JP6475134B2 - 細胞評価装置および方法 - Google Patents

Description

本発明は、分化誘導の過程の細胞を評価する細胞評価装置および方法に関するものである。

ｉＰＳ（Induced Pluripotent Stem）細胞やＥＳ（Embryonic Stem）細胞などの多能性幹細胞は、種々の組織の細胞に分化する能力を備えたものであり、再生医療、薬の開発および病気の解明などにおいて応用が可能なものとして注目されている。

多能性幹細胞から神経細胞や肝細胞などの目的の細胞を得るために分化誘導が行われるが、この分化誘導の際、目的の細胞に正しく分化しているか否かを自動的に確認したというニーズがある。

そこで、従来、目的の細胞らしさを画像特徴量として定義し、その画像特徴量を判別器によって検出して評価することによって、目的の細胞に分化しているか否かを自動的にチェックする方法が提案されている。

また、特許文献１には、培地内に溶存する酸素量の低下速度とアルカリフォスファターゼの量とに基づいて、細胞の分化段階を判断することが提案されている。また、特許文献２および特許文献３においては、分化に関与する遺伝子の発現量を解析することによって未分化状態であることまたは分化状態であることを確認する方法が提案されている。

特開２００５−１６８３６０号公報 特開２００６−０４２６６３号公報 国際公開第２０１０／１３７７２２号

しかしながら、たとえば単一の判別器によって画像特徴量を検出して目的の細胞に分化しているか否かを評価するようにしたのでは、その判別器によって目的の細胞が検出されなかった領域が、目的の細胞以外の細胞が存在する領域なのか、もしくは細胞が存在していない領域なのかを評価することができない。

したがって、たとえば判別器によって分化した細胞を検出することはできても、分化細胞が検出されなかった領域に未分化細胞が残っている可能性がある。このように未分化細胞の残存があると組織を移植した後に悪性腫瘍化するという問題がある。

また、特許文献１〜特許文献３には、細胞の分化状態を評価する方法が提案されているが、これらの文献に記載の方法を用いたとしても、未分化細胞の残存を見逃す可能性がある。

本発明は、上記の問題に鑑み、未分化細胞の残存の見逃しを抑制することができる細胞評価装置および方法を提供することを目的とする。

本発明の細胞評価装置は、評価対象の細胞を評価する第１の評価部と第２の評価部とを備え、第１の評価部が、評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞が少なくとも２種類の細胞に該当するか否かをそれぞれ判別する判別部を少なくとも２つ有し、第２の評価部が、判別部のうち少なくとも２つの判別部による判別結果が相反する場合に、評価対象の細胞を第１の評価部の評価条件とは異なる評価条件で評価することを特徴とする。

また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、第１の評価部よりも高倍率で評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞を評価することができる。

また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、評価対象の細胞の群を複数の領域に分割した画像に基づいて評価を行う場合、複数の領域の画像のうちの１つの画像の評価結果を代表の評価結果とすることができる。

また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、評価対象の細胞の群を複数の領域に分割した画像に基づいて評価を行う場合、複数の領域の画像の評価結果のうち最も多い評価結果を代表の評価結果とすることができる。

また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、評価対象の細胞の群を複数の領域に分割した画像に基づいて評価を行う場合、複数の領域の画像の評価結果を平均した結果を代表の評価結果とすることができる。

また、上記本発明の細胞評価装置において、第１の評価部は、評価対象の細胞を非侵襲的な撮像方法によって撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞を評価し、第２の評価部は、評価対象の細胞を侵襲的な撮像方法によって撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞を評価することができる。

また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、評価対象の細胞の蛍光画像に基づいて、評価対象の細胞を評価することができる。

また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、第１の評価部において判別に用いた画像の撮像時点から予め設定された時間だけ経過した時点において撮像された画像に基づいて、評価対象の細胞を評価することができる。

また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、第１の評価部よりも多い枚数の評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞を評価することができる。

また、上記本発明の細胞評価装置において、第１の評価部および第２の評価部は、評価対象の細胞を経時的に複数回評価する場合、過去の第１の評価部の少なくとも２つの判別部による判別結果が相反する場合には、現在の評価対象の細胞の第１の評価部による評価を行うことなく第２の評価部による評価を行うことができる。

また、上記本発明の細胞評価装置において、第１の評価部および第２の評価部は、評価対象の細胞の群を複数の領域に分割して評価を行う場合、複数の領域のうちの１つの領域の過去の判別結果が相反する場合には、１つの領域とその１つの領域の周囲の領域の現在の評価対象の細胞の第１の評価部による評価を行わないようにできる。

また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、第１の評価部と同じ少なくとも２つの判別部を有し、その少なくとも２つの判別部による判別結果が相反する場合には、評価対象の細胞をさらに異なる評価条件で評価することができる。

また、上記本発明の細胞評価装置において、第２の評価部は、第２の評価部が有する少なくとも２つの判別部による判別結果が相反する場合、評価条件を複数回変更して順次評価を行うものであり、少なくとの２つの判別部による判別結果が矛盾しない結果となった時点で評価を終了することができる。

本発明の細胞評価方法は、評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞が少なくとも２種類の細胞に該当するか否かを少なくとも２つの判別部を用いて判別する第１の評価を行い、判別部のうち少なくとも２つの判別部の判別結果が相反する場合に、評価対象の細胞を第１の評価とは異なる評価条件で評価する第２の評価を行うことを特徴とする。

本発明の細胞評価装置および方法によれば、評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞が少なくとも２種類の細胞に該当するか否かを少なくとも２つの判別部を用いて判別する第１の評価を行い、判別部のうち少なくとも２つの判別部の判別結果が相反する場合に、評価対象の細胞を第１の評価とは異なる評価条件で第２の評価を行う。したがって、たとえば１つの判別部によって評価対象の細胞が分化細胞に該当すると判別された場合でも、もう１つの判別部によって評価対象の細胞が未分化細胞に該当すると判別された場合には、これの判別結果は相反するものであるので、再度、異なる評価条件で第２の評価を行うようにする。このように再評価を行うことによって未分化細胞の残存の見逃しを抑制することができる。

本発明の細胞評価装置の一実施形態を用いた細胞評価システムの概略構成を示すブロック図 第１の判別部による判別結果と第２の判別部による判別結果とこれらの判別結果に基づく細胞の判定結果とを示す表 撮像領域および撮像領域を分割した評価対象範囲を示す図 本発明の細胞評価装置の一実施形態を用いた細胞評価システムの作用を説明するためのフローチャート 撮像領域、撮像領域を分割した評価対象範囲および評価対象範囲を分割した分割領域を示す図

以下、本発明の細胞評価装置および方法の一実施形態を用いた細胞評価システムについて、図面を参照しながら詳細に説明する。図１は、本実施形態の細胞評価装置を用いた細胞評価システムの概略構成を示すブロック図である。

本実施形態の細胞評価システムは、図１に示すように、第１の評価部１と第２の評価部２とを備えている。第１の評価部１は、第１の撮像装置１０を備えており、第２の評価部は、第２の撮像装置２０を備えており、第１の評価部１と第２の評価部２とで、判別結果評価装置３０が共有されている。また、判別結果評価装置３０には、表示装置３と入力装置４とが接続されている。

第１の撮像装置１０は、分化誘導の過程における細胞の画像を撮像するものである。本実施形態においては、第１の撮像装置１０として位相差顕微鏡装置を用いる。第１の撮像装置１０は、ＣＣＤ（charge-coupled device）イメージセンサやＣＭＯＳ（Complementary Metal-Oxide Semiconductor）イメージセンサなどの撮像素子を備えており、撮像素子によって撮像された撮像画像は、第１の撮像装置１０から判別結果評価装置３０に出力される。

撮像対象の細胞としては、たとえばｉＰＳ細胞およびＥＳ細胞といった多能性幹細胞から中胚葉まで分化誘導する過程における細胞、神経幹細胞からニューロンまで分化誘導する過程における細胞、肝幹細胞から肝細胞まで分化誘導する過程における細胞、多能性幹細胞から心筋細胞まで分化誘導する過程における細胞、および造血幹細胞から赤血球、リンパ球または血小板まで分化誘導する過程における細胞などがあるが、これらに限らず、分化誘導の過程におけるその他の細胞でもよい。

第２の撮像装置２０は、第１の撮像装置１０と同様に、分化誘導の過程における細胞の画像を撮像するものである。ただし、第２の撮像装置２０は、第１の撮像装置１０とは異なる評価条件で細胞を撮像するものである。なお、評価条件とは撮像条件を含むものである。具体的には、本実施形態の第２の撮像装置２０は、第１の撮像装置１０よりも高倍率な位相差画像を撮像するものであり、かつ蛍光画像の撮像も可能なように構成されたものである。なお、位相差画像の撮像が非侵襲的な撮像方法であるのに対し、蛍光画像の撮像は、励起光の照射による細胞のダメージがあるので侵襲的な撮像である。また、第２の撮像装置２０は、染色された細胞から発せられた蛍光を撮像してもよいし、細胞の自家蛍光を撮像してもよい。第２の撮像装置２０によって撮像された撮像画像は、第２の撮像装置２０から判別結果評価装置３０に出力される。

判別結果評価装置３０は、ＣＰＵ（Central Processing Unit）、半導体メモリおよびハードディスクなどを備えたコンピュータから構成されるものである。判別結果評価装置３０は、第１の撮像装置１０および第２の撮像装置２０によって撮像された撮像画像に基づいて、撮像画像内に含まれる細胞が未分化細胞であるか、分化細胞であるかを判定するものである。

判別結果評価装置３０は、具体的には、第１の判別部３１と、第２の判別部３２と、判別結果判定部３３とを備えている。

第１の判別部３１は、入力された撮像画像に基づいて、撮像画像内に含まれる細胞が未分化細胞であるか否かを判別するものである。未分化細胞であるか否かの判別方法としては、たとえば細胞の形態的な特徴を用いて判別するようにすればよい。

具体的には、たとえば細胞の大きさ、円形度または輝度を用いて未分化細胞であるか否かを判別することができる。また、細胞単位ではなく、細胞コロニー単位で未分化細胞のコロニーであるか否かを判別するようにしてもよく、たとえば細胞コロニーに含まれる細胞の数または密度、細胞コロニーの円形度、輝度もしくは白すじの面積または密度などを用いて未分化細胞であるか否かを判別することができる。

なお、白すじとは細胞の境界を表すものであり、いわゆるハロの画像である。分化が進むとハロが多くなるので、白すじの面積または密度が閾値以下である場合に未分化細胞であると判別することができる。また、未分化細胞であるか否かの判別方法については、その他の公知な技術を用いることができる。

第２の判別部３２は、入力された撮像画像に基づいて、細胞画像内に含まれる細胞が分化細胞であるか否かを判別するものである。分化細胞であるか否かの判別方法は、たとえば分化後の細胞の形態的な特徴を用いて判別するようにすればよい。

具体的には、たとえば神経幹細胞からニューロンまで分化誘導する場合には、細胞の大きさ、円形度または輝度、軸索の長さまたは数、樹状突起の大きさまたは数、細胞核の大きさまたは数、もしくは白すじの面積または密度などを用いることができる。また、肝幹細胞から肝細胞まで分化誘導する場合には、細胞の大きさ、円形度または輝度、細胞核の大きさまたは数、もしくは白すじの面積または密度などを用いることができる。また、多能性幹細胞から心筋細胞まで分化誘導する場合には、細胞の拍動の有無、もしくは白すじの面積または密度などを用いることができる。なお、細胞の拍動の有無は、時系列に撮像された２枚の画像の変化量を算出することによって取得することができる。また、造血幹細胞から赤血球まで分化誘導する場合には、細胞の色を用いることができる。

なお、分化細胞であるか否かの判別方法については、その他の公知な技術を用いることができる。また、第１の判別部３１および第２の判別部３２における判別方法として、細胞の大きさ、円形度、輝度もしくは白すじの面積または密度に基づく判別方法が共通しているが、第１の判別部３１および第２の判別部３２における閾値などの判別基準はそれぞれ異なるものである。

判別結果判定部３３は、第１の判別部３１による判別結果と第２の判別部３２による判別結果とを取得し、これらの判別結果が相反するか否かを判定するものである。具体的には、図２に示すように、第１の判別部３１による判別結果が、撮像画像内に未分化細胞が存在するという判別結果であり、かつ第２の判別部３２による判別結果が、撮像画像内には分化細胞が存在しないという判別結果である場合には、これらの結果は相反するものではないので適切な結果であるとして、撮像画像内の細胞は未分化細胞であると判定する。

また、第１の判別部３１による判別結果が、撮像画像内に未分化細胞が存在しないという判別結果であり、かつ第２の判別部３２による判別結果が、撮像画像内に分化細胞が存在するという判別結果である場合には、これらの結果も相反するものではないので適切な結果であるとして、撮像画像内の細胞は分化細胞であると判定する。

一方、第１の判別部３１による判別結果が、撮像画像内に未分化細胞が存在するという判別結果であり、かつ第２の判別部３２による判別結果が、撮像画像内に分化細胞が存在するという判別結果である場合には、これらの結果は相反するものであるので、撮像画像内の細胞が分化細胞であるか未分化細胞であるかの判定は不明とする。

また、第１の判別部３１による判別結果が、撮像画像内に未分化細胞が存在しないという判別結果であり、かつ第２の判別部３２による判別結果が、撮像画像内に分化細胞が存在しないという判別結果である場合にも、これらの結果は相反するものであるので、撮像画像内の細胞が分化細胞であるか未分化細胞であるかの判定は不明とする。判別結果判定部３３は、上述した判定結果を記憶するものである。

全体制御部３４は、第１の撮像装置１０および第２の撮像装置２０を含む細胞評価システム全体を制御するものである。特に、全体制御部３４は、判別結果判定部３３における判定結果が不明である場合には、第２の撮像装置２０によって第１の撮像装置１０とは異なる評価条件で細胞の撮像を行い、再度、第１の判別部３１および第２の判別部３２による判別を行うように制御するものである。

第２の撮像装置２０による撮像は、全体制御部３４が判定結果に応じて自動的に行うようにしてもよいし、判定結果が不明であることを表示装置３に表示させることによってユーザに報知し、ユーザが、入力装置４を用いて第２の撮像装置２０による撮像を行うように指示入力してもよい。

第２の撮像装置２０は、全体制御部３４から出力された制御信号に基づいて、上述したように第１の撮像装置１０とは異なる評価条件で細胞を撮像するものであるが、ここでは、第１の撮像装置１０よりも高倍率で細胞の位相差画像を撮像する。

第２の撮像装置２０によって高倍率で撮像された画像は、判別結果評価装置３０に出力され、判別結果評価装置３０は、入力された高倍率画像に基づいて、再び第１の判別部３１による判別と第２の判別部３２による判別を行う。そして、判別結果判定部３３は、これらの判別結果に基づいて、撮像画像に含まれる細胞が未分化細胞であるか、分化細胞であるか、または不明であるかの判定を行い、判定結果を記憶する。

そして、全体制御部３４は、判別結果判定部３３における判定結果が再び不明である場合には、第２の撮像装置２０によってさらに異なる評価条件で細胞の撮像を行い、再度、第１の判別部３１および第２の判別部３２による判別を行うように制御するものである。具体的には、第２の撮像装置２０は、細胞の蛍光画像の撮像を行う。第２の撮像装置２０による蛍光画像の撮像についても、全体制御部３４が判定結果に応じて自動的に行うようにしてもよいし、判定結果が不明であることを表示装置３に表示させることによってユーザに報知し、ユーザが、入力装置４を用いて第２の撮像装置２０による撮像を行うように指示入力するようにしてもよい。

第２の撮像装置２０によって撮像された蛍光画像は、判別結果評価装置３０に出力され、判別結果評価装置３０は、入力された蛍光画像に基づいて、再び第１の判別部３１による判別と第２の判別部３２による判別を行う。そして、判別結果判定部３３は、これらの判別結果に基づいて、撮像画像に含まれる細胞が未分化細胞であるか、分化細胞であるか、または不明であるかの判定を行い、判定結果を記憶する。

第１の撮像装置１０および第２の撮像装置２０は、全体制御部３４による制御によって、図３に示すような複数の細胞が存在する撮像領域Ｒ内を走査し、撮像領域Ｒ内の分割された評価対象範囲ｒ毎の画像を撮像するものである。撮像領域Ｒの単位は、たとえば複数のウェルを有するウェルプレートとし、そのウェルプレート内の各ウェルを評価対象範囲ｒとしてもよいし、１つウェルを撮像領域Ｒとし、その１つのウェル内の分割された各領域を評価対象範囲としてもよい。

判別結果評価装置３０における判定は、評価対象範囲ｒ毎の画像に基づいてそれぞれ行われ、評価対象範囲ｒ毎の判定結果が判別結果判定部３３に記憶される。

表示装置３は、液晶ディスプレイなどの表示デバイスによって構成されるものである。表示装置３は、全体制御部３４による制御によって、第１の撮像装置１０および第２の撮像装置２０によって撮像された画像を表示したり、第１および第２の判別部３１，３２による判別結果および判別結果判定部３３による判定結果を表示したりするものである。

入力装置４は、キーボードやマウスなどの入力デバイスによって構成されるものである。入力装置４は、たとえば上述したように第２の撮像装置２０による撮像の指示入力を受け付けるものである。なお、表示装置３および入力装置４をタッチパネルによって構成することによってこれらを兼用するようにしてもよい。

次に、本実施形態の細胞評価システムの作用について、図４に示すフローチャートを参照しながら説明する。

まず、分化誘導の過程の評価対象の細胞が収容された培養容器が第１の撮像装置１０に設置され、最初の評価対象範囲の画像が撮像されるよう設定される（Ｓ１０）。

そして、全体制御部３４によって、設定された評価対象範囲について、過去に第１の評価が行われたか否かが確認される（Ｓ１２）。なお、第１の評価とは、第１の撮像装置１０による撮像から判別結果判定部３３による判定結果の記憶までの処理である。

そして、過去に第１の評価が行われていないことが確認されると（Ｓ１２，ＮＯ）、第１の撮像装置１０によって最初の評価対象範囲の位相差画像が撮像され（Ｓ１４）、その撮像画像が第１の判別部３１および第２の判別部３２に入力される。第１の撮像装置１０は、第２の撮像装置２０よりも低倍率で撮像を行い、具体的には１倍〜４倍の倍率で撮像を行う。

次いで、第１の判別部３１によって撮像画像内に未分化細胞が存在するか否かが判別され（Ｓ１６）、かつ第２の判別部３２によって撮像画像内に分化細胞が存在するか否かが判別され（Ｓ１８）、それぞれの判別結果が判別結果判定部３３に入力される。

そして、判別結果判定部３３は、第１および第２の判別部３１，３２による判別結果に基づいて、撮像画像内の細胞が未分化細胞であるか、分化細胞であるか、または不明であるかを判定し、その判定結果を記憶する。

全体制御部３４は、判別結果判定部３３による判定結果に基づいて、第２の評価を行うか否かを決定する（Ｓ２０）。具体的には、判別結果判定部３３による判定結果が不明である場合に第２の評価を行うことを決定し、それ以外の場合には、第２の評価は行わず、最初の評価対象範囲の評価を終了する（Ｓ２０，ＮＯ）。なお、第２の評価とは、第２の撮像装置２０による撮像から判別結果判定部３３による判定結果の記憶までの処理である。

そして、全体制御部３４によって第２の評価を行うと決定された場合には（Ｓ２０，ＹＥＳ）、第２の撮像装置２０に培養容器が設置され、第２の撮像装置２０によって最初の評価対象範囲の位相差画像が撮像され（Ｓ２２）、その撮像画像が第１の判別部３１および第２の判別部３２に入力される。第２の撮像装置２０は、第１の撮像装置１０よりも高倍率で撮像を行い、具体的には１０倍〜２０倍の倍率で撮像を行う。なお、第１の撮像装置１０から第２の撮像装置２０への培養容器の移動は、たとえばターンテーブルなどを用いて行うようにすればよい。

次いで、再び第１の判別部３１によって撮像画像内に未分化細胞が存在するか否かが判別され（Ｓ２４）、かつ第２の判別部３２によって撮像画像内に分化細胞が存在するか否かが判別され（Ｓ２６）、それぞれの判別結果が判別結果判定部３３に入力される。

そして、判別結果判定部３３は、第１および第２の判別部３１，３２による判別結果に基づいて、撮像画像内の細胞が未分化細胞であるか、分化細胞であるか、または不明であるかを判定し、その判定結果を記憶する。

全体制御部３４は、判別結果判定部３３による判定結果に基づいて、蛍光画像による評価を行うか否かを決定する（Ｓ２８）。具体的には、判別結果判定部３３による判定結果が不明である場合に蛍光画像による評価を行うことを決定し、それ以外の場合には、蛍光画像による評価は行わず、最初の評価対象範囲の評価を終了する（Ｓ２８，ＮＯ）。

そして、全体制御部３４によって蛍光画像による評価を行うと決定された場合には（Ｓ２８，ＹＥＳ）、第２の撮像装置２０によって最初の評価対象範囲の蛍光画像が撮像され（Ｓ２２）、その蛍光画像が第１の判別部３１および第２の判別部３２に入力される。

次いで、再び第１の判別部３１によって蛍光画像内に未分化細胞が存在するか否かが判別され（Ｓ２４）、かつ第２の判別部３２によって蛍光画像内に分化細胞が存在するか否かが判別され（Ｓ２６）、それぞれの判別結果が判別結果判定部３３に入力される。

そして、判別結果判定部３３は、第１および第２の判別部３１，３２による判別結果に基づいて、蛍光画像内の細胞が未分化細胞であるか、分化細胞であるか、または不明であるかを判定し、その判定結果を記憶し、最初の評価対象範囲の評価を終了する（Ｓ２８，ＮＯ）。

上述したようにして最初の評価対象範囲について、最大で３回の評価が行われてその判定結果が記憶される。

そして、次の評価対象範囲が存在する場合には（Ｓ３０，ＮＯ）、再び第１の撮像装置１０に培養容器が設置され、次の評価対象範囲の画像が撮像されるよう設定される（Ｓ１０）。次の評価対象範囲についても、最初の評価対象範囲と同様にして、最大で３回の評価が行われてその判定結果が記憶される。

次いで、評価対象範囲が順次変更されてＳ１２〜Ｓ３０の処理が繰り返して行われ、全ての評価対象範囲の評価が終わった時点において、今回の撮像領域Ｒの評価を終了する（Ｓ３０，ＹＥＳ）。

そして、さらに一定期間経過させ、細胞の分化誘導を進行させた後に再び撮像領域Ｒの評価を継続して行う場合には（Ｓ３２，ＹＥＳ）、Ｓ１０に戻り、再び撮像領域Ｒ内の最初の評価対象範囲から順次、２巡目の評価が行われる。ただし、この際、過去に第１の評価を既に行っており、判別結果判定部３３による判定結果が未分化細胞であるか、分化細胞であるかのいずれかに確定しており、不明であるとの判定結果でない場合には、いずれの評価も行わない（Ｓ１２，ＹＥＳ、Ｓ２０，ＮＯ）。一方、過去に第１の評価を既に行っており、判別結果判定部３３による判定結果が不明であるとの判定結果である場合には、第１の評価は行わず、第２の評価から行う（Ｓ１２，ＹＥＳ、Ｓ２０，ＹＥＳ）。

そして、判定結果が不明であった全ての評価対象範囲の評価が終了した時点で、２巡目の撮像領域Ｒの評価を終了する（Ｓ３０，ＹＥＳ）。

次いで、さらに一定期間経過させ、細胞の分化誘導を進行させた後に３巡目の撮像領域Ｒの評価を行う場合には（Ｓ３２，ＹＥＳ）、再びＳ１０に戻り、２巡目の撮像領域Ｒの評価の場合と同様の処理が繰り返される。

一方、継続して撮像領域Ｒの３巡目の評価を行わないことがユーザによって指示入力された場合や撮像領域Ｒ内の全ての評価対象範囲ｒの判定結果が確定し、判定結果が不明である評価対象範囲ｒが存在しなくなった時点において処理を終了する（Ｓ３２，ＮＯ）。

上記実施形態の細胞評価システムによれば、評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、評価対象の細胞が未分化細胞に該当するか、分化細胞に該当するかをそれぞれ第１および第２の判別部３１，３２を用いて判別し、第１および第２の判別部３１，３２の判別結果が相反する場合には、評価対象の細胞を異なる評価条件で再評価する。したがって、このように再評価を行うことによって未分化細胞の残存の見逃しを抑制することができる。

なお、上記実施形態においては、第１の評価部１による評価によって判定結果が不明である場合には、直ちに第２の評価部２による評価を行うようにしたが、第１の評価部１によって評価した後、予め設定された時間が経過した時点において第２の評価部２によって評価を行うようにしてもよい。すなわち、第１の撮像装置１０による画像の撮像から予め設定された時間経過した時点において第２の撮像装置２０による画像の撮像を行うようにしてもよい。この場合、時間の経過によって細胞の分化が進行し、細胞の状態が変化していると考えられるので、上記実施形態のように、必ずしも倍率を変更する必要はなく、第２の撮像装置２０においても低倍率で撮像するようにしてもよい。

また、上記実施形態においては、第２の撮像装置２０によって高倍率の位相差画像および蛍光画像を撮像するようにしたが、これに限らず、たとえば露光時間の異なる複数枚の位相差画像の撮影を行い、その複数枚の位相差画像を加算した画像を用いて第１および第２の判別部３１，３２による判別を行うようにしてもよい。また、第２の撮像装置２０において、多重露光画像を撮像したり、共焦点画像を撮像したりしてもよい。また、第２の撮像装置２０において、撮像条件の異なる２枚の画像を撮像し、その差分画像を用いて第１および第２の判別部３１，３２による判別を行うようにしてもよい。

また、上記実施形態においては、撮像領域Ｒの２巡目以降の評価を行う場合、過去に第１の評価を既に行っており、判定結果が不明である評価対象範囲ｒについては、第１の評価は行わず、第２の評価から行うようにしたが、判定結果が不明である評価対象範囲ｒだけでなく、その評価対象範囲ｒに隣接する周囲の評価対象範囲ｒについても第１の評価を行わず、第２の評価から行うようにしてもよい。これは、判定結果が不明である評価対象ｒに隣接する周囲の評価対象範囲ｒも判定結果が不明となっている可能性が高いためであり、このように第２の評価から行うことで、撮像領域Ｒの評価にかかる時間を短縮することができる。

また、上記実施形態において、第２の撮像装置２０において高倍率撮像を行う場合、撮像視野が狭くなるので、図５に示すように評価対象範囲ｒを複数の領域に分割した分割領域ｓｒ毎の画像を撮像することになる。この場合、分割領域ｓｒ毎の画像について判定結果が異なる場合には、複数の分割領域ｓｒのうちのいずれか１つの分割領域ｓｒの画像の判定結果を、評価対象範囲ｒの代表の判定結果として記憶するようにすればよい。

または、評価対象範囲ｒに含まれる複数の分割領域ｓｒの画像の判定結果のうち、最も多い判定結果を、評価対象範囲ｒの代表の判定結果として記憶するようにしてもよい。

または、評価対象範囲ｒに含まれる複数の分割領域ｓｒの画像の判定結果の平均の判定結果を、評価対象範囲ｒの代表の判定結果として記憶するようにしてもよい。

具体的には、たとえば第１の判別部３１によって各分割領域ｓｒの画像内の細胞の未分化細胞らしさを第１のスコアとして算出し、全ての分割領域ｓｒの第１のスコアの平均値を算出する。また、同様に、第２の判別部３２によって各分割領域ｓｒの画像内の細胞の分化細胞らしさを第２のスコアとして算出し、全ての分割領域ｓｒの第２のスコアの平均値を算出する。なお、第１のスコアは、未分化細胞である可能性が高い（未分化細胞らしさが大きい）ほど値が大きくなるものとし、第２のスコアは、分化細胞である可能性が高い（分化細胞らしさが大きい）ほど値が大きくなるものとする。

そして、第１のスコアの平均値と第２のスコアの平均値とを比較し、これらの平均値が相反するものであるかを判定し、その判定結果を評価対象範囲ｒの代表の判定結果として記憶する。具体的には、第１のスコアの平均値と第２のスコアの平均値との差が、予め設定された閾値よりも大きい場合には、これらの平均値は相反していないとし、平均値が大きい方の判定結果を評価対象範囲ｒの判定結果とする。一方、第１のスコアの平均値と第２のスコアの平均との差が、予め設定された閾値よりも小さい場合には、これらの平均値は相反しているとし、評価対象範囲ｒの判定結果を不明とする。

なお、未分化細胞らしさのスコアおよび分化細胞らしさのスコアについては、上述したように、たとえば細胞の大きさ、輝度および色などの低次元情報をスコア化してもよいし、細胞の円形度、細胞の核の形状および細胞の密度などの細胞学的な高次元情報をスコア化するようにしてもよい。

または、評価対象範囲ｒに含まれる複数の分割領域ｓｒの画像の判定結果の中に、１つでも不明の判定結果が含まれる場合には、評価対象範囲ｒの判定結果を不明として記憶するようにしてもよい。

また、上記実施形態においては、第２の評価部２において、高倍率の位相差画像に基づく評価と蛍光画像に基づく評価とを行うようにしたが、蛍光画像に基づく評価において、第１および第２の判別部３１，３２による判別結果が相反する場合には、さらに異なる評価条件で撮像された画像に基づいて評価を行うようにしてもよく、第１および第２の判別部３１，３２による判別結果が矛盾しない結果となった時点で評価を終了するようにしてもよい。

また、上記実施形態においては、評価対象の細胞が未分化細胞であるか、分化細胞であるかを評価するようにしたが、これに限らず、生細胞であるか、死細胞であるかを評価するようにしてもよい。

具体的には、第１の判別部３１によって評価対象の細胞が生細胞であるか否かを判別し、第２の判別部３２によって評価対象の細胞が死細胞であるか否かを判別し、判別結果判定部３３によって評価対象の細胞が、生細胞であるか、死細胞であるか、または不明であるかを判定するようにしてもよい。生細胞であるか否かについては、たとえば円形度や輝度などに基づいて判別し、死細胞であるか否かについては、たとえば輝度や核の有無に基づいて判別するようにすればよい。なお、死細胞の位相差画像は、一般的には白くなり、輝度が高い画像となる。このように生細胞であるか、死細胞であるかを評価することによって、死細胞を適切に取り除くことができる。

また、多能性幹細胞であるかフィーダー細胞であるかを評価するようにしてもよい。具体的には、第１の判別部３１によって評価対象の細胞が多能性幹細胞であるか否かを判別し、第２の判別部３２によって評価対象の細胞がフィーダー細胞であるか否かを判別し、判別結果判定部３３によって評価対象の細胞が、多能性幹細胞であるか、フィーダー細胞であるか、または不明であるかを判定するようにしてもよい。多能性幹細胞であるか否かについては、たとえば円形度や輝度などに基づいて判別し、フィーダー細胞であるか否かについては、たとえばフィーダー細胞に固有の形状に基づいて判別するようにすればよい。このように多能性幹細胞であるか、フィーダー細胞であるかを評価することによって、分化誘導終了時点においてフィーダー細胞を適切に取り除くことができる。

また、上記実施形態においては、第１の判別部３１と第２の判別部の２つの判別部の判別結果を用いて評価対象の細胞を評価するようにしたが、３つ以上の判別部の判別結果を用いて評価対象の細胞を評価するようにしてもよい。具体的には、たとえば上記実施形態に対して第３の判別部を設け、その第３の判別部によってフィーダー細胞であるか否かを判別するようにしてもよい。そして、第１〜第３の判別部のうち２つ以上の判別部の判別結果が相反する場合と、全て判別部が該当する種類の細胞が存在しないとの判別結果である場合に第２の評価部２による再評価を行うようにすればよい。なお、４つ以上の判別器を設けた場合にも再評価の条件は同様である。

１ 第１の評価部
２ 第２の評価部
３ 表示装置
４ 入力装置
１０ 第１の撮像装置
２０ 第２の撮像装置
３０ 判別結果評価装置
３１ 第１の判別部
３２ 第２の判別部
３３ 判別結果判定部
３４ 全体制御部

Claims (14)

1. 評価対象の細胞を評価する評価部を備え、
   前記評価部が、前記評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、前記評価対象の細胞が２種類の細胞の一方に該当するか否かを判別する第１の判別部と、前記評価対象の細胞が前記２種類の細胞の他方に該当するか否かを判別する第２の判別部との少なくとも２つの判別部を有し、
   前記評価部が、第１の評価に基づいた前記第１の判別部と前記第２の判別部との判別結果が相反する場合に、前記評価対象の細胞を評価した前記第１の評価の評価条件とは異なる評価条件で評価する第２の評価を行なうことを特徴とする細胞評価装置。
2. 前記第２の評価では、前記第１の評価よりも高倍率で前記評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、前記評価対象の細胞を評価する請求項１記載の細胞評価装置。
3. 前記第２の評価では、前記評価対象の細胞の群を複数の領域に分割した画像に基づいて評価を行う場合、前記複数の領域の画像のうちの１つの画像の評価結果を代表の評価結果とする請求項２記載の細胞評価装置。
4. 前記第２の評価では、前記評価対象の細胞の群を複数の領域に分割した画像に基づいて評価を行う場合、前記複数の領域の画像の評価結果のうち最も多い評価結果を代表の評価結果とする請求項２記載の細胞評価装置。
5. 前記第２の評価では、前記評価対象の細胞の群を複数の領域に分割した画像に基づいて評価を行う場合、前記複数の領域の画像の評価結果を平均した結果を代表の評価結果とする請求項２記載の細胞評価装置。
6. 前記第１の評価では、前記評価対象の細胞を非侵襲的な撮像方法によって撮像した画像に基づいて、前記評価対象の細胞を評価し、
   前記第２の評価では、前記評価対象の細胞を侵襲的な撮像方法によって撮像した画像に基づいて、前記評価対象の細胞を評価する請求項１から５いずれか１項記載の細胞評価装置。
7. 前記第２の評価では、前記評価対象の細胞の蛍光画像に基づいて、前記評価対象の細胞を評価する請求項６記載の細胞評価装置。
8. 前記第２の評価では、前記第１の評価において評価に用いた画像の撮像時点から予め設定された時間だけ経過した時点において撮像された画像に基づいて、前記評価対象の細胞を評価する請求項１から７いずれか１項記載の細胞評価装置。
9. 前記第２の評価では、前記第１の評価よりも多い枚数の前記評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、前記評価対象の細胞を評価する請求項１から８いずれか１項記載の細胞評価装置。
10. 前記第１の評価および前記第２の評価で、前記評価対象の細胞を経時的に複数回評価する場合、
    過去の前記第１の評価において前記第１の判別部と前記第２の判別部との判別結果が相反する場合には、現在の前記評価対象の細胞の前記第１の評価による評価を行うことなく前記第２の評価による評価を行う請求項１から９いずれか１項記載の細胞評価装置。
11. 前記第１の評価および前記第２の評価で、前記評価対象の細胞の群を複数の領域に分割して評価を行う場合、
    前記複数の領域のうちの１つの領域の過去の判別結果が相反する場合には、前記１つの領域と該１つの領域の周囲の領域の現在の前記評価対象の細胞の前記第１の評価による評価を行わない請求項１０記載の細胞評価装置。
12. 前記評価対象の細胞を撮像する第１の撮像装置と、
    前記評価条件としての撮像条件が前記第１の撮像装置と異なる第２の撮像装置と、
    を更に含む請求項１から１１いずれか１項記載の細胞評価装置。
13. 前記第２の撮像装置は、前記第１の撮像装置より高倍率、かつ蛍光画像の撮影が可能な撮像装置である請求項１２記載の細胞評価装置。
14. 評価対象の細胞を撮像した画像に基づいて、前記評価対象の細胞が２種類の細胞の一方に該当するか否かを判別する第１の判別部と、前記評価対象の細胞が前記２種類の細胞の他方に該当するか否かを判別する第２の判別部との少なくとも２つの判別部を用いて判別する第１の評価を行い、
    前記第１の評価に基づいた前記第１の判別部と前記第２の判別部との判別結果が相反する場合に、前記評価対象の細胞を前記第１の評価とは異なる評価条件で評価する第２の評価を行うことを特徴とする細胞評価方法。