JP6480093B2 - 体細胞製造システム - Google Patents

Description

本発明は体細胞誘導技術に関し、特に体細胞製造システムに関する。

胚性幹細胞（ＥＳ細胞）は、ヒトやマウスの初期胚から樹立された幹細胞である。ＥＳ細胞は、生体に存在する全ての細胞へと分化できる多能性を有する。現在、ヒトＥＳ細胞は、パーキンソン病、若年性糖尿病、及び白血病等、多くの疾患に対する細胞移植療法に利用可能である。しかし、ＥＳ細胞の移植には障害もある。特に、ＥＳ細胞の移植は、不成功な臓器移植に続いて起こる拒絶反応と同様の免疫拒絶反応を惹起しうる。また、ヒト胚を破壊して樹立されるＥＳ細胞の利用に対しては、倫理的見地から批判や反対意見が多い。

このような背景の状況の下、京都大学の山中伸弥教授は、４種の遺伝子：Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、ｃ−Ｍｙｃ、及びＳｏｘ２を体細胞に導入することにより、誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）を樹立することに成功した。これにより、山中教授は、２０１２年のノーベル生理学・医学賞を受賞した（例えば、特許文献１参照。）。ｉＰＳ細胞は、拒絶反応や倫理的問題のない理想的な多能性細胞である。したがって、ｉＰＳ細胞は、細胞移植療法への利用が期待されている。また、近年、特定の遺伝子を細胞へ導入することで、特定の細胞から、別の細胞を作製できる技術も確立されている。このような技術は、ｉＰＳ細胞と同様、移植医療やドラッグスクリーニングに活用できると期待されている。

従来、ｉＰＳ細胞を体細胞に変化させる方法は数多くある。しかし、ｉＰＳ細胞を移植治療に利用するためには、ｉＰＳ細胞の効率の良い分化誘導方法を確立することが重要である。具体的には、ｉＰＳ細胞を体細胞へと分化誘導するときに用いる技術を確立し、分化誘導の効率及び精度を向上させ、作製した体細胞の機能性などが移植治療に耐えうるものである必要がある。

ｉＰＳ細胞や胚性幹細胞（ＥＳ細胞）から体細胞へ分化誘導する方法は、細胞の性質を決定するホルモンや成長因子、並びに低分子化合物を組み合わせ、それらの量比や濃度を経時的に変える事で、発生の過程を模倣したような形で行なわれてきている。しかし、発生の過程を試験管内で完全に模倣することは難しく効率が悪い。また、マウスの体細胞分化誘導に比べてヒトの場合は非常に長い分化誘導期間が必要であり、例えば成熟した神経を作製するためには３ヶ月以上を要する。さらに、ＥＳ／ｉＰＳ細胞株によって分化誘導の効率が大きく異なり、誘導された体細胞の性質が不均一である等の問題がある。

具体的には、ヒトＥＳ／ｉＰＳ細胞からホルモンや化学物質を利用する方法を用いて分化誘導された細胞は、初期の段階では胎児段階の体細胞であることが確認されている。ヒトの成熟した体細胞の分化誘導は極めて難しく、数か月にわたる長期の培養が必要である。しかし、発生が完了した個体を対象とする創薬や移植医療において、個体の成熟度に一致する体細胞を作製することは非常に重要である。

また、神経細胞には、様々なサブタイプの細胞が存在するが、ホルモンや化学物質を利用する方法では、これらのサブタイプ神経を均一にＥＳ／ｉＰＳ細胞から分化誘導できない。そのため、特定の神経サブタイプ特異的な創薬スクリーニングができない。したがって、創薬スクリーニングの効率が低い。また、移植医療においても、疾患のある特定の細胞だけを濃縮して移植することができない。

これに対し、ウイルスを用いて特定の体細胞の性質を規定する遺伝子をＥＳ／ｉＰＳ細胞に直接を導入し、目的の体細胞を作製する方法が提案されている。ウイルスを用いる方法は、ホルモンや化学物質を利用する方法に比べて、例えば２週間のような非常に短い期間で成熟した神経細胞を特異的に作製可能である。また、特定の遺伝子導入により神経細胞を作製すると、例えば興奮性神経のみを均一に得ることができる。そのため、特定の神経サブタイプ特異的な創薬スクリーニングが可能であり、移植医療においても、疾患のある特定の細胞だけを濃縮して移植できると考えられている。

また、ｉＰＳ細胞を体細胞に分化させた場合、分化した体細胞中に未分化なｉＰＳ細胞が残存する恐れがある。そこで、ｉＰＳ細胞を経由せず、体細胞から別の体細胞へと分化させる方法も確立されている。具体的には、繊維芽細胞を心筋細胞や神経細胞へと分化させる方法が開発されている。これらの方法は、ダイレクトリプログラミングと呼ばれ、ｉＰＳ細胞等の多能性幹細胞を経由しないため、移植時に未分化の多能性細胞が残存するというリスクがない。

特許第４１８３７４２号公報

体細胞は、細胞に遺伝子等の誘導因子を導入することによって樹立され、拡大培養され、必要に応じて凍結保存される。しかし、例えば臨床用の体細胞（例えば、ＧＬＰ，ＧＭＰグレード）を作製し産業化するには、以下のような問題点がある。

１） コスト
臨床用の体細胞は非常に綺麗に保たれたクリーンルームで作製、保存される必要がある。しかし、要求されるレベルの清潔度を維持するコストは非常に高額である。そのため、臨床用の体細胞を作るのにコストがかかり、産業化への大きな障害となっている。

２） 品質
体細胞の樹立から保存までの一連の作業が複雑であり、手作業によるところが多い。また、体細胞の作製は、個人の技量に負っているところがある。そのため、作製者や実験バッチによって、臨床用体細胞の品質のばらつきが生じうる。

３） 時間
クリーンルームの中で特定のドナー以外の他人の細胞とのクロスコンタミネーションを防ぐために、一人の人間のみに由来する臨床用体細胞が所定の時間をかけてクリーンルーム内で作製される。また臨床用体細胞の樹立、品質評価には長時間を要する。しかし、臨床用体細胞は、クリーンルームで一度に一人の人間のためだけに作製されるので、多くの希望者の臨床用体細胞を作製するのに非常に長い時間を要する。

４） 人材
上述したように、現状、臨床用体細胞の作製は手作業によるところが大きい。しかし、臨床用体細胞を作製することができるのに必要な技術を有する技術者は少ない。

これに対し、本発明は、体細胞を製造可能な体細胞製造システムを提供することを目的の一つとする。なお、体細胞は、臨床用体細胞に限定されない。

本発明の態様によれば、導入前細胞を含む溶液が通過する導入前細胞送液路と、導入前細胞送液路に接続され、導入前細胞に体細胞誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置と、誘導因子導入細胞を培養して体細胞を作製する細胞作製装置と、を備える、体細胞製造システムが提供される。

上記の体細胞製造システムが、導入前細胞送液路、因子導入装置、及び細胞作製装置を格納する筐体をさらに備えていてもよい。

上記の体細胞製造システムにおいて、体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞が、多能性幹細胞を除いてもよい。体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞が、分化細胞を含んでいてもよい。体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞が、体性幹細胞を含んでもよい。体性幹細胞は、成体幹細胞又は組織幹細胞ともいう。体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞が、神経系細胞を含んでもよい。体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞が、繊維芽細胞を含んでもよい。体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞が、心筋細胞、角化細胞（ケラチノサイト）、又は網膜細胞を含んでもよい。

上記の体細胞製造システムにおいて、導入前細胞が、多能性幹細胞を含んでもよい。多能性幹細胞が、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞を含んでもよい。導入前細胞が、体性幹細胞を含んでいてもよい。導入前細胞が、分化した体細胞を含んでいてもよい。導入前細胞が、血液細胞を含んでいてもよい。導入前細胞が、繊維芽細胞を含んでいてもよい。

上記の体細胞製造システムにおいて、細胞作製装置が、因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞を培養する体細胞培養装置と、体細胞培養装置で樹立された体細胞を拡大培養する拡大培養装置と、を備え、体細胞培養装置が、誘導因子導入細胞に培地を補給する第１の培地補給装置を備え、拡大培養装置が、体細胞に培地を補給する第２の培地補給装置を備えていてもよい。

上記の体細胞製造システムにおいて、体細胞培養装置が、薬剤耐性因子を導入されなかった細胞を死滅させる薬剤を含む溶液を供給する薬剤補給装置をさらに備えていてもよい。

上記の体細胞製造システムにおいて、因子導入装置が、導入前細胞送液路に接続された因子導入部と、体細胞誘導因子を保存する因子保存部と、因子保存部から導入前細胞送液路又は因子導入部に体細胞誘導因子を流すための因子送液路と、因子送液路内の液体を流すためのポンプと、を備えていてもよい。

上記の体細胞製造システムにおいて、体細胞誘導因子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質であってもよい。

上記の体細胞製造システムの因子導入部において、ＲＮＡリポフェクションにより、導入前細胞に体細胞誘導因子が導入されてもよい。

上記の体細胞製造システムにおいて、体細胞誘導因子がベクターに組み込まれていてもよい。ベクターがセンダイウイルスベクターであってもよい。

上記の体細胞製造システムが、細胞作製装置で作製された体細胞をパッケージするパッケージ装置をさらに備え、筐体がパッケージ装置を格納してもよい。

上記の体細胞製造システムが、筒状部材と、筒状部材の内部に配置された液体透過フィルターと、を備える溶液置換器であって、筒状部材に、液体透過フィルター上に、細胞作製装置で作製された体細胞を含む溶液を導入するための体細胞導入孔と、液体透過フィルター上に、置換溶液を導入するための置換溶液導入孔と、液体透過フィルター上に、体細胞を含む置換溶液を流出するための体細胞流出孔と、液体透過フィルターを透過した溶液が流出する廃液流出孔と、が設けられている溶液置換器をさらに備えていてもよい。

上記の体細胞製造システムが、溶液置換器の廃液流出孔に接続された廃液送液路をさらに備え、体細胞を含む溶液の溶液を廃棄する際に廃液送液路における溶液の流動が許容され、置換溶液中に体細胞を分散させる際に廃液送液路における溶液の流動が許容されなくともよい。

上記の体細胞製造システムにおいて、置換溶液が凍結保存液であってもよい。

上記の体細胞製造システムが、血液から導入前細胞を分離する分離装置をさらに備え、分離装置で分離された導入前細胞を含む溶液が導入前細胞送液路を通過してもよい。

本発明によれば、体細胞を製造可能な体細胞製造システムを提供可能である。

本発明の実施の形態に係る体細胞製造システムの模式図である。 本発明の実施の形態に係る体細胞製造システムの模式図である。 本発明の実施の形態に係る体細胞製造システムの導入細胞送液路の一例の模式的断面図である。 本発明の実施の形態に係る体細胞製造システムの導入細胞送液路の一例の模式的断面図である。 本発明の実施の形態に係る体細胞製造システムで用いられる培養バッグの模式図である。 本発明の実施の形態に係る溶液置換器の模式図である。 本発明の実施の形態に係る体細胞製造システムの模式図である。 実施例１に係る細胞の写真である。 実施例１に係る細胞の写真である。 実施例１に係るトランスフェクション効率と生存率の割合を示したグラフである。 実施例２に係る細胞の写真である。 実施例２に係るＴＵＪ−１陽性細胞の割合を示したグラフである。 実施例２に係るＴＵＪ−１陽性細胞の割合を示したグラフである。 実施例３に係るトランスフェクションの方法の模式図である。 実施例３に係る細胞の写真である。

以下に本発明の実施の形態を説明する。以下の図面の記載において、同一又は類似の部分には同一又は類似の符号で表している。ただし、図面は模式的なものである。したがって、具体的な寸法等は以下の説明を照らし合わせて判断するべきものである。また、図面相互間においても互いの寸法の関係や比率が異なる部分が含まれていることは勿論である。

なお、本開示は、米国で仮出願（６２／３５６，１９９）され、既に外国出願許可証が発せられた発明を含んでいる。

本発明の実施の形態に係る体細胞製造システムは、図１に示すように、導入前細胞を含む溶液が通過する導入前細胞送液路２０と、導入前細胞送液路２０に接続され、導入前細胞に体細胞誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置３０と、誘導因子導入細胞を培養して体細胞を作製する細胞作製装置４０と、導入前細胞送液路２０、因子導入装置３０、及び細胞作製装置４０を格納する筐体２００と、を備える。

導入前細胞は、例えば、多能性幹細胞である。多能性幹細胞としては、ＥＳ細胞及びｉＰＳ細胞が使用可能である。あるいは、導入前細胞は、例えば、分化細胞である。分化細胞としては、体性幹細胞、血液細胞、及び繊維芽細胞の分化した体細胞等が使用可能である。体性幹細胞は、成体幹細胞又は組織幹細胞ともいう。

体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞は、多能性幹細胞を除く。体細胞誘導因子を導入して作製される体細胞は、分化細胞である。分化細胞としては、体性幹細胞、神経系細胞、繊維芽細胞、心筋細胞、肝細胞、網膜細胞、角膜細胞、血液細胞、角化細胞（ケラチノサイト）及び軟骨細胞等が挙げられる。神経系細胞は、神経細胞、神経幹細胞及び神経前駆細胞のいずれかであってもよい。神経細胞は、抑制性神経細胞、興奮性神経細胞及びドーパミン産生神経細胞のいずれかであってもよい。あるいは、神経系細胞は、運動神経細胞、オリゴデンドロサイト前駆細胞、及びオリゴデンロドサイト等であってもよい。神経系細胞は、ＭＡＰ２陽性であってもよいし、β−ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ陽性であってもよい。

体細胞製造システムは、さらに、筐体２００内の気体を清浄にする空気清浄装置、筐体２００内の気体の温度を管理する温度管理装置、及び筐体２００内の気体の二酸化炭素（ＣＯ₂）濃度を管理する二酸化炭素濃度管理装置を備えていてもよい。空気清浄装置は、筐体２００内の気体の清浄度を監視する清浄度センサーを備えていてもよい。空気清浄装置は、例えば、ＨＥＰＡ（Ｈｉｇｈ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ Ｐａｒｔｉｃｕｌａｔｅ Ａｉｒ）フィルター及びＵＬＰＡ（Ｕｌｔｒａ Ｌｏｗ Ｐｅｎｅｔｒａｔｉｏｎ Ａｉｒ）フィルター等を用いて、筐体２００内の空気を清浄化する。空気清浄装置は、例えば、筐体２００内の空気の清浄度を、ＩＳＯ基準１４６４４−１でＩＳＯ１からＩＳＯ６のクラスにする。温度管理装置は、筐体２００内の気体の温度を監視する温度センサーを備えていてもよい。ＣＯ₂濃度管理装置は、筐体２００内の気体のＣＯ₂濃度を監視するＣＯ₂濃度センサーを備えていてもよい。

筐体２００には、例えば扉等が設けられているが、扉が閉じられた状態では、内部が完全に閉鎖され、内部の空気の清浄度、温度、及びＣＯ₂濃度を一定に保つことが可能である。筐体２００は、外部から内部の装置の状態を観察できるよう、透明であることが好ましい。また、筐体２００は、ゴム手袋等のグローブが一体化された、グローブボックスであってもよい。

筐体２００には、導入前細胞送液路２０に連通する導入口が設けられていてもよい。当該開口には、扉等が設けられていてもよい。あるいは、当該導入口は、着脱可能な封止材で封止可能であってもよい。導入前細胞は、当該導入口から、導入前細胞送液路２０に入れられる。あるいは、筐体２００内に、導入前細胞送液路２０に連通する、導入前細胞を保存する導入前細胞保存容器が配置されていてもよい。

またあるいは、体細胞製造システムは、図２に示すように、筐体２００内に配置された、血液から導入前細胞を分離する分離装置１０をさらに備えていてもよい。この場合、導入前細胞送液路２０は、分離装置１０に接続される。導入前細胞送液路２０には、分離装置１０で分離された導入前細胞を含む溶液が通過する。

筐体２００内の分離装置１０は、例えばヒトの血液が入ったバイアルを受け取る。分離装置１０は、例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）、ヘパリン、及び生物学的製剤基準血液保存液Ａ液（ＡＣＤ−Ａ液、テルモ株式会社）等の抗凝固剤を保存する抗凝固剤タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、抗凝固剤タンクから、ヒトの血液に、抗凝固剤を添加する。

また、分離装置１０は、例えば、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ ＰＲＥＭＩＵＭ（登録商標、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）等の単核細胞分離用試薬を保存する分離用試薬タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、分離用試薬タンクから、例えば１５ｍＬチューブ２本に、単核細胞分離用試薬を５ｍＬずつ分注する。なお、チューブの代わりに、樹脂バッグを用いてもよい。

さらに、分離装置１０は、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）等の緩衝液を保存する緩衝液タンクを備えている。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、緩衝液タンクから、例えばヒトの血液５ｍＬに、緩衝液５ｍＬを加えて希釈する。またさらに、分離装置１０は、ポンプ等を用いて、希釈されたヒトの血液を、チューブ中の単核細胞分離用試薬上に、５ｍＬずつ加える。

分離装置１０は、温度設定可能な遠心機をさらに備える。遠心機は、例えば１８℃に設定される。分離装置１０は、移動装置等を用いて、単核細胞分離用試薬及びヒトの血液等が入れられたチューブを、遠心機のホルダーに入れる。遠心機は、チューブ中の溶液を、例えば４００×ｇで３０分間遠心する。チューブの代わりに、樹脂バッグを遠心させてもよい。

遠心後、分離装置１０は、チューブ中の溶液の単核球で白く濁った中間層をポンプ等で回収する。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、回収した単核球の懸濁液を、導入前細胞送液路２０に送り出す。あるいは、さらに、分離装置１０は、回収した単核球溶液２ｍＬに対し、例えばＰＢＳ１２ｍＬを加えて、チューブを遠心機のホルダーに入れる。遠心機は、チューブ中の溶液を、例えば２００×ｇで１０分間遠心する。

遠心後、分離装置１０は、ポンプ等を用いて、チューブ中の溶液の上清を吸引して除去し、Ｘ−ＶＩＶＯ １０（登録商標、ロンザジャパン株式会社）等の単核球培地３ｍＬをチューブ中の単核球溶液に加えて懸濁する。血液細胞は、Ｍａｔｒｉｇｅｌ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）、ＣＥＬＬｓｔａｒｔ（登録商標、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ）、あるいはＬａｍｉｎｉｎ５１１ （ｎｉｐｐｉ）等の基底膜マトリックスを用いて、フィーダーフリーで培養してもよい。分離装置１０は、ポンプ等を用いて、導入前細胞としての単核球の懸濁液を、導入前細胞送液路２０に送り出す。なお、分離装置１０は、透析膜を使用して、血液から単核球を分離してもよい。また、予め用意された導入前細胞を使用する場合は、分離装置１０は無くともよい。

分離装置１０は、遠心分離以外の方法で、誘導に適した細胞を分離してもよい。例えば、分離すべき細胞がＴ細胞であればＣＤ３，ＣＤ４，ＣＤ８のいずれかが陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。分離すべき細胞が血管内皮前駆細胞であればＣＤ３４が陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。分離すべき細胞がＢ細胞であれば、ＣＤ１０，ＣＤ１９，ＣＤ２０のいずれかが陽性である細胞をパニングにより分離すればよい。また、パニングに限らず、磁気細胞分離方法（ＭＡＣＳ）やフローサイトメトリー等により分離してもよい。

導入前細胞送液路２０の内壁には、導入前細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡ（ｐｏｌｙ ２−ｈｙｄｒｏｘｙｅｔｈｙｌ ｍｅｔｈａｃｒｙｌａｔｅ）をコーティングして、細胞非接着性にしてもよい。あるいは、導入前細胞送液路２０の材料に、導入前細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、導入前細胞送液路２０の材料に、例えば、温度伝導率が良く、ＣＯ₂透過性の材料を用いることにより、導入前細胞送液路２０内の条件が、筐体２００内の管理された温度及びＣＯ₂濃度と同等になる。さらに、導入前細胞送液路２０には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。

筐体２００内の誘導因子送液機構２１は、例えば、誘導因子導入試薬溶液等を保存する誘導因子導入試薬タンクを備える。誘導因子送液機構２１は、マイクロポンプ等を用いて、誘導因子導入試薬溶液中に導入前細胞が懸濁されるように、誘導因子導入試薬溶液を、筐体２００内の導入前細胞送液路２０又は因子導入装置３０に送り出す。

遺伝子導入試薬溶液等の誘導因子導入試薬溶液は、例えば、体細胞誘導因子ＲＮＡ、ＲＮＡトランスフェクション溶液、及びＲＮＡトランスフェクション用培地のセットを含む。ＲＮＡトランスフェクションは、ＲＮＡリポフェクションを含む。体細胞誘導因子ＲＮＡのセットは、例えば、ＡＳＣＬ１のｍＲＮＡ、Ｍｙｔ１ＬのｍＲＮＡ、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）のｍＲＮＡをそれぞれ１００ｎｇ含む。Ｎｇｎ２（ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２）は、神経系細胞分化に必要なスイッチタンパク質である。

体細胞誘導因子ＲＮＡは、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいてもよい。薬剤とは、例えばピューロマイシン、ネオマイシン、ブラストサイジン、Ｇ４１８、ハイグロマイシン、及びゼオシン等の抗生物質である。薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡが導入された細胞は、薬剤耐性を示す。体細胞誘導因子ＲＮＡは、例えば、Ｎｇｎ２−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を含む。Ｎｇｎ２−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）をトランスフェクトされた細胞は、ｎｅｕｒｏｇｅｎｉｎ２（Ｎｇｎ２）を産生し、かつ、ピューロマイシン耐性を示す。

ｍＲＮＡは、Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップされ、ポリアデニル化されており、５−メチルシチジン及びプソイドウリジンで置換されていてもよい。５−メチルシチジン及びプソイドウリジンは、抗体によるｍＲＮＡの認識力を低下させる。

ＲＮＡトランスフェクション溶液は、例えば、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）あるいはリポフェクション試薬を含む。ＲＮＡのリポフェクション試薬としては、ｓｉＲＮＡのリポフェクション試薬及びｍＲＮＡのリポフェクション試薬が使用可能である。より具体的には、ＲＮＡのリポフェクション試薬としては、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＲＮＡｉＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭＡＸ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）２０００、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎ（登録商標）３０００、ＮｅｏｎＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ｓｔｅｍｆｅｃｔ ＲＮＡ ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ ｒｅａｇｅｎｔ（Ｓｔｅｍｆｅｃｔ）、ＮｅｘｔＦｅｃｔ（登録商標）ＲＮＡ Ｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢｉｏｏＳｉｅｎｔｉｆｉｃ）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ Ｔ ｃｅｌｌＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ−１００２）、Ａｍａｘａ（登録商品）Ｈｕｍａｎ ＣＤ３４ ｃｅｌｌＮｕｃｌｅｏｆｅｃｔｏｒ（登録商品）ｋｉｔ（Ｌｏｎｚａ社、ＶＡＰＡ−１００３）、及びＲｅｐｒｏＲＮＡ（登録商標）トランスフェクション試薬ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ｍＲＮＡ−ｉｎ（登録商標）（Ｔｈｅｒｍｏ ｆｉｓｈｅｒ ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社）等が使用可能である。

例えば、因子導入装置３０は、細胞に体細胞誘導因子を導入した後に、細胞を培養液に懸濁してもよい。因子導入装置３０は、体細胞誘導因子のトランスフェクションを複数回実施してもよい。例えば、細胞に体細胞誘導因子を導入してから２４時間等の所定の時間の後、培地を交換し、細胞に、再度、体細胞誘導因子をトランスフェクションしてもよい。さらに、細胞への体細胞誘導因子のトランスフェクション、及び所定の時間の細胞培養を、複数回、例えば、２回から４回繰り返してもよい。

体細胞誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際に、例えば、１２ウェルプレートを利用する場合、１ウェルあたりの細胞の数は、１×１０^４個から１×１０^８個、５×１０^４個から１×１０^６個、あるいは１×１０^５個から５×１０^５個である。なお、１ウェルの底面積は４ｃｍ^２である。体細胞誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際の体細胞誘導因子ＲＮＡの量は、１回あたり２００ｎｇから５０００ｎｇ、４００ｎｇから２０００ｎｇ、あるいは５００ｎｇから１０００ｎｇである。体細胞誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際のリポフェクション試薬の量は、０．１μＬから１００μＬ、１μＬから５０μＬ、あるいは１．５μＬから１０μＬである。

体細胞誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際に用いられる培地は、例えばＯｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標、Ｇｉｂｃｏ）等の低血清培地である。体細胞誘導因子ＲＮＡのリポフェクションの際、及びその前後に用いられる培地は、Ｂ１８Ｒタンパク質を含んでいてもよい。Ｂ１８Ｒタンパク質は、細胞の先天性抗ウイルス反応を緩和する。Ｂ１８Ｒタンパク質は、細胞へのＲＮＡの挿入時に伴う免疫反応に伴う細胞死を抑制するために使用されることがある。ただし、短期間で細胞を体細胞に分化させる場合は、培地はＢ１８Ｒタンパク質を含まなくともよく、あるいは、Ｂ１８Ｒタンパク質を０．０１％から１％のような薄い濃度で含有してもよい。

体細胞誘導因子ＲＮＡのリポフェクションから１０日以内、９日以内、８日以内、あるいは７日以内に動物細胞が体細胞に分化する。作製される体細胞が神経系細胞である場合、神経系細胞に分化したか否かは、β−ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２、又はＰｓＡ−ＮＣＡＭが陽性であるか否かによって確認される。β−ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎ、ＭＡＰ２、ＰｓＡ−ＮＣＡＭ、及びｖＧｌｕは、神経細胞を標識するマーカーであり、神経細胞突起中の微小管の構成タンパク質である。

あるいは、遺伝子導入試薬溶液等の誘導因子導入試薬溶液は、例えば、センダイウイルスベクター溶液を含んでいてもよい。センダイウイルス由来のＲＮＡは、宿主のＤＮＡにインテグレーションされないが、宿主において、目的の遺伝子を導入することが出来る。センダイウイルスベクターのセットは、例えば、ＡＳＣＬ１のｍＲＮＡ、Ｍｙｔ１ＬのｍＲＮＡ、Ｎｇｎ２のｍＲＮＡをＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）が０．０１から１０００、０．１から１、あるいは１から１０になるよう含む。誘導因子センダイウイルスベクターは、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいてもよい。センダイウイルスベクターに含まれる誘導因子ＲＮＡは、例えば、Ｎｇｎ２−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を含む。なお、細胞へのセンダイウイルスの導入は１回でもよい。

因子導入装置３０は、ポンプ等を用いて、誘導因子を導入された細胞（誘導因子導入細胞）を含む溶液を、導入細胞送液路３１に送り出す。

筐体２００内の導入細胞送液路３１の内壁には、誘導因子導入細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡをコーティングして、非接着性にしてもよい。あるいは、導入細胞送液路３１の材料に、誘導因子導入細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、例えば、導入細胞送液路３１の材料に、温度伝導率が良く、ＣＯ₂透過性の材料を用いることにより、導入細胞送液路３１内の条件が、筐体２００内の管理された温度及びＣＯ₂濃度と同等になる。さらに、導入細胞送液路３１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。また、図３に示すように、導入細胞送液路３１内部に、内径を断続的に変化させる一又は複数の襞を設けてもよい。またあるいは、図４に示すように、導入細胞送液路３１の内径を断続的に変化させてもよい。

図１及び図２に示すように、導入細胞送液路３１に接続された細胞作製装置４０は、因子導入装置３０で作製された誘導因子導入細胞を培養する体細胞培養装置５０と、体細胞培養装置５０で樹立された体細胞からなる細胞塊（細胞コロニー）を複数の細胞塊に分割する第１の分割機構６０と、体細胞を拡大培養する拡大培養装置７０と、拡大培養装置７０で拡大培養された体細胞からなる細胞塊を複数の細胞塊に分割する第２の分割機構８０と、体細胞をパッケージ装置１００に順次送る体細胞搬送機構９０と、を備える。ただし、例えば、細胞塊が形成されない場合、あるいは細胞塊を分割する必要がない場合は、第１の分割機構６０及び第２の分割機構８０は、省略されてもよい。

体細胞培養装置５０は、内部にウェルプレート、バッグ、及びチューブ等の培養容器を備えていてもよい。また、体細胞培養装置５０は、ピペッティングマシンを備えていてもよい。体細胞培養装置５０は、導入細胞送液路３１から体細胞誘導因子導入細胞を含む溶液を受け取り、ピペッティングマシンで、溶液を培養容器に分配する。

細胞を神経系細胞に分化させる場合、体細胞培養装置５０は、培養容器に誘導因子導入細胞を入れた後、例えば１から７日目に、神経分化培地であるＮ３培地（ＤＭＥＭ／Ｆ１２、２５μｇ／ｍＬインシュリン、５０μｇ／ｍＬヒトトランスフェリン、３０ｎｍｏｌ／Ｌ亜セレン酸ナトリウム、２０ｎｍｏｌ／Ｌプロゲステロン、１００ｎｍｏｌ／Ｌプトレシン）を培養容器に加える。培地に数日間１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を添加してもよい。

体細胞培養装置５０は、培養容器に誘導因子導入細胞を分配後、例えば９日目に、培地交換を行い、以降、神経系細胞等の目的の細胞が観察されるまで培地交換を行う。なお、培地を交換するとは、培地を一部置換することや、補給することも含む。

体細胞培養装置５０においては、薬剤耐性因子を導入されなかった細胞を死滅させる薬剤選択をおこなってもよい。体細胞誘導因子ＲＮＡが、薬剤耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいた場合、薬剤を含む溶液を培養容器に供給することにより、薬剤耐性を示す誘導因子導入細胞が選択的に生き残る。例えば、体細胞誘導因子ＲＮＡが、ピューロマイシン耐性遺伝子に対応するｍＲＮＡを含んでいた場合、リポフェクションの後の細胞をピューロマイシンに曝すことにより、体細胞誘導因子ＲＮＡが導入された細胞以外を死滅させ、体細胞誘導因子ＲＮＡが導入された細胞を選別することが可能である。薬剤は、培地に含まれていてもよい。薬剤の濃度は、例えば、２ｍｇ／Ｌである。

体細胞培養装置５０においては、所定の期間、薬剤耐性因子を導入されなかった細胞を死滅させる薬剤を含む培地を用いて誘導因子導入細胞を培養し、その後、薬剤を含まない培地を用いて誘導因子導入細胞を培養してもよい。

目的とする体細胞が形成されると、体細胞培養装置５０は、ピペッティングマシンで体細胞を回収する。さらに、体細胞培養装置５０は、回収した体細胞が入っている容器をインキュベーターに入れて、３７℃、ＣＯ₂５％で１０分間、体細胞と、トリプシン代替組み替え酵素と、を反応させる。なお、物理的に細胞塊を砕ける場合は、トリプシン代替組み替え酵素はなくともよい。例えば、体細胞培養装置５０は、ピペッティングマシンによるピペッティングにより、体細胞の細胞塊を砕く。またあるいは、体細胞培養装置５０は、フィルターが設けられたパイプや、図３又は図４に示した導入細胞送液路３１と同様に、内径を断続的に変化させるパイプに細胞塊を通して、細胞塊を砕いてもよい。

例えば神経を誘導する場合はその後、体細胞培養装置５０は、砕かれた体細胞の細胞塊が入れられた溶液に、上述したような神経分化培地を加える。

なお、体細胞培養装置５０における培養は、ウェルプレートではなく、バッグの中で行ってもよい。バッグは、ＣＯ₂透過性であってもよい。また、培養は接着培養であってもよいし、浮遊培養であってもよい。浮遊培養である場合は、攪拌培養を行ってもよい。さらに、体細胞培養装置５０における培養は、ハンギングドロップ培養であってもよい。

体細胞培養装置５０は、ウェルプレート、バッグ及びチューブ等の培養容器に培養液を含む培地を補給する第１の培地補給装置を備えていてもよい。第１の培地補給装置は、培養容器内の培養液を回収し、フィルターや透析膜を用いて培養液をろ過して、浄化された培養液を再利用してもよい。また、その際、再利用される培養液に成長因子等を添加してもよい。また、体細胞培養装置５０は、培養容器に、薬剤耐性因子を導入されなかった細胞を死滅させる薬剤を含む溶液を供給する薬剤補給装置を備えていてもよい。さらに、体細胞培養装置５０は、培地の温度を管理する温度管理装置、培地のｐＨを管理するｐＨ管理装置、及び培地近傍の湿度を管理する湿度管理装置等をさらに備えていてもよい。

体細胞培養装置５０において、例えば、細胞を、図５に示すような透析膜等の培養液透過性のバッグ３０１に入れ、培養液透過性のバッグ３０１を、培養液非透過性のバッグ３０２に入れて、バッグ３０１、３０２に培養液を入れてもよい。バッグ３０２は、ＣＯ₂透過性であってもよいし、ＣＯ₂透過性でなくてもよい。体細胞培養装置５０は、新鮮な培養液が入ったバッグ３０２を複数用意しておき、所定の期間ごとに、細胞が入ったバッグ３０１を入れる外側のバッグ３０２を、新鮮な培養液が入っているバッグ３０２に交換してもよい。

図１及び図２に示す体細胞培養装置５０には、第１体細胞送液路５１が接続されている。体細胞培養装置５０は、体細胞を含む溶液を、ポンプ等を用いて、第１体細胞送液路５１に送り出す。また、第１体細胞送液路５１は、所定の大きさ未満の誘導された細胞のみを通す内径を有し、所定の大きさ以上の誘導されていない細胞を除去する分岐流路に接続されていてもよい。

第１体細胞送液路５１の内壁には、体細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡをコーティングして、細胞非接着性にしてもよい。あるいは、第１体細胞送液路５１の材料に、体細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、第１体細胞送液路５１の材料に、温度伝導率が良く、ＣＯ₂透過性の材料を用いることにより、第１体細胞送液路５１内の条件が、筐体２００内の管理された温度及びＣＯ₂濃度と同等になる。さらに、第１体細胞送液路５１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。

第１体細胞送液路５１は、第１の分割機構６０に接続されている。第１の分割機構６０は、例えば、メッシュを備える。溶液に含まれる細胞塊は、水圧によってメッシュを通過する際、メッシュの各孔の大きさの複数の細胞塊に分割される。例えば、メッシュの各孔の大きさが均一であれば、分割後の複数の細胞塊の大きさも、ほぼ均一となる。あるいは、第１の分割機構６０は、ノズルを備えていてもよい。例えば、略円錐状のノズルの内部を階段状に微細加工することにより、溶液に含まれる細胞塊がノズルを通過する際に、複数の細胞塊に分割される。

第１の分割機構６０には、拡大培養装置７０が接続されている。第１の分割機構６０で分割された体細胞の細胞塊を含む溶液は、拡大培養装置７０に送られる。なお、細胞塊を形成しない場合は、第１の分割機構６０を省略してもよい。この場合、第１体細胞送液路５１は、拡大培養装置７０に接続されている。

拡大培養装置７０は、例えば、内部にウェルプレートを格納可能である。また、拡大培養装置７０は、ピペッティングマシンを備える。拡大培養装置７０は、第１の分割機構６０又は第１体細胞送液路５１から体細胞を含む溶液を受け取り、ピペッティングマシンで、溶液をウェルに分配する。拡大培養装置７０は、ウェルに体細胞を分配後、３７℃、ＣＯ₂５％で体細胞を例えば８日前後培養する。また、拡大培養装置７０は、適宜培地交換を行う。

細胞塊が形成される場合、拡大培養装置７０は、細胞塊にＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（登録商標、ライフテクノロジーズ社）等のトリプシン代替組み替え酵素を添加する。さらに、拡大培養装置７０は、細胞塊が入っている容器の温度を上昇させて、３７℃、ＣＯ₂５％で１分間、細胞塊と、トリプシン代替組み替え酵素と、を反応させる。なお、物理的に細胞塊を砕ける場合は、トリプシン代替組み替え酵素はなくともよい。例えば、拡大培養装置７０は、ピペッティングマシンによるピペッティングにより、細胞塊を砕く。またあるいは、拡大培養装置７０は、フィルターが設けられたパイプや、図３又は図４に示した導入細胞送液路３１と同様に、内径を断続的に変化させるパイプに細胞塊を通して、細胞塊を砕いてもよい。その後、図１及び図２に示す拡大培養装置７０は、細胞塊が入れられた溶液に、維持培養培地等の培地を加える。さらに、拡大培養装置７０は、接着培養である場合は、自動セルスクレーパー等で容器から細胞塊を剥がし、細胞塊を含む溶液を、拡大培養送液路７１を介して、第１の分割機構６０に送る。

なお、拡大培養装置７０における培養は、ウェルプレートではなく、バッグやチューブの中で行ってもよい。バッグやチューブはＣＯ₂透過性であってもよい。また、培養は接着培養であってもよいし、浮遊培養であってもよいし、ハンギングドロップ培養であってもよい。浮遊培養である場合は、攪拌培養を行ってもよい。

拡大培養装置７０は、ウェルプレート、バッグ及びチューブ等の培養容器に培養液を補給する第２の培地補給装置を備えていてもよい。第２の培地補給装置は、培養容器内の培養液を回収し、フィルターや透析膜を用いて培養液をろ過して、浄化された培養液を再利用してもよい。また、その際、再利用される培養液に成長因子等を添加してもよい。また、拡大培養装置７０は、培地の温度を管理する温度管理装置、及び培地近傍の湿度を管理する湿度管理装置等をさらに備えていてもよい。

拡大培養装置７０においても、例えば、細胞を、図５に示すような透析膜等の培養液透過性のバッグ３０１に入れ、培養液透過性のバッグ３０１を、培養液非透過性のバッグ３０２に入れて、バッグ３０１、３０２に培養液を入れてもよい。バッグ３０２は、ＣＯ₂透過性であってもよい。拡大培養装置７０は、新鮮な培養液が入ったバッグ３０２を複数用意しておき、所定の期間ごとに、細胞が入ったバッグ３０１を入れる外側のバッグ３０２を、新鮮な培養液が入っているバッグ３０２に交換してもよい。

図１及び図２に示す体細胞製造システムは、体細胞培養装置５０及び拡大培養装置７０における培養を撮影する撮影装置をさらに備えていてもよい。ここで、体細胞培養装置５０及び拡大培養装置７０で使用される培地に無色の培地を用いると、有色の培地を用いた場合に生じうる乱反射や自家蛍光を抑制することが可能となる。ただし、培地のｐＨを確認するために、フェノールレッド等のｐＨ指示薬を含んでいてもよい。また、誘導された細胞と、誘導されなかった細胞とでは、細胞の形状及び大きさ等が異なるため、体細胞製造システムは、体細胞培養装置５０及び拡大培養装置７０における細胞を撮影することにより、誘導された細胞の割合を算出する誘導状態監視装置を、さらに備えていてもよい。あるいは、誘導状態監視装置は、抗体免疫染色法又はＲＮＡ抽出法により、誘導された細胞の割合を特定してもよい。さらに、体細胞製造システムは、磁気細胞分離方法やフローサイトメトリー等により、誘導されていない細胞を取り除く、未誘導細胞除去装置を備えていてもよい。

図１及び図２に示す第１の分割機構６０で分割された細胞塊は、再び拡大培養装置７０内で培養される。必要な細胞の量が得られるまで、第１の分割機構６０における細胞塊の分割と、拡大培養装置７０内での体細胞の培養が繰り返される。なお、上述したように、細胞塊を形成しない場合は、第１の分割機構６０を省略してもよい。

拡大培養装置７０には、第２体細胞送液路７２が接続されている。拡大培養装置７０は、拡大培養された体細胞を含む溶液を、ポンプ等を用いて、第２体細胞送液路７２に送り出す。ただし、浮遊培養の場合は、剥離は不要である。第２体細胞送液路７２は、所定の大きさ未満の誘導された体細胞のみを通す内径を有し、所定の大きさ以上の誘導されていない細胞を除去する分岐流路に接続されていてもよい。

第２体細胞送液路７２の内壁には、体細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡをコーティングして、細胞非接着性にしてもよい。あるいは、第２体細胞送液路７２の材料に、体細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、第２体細胞送液路７２の材料に、温度伝導率が良く、ＣＯ₂透過性の材料を用いることにより、第２体細胞送液路７２内の条件が、筐体２００内の管理された温度及びＣＯ₂濃度と同等になる。さらに、第２体細胞送液路７２には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。

第２体細胞送液路７２は、第２の分割機構８０に接続されている。第２の分割機構８０は、例えば、メッシュを備える。溶液に含まれる細胞塊は、水圧によってメッシュを通過する際、メッシュの各孔の大きさの複数の細胞塊に分割される。例えば、メッシュの各孔の大きさが均一であれば、分割後の複数の細胞塊の大きさも、ほぼ均一となる。あるいは、第２の分割機構８０は、ノズルを備えていてもよい。例えば、略円錐状のノズルの内部を階段状に微細加工することにより、溶液に含まれる細胞塊がノズルを通過する際に、複数の細胞塊に分割される。

図２に示す第２の分割機構８０に、体細胞をパッケージ装置１００に順次送る体細胞搬送機構９０が接続されている。なお、細胞塊を形成しない場合は、第２の分割機構８０を省略してもよい。この場合、第２体細胞送液路７２が、体細胞搬送機構９０に接続されている。

筐体２００内の体細胞搬送機構９０と、パッケージ装置１００と、の間には、パッケージ前細胞流路９１が接続されている。体細胞搬送機構９０は、ポンプ等を用いて、体細胞を、パッケージ前細胞流路９１を介して、パッケージ装置１００に順次送る。

パッケージ前細胞流路９１には、体細胞が接着しないよう、ｐｏｌｙ−ＨＥＭＡをコーティングしてもよい。あるいは、パッケージ前細胞流路９１の材料に、体細胞が接着しにくい材料を用いてもよい。また、パッケージ前細胞流路９１の材料に、温度伝導率が良く、ＣＯ₂透過性の材料を用いることにより、パッケージ前細胞流路９１内の条件が、筐体２００内の管理された温度及びＣＯ₂濃度と同等になる。パッケージ前細胞流路９１には、コンタミネーション防止の観点から、逆流防止弁が設けられていてもよい。

パッケージ前細胞流路９１には、凍結保存液送液機構１１０が接続されている。凍結保存液送液機構１１０は、細胞凍結保存液をパッケージ前細胞流路９１に送り込む。これにより、パッケージ前細胞流路９１内で、体細胞が細胞凍結保存液で懸濁される。

パッケージ装置１００は、パッケージ前細胞流路９１を介して送られてきた体細胞を順次凍結する。例えば、パッケージ装置１００は、体細胞を受け取るたびに体細胞をクライオチューブ等の凍結保存容器に入れ、体細胞を含む溶液を例えば−８０℃以下で瞬間的に凍結する。体積あたりの表面積が小さい凍結保存容器を用いると、凍結に時間がかかる傾向にあるため、体積あたりの表面積が大きい凍結保存容器を用いることが好ましい。体積あたりの表面積が大きい凍結保存容器を用いることにより、解凍後の細胞の生存率を高くすることが可能となる。凍結保存容器の形状としては、キャピラリー状及び球状が挙げられるが、これらに限定されない。また、必要とされる解凍後の細胞の生存率によっては、必ずしも瞬間凍結をしなくともよい。

凍結には、例えば、ガラス化（Ｖｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法を用いる。この場合、細胞凍結保存液としては、ＤＡＰ２１３（コスモバイオ株式会社）及びＦｒｅｅｚｉｎｇ Ｍｅｄｉｕｍ（リプロセル株式会社）が使用可能である。凍結は、ガラス化法以外の通常の方法で行ってもよい。この場合、細胞凍結保存液としては、ＣｒｙｏＤｅｆｅｎｄ−Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ（Ｒ＆Ｄシステム社）や、ＳＴＥＭ−ＣＥＬＬＢＡＮＫＥＲ（登録商標、日本全薬工業株式会社）等が使用可能である。凍結は、液体窒素によって行ってもよいし、ペルチェ素子によっておこなってもよい。ペルチェ素子を用いると、温度変化を制御したり、温度のムラを抑制したりすることが可能となる。パッケージ装置１００は、凍結保存容器を、筐体２００の外に搬出する。凍結細胞が臨床用途である場合は、凍結保存容器は完全閉鎖系であることが好ましい。ただし、パッケージ装置１００は、体細胞を凍結することなく、保存容器内にパッケージしてもよい。

あるいは、パッケージ装置１００においては、図６に示すような溶液置換器１０１を用いて、体細胞を含む溶液の溶媒を培地から凍結保存液に置換してもよい。溶液置換器１０１の内部には、底面上に、体細胞が透過しない細孔が設けられたフィルター１０２が設けられている。また、溶液置換器１０１には、内部のフィルター１０２上に体細胞を含む培地を送液する第１の送液流路１０３が接続された体細胞導入孔、内部のフィルター１０２上に体細胞を含まない凍結液を送液する第２の送液流路１０４が接続された置換溶液導入孔、内部のフィルター１０２上から体細胞を含む凍結液を排出する第１の排出流路１０５が接続された体細胞流出孔が設けられている。さらに、溶液置換器１０１には、フィルター１０２を透過した溶液を排出する第２の排出流路１０６が接続された廃液流出孔が設けられている。第１の送液流路１０３、第２の送液流路１０４、第１の排出流路１０５、及び第２の排出流路１０６のそれぞれには、チューブ等が使用可能である。

まず、図６（ａ）及び図６（ｂ）に示すように、第２の排出流路１０６における溶液の流動を停止させた状態で、第１の送液流路１０３から溶液置換器１０１内部に、体細胞を含む培地を入れる。次に、図６（ｃ）に示すように、第２の排出流路１０６における溶液の流動を許容する状態にし、培地を溶液置換器１０１から排出する。この際、図６（ｄ）に示すように、体細胞は、フィルター１０２上に残る。さらに、図６（ｅ）及び図６（ｆ）に示すように、第２の排出流路１０６における溶液の流動を停止させた状態で、第２の送液流路１０４から溶液置換器１０１内部に、凍結保存液を入れ、凍結保存液中に体細胞を分散させる。その後、図６（ｇ）に示すように、第１の排出流路１０５から、体細胞を含む凍結保存液を排出する。体細胞を含む凍結保存液は、第１の排出流路１０５を経由して、凍結保存容器等に送られる。

図１及び図２に示す体細胞製造システムは、筐体２００内を滅菌する滅菌装置をさらに備えていてもよい。滅菌装置は、乾熱滅菌装置であってもよい。この場合、分離装置１０、導入前細胞送液路２０、誘導因子送液機構２１、因子導入装置３０、細胞作製装置４０、及びパッケージ装置１００等の電気を使用する装置の配線は、耐熱性を有する配線であることが好ましい。あるいは、滅菌装置は、オゾンガス、過酸化水素ガス、又はホルマリンガス等の滅菌ガスを筐体２００内に放出して、筐体２００内を滅菌してもよい。

体細胞製造システムは、分離装置１０、導入前細胞送液路２０、誘導因子送液機構２１、因子導入装置３０、細胞作製装置４０、及びパッケージ装置１００等の動作記録、並びに撮影装置が撮影した画像を、有線又は無線により、外部のサーバーに送信してもよい。さらに、外部サーバーは、標準作業手順（ＳＯＰ）に基づいて、体細胞製造システムの分離装置１０、誘導因子送液機構２１、因子導入装置３０、細胞作製装置４０、及びパッケージ装置１００等を制御し、ＳＯＰに基づいて各装置が稼働しているか否かを監視し、各装置の稼働記録を自動的に生成してもよい。

以上説明した体細胞製造システムによれば、自動で、体細胞を誘導することが可能となる。

なお、実施の形態に係る体細胞製造システムは、図１及び図２に示す構成に限定されない。例えば、図７に示す実施の形態に係る体細胞製造システムにおいては、血液保存部２０１から単核球分離部２０３に、血液送液路２０２を経由して血液が送液される。血液保存部２０１及び単核球分離部２０３としては、例えばチューブが使用可能である。血液送液路２０２は、例えば、樹脂チューブやシリコンチューブ等である。後述する他の送液路も同様である。血液保存部２０１には、バーコード等の識別子を付けて、血液の情報を管理してもよい。送液には、ポンプ２０４が使用される。ポンプ２０４としては、容積式ポンプが使用可能である。容積式ポンプの例としては、ピストンポンプ、プランジャーポンプ、及びダイヤフラムポンプを含む往復ポンプ、あるいは、ギアポンプ、ベーンポンプ、及びネジポンプを含む回転ポンプが挙げられる。ダイヤフラムポンプの例としては、チュービングポンプ及び圧電（ピエゾ）ポンプが挙げられる。チュービングポンプの例としては、ペリスタポンプ（登録商標、アトー株式会社）、並びにＲＰ−Ｑ１及びＲＰ−ＴＸ（高砂電気工業株式会社）が挙げられる。圧電ポンプの例としては、ＳＤＭＰ３０４、ＳＤＰ３０６、ＳＤＭ３２０、及びＡＰＰ−２０ＫＧ（高砂電気工業株式会社）が挙げられる。また、様々な種類のポンプを組み合わせたマイクロ流体チップモジュール（高砂電気工業株式会社）を用いてもよい。ペリスタポンプ（登録商標）、チュービングポンプ、及びダイヤフラムポンプ等の密閉型ポンプを用いると、血液送液路２０２内部の血液にポンプが直接接触することなく、送液することが可能である。後述する他のポンプにおいても同様である。あるいは、ポンプ２０４、並びに後述するポンプ２０７、ポンプ２１６、ポンプ２２２、ポンプ２２５、ポンプ２３４、ポンプ２４２、及びポンプ２５２としては、シリンジポンプを使用してもよい。密閉型ポンプ以外のポンプであっても、加熱滅菌処理等により再利用が可能である。

単核球分離部２０３には、分離剤保存部２０５から、送液路２０６及びポンプ２０７を介して、赤血球凝固剤が送られる。分離剤保存部２０５としては、例えばチューブが使用可能である。分離剤保存部２０５には、バーコード等の識別子を付けて、分離剤の情報を管理してもよい。赤血球凝固剤としては、例えば、ＨｅｔａＳｅｐ（登録商標、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）や赤血球凝固剤（ニプロ）等が使用可能である。単核球分離部２０３内において、赤血球凝固剤によって赤血球が沈降し、単核球が分離される。単核球分離部２０３内の単核球を含む上澄みは、単核球送液路２０８及びポンプ２０９を介して、単核球精製フィルター２１０に送られる。単核球精製フィルター２１０において、単核球以外の成分が除去され、導入前細胞としての単核球を含む溶液が得られる。単核球精製フィルター２１０としては、Ｐｕｒｅｃｅｌｌ（登録商標、ＰＡＬＬ）、セルソーバＥ（旭化成株式会社）、セパセルＰＬ（旭化成株式会社）、アダカラム（登録商標、ＪＩＭＲＯ）、及び分離バック（二プロ株式会社）等が使用可能である。

図７においては、単核球分離部２０３、分離剤保存部２０５、単核球精製フィルター２１０、及びポンプ２０４、２０７、２０９等が、分離装置を構成している。ただし、上述したように、予め用意された導入前細胞を使用する場合は、分離装置は省略してもよい。

導入前細胞を含む溶液は、導入前細胞送液路２１１及びポンプ２１２を介して、因子導入部２１３に送られる。因子導入部２１３としては、例えばチューブが使用可能である。因子導入部２１３には、体細胞誘導因子を含む因子保存部２１４から、因子送液路２１５及びポンプ２１６を介して、体細胞誘導因子が送られる。因子保存部２１４としては、例えばチューブが使用可能である。因子保存部２１４には、バーコード等の識別子を付けて、体細胞誘導因子の情報を管理してもよい。因子保存部２１４及びポンプ２１６等が、誘導因子送液機構を構成している。因子導入装置としての因子導入部２１３において、体細胞誘導因子が、例えばＲＮＡリポフェクション法によって細胞に導入され、誘導因子導入細胞が作製される。ただし、誘導因子のトランスフェクションの方法は、ＲＮＡリポフェクション法に限定されない。例えば、体細胞誘導因子を含むセンダイウイルスベクターを用いてもよい。あるいは、体細胞誘導因子がタンパク質であってもよい。また、誘導因子のトランスフェクションは、数日にわたって複数回行ってもよい。

誘導因子導入細胞は、導入細胞送液路２１７及びポンプ２１８を介して、細胞作製装置の一部としての体細胞培養器２１９に送られる。導入細胞送液路２１７は、例えば、温度透過性かつＣＯ_２透過性である。体細胞培養器２１９には、細胞に体細胞誘導因子が導入されてから最初の数日間、薬剤含有細胞培地を含む細胞培地保存部２２０から、培地送液路２２１及びポンプ２２２を介して、薬剤含有細胞培地が補給される。薬剤含有細胞培地は、薬剤耐性因子が導入されていない細胞を殺滅する薬剤を含んでいる。培地送液路２２１は、例えば、温度透過性かつＣＯ_２透過性である。薬剤含有細胞培地保存部２２０には、バーコード等の識別子を付けて、薬剤含有細胞培地の情報を管理してもよい。薬剤含有細胞培地保存部２２０、培地送液路２２１、及びポンプ２２２は、培地補給装置を構成している。

その後、体細胞培養器２１９には、目的とする体細胞に適した体細胞培地を含む体細胞培地保存部２２３から、培地送液路２２４及びポンプ２２５を介して、体細胞培地が補給される。体細胞培地保存部２２３には、バーコード等の識別子を付けて、体細胞培地の情報を管理してもよい。培地送液路２２４は、例えば、温度透過性かつＣＯ_２透過性である。体細胞培地保存部２２３、培地送液路２２４、及びポンプ２２５は、培地補給装置を構成している。

薬剤含有細胞培地保存部２２０及び体細胞培地保存部２２３は、例えば、冷蔵保存部２５９で４℃等の低温で冷蔵保存されていてもよい。薬剤含有細胞培地保存部２２０及び体細胞培地保存部２２３から送られる培地は、例えば、冷蔵保存部２５９の外の加熱器で３７℃に昇温されてから培養器に送れてもよい。あるいは、低温保存されていた培地は、送液路を進む間に３７℃に昇温するよう、送液路の周囲の温度を設定してもよい。体細胞培養器２１９内の古くなった培地は、廃液送液路２２６及びポンプ２２７を介して、廃液保管部２２８に送られる。廃液保管部２２８には、バーコード等の識別子を付けて、廃液の情報を管理してもよい。

体細胞培養器２１９で培養された体細胞は、導入細胞送液路２２９、ポンプ２３０、及び任意で細胞塊分割器２３１を介して、細胞作製装置の一部としての第１の拡大培養器２３２へ送られる。細胞塊分割器２３１を通過することにより、細胞塊は、より小さな細胞塊に分割される。細胞塊が形成されない場合は、細胞塊分割器２３１は省略してもよい。第１の拡大培養器２３２には、体細胞培地を含む体細胞培地保存部２２３から、培地送液路２３３及びポンプ２３４を介して、体細胞培地が補給される。導入細胞送液路２２９及び培地送液路２３３は、例えば、温度透過性かつＣＯ_２透過性である。体細胞培地保存部２２３、培地送液路２３３、及びポンプ２３４は、培地補給装置を構成している。

第１の拡大培養器２３２内の古くなった培地は、廃液送液路２３５及びポンプ２３６を介して、廃液保管部２２８に送られる。

第１の拡大培養器２３２で培養された体細胞は、導入細胞送液路２３７、ポンプ２３８、及び任意で細胞塊分割器２３９を経て、細胞作製装置の一部としての第２の拡大培養器２４０へ送られる。細胞塊分割器２３９を通過することにより、細胞塊は、より小さな細胞塊に分割される。細胞塊が形成されない場合は、細胞塊分割器２３９は省略してもよい。第２の拡大培養器２４０には、体細胞培地を含む体細胞培地保存部２２３から、培地送液路２４１及びポンプ２４２を介して、体細胞培地が補給される。導入細胞送液路２３７及び培地送液路２４１は、例えば、温度透過性かつＣＯ_２透過性である。体細胞培地保存部２２３、培地送液路２４１、及びポンプ２４２は、培地補給装置を構成している。

第２の拡大培養器２４０内の古くなった培地は、廃液送液路２４３及びポンプ２４４を介して、廃液保管部２２８に送られる。

第２の拡大培養器２４０で培養された体細胞は、導入細胞送液路２４５及びポンプ２４６を経て、溶液置換器２４７へ送られる。溶液置換器２４７は、例えば図６に示す構成を備えていてもよい。図７に示す溶液置換器２４７内において、体細胞はフィルターで保持され、培地は、廃液送液路２４８及びポンプ２４９を介して、廃液保管部２２８に送られる。

ポンプ２４９の駆動停止により廃液送液路２４８内の溶液の流動を停止した後、あるいは弁等で廃液送液路２４８を閉じた後、溶液置換器２４７には、凍結保存液を含む凍結保存液保存部２５０から、送液路２５１及びポンプ２５２を介して、凍結保存液が入れられる。これにより、凍結保存液中に体細胞が分散する。

体細胞を分散させた凍結保存液は、パッケージ装置の一部としての送液路２５３及びポンプ２５４を介して、凍結保存容器２５５内に送られる。凍結保存容器２５５は、低温保管庫２５６に入れられている。低温保管庫２５６には、液体窒素保管庫２５７から送液路２５８を介して、例えば−８０℃の液体窒素が送られる。これにより、凍結保存容器２５５内の体細胞が凍結させられる。ただし、体細胞の凍結は、液体窒素に依らなくともよい。例えば、低温保管庫２５６が、圧縮式冷凍庫、吸収式冷凍庫、あるいはペルチェ式冷凍庫等の冷凍庫であってもよい。また、凍結が不要である場合は、体細胞を凍結しなくともよい。

上述した送液路には、適宜、逆流防止弁を設けてもよい。上述した送液路、単核球分離部２０３、単核球精製フィルター２１０、因子導入部２１３、体細胞培養器２１９、第１の拡大培養器２３２、第２の拡大培養器２４０、及び溶液置換器２４７等は、樹脂等からなる例えばカセット状のケース２６０に格納されている。ケース２６０は、例えば、滅菌処理可能な耐熱性材料からなる。ケース２６０内は、例えば、３７℃、ＣＯ_２濃度５％のように、細胞培養に適した環境にされる。培地が流れる送液路は、例えば、ＣＯ_２透過性材料からなる。ただし、ケース２６０はカセット状に限られない。例えば、可撓性のバックであってもよい。また、上述した送液路、単核球分離部２０３、単核球精製フィルター２１０、因子導入部２１３、体細胞培養器２１９、第１の拡大培養器２３２、第２の拡大培養器２４０、及び溶液置換器２４７等は、複数のケースに分割されて格納されてもよい。

ケース２６０は、筐体２００内に配置される。ポンプ、血液保存部２０１、分離剤保存部２０５、因子保存部２１４、薬剤含有細胞培地保存部２２０、体細胞培地保存部２２３、廃液保管部２２８、凍結保存容器２５５、低温保管庫２５６、及び液体窒素保管庫２５７は、筐体２００の内部かつケース２６０の外部に配置される。

ケース２６０と、筐体２００は、例えば、互いに勘合する勘合部を備える。そのため、ケース２６０は、筐体２００内の所定の位置に配置される。また、筐体２００内において、ポンプ、血液保存部２０１、分離剤保存部２０５、因子保存部２１４、薬剤含有細胞培地保存部２２０、体細胞培地保存部２２３、廃液保管部２２８、凍結保存容器２５５、低温保管庫２５６、及び液体窒素保管庫２５７は、所定の位置に配置される。ケース２６０が筐体２００内の所定の位置に配置されると、ケース２６０内の送液路は、ポンプ、血液保存部２０１、分離剤保存部２０５、因子保存部２１４、薬剤含有細胞培地保存部２２０、体細胞培地保存部２２３、廃液保管部２２８、凍結保存容器２５５、低温保管庫２５６、及び液体窒素保管庫２５７と接する。

例えば、ケース２６０及びその内包物は使い捨て可能であり、体細胞の凍結が完了した後は、廃棄して、新しいものと交換してもよい。あるいは、ケース２６０及びその内包物を再利用する場合は、ケース２６０にバーコード等の識別子を付け、使用回数等を管理してもよい。

以上説明した実施の形態に係る体細胞製造システムによれば、人を介さずに、導入前細胞から自動的に体細胞を製造することが可能である。

（他の実施の形態）
上記のように、本発明を実施の形態によって記載したが、この開示の一部をなす記述及び図面はこの発明を限定するものであると理解するべきではない。この開示から当業者には様々な代替実施の形態、実施の形態及び運用技術が明らかになるはずである。例えば、因子導入装置３０は、レトロウイルス、レンチウイルス、及びセンダイウイルス等のウイルスベクターや、プラスミドを用いるトランスフェクション、あるいはタンパク質トランスフェクションにより、細胞を誘導してもよい。あるいは、因子導入装置３０は、エレクトロポレーションにより細胞を誘導してもよい。また、導入前細胞送液路２０、導入細胞送液路３１、第１体細胞送液路５１、拡大培養送液路７１、第２体細胞送液路７２、及びパッケージ前細胞流路９１はマイクロフルイディクス技術により基板上に設けられていてもよい。この様に、本発明はここでは記載していない様々な実施の形態等を包含するということを理解すべきである。

（実施例１）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされた１２ウェルディッシュを用意し、各ウェルに１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むフィーダーフリー培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた。ＲＯＣＫ阻害剤は、細胞死を抑制する。

ｉＰＳ細胞を組織・培養細胞の剥離／分離／分散溶液（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分散させ、１２ウェルディッシュにまいた。トランスフェクトされる細胞は、１ウェルあたり、４×１０^５個の密度でまかれた。なお、１ウェルの底面積は４ｃｍ^２であった。トランスフェクトされないコントロール細胞は、１ウェルあたり、２×１０^５個の密度でまかれた。その後、細胞を、フィーダーフリー培地中で２４時間培養した。この際、温度は３７℃、ＣＯ_２濃度は５％、酸素濃度は２５％以下であった。

１．２５ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、０．５μＬのＰｌｕｒｉｔｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、２μＬの濃度が１００ｎｇ／μＬのＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、を混合し、トランスフェクション培地を用意した。トランスフェクションの前に各ウェルのフィーダーフリー培地をトランスフェクション培地に交換し、３７℃で２時間、細胞を培養した。

緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）ｍＲＮＡ（ＴｒｉLｉｎｋ）と、を用意した。ｍＲＮＡは、Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップされ、ポリアデニル化されており、５−メチルシチジン及びプソイドウリジンで置換されていた。

さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、をそれぞれウェルの数だけ用意した。

チューブＡに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。その後、室温で１０分間、第１の反応液が混合するよう、チューブＡを軽くたたいた。

チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、５００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ （Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。

第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で５分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をそれぞれのウェルに加え、３７℃で一晩静置した。これにより、それぞれのウェルに、５００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡが加えられた。

その翌日に蛍光顕微鏡を用いて細胞を観察したところ、図８、図９に示すように、トランスフェクションした細胞の発色が確認された。さらに、図１０に示すように、細胞の生存率が確認された。このことから、リポフェクション試薬とＲＮＡを用いてｉＰＳ細胞にｍＲＮＡを導入し、タンパク質を発現させることが可能である事が示された。

（実施例２）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされた１２ウェルディッシュを用意し、各ウェルに１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むフィーダーフリー培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた。ＲＯＣＫ阻害剤は、細胞死を抑制する。

ｉＰＳ細胞を組織・培養細胞の剥離／分離／分散溶液（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分散させ、１２ウェルディッシュにまいた。トランスフェクトされる細胞は、１ウェルあたり、４×１０^５個の密度でまかれた。トランスフェクトされないコントロール細胞は、１ウェルあたり、２×１０^５個の密度でまかれた。その後、細胞を、フィーダーフリー培地中で２４時間培養した。

１．２５ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、０．５μＬのＰｌｕｒｉｔｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、２μＬの濃度が１００ｎｇ／μＬのＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、を混合し、トランスフェクション培地を用意した。トランスフェクションの前に各ウェルのフィーダーフリー培地をトランスフェクション培地に交換し、３７℃で２時間、細胞を培養した。

Ｎｇｎ２−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ） ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と、を用意した。ｍＲＮＡは、Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップされ、ポリアデニル化されており、５−メチルシチジン及びプソイドウリジンで置換されていた。また、ｍＲＮＡは、シリカ膜で精製されており、ｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）とともに、ｐＨ６の１ｍｍｏｌ／Ｌのクエン酸ナトリウムを溶媒とする溶液によってされる。さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、を、それぞれウェルの数だけ用意した。

チューブＡに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。その後、室温で１０分間、第１の反応液が混合するよう、チューブＡを軽くたたいた。

チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに５００ｎｇのＮｇｎ２−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と１５００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。

第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で５分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をそれぞれのウェルに加え、３７℃で一晩静置した。これにより、それぞれのウェルに、５００ｎｇのＮｇｎ２ｍＲＮＡと、１００ｎｇのＧＦＰｍＲＮＡが加えられた。

ｍＲＮＡ導入後、一日目に観察したところ、図１１に示すように、細胞の発色が確認された。

その後の２日間、１日ごとに、培地を、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）と、１ｍｇ／Ｌの濃度で抗生物質（ピューロマイシン）を含む、神経分化培地（Ｎ２／ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で完全に交換し、ｍＲＮＡがトランスフェクトされた細胞をセレクションした。３日目に、培地を、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含む神経分化培地（Ｎ２／ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で置き換えた。その後、７日目までに、同じ培地で半量ずつ培地交換した。

７日目にウェルから培地を除き、１ｍＬのＰＢＳで洗った。その後、４％ＰＦＡを入れ１５分４℃で反応させ、固定した。その後ＰＢＳで２回洗浄後、５％ＣＣＳ，０．１％トライトン ｉｎ ＰＢＳ培地で一次抗体を希釈し、５００μＬ添加した。一次抗体としては、ウサギ抗ヒトＴｕｊ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ８４５５０１）及びマウス抗ラット及びヒトＮｇｎ２抗体（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を利用し、ウサギ抗ヒトＴｕｊ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ８４５５０１）をバッファで１／１０００希釈、又はマウス抗ラット及びヒトＮｇｎ２抗体（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）をバッファで１／７５希釈し、さらにＤＡＰＩをバッファで１／１００００希釈したものを各ウェルに添加し、室温で一時間反応させた。Ｔｕｊ１抗体は、β−ＩＩＩＴｕｂｕｌｉｎに対する抗体である。

室温で一時間反応後、各ウェルに１ｍＬのＰＢＳを添加し、ウェルによくなじませた後、ＰＢＳを廃棄した。再度、ＰＢＳを添加、廃棄し、透過バッファ中に、１／１０００希釈のロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５複合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を１／１０００希釈のロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７複合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ）を含む、二次抗体含有透過バッファを５００μＬずつ添加し、室温で３０分間反応させた。

室温で３０分反応後、細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察し、蛍光を発している細胞をカウントした。

図１２は、Ｎｇｎ２−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡをリポフェクションを用いて導入し、その後、ピューロマイシンを添加し２日間培養後、さらにピューロマイシンを添加せず５日間培養して、Ｔｕｊｉ１で染色して蛍光顕微鏡で観察した写真である。図１３は上記の手順によって各トランスフェクション試薬を利用して、Ｎｇｎ２−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡをトランスフェクションし、７日目にＴＵＪ−１陽性細胞の割合を示したものである。これらの結果から、神経細胞が誘導されたことが示された。

（実施例３）
可溶化基底膜調製品（Ｍａｔｒｉｇｅｌ、Ｃｏｒｎｉｎｇ）でコートされた１２ウェルディッシュを用意し、各ウェルに１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ（Ｒｈｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｃｏｉｌｅｄ−ｃｏｉｌ ｆｏｒｍｉｎｇ ｋｉｎａｓｅ／Ｒｈｏ結合キナーゼ）阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）を含むフィーダーフリー培地（ｍＴｅＳＲ（登録商標）１、ＳＴＥＭＣＥＬＬ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を入れた。

ｉＰＳ細胞を組織・培養細胞の剥離／分離／分散溶液（Ａｃｃｕｔａｓｅ、Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で分散させ、１２ウェルディッシュにまいた。トランスフェクトされる細胞は、１ウェルあたり、４×１０^５個の密度でまかれた。トランスフェクトされないコントロール細胞は、１ウェルあたり、１×１０^５個の密度でまかれた。その後、細胞を、フィーダーフリー培地中で２４時間培養した。この際、温度は３７℃、ＣＯ_２濃度は５％、酸素濃度は２５％以下あった。

１．２５ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、０．５μＬのＰｌｕｒｉｔｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、２μＬの濃度が１００ｎｇ／μＬのＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）と、を混合し、Ｂ１８Ｒ含有トランスフェクション培地を用意した。また、１．２５ｍＬのゼノフリー培地（Ｐｌｕｒｉｔｏｎ、ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、０．５μＬのＰｌｕｒｉｔｏｎ Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ（ＳＴＥＭＧＥＮＴ）と、を混合し、Ｂ１８Ｒ非含有トランスフェクション培地を用意した。

トランスフェクションの前に各ウェルのフィーダーフリー培地をＢ１８Ｒ含有トランスフェクション培地又はＢ１８Ｒ非含有トランスフェクション培地に交換し、３７℃で２時間、細胞を培養した。

Ｎｇｎ２−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と、ＧＦＰ ｍＲＮＡ （Ｔｒｉｌｉｎｋ）と、を用意した。ｍＲＮＡは、Ａｎｔｉ−Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｃａｐ Ａｎａｌｏｇ（ＡＲＣＡ）でキャップされ、ポリアデニル化されており、５−メチルシチジン及びプソイドウリジンで置換されていた。

さらに、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＡと、１．５ｍＬのマイクロ遠心分離チューブＢと、を、それぞれウェルの数だけ用意した。

チューブＡに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに１．８７５μＬのｍＲＮＡ導入用試薬（Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ ＭｅｓｓｅｎｇｅｒＭａｘ（登録商標）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加え、よく混ぜて第１の反応液とした。その後、室温で１０分間、第１の反応液が混合するよう、チューブＡを軽くたたいた。

チューブＢに、６２．５μＬの低血清培地（Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ（登録商標）、Ｇｉｂｃｏ）を入れ、そこに５００ｎｇのＮｇｎ２−Ｔ２Ａ−Ｐｕｒｏ ｍＲＮＡ（Ｔｒｉｌｉｎｋ）と１００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡ （Ｔｒｉｌｉｎｋ） を加え、よく混ぜて第２の反応液とした。

第２の反応液をチューブＡ内の第１の反応液に加えて混合反応液とし、その後、室温で５分間、リポソームが形成されるよう、チューブＡを軽くたたいた。次に、混合反応液をそれぞれのウェルに加え、３７℃で一晩静置した。これにより、それぞれのウェルに、５００ｎｇのＮｇｎ２ ｍＲＮＡと、１００ｎｇのＧＦＰ ｍＲＮＡが加えられた。また、図１４に示すように、トランスフェクションを１回、２回、３回行ったものを用意した。

その後の２日間、１日ごとに、培地を、１０μｍｏｌ／Ｌの濃度でＲＯＣＫ阻害剤（Ｓｅｌｌｅｃｋ）と、１ｍｇ／Ｌの濃度で抗生物質（ピューロマイシン）を含む、神経分化培地（Ｎ２／ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で完全に交換し、ｍＲＮＡがトランスフェクトされた細胞をセレクションした。３日目に、培地を、２００ｎｇ／ｍＬの濃度でＢ１８Ｒ組み換えタンパク質含有液（ｅＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）を含む神経分化培地（Ｎ２／ＤＭＥＭ／Ｆ１２／ＮＥＡＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で置き換えた。その後、７日目までに、同じ培地で半量ずつ培地交換した。

７日目にウェルから培地を除き、１ｍＬのＰＢＳで洗った。その後、４％ＰＦＡを入れ１５分４℃で反応させ、固定した。その後ＰＢＳで２回洗浄後、ＰＢＳ中に５％のＣＣＳ及び０．１％のＴｒｉｔｏｎＸを含む透過バッファで希釈した一次抗体を各ウェルに５０μＬずつ添加し、室温で１時間反応させた。一次抗体は、マウス抗ヒトＴｕｊ１抗体（ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ ８４５５０１）を１：１０００で、マウス抗ヒトＮｇｎ２抗体（Ｒ ａｎｄ Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ， ＭＡＢ３３１４−ＳＰ）を１：１５０でありとなるよう透過バッファで希釈したものであり、さらにＤＡＰＩが１：１０，０００になるよう添加した。

一時間後、各ウェルに１ｍＬのＰＢＳを添加し、ウェルによくなじませた後、ＰＢＳを廃棄した。再度、ＰＢＳを添加、廃棄し、透過バッファ中にロバ抗マウスＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５複合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａ−２１４２８）を１：１０００で、ロバ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）二次抗体Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７複合体（Ｔｈｅｒｍｏｆｉｓｈｅｒ、Ａ３１５７３）を１：１０００で含む、二次抗体含有透過バッファを５００μＬ添加し、室温で３０分反応させた。

細胞をＰＢＳで２回洗浄し、蛍光顕微鏡で観察し、蛍光を発している細胞をカウントした。その結果、図１５に示すように、ｍＲＮＡを一回だけトランスフェクションしたものは、９日目にはＧＦＰはほとんど発現していなかった。その一方で、ｍＲＮＡを３回トランスフェクションしたものは、９日目においてもＧＦＰが発現していた。このことから、ｍＲＮＡは細胞内で分解され、タンパク質の発現は一過性であることが明らかとなった。

以上示したように、ｉＰＳ細胞を播種後、ＲＮＡをトランスフェクションして数日で神経細胞に誘導できることが示された。また、短期間で神経細胞に誘導できることから、細胞へのＲＮＡの挿入時に伴う免疫反応に伴う細胞死を抑制するために通常使用されるＢ１８Ｒタンパク質を培地に含めなくともよいことが示された。

２・・・チューブ、１０・・・分離装置、２０・・・導入前細胞送液路、２１・・・誘導因子送液機構、３０・・・因子導入装置、３１・・・導入細胞送液路、４０・・・細胞作製装置、５０・・・体細胞培養装置、５１・・・体細胞送液路、６０・・・分割機構、７０・・・拡大培養装置、７１・・・拡大培養送液路、７２・・・体細胞送液路、８０・・・分割機構、９０・・・体細胞搬送機構、９１・・・パッケージ前細胞流路、１００・・・パッケージ装置、１０１・・・溶液置換器、１０２・・・フィルター、１０３・・・送液流路、１０４・・・送液流路、１０５・・・排出流路、１０６・・・排出流路、１１０・・・凍結保存液送液機構、２００・・・筐体、２０１・・・血液保存部、２０２・・・血液送液路、２０３・・・単核球分離部、２０４・・・ポンプ、２０５・・・分離剤保存部、２０６・・・送液路、２０７・・・ポンプ、２０８・・・単核球送液路、２０９・・・ポンプ、２１０・・・単核球精製フィルター、２１１・・・導入前細胞送液路、２１２・・・ポンプ、２１３・・・因子導入部、２１４・・・因子保存部、２１５・・・因子送液路、２１６・・・ポンプ、２１７・・・導入細胞送液路、２１８・・・ポンプ、２１９・・・体細胞培養器、２２０・・・細胞培地保存部、２２１・・・培地送液路、２２２・・・ポンプ、２２３・・・体細胞培地保存部、２２４・・・培地送液路、２２５・・・ポンプ、２２６・・・廃液送液路、２２７・・・ポンプ、２２８・・・廃液保管部、２２９・・・導入細胞送液路、２３０・・・ポンプ、２３１・・・細胞塊分割器、２３２・・・拡大培養器、２３３・・・培地送液路、２３４・・・ポンプ、２３５・・・廃液送液路、２３６・・・ポンプ、２３７・・・導入細胞送液路、２３８・・・ポンプ、２３９・・・細胞塊分割器、２４０・・・拡大培養器、２４１・・・培地送液路、２４２・・・ポンプ、２４３・・・廃液送液路、２４４・・・ポンプ、２４５・・・導入細胞送液路、２４６・・・ポンプ、２４７・・・溶液置換器、２４８・・・廃液送液路、２４９・・・ポンプ、２５０・・・凍結保存液保存部、２５１・・・送液路、２５２・・・ポンプ、２５３・・・送液路、２５４・・・ポンプ、２５５・・・凍結保存容器、２５６・・・低温保管庫、２５７・・・液体窒素保管庫、２５８・・・送液路、２５９・・・冷蔵保存部、２６０・・・ケース、３０１・・・バッグ、３０２・・・バッグ

Claims (26)

1. 導入前細胞を含む溶液が通過する導入前細胞送液路と、
   前記導入前細胞送液路に接続され、前記導入前細胞に体細胞誘導因子を導入して誘導因子導入細胞を作製する因子導入装置と、
   前記誘導因子導入細胞を培養して体細胞を作製する細胞作製装置と、
   前記因子導入装置から前記細胞作製装置に前記誘導因子導入細胞を含む溶液を送るための導入細胞送液路と、
   を備える体細胞製造システム。
2. 前記導入前細胞送液路、前記因子導入装置、及び前記細胞作製装置を格納する筐体をさらに備える、請求項１に記載の体細胞製造システム。
3. 前記体細胞が、多能性幹細胞を除く、請求項１又は２に記載の体細胞製造システム。
4. 前記体細胞が、分化細胞を含む、請求項１又は２に記載の体細胞製造システム。
5. 前記体細胞が、体性幹細胞を含む、請求項１又は２に記載の体細胞製造システム。
6. 前記体細胞が、神経系細胞を含む、請求項１又は２に記載の体細胞製造システム。
7. 前記導入前細胞が、多能性幹細胞を含む、請求項１又は２に記載の体細胞製造システム。
8. 前記導入前細胞が、体性幹細胞を含む、請求項１又は２に記載の体細胞製造システム。
9. 前記導入前細胞が、分化した体細胞を含む、請求項１又は２に記載の体細胞製造システム。
10. 前記細胞作製装置が、
    前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞を培養する体細胞培養装置と、
    前記体細胞培養装置で樹立された体細胞を拡大培養する拡大培養装置と、
    前記体細胞培養装置から前記拡大培養装置に前記体細胞を含む溶液を送るための送液路と、
    を備え、
    前記導入細胞送液路が、前記因子導入装置から前記体細胞培養装置に前記誘導因子導入細胞を含む溶液を送り、
    前記体細胞培養装置が、前記誘導因子導入細胞に培地を補給する第１の培地補給装置を備え、
    前記拡大培養装置が、前記体細胞に培地を補給する第２の培地補給装置を備える、
    請求項１から９のいずれか１項に記載の体細胞製造システム。
11. 前記体細胞培養装置が、薬剤耐性因子を導入されなかった細胞を死滅させる薬剤を含む溶液を供給する薬剤補給装置をさらに備える、請求項１０に記載の体細胞製造システム。
12. 前記因子導入装置が、
    前記導入前細胞送液路に接続された因子導入部と、
    前記体細胞誘導因子を保存する因子保存部と、
    前記因子保存部から前記導入前細胞送液路又は前記因子導入部に前記体細胞誘導因子を流すための因子送液路と、
    前記因子送液路内の液体を流すためのポンプと、
    を備える、請求項１から１１のいずれか１項に記載の体細胞製造システム。
13. 前記体細胞誘導因子が、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又はタンパク質である、請求項１２に記載の体細胞製造システム。
14. 前記因子導入部において、ＲＮＡリポフェクションにより、前記導入前細胞に前記体細胞誘導因子が導入される、請求項１２に記載の体細胞製造システム。
15. 前記体細胞誘導因子がベクターに組み込まれている、請求項１２に記載の体細胞製造システム。
16. 前記ベクターがセンダイウイルスベクターである、請求項１５に記載の体細胞製造システム。
17. 前記細胞作製装置で作製された前記体細胞をパッケージするパッケージ装置をさらに備え、前記筐体が前記パッケージ装置を格納する、請求項２に記載の体細胞製造システム。
18. 筒状部材と、
    前記筒状部材の内部に配置された液体透過フィルターと、
    を備える溶液置換器であって、
    前記筒状部材に、
    前記液体透過フィルター上に、前記細胞作製装置で作製された前記体細胞を含む溶液を導入するための体細胞導入孔と、
    前記液体透過フィルター上に、置換溶液を導入するための置換溶液導入孔と、
    前記液体透過フィルター上に、前記体細胞を含む置換溶液を流出するための体細胞流出孔と、
    前記液体透過フィルターを透過した溶液が流出する廃液流出孔と、
    が設けられている溶液置換器と、
    前記細胞作製装置から前記溶液置換器に前記体細胞を含む溶液を送るための送液路と、
    をさらに備える、請求項１から１７のいずれか１項に記載の体細胞製造システム。
19. 前記廃液流出孔に接続された廃液送液路をさらに備え、前記体細胞を含む溶液の溶液を廃棄する際に前記廃液送液路における溶液の流動が許容され、前記置換溶液中に前記体細胞を分散させる際に前記廃液送液路における溶液の流動が許容されない、請求項１８に記載の体細胞製造システム。
20. 前記置換溶液が凍結保存液である、請求項１８又は１９に記載の体細胞製造システム。
21. 血液から前記導入前細胞を分離する分離装置をさらに備え、前記分離装置で分離された前記導入前細胞を含む溶液が前記導入前細胞送液路を通過する、請求項１に記載の体細胞製造システム。
22. 前記因子導入装置から前記導入細胞送液路に前記誘導因子導入細胞を含む溶液を送り出すポンプをさらに備える、請求項１に記載の体細胞製造システム。
23. 前記体細胞培養装置から前記拡大培養装置に前記体細胞を含む溶液を送るための送液路に前記体細胞を含む溶液を送り出すポンプをさらに備える、請求項１０に記載の体細胞製造システム。
24. 前記細胞作製装置から前記溶液置換器に前記体細胞を含む溶液を送るための送液路に前記体細胞を含む溶液を送り出すポンプをさらに備える、請求項１８に記載の体細胞製造システム。
25. 前記細胞作製装置が、前記誘導因子導入細胞を浮遊培養して体細胞を作製する、請求項１から２４のいずれか１項に記載の体細胞製造システム。
26. 前記体細胞培養装置が、前記因子導入装置で作製された誘導因子導入細胞を浮遊培養し、前記拡大培養装置が、前記体細胞培養装置で樹立された体細胞を拡大浮遊培養する、
    請求項１０又は１１に記載の体細胞製造システム。