JP6519038B2 - 脳梗塞治療のための多能性幹細胞 - Google Patents

Description

本発明は、再生医療における細胞製剤に関する。より具体的には、脳梗塞により損傷を受けた脳組織の修復及び再生に有効な多能性幹細胞を含有する細胞製剤に関する。

脳梗塞は、脳局所の虚血性壊死によって生じる脳機能障害を指し、救急治療の必要な疾患であり、癌及び心臓病と並んで３大死因の一つである。脳梗塞は、作用機序の面から、血栓性、塞栓性、血行力学性に分類され、また臨床所見の側面からはアテローム血栓性脳梗塞、心原性脳塞栓症、ラクナ梗塞などに分類される。

虚血は、動脈硬化など脳血管病変、又は心原性血栓により局所脳血流が遮断されることにより起こり、虚血中心部位ではエネルギー枯渇による神経細胞死が引き起こされる。虚血中心部の周辺では副側血行路を介した血流が残存しており、神経細胞は電気生理学的に機能していないものの、生存している状態にある。この部分の神経細胞は治療を施さない限り、将来的に死滅し、病理学的には脳梗塞巣の進展として、臨床学的には機能不全として障害となる。よって、できるだけ早期にこの部分の神経細胞の機能を回復できれば機能不全の治療ができることとなる。この可逆的な不完全虚血領域をペナンブラと呼ぶ。脳梗塞急性期の治療目的は、このペナンブラ領域の神経細胞の機能を回復することであり、その転帰は虚血の程度並びにその持続時間に依存する。すなわち、如何に早くペナンブラ領域に血流を再開させるかが、その転帰を決定することとなる。このペナンブラ領域の神経細胞は発症後３〜６時間生存できるとされている。また、治療によってペナンプラ領域の神経細胞が機能を回復することが可能な許容時間のことを治療可能時間と呼ぶ（非特許文献１）。

現在、脳梗塞急性期治療薬として米国で承認されている組換えヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ（ｒｔ−ＰＡ）を用いた血栓溶解療法は、虚血の原因となっている血栓を溶解することによりペナンブラ領域への血流を回復することを目的として開発された。発症後３時間以内の脳梗塞患者を対象としたｒｔ−ＰＡ静注療法試験において、プラセボ二重盲検で検討した米国の臨床試験では、ｒｔ−ＰＡ投与群において３ヶ月後の転帰が有意に良好であった。ｒｔ−ＰＡは、血栓を溶解することにより虚血領域への血液供給を再開させ、脳梗塞の伸展を抑制し、脳梗塞に起因する機能不全を改善すると考えられている。この結果は血栓溶解作用による脳血流の早期再開は長期予後を改善することを示した（非特許文献２）。また、上記の血栓溶解療法を用いること以外に、幹細胞治療が脳梗塞の治療における新しい治療法として期待されてきているが、十分な治療効果をもたらすには至っておらず、治療法として確立されていないのが現状である（非特許文献３）。

本発明者らの一人である出澤の研究により、間葉系細胞画分に存在し、誘導操作なしに得られる、ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ａｎｔｉｇｅｎ−３）を表面抗原として発現している多能性幹細胞（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ ｃｅｌｌｓ；Ｍｕｓｅ細胞）が間葉系細胞画分の有する多能性を担っており、組織再生を目指した疾患治療に応用できる可能性があることが分かってきた（特許文献１；非特許文献４；非特許文献５；非特許文献６）。しかしながら、脳梗塞の治療にＭｕｓｅ細胞を使用し、期待される治療効果が得られることを明らかにした例はない。

国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号

Ｓｔｒｏｋｅ，ｖｏｌ．２１，ｐ．６３７−６７６（１９９０） Ｎ．Ｅｎｇ．Ｊ．Ｍｅｄ．，Ｖｏｌ．３３３，ｐ．１５８１−１５８７（１９９５） Ｓｉｎｄｅｎ，Ｊ．Ｄ．＆ Ｍｕｉｒ，Ｋ．Ｗ．，Ｖｏｌ．７，ｐ．４２６−４３４（２０１２） Ｋｕｒｏｄａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１０７，ｐ．８６３９−８６４３（２０１０） Ｗａｋａｏ，Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．１０８，ｐ．９８７５−９８８０（２０１１） Ｋｕｒｏｄａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｐｒｏｔｏｃｏ．，Ｖｏｌ．８，ｐ．１３９１−１４１５（２０１３）

本発明は、再生医療において、多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を用いた新たな医療用途を提供することを目的とする。より具体的には、本発明は、Ｍｕｓｅ細胞を含む、脳梗塞の治療、並びにそれに伴って起こる後遺症（運動障害、感覚障害、言語障害など）の予防及び／又は治療のための細胞製剤を提供することを目的とする。

本発明者らは、脳内血管に塞栓子を挿入し、虚血再還流によって引き起こされたラット脳梗塞モデルに対して、Ｍｕｓｅ細胞を脳実質内に注入することにより、Ｍｕｓｅ細胞が障害脳組織内に生着後、数カ月にわたり生存し、尚且つ自発的に脳細胞に分化することによって、梗塞サイズの縮小及び脳機能の改善又は回復をもたらすことを見出し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明は、以下の通りである。
［１］生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を含む、脳梗塞を治療するための細胞製剤。
［２］脳梗塞後の後遺症を予防及び／又は治療するための、上記［１］に記載の細胞製剤。
［３］外部ストレス刺激によりＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞が、濃縮された細胞画分を含む、上記［１］及び［２］に記載の細胞製剤。
［４］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１０５陽性である、上記［１］〜［３］に記載の細胞製剤。
［５］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、上記［１］〜［４］に記載の細胞製剤。
［６］前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞製剤。
［７］前記多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、上記［１］〜［６］に記載の細胞製剤。
［８］前記多能性幹細胞が、以下の性質の全てを有する多能性幹細胞である、上記［１］〜［７］に記載の細胞製剤：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ。
［９］前記多能性幹細胞が、神経細胞、グリア細胞、血管内皮細胞、及び／又はミクログリアからなる群から選択される１つ以上の細胞に分化する能力を有する、上記［１］〜［８］に記載の細胞製剤。

本発明は、脳梗塞を患っている対象に対し、Ｍｕｓｅ細胞を脳実質内に投与することにより、障害脳組織内でＭｕｓｅ細胞が脳組織を構成する細胞に分化するという脳組織再生メカニズムによって、脳梗塞サイズを劇的に縮小させることができる。

ラット脳梗塞モデルの脳実質内にヒト皮膚線維芽細胞由来のＭｕｓｅ細胞、Ｍｕｓｅ細胞を除いたヒト皮膚線維芽細胞（すなわち非Ｍｕｓｅ細胞）、又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）を注入後、３カ月にわたって神経学的重症度スコア（ＮＳＳ）により評価した結果を示す。縦軸のスコア値が下がるは、脳機能の回復に対応する。 Ｍｕｓｅ細胞、非Ｍｕｓｅ細胞又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が注入されたラット脳梗塞モデルの運動機能についてロータロッド試験の結果を示す。Ｍｕｓｅ細胞等を移植前の２回の測定値を基準とした、各測定日の測定値（２回）の平均値の百分率により、脳機能の回復を経時的に観察した。 Ｍｕｓｅ細胞等を注入してから８５日後のラット脳梗塞モデルの体性感覚誘発電位検査（ＳＥＰ）を測定した結果を示す。 脳組織におけるＭｕｓｅ細胞の生着及び分化を示す蛍光画像である。ヒト由来のＭｕｓｅ細胞は、ヒトミトコンドリアマーカーにより緑色に標識し、神経細胞はβ−チューブリンＩＩＩをマーカーとして赤色に標識した。脳実質内に注入されたＭｕｓｅ細胞は、梗塞境界領域に集積し、生着後、神経細胞に分化していることが示唆された。一方、非Ｍｕｓｅ細胞の生着及び分化は観察されなかった。 ヒトミトコンドリアマーカー陽性の細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、１０視野に含まれる各細胞数をそれぞれカウントした結果を示す。梗塞境界領域においては、非Ｍｕｓｅ細胞はほとんど生着していなかったが、Ｍｕｓｅ細胞は多数存在していた。

本発明は、ＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む、脳梗塞を治療するための細胞製剤に関する。本発明を以下に詳細に説明する。

１．適用疾患
本発明は、ＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）を含む細胞製剤を用いて、脳梗塞の治療を目指す。ここで、「脳梗塞」とは、脳血管の閉塞や灌流圧低下により、脳に局所的な虚血部分が生じ、神経細胞の不可逆的細胞死を呈した状態をいう。本発明においては、発症後４８時間以内の脳梗塞急性期であり、好ましくは、発症後２４時間以内であり、より好ましくは６時間以内であり、最も好ましくは３時間以内の脳梗塞を対象とする。ここで、「発症」とは、患者の正常な状態を最後に見たとき、又は目撃者のいない就寝中に脳梗塞が起こった際の就寝時と定義される。脳梗塞には、血栓の由来により脳血栓と脳塞栓に分類され、本発明は、脳血栓及び脳塞栓の治療に有用である。「脳梗塞の治療」とは、脳梗塞急性期における梗塞巣の進展防止効果、脳梗塞に伴う機能不全若しくは自覚症状を改善する効果、及び／又は慢性期の精神症状やけいれん発作の発現の抑制を意味する。さらに、脳梗塞発作の再発予防も含まれる。また、投与前のＣＴ所見により、脳梗塞の程度は、梗塞巣の大きさ、梗塞巣の広がり（穿通枝、皮質枝）、梗塞側（左、右、両側）、梗塞領域（前大脳動脈領域、中大脳動脈領域、後大脳動脈領域、分水嶺領域、脳幹、小脳、その他）及び浮腫の程度によって分類できる。「脳梗塞巣の進展を抑制する」とは、虚血イベント発症後の時間経過による梗塞巣の拡大を、未処置の場合と比較し抑制する効果をいう。「脳梗塞体積の縮小効果」とは、本発明の細胞製剤の投与前に測定した脳梗塞により生じた梗塞巣の体積が、薬剤投与後一定期間後の評価時点の測定において、該細胞製剤の投与前よりも縮小することを意味する。また、本発明によれば、脳梗塞後に残る後遺症の予防及び／又は治療において、本発明の細胞製剤を用いることもできる。ここで、「後遺症」には、言語障害、しびれ等の知覚障害、手足等の運動障害、頭痛、嘔吐、視力喪失、嚥下障害、構音障害、痴呆などが含まれる。

２．細胞製剤
（１）多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）
本発明の細胞製剤に使用される多能性幹細胞は、本発明者らの一人である出澤が、ヒト生体内にその存在を見出し、「Ｍｕｓｅ（Ｍｕｌｔｉｌｉｎｅａｇｅ−ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇ Ｓｔｒｅｓｓ Ｅｎｄｕｒｉｎｇ）細胞」と命名した細胞である。Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄液、脂肪組織（Ｏｇｕｒａ，Ｆ．，ｅｔ ａｌ．，Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ Ｄｅｖ．，Ｎｏｖ ２０，２０１３（Ｅｐｕｂ）（ｐｕｂｌｉｓｈｅｄ ｏｎ Ｊａｎ １７，２０１４））や真皮結合組織等の皮膚組織から得ることができ、各臓器の結合組織にも散在する。また、この細胞は、多能性幹細胞と間葉系幹細胞の両方の性質を有する細胞であり、例えば、それぞれの細胞表面マーカーである「ＳＳＥＡ−３（Ｓｔａｇｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ−３）」と「ＣＤ１０５」のダブル陽性として同定される。したがって、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、これらの抗原マーカーを指標として生体組織から分離することができる。Ｍｕｓｅ細胞の分離法、同定法、及び特徴などの詳細は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に開示されている。また、Ｗａｋａｏら（２０１１、上述）によって報告されているように、骨髄、皮膚などから間葉系細胞を培養し、それをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、ＳＳＥＡ−３陽性細胞の全てがＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。したがって、本発明における細胞製剤においては、生体の間葉系組織又は培養間葉系幹細胞からＭｕｓｅ細胞を分離する場合は、単にＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとしてＭｕｓｅ細胞を精製し、使用することができる。なお、本明細書においては、脳梗塞（後遺症を含む）を治療するための細胞製剤において使用され得る、ＳＳＥＡ−３を抗原マーカーとして、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織から分離された多能性幹細胞（Ｍｕｓｅ細胞）又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を単に「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」と記載することがある。また、本明細書においては、「非Ｍｕｓｅ細胞」とは、生体の間葉系組織又は培養間葉系組織に含まれる細胞であって、「ＳＳＥＡ−３陽性細胞」以外の細胞を指す。

簡単には、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、細胞表面マーカーであるＳＳＥＡ−３に対する抗体を単独で用いて、又はＳＳＥＡ−３及びＣＤ１０５に対するそれぞれの抗体を両方用いて、生体組織（例えば、間葉系組織）から分離することができる。ここで、「生体」とは、哺乳動物の生体をいう。本発明において、生体には、受精卵や胞胚期より発生段階が前の胚は含まれないが、胎児や胞胚を含む胞胚期以降の発生段階の胚は含まれる。哺乳動物には、限定されないが、ヒト、サル等の霊長類、マウス、ラット、ウサギ、モルモット等のげっ歯類、ネコ、イヌ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ、ヤギ、フェレット等が挙げられる。本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、生体の組織から直接マーカーを持って分離される点で、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）やｉＰＳ細胞と明確に区別される。また、「間葉系組織」とは、骨、滑膜、脂肪、血液、骨髄、骨格筋、真皮、靭帯、腱、歯髄、臍帯、臍帯血などの組織及び各種臓器に存在する組織をいう。例えば、Ｍｕｓｅ細胞は、骨髄や皮膚、脂肪組織から得ることができる。例えば、生体の間葉系組織を採取し、この組織からＭｕｓｅ細胞を分離し、利用することが好ましい。また、上記分離手段を用いて、線維芽細胞や骨髄間葉系幹細胞などの培養間葉系細胞からＭｕｓｅ細胞を分離してもよい。なお、本発明の細胞製剤においては、使用されるＭｕｓｅ細胞は、細胞移植を受けるレシピエントに対して自家であってもよく、又は他家であってもよい。

上記のように、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団は、例えば、ＳＳＥＡ−３陽性、及びＳＳＥＡ−３とＣＤ１０５の二重陽性を指標にして生体組織から分離することができるが、ヒト成人皮膚には、種々のタイプの幹細胞及び前駆細胞を含むことが知られている。しかしながら、Ｍｕｓｅ細胞は、これらの細胞と同じではない。このような幹細胞及び前駆細胞には、皮膚由来前駆細胞（ＳＫＰ）、神経堤幹細胞（ＮＣＳＣ）、メラノブラスト（ＭＢ）、血管周囲細胞（ＰＣ）、内皮前駆細胞（ＥＰ）、脂肪由来幹細胞（ＡＤＳＣ）が挙げられる。これらの細胞に固有のマーカーの「非発現」を指標として、Ｍｕｓｅ細胞を分離することができる。より具体的には、Ｍｕｓｅ細胞は、ＣＤ３４（ＥＰ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ１１７（ｃ−ｋｉｔ）（ＭＢのマーカー）、ＣＤ１４６（ＰＣ及びＡＤＳＣのマーカー）、ＣＤ２７１（ＮＧＦＲ）（ＮＣＳＣのマーカー）、ＮＧ２（ＰＣのマーカー）、ｖＷＦ因子（フォンビルブランド因子）（ＥＰのマーカー）、Ｓｏｘ１０（ＮＣＳＣのマーカー）、Ｓｎａｉ１（ＳＫＰのマーカー）、Ｓｌｕｇ（ＳＫＰのマーカー）、Ｔｙｒｐ１（ＭＢのマーカー）、及びＤｃｔ（ＭＢのマーカー）からなる群から選択される１１個のマーカーのうち少なくとも１個、例えば、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個、１０個又は１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。例えば、限定されないが、ＣＤ１１７及びＣＤ１４６の非発現を指標に分離することができ、さらに、ＣＤ１１７、ＣＤ１４６、ＮＧ２、ＣＤ３４、ｖＷＦ及びＣＤ２７１の非発現を指標に分離することができ、さらに、上記の１１個のマーカーの非発現を指標に分離することができる。

また、本発明の細胞製剤に使用される上記特徴を有するＭｕｓｅ細胞は、以下：
（ｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
（ｉｉ）三胚葉のいずれの胚葉の細胞に分化する能力を持つ；
（ｉｉｉ）腫瘍性増殖を示さない；及び
（ｉｖ）セルフリニューアル能を持つ
からなる群から選択される少なくとも１つの性質を有してもよい。本発明の一局面では、本発明の細胞製剤に使用されるＭｕｓｅ細胞は、上記性質を全て有する。ここで、上記（ｉ）について、「テロメラーゼ活性が低いか又は無い」とは、例えば、ＴＲＡＰＥＺＥ ＸＬ ｔｅｌｏｍｅｒａｓｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社）を用いてテロメラーゼ活性を検出した場合に、低いか又は検出できないことをいう。テロメラーゼ活性が「低い」とは、例えば、体細胞であるヒト線維芽細胞と同程度のテロメラーゼ活性を有しているか、又はＨｅｌａ細胞に比べて１／５以下、好ましくは１／１０以下のテロメラーゼ活性を有していることをいう。上記（ｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏにおいて、三胚葉（内胚葉系、中胚葉系、及び外胚葉系）に分化する能力を有し、例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで誘導培養することにより、肝細胞、神経細胞、骨格筋細胞、平滑筋細胞、骨細胞、脂肪細胞等に分化し得る。また、ｉｎ ｖｉｖｏで精巣に移植した場合にも三胚葉に分化する能力を示す場合がある。さらに、静注により生体に移植することで損傷を受けた臓器（心臓、皮膚、脊髄、肝、筋肉等）に遊走及び生着し、組織に応じた細胞に分化する能力を有する。上記（ｉｉｉ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、浮遊培養では増殖速度約１．３日で増殖するが、浮遊培養では１細胞から増殖し、胚様体様細胞塊を作り１４日間程度で増殖が止まる、という性質を有するが、これらの胚様体様細胞塊を接着培養に持っていくと、再び細胞増殖が開始され、細胞塊から増殖した細胞が広がっていく。さらに精巣に移植した場合、少なくとも半年間は癌化しないという性質を有する。また、上記（ｉｖ）について、Ｍｕｓｅ細胞は、セルフリニューアル（自己複製）能を有する。ここで、「セルフリニューアル」とは、１個のＭｕｓｅ細胞から浮遊培養で培養することにより得られる胚様体様細胞塊に含まれる細胞から３胚葉性の細胞への分化が確認できると同時に、胚様体様細胞塊の細胞を再び１細胞で浮遊培養に持っていくことにより、次の世代の胚様体様細胞塊を形成させ、そこから再び３胚葉性の分化と浮遊培養での胚様体様細胞塊が確認できることをいう。セルフリニューアルは１回又は複数回のサイクルを繰り返せばよい。

（２）細胞製剤の調製及び使用
本発明の細胞製剤は、限定されないが、上記（１）で得られたＭｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団を生理食塩水や適切な緩衝液（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）に懸濁させることによって得られる。この場合、自家又は他家の組織から分離したＭｕｓｅ細胞数が少ない場合には、細胞移植前に細胞を培養して、所定の細胞濃度が得られるまで増殖させてもよい。なお、すでに報告されているように（国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレット）、Ｍｕｓｅ細胞は、腫瘍化しないため、生体組織から回収した細胞が未分化のまま含まれていても癌化の可能性が低く安全である。また、回収したＭｕｓｅ細胞の培養は、特に限定されないが、通常の増殖培地（例えば、１０％仔牛血清を含むα−最少必須培地（α−ＭＥＭ））において行うことができる。より詳しくは、上記国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号パンフレットを参照して、Ｍｕｓｅ細胞の培養及び増殖において、適宜、培地、添加物（例えば、抗生物質、血清）等を選択し、所定濃度のＭｕｓｅ細胞を含む溶液を調製することができる。ヒト対象に本発明の細胞製剤を投与する場合には、ヒトの腸骨から数ｍｌ程度の骨髄液を採取し、例えば、骨髄液からの接着細胞として骨髄間葉系幹細胞を培養して有効な治療量のＭｕｓｅ細胞を分離できる細胞量に達するまで増やした後、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ−３の抗原マーカーを指標として分離し、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。あるいは、例えば、Ｍｕｓｅ細胞をＳＳＥＡ−３の抗原マーカーを指標として分離後、有効な治療量に達するまで細胞を培養して増やした後、自家又は他家のＭｕｓｅ細胞を細胞製剤として調製することができる。

また、Ｍｕｓｅ細胞の細胞製剤への使用においては、該細胞を保護するためにジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）や血清アルブミン等を、細菌の混入及び増殖を防ぐために抗生物質等を細胞製剤に含有させてもよい。さらに、製剤上許容される他の成分（例えば、担体、賦形剤、崩壊剤、緩衝剤、乳化剤、懸濁剤、無痛化剤、安定剤、保存剤、防腐剤、生理食塩水など）や間葉系幹細胞に含まれるＭｕｓｅ細胞以外の細胞又は成分を細胞製剤に含有させてもよい。当業者は、これら因子及び薬剤を適切な濃度で細胞製剤に添加することができる。このように、Ｍｕｓｅ細胞は、各種添加物を含む医薬組成物として使用することも可能である。

上記で調製される細胞製剤中に含有するＭｕｓｅ細胞数は、脳梗塞及び後遺症における所望の効果（例えば、脳梗塞巣の進展の抑制、脳梗塞体積の縮小、運動機能の回復、言語機能の回復、知覚機能の回復など）が得られるように、対象の性別、年齢、体重、患部の状態、使用する細胞の状態等を考慮して、適宜、調整することができる。後述する実施例３及び４においては、塞栓子によって脳梗塞を生じさせたラット脳梗塞モデルに対して、Ｍｕｓｅ細胞移植による各種の効果を検討した。約２００〜３００ｇのＷｉｓｔａｒ系ラットに対しては、ＳＳＥＡ３陽性細胞を３×１０^４細胞／頭で投与することにより、非常に優れた効果が得られた。この結果から哺乳動物一個体あたり１〜１．５×１０^５細胞／ｋｇを体重換算した細胞量を投与することで優れた効果が得られることが期待される。なお、対象とする個体はラット、ヒトを含むがこれに限定されない。また、本発明の細胞製剤は、所望の治療効果が得られるまで、複数回（例えば、２〜１０回）、適宜、間隔（例えば、１日に２回、１日に１回、１週間に２回、１週間に１回、２週間に１回、１カ月に１回、２カ月に１回、３カ月に１回、６カ月に１回）をおいて投与されてもよい。したがって、対象の状態にもよるが、治療上有効量としては、例えば、一個体あたり１×１０^３細胞〜２×１０^７細胞で１〜１０回の投与量が好ましい。一個体における投与総量としては、限定されないが、１×１０^３細胞〜２×１０^８細胞、１×１０^４細胞〜１×１０^８細胞、２×１０^４細胞〜５×１０^７細胞、５×１０^４細胞〜２×１０^７細胞、１×１０^５細胞〜１×１０^７細胞などが挙げられる。

３．ラット脳梗塞モデルの作製
本明細書においては、本発明の細胞製剤による脳梗塞（後遺症を含む）の治療効果を検討するためにラット脳梗塞モデルを構築し、使用することができる。該モデルとして使用されるラットには、限定されないが、一般的に、Ｗｉｓｔａｒ系ラット、スプラーグドーリー（ＳＤ）系ラットが挙げられる。脳梗塞モデルは、ヒトの脳梗塞に近い症状を促すために、ラットの頸動脈から塞栓子を挿入し、脳梗塞を引き起させた脳組織に繋がる動脈（例えば、中大脳動脈（ＭＣＡ））を塞栓子によって所定時間塞ぎ（虚血状態）、その後、該塞栓子を引き出すことによって作製される。なお、脳梗塞の状態は、脳組織切片（ＴＴＣ染色）により確認することができる。また、本発明の細胞製剤はヒト由来のＭｕｓｅ細胞であるため、該製剤を投与されるラットとは異種の関係にある。通常、モデル動物において異種の細胞等が投与される実験では、異種細胞の生体内で拒絶反応を抑制するために、異種細胞の投与前又は同時に免疫抑制剤（シクロスポリンなど）が投与される。

４．Ｍｕｓｅ細胞による治療効果
本発明の実施形態では、本発明の細胞製剤は、脳梗塞の患者、又は後遺症を患っている患者の脳機能を回復又は正常に回復することができる。本明細書において使用するとき、脳機能の「回復」とは、脳梗塞に伴う各種の機能障害（後遺症を含む）の緩和及び進行の抑制を意味し、好ましくは、日常生活に差し支えない程度にまで機能障害を緩和することを意味する。また、脳機能を「正常に回復する」とは、脳梗塞（後遺症を含む）に起因した機能障害が脳梗塞前の状態に戻ることを意味する。また、脳機能の回復の評価には、限定されないが、電気生理学検査、神経学的重症度スコア（ＮＳＳ）、画像検査、病理検査による評価が一般的である。ここで、「電気生理学的検査」は、中枢神経、末梢神経、筋肉等の機能を電気刺激に対して得られる電位（電気信号の波形）を所定の装置により観察することによって脳を含む各種器官等の機能評価を行うために行うものである。例えば、中枢神経（脊髄）の検査は、特に、「体性感覚誘発電位検査（Ｓｏｍａｔｏｓｅｎｓｏｒｙ Ｅｖｏｋｅｄ Ｐｏｔｅｎｔｉａｌ；ＳＥＰ）」と呼ばれ、四肢の感覚刺激による反応が脊髄の感覚伝導路を通って大脳皮質に伝えられたときに誘発される電位を測定する検査である。これにより、本発明の細胞製剤を患者に投与した後に、患者の中枢神経の機能回復の程度を客観的に確認することができる。また、「神経学的重症度スコア」（ＮＳＳ）は、損傷した脳の機能の程度を各項目についてスコアリングすることによって評価するものである。ラットを対象としたＮＳＳは、Ｃｈｅｎ，Ｊ．ら（Ｓｔｒｏｋｅ，Ｖｏｌ．３２，ｐ．１００５−１１１１（２００１））によって示されている。

以下の実施例により、本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。

実施例１：ラット脳梗塞モデルの作製
本実施例におけるラットを用いた実験プロトコールは、「国立大学法人東北大学動物実験等に関する規定」を遵守し、実験動物は、東北大学動物実験センターの監督下において該規定に沿って作製された。より具体的には、ラット脳梗塞モデルは、Ｗｉｓｔａｒ系ラット（雄性１０週齢）の頸動脈から塞栓子を挿入し、脳血管の一部（例えば、中大脳動脈（ＭＣＡ））を閉塞した。その後、塞栓子を引き出し、再灌流させ、該ラットを脳梗塞モデルとして以下の実験に使用した。なお、脳梗塞の状態は、脳組織切片（ＴＴＣ染色）により確認した。また、ラットに対して異種となるヒトＭｕｓｅ細胞を移植するため、移植前に免疫抑制剤（ＦＫ５０６）を脳梗塞ラットに投与した。

実施例２：Ｍｕｓｅ細胞の調製
ヒト線維芽細胞由来のＭｕｓｅ細胞の調製は、国際公開第ＷＯ２０１１／００７９００号に記載された方法に従って行った。より具体的には、ヒト骨髄液から接着性を有する間葉系細胞を培養し、増殖を経て、Ｍｕｓｅ細胞又はＭｕｓｅ細胞を含む細胞集団をＳＳＥＡ−３陽性細胞としてＦＡＣＳにて分離した。また、非Ｍｕｓｅ細胞は、上記間葉系細胞のうち、ＳＳＥＡ−３陰性の細胞群であり、対照として用いた。その後、リン酸緩衝生理食塩水又は培養液を用いて、所定濃度に調整し、以下のラット脳梗塞モデルにおけるＭｕｓｅ細胞による脳機能評価等に使用した。なお、骨髄間葉系細胞などの間葉系細胞を培養して得たものをＭｕｓｅ細胞の母集団として用いる場合、Ｗａｋａｏら（２０１１、上述）によって報告されているように、ＳＳＥＡ−３陽性細胞は全て、ＣＤ１０５陽性細胞であることが分かっている。

実施例３：Ｍｕｓｅ細胞移植による脳機能評価
実施例１で作製した脳梗塞ラットを３群に分け、再灌流後の２日目に、ヒト線維芽細胞由来のＭｕｓｅ細胞（１×１０^４細胞／２μｌ ＰＢＳ×３箇所）、非Ｍｕｓｅ細胞（１×１０^４細胞／２μｌ ＰＢＳ×３箇所）、又は生理食塩水（６μｌ）を各群のラットの脳実質内に直接注入した。その後、経時的にラットの運動機能の改善を評価し、さらに、所定時間後の細胞動態解析を行った。

（１）神経学的重症度スコア（ＮＳＳ）による総合的評価
上記で移植されたラットに対して、移植後の３カ月間、各種の脳機能障害（麻痺、感覚障害、視覚障害など）を神経学的重症度スコア（ＮＳＳ）（Ｃｈｅｎ，Ｊ．，Ｓｔｒｏｋｅ，Ｖｏｌ．３２，ｐ．１００５−１１１１（２００１））を用いて評価した。このＮＳＳによる評価では、ポイントが運動機能及び行動の変化について割り当てられ、その結果、１８の最大スコアが重症の神経学的機能不全を表し、一方、０のスコアが正常の神経学的状態を示す。具体的には、下記の項目について評価された：尾によって体を起こすこと（各項目１ポイント（最大３ポイント））；床面に置いたときの状態（０〜３ポイント）；感覚試験（１又は２ポイント）；ビームバランス試験（０〜６ポイント）；並びに反射欠如及び運動異常（各項目１ポイント（最大４ポイント））。各ラット群（ｎ＝１０）のＮＳＳ評価の結果を図１に示す。非Ｍｕｓｅ細胞の投与群及び生理食塩水の投与群では、最初の１０日程度までスコアを下げ、それ以降、スコアが６〜８ポイントで維持される傾向にあった。これに対して、Ｍｕｓｅ細胞の投与群では、２０日目でスコアを他の群と比較して有意に下げ、およそ実験を終了させた時期（８０日以降）においてもさらにスコアを下げる傾向にあり、他の群と比較して有意差が見られた。

（２）ロータロッド試験
実験動物のもつ運動機能の協調性と平衡感覚を測定する装置として一般的に知られた装置を用いて、Ｍｕｓｅ細胞等の移植による脳機能障害の回復を調べた。該試験の評価は、回転する台の上でラットが落下するまでの時間を週１回（０〜８４日目）の頻度で各日２回の計測し、それらの平均値を求め、脳梗塞発症前の２回の平均値を基準としたスコア（％）を算出することにより行った。結果を図２に示す。非Ｍｕｓｅ細胞の投与群及び生理食塩水の投与群では、２１〜２８日目にかけて最大７０％程度まで運動機能の回復が見られたが、それ以降では１００％まで運動機能を回復させることはなかった。これに対して、Ｍｕｓｅ細胞の投与群では、一度、２８日目で９０％まで回復後、一次的にスコアが７０％まで下がるが、５６日からはほぼ１００％まで運動機能の回復が見られた。上記のＮＳＳによる総合評価及びロータロッド試験の結果から、Ｍｕｓｅ細胞は、脳梗塞ラットの脳機能を顕著に改善させることが示唆された。

（３）電気生理学的検査
Ｍｕｓｅ細胞等を注入してから８５日後のラット脳梗塞モデルの体性感覚誘発電位検査（ＳＥＰ）を測定した（図３）。大腿直筋を１０ｍＡ、１Ｈｚ×１００回（１秒間隔）で刺激し、電位の測定点は前項（ｂｒｅｇｍａ）より２．５ｍｍ側方、２．５ｍｍ後方、深さ１ｍｍとした。右脳−左足（ｒｔ−ｌｔ）は障害側に伝わる刺激の潜時を示し、左脳−左足（ｌｔ−ｌｔ）は同側の脳に伝わる刺激、すなわち健常側での潜時を示す。潜時が短い方が、回復が早いことを示す。右脳−左足（ｒｔ−ｌｔ）、左脳−左足（ｌｔ−ｌｔ）共に、Ｍｕｓｅ細胞が投与された群では、ＰＢＳ又は非Ｍｕｓｅ細胞に比べて潜時が短く、統計的有意差は認められなかったものの、実測値において神経回路網の回復が示唆された。

実施例４：脳組織におけるＭｕｓｅ細胞の生着及び分化
脳実質内に注入されたＭｕｓｅ細胞及び非Ｍｕｓｅ細胞の挙動を調べるために、これらの細胞が脳組織に生着及び分化するかどうかを検討した。これらの細胞を投与８５日後に、脳組織切片を調製し、蛍光顕微鏡下で観察した（図４）。いずれの切片においても、細胞核をＤＡＰＩで染色し、さらにヒトミトコンドリアマーカーと神経細胞マーカーであるβ−チューブリンＩＩＩの二重染色を行った。その結果、Ｍｕｓｅ細胞を注入されたラットの脳切片では、ヒトミトコンドリアマーカーの蛍光（緑色）と神経細胞を示すβ−チューブリンＩＩＩのマーカーの蛍光（赤色）が同一細胞群において観察されたことから、Ｍｕｓｅ細胞は、脳組織に生着し、神経細胞に分化していることが示唆された。一方、非Ｍｕｓｅ細胞を注入した場合の脳組織切片では、非Ｍｕｓｅ細胞の生着は観察されなかった。また、梗塞境界領域のおけるＭｕｓｅ細胞及び非Ｍｕｓｅ細胞の生着について、ヒトミトコンドリアマーカー陽性の細胞を蛍光顕微鏡下で観察し、１０視野に含まれる各細胞数をそれぞれカウントした（図５）。梗塞境界領域においては、非Ｍｕｓｅ細胞はほとんど生着していなかったが、Ｍｕｓｅ細胞は多数存在していた。これらの結果から、Ｍｕｓｅ細胞は、非Ｍｕｓｅ細胞と比較して、梗塞境界領域に生着し、神経細胞に分化することが示唆された。

本発明の細胞製剤は、脳梗塞モデルの脳実質内に投与することにより、梗塞部位において脳細胞（神経細胞、グリア細胞等）を再生することができ、梗塞サイズを縮小させ、脳機能を改善することができ、脳梗塞の治療、並びに脳梗塞後の後遺症の予防及び／又は治療に応用できる。

本明細書に引用する全ての刊行物及び特許文献は、参照により全体として本明細書中に援用される。なお、例示を目的として、本発明の特定の実施形態を本明細書において説明したが、本発明の精神及び範囲から逸脱することなく、種々の改変が行われる場合があることは、当業者に容易に理解されるであろう。

Claims (7)

1. 生体の間葉系組織又は培養間葉系細胞から分離されたＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞を有効成分として含む、脳梗塞後の後遺症を治療するための細胞製剤であって、ここで、前記多能性幹細胞は、以下：
   （ｉ）ＳＳＥＡ−３陽性；
   （ｉｉ）ＣＤ１０５陽性；
   （ｉｉｉ）テロメラーゼ活性が低いか又は無い；
   （ｉｖ）三胚葉のいずれかの胚葉に分化する能力を持つ；
   （ｖ）腫瘍性増殖を示さない；及び
   （ｖｉ）セルフリニューアル能を持つ
   の全ての性質を有する、上記細胞製剤。
2. 脳梗塞後の後遺症が、言語障害、知覚障害、運動障害、頭痛、嘔吐、視力喪失、嚥下障害、構音障害、又は痴呆である、請求項１に記載の細胞製剤。
3. 外部ストレス刺激によりＳＳＥＡ−３陽性の多能性幹細胞が濃縮された細胞画分を含む、請求項１又は２に記載の細胞製剤。
4. 前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性及びＣＤ１４６陰性である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の細胞製剤。
5. 前記多能性幹細胞が、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＮＧ２陰性、ＣＤ３４陰性、ｖＷＦ陰性、及びＣＤ２７１陰性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の細胞製剤。
6. 前記多能性幹細胞が、ＣＤ３４陰性、ＣＤ１１７陰性、ＣＤ１４６陰性、ＣＤ２７１陰性、ＮＧ２陰性、ｖＷＦ陰性、Ｓｏｘ１０陰性、Ｓｎａｉ１陰性、Ｓｌｕｇ陰性、Ｔｙｒｐ１陰性、及びＤｃｔ陰性である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の細胞製剤。
7. 前記多能性幹細胞が、神経細胞、グリア細胞、血管内皮細胞、及び／又はミクログリアからなる群から選択される１つ以上の細胞に分化する能力を有する、請求項１〜６のいずれか１項に記載の細胞製剤。