JP6501353B2 - ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤 - Google Patents

Description

本発明は、カルパインインヒビターを有効成分とする、スフィンゴシルフォスフォリルコリン（sphingosylphosphorylcholine：以下、「ＳＰＣ」ともいう）／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤や、ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路に依存する血管攣縮の抑制剤に関する。

血管平滑筋の異常収縮である血管攣縮は、狭心症、心筋梗塞、脳血管障害等の重篤な疾病を引き起こし、上記疾病患者の合計死亡数は、がんとほぼ並んで我が国の死因の第２位となり、しかも突然死の主原因である。ここで、正常血圧維持に必要な血管平滑筋の正常収縮と異常収縮とのシグナル伝達機構は異なり、前者は細胞質Ｃａ²⁺濃度の上昇を必要とするが、後者は細胞質Ｃａ²⁺濃度に依存しない。しかしながら、異常収縮の原因分子が不明であるため、異常収縮に対する従来の予防及び治療薬として、原因分子が明らかな正常収縮のＣａ²⁺シグナル経路を阻害するＣａ拮抗薬等が主に使われ、その結果、難治例や、低血圧等の副作用が生じていた。

本発明者らは、ＳＰＣによりＦｙｎが血管平滑筋細胞膜壁上のメンブレンラフトと呼ばれる構造に結合すると共に活性化することで、Ｒｈｏキナ−ゼを活性化することが血管攣縮に関与していることを見いだした（非特許文献１〜４参照）。更に、かかるＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路を特異的に遮断する物質として魚油に多く含まれるエイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）を見いだした（特許文献１参照）。このＥＰＡは血管異常収縮の特効薬としての性質を備えているが、原料である魚は海洋汚染等により安定供給が困難になる可能性があるという問題や、ＥＰＡは投与経路が経口に限られ、血管内投与ができず、急性発症で重篤な患者への投与が困難であるという問題があった。したがって、ＥＰＡと同等にＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路を阻害することで異常収縮を特異的に抑制でき、かつ、血管内投与が可能な物質の開発が求められていた。

一方、カルパイン（ＥＣ ３．４．２２．１７）は、カルシウムイオンで活性化され、蛋白質を限定的に切断してその構造や機能を変化させる細胞内プロテアーゼであり、種々の生理学的過程で重要な役割を有すると考えられている。このカルパインを阻害することで脳血管痙攣（脳血管攣縮）等を治療することが提案されているが（特許文献２参照）、かかる治療は、脳血管痙攣（脳血管攣縮）の結果生じる虚血による臓器障害を抑制するものであって、ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路を阻害して脳血管痙攣（脳血管攣縮）そのものを抑制するものではなかった。

特開２００７−１１２７８４号公報 特開２０１０−００６８３４号公報

月刊バイオインダストリー２００３年１１月号「エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）による血管攣縮の予防効果」 Nakao F, Kobayashi S.et al. (2002) Circ.Res. 91：953-960 Shirao S, Kobayashi S.et al. (2002) Circ.Res. 91：112-119 Somlyo A.V. (2002) Circ.Res. 91：83-84

本発明の課題は、ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤や、ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路に依存する血管攣縮の抑制剤を提供することにある。

本発明者らは、ＦｙｎがＲｈｏキナーゼを活性化する機構を解明するため、高感度タンデム型質量分析計、及び、独自に開発したＲＮＡ干渉と自動細胞イメージングシステムを組み合わせたハイスループットスクリーニングシステムを用いて、Ｆｙｎの下流分子を探索し、その結果、候補分子の一つとして、細胞骨格のうち中間径フィラメントを構成するビメンチンを同定した。

さらに、血管平滑筋細胞及び組織をＳＰＣで刺激すると、ビメンチンはＮ末端が切断・除去される限定分解を受けていることが明らかとなった。限定分解のパターンから、蛋白分解酵素であるカルパインの関与が考えられ、カルパインの活性を測定したところ、実際にＳＰＣ刺激後にカルパインの活性が上昇していた。そこで、カルパインのＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路への関与について、カルパインインヒビターを用いて検討した。

その結果、カルパインインヒビターは、ＳＰＣの刺激による血管攣縮を特異的に抑制する一方で、カルシウム依存性の正常収縮を全く抑制しなかったことから、カルパインインヒビターはＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路を阻害することを見いだし、本発明を完成した。

すなわち、本発明は以下に示すとおりのものである。
（１）カルパインインヒビターを有効成分とする、スフィンゴシルフォスフォリルコリン／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤。
（２）カルパインインヒビターが、非ペプチド性カルパインインヒビターであることを特徴とする上記（１）記載の阻害剤。
（３）非ペプチド性カルパインインヒビターが、２−メルカプト−３−（４−ヨードフェニル）プロパン酸であることを特徴とする上記（２）記載の阻害剤。
（４）カルパインインヒビターを有効成分とする、スフィンゴシルフォスフォリルコリン／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路に依存する血管攣縮の抑制剤。
（５）カルパインインヒビターが、非ペプチド性カルパインインヒビターであることを特徴とする上記（４）記載の抑制剤。
（６）非ペプチド性カルパインインヒビターが、２−メルカプト−３−（４−ヨードフェニル）プロパン酸であることを特徴とする上記（５）記載の抑制剤。

本発明の阻害剤により、ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路を阻害することができ、その結果、血管攣縮を抑制することが可能となる。

ヒト冠状動脈平滑筋細胞をＳＰＣで刺激した後の細胞溶解液におけるウェスタンブロット解析の結果を示す図である。 ブタ冠状動脈平滑筋組織をＳＰＣで刺激した後の細胞溶解液におけるウェスタンブロット解析の結果を示す図である。 ヒト冠状動脈平滑筋細胞をＳＰＣで刺激した後の細胞溶解液におけるカルパインの活性を測定した結果を示す図である。 血管異常収縮（上段）及び正常収縮（下段）に対するカルパインインヒビターの効果を調べた結果を示す図である。

本発明のＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤としては、カルパインインヒビターを有効成分としていれば特に制限されず、ここで「カルパインインヒビター」とは、カルパインの酵素活性を阻害する物質を意味する。

本発明の他の態様としては、カルパインインヒビターを対象に投与することを特徴とするＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路の阻害方法や、ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路阻害剤として使用するためのカルパインインヒビターや、カルパインインヒビターの、ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路阻害剤の調製における使用を挙げることができる。

本発明のさらなる態様としては、カルパインインヒビターを対象に投与することを特徴とするＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路に依存する血管攣縮の抑制方法や、ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路に依存する血管攣縮の抑制剤として使用するためのカルパインインヒビターや、カルパインインヒビターの、ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路に依存する血管攣縮の抑制剤の調製における使用を挙げることができる。

本発明において、「ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路」とは、ＳＰＣによりチロシンキナーゼであるＦｙｎが血管平滑筋細胞膜壁上のメンブレンラフトと呼ばれる構造に結合すると共に活性化することでＲｈｏキナ−ゼが活性化されることにより、ミオシン軽鎖のリン酸化が亢進する一連の経路を意味する。

また、本発明のＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路に依存する血管攣縮の抑制剤としては、カルパインインヒビターを有効成分としていれば特に制限されず、ここで、ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路に依存する血管攣縮とは、上記ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路が関与して引き起こされる血管攣縮を意味し、プロテインキナーゼＣが関与して引き起こされる血管攣縮は含まない。

カルパインインヒビターとしては、２−メルカプト−３−（４−ヨードフェニル）プロパン酸（ＰＤ１５０６０６）、（Ｚ）−３−（５−フルオロ−１Ｈ−インドール−３−イル）−２−メルカプトプロペン酸（ＰＤ１５１７４６）等の水溶性の非ペプチド性カルパインインヒビターや、カルペプチン、カルパインインヒビターＩ、カルパインインヒビターII、カルパインインヒビターIII、カルパインインヒビターIV、カルパインインヒビターＶ、カルパインインヒビターVI、カルパインインヒビターVII、カルパインインヒビターXII、ロイペプチン等のペプチド性カルパインインヒビターを挙げることができるが、水溶性の非ペプチド性カルパインインヒビターを好適に挙げることができ、２−メルカプト−３−（４−ヨードフェニル）プロパン酸（ＰＤ１５０６０６）をより好適に挙げることができる。

これらカルパインインヒビターは市販されているものを購入して使用することができる。たとえば、ＰＤ１５０６０６、ＰＤ１５１７４６はＭｅｒｃｋ社、フナコシ社、シグマアルドリッチ社又はＳａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社から購入して使用することができ、カルパインインヒビターＩ、カルパインインヒビターIIはロシュ社から購入して使用することができる。

本発明のＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤や、本発明のＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路に依存する血管攣縮の抑制剤を医薬品やサプリメントとして用いる場合は、薬学的に許容される通常の担体、結合剤、安定化剤、賦形剤、希釈剤、ｐＨ緩衝剤、崩壊剤、可溶化剤、溶解補助剤、等張剤等の各種調剤用配合成分を添加することもできる。

本発明のＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路に依存する血管攣縮の抑制剤は、ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路に依存する血管攣縮が関与する病態の予防剤や症状改善剤として、さらに、かかる血管攣縮が関与する病態の予防・改善作用を有するサプリメントを生産するための薬理組成物素材として、有利に用いることができる。

本発明のＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤や、本発明のＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路に依存する血管攣縮の抑制剤の投与形態としては、溶液、乳剤、懸濁液、顆粒等の剤型を経口により投与する形態や、溶液等の剤型を皮下注、静注、筋注、腹腔内注等により非経口的に投与する形態を挙げることができるが、急性発症で重篤な患者への投与が可能である点で非経口的に投与する形態を好適に挙げることができる。

本発明のＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤の投与量としては、必要とする対象においてＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路を阻害することができる量であれば特に制限されず、例えば、有効成分のカルパインインヒビターに換算して、好ましくは１日あたり、０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与することができるが、症状、性別、年齢等に応じて、摂取量は適宜調整することができる。

また、本発明のＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路に依存する血管攣縮の抑制剤の投与量としては、必要とする対象において血管攣縮を抑制することができる量であれば特に制限されず、例えば、有効成分のカルパインインヒビターに換算して、好ましくは１日あたり、０．０１〜２００ｍｇ／ｋｇ体重、好ましくは０．１〜１００ｍｇ／ｋｇ体重の範囲で投与することができるが、症状、性別、年齢等に応じて、摂取量は適宜調整することができる。

以下に、実施例を挙げて本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲は、これら実施例により限定されるものではない。

［ＳＰＣ刺激による血管平滑筋細胞のビメンチンの限定分解］
ヒト冠状動脈平滑筋細胞をＳＰＣで刺激した後、細胞溶解液を調製し、ビメンチンのウェスタンブロット解析を行った。

（血管平滑筋細胞の細胞溶解液の調製）
ヒト冠状動脈平滑筋細胞（ＨＣＡＳＭＣｓ，ＫＵＲＡＢＯ社製）を、１００ｍｍ−ｄｉｓｈ内で増殖培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＳＧ２，ＫＵＲＡＢＯ社製）を用いて３７℃、５％ＣＯ_２で培養し、細胞密度が９０％コンフルエントの状態に達した後、培地を基礎培地（ＨｕＭｅｄｉａ−ＳＢ２，ＫＵＲＡＢＯ社製）に交換して、血清や増殖因子を除去した。２４時間後、ＨｕＭｅｄｉａ−ＳＢ２を吸引除去し、ＳＰＣ（Ｂｉｏｍｏｌ社製）を最終濃度３０μＭで溶解したＨｕＭｅｄｉａ−ＳＢ２に交換することにより、ＨＣＡＳＭＣｓをＳＰＣで刺激した。ＳＰＣ入りＨｕＭｅｄｉａ−ＳＢ２は、あらかじめ終濃度１０ｍＭでエタノールに溶解したＳＰＣストック溶液を、最終濃度３０μＭでＨｕＭｅｄｉａ−ＳＢ２に希釈することで作製した。所定の時間（５，１０，３０，６０分）が経過した後、ＳＰＣ入りＨｕＭｅｄｉａ−ＳＢ２を吸引除去し、ＨＣＡＳＭＣｓを１×ＰＢＳ（−）［１３７ｍＭ ＮａＣｌ，２．７ｍＭ ＫＣｌ，８．１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４，１．５ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４］で２回洗浄し、１×ＩＰＢｕｆｆｅｒ［１０ｍＭ Ｔｒｉｓ・ＨＣｌ（ｐＨ７．４），１５０ｍＭ ＮａＣｌ，１ｍＭ ＥＤＴＡ，１ｍＭ ＥＧＴＡ，０．２ｍＭ Ｎａ_３ＶＯ_４，１×ｐｒｏｔｅａｓｅ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ（Ｐ ８３４０：シグマアルドリッチ社製），０．５％ＮＰ−４０，１％ＴｒｉｔｏｎＸ−１００］１ｍＬを加えて細胞を溶解し、１．５ｍＬチューブに回収して細胞溶解液を調製した。ＳＰＣで刺激しなかったＨＣＡＳＭＣｓからも同様の方法で細胞溶解液を調製し、０分のサンプルとした。

（蛋白質濃度の定量）
調製した細胞溶解液の蛋白質濃度は、Ｂｒａｄｆｏｒｄ法の原理に基づき、ＢｉｏＲａｄ（登録商標）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙ（ＢｉｏＲａｄ社製）を用いて測定した。標準曲線の作成には、牛血清アルブミンを用い、５９５ｎｍにおける吸光度の測定には、分光光度計ＤＵ６４０Ｓ（ベックマン・コールター社製）用いた。

（ウェスタンブロット解析）
調製した細胞溶解液について、上記蛋白質濃度の結果に基づき、１レーンあたり８μｇ相当の細胞溶解液をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルにロードし、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）を行い、蛋白質を分子量に従って分離した。その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した蛋白質をＰＶＤＦ膜に転写した。転写後のＰＶＤＦ膜を５％ ｎｏｎｆａｔ ｍｉｌｋ ｉｎ Ｔｒｉｓ−ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ（ＴＢＳ）−０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）に室温で１時間浸して、ブロッキングを行った後、ＴＢＳ−Ｔで１０分間×２回洗浄し、ＴＢＳ−Ｔに２００倍希釈した抗ビメンチン抗体（Ｈ−８４若しくはＳ−２０，Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ社製）を用いて４℃で一晩インキュベートし、一次抗体反応を行った。反応後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間×４回洗浄し、Ｈ−８４と反応させたＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ−Ｔに２万倍希釈した抗ウサギＩｇＧ ＨＲＰ（horse radish peroxidase）抗体、Ｓ−２０と反応させたＰＶＤＦ膜は、ＴＢＳ−Ｔに２万倍希釈した抗ヤギＩｇＧ−ＨＲＰ抗体を用いて、室温１時間でインキュベートし二次抗体反応を行った。その後、ＰＶＤＦ膜をＴＢＳ−Ｔで１０分間×４回洗浄し、ＳｕｐｅｒＳｉｇｎａｌ（登録商標） Ｗｅｓｔ Ｐｉｃｏ（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社製）と室温５分間反応させて、化学発光でビメンチンを検出し、ＣｈｅｍｉＤｏｃ ＸＲＳ−Ｊ（ＢｉｏＲａｄ社製）で画像を取得した。

（結果）
結果を図１に示す。ビメンチンのＮ末端を認識する抗体（Ｈ−８４）を用いた場合には、ＳＰＣ刺激前（０分）で検出された５４ｋＤａの全長ビメンチンが、ＳＰＣ刺激後に減少していた。一方、ビメンチンのＣ末端を認識する抗体（Ｓ−２０）を用いた場合には、ＳＰＣ刺激後に、約４０ｋＤａのビメンチン断片が増加していた。これらの結果より、ヒト冠状動脈平滑筋細胞において、ビメンチンは、ＳＰＣ刺激によって、Ｎ末端が切断・除去される限定分解を受けていることが明らかとなった。

［ＳＰＣ刺激による血管平滑筋組織のビメンチンの限定分解］
ブタ冠状動脈平滑筋組織をＳＰＣで刺激した後、細胞溶解液を調製し、ビメンチンのウェスタンブロット解析を行った。

（血管平滑筋組織の細胞溶解液の調製）
ブタ冠状動脈平滑筋条片（３×３ｍｍ）を、あらかじめ混合ガス（９５％Ｏ_２，５％ＣＯ_２）でバブリングしたＫｒｅｂｓ液［１２３ｍＭ ＮａＣｌ，４．７ｍＭ ＫＣｌ，１５．５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３，１．２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４，１．２ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１．２５ｍＭ ＣａＣｌ_２，１１．５ｍＭ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ］を５ｍＬ入れた試験管に入れ、さらに３７℃，１５分バブリングした後、あらかじめ終濃度１０ｍＭでエタノールに溶解したＳＰＣストック溶液を、最終濃度３０μＭで添加し、所定の時間（５分又は３０分）３７℃でバブリングした後、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（ｃａｔ＃Ｋ２４０−１００ ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）３００μＬの中に入れ、氷水中で超音波処理（ｐｏｗｅｒ＝４０％，ｏｎ＝０．５秒，ｏｆｆ＝０．５秒，１０ｐｕｌｓｅ×４回：Ｄｉｇｉｔａｌ Ｓｏｎｉｆｉｅｒ，ＢＲＡＮＳＯＮ社製）して細胞を破砕した。その後、３０分氷中に置いた後、１０，０００×ｇ，１０分，４℃で遠心し、上清を１．５ｍＬチューブに回収して細胞溶解液を調製した。ＳＰＣで刺激しなかったブタ冠状動脈平滑筋条片からも同様の方法で細胞溶解液を調製し、０分のサンプルとした。

調製した細胞溶解液の蛋白質濃度測定、及びウェスタンブロット解析を実施例１と同様の方法で行った。ウェスタンブロット解析における抗体はＳ−２０を用いた。結果を図２に示す。ブタ冠状動脈平滑筋組織においても、ＳＰＣに刺激によって、ビメンチンの限定分解が起きていることが明らかとなった。

［ＳＰＣ刺激によるカルパイン活性の上昇］
ヒト冠状動脈平滑筋細胞を、３０μＭ ＳＰＣで５分間刺激した後に細胞溶解液を調製し、カルパイン活性を測定した。

ＨＣＡＳＭＣｓを、実施例１と同様の方法で、１００ｍｍ−ｄｉｓｈで培養後、ＳＰＣで最終濃度３０μＭ，５分間刺激した。カルパインインヒビターＰＤ１５０６０６（Ｍｅｒｃｋ社製）で前処理する細胞については、ＳＰＣ刺激３０分前に、１００ｍＭ ＰＤ１５０６０６ストック溶液（ＤＭＳＯに溶解）を最終濃度１００μＭで希釈したＨｕＭｅｄｉａ−ＳＢ２を細胞に投与し、更に、ＰＤ１５０６０６の存在下で３０μＭ，５分間ＳＰＣで刺激した。また、ＳＰＣで刺激しなかったＨＣＡＳＭＣｓをコントロールとした。その後、Ｃａｌｐａｉｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ａｓｓａｙ ｋｉｔ（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ社製）のマニュアルに従い、カルパイン活性を測定した。

即ち、ＨＣＡＳＭＣｓをトリプシン処理で１００−ｍｍ ｄｉｓｈから剥がし、１，０００ｒｐｍ，５分間遠心して回収した後、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを１００μＬ加え、２０分間時々混ぜながら氷中で静置し、１０，０００×ｇ，５分間４℃で遠心して、上清を細胞抽出液として１．５ｍＬチューブに回収した。細胞抽出液の蛋白質濃度を実施例１と同様の方法で定量し、２５μｇ相当を別の１．５ｍＬチューブに移し、Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒを加えて容量を８５μＬに合わせた。ここに、１０×Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ１０μＬ、Ｃａｌｐａｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅ（Ａｃ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−ＡＦＣ）５μＬを加え、遮光した状態で３７℃、１時間インキュベートした。反応後、検体を蛍光測定用９６−ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ（Ｏｐｔｉｐｌａｔｅ−Ｆ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）に移し、Ｃａｌｐａｉｎ Ｓｕｂｓｔｒａｔｅがカルパインによって分解されることにより発生する蛍光を、マイクロプレートリーダー（ＡＲＶＯｓｘ，ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製）で検出した。

結果を図３に示す。ＳＰＣ刺激前（ｃｏｎｔｒｏｌ）と比較して、３０μＭのＳＰＣで刺激した場合には、カルパイン活性が上昇していた。さらに、このカルパイン活性の上昇は、カルパインインヒビターＰＤ１５０６０６を加えることによって抑制された。

［血管異常収縮及び正常収縮に対するカルパインインヒビターの効果］
ブタ冠状動脈平滑筋条片を用いて、血管異常収縮及び正常収縮に対するカルパインインヒビターの効果を調べた。

（平滑筋条片の作製）
北九州市保健福祉局医療部食肉センターより入手した、新鮮なブタ左冠状動脈前下行枝を主幹分岐部の約１ｃｍ下から約３ｃｍ採取し、あらかじめ混合ガス（９５％Ｏ_２，５％ＣＯ_２）でバブリングし、氷冷したＫｒｅｂｓ液（１２３ｍＭ ＮａＣｌ，４．７ｍＭ ＫＣｌ，１５．５ｍＭ ＮａＨＣＯ_３，１．２ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４，１．２ｍＭ ＭｇＣｌ_２，１．２５ｍＭ ＣａＣｌ_２，１１．５ｍＭ Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｅ）で動脈内の血液を洗浄した。採取当日に血管周辺の脂肪及び線維を取り除いた後、外膜を剥離し、Ｋｒｅｂｓ液中にて４℃で保存した。実験当日、あらかじめ混合ガスでバブリングしたＫｒｅｂｓ液中にて、血管を長軸方向に切り開き、綿棒を用い血管内腔を軽く一方向に擦って血管内皮細胞（内膜）を除去し、剃刀を用いて長軸方向に対してほぼ垂直に、平滑筋細胞の走行方向に合わせて切断し平滑筋条片１ｍｍ×４ｍｍを作製した。

（測定装置）
ブタ冠状動脈平滑筋条片（幅１ｍｍ×長さ３−４ｍｍ）を、オーガンチャンバーに垂直に懸垂して一端を固定し、もう一端をトランスデューサー（張力検知器）（ＴＢ−６１２Ｔ，日本光電社製）に連結して等尺性張力の測定を行い、血管の収縮を評価した。平滑筋条片は、マグヌス管中の７ｍＬのＫｒｅｂｓ液に浸し、Ｋｒｅｂｓ液は常に混合ガス（９５％Ｏ_２、５％ＣＯ_２）でバブリングした。マグヌス管外は、恒温槽にて３７℃に保った水を循環させた。また、交換用の液についても、３７℃で保温し混合ガスをバブリングしたものを用いた。

（収縮抑制作用の確認）
上記測定装置を用い、Ｋｒｅｂｓ液に１０分間平滑筋条片を浸し、Ｋｒｅｂｓ液を排出し、１１８ｍＭの高カリウム溶液を加えて高カリウム脱分極による収縮を５分間引き起こし、その後高カリウム溶液を排出し、Ｋｒｅｂｓ液に浸して１０分間弛緩させる操作を繰り返し、高カリウム脱分極による収縮の安定性と大きさを指標に静止張力を最適化した。次に、高カリウム脱分極による収縮のトレースが安定したところで、４０ｍＭのカリウム溶液を加え、その収縮が定常状態に達した後、ブラジキニン（ペプチド研究所社製）を最終濃度１μＭとなるように加えて弛緩が生じなかったことで、血管内皮細胞が除去されていることを確認した。なお、血管内皮細胞が残っている場合、ブラジキニンを加えることで弛緩が生じる。

次に、ブラジキニンを含むカリウム溶液を排出し、Ｋｒｅｂｓ液を加え１０分間浸した後排出し、ＳＰＣを最終濃度３０μＭ加えたものを異常収縮、４０ｍＭのカリウム溶液を加えたものを正常収縮として、それぞれの収縮が定常状態に達した後、ＰＤ１５０６０６を最終濃度１００μＭとなるように加え、収縮抑制作用を確認した。

結果を図４に示す。ＰＤ１５０６０６はＳＰＣの刺激による異常収縮を特異的に抑制する一方で、カルシウム依存性の正常収縮を全く抑制しなかった。したがって、カルパインインヒビターは、ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路を阻害し、その結果、かかる経路に依存する異常収縮を特異的に抑制することが明らかとなった。

なお、血管攣縮には、ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路によるもの（Shirao et al., (2002) Circulation Research 91:112-119）のほか、プロテインキナーゼＣ経路によるものが存在していること（Jensen et al., (1996) Biochemical Journal 318:469-475）や、プロテインキナーゼＣがカルパインによって分解されて活性型になることによって血管攣縮が生じること（Sato et al., (1997) Journal of Neurosurgery 87:752-756）は知られている。しかしながら、上記Shirao et al.の文献において、プロテインキナーゼＣを特異的に阻害する偽基質ペプチドを用いてもＳＰＣの刺激によるカルシウム非依存性の血管攣縮を抑制しなかったことから、ＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路とプロテインキナーゼＣ経路は独立していると考えられると明記されており、かかる状況において、カルパインインヒビターがプロテインキナーゼＣ経路とは独立したＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路にも関与していることは予測しがたいことであった。

本発明のＳＰＣ／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路の阻害剤を用いれば、ＳＰＣによる血管攣縮等を抑制することができ、医薬品分野で利用可能である。

Claims (1)

1. ２−メルカプト−３−（４−ヨードフェニル）プロパン酸を有効成分とする、スフィンゴシルフォスフォリルコリン／Ｆｙｎ／Ｒｈｏキナーゼシグナル伝達経路に依存する血管攣縮の抑制剤。