JP6503085B2 - ドライアイ疾患を治療及び／又は予防するための短い合成ペプチドの使用 - Google Patents

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Description

本開示は、短い合成ペプチドの発見、及び眼疾患の治療及び/又は予防における該合成ペプチドの使用に関する。
ドライアイ疾患(DED)は、 角膜表面の損傷に起因する可能性のある涙液膜の異常を特徴とする様々な病状の総称である。ドライアイは、目に砂が入っているような感じ、灼熱感、刺すような感じ、又は日中に悪化する異物感等の症状を特徴とする。DEDに苦しんでいる患者は、軽度から重度の症状を訴える。重度の症状を有する患者は、日常生活に支障を来すほどの持続する眼刺激を経験し、眼表面上皮疾患、及び失明の恐れのある滅菌性又は微生物性角膜潰瘍を発症する場合がある。現在、DEDを治療するための唯一のFDA承認処方薬は、コルチコステロイド及びレスタシス（0.05％シクロスポリン）である。しかし、上記の両薬物は、いずれも損傷した角膜組織を治癒することができず、さらに、DED症状の著しい改善又は損傷した角膜組織の治療効果が生じるのに、約4-6ヶ月もかかる。
そのため、DEDを治療及び/又は予防するための医薬品及び/又は方法を改善する必要がある。
一般に、本開示は、眼疾患、特にドライアイ疾患(DED)を治療するための新規化合物及び/又は方法の開発に関する。
従って、本開示の第１の態様は、DEDを治療できる短い合成ペプチドを提供することを目的とする。該短い合成ペプチドは、DLYRX1X2S(配列番号：1)で示される7つの連続したアミノ酸残基から構成され、X1及びX2が互いに独立して任意のアミノ酸残基である。
他の実施形態によれば、X1及びX2は、それぞれバリン及びアルギニンであり、上記合成ペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態によれば、X1及びX2は、それぞれロイシン及びアルギニンであり、上記合成ペプチドは、配列番号:3のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態によれば、X1及びX2は、それぞれグルタミン及びアルギニンであり、上記合成ペプチドは、配列番号:4のアミノ酸配列を有する。
さらなる実施形態によれば、X1及びX2は、それぞれグルタミン及びリジンであり、上記合成ペプチドは、配列番号:5のアミノ酸配列を有する。
さらに他の実施形態によれば、配列番号:1の合成ペプチドは、少なくとも1つのD型アミノ酸残基を有する。いくつかの例において、配列番号:1の合成ペプチドは、2つのD型アミノ酸残基を有する。
本開示の第２の態様は、ドライアイ疾患(DED)に罹患している被験体を治療する方法を提供することを目的とする。該方法は、DEDに関連する症状を改善するための有効量の合成ペプチドを被験体に投与することを含む。該合成ペプチドは、DLYRX1X2S(配列番号：1)で示される7つの連続したアミノ酸残基から構成され、X1及びX2が互いに独立して任意のアミノ酸残基である。
他の実施形態によれば、X1及びX2は、それぞれバリン及びアルギニンであり、上記合成ペプチドは、 配列番号:2のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態によれば、X1及びX2は、それぞれロイシン及びアルギニンであり、上記合成ペプチドは、配列番号:3のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態によれば、X1及びX2は、それぞれグルタミン及びアルギニンであり、上記合成ペプチドは、配列番号:4のアミノ酸配列を有する。
さらなる実施形態によれば、X1及びX2は、それぞれグルタミン及びリジンであり、上記合成ペプチドは、配列番号:5のアミノ酸配列を有する。
さらに他の実施形態によれば、配列番号:1の合成ペプチドは、少なくとも1つのD型アミノ酸残基を有する。いくつかの例において、配列番号:1の合成ペプチドは、2つのD型アミノ酸残基を有する。
任意の実施形態によれば、上記方法は、被験体にDEDを治療する有効量の薬剤を投与するステップを、更に含み、上記薬剤は、抗炎症剤、カルシニューリン阻害剤、抗生物質、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト、及び抗リンパ管新生剤からなる群から選択される。
いくつかの例において、上記抗炎症剤は、シクロスポリンであり得る。上記カルシニューリン阻害剤は、ボクロスポリンであり得る。上記抗生物質は、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、テイコプラニン、バンコマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、ナフシリン、ペニシリン、ピペラシリン、チカルシリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンB、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、マフェニド、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファサラジン、スルフィドオキサゾール、トリメトプリム、コトリモキサゾール、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン,及びテトラサイクリンからなる群から選択され得る。上記ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニストは、ピロカルピン、アトロピン、ニコチン、エピバチジン、ロブリン、又はイミダクロプリドのいずれかであり得る。上記抗リンパ管新生剤は、血管内皮成長因子C(VEGF-C)抗体、VEGF-D抗体、又はVEGF-3抗体であり得る。
すべての実施形態において、上記被験体は、ヒトである。
本発明の第３の態様は、DEDを治療及び/又は予防するための医薬品の製造における合成ペプチドの使用に関する。上記合成ペプチドは、DLYRX1X2S(配列番号：1)で示される7つの連続したアミノ酸残基から構成され、X1及びX2が互いに独立して任意のアミノ酸残基である。
他の実施形態によれば、X1及びX2は、それぞれバリン及びアルギニンであり、上記合成ペプチドは、配列番号:2のアミノ酸配列を有する。
いくつかの実施形態によれば、X1及びX2は、それぞれロイシン及びアルギニンであり、上記合成ペプチドは、配列番号:3のアミノ酸配列を有する。
他の実施形態によれば、X1及びX2は、それぞれグルタミン及びアルギニンであり、上記合成ペプチドは、配列番号:4のアミノ酸配列を有する。
さらなる実施形態によれば、X1及びX2は、それぞれグルタミン及びリジンであり、上記合成ペプチドは、配列番号:5のアミノ酸配列を有する。
さらに他の実施形態によれば、配列番号:1の合成ペプチドは、少なくとも1つのD型アミノ酸残基を有する。いくつかの例において、配列番号:1の合成ペプチドは、2つのD型アミノ酸残基を有する。
以下、本発明の1つ以上の実施形態の詳細を説明する。本発明の他の特徴及び利点は、詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになるであろう。
特許又は出願書類には、少なくとも1つのカラー図面が含まれる。この特許又は特許出願の刊行物のカラー図面の写しは、請求及び必要な手数料の支払いがあった場合に庁によって提供される。本説明は、添付の図面に照らして読まれた以下の詳細な説明からよりよく理解されるであろう。
本開示の一実施形態に係る合成ペプチドの、乾燥ストレスを与えたマウスに対する予防効果を示すフルオレセイン染色角膜組織の写真である。
図1Aの定量分析を示す棒グラフである。
本開示の一実施形態に係る合成ペプチドの、乾燥ストレスを与えたマウスの涙生産能力に対する効果を示す。
本開示の一実施形態に係る合成ペプチドの、乾燥ストレスを与えたマウスに対する効果を示すフルオレセイン染色角膜組織の写真である。
図3Aの定量分析を示す棒グラフである。
本開示の一実施形態に係るH&E染色による角膜切片の組織学的検査を示す写真である。
図4Aの定量分析を示す棒グラフである。
本開示の一実施形態に係るPAS染色結膜上皮の写真である。同写真において、杯細胞（ピンク、PAS染色陽性）は矢印で示される
図5A の定量分析を示す棒グラフである。
添付の図面に関連して以下に提供される詳細な説明は、本実施例の説明として意図されており、本実施例が構築又は利用され得る唯一の形態を表すものではない。この説明は、この実施例の機能と、この実施例を構成し動作させるための一連のステップを示す。しかし、同じ又は同等の機能及び順序は、異なる実施例によって達成されてもよい。
1. 定義
便宜上、本開示の文脈で使用される特定の用語がここに集められる。別途規定されない限り、本明細書で使用される全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。
ここで使用される用語「ペプチド」とは、アミノ酸残基のポリマーを意味する。ここで使用される「合成ペプチド」は、天然に存在するタンパク質分子全体を含まないペプチドを意味する。このペプチドは、化学合成、組換え遺伝子技術、又は抗原全体の断片化などの技術を用いたヒトの介入によって産生され得る点で「合成品」である。本開示の全体を通して、ペプチド内の任意の特定のアミノ酸残基の位置は、ペプチドのN末端から番号が付けられる。
本明細書でいう合成ペプチド配列に関する「アミノ酸配列同一性パーセンテージ(%)」は、最大パーセント配列同一性が得られるように、特定のペプチド配列と候補配列を整列させ、必要に応じてギャップを導入することにより、特定のペプチド配列におけるアミノ酸残基と一致している候補配列におけるアミノ酸残基のパーセンテージとして定義される。なお、保存的置換は、配列同一性の一部として考慮されていない。配列同一性パーセンテージを決定するためのアライメントは、当分野内の様々な方法、例えば、公然に入手可能なコンピュータソフトウェア、例えば、BLAST、BLAST-2、ALIGN又はMegalign(DNASTAR)ソフトウェアにより達成することができる。当業者であれば、アライメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。上記パラメータは、比較される配列の全長にわたって最大のアライメントを達成するために必要である任意のアルゴリズムを含む。本明細書の目的を達成するために、2つのアミノ酸配列間の配列比較は、国立生物工学情報センター(NCBI)によってオンラインで提供されるコンピュータプログラムBlastp(タンパク質-タンパク質BLAST)により実施される。所与のアミノ酸配列Bに対する所与のアミノ酸配列Aのアミノ酸配列同一性パーセンテージ(本明細書において、所与のアミノ酸配列Bと特定の％アミノ酸配列同一性を有する所与のアミノ酸配列Aとも呼ばれる)は、以下の式により計算される。

ここで、Xは、配列アライメントプログラムBLASTにより、配列A、Bをアライメントすることで同一のマッチとして得られたアミノ酸残基の数である。Yは、配列A又はBのいずれか短い方のアミノ酸残基の総数である。
本明細書で用いられる用語「治療」は、所望の薬理学的及び/又は生理的効果(例えば、ドライアイ疾患に関する病状の遅延、阻害、又は改善)を得ることを意味することを意図する。効果は、疾患又はその症状の発生を完全に又は部分的に予防又は阻害する観点から防止的であってもよく、及び/又は、疾患及び/又は疾患に起因する副作用を部分的に又は完全に治癒する観点から治療的であってもよい。本明細書で用いられる「治療」は、哺乳動物(特にヒト)の疾患の予防(例えば、防止)、治癒又は一時的に軽くする治療を含み、そして、(1)疾患の傾向にあるが、まだ診断されていない個人で生じる疾患又は状態の予防（例えば、防止）、治癒又は一時的に軽くする治療、(2)(例えば、疾患の発症を抑制することによって)疾患を阻害すること、又は(3)疾患を緩和する(例えば、疾患と関連した症状を低減する)こと、を含む。
用語「投与される」、「投与する」又は「投与」は、本願明細書において互いに置換可能に用いており、限定するものではないが、静脈内、筋肉内、腹膜内、動脈内、頭蓋内又は皮下に本発明の薬剤(例えば、化合物又は組成物)を投与することを含む送達モードを指す。
本明細書で用いられる「有効量」という用語は、疾患の治療に関する所望の結果を成し遂げるために必要な期間及び用量での有効量を指す。例えば、ドライアイ疾患の治療において、ドライアイ疾患の任意の症状を低減、阻害、予防、遅延又は抑制する薬剤(即ち、化合物、合成ペプチド又は治療ペプチドをエンコードしている核酸)は、有効である。薬剤の有効量は、疾患又は状態の治癒に必須ではなく、疾患又は状態の発病が遅延、妨害又は予防されるように、又は、疾患又は状態の症状を改善するように疾患又は状態を治療するだろう。有効量は、指定期間全体にわたって1、2又は3回以上で投与される適切な形態で1、2又は3以上の用量に分けてもよい。
用語「哺乳動物」は、ヒト、霊長類、家畜、及び、農場動物、例えば、ウサギ、ブタ、ヒツジ又は牛;動物園、スポーツ又はペット動物;及びマウス及びラットのようなげっ歯類を含む哺乳綱のすべてのメンバーを指す。用語「非ヒト哺乳動物」は、ヒト以外の哺乳綱のすべてのメンバーを指す。
用語「被験体」及び「患者」は、本明細書では互換的に使用され、本発明の合成ペプチド及び/又は方法によって治療可能な人類を含む動物を意味する。用語「被験体」又は「患者」は、1つの性別が特定されていない限り、オスとメスの両方の性別を指すことが意図される。従って、用語「被験体」又は「患者」は、本開示の治療方法から利益を得ることができる任意の哺乳動物を含む。「被験体」又は「患者」の例は、ヒト、ラット、マウス、モルモット、サル、ブタ、ヤギ、ウシ、ウマ、イヌ、ネコ、トリ及びニワトリを含むがこれらに限定されない。例示的な実施形態において、患者はヒトである。
ここで使用される用語「薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤」は、眼投与のために薬学的に許容される適切なビヒクル、薬剤又は化合物を意味する。本明細書で使用される用語「眼科用組成物」は、眼に適用する、又は眼と接触して配置されるデバイス（例えば、コンタクトレンズ）を処理するための組成物を意味する。
ここで使用される用語「ドライアイ疾患(DED)」は、以下のいずれかに起因する結膜の持続的な乾燥及び角膜の不透明を特徴とする任意の障害を意味する。即ち、涙液産生の減少、過剰な涙液の蒸発、涙液層に通常見られる粘液又は脂質の産生異常。 DEDの原因には、飛行機や作業場などの乾燥環境への曝露、ビタミンA欠乏、シェーグレン症候群、 関節リウマチその他のリウマチ性疾患、化学的又は熱的な火傷、薬物（アテノロール、クロルフェニラミン、ヒドロクロロチアジド、イソトレチノイン、ケトロラク、ケトチフェン、レボカバスチン、レボフロキサシン、オキシブチニン、及びトルテロジン）が含まれるが、これらに限定されるものではない。
本発明の広い範囲を示す数値範囲及びパラメーターが近似値であるにもかかわらず、特定の実施例に示された数値は可能な限り正確に報告される。しかし、いずれの数値も本質的に、それぞれの試験測定値に見られる標準偏差から必然的に生じる特定の誤差を含む。また、本明細書で使用する「約」という用語は、一般に、所与の値又は範囲の10％、5％、1％又は0.5％以内を意味する。或いは、用語「約」は、当業者によって考慮される場合、平均の許容可能な標準誤差内にあることを意味する。操作例／実施例以外で、又は特に明記しない限り、本明細書中に開示される材料の量、時間、温度、操作条件、量の比などについての、数値範囲、量、値及びパーセンテージの全てが、すべての場合において、用語「約」により修飾されているものと理解されるべきである。したがって、反対のことが示されない限り、本開示及び添付の請求項に記載される数値パラメーターは、所望に応じて変化することのできる近似値である。少なくとも、各数値パラメーターは、報告された有効数字の数に照らして、及び通常の丸め技法を適用することによって、少なくとも解釈されるべきである。
文脈で別途明記示されない限り、単数形「a」、「an」及び「the」は複数の言及を含む。
2. 好ましい実施形態の詳細な説明
本開示は、眼疾患、例えばドライアイ疾患(DED)を発症しないように、被験体を治療及び/又は予防することができる短い合成ペプチドの発見に少なくとも部分的に基づいている。 従って、本発明は、DEDを治療及び/又は予防するための新たに同定された合成ペプチドを含む方法及び組成物を提供する。
2.1 本発明の合成ペプチド
本開示の短い合成ペプチドは、DLYRX1X2S(配列番号：1)で示される7つの連続したアミノ酸残基から構成され、X1及びX2がそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基である。
一実施形態において、X1はロイシン、X2は任意のアミノ酸残基である。
別の実施形態において、X1及びX2は、それぞれバリン及びアルギニンである。
さらに別の実施形態において、X1及びX2は、それぞれグルタミン及びリジンである。
任意の実施形態によれば、配列番号:1の合成ペプチドは、少なくとも1つのD型アミノ酸残基を有し得る。いくつかの例において、配列番号:1の合成ペプチドは、2つのD型アミノ酸残基を有する。
本発明の合成ペプチドは、当該技術分野における任意の標準ペプチド合成プロトコルに従って合成することができる。一実施形態において、本発明の合成ペプチドは、製造者のプロトコルに従って固相ペプチド合成機(ABI433A ペプチドsynthesizer, Applied Biosystems Inc., Life Technologies Corp., Foster City, CA, USA)を用いて合成された。本開示の合成ペプチドは、7-mer(X1, X2)(配列番号:1)、7-mer(配列番号:2)、7-mer(V→L)(配列番号:3)、7-mer(V→Q)(配列番号:4)、及び7-mer(VR→QK)(配列番号:5)に指定される。その詳細を以下の表1に示す。
表1:本発明の合成ペプチド

X1, X2は、それぞれ任意のアミノ酸である。
当業者であれば、ポリペプチド配列の変化のポリペプチドの立体構造に対する影響を予測する方法(例えば、コンピュータシミュレーションプログラム)により合成ペプチドを修飾することができる。それによって、本明細書に開示される情報に基づいて、修飾後の合成ペプチドを提案し試験することで、修飾後の合成ペプチドが所望の機能又は立体構造を保持するか否かを確定することにより、 本発明の合成ペプチド(例えば、7-mer)を「設計」又は「修飾」することができる。本発明の合成ペプチド(例えば、7-mer)は、その生理的活性に無関係なペプチドの特徴を変更するように特異的に修飾されてもよい。例えば、この研究におけるペプチドの生理的活性（即ち、DEDの治療能力）に影響を及ぼすことなく、特定のアミノ酸を変更及び/又は欠失させることができる。いくつかの実施形態によれば、7-merの第5及び第6アミノ酸残基(それぞれ、バリン及びアルギニン)は、DEDの治療及び/又は予防の能力に影響を及ぼすことなく、任意のアミノ酸残基に置換され得る。したがって、本発明は、配列番号2の好ましい合成ペプチド（即ち、7-mer）の機能的に等価な誘導体を包含する。該誘導体は、保存的アミノ酸置換を有するペプチドを含む。
他の実施形態によれば、配列番号:2のN末端及びC末端のそれぞれに位置するアスパラギン酸(D)及びセリン(S)残基を欠失させて得られた、それぞれ7-mer-ΔD(LYRVRS, 配列番号:6)及び7-mer-ΔS(DLYRVR, 配列番号:7)に指定されるペプチドは、DEDに対していかなる生物学的機能も有さない。従って、配列番号:2のN末端及びC末端のそれぞれに位置するアスパラギン酸(D)及びセリン(S)残基は、本発明の合成ペプチドのDED治療能力に必要である。これらの2つの残基は、保存的アミノ酸残基によってのみ置換され得る。
或いは、本発明の合成ペプチドは、組換え技術を用いて調製することができる。例えば、発現ベクターにおいて、本発明のペプチドをコードする核酸をクローニングすることができ、ここで、核酸が宿主細胞で本発明のペプチドを発現させるのに適した調節配列に作動可能に結合される。次いで、上記ベクターを適切な宿主細胞に導入して、ペプチドを発現させることができる。発現された組換えポリペプチドは、硫酸アンモニウム沈殿法及び分取カラムクロマトグラフィー等の方法により宿主細胞から精製することができる。このようにして調製されたペプチドは、以下の実施例に記載の方法に従ってその活性を試験することができる。
前記核酸又はポリヌクレオチドは、当該分野で公知のポリマー、生分解性微粒子若しくはマイクロカプセル送達装置の使用によって送達され得る。宿主中での核酸の取り込みを達成するための別の方法は、標準的な方法によって調製されたリポソームを使用することである。ポリヌクレオチドは、単独で、又は組織特異的抗体と一緒にこれらの送達ビヒクルに導入することができる。或いは、静電気力若しくは共有結合力によってポリ-L-リシンに結合したプラスミド又は他のベクターから構成される分子複合体を調製することができる。或いは、組織特異的標的化は、当技術分野で公知の組織特異的転写調節エレメントの使用によって達成することができる。筋肉内、皮内、又は皮下部位への「裸のDNA」（即ち、送達ビヒクルなし）の送達は、インビボ発現を達成するための別の手段である。
2.2 DEDの治療及び/又は予防のための組成物
本発明の合成ペプチドは、DEDに罹患している被験体を治療するか、又は被験体をDEDの発症から防ぐことに適している。
従って、本開示のさらなる態様は、DEDを治療するための本発明の合成ペプチドを含む医薬品を提供する。該医薬品は、適切な量の本発明の合成ペプチドを、薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤と共に、眼投与に適した組成物、例えば、凍結乾燥製剤又は水溶液に混合することによって製造される。特定の実施形態において、該合成ペプチドは、配列が配列番号:2-5のいずれかであるペプチド群、又はそれらの組合せから選択される。
組成物中に存在するペプチドの量は、使用されるペプチドに依存する。ペプチドは、典型的には組成物中に約0.001重量％~約10重量％で存在する。例えば、0.001重量％、0.005重量％、0.01重量％、0.02重量％、0.03重量％、0.04重量％、0.05重量％、0.06重量％、0.07重量％、0.08重量％、0.09重量％、0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1.0重量％、1.1重量％、1.2重量％、1.3重量％、1.4重量％、1.5重量％、1.6重量％、1.7重量％、1.8重量％、1.9重量％、2.0重量％、2.1重量％、2.2.重量％、2.3重量％、2.4重量％、2.5重量％、2.6重量％、2.7重量％、2.8重量％、2.9重量％、3.9重量％、3.1重量％、3.2重量％、3.3重量％、3.4重量％、3.5重量％、3.6重量％、3.7重量％、3.8重量％、3.9重量％、4.0重量％、4.1重量％、4.2重量％、4.3重量％、4.4重量％、4.5重量％、4.6重量％、4.7重量％、4.8重量％、4.9重量％、5.0重量％、5.1重量％、5.2重量％、5.3重量％、5.4重量％、5.5重量％、5.6重量％、5.7重量％、5.8重量％、5.9重量％、6.0重量％、6.1重量％、6.2重量％、6.3重量％、6.4重量％、6.5重量％、6.6重量％、6.7重量％、6.8重量％、6.9重量％、7.0重量％、7.1重量％、7.2重量％、7.3重量％、7.4重量％、7.5重量％、7.6重量％、7.7重量％、7.8重量％、7.9重量％、8.0重量％、8.1重量％、8.2重量％、8.3重量％、8.4重量％、8.5重量％、8.6重量％、8.7重量％、8.8重量％、8.9重量％、9.0重量％、9.1重量％、9.2重量％、9.3重量％、9.4重量％、9.5重量％、9.6重量％、9.7重量％、9.8重量％、9.9重量％、及び10.0重量％である。特に約0.01重量％~約5重量％で存在する。例えば、0.01重量％、0.02重量％、0.03重量％、0.04重量％、0.05重量％、0.06重量％、0.07重量％、0.08重量％、0.09重量％、0.1重量％、0.2重量％、0.3重量％、0.4重量％、0.5重量％、0.6重量％、0.7重量％、0.8重量％、0.9重量％、1.0重量％、1.1重量％、1.2重量％、1.3重量％、1.4重量％、1.5重量％、1.6重量％、1.7重量％、1.8重量％、1.9重量％、2.0重量％、2.1重量％、2.2.重量％、2.3重量％、2.4重量％、2.5重量％、2.6重量％、2.7重量％、2.8重量％、2.9重量％、3.9重量％、3.1重量％、3.2重量％、3.3重量％、3.4重量％、3.5重量％、3.6重量％、3.7重量％、3.8重量％、3.9重量％、4.0重量％、4.1重量％、4.2重量％、4.3重量％、4.4重量％、4.5重量％、4.6重量％、4.7重量％、4.8重量％、4.9重量％、及び5.0重量％である。
合成ペプチドと併用する薬学的に許容される担体、賦形剤又は安定剤は、関連技術分野において周知であり、緩衝液（例えば、リン酸塩、クエン酸塩、及び他の有機酸）;アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤;防腐剤(例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチル又はベンジルアルコール、アルキルパラベン（例えば、メチル又はプロピルパラベン）、カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、3-ペンタノール、及びm-クレゾール); 低分子量（約10残基未満）のポリペプチド;タンパク質（例えば、血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン）;親水性ポリマー（例えば、ポリビニルピロリドン）; アミノ酸（例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリジン）;単糖類、二糖類、及び他の炭水化物（例えば、グルコース、マンノース、又はデキストリン）;キレート剤（例えば、エチレンジアミン四酢酸(EDTA)）;糖（例えば、スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール）;塩形成対イオン（例えば、ナトリウム）;金属複合体(例えば、亜鉛タンパク質複合体);及び/又は非イオン性界面活性剤（例えば、ポリソルベート(例えば、TWEEN(登録商標))、ロキサマー(例えば、PLURONICS(登録商標))、又はポリエチレングリコール(PEG)）を含むが、これらに限られない。
特定の実施形態において、本発明によって提供される組成物は、局所適用のために製剤化され、投与される。局所製剤は、一般に水性であり、生理学的に許容されるpHに緩衝され、典型的にはマルチディスペンス用に保存される。従って、特定の実施形態において、上記組成物は、治療有効量の本発明の合成ペプチド(即ち、7-mer、7-mer(V→L)、7-mer(V→Q)又は7-mer(VR→QK))及び上記ペプチド用の薬学的に許容される担体を含む局所眼科用組成物である。上記薬学的に許容される担体は、局所眼投与に適用されるビヒクルである。当業者にはよく知られているように、様々なタイプのビヒクルが利用され得る。該ビヒクルは、一般に水性である。水性溶液は、製剤の容易さ、及び患者が、罹患した眼に溶液を1〜2滴点眼することにより該組成物を容易に投与できる観点から、一般に好ましい。しかし、本発明によって提供される合成ペプチドは、懸濁液、粘性若しくは半粘性ゲル、又は他の固体若しくは半固体組成物等の他のタイプの組成物に容易に組み込むこともできる。懸濁液は、水に比較的不溶性であるペプチドに好適である。本発明の眼科用組成物には、緩衝液、防腐剤、共溶媒及び粘度付与剤等の他の成分を含んでもよい。
本明細書に記載の組成物のいずれかとの関係では、pHを約6~約8、好ましくは約7に維持するために有効量の緩衝液を含めることが好ましい。使用される緩衝液は当業者に知られているものであり、限定されないが、例えば、酢酸塩、アスコルビン酸塩、ホウ酸塩、重炭酸塩、炭酸塩、クエン酸塩、及びリン酸塩緩衝液が挙げられる。好ましくは、緩衝液はホウ酸塩を含む。本発明の目的に必要な有効量の緩衝液は、過度の実験をすることなく当業者によって容易に決定することができる。緩衝液にホウ酸塩を含む場合に、該ホウ酸塩緩衝液の濃度は約0.6％であることが好ましい。
本明細書に記載の組成物のいずれにおいて、等張化剤を含むことが好ましい。等張化剤は、溶解した材料の濃度を所望の等張性範囲に調整するために、眼科用組成物に使用される。等張化剤は、眼科分野の当業者に知られており、限定されないが、例えば、グリセリン、マンニトール、ソルビトール、塩化ナトリウム、及び他の電解質が挙げられる。好ましくは、等張化剤は塩化ナトリウムである。
眼科用製剤は、典型的には、多回投与形態で包装される。そのため、防腐剤は、使用中の微生物汚染を防ぐために必要とされる。状況に応じて、一回使用組成物に防腐剤を使用する理由もあり得る。用語「防腐剤」は、眼科分野で一般的に理解されている意味を有する。防腐剤は、複数回使用の眼科用調製物における細菌汚染を防ぐために使用され、限定されないが、例えば、塩化ベンザルコニウム、チメロサール、クロロブタノール、メチルパラベン、プロピルパラベン、フェニルエチルアルコール、エデト酸二ナトリウム、ソルビン酸、ポリクオタニウム-1、安定化オキシクロロ複合体(Purite(登録商標)としても知られている)、フェニル水銀酢酸塩、クロロブタノール、ベンジルアルコール、又は当業者に公知の他の薬剤が挙げられる。そのような防腐剤は、典型的には、組成物の総重量（重量％）に対して0.001~1.0重量％で使用される。
ある状況下では、界面活性剤又は他の適切な共溶媒が、本発明によって提供される組成物のいずれかに使用され得る。本明細書で使用される用語「界面活性剤」及び「共溶媒」は、当技術分野で一般に理解されている意味を有する。界面活性剤は、組成物の治療活性剤又は不溶性成分を可溶化するのを助けるために使用され、他の目的にも役立ち得る。前記化合物の例示的で非限定的な例には、ポリエトキシル化ヒマシ油、ポリソルベート20, 60及び80、Pluronic(登録商標) F-68, F-84及びP-103(BASF Corp., Parsippany N.J., USA)、シクロデキストリン、又は当業者に公知の他の薬剤が含まれる。アニオン性、カチオン性、両性、双性イオン性及び非イオン性界面活性剤は、全て本発明に使用されることができる。 本発明の目的のためには、界面活性剤を使用することが望ましい場合に、非イオン性界面活性剤、例えば、ポリソルベート、ポロキサマー、アルコールエトキシレート、エチレングリコール-プロピレングリコールブロックコポリマー、脂肪酸アミド、アルキルフェノールエトキシレート、又はリン脂質を使用することが好ましい。このような界面活性剤又は共溶媒は、典型的には0.01~2重量％で使用される。
活性成分の眼への吸収を高めるため、製剤を分配する際の変異性を低減するため、製剤の懸濁液又は乳濁液の成分の物理的分離を減少させるため、及び/又は眼科用製剤を改善するため、単純な水溶液の粘度よりも大きい粘度が望ましい。このような粘度付与剤は、例えば、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、ヒドロキシプロピルセルロース、又は、当業者に公知の他の薬剤を含む。そのような薬剤は、典型的には、0.01~2重量％で使用される。
本発明の任意の組成物に使用され得る別の化合物は、キレート剤である。用語「キレート剤」は、化学分野の当業者に理解されるように、金属と複合体を形成することができる化合物を指す。キレート剤は、防腐効果を高めるために眼科用組成物に使用される。本発明の目的を達成するためのいくつかの有用なキレート剤は、エデト酸塩、例えばエデト酸二ナトリウム、エデト酸カルシウム二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、及びエデト酸ジカリウムであるが、これらに限られない。
特定の実施形態において、本発明の合成ペプチドは、点眼剤、軟膏剤、クリーム剤などの眼科用に適した局所組成物の形態で投与される。
本発明の組成物は、眼に局所的に投与される。疾患のタイプ及び重症度に応じて、約1μg/kg〜約50mg/kg（例えば、0.1〜20mg/kg）の本発明の合成ペプチドを患者に投与する。典型的な1日又は1週間の投与量は、約1μg/ kg~約20mg / kg、又はそれ以上であり得る。局所投与の上記目的のいずれかに利用される用量(mg/kg)は、一般に、体重1kgあたり約0.01〜100 mgであり、1日に1回〜数回、例えば4回、6回、8回又はそれ以上投与される。
特定の実施形態において、本発明によって提供される組成物は、2つ以上の合成ペプチドを含み、そのうちの少なくとも1つが7-mer又はその誘導体(例えば、7-mer(V→L)、7-mer(V→Q)、又は7-mer(VR→QK)であり、DEDを治療又は予防する能力を有する。この実施形態において、合成ペプチドは、それらの、別々の、同時又は連続的な使用のために製剤化することができる。
本発明によって提供される組成物は、キットの形態であってもよい。本発明において、「キット」は、本発明により提供される合成ペプチド及び/又はパッケージングされた組成物を形成する追加の治療化合物を含有することで、その輸送、保存、及び、同時又は連続投与が可能である製品として理解される。したがって、本発明のキットは、1つ以上の懸濁液、シリンジなどを含むことができ、且つ、本発明の合成ペプチドを含み、単回投与又は複数回投与で調製することができる。このキットは、必要に応じて、合成ペプチドを可溶化するのに適したビヒクル、例えば、水性媒体（例えば、生理食塩水、リンゲル液、デキストロース及び塩化ナトリウム）、水溶性媒体（例えば、アルコール、 ポリエチレングリコール、プロピルエチレングリコール）、及び水不溶性ビヒクルをさらに含み得る。キットに存在し得る別の成分は、本発明の組成物を所定限界内に維持することを可能にするパッケージである。 そのようなパッケージを製造するのに適した材料には、ガラス、プラスチック（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリカーボネートなど）、ボトル、バイアル、紙、サッシェなどが含まれる。
本発明のキットは、キットに存在する異なる製剤の同時、連続的な又は別々の投与のための説明書をさらに含むことができる。したがって、本発明のキットは、異なる成分の同時、連続的又は別々の投与のための説明書をさらに含むことができる。上記説明書は、被印刷物の形態であってもよく、又は被験者が読むことができるように該説明書を格納可能な電子的支持体の形態、例えば、電子記憶媒体(磁気ディスク、テープ等)、光学媒体（CD-ROM, DVD)等であってもよい。該媒体は、上記説明書を提供するインターネットウェブページを追加的又は代替的に含むことができる。
2.3 DEDの治療及び/又は予防のための方法
上記のように、本発明に記載の知見は、DEDの予防及び/又は治療に有用である。
したがって、本発明は、DEDの予防及び/又は治療の方法に関する。該方法は、治療を必要とする被検体に医薬品又は組成物を局所的に投与するステップを含む。該医薬品又は組成物は、合成ペプチド及び薬学的に許容される担体を含む。該合成ペプチドは、DLYRX1X2S(配列番号：1）で示される7つの連続したアミノ酸残基から構成され、X1及びX2 がそれぞれ独立して任意のアミノ酸残基である。
特定の実施形態において、上記合成ペプチドは、1つ以上の合成ペプチドを含む組成物の形態である。特定の実施形態において、上記合成ペプチドは、配列が配列番号2~5のいずれかであるペプチド群、又はそれらの組み合わせから選択される。
必要に応じて、該方法は、被験体にDEDを治療する有効量の薬剤を投与することをさらに含み得る。該薬剤は、抗炎症剤、カルシニューリン阻害剤、抗生物質、ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニスト、及び抗リンパ管新生剤からなる群から選択される。
いくつかの例において、上記抗炎症剤は、シクロスポリンであり得る。上記カルシニューリン阻害剤は、ボクロスポリンであり得る。上記抗生物質は、アミカシン、ゲンタマイシン、カナマイシン、ネオマイシン、ネチルミシン、ストレプトマイシン、トブラマイシン、テイコプラニン、バンコマイシン、アジスロマイシン、クラリスロマイシン、ジリスロマイシン、エリスロマイシン、ロキシスロマイシン、トロレアンドマイシン、アモキシシリン、アンピシリン、アズロシリン、カルベニシリン、クロキサシリン、ジクロキサシリン、フルクロキサシリン、メズロシリン、ナフシリン、ペニシリン、ピペラシリン、チカルシリン、バシトラシン、コリスチン、ポリミキシンB、シプロフロキサシン、エノキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシン、ロメフロキサシン、モキシフロキサシン、ノルフロキサシン、オフロキサシン、トロバフロキサシン、マフェニド、スルファセタミド、スルファメチゾール、スルファサラジン、スルフィドオキサゾール、トリメトプリム、コトリモキサゾール、デメクロサイクリン、ドキシサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、及びテトラサイクリンからなる群から選択される。上記ニコチン性アセチルコリン受容体アゴニストは、ピロカルピン、アトロピン、ニコチン、エピバチジン、ロブリン、又はイミダクロプリドのいずれかであり得る。上記抗リンパ管新生剤は、血管内皮成長因子 C(VEGF-C)抗体、VEGF-D抗体、又はVEGF-3抗体であり得る。
全ての実施形態において、治療に適した被験体はヒトである。
以下、実施例により本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。
実施例
材料及び方法
材料
カルボキシメチルセルロースナトリウム(CMC)、過ヨウ素酸シッフ(PAS）試薬、及びデキサメタゾンは、全てSigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA)から入手した。平衡塩溶液におけるCMC(1％w/v)を7-merビヒクルとして使用した。全てのペプチドは、GenScript(Piscataway, NJ, USA)により合成されたものである。各ペプチドについて、NH2末端でのアセチル化及びCOOH末端でのアミド化によって修飾されることで、その安定性を改善し、続いて質量分析法（> 95％純度）を採用して特徴付けた。
実験動物
本研究において、C57BL/6マウス(7-8週齢、それぞれ約18~25gの重さ)を使用した。すべてのマウスは、Mackay Memorial Hospital Review Board(Taiwan, R.O.C. )に承認された手順に従って、動物施設で飼育されていた。すべての動物実験手順は、眼科及び視覚研究における動物の使用に関するARVO宣言に従って行われた。
ドライアイ動物モデル
Barabinoら(IVOS(2005)46(8), 2766-2771)によって記述された手順に従って、マウスを制御された環境チャンバー(CEC)に置き、ドライアイを誘導した。CECに置かれたマウスは、相対湿度（RH）<25％、温度20~22℃、空気流量15L /分の環境に1日当たり12時間曝露された。対照マウスは、同じ期間、通常環境（RH> 50％、気流なし、温度21~23℃）で飼育された。
角膜フルオレセイン染色
ゾレチル（6mg / kg）とキシラジン（3mg / kg）の混合物の腹腔内注射によって動物を麻酔した。局所的なフルオレセイン(Fluor-I-Strip, Ayerst Laboratories, Philadelphia, PA）で染色することによって角膜上皮損傷を確定した。コバルト青色光下のスリットランプ生体顕微鏡で角膜フルオレセイン染色を検査し、デジタルカメラで撮影した。データは、平均値±SDとして示される。標準化された5ポイントスケール(0ドット、グレード0;1-5ドット、グレード1;6-15ドット、グレード2;16-30ドット、グレード3;30ドット、グレード4)で、各眼の1mmの中心角膜ゾーンにおいてフルオレセイン染色ドットの数を等級分けした。コンフルエントな染色の領域が1つある場合に、1ポイントをスコアに加え、2つ以上のコンフルエンスの領域の場合に、2ポイントを加えた(Li J et al., Mole Visions 2012, 18, 317）。
涙液産生量の測定
フェノールレッド含浸綿糸(Zone-Quick; Oasis, Glendora, CA)により涙液産生量を測定した。マウスについてのこの試験の有効性は、Dursunら(IVOS(2002)43, 632-638)によって記述された手順に従って実施された。宝飾鉗子で糸を挟んで、60秒間外眼角に置いた。涙液産生量は、涙液で濡れられ、且つ赤色に変わった糸のミリメートルで表された。
角膜上皮組織病理
上記のように、角膜上皮の損傷を評価した(Pflugfelder et al., 2005, Am J Pathol 166, 61-71)。簡単に言えば、分離している頂端細胞の数は、2人の独立したマスクをかけている観察者によって、20の対物レンズを用いて、3つの別々の組織切片からの完全な顕微鏡視野から数えられた。各処置において、3匹のマウスを評価した。
杯細胞の過ヨウ素酸シッフ(PAS)染色
動物を安楽死させた後、眼を外科的に摘出し、10％ホルマリンで固定し、パラフィン包埋し、5μm切片に切断した。上結膜及び下結膜における杯細胞の検出に適したPAS（Sigma-Aldrich）試薬で切片を染色し、その後、PASで染色された切片を検査し、デジタルカメラを備えた顕微鏡で撮影した。
統計
結果は、平均±標準誤差（SEM）として表された。統計的比較に一元配置分散分析（1-way ANOVA）を使用した。P <0.05を有意とみなした。
実施例1 本発明の合成ペプチドは、乾燥ストレス誘発性ドライアイを防止する。
「材料及び方法」の項に記載された手順に従って、制御された環境チャンバ（CEC）を使用して、マウスに対してドライアイを誘導した。マウスがCECに収容された最初の日に治療を開始した。本発明の合成ペプチド(即ち、7-mer,100μM)、ペプチドビヒクル(1％CMC)、又は、7-merに由来するペプチド(即ち、7-mer-ΔD、7-mer-ΔS、7-mer(V→L)及び7-mer(VR→QK)、100μM)を1日3回で14日間、眼に局所投与した。上記ペプチド7-mer-ΔD(LYRVRS, 配列番号:6)及び7-mer-ΔS(DLYRVR, 配列番号:7)は、それぞれ7-merの5'末端(D;アスパラギン酸)及び3'末端(S;セリン)から1つのアミノ酸残基を欠失させたペプチドを示し、陰性対照ペプチドとして使用された。さらに、7-mer(V→L)及び7-mer(VR→QK)を生成する7-merにおける単一及び二重アミノ酸置換の効果も、ドライアイの治療に用いられた。
フルオレセイン染色を用いて角膜上皮の完全性の変化を評価し、結果を図1A、1Bに示す。図1Aは、それぞれ1％CMCビヒクル、7-mer、及びその誘導体で処理されたドライアイの写真である。図1Bは、図1Aの定量分析を示す。
図1Aから明らかになるように、1％CMCビヒクル処理が角膜上皮に著しいフルオレセイン染色を生じないため、ビヒクル処理が乾燥ストレス誘発性角膜上皮損傷を防止できないことが示された。その一方、7-mer(3.8±0.31対1.3±0.21)で処理されたマウスでは、フルオレセイン染色の有意な減少が観察されたため、7-merで処理されたマウスの角膜上皮構造が比較的無傷であることが示され、7-merの合成ペプチドは、マウスがDEDを発症するのを防御及び/又は防止できることが示された。7-merに由来のペプチド（即ち、7-mer(V→L)及び7-mer(VR→QK））で処理されたマウスにおいても、同様の保護効果が観察された一方、7-mer(ΔD)及び7-mer(ΔS)は、このような効果を有さなかった。
また、試験動物の涙液を測定することにより、7-mer及びその誘導体のDEDに対する保護効果を評価し、その結果を図2に示す。
CECに14日間収容した後、1％CMCビヒクルで処理されたマウスにより産生された涙液量は、CECに収容されていないか、又は処理されていない健常マウスと比較して有意に減少した（P <0.05）。その一方、7-mer、7-mer（V→L）又は7-mer（VR→QK）処理により、ビヒクル対照(5.1±0.21、5.0±0.16及び4.9±0.15対3.7±0.25;図2)と比較して、乾燥ストレスを受けたマウスの涙液生産能力を回復させた一方、7-mer(ΔD)又は7-mer(ΔS)ペプチドは、このような効果を有していなかった。
この実施例の結果から、7-mer合成ペプチドは、動物を乾燥ストレス誘導性DEDの発症から防ぐことができることが確認された。
実施例2 本発明の合成ペプチドは、乾燥ストレス誘発性ドライアイに対して治療効果を発揮する。
「材料及び方法」の項に記載された手順に従ってCECに試験動物を14日間収容することによりドライアイを誘導した。フルオレセイン染色によるDEDの徴候（図3A;上部パネル; 14日目）を確認した後、動物をCECから取り出し、通常の環境（15日目）に置いた。その後、1％CMC、1％デキサメタゾン(Dex)、7-mer(100μM)、又は7-mer(ΔS)(100μM）を含む点眼液を7日間投与することにより治療を開始した（図3A;下パネル; 21日目;及び図3B）。
図3Bに示される定量的結果は、0.1％デキサメタゾン及び対照ペプチド（7-mer(ΔS））DEDに対して治療効果を有さないことを示した。その一方、本開示の7-mer合成ペプチドは、1％CMC(1.5±0.18対3.6±0.26;図3B)で処理された対照マウスと比較して、角膜フルオレセイン染色スコアを有意に低下させることができる。
1％CMCビヒクル、0.1％Dex、及び対照ペプチド7-mer(ΔS)で処理されたマウス(図4A)から採取したH&E染色した角膜組織切片について、分離した表面上皮細胞が確認された。その一方、健常なマウス及び7-merで処理されたマウスから採取した角膜組織には、分離した細胞が見出されなかった。本開示の7-mer合成ペプチドは、1％CMC又は7-mer(ΔS)(2.1±0.37対14±1.06及び13.8±1.03;図4B)で処理された対照マウスに比較して、分離した表面上皮細胞を有意に減少させることができる。
杯細胞は、水和環境において角膜を維持するのに役立つ涙液層の構成成分の1つであるムチンの分泌に関与する上皮における主要な細胞型である。PAS染色角膜切片では、乾燥状態で14日間飼育されたマウス、及び1％CMC又は7-mer（ΔS）で処理された乾燥ストレスを受けたマウス（図5A、下のパネル）における杯細胞の数が有意に減少したことが明らかになった。その一方、7-mer合成ペプチドで処理された乾燥ストレスを受けたマウスにおける杯細胞の数は、健常なマウス（図5A、上のパネル）と比較的同じである。本開示の7-mer合成ペプチドは、1％CMCで処理されたマウス(12.7±1.28対7.5±0.96,図5B)と比較して、杯細胞の増殖を有意に誘導することができる。
まとめると、上記の結果により、ドライアイ疾患の治療及び/又は予防に関する本開示の短い合成ペプチドの新規な機能が確認された。
実施形態の上記の説明が単なる例として与えられており、当業者によって様々な変更がなされ得ることが理解されるだろう。上記の明細書、実施例及びデータは、本発明の例示的な実施形態の構造及び使用の完全な説明を提供する。本発明の様々な実施形態が、ある程度具体的に、又は1又は複数の個々の実施形態を参照して、上述されているが、当業者は、本発明の精神又は範囲から逸脱することなく、開示された実施形態に多数の変更を行うことができる。

Claims (2)

  1. DLYRX1X2S(配列番号:1)で示される7つの連続したアミノ酸残基から構成される合成ペプチドであって、
    X1及びX2が互いに独立してバリン及びアルギニン（配列番号:2）、ロイシン及びアルギニン（配列番号:3）、又はグルタミン及びリジン（配列番号:5）である、合成ペプチド。
  2. DLYRX 1 X 2 S(配列番号:1)で示される7つの連続したアミノ酸残基から構成される合成ペプチド、及び、薬学的に許容される担体を含むドライアイ疾患(DED)を治療するための医薬品であって、
    X 1 及びX 2 が互いに独立してバリン及びアルギニン（配列番号:2）、ロイシン及びアルギニン（配列番号:3）、又はグルタミン及びリジン（配列番号:5）である医薬品。
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