JP6478115B2 - タンパク質の血中滞留性の増強方法 - Google Patents

タンパク質の血中滞留性の増強方法 Download PDF

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Description

本発明は、タンパク質の血中滞留性を増強する技術に関する。
コンドロイチンは、グリコサミノグリカンの１種であり、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の二糖構造[→4)-β-GlcUA-(1→3)-β-GalNAc-(1→]の繰り返しを基本骨格とする糖鎖である。コンドロイチンは、動物の体内では主に構成糖の水酸基の一部が硫酸化されたコンドロイチン硫酸として存在し、例えば、ＧａｌＮＡｃ残基の４位の水酸基が硫酸化されたコンドロイチン（コンドロイチン４硫酸）はコンドロイチン硫酸Ａと呼ばれ、ＧａｌＮＡｃ残基の６位の水酸基が硫酸化されたコンドロイチン（コンドロイチン６硫酸）はコンドロイチン硫酸Ｃと呼ばれている。
特許文献１には、コンドロイチンが共有結合したタンパク質が記載されており、また、同タンパク質は、非修飾物質に比較して生体内減成に対する安定性が増大している旨が記載されている。しかし、特許文献１において、この「コンドロイチン」の語は、コンドロイチン４硫酸やコンドロイチン６硫酸等の「コンドロイチン硫酸」を意味するものとして用いられている（同文献第４頁左上欄参照）。
特許文献２には、生理的に活性なヒト トロンボモジュリン ポリペプチドであって、そのペプチド鎖にコンドロイチン及び／又はコンドロイチン硫酸を含む糖鎖を有する単離されたポリペプチド（タイプＩＩトロンボモジュリン ポリペプチド）が記載されている。また、特許文献２には、このポリペプチドは、コンドロイチン及び／又はコンドロイチン硫酸を含む糖鎖を実質的に有しないポリペプチド（タイプＩトロンボモジュリン ポリペプチド）に比較してより高い活性を有していることを知見した旨、記載されている。
特許文献３には、グリコサミノグリカンにより修飾されたタンパク質が記載されており、また、同タンパク質は、未修飾タンパク質と比較して、生体内での安定性に優れ、且つ、生理活性を持続的に発現し得る旨が記載されている。また、特許文献４には、共有結合によりタンパク質に結合したグリコサミノグリカンを含む共有結合体が記載されており、また、グリコサミノグリカンの結合による薬物動態学的特性の改良について記載されている。特許文献３や４においては、コンドロイチンについて言及しているものの、コンドロイチンは、他の多くのグリコサミノグリカン（すなわち、コロミン酸、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸、テイクロン酸、デルマタン硫酸、ヘパリン、ヘパラン硫酸、ケラト硫酸、ケラトポリ硫酸、およびこれらの誘導体）と同列の素材として例示されているにとどまる。実際、グリコサミノグリカンの種類によってタンパク質に結合させた場合の当該タンパク質の安定性が異なるか否かの開示や示唆はない。
また、これらの文献には、コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンやコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンを利用することについての開示や示唆もない。
コンドロイチンは、自然界には線虫、ウシの眼の角膜、スルメイカやマダコの皮などに存在するとされているものの、その存在量が少なく、これらに由来するコンドロイチンを工業的規模で製造するのは非現実的である。そこで、コンドロイチンは、一般にコンドロイチン硫酸を脱硫酸化することによって製造されており、これが一般的にコンドロイチンとして利用されている。
近年、コンドロイチンを微生物に生産させる技術が報告されており、特許文献５〜７には、コンドロイチン生産能を有するエシェリヒア（Escherichia）属に属する細菌や、これらの細菌によって生産されたコンドロイチンが記載されている。また、特許文献８や９には、コンドロイチン合成酵素を利用してｉｎ ｖｉｔｒｏでコンドロイチンを合成する方法が開示されている。しかし、これらの文献には、細菌等の微生物によって生産されたコンドロイチンやコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンをタンパク質の血中滞留性の増強に利用することについての開示や示唆はない。
さらに、特許文献１〜９には、グリコサミノグリカンの種類や由来によってグリコサミノグリカンそのものの血中滞留性が異なることについての開示や示唆はなく、また、微生物によって生産されたコンドロイチンや酵素によって合成されたコンドロイチンが、他のグリコサミノグリカンに比して著しく長い血中滞留性を有することについての開示や示唆もない。そして、特許文献１〜９には、微生物によって生産されたコンドロイチンや酵素によって合成されたコンドロイチンをタンパク質に結合させた複合体が、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンや他のグリコサミノグリカンをタンパク質に結合させた複合体に比して著しく長い血中滞留性を有することについての開示や示唆もない。
特開昭６２−２５５４３５号公報 国際公開第１９９１／４２７６号 特開平３−２８４６９８号公報 特表２０００−５０１０８２号公報 特開２００８−２９５４５０号公報 特表２０１０−５２４４３１号公報 特表２０１３−５２０９９５号公報 特許第４１０１５４８号公報 特許第５０８１６２９号公報
本発明は、タンパク質の血中滞留性を増強する技術を提供することを課題とする。
本発明者は、コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンは、他のグリコサミノグリカンに比して、著しく長い血中滞留性を有することを見出した。また、本発明者は、コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンをタンパク質に結合させて複合体を形成させることにより、他のグリコサミノグリカンをタンパク質に結合させた場合に比して、当該タンパク質の血中滞留性を著しく増強できることを見出した。さらに驚くべきことに、本発明者は、コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンは、コンドロイチン硫酸の脱硫酸化により生産されたコンドロイチンと比して、タンパク質と複合体を形成させた場合に当該タンパク質の血中滞留性を顕著に増強することも見出し、本発明を完成させた。
すなわち前記課題は、以下に例示する本発明によって解決される。
［１］
コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンおよび／またはコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンを有効成分として含有する、タンパク質の血中滞留性増強剤。
［２］
前記微生物が、細菌である、前記増強剤。
［３］
前記細菌が、エシェリヒア（Escherichia）属に属する細菌である、前記増強剤。
［４］
前記細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、前記増強剤。
［５］
前記コンドロイチン合成酵素が、コンドロイチンポリメラーゼである、前記増強剤。
［６］
前記コンドロイチンが、側鎖を有しないコンドロイチンである、前記増強剤。
［７］
コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンおよび／またはコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンと、タンパク質との複合体。
［８］
前記コンドロイチンと前記タンパク質とが共有結合によって複合体を形成している、前記複合体。
［９］
前記複合体を含有する、医薬組成物。
［１０］
前記複合体を含有する、血中滞留性が増強されたタンパク質製剤。
［１１］
コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンおよび／またはコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンと、タンパク質との複合体を形成させるステップを含む、タンパク質の血中滞留性の増強方法。
［１２］
コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンおよび／またはコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンと、タンパク質との複合体を形成させるステップを含む、血中滞留性が増強されたタンパク質の製造方法。
［１３］
複合体の形成が、共有結合の形成によって行われる、前記方法。
各種グリコサミノグリカンおよび微生物によって生産されたコンドロイチンのそれぞれと複合体を形成した場合の、タンパク質（アスパラギナーゼ）の血中滞留性を比較した図。 各種グリコサミノグリカンおよび微生物によって生産されたコンドロイチンのそれぞれと複合体を形成した場合の、タンパク質（インターフェロン）の血中滞留性を比較した図。 コンドロイチン硫酸を脱硫酸することによって製造したコンドロイチンおよび微生物によって生産されたコンドロイチンのそれぞれと複合体を形成した場合の、タンパク質（アスパラギナーゼ）の血中滞留性を比較した図。 各種グリコサミノグリカン、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化することによって製造したコンドロイチン、および微生物によって生産されたコンドロイチンのそれぞれと複合体を形成した場合の、タンパク質（オボアルブミン）の血中滞留性を比較した図。 微生物によって生産されたコンドロイチンと複合体を形成した場合の、タンパク質（成長ホルモン）の血中滞留性を示した図。 微生物によって生産されたコンドロイチンの血中滞留性を示した図。
[１]本発明で用いられるコンドロイチン
本発明で用いられるコンドロイチン（以下、「本発明のコンドロイチン」ともいう）は、コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンおよび／またはコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンである。以下、コンドロイチン生産能を有する微生物によって生産されたコンドロイチンを、「微生物由来コンドロイチン」ともいう。また、以下、コンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンを、「酵素合成コンドロイチン」ともいう。この「微生物由来コンドロイチン」は、具体的には、例えば、コンドロイチン生産能を有する微生物を培養することにより生産されたコンドロイチンである。また、この「酵素合成コンドロイチン」は、具体的には、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは無細胞系でコンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンである。
「コンドロイチン」とは、グルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）とＮ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）の二糖構造[→4)-β-GlcUA-(1→3)-β-GalNAc-(1→]の繰り返しを基本骨格とする糖鎖をいう。同基本骨格を「コンドロイチン骨格」ともいう。コンドロイチンは、側鎖を有していてもよく、有していなくてもよい。すなわち、コンドロイチンは、具体的には、コンドロイチン骨格に側鎖を有する糖鎖（以下、「側鎖を有するコンドロイチン」ともいう）であってもよく、コンドロイチン骨格に側鎖を有しない糖鎖（以下、「側鎖を有しないコンドロイチン」ともいう）であってもよい。側鎖としては、フルクトース（Ｆｒｕ）等の糖残基が挙げられる。側鎖を有するコンドロイチンとしては、ＧａｌＮＡｃ、ＧｌｃＵＡ、およびＦｒｕからなる三糖構造[→4)(β-Fru-(2→3))-β-GlcUA-(1→3)-β-GalNAc-(1→]が繰り返し重合して構成された糖鎖であるＫ４多糖（フルクトシル化コンドロイチン）が挙げられる。Ｋ４多糖としては、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）Ｋ４株が生産する多糖が挙げられる。側鎖を有しないコンドロイチンとしては、本来的に側鎖を有しないコンドロイチン（側鎖を有しない形態で生産されたコンドロイチン）や側鎖を除去したコンドロイチンが挙げられる。側鎖を除去したコンドロイチンとしては、フルクトース残基を除去したＫ４多糖（脱フルクトシル化Ｋ４多糖）が挙げられる。側鎖は、例えば、酸加水分解反応により除去することができる（Lidholt K, Fjelstad M., J Biol Chem. 1997 Jan 31; 272(5): 2682-7.）。なお、「側鎖を有しないコンドロイチン」には、側鎖を全く有しないコンドロイチンに限られず、側鎖を実質的に有しないコンドロイチンも含まれるものとする。「側鎖を実質的に有しないコンドロイチン」とは、コンドロイチン骨格を構成する糖残基の総数に対する側鎖を有する糖残基の数の比率が５％以下であるコンドロイチンをいい、コンドロイチン骨格を構成する糖残基の総数に対する側鎖を有する糖残基の数の比率が３％以下、１％以下、または０．５％以下であるコンドロイチンであってもよい。
コンドロイチンは、側鎖を有しないコンドロイチンであることが好ましい。よって、本発明の一態様においては、Ｋ４多糖等の側鎖を有するコンドロイチンは、「コンドロイチン」に含まれなくてもよい。また、コンドロイチンは、本来的に側鎖を有しないコンドロイチンであることも好ましい。よって、本発明の一態様においては、脱フルクトシル化Ｋ４多糖等の側鎖を除去したコンドロイチンも、「コンドロイチン」に含まれなくてもよい。
本発明において、「コンドロイチン」には、コンドロイチン硫酸は含まれないものとする。また、「本発明のコンドロイチン」には、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンは含まれないものとする。
本発明のコンドロイチンの分子量は、タンパク質と複合体を形成することによりタンパク質の血中滞留性を増強することができる限り、特に制限されない。本発明のコンドロイチンの分子量は、重量平均分子量として、例えば、６×１０2〜１×１０6、３×１０3〜１×１０6、３×１０3〜１×１０5、または３×１０3〜５×１０4であってよい。また、本発明のコンドロイチンの分子量は、重量平均分子量として、例えば、１×１０4以上であってよい。なお、ここでいう「重量平均分子量」は、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定される重量平均分子量である。
＜微生物由来コンドロイチン＞
「コンドロイチン生産能を有する微生物」とは、本発明のコンドロイチンを生産する能力を有する微生物をいう。「本発明のコンドロイチンを生産する能力」とは、例えば、本発明のコンドロイチンそのものを生産する能力であってもよく、修飾されたコンドロイチンを生産する能力であってもよい。「修飾されたコンドロイチン」とは、本発明のコンドロイチンを製造する為の素材として用いることが可能な、コンドロイチン骨格を有する糖鎖をいう。「修飾されたコンドロイチン」としては、本発明のコンドロイチンに他の糖が結合してなる糖鎖が挙げられる。すなわち、「修飾されたコンドロイチン」としては、本発明のコンドロイチンが側鎖を除去したコンドロイチンである場合における、側鎖を有するコンドロイチンが挙げられる。例えば、Ｋ４多糖が微生物により生産される場合、Ｋ４多糖は、そのまま、あるいは好ましくは脱フルクトシル化して、本発明のコンドロイチンとして用いることができる。よって、Ｋ４多糖を生産する能力を有する微生物は、「コンドロイチン生産能を有する微生物」に含まれてよい。また、微生物によって生産されたＫ４多糖、およびそれを脱フルクトシル化して得られた脱フルクトシル化Ｋ４多糖は、いずれも、「微生物由来コンドロイチン」に含まれてよい。
「本発明のコンドロイチンを生産する能力」は、本発明のコンドロイチンそのものを生産する能力であるのが好ましい。よって、本発明の一態様においては、「コンドロイチン生産能を有する微生物」には、修飾されたコンドロイチンを生産する微生物は含まれなくてもよい。すなわち、例えば、本発明のコンドロイチンに他の糖が結合してなる糖鎖を生産する微生物は、生産された糖鎖から他の糖を除去しなければ本発明のコンドロイチンを取得することができないので、本発明における「コンドロイチン生産能を有する微生物」に含まれなくてもよい。具体的には、例えば、Ｋ４多糖等の側鎖を有するコンドロイチンを生産する微生物は、「コンドロイチン生産能を有する微生物」に含まれなくてもよい。
コンドロイチン生産能を有する微生物は、例えば、細胞内にコンドロイチンを生産する微生物であってもよく、培地中にコンドロイチンを生産する微生物であってもよく、菌体表層（例えば、細胞膜上や細胞壁上）にコンドロイチンを生産する微生物であってもよい。菌体表層にコンドロイチンを生産する微生物としては、莢膜多糖としてコンドロイチンを生産する微生物が挙げられる。
微生物の種類は特に限定されない。微生物としては、例えば、細菌や酵母が挙げられる。微生物としては、コンドロイチンの生産性や取り扱いの容易性などの点から、細菌が好ましい。
細菌の種類は特に限定されない。細菌としては、特許文献６に開示されているグルコノアセトバクター・ハンセニー（Gluconacetobacter hansenii）やグルコノアセトバクター・キシリナス（Gluconacetobacter xylinus）等のグルコノアセトバクター属細菌、リゾビウム・メフロティ（Rhizobium meffloti）等のリゾビウム属細菌、アセトバクター・キシリナム（Acetobacter xylinum）等のアセトバクター属細菌、エルヴィニア・アミロボーラ（Erwinia amylovora）等のエルヴィニア属細菌、チオバチルス・フェロキシダンス（Thiobacillus ferrooxidans）等のチオバチルス属細菌、ザイレラ・ファスチジオーサ（Xylella fastidiosa）等のザイレラ属細菌、シノリゾビウム・メリロティ（Sinorhizobium meliloti）等のシノリゾビウム属細菌、ロドコッカス・ロドクラス（Rhodococcus rhodochrous）等のロドコッカス属細菌、クレブシエラ・アエロゲネス（Klebsiella aerogenes）等のクレブシエラ属細菌、エンテロバクター・アエロゲネス（Enterobacter aerogenes）等のエンテロバクター属細菌、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）等のエシェリヒア属細菌が例示される。また、細菌としては、特許文献７に開示されているシュードモナス（Pseudomonas）属細菌、キサントモナス（Xanthomonas）属細菌、メチロモナス（Methylomonas）属細菌、アシネトバクター（Acinetobacter）属細菌、スフィンゴモナス（Sphingomonas）属細菌などの非病原性生物も例示できる。また、細菌としては、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）も挙げられる。
細菌としては、コンドロイチンの生産性や、汎用性、取り扱いの容易性などの点で、エシェリヒア（Escherichia）属に属する細菌が好ましい。なかでも、特に汎用されており取り扱いが容易な、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）が好ましい。エシェリヒア・コリとしては、例えば、Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）やＭＧ１６５５株（ＡＴＣＣ ４７０７６）等のエシェリヒア・コリＫ−１２株；ＮＣＤＣ Ｕ１−４１株（ＡＴＣＣ ２３５０２）等のエシェリヒア・コリＫ４株；ＮＣＤＣ Ｂｉ ８３３７−４１株（ＡＴＣＣ ２３５０６）等のエシェリヒア・コリＫ５株；ＢＬ２１株等のエシェリヒア・コリＢ株；およびそれらの派生株が挙げられる。これらの株は、例えば、American Type Culture Collection（ATCC）（P.O. Box 1549 Manassas, VA 20108 United States of America）やThe International Escherichia and Klebsiella Centre (WHO), Statens Serum Institut（Building 37K, Room 125c Artillerivej 5 DK-2300 Copenhagen S Denmark）のカタログ又はホームページから入手可能である。
コンドロイチン生産能を有する微生物は、本来的に本発明のコンドロイチンを生産する能力を有する微生物であってもよく、本発明のコンドロイチンを生産する能力を有するように改変された微生物であってもよい。コンドロイチン生産能を有する微生物は、例えば、上記のような微生物にコンドロイチン生産能を付与することにより取得できる。
本来的に本発明のコンドロイチンを生産する能力を有する微生物としては、例えば、エシェリヒア・コリＫ４株やパスツレラ・ムルトシダ タイプＦが挙げられる。エシェリヒア・コリＫ４株は、フルクトース残基を側鎖として有するコンドロイチン（Ｋ４多糖）を生産する。よって、エシェリヒア・コリＫ４株は、例えば、そのまま「コンドロイチン生産能を有する微生物」として用いられてもよいし、生産するコンドロイチン（Ｋ４多糖）がフルクトース残基を側鎖として有しないように改変され「コンドロイチン生産能を有する微生物」として用いられてもよい。そのようなエシェリヒア・コリＫ４株の改変株（生産するコンドロイチン（Ｋ４多糖）がフルクトース残基を側鎖として有しないように改変された株）は、例えば、エシェリヒア・コリＫ４株のkfoE遺伝子を不活性化して得ることができる。エシェリヒア・コリＫ４株のkfoE遺伝子の不活性化は、例えば、公知の文献（特表２０１３−５３１９９５）に記載された方法で行うことができる。
コンドロイチン生産能は、例えば、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を微生物に発現可能に導入することにより、付与できる。
コンドロイチン生産能が側鎖を有するコンドロイチンの生産能である場合、コンドロイチン生産能は、例えば、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を、側鎖を付加する微生物に発現可能に導入することにより、付与できる。「側鎖を付加する微生物」は、例えば、側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物である。「側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子を有する微生物」は、該遺伝子を本来的に有する微生物であってもよく、該遺伝子を発現可能に導入した微生物であってもよい。
コンドロイチン生産能が側鎖を有しないコンドロイチンの生産能である場合、コンドロイチン生産能は、例えば、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を、側鎖を付加しない微生物に発現可能に導入することにより、付与できる。「側鎖を付加しない微生物」は、例えば、側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子を有しない微生物である。「側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子を有しない微生物」は、該遺伝子を本来的に有しない微生物であってもよく、該遺伝子を欠失または不活性化させた微生物であってもよい。
コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT, pmCS遺伝子が挙げられる。kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子が挙げられる。pmCS遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のpmCS遺伝子が挙げられる。側鎖の付加に関与するタンパク質をコードする遺伝子としては、kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子が挙げられる。kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子が挙げられる。これらの遺伝子の塩基配列、及びこれらの遺伝子がコードするタンパク質のアミノ酸配列は、例えば、NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）等の公用データベースから取得できる。遺伝子の導入は、例えば、同遺伝子を搭載したベクターを微生物に導入することや、遺伝子を微生物の染色体上に導入することにより達成できる。遺伝子は、１コピーのみ導入されてもよく、２コピーまたはそれ以上導入されてもよい。本発明においては、１種の遺伝子を導入してもよく、２種またはそれ以上の遺伝子を導入してもよい。
導入する遺伝子は、用いる微生物の種類等に応じて適宜選択できる。例えば、エシェリヒア・コリＫ５株は、グリコサミノグリカンの１種であるヘパロサンの生産能を有し、コンドロイチンの生産能を有さないが、kfoAおよびkfoC遺伝子を導入することにより、エシェリヒア・コリＫ５株にコンドロイチン生産能を付与することができる。また、例えば、エシェリヒア・コリＫ−１２株は、コンドロイチンの生産能を有さないが、kfo遺伝子群（kfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG）およびkps遺伝子群（kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT）を導入することにより、エシェリヒア・コリＫ−１２株にコンドロイチン生産能を付与することができる。これらのコンドロイチン生産能を付与された株により、例えば、コンドロイチンを莢膜多糖として生産させることができる。莢膜多糖として生産されたコンドロイチンは、例えば、そのまま本発明のコンドロイチンとして用いてもよく、塩酸等の酸と接触させて処理し本発明のコンドロイチンとして用いてもよい。
また、コンドロイチン生産能を有する微生物は、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子の内、同微生物がもともと有する遺伝子の発現が増強されるよう改変されていてもよい。例えば、エシェリヒア・コリＫ４株に、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする遺伝子を導入してもよい。また、例えば、エシェリヒア・コリＫ５株に、kfoAおよびkfoC遺伝子に加えて、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードする他の遺伝子をさらに導入してもよい。なお、「微生物がもともと有する遺伝子」は、当該微生物由来の遺伝子であってもよく、そうでなくてもよい。すなわち、例えば、エシェリヒア・コリＫ４株に、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードするエシェリヒア・コリＫ４株由来の遺伝子を導入してもよく、コンドロイチンの生産に関与するタンパク質をコードするエシェリヒア・コリＫ４株以外の生物由来の遺伝子を導入してもよい。
コンドロイチン生産能を有する微生物としては、例えば、特許文献６または７に開示されているコンドロイチン生産能を有する細菌が挙げられる。
コンドロイチン生産能を有する微生物としては、特許文献６に記載されている「エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子とkfoC遺伝子が共に導入されたエシェリヒア・コリ」を好ましく例示することができる。また、コンドロイチン生産能が側鎖を有しないコンドロイチンの生産能である場合は、コンドロイチン生産能を有する微生物としては、「エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子とkfoC遺伝子が共に導入された、kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子から選択される１〜３または全ての遺伝子を有しないエシェリヒア・コリ」を好ましく例示することができる。そのようなエシェリヒア・コリとしては、例えば、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子とkfoC遺伝子が共に導入されたエシェリヒア・コリＫ５株が好ましい。エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子やkfoC遺伝子の導入は、例えば、特許文献６に記載された方法で行うことができる。
また、コンドロイチン生産能を有する微生物としては、特許文献７に記載されている「エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のxylS遺伝子が導入されたエシェリヒア・コリ」も好ましく例示することができる。また、コンドロイチン生産能が側鎖を有しないコンドロイチンの生産能である場合は、コンドロイチン生産能を有する微生物としては、「エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG, kpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子及びシュードモナス・プチダ（Pseudomonas putida）由来のxylS遺伝子が導入された、kfoD, orf3(kfoI), kfoE, orf1(kfoH)遺伝子から選択される１〜３または全ての遺伝子を有しないエシェリヒア・コリ」も好ましく例示することができる。そのようなエシェリヒア・コリとしては、例えば、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA, kfoB, kfoC, kfoF, kfoG遺伝子を各４コピー、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkpsF, kpsE, kpsD, kpsU, kpsC, kpsS, kpsM, kpsT遺伝子を各１コピー、及びシュードモナス・プチダ由来のxylS遺伝子を１コピー導入したエシェリヒア・コリが好ましい。なかでも、これらの遺伝子が導入されたエシェリヒア・コリＫ−１２株が好ましい。エシェリヒア・コリＫ−１２株としては、エシェリヒア・コリＫ−１２ Ｗ３１１０株を好ましく例示することができる。エシェリヒア・コリＫ−１２ Ｗ３１１０株にこれらの遺伝子が導入された細菌株は、特許文献７において「ＭＳＣ７０２株」として開示されている。これらの遺伝子の導入は、例えば、特許文献７に記載された方法で行うことができる。
なお、コンドロイチン生産能の付与等の微生物の改変に使用される遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示したような公知の遺伝子に限られず、例えば、そのバリアントであってもよい。微生物の改変に使用される遺伝子は、例えば、公知の遺伝子の塩基配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、且つ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。また、微生物の改変に使用される遺伝子は、例えば、公知のタンパク質のアミノ酸配列全体に対して、８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９７％以上、特に好ましくは９９％以上の相同性を有し、且つ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。なお、「相同性」とは、「同一性」を意味してよい。また、微生物の改変に使用される遺伝子は、例えば、公知のタンパク質のアミノ酸配列において、１箇所にまとまって若しくは数箇所に分散して、１又は数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入、及び／又は付加されたアミノ酸配列を有し、且つ、元の機能が維持されたタンパク質をコードする遺伝子であってもよい。「１又は数個」とは、例えば、１〜３０個、好ましくは１〜２０個、より好ましくは１〜１０個、さらに好ましくは１〜５個、特に好ましくは１〜３個であってよい。アミノ酸の置換、欠失、挿入、及び／又は付加は、タンパク質の機能が正常に維持される保存的変異である。保存的変異の代表的なものは、保存的置換である。保存的置換とは、置換部位が芳香族アミノ酸である場合には、Phe、Trp、Tyr間で、置換部位が疎水性アミノ酸である場合には、Leu、Ile、Val間で、極性アミノ酸である場合には、Gln、Asn間で、塩基性アミノ酸である場合には、Lys、Arg、His間で、酸性アミノ酸である場合には、Asp、Glu間で、ヒドロキシル基を持つアミノ酸である場合には、Ser、Thr間でお互いに置換する変異である。保存的置換とみなされる置換としては、具体的には、AlaからSer又はThrへの置換、ArgからGln、His又はLysへの置換、AsnからGlu、Gln、Lys、His又はAspへの置換、AspからAsn、Glu又はGlnへの置換、CysからSer又はAlaへの置換、GlnからAsn、Glu、Lys、His、Asp又はArgへの置換、GluからGly、Asn、Gln、Lys又はAspへの置換、GlyからProへの置換、HisからAsn、Lys、Gln、Arg又はTyrへの置換、IleからLeu、Met、Val又はPheへの置換、LeuからIle、Met、Val又はPheへの置換、LysからAsn、Glu、Gln、His又はArgへの置換、MetからIle、Leu、Val又はPheへの置換、PheからTrp、Tyr、Met、Ile又はLeuへの置換、SerからThr又はAlaへの置換、ThrからSer又はAlaへの置換、TrpからPhe又はTyrへの置換、TyrからHis、Phe又はTrpへの置換、及び、ValからMet、Ile又はLeuへの置換が挙げられる。微生物の改変に使用される遺伝子は、任意のコドンをそれと等価のコドン（同じアミノ酸をコードする別のコドン）に置換したものであってもよい。例えば、微生物の改変に使用される遺伝子は、使用する宿主のコドン使用頻度（宿主が発現するタンパク質をコードする核酸においてコドンとして使用される頻度）に応じて最適なコドンを有するように改変されていてもよい。
「微生物由来コンドロイチン」は、例えば、上記例示したようなコンドロイチン生産能を有する微生物を培養することで生産できる。培養条件は、コンドロイチン生産能を有する微生物が生育でき、コンドロイチンが生産される限り、特に制限されない。コンドロイチン生産能を有する微生物は、例えば、細菌や酵母等の微生物を培養する通常の条件で培養することができる。培養条件としては、例えば、特許文献５〜７に記載されている培養条件を参照できる。
培養後、公知の方法で培養物からコンドロイチンを単離し精製することができる。具体的には、例えば、コンドロイチンは、エタノール等の溶媒を利用して沈殿させ、回収することができる。また、コンドロイチンは、この沈殿物の再溶解と沈殿の繰り返しや、陰イオン交換その他のクロマトグラフィーなどによってさらに精製してもよい。
＜酵素合成コンドロイチン＞
「コンドロイチン合成酵素」とは、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）残基およびグルクロン酸（ＧｌｃＵＡ）残基を糖鎖非還元末端に交互に付加し、コンドロイチン鎖を伸長する反応を触媒するタンパク質をいう。コンドロイチン合成酵素は、ＧａｌＮＡｃ残基の付加およびＧｌｃＵＡ残基の付加の両方を単独で触媒するタンパク質であってもよく、ＧａｌＮＡｃ残基の付加を触媒するタンパク質とＧｌｃＵＡ残基の付加を触媒するタンパク質の組み合わせであってもよい。コンドロイチン合成酵素としては、コンドロイチンポリメラーゼが挙げられる。コンドロイチンポリメラーゼは、ＧａｌＮＡｃ残基の付加およびＧｌｃＵＡ残基の付加の両方を単独で触媒する。コンドロイチンポリメラーゼとしては、kfoC遺伝子にコードされるKfoCタンパク質やpmCS遺伝子にコードされるPmCSタンパク質が挙げられる。kfoC遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoC遺伝子が挙げられる。pmCS遺伝子としては、パスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）由来のpmCS遺伝子が挙げられる。コンドロイチン合成酵素としては、例えば、微生物由来のコンドロイチン合成酵素が好ましい。微生物由来のコンドロイチン合成酵素としては、具体的には、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoC遺伝子にコードされるKfoCタンパク質（Ｋ４ＣＰ）やパスツレラ・ムルトシダ（Pasteurella multocida）のpmCS遺伝子にコードされるPmCSタンパク質等の微生物が本来的に有するコンドロイチン合成酵素が好ましく例示される。中でも、KfoCタンパク質（Ｋ４ＣＰ）が好ましい。コンドロイチン合成酵素としては、１種のコンドロイチン合成酵素を用いてもよく、２種またはそれ以上のコンドロイチン合成酵素を用いてもよい。
コンドロイチン合成酵素としては、例えば、コンドロイチン合成酵素を産生する微生物の培養物、該培養物から分離した培養上清、該培養物から分離した菌体、該菌体の処理物、それらから分離したコンドロイチン合成酵素が挙げられる。すなわち、コンドロイチン合成酵素は、コンドロイチン合成酵素以外の成分を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。また、コンドロイチン合成酵素は、所望の程度に精製されていてよい。コンドロイチン合成酵素を産生する微生物は、本来的にコンドロイチン合成酵素を産生するものであってもよく、コンドロイチン合成酵素を産生するように改変されたものであってもよい。コンドロイチン合成酵素を産生する微生物は、例えば、コンドロイチン合成酵素をコードする遺伝子を微生物に発現可能に導入することにより取得できる。遺伝子の導入は、例えば、同遺伝子を搭載したベクターを微生物に導入することや、遺伝子を微生物の染色体上に導入することにより達成できる。
コンドロイチン合成酵素をコードする遺伝子は、元の機能が維持されたタンパク質をコードする限り、上記例示したような公知の遺伝子に限られず、例えば、そのバリアントであってもよい。コンドロイチン合成酵素をコードする遺伝子のバリアントについては、上述したコンドロイチン生産能の付与等の微生物の改変に使用される遺伝子のバリアントに関する記載を準用できる。
「酵素合成コンドロイチン」は、例えば、上記に例示したようなコンドロイチン合成酵素を、ＧｌｃＵＡ供与体、ＧａｌＮＡｃ供与体、および糖受容体と、適当な反応系において共存させることにより合成できる。反応条件は、コンドロイチンが合成される限り、特に制限されない。反応条件は、コンドロイチン合成酵素の由来や態様、およびコンドロイチンの所望の重合度等の諸条件に応じて適宜設定できる。反応条件としては、例えば、特許文献８または９に記載の条件を参照できる。
「ＧｌｃＵＡ供与体」とは、コンドロイチン合成酵素によるコンドロイチン合成反応においてＧｌｃＵＡ残基を供給する分子をいう。ＧｌｃＵＡ供与体の種類は、コンドロイチン合成反応に利用可能である限り特に限定されない。ＧｌｃＵＡ供与体としては、ＧｌｃＵＡヌクレオチドが挙げられる。ＧｌｃＵＡヌクレオチドとしては、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡ（ウリジン５’−ジホスホ−グルクロン酸）が挙げられる。ＧｌｃＵＡ供与体としては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。ＧｌｃＵＡ供与体は、例えば、公知の手法により合成することができる。
「ＧａｌＮＡｃ供与体」とは、コンドロイチン合成酵素によるコンドロイチン合成反応においてＧａｌＮＡｃ残基を供給する分子をいう。ＧａｌＮＡｃ供与体の種類は、コンドロイチン合成反応に利用可能である限り特に限定されない。ＧａｌＮＡｃ供与体としては、ＧａｌＮＡｃヌクレオチドが挙げられる。ＧａｌＮＡｃヌクレオチドとしては、ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃ（ウリジン５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルガラクトサミン）が挙げられる。ＧａｌＮＡｃ供与体としては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。ＧａｌＮＡｃ供与体は、例えば、公知の手法により合成することができる。
ＵＤＰ−ＧａｌＮＡｃは、例えば、ＵＤＰ−Ｇｌｃ−４−エピメラーゼの作用により、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ（ウリジン５’−ジホスホ−Ｎ−アセチルグルコサミン）を変換して得ることができる。また、ＵＤＰ−ＧｌｃＵＡは、例えば、ＵＤＰ−Ｇｌｃデヒドロゲナーゼの作用により、ＵＤＰ−Ｇｌｃ（ウリジン５’−ジホスホ−グルコース）を変換して得ることができる。よって、ＵＤＰ−Ｇｌｃ−４−エピメラーゼおよび／またはＵＤＰ−Ｇｌｃデヒドロゲナーゼを利用することにより、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃおよび／またはＵＤＰ−ＧｌｃをＧａｌＮＡｃ供与体および／またはＧｌｃＵＡ供与体として用いてコンドロイチンを合成することもできる。ＵＤＰ−Ｇｌｃ−４−エピメラーゼとしては、kfoA遺伝子にコードされるKfoAタンパク質が挙げられる。ＵＤＰ−Ｇｌｃデヒドロゲナーゼとしては、kfoF遺伝子にコードされるKfoFタンパク質が挙げられる。kfoA遺伝子およびkfoF遺伝子としては、エシェリヒア・コリＫ４株由来のkfoA遺伝子およびkfoF遺伝子が挙げられる。
「糖受容体」とは、コンドロイチン合成酵素によるコンドロイチン合成反応において、その非還元末端にＧｌｃＵＡ残基またはＧａｌＮＡｃ残基が付加されることによりコンドロイチン鎖の伸長が開始される糖鎖（アクセプター）をいう。
糖受容体としては、下記一般式（Ｉ）または（ＩＩ）で示される糖鎖が挙げられる。
ＧｌｃＵＡ−Ｒ1 ・・・・（Ｉ）
ＧａｌＮＡｃ−Ｒ2 ・・・・（ＩＩ）
（各式中、「Ｒ1」及び「Ｒ2」はそれぞれ任意の基を示す。）
「Ｒ1」及び「Ｒ2」としては、水酸基や１またはそれ以上の残基数の糖鎖が挙げられる。「Ｒ1」及び「Ｒ2」がそれぞれ糖鎖である場合、各式中、「−」はグリコシド結合を示す。糖鎖としては、コンドロイチン鎖、ヘパロサン鎖、ヒアルロン酸鎖が挙げられる。コンドロイチン鎖としては、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンや微生物由来コンドロイチンが挙げられる。また、糖鎖としては、これら糖鎖の誘導体も挙げられる。「糖鎖の誘導体」とは、原子、官能基、化合物等の構成要素が導入、置換、および／または除去された糖鎖をいう。糖鎖の誘導体としては、硫酸化された糖鎖や任意の糖が付加された糖鎖が挙げられる。すなわち、酵素合成コンドロイチンの糖受容体部分は、本発明のコンドロイチンに該当する構造を有していてもよいし、本発明のコンドロイチンに該当しない構造を有していてもよい。
一般式（Ｉ）において、非還元末端のＧｌｃＵＡ残基はβ構造であるのが好ましい。また、一般式（Ｉ）において、「Ｒ1」がＧｌｃＮＡｃやＧａｌＮＡｃ等の糖残基を含み、非還元末端のＧｌｃＵＡ残基が「Ｒ1」の該糖残基と結合している場合、その結合はβ−１，３−グリコシド結合またはβ−１，４−グリコシド結合であるのが好ましい。
一般式（ＩＩ）において、非還元末端のＧａｌＮＡｃ残基はβ構造であるのが好ましい。また、一般式（ＩＩ）において、「Ｒ2」がＧｌｃＵＡ等の糖残基を含み、非還元末端のＧａｌＮＡｃ残基が「Ｒ2」の該糖残基と結合している場合、その結合はβ−１，４−グリコシド結合であるのが好ましい。
糖受容体の糖鎖の残基数は、コンドロイチンが合成される限り特に制限されない。糖受容体の糖鎖の残基数は、例えば、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、または１０以上であってよく、６以上であるのが好ましい。糖受容体の糖鎖の残基数は、例えば、５０以下、４０以下、３０以下、または２０以下であってよい。
糖受容体としては、コンドロイチン鎖が好ましい。コンドロイチン鎖としては、本発明のコンドロイチンが好ましい。本発明のコンドロイチンとしては、微生物由来コンドロイチンが挙げられる。糖受容体としては、具体的には、例えば、６残基以上のコンドロイチン鎖を好適に用いることができる。
糖受容体としては、市販品を用いてもよく、適宜製造して取得したものを用いてもよい。糖受容体は、例えば、公知の手法により調製することができる。
また、反応系には、界面活性剤を共存させてよい。また、反応系には、有機溶媒を共存させてよい。界面活性剤や有機溶媒としては、特許文献９に記載されたものが挙げられる。
反応温度は、例えば、１０〜５０℃、２０〜４０℃、または２５〜３７℃であってよい。反応時間は、例えば、１時間〜１０日間、１０〜３０時間、または１５〜２４時間であってよい。
上記のように反応を行うことにより、酵素合成コンドロイチンが合成される。酵素合成コンドロイチンは、上述した微生物由来コンドロイチンと同様にして、単離および精製することができる。
このようにして得られる「酵素合成コンドロイチン」は、コンドロイチン生産能を有する微生物が細胞内で行う反応を、微生物の培養以外の方法、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは無細胞系で再現して得られるコンドロイチンである。すなわち、「酵素合成コンドロイチン」は「微生物由来コンドロイチン」と実質的に同一の反応を経て得られるコンドロイチンである。よって、両者は血中滞留性等において同質のコンドロイチンである。
[２]本発明の増強剤
本発明の増強剤は、本発明のコンドロイチンを有効成分として含有する、タンパク質の血中滞留性増強剤である。本発明の増強剤は、微生物由来コンドロイチン及び酵素合成コンドロイチンのいずれか一方のみを有効成分として含有していてもよく、これらの両者を有効成分として含有していてもよい。また、本発明の増強剤は、本発明のコンドロイチンからなるものであってもよく、その他の成分を含むものであってもよい。「その他の成分」は、本発明の増強剤の利用態様に応じて許容可能なものであれば特に制限されない。「その他の成分」としては、例えば、本発明の効果を損なわず、且つ薬理学的に許容される成分が挙げられる。
本発明の増強剤は、例えば、任意の剤形で製剤化されていてよい。剤形は、本発明の増強剤の利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。製剤化は、公知の手法により行うことができる。
本発明の増強剤における本発明のコンドロイチンの濃度は、本発明の増強剤によりタンパク質の血中滞留性を増強できる限り、特に制限されない。本発明の増強剤における本発明のコンドロイチンの濃度は、本発明の増強剤の剤型、対象のタンパク質の種類、所望の血中滞留性等の諸条件に応じて適宜設定できる。本発明の増強剤における本発明のコンドロイチンの濃度は、例えば、０．００１〜１００％（ｗ／ｗ）であってよい。
本発明の増強剤は、その有効成分である本発明のコンドロイチンと血中滞留性を増強させたいタンパク質とが複合体を形成するように用いられる。本発明の増強剤は、例えば、そのまま、あるいは適宜、水、生理食塩水、または緩衝液等の薬理学的に許容される溶媒を用いて希釈、分散、又は溶解し、タンパク質の血中滞留性増強に用いてよい。このように希釈、分散、又は溶解等した場合にも、本発明の増強剤の範囲に含まれることは言うまでもない。
本発明の増強剤を適用するタンパク質は、血中滞留性の増強を所望するタンパク質であれば特に限定されない。タンパク質は、単量体タンパク質であってもよく、多量体（multimer）タンパク質であってもよい。なお、「タンパク質」には、ペプチド、オリゴペプチド、またはポリペプチドと呼ばれる態様も含む。タンパク質としては、医薬として用いられるタンパク質（例えば、アスパラギナーゼ、インターフェロン、成長ホルモンなど）を例示することができる。また、タンパク質としては、試薬や動物試験に用いられるタンパク質（例えば、オボアルブミンなど）を例示することもできる。
本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体を形成する方法は、両者が接触し、両者の複合体が形成される限り、特に制限されない。本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体を形成する方法としては、例えば、グリコサミノグリカンとタンパク質との複合体を形成する公知の方法を用いることができる。
複合体における両者の結合様式は、複合体が維持される限り特に限定されない。複合体における両者の結合様式は、形成された複合体の安定性の点から、共有結合であるのが好ましい。本発明のコンドロイチンとタンパク質とを共有結合させる方法としては、例えば、グリコサミノグリカンとタンパク質とを共有結合させる公知の方法を用いることができる。そのような方法としては、例えば、特許文献１、３、４に記載された方法を例示できる。具体的には、例えば、本発明のコンドロイチンにアルデヒド基を導入し、当該アルデヒド基とタンパク質側鎖のアミノ基とを反応させることにより、本発明のコンドロイチンとタンパク質とを共有結合させることができる。
複合体における両者の比率は、タンパク質の血中滞留性を増強できる限り、特に制限されない。複合体における両者の比率は、例えば、タンパク質に対する本発明のコンドロイチンの重量比（本発明のコンドロイチンの重量／タンパク質の重量）が、０．０１〜５００または０．０５〜２００となるような比率であってよい。
本発明の増強剤の有効成分である本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体を形成させることで、本発明のコンドロイチンとの複合体を形成していない当該タンパク質に比して、当該タンパク質の血中滞留性が増強される。
[３]本発明の複合体
本発明の複合体は、本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体である。
本発明の複合体を構成する本発明のコンドロイチンおよびタンパク質、本発明の複合体の形成方法、本発明の複合体におけるコンドロイチンおよびタンパク質の結合様式などは、「本発明の増強剤」において上述した通りである。したがって、例えば、本発明の複合体においても、本発明のコンドロイチンとタンパク質とが共有結合によって複合体を形成していることが好ましい。
本発明の複合体におけるタンパク質は、本発明のコンドロイチンと複合体を形成していない当該タンパク質に比して、血中滞留性が増強されている。
[４]本発明の組成物
本発明の組成物は、本発明の複合体を含有する、医薬組成物である。本発明の複合体については、上述した通りである。なお、本発明の組成物は医薬組成物であるので、本発明の組成物に含有される本発明の複合体の構成成分であるタンパク質としては、上述したような「医薬として用いられるタンパク質」（例えば、アスパラギナーゼ、インターフェロン、成長ホルモンなど）が好ましく例示できる。
本発明の組成物は、本発明の複合体からなるものであってもよく、その他の成分を含むものであってもよい。「その他の成分」は、本発明の組成物の利用態様に応じて許容可能なものであれば特に制限されない。「その他の成分」としては、例えば、本発明の組成物の効果を損なわず、且つ薬理学的に許容される成分が挙げられる。
本発明の組成物は、例えば、任意の剤形で製剤化されていてよい。剤形は、本発明の組成物の利用態様等の諸条件に応じて適宜選択できる。例えば、本発明の組成物を血液中への投与（例えば、血管（動脈や静脈）内への投与）や皮下投与に用いる場合には、本発明の組成物は、注射剤（例えば、溶液形態、用時溶解用の乾燥形態など）の形態で提供することができる。製剤化は、公知の手法により行うことができる。
本発明の組成物における本発明の複合体の濃度は、本発明の組成物の投与により所望の効果が達成される限り、特に制限されない。本発明の組成物における本発明の複合体の濃度は、本発明の組成物の剤型、本発明の組成物に含まれるタンパク質の種類、本発明の組成物の投与目的等の諸条件に応じて適宜設定できる。本発明の組成物における本発明の複合体の濃度は、例えば、０．００１〜１００％（ｗ／ｗ）であってよい。
本発明の組成物は、医薬組成物として、疾病の予防および治療等の医療的処置のために、対象に投与することができる。投与の対象は、疾病の予防および治療等の医療的処置が必要な動物である限り、特に限定されない。投与の対象としては、例えば、哺乳類が好ましく、なかでもヒトが好ましい。
本発明の組成物の投与方法は、本発明の組成物の剤型、本発明の組成物に含まれるタンパク質の種類、本発明の組成物の投与目的等の諸条件に応じて適宜設定できる。例えば、本発明の組成物は、本発明の組成物に含まれるタンパク質が医薬として用いられる際に通常採用される方法で投与されてよい。投与方法として、具体的には、例えば、血液中への投与（例えば、血管（動脈や静脈）内への投与）や皮下投与を例示することができるが、これに限定されるものではない。本発明の組成物は、例えば、そのまま、あるいは適宜、水、生理食塩水、または緩衝液等の薬理学的に許容される溶媒を用いて希釈、分散、又は溶解し、対象に投与してよい。このように希釈、分散、又は溶解等した場合にも、本発明の組成物の範囲に含まれることは言うまでもない。
本発明の組成物に含有される本発明の複合体におけるタンパク質は、本発明のコンドロイチンと複合体を形成していない当該タンパク質に比して、血中滞留性が増強されている。
[５]本発明の製剤
本発明の製剤は、本発明の複合体を含有する、血中滞留性が増強されたタンパク質製剤である。本発明の複合体については、上述した通りである。なお、本発明の製剤は、ヒト等の動物用の医薬製剤に加えて、試薬や動物試験用の製剤なども含む概念である。したがって、本発明の製剤に含有される本発明の複合体の構成成分であるタンパク質としては、上述したような「医薬として用いられるタンパク質」（例えば、アスパラギナーゼ、インターフェロン、成長ホルモンなど）や「試薬や動物試験に用いられるタンパク質」（例えば、オボアルブミンなど）が好ましく例示できる。
本発明の製剤については、上述した本発明の組成物に関する説明を準用できる。
本発明の製剤に含有される本発明の複合体におけるタンパク質は、本発明のコンドロイチンと複合体を形成していない当該タンパク質に比して、血中滞留性が増強されている。
[６]本発明の増強方法
本発明の増強方法は、本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体を形成させるステップを含む、タンパク質の血中滞留性の増強方法である。また、本発明の増強方法は、言い換えると、本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体を形成させるステップを含む、血中滞留性が増強されたタンパク質の製造方法である。
本発明のコンドロイチン、タンパク質、複合体の形成方法、複合体における両分子間の結合様式などは、「本発明の増強剤」において上述した通りである。したがって、例えば、本発明の増強方法においても、本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体形成は、共有結合の形成によって行われることが好ましい。
本発明の増強方法により、タンパク質の血中滞留性を、本発明のコンドロイチンと複合体を形成していない当該タンパク質に比して、増強することができる。
なお、本発明において、「血中滞留性増強」およびこれに類する語は、血中滞留性付与、血中滞留性改善、血中滞留性向上、血中持続性付与、血中持続性増強、血中持続性改善、血中持続性向上、血中におけるタンパク質の活性維持などの思想を包含する。
また、本発明には、本発明のコンドロイチンとタンパク質との複合体を形成させるステップを含む、本発明の複合体の製造方法、本発明の組成物の製造方法、本発明の製剤の製造方法も包含される。これら製造方法については、前記の本発明の増強剤、本発明の複合体、本発明の組成物、本発明の製剤についての記載を準用できる。
以下、本発明を実施例により具体的に説明する。しかしながら、実施例により本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
また、本実施例において、「分子量」とは、ゲル濾過クロマトグラフィーにより測定した重量平均分子量を意味する。
＜実施例１＞本発明の複合体、組成物、および製剤の製造
（１）微生物由来コンドロイチンの製造
微生物由来コンドロイチンは、公知の方法に基づき、以下の手順で製造した。
まず、特許文献７に記載の方法に基づき、エシェリヒア・コリＫ−１２ Ｗ３１１０株（ＡＴＣＣ ２７３２５）に、エシェリヒア・コリＫ４株由来のｋｆｏＡ、ｋｆｏＢ、ｋｆｏＣ、ｋｆｏＦ、ｋｆｏＧ遺伝子を各４コピー、エシェリヒア・コリＫ４株由来のｋｐｓＦ、ｋｐｓＥ、ｋｐｓＤ、ｋｐｓＵ、ｋｐｓＣ、ｋｐｓＳ、ｋｐｓＭ、ｋｐｓＴ遺伝子を各１コピー、及びシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）由来のｘｙｌＳ遺伝子を１コピー導入し、コンドロイチン生産能を有するエシェリヒア・コリＫ−１２ ＭＳＣ７０２株を構築した。
ＮＺアミンＨＤ １６０ｇ、Ｔａｓｔｏｎｅ １５４ ４ｇ、ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ８ｇ、Ｎａ2ＳＯ4 ２４ｇ、クエン酸ナトリウム ２．４ｇ、ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ ２９６ｍｇ、Ｄｏｗ １５２０ＵＳ消泡剤０．８ｍＬを脱イオン水に溶解して６Ｌに調製し、オートクレーブ後にグリセリン ４８ｇ、ＫＨ2ＰＯ4 ４８ｇ、チアミンＨＣｌ ３２０μｇ、微量金属溶液（２７ｇ／Ｌ ＦｅＣｌ3・６Ｈ2Ｏ、１．３ｇ／Ｌ ＺｎＣｌ2、２ｇ／Ｌ ＣｏＣｌ2・６Ｈ2Ｏ、２ｇ／Ｌ Ｎａ2ＭｏＯ4・６Ｈ2Ｏ、２．５ｇ／Ｌ ＣａＣｌ2・２Ｈ2Ｏ、３．３ｇ／Ｌ ＭｎＣｌ2・４Ｈ2Ｏ、０．５ｇ／Ｌ Ｈ3ＢＯ3、３３ｇ／Ｌ クエン酸、を含有する）２４ｍＬを各々無菌的に添加して培地とした。
この培地に、ＭＳＣ７０２株の前培養液（ＯＤ６００＝９．０）５０ｍＬを接種して培養した。培養開始４時間後に、終濃度２ｍＭとなるようにｍ−トルイル酸を添加し、さらに８２時間培養した。培養中、炭素源としてグリセリンを、培養液中のグリセリン濃度が１ｇ／Ｌ未満で維持されるように添加した。また、培養中、窒素源として水酸化アンモニウム（アンモニア水）を、培養液中のアンモニア濃度が１００ｍｇ／Ｌ未満で維持されるように添加した。その他の主な培養条件は次のとおりである。
温度：２９．８〜３０．２℃、ｐＨ：７．１〜７．３、撹拌：１５０〜４８０ｃｐｓ、溶存酸素：５０％、気流：３．４〜６．４Ｌ／分、酸素流：０〜３．１Ｌ／分。
培養終了後の総液量は８．４Ｌ、ＯＤ６００は６９であった。培養液をオートクレーブ処理して遠心分離し、上清を回収した。この培養上清中のコンドロイチンの濃度は、８．３ｇ／Ｌであった。
この培養上清１Ｌ（コンドロイチン含量８．３ｇ）に１Ｌの脱イオン水を添加して遠心分離し、上清を得た。この上清に４倍容のエタノールを添加し、沈殿した粗コンドロイチン画分を回収した。回収した粗コンドロイチン画分を２５０ｍＬの脱イオン水に溶解して遠心分離し、上清を回収した。この上清を、電気伝導率が５ｍＳ／ｃｍ以下になるまで脱イオン水で希釈した。
この希釈溶液を、脱イオン水で平衡化したＤＥＡＥセファロース（ＧＥヘルスケア）カラム（５００ｍＬ）に通した。このカラムを１Ｌの脱イオン水、次いで１Ｌの１００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液で洗浄した後、２．５Ｌの３００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液でコンドロイチンを溶出した。溶出液を分画し、各画分中のコンドロイチン含量をカルバゾール−硫酸法（BITTER T, MUIR HM., Anal Biochem. 1962 Oct; 4: 330-4.）で定量した。コンドロイチンを含有する画分を合わせて（１．６Ｌ）、減圧下で２００ｍＬに濃縮した。この濃縮液に４倍容のエタノールを添加し、コンドロイチンを沈殿として回収した。
この沈殿を２００ｍＬのアルカリ水溶液（ｐＨ１０以上）に溶解し、液温を４０℃とした。これにアルカリプロテアーゼ（エスペラーゼ（登録商標）、ノボザイム）を５ｇ添加し、４０℃で一晩酵素反応させた。反応後の溶液を中和した後、４倍容のエタノールを添加して、コンドロイチンを沈殿として回収した。この沈殿を電気伝導率が５ｍＳ／ｃｍ以下になるように脱イオン水で溶解し、ＤＥＡＥセファロース（ＧＥヘルスケア）カラム（５００ｍＬ）に通した。このカラムを１Ｌの１００ｍＭ塩化ナトリウム水溶液で洗浄し、次いで１００ｍＭから５００ｍＭの塩化ナトリウム水溶液のグラジエント勾配でコンドロイチンを溶出した。
溶出液を分画し、各画分中のコンドロイチン含量をカルバゾール−硫酸法で定量して、コンドロイチンを含有する画分（１７０ｍＭ塩化ナトリウム濃度付近の溶出画分）を回収した。この画分を減圧下で濃縮し、２倍容のエタノールを添加して、コンドロイチンの精製品を沈殿として得た。このコンドロイチンの精製品を脱イオン水に溶解し、ｐＨ７となるよう中和した後、凍結乾燥させた。凍結乾燥後のコンドロイチン（精製品）の重量は４．２ｇであった。
後の実施例で、一般に汎用されているコンドロイチン（コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られたコンドロイチン）や各種グリコサミノグリカンとなるべく分子量を揃えて試験するため、上記で得られた微生物由来コンドロイチン（精製品）の分子量を以下のとおり調整した。
上記で得られた微生物由来コンドロイチン（精製品）を、終濃度１ｇ／Ｌとなるように蒸留水に溶解した。この溶液に終濃度０．５Ｍとなるように塩酸を添加して６０℃で維持し、反応開始３０分後に中和して反応を停止させた。この反応物を分画分子量（ＭＷＣＯ）１Ｋの透析膜を用いて１０Ｌの脱イオン水に対して透析し、凍結乾燥させた。この操作を２回繰り返し、分子量４８×１０3、４６×１０3の各々の微生物由来コンドロイチン（凍結乾燥品）を得た。
また、同様の操作で反応開始４．５時間後、５時間後に各々反応を停止させ、同様に透析し、凍結乾燥させることによって、分子量７×１０3、５×１０3の各々の微生物由来コンドロイチン（凍結乾燥品）を得た。
以下、これらの微生物由来コンドロイチンを総称して「ｒＣＨ」ともいう。また、分子量４８×１０3のｒＣＨを「ｒＣＨ４８」、分子量４６×１０3のｒＣＨを「ｒＣＨ４６」、分子量７×１０3のｒＣＨを「ｒＣＨ７」、分子量５×１０3のｒＣＨを「ｒＣＨ５」とそれぞれ略記する。
（２）タンパク質の入手
タンパク質は、以下の市販のものを用いた。
・Ｌ−アスパラギナーゼ（以下「Ａｓｐ」。）（協和発酵キリン、製品名「ロイナーゼ」（登録商標））
・インターフェロンα２ｂ（以下「ＩＦＮ」。）（ＰＲＯＳＰＥＣ）
・オボアルブミン（以下「ＯＶＡ」。）（シグマアルドリッチ）
・成長ホルモン（以下「ＧＨ」。）（サンド、製品名「ソマトロピンＢＳ皮下注」）
（３）微生物由来コンドロイチンとタンパク質（Ａｓｐ、ＩＦＮ、ＯＶＡ）との複合体の製造（共有結合形成）
まず、タンパク質のアミノ基と反応させるため、次の方法で微生物由来コンドロイチンにアルデヒド基を導入した。
微生物由来コンドロイチンを濃度５０ｍｇ／ｍＬとなるよう水に溶解し、これに１／２容量の２ｍｇ／ｍＬ 水素化ホウ素ナトリウム水溶液を添加して、室温で一晩反応させた。その後、３％（ｗ／ｖ）となる量の酢酸ナトリウムを添加し、次いで２倍容のエタノールを添加して沈殿を得た。この沈殿を５ｍＬのリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、５モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムを添加して４℃で１時間反応させた。この反応物に１／３０容量のエチレングリコールを添加して再び４℃で１時間反応させた後、３％（ｗ／ｖ）となる量の酢酸ナトリウムを添加し、次いで２倍容のエタノールを添加して沈殿を得た。この沈殿を水に溶解して透析し、凍結乾燥させて、アルデヒド基が導入された微生物由来コンドロイチン（凍結乾燥品）を得た。
次に、このアルデヒド基が導入された微生物由来コンドロイチンを、還元剤としてトリメチルアミンボランを用いてタンパク質と共有結合させた。
すなわち、タンパク質１ｍｇとアルデヒド基が導入された微生物由来コンドロイチン１５ｍｇを、１ｍＬの０．２Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ９）に溶解した。この溶液に１ｍｇのトリメチルアミンボランを添加して、室温で２４時間反応させた。その後、反応物に１ｍｇのトリメチルアミンボランを添加して室温で２４時間反応させる操作を３回繰り返した。反応後の溶液中の未反応物を疎水カラムクロマトグラフィーで除去し、溶出液を回収して限外ろ過により脱塩および濃縮して、微生物由来コンドロイチンとタンパク質との複合体を含有する画分を得た。
以下、このようにして製造された、ｒＣＨとＡｓｐとの複合体を「ｒＣＨ−Ａｓｐ」、ｒＣＨとＩＦＮとの複合体を「ｒＣＨ−ＩＦＮ」、ｒＣＨとＯＶＡとの複合体を「ｒＣＨ−ＯＶＡ」とそれぞれ略記する。
（４）微生物由来コンドロイチンとタンパク質（ＧＨ）との複合体の製造（共有結合形成）
タンパク質のアミノ基との共有結合を形成させるため、まず以下の方法で微生物由来コンドロイチンにアルデヒド基を導入した。
微生物由来コンドロイチンを２０ｍｇ／ｍＬとなるようリン酸塩緩衝液（ｐＨ７）に溶解し、これに２モル当量の過ヨウ素酸ナトリウムを混合して４℃で２４時間反応させた。この反応物に２モル当量のｃｉｓ１，２−シクロヘキサンジオールを混合してさらに４℃で１時間反応させた後、水に対して透析し、凍結乾燥させて、アルデヒド基が導入された微生物由来コンドロイチンを得た。
次に、このアルデヒド基が導入された微生物由来コンドロイチンとタンパク質を、還元剤としてナトリウムシアノボロハイドライドを用い、還元的アミノ化法により共有結合させた。
すなわち、タンパク質０．５ｍｇとアルデヒド基が導入された微生物由来コンドロイチン１８．０ｍｇを、０．２％プルロニックＦ６８を含有する０．１Ｍビシン（N,N-Bis(2-hydroxyethyl)glycine）緩衝液（ｐＨ９）１ｍＬに溶解し、この溶液に２．８ｍｇのナトリウムシアノボロハイドライドを混合して、室温で２４時間反応させた。反応後の溶液中の未反応物を疎水カラムクロマトグラフィーで除去し、溶出液を回収して限外ろ過により脱塩および濃縮して、微生物由来コンドロイチンとタンパク質との複合体を含有する画分を得た。
以下、このようにして製造されたｒＣＨとＧＨとの複合体を「ｒＣＨ−ＧＨ」と略記する。
（５）医薬組成物および製剤の製造
上記（３）で製造した、ｒＣＨ−Ａｓｐ、ｒＣＨ−ＩＦＮ、ｒＣＨ−ＯＶＡ、および上記（４）で製造したｒＣＨ−ＧＨを、各々生理食塩水で所望の濃度に希釈して医薬組成物とした。さらに、これらの医薬組成物をそれぞれ注射用シリンジに充填して、血管内投与用または皮下投与用の製剤とし、後述の実施例２に用いた。
＜参考例＞比較対象物の製造
（１）各種グリコサミノグリカン
ｒＣＨの比較対象として、以下のヒアルロン酸（生化学工業株式会社製、またはＬｉｆｅｃｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製）、各種硫酸化グリコサミノグリカン（いずれも生化学工業株式会社製）、およびヘパロサンを用いた。これらは、前記実施例１の（１）に記載した方法で分子量を調整したものである。
・コンドロイチン硫酸Ａ（以下「ＣＳＡ」。クジラ軟骨由来。分子量６×１０3）
・コンドロイチン硫酸Ｃ（以下「ＣＳＣ」。サメ軟骨由来。分子量６×１０3および３８×１０3）
・コンドロイチン硫酸Ｅ（以下「ＣＳＥ」。イカ軟骨由来。分子量９×１０3）
・デルマタン硫酸（以下「ＤＳ」。鶏冠由来。分子量５×１０3）
・ヒアルロン酸（以下「ＨＡ」。鶏冠由来。分子量５×１０3および４７×１０3。生化学工業株式会社製）
・ヒアルロン酸（以下「ＨＡ」。微生物由来。分子量６６×１０3。Ｌｉｆｅｃｏｒｅ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ社製）
・ヘパロサン（以下「ＨＰＮ」。エシェリヒア・コリＫ５株由来。分子量５×１０3および３６×１０3）
・ヘパリン（以下「ＨＰ」。ブタ腸由来。分子量９×１０3）
・ヘパラン硫酸（以下「ＨＳ」。ブタ腎臓由来。分子量１４×１０3）
以下、ｒＣＨと同様に、各種グリコサミノグリカンについても、例えば、分子量６×１０3のＣＳＣを「ＣＳＣ６」、分子量３８×１０3のＣＳＣを「ＣＳＣ３８」、分子量３６×１０3のＨＰＮを「ＨＰＮ３６」という要領で略記する。
（２）ヘパロサン（ＨＰＮ）の製造
ＨＰＮは、公知の文献（特開２００４−０１８８４０号公報）に記載の方法に従って大腸菌Ｋ５株（Serotype O10:K5(L):H4, ATCC 23506）を培養し、培養上清を精製して製造した。
（３）一般に用いられているコンドロイチンの製造
コンドロイチンの工業的生産法として一般的な以下の方法により、一般に汎用されているコンドロイチン（コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチン）を製造した。
コンドロイチン硫酸の脱硫酸化は、J. Am. Chem. Soc., 1957, 79 (1), pp 152-153に記載の方法に準じて行った。
メタノール９３ｍＬに塩化アセチル７ｍＬを滴下して、メタノール塩酸溶液を調製した。これにＣＳＣ（サメ軟骨由来。分子量は未調整。生化学工業株式会社製）１０ｇを添加した。これを室温で２０時間撹拌した後、３０ｍＬを分取し、遠心分離して沈殿を回収した。
回収した沈殿を３０ｍＬの蒸留水に溶解し、ｐＨを中性付近に調整した。この溶液をＭＷＣＯ１２０００〜１４０００の透析膜を用いて流水下で一晩透析した後、凍結乾燥させた。
この凍結乾燥物の１ｇを、５０ｍＬの０．１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液に溶解させ、室温で一晩撹拌した。その後中和し、ＭＷＣＯ１２０００〜１４０００の透析膜を用いて流水下で一晩透析した。この透析後の溶液を凍結乾燥して、一般に汎用されているコンドロイチン（凍結乾燥品）を得た。このコンドロイチンの分子量は７×１０3であった。
以下、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得たコンドロイチンを「ｄＣＨ」ともいう。また、分子量７×１０3のｄＣＨを「ｄＣＨ７」と略記する。
（４）各種グリコサミノグリカンやｄＣＨとタンパク質との複合体の製造
実施例１の（３）と同じ方法で、上記の各種グリコサミノグリカンやｄＣＨと、Ａｓｐ、ＩＦＮ、又はＯＶＡとの複合体を製造した。
以下、ｒＣＨの場合と同様に、各種グリコサミノグリカンについても、例えば、ＣＳＡとＡｓｐとの複合体は「ＣＳＡ−Ａｓｐ」、ｄＣＨとＯＶＡとの複合体は「ｄＣＨ−ＯＶＡ」という要領で略記する。
これらの複合体は、実施例１の（５）と同じ方法で製剤化し、後述の実施例２に用いた。
＜実施例２＞グリコサミノグリカンとタンパク質との複合体の血中滞留性の測定
（１）試験方法１（Ａｓｐ）
タンパク質として「Ａｓｐ」を含有する被験物質（Ａｓｐを含有する各種複合体や、Ａｓｐ自体）を使用する場合には、以下のとおり試験を行った。
被験物質を１ｍｇタンパク質／ｋｇ体重の用量で雄のＩＣＲマウス（１群につき３匹）に尾静脈注射した。
投与後８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１２０時間の各時点で上記マウスから採血し、遠心分離して血漿を得た。
Ａｓｐの血中滞留性は、血漿中のＡｓｐ活性を指標として測定した。血漿中のＡｓｐ活性は、Ａｓｐがアスパラギンをアスパラギン酸に変換する際に発生するアンモニア量を指標として算出した。具体的には、２００μＬの２．５５ｍｇ／ｍＬアスパラギンを含有する０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８）に、１０〜４０倍希釈した血漿を１０μＬ添加し、３７℃で３０分間インキュベートした。その後、反応物に１０μＬのトリクロロ酢酸を添加して遠心し、上清１０μＬにネスラー試薬を混合して、上清中に含まれるアンモニアと反応させた。その後４５０ｎｍの吸光度をウェルリーダーＳＫ６０３（生化学工業株式会社）で測定した。
（２）試験方法２（ＩＦＮ）
タンパク質として「ＩＦＮ」を含有する被験物質（ＩＦＮを含有する各種複合体や、ＩＦＮ自体）を使用する場合には、以下のとおり試験を行った。
被験物質を０．２ｍｇタンパク質／ｋｇ体重の用量で雄のＩＣＲマウス（１群につき３匹）に皮下注射した。
投与後２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の各時点で上記マウスから採血し、遠心分離して血漿を得た。
ＩＦＮの血中滞留性は、血漿中のＩＦＮ活性を指標として測定した。血漿中のＩＦＮ活性は、ｉＬｉｔｅ ａｌｐｈａｂｅｔａキット（Ｂｉｏｍｏｎｉｔｏｒ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）を用い、その説明書に記載の方法でルシフェラーゼ活性による発光を指標として測定した。発光強度は、マルチラベルリーダー２０３０ ＡＲＶＯ（パーキンエルマー社）で測定した。
（３）試験方法３（ＯＶＡ）
タンパク質として「ＯＶＡ」を含有する被験物質（ＯＶＡを含有する各種複合体や、ＯＶＡ自体）を使用する場合には、以下のとおり試験を行った。
被験物質を０．８ｍｇタンパク質／ｋｇ体重の用量で雄のＩＣＲマウス（１群につき３匹）に尾静脈注射した。
投与後２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の各時点で上記マウスから採血し、遠心分離して血漿を得た。
ＯＶＡの血中滞留性は、血漿中のＯＶＡ濃度を指標として測定した。血漿中のＯＶＡ濃度は、ＩＴＥＡ ＯＶＡ ＥＬＩＳＡキット（ＩＴＥＡ株式会社）を用い、その説明書に記載の方法で測定した。標準曲線の作成には、ＯＶＡ自体を投与した個体の血漿についてはＯＶＡ自体を、ＯＶＡを含有する複合体を投与した個体の血漿については当該複合体を、それぞれスタンダードとして用いた。吸光度は、ウェルリーダーＳＫ６０３（生化学工業株式会社）で測定した。
（４）試験方法４（ＧＨ）
タンパク質として「ＧＨ」を含有する被験物質（ＧＨを含有する複合体や、ＧＨ自体）を使用する場合には、以下のとおり試験を行った。
被験物質を０．１ｍｇタンパク質／ｋｇ体重の用量でＩＣＲ系雄性マウス（１群につき３匹）に尾静脈注射した。
ＧＨ自体を投与した場合は、投与後０．５時間、２時間、４時間、８時間の各時点で、また、ＧＨとグリコサミノグリカンとの複合体を投与した場合は、投与後８時間、２４時間、４８時間、７２時間の各時点でマウスから採血し、遠心分離して血漿を得た。
ＧＨの血中滞留性は、血漿中のＧＨ濃度を指標として測定した。血漿中のＧＨ濃度は、ｈＧＨ ＥＬＩＳＡキット（ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社）を用い、その説明書に記載の方法で測定した。標準曲線の作成には、ＧＨ自体を投与した個体の血漿についてはＧＨ自体を、ＧＨを含有する複合体を投与した個体の血漿については当該複合体を、それぞれスタンダードとして用いた。吸光度は、ウェルリーダーＳＫ６０３（生化学工業株式会社）で測定した。
（５）半減期の算出
上記によって得られた血中のＡｓｐ活性、ＩＦＮ活性、ＯＶＡ濃度、ＧＨ濃度それぞれの推移データに基づき、Ｐｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（サターラ合同会社）を用いて、各個体の最終測定時点から３時点のデータを用いてモデル非依存的解析を行い、血中半減期（ｔ１／２）を算出した。以下、血中半減期（ｔ１／２）は、平均±標準誤差（ＳＥ）で表示する。
（６）ｒＣＨを用いた試験１（各種グリコサミノグリカンとの比較）
被験物質として「ｒＣＨ７−Ａｓｐ」と、「各種グリコサミノグリカンとＡｓｐとの複合体」を用い、前記（１）に示した試験方法で血中滞留性を試験した。
ここでは、糖鎖部分の分子量をｒＣＨ（７×１０3）となるべく揃えるため、「各種グリコサミノグリカンとＡｓｐとの複合体」として以下のものを用いた：
ＣＳＡ６−Ａｓｐ、ＣＳＣ６−Ａｓｐ、ＣＳＥ９−Ａｓｐ、ＤＳ５−Ａｓｐ、ＨＡ５−Ａｓｐ、ＨＰＮ５−Ａｓｐ、ＨＰ９−Ａｓｐ、ＨＳ１４−Ａｓｐ。
また、対照物質として非修飾の「Ａｓｐ」を用いた。結果を図１に示す。
図１から、ｒＣＨを用いてタンパク質と複合体を形成させると、他のいずれのグリコサミノグリカンを用いて複合体を形成させた場合よりも、顕著に当該タンパク質の血中滞留性が高まることが示された。
また、このことは、次に示す「ｒＣＨ７−Ａｓｐ」と、次に良好であった「ＨＰＮ５−Ａｓｐ」との血中半減期（ｔ１／２）の差からも示される。
ｒＣＨ７−Ａｓｐ：３５．２１±３．１４時間
ＨＰＮ５−Ａｓｐ： ９．００±０．４６時間
（７）ｒＣＨを用いた試験２（各種グリコサミノグリカンとの比較）
被験物質として「ｒＣＨ４６−ＩＦＮ」と、「各種グリコサミノグリカンとＩＦＮとの複合体」を用い、前記（２）に示した試験方法で血中滞留性を試験した。
ここでは、糖鎖部分の分子量をｒＣＨ（４６×１０3）となるべく揃えるため、「各種グリコサミノグリカンとＩＦＮとの複合体」として以下のものを用いた：
ＣＳＣ３８−ＩＦＮ、ＨＡ４７−ＩＦＮ、ＨＰＮ３６−ＩＦＮ。
また、対照物質として非修飾の「ＩＦＮ」を用いた。結果を図２に示す。
図２からも、ｒＣＨを用いてタンパク質と複合体を形成させると、他のいずれのグリコサミノグリカンを用いて複合体を形成させた場合よりも、顕著に当該タンパク質の血中滞留性が高まることが確認された。
また、このことは、次に示す「ｒＣＨ４６−ＩＦＮ」と、他の複合体との血中半減期（ｔ１／２）の差からも示される。
ｒＣＨ４６−ＩＦＮ：１８．２２±２．５６時間
ＣＳＣ３８−ＩＦＮ： １．２８±０．１０時間
ＨＡ４７−ＩＦＮ ： １．１８±０．０４時間
（８）ｒＣＨを用いた試験３（ｄＣＨとの比較）
被験物質として「ｒＣＨ５−Ａｓｐ」と「ｄＣＨ７−Ａｓｐ」を用い、前記（１）に示した試験方法で血中滞留性を試験した。結果を図３に示す。
図３から、ｒＣＨとｄＣＨはいずれも一般的にはコンドロイチンと呼ばれるものであるものの、タンパク質と複合体を形成させた場合における当該タンパク質の血中滞留性の点では、驚くべきことに、ｄＣＨを用いた場合と比較して、ｒＣＨを用いた方が格段に高い血中滞留性を発揮させることができることを見出した。
（９）ｒＣＨを用いた試験４（各種グリコサミノグリカンおよびｄＣＨとの比較）
被験物質として「ｒＣＨ５−ＯＶＡ」、「ｄＣＨ７−ＯＶＡ」、および「各種グリコサミノグリカンとＯＶＡとの複合体」を用い、前記（３）に示した試験方法で血中滞留性を試験した。
ここでは、糖鎖部分の分子量をｒＣＨ（５×１０3）となるべく揃えるため、「各種グリコサミノグリカンとＯＶＡとの複合体」として以下のものを用いた：
ＣＳＣ６−ＯＶＡ、ＨＡ５−ＯＶＡ。
また、対照物質として非修飾の「ＯＶＡ」を用いた。結果を図４に示す。
図４からも、ｒＣＨを用いてタンパク質と複合体を形成させると、他のいずれのグリコサミノグリカンを用いて複合体を形成させた場合よりも、顕著に当該タンパク質の血中滞留性が高まることが確認された。また、タンパク質と複合体を形成させた場合における当該タンパク質の血中滞留性の点で、ｄＣＨを用いた場合と比較して、ｒＣＨを用いた方が格段に高い血中滞留性を発揮させることができることも改めて確認された。
また、このことは、次に示す「ｒＣＨ５−ＯＶＡ」と、他の複合体との血中半減期（ｔ１／２）の差からも示される。
ｒＣＨ５−ＯＶＡ：２４．３４±２．０２時間
ｄＣＨ７−ＯＶＡ： ３．６１±０．１０時間
ＣＳＣ６−ＯＶＡ： ２．６０±０．０５時間
ＨＡ５−ＯＶＡ ： ２．６４±０．０５時間
（１０）ｒＣＨを用いた試験５
被験物質として「ｒＣＨ７−ＧＨ」を用い、前記（４）に示した方法で血中滞留性を測定した。
ここでは、対象物質として非修飾の「ＧＨ」を用いた。結果を図５に示す。
図５からも、ｒＣＨを用いてタンパク質と複合体を形成させると、顕著に当該タンパク質の血中滞留性が増強されることが確認された。
また、このことは、次に示す「ｒＣＨ７−ＧＨ」と、非修飾のＧＨとの血中半減期（ｔ１／２）の差からも示される。
ｒＣＨ７−ＧＨ： ９．９０±１．３７時間
非修飾のＧＨ ： １．２７±０．１０時間
＜実施例３＞グリコサミノグリカンの血中滞留性の測定
（１）脱フルクトシル化Ｋ４多糖の製造
脱フルクトシル化Ｋ４多糖は、特許文献５に記載の方法に従って大腸菌Ｋ４株（Serotype O5:K4(L):H4）を培養し、培養上清を精製してＫ４多糖（フルクトシル化コンドロイチン）を製造した後、公知の文献（Lidholt K, Fjelstad M., J Biol Chem. 1997 Jan 31; 272(5): 2682-7.）に準じた以下の方法によって、Ｋ４多糖からフルクトース残基を酸加水分解反応により除去（脱フルクトシル化）して製造した。
３１３．９ｍｇのＫ４多糖を３０ｍＬの蒸留水に溶解し、塩酸を混合してｐＨ１．５に調整した後、８０℃で３０分間インキュベートして、酸加水分解反応によりフルクトース残基を除去した。この溶液を中和した後、水に対して透析し、凍結乾燥させて、１９６．１ｍｇの脱フルクトシル化Ｋ４多糖を得た。この脱フルクトシル化Ｋ４多糖の分子量は３８×１０3であった。
以下、脱フルクトシル化Ｋ４多糖を「ｄｆＣＨ」ともいう。また、分子量３８×１０3のｄｆＣＨを「ｄｆＣＨ３８」と略記する。
（２）グリコサミノグリカンの血中滞留性の測定
被験物質として「ｒＣＨ４８」、「ｄｆＣＨ３８」、および「各種グリコサミノグリカン」を用い、以下の方法で血中滞留性を測定した。
ここでは、グリコサミノグリカンの分子量をｒＣＨ４８（４８×１０3）とできる限り揃えるため、「各種グリコサミノグリカン」として以下の被験物質を用いた：
ＣＳＣ３８、ＨＡ６６。
グリコサミノグリカンを１０ｍｇ／ｋｇの用量でＩＣＲ系雄性マウス（１群１時点につき３匹）に尾静脈注射した。
ｒＣＨまたはｄｆＣＨを投与した場合は、投与後４時間、８時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間の各時点で、ＣＳＣを投与した場合は、投与後０．２５時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間の各時点で、また、ＨＡを投与した場合は、投与後１時間、６時間、１４時間、２４時間、４８時間、７２時間の各時点でマウスから心臓採血し、遠心分離して血漿を得た。
グリコサミノグリカンの血漿中濃度は、ＨＰＬＣポストカラム誘導体化法によって以下のとおり測定した。
血漿５０μＬに、０．１Ｍトリス緩衝液（ｐＨ８．０）４０μＬ、酵素溶液（５Ｕ／ｍＬ コンドロイチナーゼＡＢＣ、０．５Ｕ／ｍＬ コンドロイチナーゼＡＣII、０．１％ＢＳＡを含有する）２５μＬ、蒸留水を混合して全量を２００μＬとし、３７℃で２時間インキュベートした。その後、反応液を分画分子量（ＭＷＣＯ）１０Ｋのスピンカラムを用いて限外ろ過し、ろ液を回収した。ろ液５０μＬを陰イオン交換カラムに通し、溶出された糖をポストカラム誘導体化法により検出して、グリコサミノグリカンの血漿中濃度を測定した。
イオン交換カラムはＹＭＣ−Ｐａｃｋ ＰＡ−Ｇ（内径：４．６ｍｍ×長さ：１５０ｍｍ）（ＹＭＣ社製）を用い、カラム温度は室温とした。移動相として溶媒Ａ（５％エタノール）と溶媒Ｂ（２００ｍＭ硫酸ナトリウム／５％エタノール）を用い、溶離は分析開始後から３０分後までの間に溶媒Ｂの割合を０％から１００％にするリニアグラジエントによって行った。流速は０．４ｍＬ／ｍｉｎとした。
カラムの溶出液と０．２２５ｍＬ／ｍｉｎで送液した誘導体化試薬（１％ ２−シアノアセトアミド、５０ｍＭ四ホウ酸ナトリウム（ｐＨ９．０）を含有する）を三方ジョイントに通して混合させた後、反応コイル（内径：０．５ｍｍ×長さ：１０ｍ）、蛍光検出器の順に通液させた。反応コイルは１４５℃に加温した状態で使用した。蛍光検出器は、励起波長を３４６ｎｍに、蛍光波長を４１０ｎｍに設定して使用した。また、反応コイルと蛍光検出器は、背圧コイルを介して接続した。
上記によって得られたグリコサミノグリカンの血漿中濃度の推移データに基づき、最終測定時点から３時点の平均値のデータを用いてＰｈｏｅｎｉｘ ＷｉｎＮｏｎｌｉｎによるモデル非依存的解析を行い、血中半減期（ｔ１／２）を算出した。
ｒＣＨとｄｆＣＨの血漿中濃度の推移を図６に示す。図６から、微生物由来コンドロイチンであるｒＣＨとｄｆＣＨは、共に顕著に長い血中滞留性を有することが示された。また、ｒＣＨとｄｆＣＨは血漿中濃度の経時変化が同等であったことから、両者は血中滞留性において同質のコンドロイチンであることが示された。
また、以下に示す「ｒＣＨ」、「ｄｆＣＨ」と、「他のグリコサミノグリカン」との血中半減期（ｔ１／２）の差から、ｒＣＨとｄｆＣＨが他のグリコサミノグリカンと比較して顕著に長い血中滞留性を有することが示された。
ｒＣＨ４８ ：３２．２時間
ｄｆＣＨ３８：３８．０時間
ＣＳＣ３８ ： ０．９時間
ＨＡ６６ ： ２．２時間
実施例２の（６）〜（１０）に示した通り、微生物由来コンドロイチンはタンパク質との複合体を形成した際に、顕著に長い血中滞留性を発揮することができる。ｒＣＨとｄｆＣＨ自体が顕著に長い血中滞留性を有することから、このような微生物由来コンドロイチンがタンパク質の血中滞留性を増強する効果は、微生物由来コンドロイチンそのものの性質によるものである、すなわち、タンパク質との複合体を形成した際に、この性質がタンパク質に付与されることによる効果である、と考えられる。よって、微生物由来コンドロイチンは、特定のタンパク質に限られず、任意のタンパク質に対する血中滞留性増強剤として適用することが可能である。また、例えば、ｒＣＨとｄｆＣＨは糖鎖そのものの血中滞留性において同質であることから、両者はタンパク質の血中滞留性を増強する効果等においても同質のコンドロイチンであると考えられる。よって、特定の微生物由来コンドロイチンに限られず、任意の微生物由来コンドロイチンを、タンパク質に対する血中滞留性増強剤として適用することが可能である。
本発明によれば、タンパク質の血中滞留性を顕著に増強させることができる。よって、本発明によれば、例えば、タンパク質を有効成分とする医薬や製剤の効果を長期間にわたり維持することができる。したがって、本発明は、臨床上および／または研究上、極めて有用である。
日本国特許出願第２０１３−２０４０５３号（出願日：２０１３年９月３０日）の開示は、その全体が参照により本明細書に取り込まれる。本明細書に記載された全ての文献、特許出願、及び技術規格は、個々の文献、特許出願、及び技術規格が参照により取り込まれることが具体的かつ個々に記された場合と同程度に、本明細書に参照により取り込まれる。

Claims (13)

  1. コンドロイチン（ただし、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンを除く）を有効成分として含有するタンパク質の血中滞留性増強剤であって、
    前記コンドロイチンは、コンドロイチン生産能を有する細菌によって生産されたコンドロイチンおよび細菌由来コンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンからなる群から選択され、
    前記コンドロイチンと前記タンパク質との複合体が、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンと前記タンパク質との複合体に比して長い血中滞留性を有する、血中滞留性増強剤。
  2. 前記細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、請求項１に記載の血中滞留性増強剤。
  3. 前記コンドロイチンの重量平均分子量が３×１０ ３ 〜１×１０ ６ である、請求項１又は２に記載の血中滞留性増強剤。
  4. コンドロイチン（ただし、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンを除く）とタンパク質との複合体であって、
    前記コンドロイチンは、コンドロイチン生産能を有する細菌によって生産されたコンドロイチンおよび細菌由来コンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンからなる群から選択され、
    コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンと前記タンパク質との複合体に比して長い血中滞留性を有する、複合体。
  5. 前記細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、請求項４に記載の複合体。
  6. 前記コンドロイチンの重量平均分子量が３×１０ ３ 〜１×１０ ６ である、請求項４又は５に記載の複合体。
  7. 請求項４から６のいずれか１項に記載の複合体を含有する、医薬組成物。
  8. コンドロイチン（ただし、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンを除く）とタンパク質との複合体を形成させるステップを含む、タンパク質の血中滞留性増強方法であって、
    前記コンドロイチンは、コンドロイチン生産能を有する細菌によって生産されたコンドロイチンおよび細菌由来コンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンからなる群から選択され、
    前記複合体が、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンと前記タンパク質との複合体に比して長い血中滞留性を有する、血中滞留性増強方法。
  9. 前記細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、請求項８に記載の血中滞留性増強方法。
  10. 前記コンドロイチンの重量平均分子量が３×１０ ３ 〜１×１０ ６ である、請求項８又は９に記載の血中滞留性増強方法。
  11. コンドロイチン（ただし、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンを除く）とタンパク質との複合体を形成させるステップを含む、血中滞留性が増強されたタンパク質の製造方法であって、
    前記コンドロイチンは、コンドロイチン生産能を有する細菌によって生産されたコンドロイチンおよび細菌由来コンドロイチン合成酵素によって合成されたコンドロイチンからなる群から選択され、
    前記複合体が、コンドロイチン硫酸を脱硫酸化して得られるコンドロイチンと前記タンパク質との複合体に比して長い血中滞留性を有する、製造方法。
  12. 前記細菌が、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）である、請求項１１に記載の製造方法。
  13. 前記コンドロイチンの重量平均分子量が３×１０ ３ 〜１×１０ ６ である、請求項１１又は１２に記載の製造方法。
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