラブドイド乳児脳腫瘍系）を使用して、小児神経膠芽腫のマウスモデルを作製し、ＧＢＭ−４３細胞を使用して、成体神経膠芽腫の放射線抵抗性モデルを作製し、Ｕ２５１細胞を使用して、成体神経膠芽腫の低酸素モデルを作製した。以前に記載された通りに神経膠芽腫マウスモデルを作製した。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｏｚａｗａ， Ｔら（２０１０年）Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ， Ｊｕｌ １３巻；（４１号）を参照されたい。簡潔に説明すると、ＢＴ−１２細胞、Ｕ２５１細胞またはＧＢＭ−４２細胞を頭蓋内注射のために収集し、１ｍＬ当たり約１×１０８細胞の濃度となるようダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に再懸濁した。ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内（ＩＰ）注射によりマウスを麻酔した。両足の足蹠をつねることによる足引込め反射を使用して、最初の切開に先立ち、また、手順を通して一定間隔で、麻酔の深さをモニターした。頭皮に沿って１ｃｍの矢状切開を行い、頭蓋縫合線を露出させた。ブレグマの３ｍｍ側方および０．５ｍｍ前方において、２５ｇ針による穿刺により小孔を作製した。滅菌Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジ（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を使用して、３ｍｍの深さで６０秒間の期間にわたり、３μｌ中の３×１０５細胞を注射した。注射後に、シリンジを１分間適所に保持し、続いてゆっくりと除去した。頭蓋を３％過酸化水素で消毒し、次に骨ろうで密封し、その後、７ｍｍ外科的ステープル（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を使用して頭皮を閉鎖した。０．１ｍｇ／ｋｇブプレノルフィンの皮下注射を与えたマウスを加熱パッドに置き、これらの試験において使用するための移動性を回復するまでモニターした。
Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体が、脳組織に浸透できるかを決定するために、Ｕ２５１同所性脳腫瘍を有するマウスに、尾静脈を介して７５０ｍｇ／ｋｇ Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ単量体または７５０ｍｇ／ｋｇ Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体のいずれかを注射した。安楽死に先立ち、腹腔内注射により低酸素マーカー、ピモニダゾールをマウスに与えた。免疫組織化学解析のため、Ｈ−ＮＯＸタンパク質投与の約２時間後に脳を単離し、切片を作製し、Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｂｅ−１モノクローナル抗体でピモニダゾールを、抗ＨＩＦ−１α抗体で低酸素誘導性因子１（ＨＩＦ−１α）を、抗Ｈ−ＮＯＸ抗体でＨ−ＮＯＸタンパク質を、抗ＨＬＡ−ＡＢＣ抗体（ＮｖｕｓＢｉｏｌｏｇｉｃａｌラットモノクローナル抗体クローン＃ＹＴＨ８６２．２）でＨＬＡ−ＡＢＣタンパク質を染色した。免疫蛍光イメージングのために、Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈによって製造されたＦＩＴＣ（緑色チャネル）とコンジュゲートした抗ウサギ抗体にコンジュゲートした二次抗体およびＤＡＰＩで脳組織試料のセットをさらに染色した。Ｈ−ＮＯＸ三量体で処置したマウスは、対照処置マウスと比較して、Ｈ−ＮＯＸの染色の増加を実証し、Ｈ−ＮＯＸ三量体が脳組織に浸透したことを示した（図１７Ａ）。加えて、Ｈｙｄｒｏｘｙｐｒｏｂｅ−１モノクローナル抗体によるピモニダゾールの染色の減少は、Ｈ−ＮＯＸ三量体投与が、注射後６０分で低酸素を実質的に低下させたことを示した（図１７Ｂ）。ピモニダゾールおよびＨＩＦ−１αタンパク質の染色の減少を免疫蛍光画像においてさらに観察した（図１８Ａおよび図１８Ｃ）。免疫蛍光画像の定量化は、食塩水処置マウスと比較して、Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体処置マウスの腫瘍における低レベルのピモニダゾール染色と低レベルのＨＩＦ−１αタンパク質染色を実証した（図１８Ｂおよび図１８Ｄ）。
図１９は、Ｕ２５１同所性脳腫瘍および健常脳におけるＨ−ＮＯＸ三量体の体内分布を示す。高拡大率でのＨ−ＮＯＸ三量体の蛍光イメージングは、健常脳における血管外部への弱い拡散を示す。
Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ単量体およびＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体の間の浸透および保持時間を比較するために、同所性脳腫瘍を有するマウスに、尾静脈を介して７５０ｍｇ／ｋｇ Ａｌｅｘａ−６４７標識Ｈ−ＮＯＸ単量体または７５０ｍｇ／ｋｇ Ａｌｅｘａ−６４７標識Ｈ−ＮＯＸ三量体のいずれかを注射し、様々な時点で生物発光イメージングに供した。Ａｌｅｘａ−６４７標識Ｈ−ＮＯＸタンパク質を作製して、次の通りに、蛍光標識したＨ−ＮＯＸタンパク質の蛍光励起および発光スペクトルを確認した。
精製タンパク質、Ｈ−ＮＯＸ単量体タンパク質、Ｈ−ＮＯＸ三量体またはＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ、対照として使用）を氷上で解凍し、エンドトキシンフリー透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、７ｋＤａ ＭＷＣＯ）を使用して、エンドトキシンフリー標識バッファー（５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）にバッファー交換した。ＵＶ−ｖｉｓ分光法により、標識バッファーへと透析した後のタンパク質濃度を決定した。標識反応への添加の直前にＡｌｅｘａ ６４７色素（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７カルボン酸、スクシンイミジルエステル、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ＃Ａ−２０００６）を調製した。色素を室温に温め、次に、最終濃度１０ｍｇ／ｍＬとなるようＤＭＳＯに溶解した。この混合物を１０秒間ボルテックスし、続いて色素を各標識反応に添加した。標識反応は、様々なタンパク質：色素比を使用して、Ａｌｅｘａ標識の程度を制御した。反応物は、最終ＤＭＳＯ濃度５〜１０％に対してタンパク質（標識バッファーに溶解）および色素からなった。穏やかに振盪しつつ、反応物を１時間室温でインキュベートした（光から保護した）。反応後に、エンドトキシンフリー透析カセット（Ｐｉｅｒｃｅ Ｓｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ、７ｋＤａ ＭＷＣＯカットオフ）を使用したエンドトキシンフリー製剤バッファー（３０ｍＭトリエタノールアミン、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）への大規模透析により、遊離Ａｌｅｘａ色素を除去した。
製剤バッファーへと透析した後、標識後の色素のタンパク質に対するモル比を決定するため、Ｈ−ＮＯＸ（２８０および４１５ｎｍ）およびＡｌｅｘａ色素（６５３ｎｍ）の固有吸光度を使用したＵＶ−ｖｉｓ分光法により、タンパク質濃度および標識の程度を決定した。６４７ｎｍにおける励起による標識タンパク質の蛍光を解析して、発光スペクトルを収集した。標識タンパク質の発光スペクトルは、公表データおよびＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎデータと一致した。サイズ排除クロマトグラフィーにより標識タンパク質をさらに解析して、標識がタンパク質のオリゴマー形成状態に影響を与えないことを確実にした。Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＬＡＬ Ｇｅｌ Ｃｌｏｔアッセイ（０．０３ＥＵ／ｍＬ感度）を使用して、標識タンパク質における最終のエンドトキシンの混入を決定した。
生物発光イメージングのため、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射によりマウスを麻酔し、続いてＩＰにより、滅菌食塩水に溶解した３３．３ｍｇのＤ−ルシフェリン（カリウム塩、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）を注射した。ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアを使用して、ピークピクセル強度の２５％の下位閾値（ｌｏｗｅｒ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ ｖａｌｕｅ）によって定義される、目的の領域における毎秒光子計数の合計として、ルシフェリン注射の１０分後に腫瘍生物発光を決定した。画像取得は非侵襲的であり、加熱したイメージングプラットフォームを使用して動物体温を維持した。Ｈ−ＮＯＸ単量体またはＨ−ＮＯＸ三量体で処置したＢＴ−１２マウスに対して、注射後０、０．５、１、２および４時間にイメージングを行った。Ｈ−ＮＯＸ単量体またはＨ−ＮＯＸ三量体で処置したＧＢＭ−４１マウスに対して、注射後０、０．５、１、２、４および６時間にイメージングを行った。Ｈ−ＮＯＸ単量体またはＨ−ＮＯＸ三量体で処置したＵ２５１マウスに対して、注射後０、０．５、１、２、４、６および７２時間にイメージングを行った。腫瘍生物発光は、同所性ＧＢ異種移植片を有するマウスにおける腫瘍体積に正比例することが以前に示された。その全体が参照により本明細書に組み込まれる、Ｍｏｅｌｌｅｒ， ＢＪら（２００７年）Ｃａｎｃｅｒ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ Ｒｅｖ、２６巻：２４１〜２４８頁を参照されたい。Ｈ−ＮＯＸ単量体および三量体体内分布の比較は、神経膠芽腫のＢＴ−１２マウスモデルにおいて、Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ単量体（図２０Ａ）およびＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体（図２０Ｂ）が両者共に脳腫瘍に浸透したことを実証した。Ｈ−ＮＯＸ三量体は、Ｈ−ＮＯＸ単量体と比較して、腫瘍における有意により長い保持時間を有した。ＨＮＯＸ単量体が、２時間までに大部分が腫瘍から排除された（図２０Ａ）一方、Ｈ−ＮＯＸ三量体は、数時間腫瘍に蓄積し続けた（図２０Ｂ）。Ｈ−ＮＯＸ単量体注射後３０および６０分（図２１Ａおよび図１８Ｂ）ならびにＨ−ＮＯＸ三量体注射後６０分（図２１Ｃ）にマウスから単離された脳組織のｅｘ ｖｉｖｏイメージングにより、Ｈ−ＮＯＸ頭蓋内局在化を確認した。注射後３０、６０、１２０および２４０分の生物発光によるさらなる可視化は、Ｈ−ＮＯＸ単量体（図２２）およびＨ−ＮＯＸ三量体（図２３）が、脊柱における転移性コロニーにも局在化したことも実証した。Ｈ−ＮＯＸ単量体は、Ｈ−ＮＯＸ三量体（図２３Ａ）と比較して、３０分で脊柱に実質的に蓄積した（図２２Ａ）が、２時間までに大部分が排除され（図２２Ｂ〜Ｄ）、その一方、Ｈ−ＮＯＸ三量体は、数時間脊柱に蓄積し続けた（図２３Ｂ〜Ｄ）。より少量の標識タンパク質を使用し、シグナル強度を増加させることにより、Ｈ−ＮＯＸ単量体が、経時的に腎臓に蓄積したことが明らかになり、排除の経路が示唆された（図２４）。
ＧＢＭ−４３（図２５）およびＵ２５１マウスモデル（図２６）において、脳および脊柱におけるＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体の蓄積を確認した。より高用量のＨ−ＮＯＸ三量体用量２９５ｍｇ／ｋｇおよびより低用量の３０ｍｇ／ｋｇを注射したＵ２５１マウスにおいて、Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体の局在化をさらに調査した。注射後０、０．５、１、２、４および６時間における生物発光イメージングは、Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体が、高および低濃度のＨ−ＮＯＸ三量体投与（それぞれ図２７および図２８）の両方において、マウスの脳腫瘍に蓄積したことを実証した。比較すると、Ｈ−ＮＯＸ単量体 Ｌ１４４ＦバリアントからアセンブルしたＨ−ＮＯＸ三量体の局在化は、３０ｍｇ／ｋｇ注射後０、０．５、１、２、４および６時間の生物発光画像によって証明される通り（図２９）、小型の脳腫瘍に蓄積しなかった。３０ｍｇ／ｋｇ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体（図３０Ａ）または７５０ｍｇ／ｋｇ Ｌ１４４Ｆ三量体（図３０Ｂ）で処置したマウスから単離された脳のｅｘ ｖｉｖｏ生物発光イメージングは、単回用量のＨ−ＮＯＸタンパク質の量が、頭蓋内腫瘍へのＨ−ＮＯＸ局在化に殆ど効果がないことを示した。さらに、大型（図３０Ｃ）または小型の腫瘍（図３０Ｄ）を有するマウスのリアルタイム生物発光イメージングは、２９５ｍｇ／ｋｇのＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体の投与後に、腫瘍サイズにかかわらず三量体が頭蓋内腫瘍に分布したことを示した（図３０Ｂ）。神経膠芽腫の３種のマウスモデル、ＧＢＭ、Ｕ２５１およびＢＴ−１２のリアルタイムおよびｅｘ ｖｉｖｏ生物発光イメージングは、Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体が、全３種のモデルにおいて頭蓋内腫瘍および脊髄腫瘍に分布したことを実証した（図３１および図３２）。Ｈ−ＮＯＸタンパク質および血管系に対する抗体で染色した腫瘍切片の免疫蛍光イメージングは、Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体が血管系を通り過ぎて、脳腫瘍の至るところに拡散したことを示した（図３３）。全体的に見て、これらのデータは、臨床的に意義のある腫瘍体内分布プロファイルを有するＨ−ＮＯＸタンパク質を同定した。
血漿および脳の間におけるＨ−ＮＯＸ三量体の分配を確かめるために、３匹の雌ＦＶＢマウスの群を使用してＬ１４４Ｆ三量体を試験した（図３４）。尾静脈への静脈内ボーラス注射による２００および７５０ｍｇ／ｋｇの用量で、時間０の時点で候補Ｈ−ＮＯＸ三量体を注射した。候補Ｈ−ＮＯＸ三量体またはバッファー対照の注射後３０分、１時間、１．５時間および２時間にマウスを屠殺した。心臓内穿刺により約１ｍｌの血液を採取し、脳を収集した。採取した血液を処理して血漿にし、脳試料を溶解（ｌｙｚｅｄ）して、タンパク質を抽出した。その後、Ｈ−ＮＯＸタンパク質に対するポリクローナル抗体によるＥＬＩＳＡアッセイを使用して、Ｈ−ＮＯＸ三量体の存在に関して血漿および脳を解析した。
（実施例７）
Ｈ−ＮＯＸ三量体は、神経膠芽腫のｉｎ ｖｉｖｏマウスモデルにおける放射線の効果を増強した
Ｈ−ＮＯＸ浸透による低酸素腫瘍の酸素化が、放射線誘導性の腫瘍死滅化を増強し得るかを決定するために、頭蓋内神経膠芽腫腫瘍を有する１０匹の胸腺欠損Ｕ２５１マウスの群において試験を行って、Ｈ−ＮＯＸ三量体の存在下における放射線療法（ＲＴ）の効果を評価した。静脈内注射によって送達される７５０ｍｇ／ｋｇ Ａｌｅｘａ−６４７標識Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体の投与ありまたはなしのいずれかで、腫瘍植え込み後１５、１７および２０日目に、１分割当たり２Ｇｙの３分割の放射線療法によりマウスを処置した。２９日目までマウスをモニターし、１５、１７、２０、２２、２４および２９日目に生物発光イメージングに供した。処置群毎に決定された平均生物発光イメージング（ＢＬＩ）スコアは、複数用量のＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体が、腫瘍成長に統計学的に有意な遅延をもたらし（図３５Ａおよび図３５Ｂ）、処置したＵ２５１同所性腫瘍の浸潤性かつ軽度に低酸素な性質にもかかわらず、Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ処置群において動物生存も有意に増強された（図３５Ｃ）ことを実証した。免疫組織化学染色および解析のためにも腫瘍を収集した。
頭蓋内神経膠芽腫腫瘍を有する２種のマウスモデル、Ｕ２５１およびＧＢＭ４３において、ヒト神経膠芽腫の放射線療法におけるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体の効果をさらに調査した。１試験において、頭蓋内神経膠芽腫腫瘍を有する１０匹の雌胸腺欠損Ｕ２５１マウスの群を、１）処置バッファー単独、２）単一線量の２Ｇｙ放射線（照射器セットアップ＝０．８１；セシウム照射器の線量率は２４７ＣＧｙ／分）と組み合わせた処置バッファー、３）ＩＶによる７５０ｍｇ／ｋｇ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体単独または４）単一線量の２Ｇｙ放射線（照射器セットアップ＝０．８１；セシウム照射器の線量率は２４７ＣＧｙ／分）と組み合わせたＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体のいずれかで処置した。Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体送達の２時間後に、併用処置を与えるマウスの脳のテント上部分（ｓｕｐｒａｔｅｎｔｏｒｉａｌ ｐｏｒｔｉｏｎ）に照射を行った。３．０×１０５ Ｕ２５１細胞によるマウスの頭蓋内注射の１４日後に、全マウスの処置を始めた。動物生存が、Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体および２Ｇｙ放射線の併用処置を与えたコホートにおいて増加したことが判明した（図３６Ａ）。別の試験において、頭蓋内神経膠芽腫腫瘍を有する１０匹のＧＢＭ４３マウスの群を、１）２Ｇｙ放射線療法；２）４Ｇｙ放射線療法；３）８Ｇｙ放射線療法；４）２サイクルの４Ｇｙ放射線療法；５）Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体と組み合わせた４Ｇｙ放射線療法または６）処置バッファーのいずれかで処置した。Ｈ−ＮＯＸ三量体送達の１〜１．５時間後に併用処置を与えるマウスを照射し、ＲＴの複数線量を与えるマウスは、４日間空けてＲＴを投与した。全ＲＴ群において、脳のテント上部分に放射線処置を投与した。腫瘍植え込み７日後に全マウスの処置を始めた。Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体および４Ｇｙ放射線の併用処置を与えたコホートにおける動物生存が、４Ｇｙ処置単独を与えたコホートにおける動物生存と同様であったことが判明した（図３６Ｂ）。
（実施例８）
Ｈ−ＮＯＸタンパク質の毒性試験
ＩＮＤ許可申請（ＩＮＤ−ｅｎａｂｌｉｎｇ）毒性試験を見込んだＨ−ＮＯＸ単量体の安全性プロファイルを評価するために、ＦＤＡ認定の独立した医薬品開発受託機関（Ｃｏｎｔｒａｃｔ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ）（ＭＰＩ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）において、スプラーグドーリー（Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙ）ラットにおける予備的ＧＬＰ様毒性試験を行った。１００および３００ｍｇ／ｋｇ用量のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ単量体において、注射（ＩＶ）４８時間後に有害事象または対照との差は検出されなかった。１０００ｍｇ／ｋｇ最大実行可能用量において、毒性のある程度の軽度適応症が記述された（表４）。４８時間の白血球細胞（ｗｈｉｔｅ ｂｌｏｏｄ ｃｅｌｌ）数の上昇は、タンパク質製剤に存在する微量のエンドトキシンによる可能性があり、このようなレベルは、さらなる試験のための生産の実行において１００倍低下した。別々の試験において、ラットに、５０ｍｇ／ｋｇ Ｌ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ単量体またはＬ１４４Ｆ Ｈ−ＮＯＸ三量体のいずれかを注射し、３２日目まで追跡した。ＩｇＭおよびＩｇＧ抗治療抗体の両方が作製されたが、Ｈ−ＮＯＸバリアントまたは用量数（最大４用量を試験）にかかわらず、アナフィラキシーショックの症例はなかった。
（実施例９）
神経膠芽腫のｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおける最小Ｈ−ＮＯＸ三量体投薬スケジュールの特徴付け
ＩＮＤ許可申請毒性試験および臨床試験のデザインを最も良く通知するため、Ｕ２５１神経膠芽腫マウスモデルを使用して、リードＨ−ＮＯＸ三量体の用量レベルおよびスケジュールを特徴付ける。神経膠芽腫の追加の動物モデルにおいて、これらの試験の結果を確かめて、患者選択を最も良く通知する。
ＲＴを増強するリードＨ−ＮＯＸ三量体の最小有効用量を同定する
リードＨ−ＮＯＸ三量体を与えた患者における有害事象を最小化するために、また、腫瘍の酸素化および放射線増感におけるリードＨ−ＮＯＸ三量体の薬力学（ＰＤ）を定量化するために、Ｕ２５１神経膠芽腫マウスモデルにおけるＨ−ＮＯＸ三量体の最小有効用量（ＭＥＤ）を同定する。予備試験は、７５０ｍｇ／ｋｇ Ｈ−ＮＯＸ三量体の用量において、投与２時間後に腫瘍低酸素の実質的な低下がもたらされ（図１７Ａおよび図１７Ｂ）、この効果がＲＴに対する腫瘍応答を有意に増強するのに十分であった（図３５）ことを実証した。他の異種移植腫瘍試験は、Ｈ−ＮＯＸ三量体が、１０ｍｇ／ｋｇもの低さの用量で腫瘍に蓄積したことを実証し、効果的な用量の広範な潜在的範囲を確立した。Ｈ−ＮＯＸ三量体のＭＥＤを同定するため、ＲＴに対する腫瘍応答の増強に７．５ｍｇ／ｋｇ〜７５０ｍｇ／ｋｇに及ぶ投薬量を使用する。
Ｈ−ＮＯＸ三量体ＭＥＤを同定するために、以前に確立された効果的用量の７５０ｍｇ／ｋｇに対し、７５ｍｇ／ｋｇおよび７．５ｍｇ／ｋｇ用量の放射線増感効果を比較する（表５）。ルシフェラーゼ修飾Ｕ２５１ヒトＧＢ細胞系を使用して、ＧＢの同所性マウスモデルに対する有効性を試験する。１０匹のマウスの１コホートを使用して、生物発光イメージングにより腫瘍成長を追跡し、生存を追跡する。それぞれ３匹のマウスの３種の追加のコホートを使用して、免疫組織化学検査および定量的ＥＬＩＳＡによるＨ−ＮＯＸ三量体局在化、低酸素のマーカーとしてＥＦ５を使用した免疫組織化学検査による腫瘍酸素化、ならびにγＨ２ＡＸ染色を使用した免疫組織化学検査によるＤＮＡ損傷の評価を含む、Ｈ−ＮＯＸ三量体作用の背後にある分子機序を試験する（表５）。
これらの試験のために、１ｍＬ当たり約１×１０８細胞の濃度となるようＵ２５１細胞をダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ）に再懸濁する。ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）の腹腔内（ＩＰ）注射により胸腺欠損マウスを麻酔する。頭皮に沿って１ｃｍの矢状切開を行い、ブレグマの３ｍｍ側方および０．５ｍｍ前方において、２５ｇ針による穿刺により小孔を作製する。滅菌Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジ（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を使用して、６０秒間の期間にわたり３ｍｍの深さに、３μｌ体積中３×１０５細胞を注射する。注射後に、シリンジを除去し、頭蓋を骨ろうで密封し、その後、７ｍｍ外科的ステープル（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を使用して頭皮を閉鎖する。Ｏｚａｗａ， Ｔら（２０１０年）Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ， Ｊｕｌ １３巻；（４１号）を参照されたい。マウスに、０．１ｍｇ／ｋｇブプレノルフィンの皮下注射を与え、移動性を回復するまでモニターする。腫瘍植え込み後２１〜２５日間の間、尾静脈注射により、ＲＴの２時間前にコホート毎に表示の投薬量のＨ−ＮＯＸ三量体を投与し、テント上脳全体に２Ｇｙ／回のＲＴが投与される（表６）。全脳ＲＴ投与のため、およそ２８０ｃＧｙ／分の線量率を送達する１３７Ｃｓ源を使用し、２Ｇｙを生じるだけの長さの時間でマウスを照射する。
全ＲＴスケジュールは、２Ｇｙ／回を１週間に３回からなる
試験経過を通して生物発光イメージングにより非浸潤性腫瘍成長をモニターする。生物発光イメージングのため、ケタミン（１００ｍｇ／ｋｇ）およびキシラジン（１０ｍｇ／ｋｇ）のＩＰ注射によりマウスを麻酔し、続いて、滅菌食塩水に溶解した３３．３ｍｇのＤ−ルシフェリン（カリウム塩、Ｇｏｌｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ、ＵＳＡ）をＩＰにより注射する。ＩＶＩＳ Ｌｕｍｉｎａ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｃａｌｉｐｅｒ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ａｌａｍｅｄａ、ＣＡ、ＵＳＡ）およびＬｉｖｉｎｇＩｍａｇｅソフトウェアを使用して、ピークピクセル強度の２５％の下位閾値によって定義される目的の領域における毎秒光子計数の合計として、ルシフェリン注射の１０分後に腫瘍生物発光を決定する。生存解析のため、体重が１５％を超えて減少したら、あるいは神経学的欠損が観察されたらマウスを安楽死させる（Ｎ有効性、表５）。
腫瘍酸素化または低酸素低下、および腫瘍におけるＨ−ＮＯＸ三量体局在化を調査するために、各投薬量群由来の３匹のマウスに、低酸素の臨床バイオマーカーである１０ｍＭ ＥＦ５をＩＶにより注射し、全脳切片におけるＩＨＣ解析のためにＲＴの直後に屠殺する（Ｎ低酸素およびＨ−ＮＯＸ三量体ＩＨＣ、表５）。ＲＴの直後に３匹のマウスの追加のコホートを屠殺し、定量的ＥＬＩＳＡによるＨ−ＮＯＸ三量体含有量の解析のために腫瘍を切除する（ＮＨ−ＮＯＸ三量体ＥＬＩＳＡ、表５）。ＲＴ完了の２時間後に、全脳切片におけるγＨ２ＡＸ ＩＨＣによるＤＮＡ損傷の解析のために３匹のマウスの追加のコホートを屠殺する（ＮＤＮＡ損傷ＩＨＣ、表５）。ＲＴ有効性解析ならびに低酸素、腫瘍局在化およびＤＮＡ損傷の分子解析のため、ＡＮＯＶＡとその後の対応するｔ検定により統計学的解析を行い、Ｐ≦０．０５における変化を統計学的に有意であるとみなす。生存解析のため、ログランク検定は、１．５のエフェクトサイズを検出する８８％検出力のための０．０５に等しい両側アルファで使用する。エフェクトサイズは、処置内標準偏差で割った平均生存の差として定義される。
リードＨ−ＮＯＸ三量体の滞留時間および腫瘍における酸素化を放射線増感と相関させる
Ｈ−ＮＯＸ三量体の標的臨床プロファイルをより良く通知するために、放射線増感をもたらす腫瘍におけるＨ−ＮＯＸ三量体酸素化効果の長寿命を調査する。Ｈ−ＮＯＸ三量体のピーク頭蓋内腫瘍局在化時間枠に基づき、様々な時点でＲＴを投与し（図２６）、Ｈ−ＮＯＸ三量体のＭＥＤを使用して、Ｈ−ＮＯＸ三量体投与およびＲＴの間の時間の長さを変える（表６）。Ｈ−ＮＯＸ三量体のＭＥＤを決定するための試験と同様に、腫瘍組織におけるＨ−ＮＯＸ三量体分布、低酸素低下、ＤＮＡ損傷、腫瘍成長遅延および生存全体の増強等、数種類の薬力学的パラメータを評価する。
ＧＢの追加のクラスにおけるＨ−ＮＯＸ三量体媒介性放射線増感の再現性
Ｈ−ＮＯＸ三量体媒介性放射線増感に関して、３種の分子的に定義される臨床ＧＢサブクラスが試験される。以前に記載された通りに、これら３種のサブクラスの細胞系（ＧＢＭ４３、ＧＢＭ６およびＧＢＭ１４）に由来する異種移植モデルを確立する。Ｖｅｒｈａａｋら（２０１０年）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、１７巻：９８〜１１０頁およびＰｈｉｌｌｉｐｓら（２００６年）Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ、９巻：１５７〜１７３頁を参照されたい。簡潔に説明すると、これら３種のマウスモデルの作製のために、これら３種のがん型の皮下腫瘍をメスで刻み、４０μｍポアフィルターによる３ラウンドの通過に供し、濾過の各ラウンド後に、１５８×ｇ、３５５×ｇ、６３１×ｇと増加するスピードで各１０分間、遠心分離を行う。最終ラウンドの遠心分離後に、細胞を１ｍＬの滅菌ＤＭＥＭ培地に再懸濁し、計数し、頭蓋内注射のため１×１０８細胞／ｍＬとなるよう希釈する。その上、ＧＢの免疫適格性モデルにおいて（ＧＬ２６１）、Ｈ−ＮＯＸ三量体媒介性放射線増感を試験するが、これは、ＧＢ患者におけるインタクト免疫系を再現する。ＧＬ２６１マウスモデルの作製のため、Ｃ５７ＢＬ／６マウスと同系のマウスＧＢ細胞系を使用して、Ｕ２５１モデルと同様に腫瘍細胞収集および注射を行う。Ｎｅｗｃｏｍｂら（２００６年）Ｃｅｌｌ Ｃｙｃｌｅ（５巻）：９３〜９９頁を参照されたい。有効性試験のため、腫瘍モデル毎に４種の実験群を使用する（表７）。Ｕ２５１モデルと同様に、腫瘍モデルが７５％完了したら処置が開始され、生存の平均日数が１００％完了を反映する。Ｈ−ＮＯＸ三量体のＭＥＤを決定するための試験と同様に、腫瘍組織におけるＨ−ＮＯＸ三量体分布、低酸素低下、ＤＮＡ損傷、腫瘍成長遅延および生存全体の増強等、薬力学的パラメータを評価する。
（実施例１０）
神経膠芽腫のｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおけるＨ−ＮＯＸ三量体単回用量毒性の薬力学的特徴付け
ＩＮＤ許可申請ＧＬＰ毒性試験の種選択を正当化するために、また、第１ｂ相臨床試験を通知するため、ラット（齧歯類）およびイヌ（非齧歯類）において探索的非ＧＬＰ毒性およびＧＢ ＰＤ試験を行う。Ｈ−ＮＯＸ三量体は、ヒト特異的標的に結合しないかまたはそれと反応しないため、非霊長類種がＦＤＡに許容される。
ラットにおける非ＧＬＰ単回用量範囲探索毒性試験
Ｈ−ＮＯＸ三量体の最大耐量（ＭＴＤ）を同定し、Ｈ−ＮＯＸ三量体の毒性および毒物動態（ＴＫ）プロファイルを特徴付けするために、スプラーグドーリー（ＳＤ）ラットにおける非ＧＬＰ単回用量試験を行う。
少なくとも６〜８週齢の雄および雌ＳＤラットを５試験群に割り当てる（表８）。各動物に、尾静脈における緩徐なＩＶボーラス（４〜５分間）投与により、最大１０ｍＬ／ｋｇの容量で、媒体またはＨ−ＮＯＸ三量体を与える。各用量の間に３日間を置いて１群同時に動物に投薬する。Ｈ−ＮＯＸ三量体用量レベルは、ほぼＭＥＤから最大実行可能用量に及ぶ。投薬後一定間隔で血漿試料を採取して、Ｈ−ＮＯＸ三量体の血漿薬物動態（ＰＫ）を評価する。毒物動態解析の時点は、ＰＫ結果に基づく。動物の直近の体重に基づき、用量を容積測定的に（ｖｏｌｕｍｅｔｒｉｃａｌｌｙ）投与する。次の用量を選択する前に、臨床観察、体重、摂食量および臨床的病状をよく調べる（表９）。最大１４日間の回復期間は、いずれかの毒性事象の残留性、発生遅延および回復の評価を可能にする。
ＧＢのラットモデルにおけるＨ−ＮＯＸ三量体腫瘍分布およびＰＤを評価する
Ｈ−ＮＯＸ腫瘍分布および低酸素低下が、ラットおよびマウスで同様であることを確かめるために、ラット９Ｌ神経膠腫モデルにおけるＨ−ＮＯＸ三量体の腫瘍分布およびＰＤを評価する。ラット９Ｌ神経膠腫モデルを作製するために、以前に記載された通りに、ウィスター（Ｗｉｓｔａｒ）ラットの頭蓋内に９Ｌ神経膠腫細胞を植え込む。Ｓｔｏｊｉｌｊｋｏｖｉｃら（２００３年）Ｊ． Ｎｅｕｒｏｏｎｃｏｌ（６３巻）：１〜７頁を参照されたい。簡潔に説明すると、頭蓋内注射のためにラット神経膠腫細胞系である９Ｌ細胞を単層トリプシン処理により収集し、ＤＭＥＭへ再懸濁して５μＬ中４×１０４細胞の濃度にする。１０ｍＭケタミンおよび７．５ｍｇ／ｋｇキシラジンのＩＰ注射により麻酔を導入する。頭皮に沿って２ｃｍの矢状切開を行い、ブレグマの３ｍｍ側方および０．５ｍｍ前方において、小型の歯科用ドリルを使用して穿頭孔を作製する。滅菌Ｈａｍｉｌｔｏｎシリンジ（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を使用して、４．５ｍｍの深さに６０秒間の期間にわたり、１０μｌ中の５×１０５細胞を注射する。注射後にシリンジを除去し、頭蓋を骨ろうで密封し、その後、７ｍｍ外科的ステープル（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ）を使用して頭皮を閉鎖する。１０ｍＬ／ｋｇを超えない投薬容量で、２７ｇ針を使用した尾静脈注射によりＨ−ＮＯＸ三量体をラットに投与する。Ｈ−ＮＯＸ三量体投与の１時間後に、ラットに１０ｍＭ用量の低酸素マーカー、ＥＦ５をＩＶにより与える。Ｈ−ＮＯＸ投与の２時間後に、免疫組織化学解析によるＨ−ＮＯＸ三量体局在化および低酸素定量化のためまたはＥＬＩＳＡによるＨ−ＮＯＸ三量体定量化のために、ラットを安楽死させ、腫瘍を有する脳を収集する（表１０）。
イヌにおける非ＧＬＰ単回用量範囲探索毒性試験
ビーグル犬においてＨ−ＮＯＸ三量体の毒性および毒物動態を調査する。簡潔に説明すると、少なくとも５か月齢の雄および雌ビーグル犬を４投薬群に割り当てる（表１１）。Ｈ−ＮＯＸ三量体用量レベルは、この種に計算された均等量としてのほぼＭＥＤから最大実行可能用量に及ぶ。橈側皮静脈を介した緩徐なＩＶボーラスにより、各動物にＨ−ＮＯＸ三量体を与える。投薬後に一定間隔で血漿試料を採取して、Ｈ−ＮＯＸ三量体の血漿薬物動態（ＰＫ）を評価する。毒物動態解析の時点は、ＰＫ結果に基づく。動物の直近の体重に基づき、用量を容積測定的に投与する。次の用量を選択する前に臨床観察、体重、摂食量および臨床的病状をよく調べる（表１２）。最大１４日間の回復期間は、いずれかの毒性事象の残留性、発生遅延および回復の評価を可能にする。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン４．０３）を使用して統計学的解析を行う。パラメトリック（例えば、反復測定分散分析と、続くダネットの多重比較ｔ検定）またはノンパラメトリック（例えば、フリードマン検定およびダンの事後検定）統計学的手順のいずれかを使用して、各対応するデータ解析時点において、媒体およびＨ−ＮＯＸ三量体試験群の間で比較を行う。パラメトリックまたはノンパラメトリック統計学の選択は、比較される群が分散基準の均一性を満たすかどうかに基づく。媒体およびＨ−ＮＯＸ三量体処置の間の差は、ｐ＜０．０５として記述される。
ＧＢのイヌモデルにおけるＨ−ＮＯＸ三量体腫瘍分布およびＰＤを評価する
齧歯類ＧＢモデルに観察された腫瘍分布および酸素化が、ヒト腫瘍と同様に腫瘍に代表的であることを確認するために、ＧＢを有するイヌにおける第１ｂ相様試験を行って、自発的脳腫瘍におけるＨ−ＮＯＸ三量体蓄積を測定し、低酸素のための臨床的に意義のあるリアルタイムＰＥＴプローブ（およびＰＥＴプローブを使用することができる；例えば、１８Ｆ−ＭＩＳＯの１８Ｆ−ＥＦ５）を使用して低酸素の変化を定量化する。クライアントが所有する、自発的ＧＢを有する１０匹のイヌ（本明細書において「イヌ患者」と称される）を本試験に登録する。全体的に見て、イヌ患者に、前または後の１８Ｆ−ＥＦ５ ＰＥＴ走査を伴う単回用量のＨ−ＮＯＸ三量体を与えて、Ｈ−ＮＯＸ三量体処置に起因する腫瘍低酸素のいずれかの変化を評価する。Ｈ−ＮＯＸ三量体投与に先立ち、低酸素腫瘍（腫瘍：正常脳比２．０として定義）がないイヌを本試験から除外する。十分に低酸素腫瘍を有するイヌ患者について、初期ＰＥＴ走査の７２時間以上後に、Ｈ−ＮＯＸ三量体による処置を予定する。１０ｍＬ／ｋｇを超えない投薬容量のボーラスＩＶ注射としてＨ−ＮＯＸ三量体を投与する。Ｈ−ＮＯＸ三量体投薬量レベルは、ＭＥＤから始まり、３＋３用量漸増デザインに従って漸増する。３用量レベル後にまたは１匹以上のイヌにおいて用量規制毒性に達したら用量漸増を停止する。Ｈ−ＮＯＸ三量体投与の２時間後に、イヌ患者は、第２のＰＥＴ走査を受け、腫瘍低酸素をスコア化する。ＰＥＴ走査のため、麻酔に先立つ１２時間食物を与えない。各イヌ患者に静脈内カテーテルを置き、１０〜２５ｍｇ／ｋｇチオペンタールまたは６ｍｇ／ｋｇプロポフォールにより麻酔を導入し、酸素中の１〜５％イソフルランにより維持する。麻酔が導入された直後に１８Ｆ−ＥＦ５を投与し、１８Ｆ−ＥＦ５投与の１時間後にＰＥＴ／ＣＴ走査を開始する。標準治療の一環として外科手術を受けるイヌ患者について、Ｈ−ＮＯＸ三量体含有量の解析のために切除された腫瘍の一部を確保する。Ｈ−ＮＯＸ三量体腫瘍局在化を評価するために、Ｈ−ＮＯＸタンパク質およびピモニダゾールに対する抗体を使用した定量的ＩＨＣまたはＥＬＩＳＡにより、切除された腫瘍を評価する。最大耐量等、安全性パラメータの解析のため、また、抗治療抗体の存在をアッセイするため、投薬前ならびにＨ−ＮＯＸ三量体投与の２４時間、４８時間および１４日後に少量の全血を得る。投薬前および投薬１４日後に安全性データを収集する。銅（ＩＩ）（ジアセチル−ビス（Ｎ４−メチルチオセミカルバゾン））（６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ）等、追加の低酸素バイオマーカーを本試験において使用する。
イヌにおけるＨ−ＮＯＸ三量体媒介性放射線増感
イヌにおける単回用量毒性試験の情報を利用して、これらの動物においてＨ−ＮＯＸ三量体媒介性放射線増感をさらに試験する。少なくとも５か月齢の雄および雌ビーグル犬を、８Ｇｙ単一分割の高線量放射線療法ありまたはなしのＨ−ＮＯＸ三量体または媒体処置からなる投薬群に割り当てる。Ｈ−ＮＯＸ三量体含有量の解析のため、これらのイヌ患者における腫瘍を切除する。Ｈ−ＮＯＸ三量体腫瘍局在化のため、Ｈ−ＮＯＸタンパク質およびピモニダゾールに対する抗体を使用する定量的ＩＨＣまたはＥＬＩＳＡにより、切除された腫瘍を評価する。６４Ｃｕ−ＡＴＳＭ等、追加の低酸素バイオマーカーを本試験において使用する。
（実施例１１）
Ｈ−ＮＯＸ三量体のＧＭＰ生産
臨床試験を開始するためのＦＤＡの認可を得るために必要なｃＧＭＰ生産、ＧＬＰ安全性試験および規制に対する備え（ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ）を含む、Ｈ−ＮＯＸ三量体の開発を調査する。
候補Ｈ−ＮＯＸ三量体のＧＭＰ製造
毒性試験、ラットおよびイヌＰＤ試験ならびに臨床試験を支持するための大量（例えば、キログラム量）のＧＭＰタンパク質を生産する。細胞の成長およびＧＭＰ細胞バンクの作製に必要な細胞系、プラスミドおよび培養成長条件を本明細書に提供する。ＯＤが１１５もの高さに達する、４Ｌ発酵からＨ−ＮＯＸ三量体を産生するための方法も本明細書に提供する。１２Ｌの細胞培養物から最大１ｇの精製されたＨ−ＮＯＸ三量体タンパク質を作製することができる、Ｈ−ＮＯＸ三量体のタンパク質精製のための方法が、本明細書にさらに提供される。本明細書において、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＵＶ／Ｖｉｓスペクトル解析、ＬＣ−ＭＳ、分析的ＳＥＣ、ＳＥＣ−ＨＰＬＣ、エンドトキシン試験、微粒子の濾過試験、ウイルス混入試験および有効性のための酸素放出速度等が挙げられるがこれらに限定されない、Ｈ−ＮＯＸ三量体の品質管理アッセイも提供される。本明細書においてさらに、マイクロリアクターシステム、プロセススケール機器、ポンプおよびフィルターが挙げられるがこれらに限定されない、Ｈ−ＮＯＸ三量体の産生のためのシステムも提供される。Ｈ−ＮＯＸ三量体は、前臨床および臨床試験に提供する前に、ＱＣ／ＱＡ試験および検証を受ける。
ラットおよびイヌにおけるＨ−ＮＯＸ三量体のＧＬＰ毒性試験
ＩＣＨガイドラインＳ６（Ｒ１）およびＳ９に従ってＧＬＰ毒性試験を行う。ＩＣＨガイドラインの通りに、齧歯類（スプラーグドーリーラット）および非齧歯類（ビーグル犬）種において毒性試験を行う。ラット７日間反復用量試験のため、雄および雌スプラーグドーリーラットを４処置群に割り当てる（表１４）。Ｈ−ＮＯＸ三量体用量レベルは、ほぼＭＥＤから最大実行可能用量または最大耐量に及ぶ。各動物に、緩徐なＩＶボーラスにより、尾静脈において最大１０ｍＬ／ｋｇの容量で媒体またはＨ−ＮＯＸ三量体を与える。動物の直近の体重に基づき、容積測定的に用量を投与する。１日１回を７日間連続で動物に投薬する。終末剖検に指定された動物（最大で最初の１０匹のラット／性別／群）を８日目に剖検する。回復剖検に指定された動物（最大で最後の５匹のラット／性別／群）は、７日間の投薬と、続く７日間の回復を経て、１５日目に剖検し、Ｈ−ＮＯＸ三量体の毒性および毒物動態を評価する。生命維持に不可欠な臓器（呼吸器、心血管および中枢神経系）の評価を含む標準毒性パラメータをモニターする（表１５）。
イヌ７日間反復用量試験のため、少なくとも５か月齢の雄および雌純血種ビーグル犬を４群に割り当てる（表１６）。Ｈ−ＮＯＸ三量体用量レベルは、ほぼＭＥＤから最大実行可能用量または最大耐量に及ぶ。各動物に、緩徐なＩＶボーラスにより、橈側皮静脈において最大１０ｍＬ／ｋｇの容量で媒体またはＨ−ＮＯＸ三量体を与える。１日１回を７日間連続で媒体またはＨ−ＮＯＸ三量体を動物に与える。終末剖検に指定された動物（最大で最初の３匹のイヌ／性別／群）を８日目に剖検する。回復剖検に指定された動物（最大で最後の２匹のイヌ／性別／群）は、７日間の投薬と、続く７日間の回復を経て、１５日目に剖検し、Ｈ−ＮＯＸ三量体の毒性および毒物動態を評価する。生命維持に不可欠な臓器（呼吸器、心血管および中枢神経系）の評価を含む標準毒性パラメータをモニターする（表１７）。投薬フェーズの間、心電図（ＥＣＧ）をモニターすることにより、本試験の一環として心臓安全性を評価する。
さらに、Ｈ−ＮＯＸ三量体は、新規タンパク質治療薬であるため、イヌにおいてスタンドアロン心臓安全性試験を行って心機能および血管作用性における効果をモニターする。ラジオテレメトリーデバイス（ＤＳＩ：ＴＬ１１Ｍ２−Ｄ７０−ＰＣＴ）を以前に植え込んだ４匹の非ナイーブ雄ビーグル犬（９〜１８ｋｇ）にＩＶボーラス注射により投薬する。イヌに、上向きまたはラテン方格投薬レジメンを使用して媒体および３用量レベルのＨ−ＮＯＸ三量体を投与する（表１８）。各動物に４種の用量のうち１種を（所定の順序で）毎週１回（投薬フェーズの１、８、１５および２２日目）与える。イヌにおいて以前に行った試験に基づき用量を選ぶ。全動物について、Ｈ−ＮＯＸ三量体または媒体に対する反応の臨床的に意義のある徴候が頻繁に観察され、投薬日に、続いて本試験の生存中フェーズにおいて少なくとも毎日１回ケージ脇で観察する。血行動態パラメータ（動脈圧、心拍数およびリードＩＩ心電図［ＥＣＧ］）を記録する。投薬の少なくとも１時間前に記録を開始し、投薬後少なくとも２４時間続ける。評価されるパラメータは、収縮期、拡張期および平均動脈圧、心拍数、ＰＲ、ＱＲＳ、ＱＴおよびＲＲ間隔、ＱＲＳ持続時間ならびにＱＴｃＶＷおよびＱＴｃＩ補正ＱＴ間隔を含む（表１９）。精度と、試験項目の薬物動態に基づき１０個の所定の時点で作表された値に関してデータを目視により点検する。律動の撹乱および波形形態に関する全ＥＣＧ波形の目視点検を加える。Ｇｒａｐｈ Ｐａｄ Ｐｒｉｓｍ（バージョン４．０３）を使用して、血行動態およびＥＣＧデータの統計学的解析を行う。パラメトリック（例えば、反復測定分散分析と、続くダネットの多重比較ｔ検定）またはノンパラメトリック（例えば、フリードマン検定およびダンの事後検定）統計学的手順のいずれかを使用して、各対応するデータ解析時点において媒体およびＨ−ＮＯＸ三量体処置群の間で比較を行う。パラメトリックまたはノンパラメトリック統計学の選択は、比較される群が、分散基準の均一性を満たすかどうかに基づく。媒体およびＨ−ＮＯＸ三量体処置の間の差は、ｐ＜０．０５として記述される。
（実施例１１）
神経膠芽腫患者（ｐａｔｅｎｔ）におけるＨ−ＮＯＸ三量体の使用のための第１相臨床試験
第１ｂ相試験を行って、反復性ＧＢを有する患者におけるＨ−ＮＯＸ三量体安全性、腫瘍における体内分布および低酸素低下を評価する。第２の第１ｂ相試験を行って、ＧＢと新たに診断された患者におけるＨ−ＮＯＸ三量体安全性を評価する。
反復性ＧＢ患者における第１ｂ相試験
第１の第１ｂ相試験は、第２の切除の候補である反復性ＧＢを有する患者のための単回用量標的化エンドポイント漸増試験である。本試験は、臨床的に意義のある集団における用量レベルおよび投与経路の選択の観点から方向性を提供する。算入および除外基準を満たす反復性ＧＢを有する２０名の患者が本試験に含まれる。
算入基準：
１．標準治療の一環として反復切除を計画する、反復性ＧＢのイメージング証拠を有する患者が適格である。
２．元の組織学的診断が低悪性度神経膠腫であり、その後の組織学的診断がＧＢである場合の患者は適格である。
３．全患者は、患者が本試験の治験的性質を承知していることを示すインフォームドコンセントにサインしなければならない。患者は、保護される健康情報の公開の承諾にサインしていなければならない。患者は、試験薬物による処置に先立ちデータベースに登録しなければならない。
４．患者は１８歳以上でなければならず、平均余命＞８週間でなければならない。
５．患者は、＞６０のカルノフスキーパフォーマンスステータスを有していなければならない。
６．登録時に：患者は、先行する治療の毒性効果から回復していなければならず：あらゆる治験剤から＞２８日間、先行する細胞傷害性治療から＞２８日間、ビンクリスチンから＞１４日間、ニトロソウレアから＞４２日間、プロカルバジン投与から＞２１日間、非細胞傷害性薬剤、例えば、インターフェロン、タモキシフェン、サリドマイド、シス−レチノイン酸等から＞７日間でなければならない。非細胞傷害性薬剤の定義に関するいずれかの質問は、試験責任者（Ｃｈａｉｒ）に尋ねるべきである。
７．患者は、治療の開始前に、適切な骨髄機能（ＷＢＣ＞３，０００／μｌ、ＡＮＣ＞１，５００／ｍｍ３、血小板数＞１００，０００／ｍｍ３およびヘモグロビン＞１０ｇｍ／ｄｌ）、適切な肝機能（ＳＧＯＴおよびビリルビン＜ＵＬＮの２倍）および適切な腎機能（クレアチニン＜１．５ｍｇ／ｄＬ）を有していなければならない。これらの検査は、登録に先立つ１４日間以内に行われなければならない。ヘモグロビンの適格性レベルは、輸血によって達成することができない。
８．患者は、ＭＲＩまたはＣＴにより腫瘍進行の明解なＸ線検査証拠を示していなければならない。登録に先立ち１４日間以内に、少なくとも５日間安定的なステロイド用量において走査を行うべきである。イメージングおよび登録の日の間にステロイド用量が増加する場合、新たなベースラインＭＲ／ＣＴが要求される。腫瘍測定のためのプロトコール処置期間を通じて、同じ種類の走査、即ち、ＭＲＩまたはＣＴを使用しなければならない。
９．患者は、いかなる回数の以前の再燃を処置されていてよい。
１０．出産の可能性がある女性は、登録に先立ち１４日間以内にＢ−ＨＣＧ妊娠検査が陰性であることを実証づけられなければならない。
除外基準：
１．患者は、ベバシズマブ（アバスチン）、他のＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＲ剤または抗血管新生剤とみなされる他の薬剤による先行する治療を受けていてはならない。
２．低い低酸素分画（ＳＵＶ腫瘍／ＳＵＶ小脳比２．０）のＰＥＴ証拠を有するいかなる患者も除外される。
３．抗高血圧薬治療中のいかなる患者も除外される。
４．患者は、治験責任医師の所見において、適切な治療により適切に制御できない、あるいは本治療に耐容性を示す患者の能力を損ないかねない、いかなる有意な医学的疾病も有してはならない。
５．完全寛解し最小３年間該疾患のあらゆる治療を絶った場合を除き、他のいずれかのがん（非メラノーマ皮膚がんまたは子宮頸部の上皮内癌を除く）の病歴を有する患者は不適格である。
６．患者は、活動性感染症または重篤な介入性医学的疾病を有してはならない。
７．患者は、毒性を不明瞭にするまたは薬物代謝を危険に変更するいかなる疾患も有してはならない。
本試験における患者に、他の同時療法なしで、Ｈ−ＮＯＸ三量体単独を与える。４種の用量レベルが存在し、正確な投薬レベルは、前臨床毒性試験において良好な耐容性を示すと同定されたレベルから決定され、３＋３デザインに従って漸増される。単回用量のＨ−ＮＯＸ三量体に予想される低毒性のため、停止ポイントおよび用量漸増は、主に低酸素低下に基づく。Ｈ−ＮＯＸタンパク質の予備的毒性試験に基づき、Ｈ−ＮＯＸ三量体に伴う毒性は殆どまたは全く予想されない。しかし、用量規制毒性（ＤＬＴ）が観察される場合、漸増の基準は、ＤＬＴおよび標準３＋３デザインに基づく漸増規定に基づくよう直ちに変えられる。本試験のＤＬＴは、Ｈ−ＮＯＸ三量体に起因し得る次の事象のいずれかとして定義される：
１．グレード３血小板減少症
２．グレード４貧血症および／またはグレード４好中球減少症
３．いずれかの非血液学的グレード３毒性、脱毛症を除外。
Ｈ−ＮＯＸ三量体の生物学的活性を評価するために、患者に、Ｈ−ＮＯＸ三量体投薬の７２時間前に１８Ｆ−ＥＦ５ ＰＥＴ走査を与える。ＰＥＴ走査は、腫瘍の標準摂取値（ＳＵＶ）の小脳（正常脳）のＳＵＶに対する比として特徴付けされる、低酸素分画の定量化を可能にし、外科手術に先立つ腫瘍低酸素のベースラインレベルを確立する。低レベルの低酸素（２．０を下回る腫瘍：正常脳比によって定義される）を有する患者を除外する。十分に低酸素の腫瘍を有する患者に、単回用量のＨ−ＮＯＸを静脈内に与え、Ｈ−ＮＯＸ三量体投薬の２時間後に第２の１８Ｆ−ＥＦ５ ＰＥＴ走査を行って、低酸素分画の変化を評価する。第２のＰＥＴ走査をスコア化し、ベースライン走査からのいかなる変化も記録する。少なくとも１５％の低酸素分画の変化が、臨床的に有望であると考慮され、「陽性」変化を構成する一方、１５％未満の変化は、「陰性」変化であると明言される。Ｈ−ＮＯＸ三量体投薬の２４時間以内に、計画された外科的切除に進む。Ｈ−ＮＯＸ三量体浸透は定量的免疫組織化学（ＩＨＣ）により、ＥＦ５染色は定量的ＩＨＣにより、切除された腫瘍を検査して、ＰＥＴ結果を確認する。可能であれば、ホモジナイズした組織試料を使用した定量的ＥＬＩＳＡにより、Ｈ−ＮＯＸ三量体分布データを確認する。安全性のための全ルーチン臨床実験室検査（例えば、肝機能、腎機能、ＣＢＣ）は、投薬前にならびに投薬後２４時間、４８時間および１４日目に行われる。これらの時点のそれぞれから得た血液試料を使用して、血漿薬物動態（ＰＫ）を決定すると共に、抗治療抗体（ＡＴＡ）の存在をアッセイする。一次エンドポイントは、単一薬剤安全性を含み、二次エンドポイントは、腫瘍ＰＫ、低酸素低下およびＡＴＡ産生までの時間を含む。
新たに診断されたＧＢ患者における第１ｂ相試験
第２の第１ｂ相試験は、新たに診断されたＧＢのための現在の標準治療による治療とＨ−ＮＯＸ三量体とを組み合わせる、古典的３＋３用量漸増試験である。診断および初期切除後に、ＧＢ患者には現在、経口ＤＮＡアルキル化化学療法であるテモゾロミド（ＴＭＺ）と併せて、分割されたＲＴにおいておよそ６０Ｇｙを与えている。Ｈ−ＮＯＸ三量体の作用機序は、固形腫瘍における低酸素の低下に関与するため、部分的（即ち、亜全）切除を有する患者のみが本試験に登録される。算入および除外基準を満たす新たに診断されたＧＢを有する２０名の患者が、本試験に含まれる。
算入基準：
１．組織学的に証明された新たに診断された頭蓋内ＧＢを有する患者は、本プロトコールに適格である。
２．患者は、治療開始前に為される１８Ｆ−ＥＦ５ ＰＥＴイメージングにおいて有意な低酸素分画を有していなければならない。
３．新たに診断されたＧＢの切除後に残留する評価可能な疾患は、本試験への適格性を義務付けられる。術後に残留する疾患の程度を最も良く評価するために、手術直後期間の９６時間以内に、または少なくとも術後４週間に、登録に先立つ１４日間以内にＣＴ／ＭＲＩを行うべきである。９６時間走査が、登録前の１４日間を超える場合、走査は反復される必要がある。イメージングおよび登録の日の間にステロイド用量が増加する場合、少なくとも５日間の安定的ステロイド投薬量における新たなベースラインＭＲＩ／ＣＴが要求される。
４．生検または切除は、処置に先立つ５週間以内に行われていなければならない。
５．全患者は、患者が本試験の治験的性質を承知していることを示すインフォームドコンセントにサインしなければならない。患者は、保護される健康情報の公開の承諾にサインしていなければならない。患者は、試験薬物による処置に先立ちデータベースに登録しなければならない。
６．患者は１８歳以上でなければならず、平均余命＞８週間でなければならない。
７．患者は、＞６０のカルノフスキーパフォーマンスステータスを有していなければならない。
８．患者は、治療開始前に適切な骨髄機能（ＷＢＣ＞３，０００／μｌ、ＡＮＣ＞１，５００／ｍｍ３、血小板数＞１００，０００／ｍｍ３およびヘモグロビン＞１０ｇｍ／ｄｌ）、適切な肝機能（ＳＧＯＴおよびビリルビン＜ＵＬＮの２倍）および適切な腎機能（クレアチニン＜１．５ｍｇ／ｄＬ）を有していなければならない。これらの検査は、登録に先立つ１４日間以内に行われなければならない。ヘモグロビンの適格性レベルは、輸血によって達成することができない。
９．出産の可能性がある女性は、登録に先立ち１４日間以内にＢ−ＨＣＧ妊娠検査が陰性であることを実証づけられなければならない。
１０．患者は、先行する細胞傷害性薬物治療、非細胞傷害性薬物治療または脳腫瘍のための実験的薬物治療を受けていてはならない。元の切除時にカルムスチン留置（ギリアデル）ウェーハによりポリフェスパン（ｐｏｌｉｆｅｓｐａｎ）２０を与えた患者は除外される。
１１．患者は、Ｈ−ＮＯＸ三量体およびテモゾロミド開始の翌日に部分的脳放射線療法の開始を計画しなければならない。放射線療法は、放射線腫瘍学者が、本プロトコールに指定される通りに放射線が行われ得ることの保証を与えることができるように、提携機関において為されなければならない。放射線療法は、１．８〜２．０Ｇｙの毎日の分割線量における部分的脳領域への外部照射によって与えられて、５９．４〜６１．０Ｇｙの腫瘍に計画される総線量とならなければならない。定位放射線手術（例えば、ガンマ−ナイフ処置）および近接照射療法は許可されない。
１２．患者は、Ｈ−ＮＯＸ三量体およびテモゾロミドで処置されつつ、腫瘍に対する他の細胞傷害性および非細胞傷害性薬物治療に進む意思がなければならない。
１３．生殖能を有する男性および女性患者は、試験処置の間および試験処置中断後の３カ月間、適切であれば、承認された避妊法を使用しなければならない（例えば、子宮内避妊具［ＩＵＤ］、経口避妊薬またはバリアデバイス）。出産の可能性がある女性は、処置に先立つ１４日間以内に、ベータ−ＨＣＧ妊娠検査で陰性であることが実証されなければならない。バリアー避妊としてコンドームを使用する場合、殺精子剤が添加されて妊娠が起こらないことを確実にするべきである。本試験に参加しながら女性が妊娠したまたは妊娠が疑われる場合、女性は、自身の処置担当の医師に直ちに伝えるべきである。
除外基準：
１．患者は、ベバシズマブ（アバスチン）、他のＶＥＧＦもしくはＶＥＧＦＲ剤または抗血管新生剤とみなされる他の薬剤による先行する同時療法を受けていてはならない。
２．低い低酸素分画の１８Ｆ−ＥＦ５ ＰＥＴ証拠は除外をもたらす。
３．抗高血圧薬治療中のいかなる患者も除外される。
４．患者は、治験責任医師の所見において、適切な治療により適切に制御することができない、あるいは本治療に耐容性を示す患者の能力を損ないかねない、いかなる有意な医学的疾病も有してはならない。
５．完全寛解し最小３年間該疾患のあらゆる治療を絶った場合を除き、他のいずれかのがん（非メラノーマ皮膚がんまたは子宮頸部の上皮内癌を除く）の病歴を有する患者は不適格である。
６．患者は、活動性感染症または重篤な介入性医学的疾病を有してはならない。
７．患者は、毒性を不明瞭にするまたは薬物代謝を危険に変更するいかなる疾患も有してはならない。
８．著しい完全切除を有する患者は除外される。
９．患者は、先行する頭蓋放射線療法を受けていてはならない。
ベースライン１８Ｆ−ＥＦ５−ＰＥＴ走査を行い、正常酸素圧腫瘍（腫瘍：正常脳比＜２．０として定義）を有する患者を本試験から除外する。ＲＴ治療の第１日目から開始して、ＲＴの２時間前に患者にＨ−ＮＯＸ三量体の用量をＩＶにより与える。Ｈ−ＮＯＸ三量体タンパク質に対するアレルギー反応の可能性を最小化するために、残留する腫瘍が最大である場合、ＲＴの最初の５日間に投薬を限定する。このレジメンを毎日５日間続け、３＋３デザインに従って用量レベルを漸増させる。第１の第１ｂ相試験に記載されている通り、但しＤＬＴ定義を修正しつつ、毒性をグレード付けする。ＤＬＴは、本試験の１０週目に起こり、Ｈ−ＮＯＸ三量体単独またはＴＭＺおよびＲＴと組み合わせて投薬されたＨ−ＮＯＸ三量体に起因し得る、次の事象のいずれかとして定義される：
１．７日間を超えて持続する、いずれかのグレード３もしくは４血小板減少症、グレード４貧血症またはグレード４好中球減少症
２．いずれかの熱性好中球減少症
３．最大限の医学的治療にもかかわらず生じる、いずれかの非血液学的グレード３以上の毒性、脱毛症を除外。発疹、悪心、嘔吐および下痢等、非血液学的毒性は、最大限の医学的治療にもかかわらずグレード３以上のままである場合にのみＤＬＴとみなされる。
４．いずれかのグレード４放射線誘導性皮膚変化。
同時ＲＴおよびテモゾロミドからなるＧＢのための現在の標準治療による治療は、６名の患者のうちおよそ１名に用量規制毒性を誘発する。コホートによるＨ−ＮＯＸ三量体用量漸増は、用量が、３名の患者のうち≦１名に、あるいはコホートサイズが増加される場合は６名の患者のうち≦２名にＤＬＴを生じる限り続く。ＲＴおよびテモゾロミドによる処置の間の公知および予想される毒性の頻度が相対的に高いため、コホートサイズは、より従来サイズの３名の患者よりも僅かに大きい。投薬コホートが、ドロップアウトにより３名の評価可能な登録患者を持たない場合、あるいは６名の患者のうち３名がＤＬＴを経験する場合、最大３名の追加の患者が１名ずつコホートに登録される（表２０）。
Ｈ−ＮＯＸ三量体投薬の完了後に、同時放射線／ＴＭＺフェーズの持続時間（一般に６週間の期間）にわたり毎週、有害事象に関して患者を評価する。患者は１２カ月間追跡され、処置の６カ月および１２カ月後に無増悪生存が決定される。Ｈ−ＮＯＸ三量体のＭＴＤは、患者の３分の１以下がＤＬＴを経験する用量である。ＭＴＤは、同時放射線およびＴＭＺの経過の間に観察されるＤＬＴに基づき、その後の第２相試験における使用のために定義される。一次エンドポイントは、標準ケア処置と組み合わせた安全性を含み、二次エンドポイントは、ＡＴＡ産生までの時間およびＰＦＳ−１２を含む。
Ｈ−ＮＯＸ三量体の予想される低毒性のため、第１の第１ｂ相試験は、生物学的に適切な用量、即ち、８０％奏効率を生じる用量を見出すことができる。陽性／陰性低酸素分画変化のバイナリー応答による比率［４／６］のデザインが実行される。Ｂｒｏｗｎら（２０１０年）Ｉｎｔ Ｊ Ｒａｄｉａｔ Ｏｎｃｏｌ Ｂｉｏｌ Ｐｈｙｓ ７８巻：３２３〜３２７頁を参照されたい。このデザインは、用量に関連する真の奏効率が低い場合（ここでは０．３と定義）、次の用量へと漸増する確率が高い一方；高い真の奏効率（０．８と定義）は、さらに漸増する確率が低いことを確実にする。≦１／３応答が観察される限り、漸増のために３名のコホートが使用される。≧２／３応答が観察される場合、コホートは６名に拡大される。≦３／６応答が観察される場合、漸増は続けられる。第２の第１ｂ相試験に推奨される用量は、≧４／６応答を達成する用量または最大用量レベル、即ち、１００ｍｇ／ｋｇである。出発用量の５ｍｇ／ｋｇが、≧４／６応答を達成する場合、十分な活性のためにより低用量が調査される。標準毒性デザインとは対照的に、ある特定の用量で停止するための応答基準が満たされない（即ち、０／２または２／５応答が観察された）ことが明らかである場合、より高用量への早期漸増が行われる。真の率＝０．３の場合の漸増の確率は０．９４であるが、真の率が０．８の場合の漸増の確率は０．１５である。４種の用量レベルの場合、最小９名かつ最大２４名の患者が使用される。
毒性が観察される場合、標的エンドポイント漸増試験からＤＬＴに基づく試験へと試験を切り換える。そのようなものとして、ＭＴＤは、Ｈ−ＮＯＸ三量体による処置後の２週間におけるＤＬＴの評価に基づき、患者の３分の１未満がＤＬＴを経験する用量として定義される；即ち、ＭＴＤは、０／３または１／６名の患者がＤＬＴを経験する用量レベルであり、次のより高用量は、少なくとも２／３または２／６名の患者がＤＬＴに遭遇する用量レベルである。用量レベル１００ｍｇ／ｋｇに至るまで、上に定義されるＤＬＴがいずれのコホートにおいても達成されない場合、さらなる漸増は行わない。

Claims (94)

  1. ３個のＨ−ＮＯＸドメインを含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であって、該３個のＨ−ＮＯＸドメインが、三量体形成ドメインに共有結合により連結しており、該Ｈ−ＮＯＸドメインが、１個または複数の遠位ポケット変異を含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインが、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該三量体Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、グアニリルシクラーゼドメインを含まない、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  2. 前記３個のＨ−ＮＯＸドメインが、同種Ｈ−ＮＯＸドメインである、請求項１に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  3. 単量体が会合して、前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成する、請求項１または２に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  4. 前記三量体形成ドメインが、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである、請求項１から３のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  5. 前記三量体形成ドメインが、フォルドンドメインである、請求項４に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  6. 前記フォルドンドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項５に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  7. 少なくとも１個のタグを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  8. 前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインである、請求項１から７のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  9. 前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対し、少なくとも９０％同一である、請求項１から８のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  10. 前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインが、１４４位にアミノ酸置換を含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  11. １４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、請求項１０に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  12. 前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヒトヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低い、請求項１から１１のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  13. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、２０℃において１ｎＭ〜１０００ｎＭの間である、請求項１から１２のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  14. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、２０℃において７００ｓ−１未満である、請求項１から１３のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  15. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヒトヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い、請求項１から１４のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  16. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆが、２０℃において０．６５ｓ−１以下である、請求項１から１５のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  17. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度が、３７℃において１ｈ−１未満である、請求項１から１６のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  18. １００ｋＤａｌを超える、請求項１から１７のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  19. 請求項１から１８のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質であって、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、単一のＨ−ＮＯＸドメインを含む対応する単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較して、該哺乳動物における１種または複数の組織に優先的に蓄積する、三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  20. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸの１０％未満が、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後の３時間未満以内に、腎臓によって該哺乳動物から排除される、請求項１９に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  21. 前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がペグ化されている、請求項１から２０のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質。
  22. Ｈ−ＮＯＸドメインおよび三量体形成ドメインを含む組換えＨ−ＮＯＸタンパク質であって、該Ｈ−ＮＯＸドメインが、１個または複数の遠位ポケット変異を含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインが、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、該Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、グアニリルシクラーゼドメインを含まない、組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  23. 前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、前記三量体形成ドメインに共有結合により連結されている、請求項２２に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  24. 前記三量体形成ドメインが、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである、請求項２３に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  25. 前記三量体形成ドメインが、フォルドンドメインである、請求項２４に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  26. 前記フォルドンドメインが、配列番号４を含む、請求項２５に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  27. タグを含む、請求項２２から２６のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  28. 前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインである、請求項２２から２７のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  29. 前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対して、少なくとも９０％同一である、請求項２２から２８のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  30. 前記遠位ポケット変異が、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸのＬ１４４に対応する部位におけるアミノ酸置換である、請求項２２から２９のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  31. １４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、請求項３０に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  32. 前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヒトヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低い、請求項２２から３１のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  33. 前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＯ２解離定数が、２０℃において１ｎＭ〜１０００ｎＭの間である、請求項２２から３２のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  34. 前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、２０℃において７００ｓ−１未満である、請求項２２から３３のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  35. 前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヒトヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い、請求項２２から３４のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  36. 前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆが、２０℃において０．６５ｓ−１以下である、請求項２２から３５のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  37. 前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度が、３７℃において１ｈ−１未満である、請求項２２から３６のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  38. 前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がペグ化されている、請求項２２〜３７のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質。
  39. 三量体形成ドメインに共有結合により連結した３個のＨ−ＮＯＸドメインを含む三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む医薬組成物であって、
    該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヒトヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低く、該三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において１ｎＭ〜１０００ｎＭの間であり、
    該Ｈ−ＮＯＸドメインが、１個または複数の遠位ポケット変異を含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインが、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインである、医薬組成物。
  40. 薬学的に許容される賦形剤をさらに含む、請求項３９に記載の医薬組成物。
  41. 脳がんを有する個体における脳腫瘍へとＯ２を送達するための組成物であって、有効量の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、
    該三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、三量体形成ドメインに共有結合により連結した３個のＨ−ＮＯＸドメインを含み、
    該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヒトヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低く、該三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において１ｎＭ〜１０００ｎＭの間であり、
    該Ｈ−ＮＯＸドメインが、１個または複数の遠位ポケット変異を含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインが、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインであり、
    該組成物が、該個体に投与されることを特徴とする、組成物。
  42. 前記組成物が、前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与のために製剤化され、放射線療法または化学療法と組み合わせて使用される、請求項４１に記載の組成物。
  43. 前記放射線が、Ｘ線照射である、請求項４２に記載の組成物。
  44. 前記脳がんが神経膠芽腫である、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の組成物。
  45. 前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質の組成物が、放射線および別の療法と共に使用するために製剤化される、請求項４１から４４のいずれか一項に記載の組成物。
  46. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、三量体型のＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸである、請求項４１から４５のいずれか一項に記載の組成物。
  47. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対し、少なくとも９０％同一であるＨ−ＮＯＸドメインを含む、請求項４１から４６のいずれか一項に記載の組成物。
  48. 前記Ｈ−ＮＯＸが、１４４位にアミノ酸置換を含むＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸである、請求項４１から４６のいずれか一項に記載の組成物。
  49. １４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、請求項４８に記載の組成物。
  50. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、２０℃において７００ｓ−１未満である、請求項４１から４９のいずれか一項に記載の組成物。
  51. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヒトヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い、請求項４１から５０のいずれか一項に記載の組成物。
  52. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆが、２０℃において０．６５ｓ−１以下である、請求項４１から５１のいずれか一項に記載の組成物。
  53. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度が、３７℃において１ｈ−１未満である、請求項４１から５２のいずれか一項に記載の組成物。
  54. 酸素の送達を必要とする個体へと酸素を送達するための組成物であって、有効量の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む組成物であって、
    該三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、三量体形成ドメインに共有結合により連結した３個のＨ−ＮＯＸドメインを含み、
    該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヒトヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低く、該三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において１ｎＭ〜１０００ｎＭの間であり、
    該Ｈ−ＮＯＸドメインが、１個または複数の遠位ポケット変異を含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインが、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインである、組成物。
  55. がんの処置を必要とする個体におけるがんを処置するための組成物であって、有効量の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、該組成物が、有効量の放射線と組み合わせて該個体に投与されることを特徴とし、
    該三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、三量体形成ドメインに共有結合により連結した３個のＨ−ＮＯＸドメインを含み、
    該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヒトヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低く、該三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において１ｎＭ〜１０００ｎＭの間であり、
    該Ｈ−ＮＯＸドメインが、１個または複数の遠位ポケット変異を含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインが、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインである、組成物。
  56. 腫瘍成長の低下を必要とする個体における腫瘍成長を低下させるための組成物であって、有効量の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含み、該組成物が、有効量の放射線と共に該個体に投与されることを特徴とし、
    該三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、三量体形成ドメインに共有結合により連結した３個のＨ−ＮＯＸドメインを含み、
    該Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヒトヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１０倍低く、該三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＯ ２ 解離定数が、２０℃において１ｎＭ〜１０００ｎＭの間であり、
    該Ｈ−ＮＯＸドメインが、１個または複数の遠位ポケット変異を含み、該Ｈ−ＮＯＸドメインが、Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｌ．ｐｎｅｕｍｏｐｈｉｌｉａ ２ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｈｏｍｏ ｓａｐｉｅｎｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ β１ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｄ．ｍｅｌａｎｇａｓｔｅｒ ＣＧ１４８８５−ＰＡ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｅｎｏｒｈａｂｄｉｓ ｅｌｅｇａｎｓ ＧＣＹ−３５ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｎｏｓｔｏｃ ｐｕｎｃｔｉｆｏｒｍｅ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｃａｕｌｏｂａｃｔｅｒ ｃｒｅｓｃｅｎｔｕｓ Ｈ−ＮＯＸドメイン、Ｓｈｅｗａｎｅｌｌａ ｏｎｅｉｄｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインまたはＣｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ａｃｅｔｏｂｕｔｙｌｉｃｕｍ Ｈ−ＮＯＸドメインである、組成物。
  57. 前記放射線が、Ｘ線照射である、請求項５５から５６のいずれか一項に記載の組成物。
  58. がんが脳がんである、請求項５５から５７のいずれか一項に記載の組成物。
  59. 前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、別の療法と組み合わせて放射線と共に使用するために製剤化される、請求項５５から５８のいずれか一項に記載の組成物。
  60. 前記三量体形成ドメインが、バクテリオファージＴ４三量体形成ドメインである、請求項５４から５９のいずれか一項に記載の組成物。
  61. 前記三量体形成ドメインが、フォルドンドメインである、請求項６０に記載の組成物。
  62. 前記フォルドンドメインが、配列番号４のアミノ酸配列を含む、請求項６１に記載の組成物。
  63. タグが、前記三量体形成ドメインのＣ末端に共有結合により連結されている、請求項６０から６２のいずれか一項に記載の組成物。
  64. 前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、Ｔ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインである、請求項５４から６３のいずれか一項に記載の組成物。
  65. 前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、配列番号２に示されるＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓのＨ−ＮＯＸドメインに対して、少なくとも９０％同一である、請求項５４から６４のいずれか一項に記載の組成物。
  66. 前記Ｈ−ＮＯＸドメインが、１４４位にアミノ酸置換を含むＴ．ｔｅｎｇｃｏｎｇｅｎｓｉｓ Ｈ−ＮＯＸドメインである、請求項５４から６５のいずれか一項に記載の組成物。
  67. １４４位における前記アミノ酸置換が、Ｌ１４４Ｆ置換である、請求項６６に記載の組成物。
  68. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、２０℃において７００ｓ−１未満である、請求項５４から６７のいずれか一項に記載の組成物。
  69. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のＮＯ反応性が、ヒトヘモグロビンのＮＯ反応性よりも少なくとも１００倍低い、請求項５４から６８のいずれか一項に記載の組成物。
  70. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の酸素に対するｋｏｆｆが、２０℃において０．６５ｓ−１以下である、請求項５４から６９のいずれか一項に記載の組成物。
  71. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質のヘム自動酸化の速度が、３７℃において１ｈ−１未満である、請求項５４から７０のいずれか一項に記載の組成物。
  72. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、１００ｋＤａｌを超える、請求項５４から７１のいずれか一項に記載の組成物。
  73. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、哺乳動物への該Ｈ−ＮＯＸタンパク質の投与後に、単一のＨ−ＮＯＸドメインを含む対応する単量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質と比較して、該哺乳動物における１種または複数の組織に優先的に蓄積する、請求項５４から７２のいずれか一項に記載の組成物。
  74. 前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質がペグ化されている、請求項５４から７３のいずれか一項に記載の組成物。
  75. 請求項１から２１のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質をコードする組換え核酸。
  76. 請求項７５に記載の核酸を含むベクター。
  77. 請求項７５に記載の核酸または請求項７６に記載のベクターを含む細胞。
  78. 三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を産生する方法であって、該三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質の産生に適した条件下で、請求項７７に記載の細胞を培養するステップを含む方法。
  79. 前記Ｈ−ＮＯＸタンパク質を精製するステップをさらに含む、請求項７８に記載の方法。
  80. 請求項２２から３８のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質をコードする組換え核酸。
  81. 請求項８０に記載の核酸を含むベクター。
  82. 請求項８０に記載の核酸または請求項８１に記載のベクターを含む細胞。
  83. 三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を産生する方法であって、請求項８２に記載の細胞を、該細胞の前記組換えＨ−ＮＯＸタンパク質が発現され、会合して三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を形成する条件下で、培養するステップを含む方法。
  84. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を精製するステップをさらに含む、請求項８３に記載の方法。
  85. 請求項１から２１のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含むキット。
  86. 請求項２２から３８のいずれか一項に記載の組換えＨ−ＮＯＸタンパク質を含むキット。
  87. 使用のための指示を含む、請求項８５または８６に記載のキット。
  88. 請求項１から２１のいずれか一項に記載の三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質を含む製造品。
  89. Ｈ−ＮＯＸタンパク質およびバッグを含む、請求項８８に記載の製造品。
  90. 前記バッグがＩＶバッグである、請求項８９に記載の製造品。
  91. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、Ｏ２の送達を必要とする個体へとＯ２を送達するためのものである、請求項８９または９０に記載の製造品。
  92. 前記個体が脳腫瘍を有する、請求項９１に記載の製造品。
  93. 前記脳腫瘍が神経膠芽腫である、請求項９２に記載の製造品。
  94. 前記三量体型Ｈ−ＮＯＸタンパク質が、放射線療法と併せて使用される、請求項９３に記載の製造品。
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