JP6528281B2

JP6528281B2 - シクロデキストリンの利用による抗がん活性が増強されたアシュワガンダ葉の水抽出物の調製方法、及びアシュワガンダ葉を含む医薬組成物

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Publication number: JP6528281B2
Application number: JP2015559996A
Authority: JP
Inventors: ワダワ　レヌー; レヌーワダワ; スニルカウル; 寺尾　啓二; 啓二寺尾; 善行石田
Original assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Current assignee: National Institute of Advanced Industrial Science and Technology AIST
Priority date: 2014-01-29
Filing date: 2015-01-29
Publication date: 2019-06-12
Anticipated expiration: 2035-01-29
Also published as: JPWO2015115512A1; WO2015115512A1; US10646532B2; US20170007659A1

Description

本発明は、アシュワガンダ葉の水抽出物の調製方法、及びアシュワガンダ葉の水抽出物の抗がん活性を増強させる方法に関する。本発明は、また、アシュワガンダ葉の水抽出物を含むがん治療又は予防用医薬組成物にも関する。本発明は、また、アシュワガンダ葉の乾燥粉末及びシクロデキストリンを含む医薬組成物にも関する。

がんは全世界において死亡原因の上位であり、高い割合を占める。がんの診断法及び治療法の進歩により患者の生存率は高まってきているが、全世界人口の約７５％にあたる発展途上国に住む人々にとって、先進的ながん治療を受けることは難しい。そのため、より安価ながん治療法が求められている。

先進医療の一方で、ハーブ等を用いた自然療法も古くから知られている。アーユルヴェーダはインドに紀元前から伝わる自然療法の一種である。アーユルヴェーダで用いられる薬草アシュワガンダ（学名Withania somnifera、インド人参，Indian ginseng，Winter cherryとも称される）の根は、滋養強壮作用や健康増進作用等を有することが知られている。

本発明者らは、以前、アシュワガンダ葉のアルコール抽出物が抗がん活性を示すことを見出している（特許文献１）。アシュワガンダ葉のアルコール抽出物には、下記式のウィザノンやウィザフェリンＡ：

といったウィザノライド類が有効成分として含まれており、アポトーシスや成長阻害といった機構によりがん細胞を死滅させる。ｉｎｖｉｔｒｏ試験では、ウィザノンはがん細胞に選択的に細胞毒性を示すが、ウィザフェリンＡは正常細胞にも影響を及ぼす。ウィザノンとウィザフェリンＡを細胞培養液に加えることで、ウィザフェリンＡの正常細胞への毒性がウィザノンにより防御される。

また、本発明者らは、以前、アシュワガンダ葉の水抽出物が抗がん活性を有することも見出している（特許文献２）。アシュワガンダ葉の水抽出物では、ウィザノン及びウィザフェリンＡの含量は低く、トリエチレングリコールが主な抗がん成分であることが知られている（非特許文献１）。

国際公開第２００５／８２３９２号公報国際公開第２００９／１１０５４６号公報

Renu Wadhwa et al: PLOS ONE 2013, Vol 8, Issue 10, e77189

上記のように、アシュワガンダ葉の水抽出物では、有効成分のウィザノン及びウィザフェリンＡの含量は低い。

それ故、本発明は、アシュワガンダ葉の水抽出物中の有効成分のウィザノン及びウィザフェリンＡの含量を増加させる、アシュワガンダ葉の水抽出物の調製方法を提供することを目的とする。また、本発明は、アシュワガンダ葉を含む医薬組成物をより経済的かつ簡便に提供することも目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決するための手段を種々検討した結果、シクロデキストリンを用いることにより、アシュワガンダ葉の水抽出物中の有効成分のウィザノン及びウィザフェリンＡの含量を増加させることができ、また、アシュワガンダ葉の乾燥粉末とシクロデキストリンを用いることにより、アシュワガンダ葉を含む医薬組成物をより経済的かつ簡便に提供することができることを見出し、本発明を完成した。

すなわち、本発明の要旨は以下の通りである。
（１）アシュワガンダ葉をシクロデキストリンの存在下で抽出することを特徴とするアシュワガンダ葉の水抽出物の調製方法。
（２）シクロデキストリンが、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルフォブチルエーテル−β−シクロデキストリン及び分岐型シクロデキストリンから選ばれる少なくとも１種である（１）の調製方法。
（３）シクロデキストリンを用いるアシュワガンダ葉の水抽出物の抗がん活性を増強させる方法。
（４）（１）又は（２）に記載の調製方法で得られたアシュワガンダ葉の水抽出物を含むがん治療又は予防用医薬組成物。
（５）アシュワガンダ葉の水抽出物とシクロデキストリンを混合して得られる組成物を含むがん治療又は予防用医薬組成物。
（６）アシュワガンダ葉の乾燥粉末及びシクロデキストリンを含む、同時に、別々に、又は順次に投与するための医薬組成物。
（７）がん治療又は予防用である（６）の医薬組成物。
（８）シクロデキストリンがγ−シクロデキストリンである（６）又は（７）の医薬組成物。

本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2014-014389号、2014-229652号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。

本発明により、アシュワガンダ葉の水抽出物中の有効成分のウィザノン及びウィザフェリンＡの含量が増加したアシュワガンダ葉の水抽出物の調製方法を提供し、また、アシュワガンダ葉を含む医薬組成物をより経済的かつ簡便に提供することが可能となる。

図１は実施例１−３及び比較例１の水抽出物並びに実施例４の複合体のウィザノン及びウィザフェリンＡの含量を示す図である。図２はがん細胞に対するｉｎｖｉｔｒｏがん細胞毒性アッセイの結果を示す図である。図３はマウスを用いたｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイにおける腫瘍容積を示す図である。図４はマウスを用いたｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイにおける腫瘍の数を示す図である。図５（ａ）−（ｄ）はマウスを用いたｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイにおける体重の変化を示す図である。図６はマウスを用いたｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイにおける腫瘍容積を示す図である。

以下、本発明の好ましい実施形態について詳細に説明する。
１．アシュワガンダ葉の水抽出物の調製方法
本発明は、シクロデキストリンを用いるアシュワガンダ葉の水抽出物の調製方法に関する。本発明のアシュワガンダ葉の水抽出物の調製方法は、アシュワガンダ葉をシクロデキストリンの存在下で抽出することを特徴とする。シクロデキストリンの存在下でアシュワガンダ葉を抽出することにより、シクロデキストリンを用いない場合と比較して、得られる水抽出物中のウィザノン及びウィザフェリンＡの含量を増加させることができる。

本発明の方法に用いられるアシュワガンダとしては、学名Withania somniferaを用いる。アシュワガンダは天然に生育するものに限定されず、ｉｎｖｉｔｒｏで培養したものであってもよいが、アシュワガンダ葉に含有される成分の組成はアシュワガンダの産地や樹齢等により若干の差があると考えられるため、本発明のアシュワガンダ葉の水抽出物を得るためには、インド国内で種から栽培した２〜４年目の植物を用いることが望ましい。アシュワガンダ葉は、採取したままの新鮮葉、それを乾燥させたもの、又は焙煎させたもののいずれでもよいが、乾燥させたものが望ましい。アシュワガンダ葉は、そのままの形態で用いてもよいが、適宜処理して用いることが好ましく、例えば、粉末の形態で用いることができる。

本発明の方法に用いられるシクロデキストリン（ＣＤ）としては、特に限定されずにα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、及びこれらの誘導体等を用いることができる。上記誘導体としては、例えば、分岐型シクロデキストリン及び化学修飾シクロデキストリンが挙げられる。分岐型シクロデキストリンとしては、例えば、酵素反応によりシクロデキストリンに糖の側鎖を結合させたグリコシル化ＣＤ、より具体的には、グルコシル−ＣＤ、マルトシル−ＣＤ、ガラクトシル−ＣＤ、マンノシル−ＣＤ等の単糖又は二糖修飾ＣＤを挙げることができる。化学修飾シクロデキストリンとしては、部分メチル化ＣＤ、ヒドロキシプロピル化ＣＤ、スルフォブチルエーテル化ＣＤ、アセチル化ＣＤ、モノクロロトリアジノ化ＣＤ等が挙げられる。本発明の方法において、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン、スルフォブチルエーテルβ−シクロデキストリン又は分岐型シクロデキストリンを用いることが好ましく、β−シクロデキストリンが特に好ましい。β−シクロデキストリンを用いると、得られるアシュワガンダ葉の水抽出物中のウィザノン及びウィザフェリンＡの含量が高くなる。

本発明の方法において用いられるシクロデキストリンは、好ましくは水溶液の形態で用いられる。

本発明の好ましい実施形態において、本発明のアシュワガンダ葉の水抽出物は、アシュワガンダ葉をシクロデキストリン水溶液と混合し、得られたスラリーを遠心分離及び／又はろ過することによって得ることができる。

アシュワガンダ葉とシクロデキストリンの混合は、特に限定されずに、例えば、アシュワガンダ葉をシクロデキストリン水溶液に加えて、５〜６０℃で６〜１００時間、回転数１０〜２００ｒｐｍにて処理することにより達成することができる。

２．アシュワガンダ葉の水抽出物を含むがん治療又は予防用医薬組成物
本発明は、アシュワガンダ葉の水抽出物を含むがん治療又は予防用医薬組成物にも関する。本発明の医薬組成物は、アシュワガンダ葉由来の水溶性物質とシクロデキストリンとを含む。好ましくは、本発明の医薬組成物は、アシュワガンダ葉由来の水溶性物質とシクロデキストリンとの複合体を含む。本発明のアシュワガンダ葉由来の水溶性物質とシクロデキストリンとの複合体には、ｉｎｖｉｔｒｏでこれらを複合化したものだけでなく、これらを別々に対象に投与し、ｉｎｖｉｖｏで複合化したものも含む。

本発明の医薬組成物は、アシュワガンダ葉の水抽出物とシクロデキストリンとを混合することによって得ることができる。ここで、アシュワガンダ葉の水抽出物とシクロデキストリンとの混合は、アシュワガンダ葉の水抽出物を調製した後、該水抽出物とシクロデキストリンとを混合してもよく、又はアシュワガンダ葉の水抽出物の調製とシクロデキストリンとの混合を同時に行ってもよい。すなわち、本発明の医薬組成物は、シクロデキストリンを用いずに抽出したアシュワガンダ葉の水抽出物とシクロデキストリンとを混合することにより、又は、上記のシクロデキストリンの存在下でアシュワガンダ葉を水で抽出することにより得ることができる。

アシュワガンダ葉の水抽出物を調製した後、該水抽出物とシクロデキストリンとを混合して本発明の医薬組成物を得る場合、本発明の医薬組成物は、例えば、所定量の該水抽出物をシクロデキストリンの５〜２０％の水溶液又は懸濁液に添加し、室温、又は加温しながら数分〜数十時間撹拌し、その後遠心分離等により、得られた沈殿物を回収することによって得ることができる。

シクロデキストリンを用いずにアシュワガンダ葉の水抽出物を調製する場合、この水抽出物は、特に限定されずに、アシュワガンダ葉を水に加えて２０〜７０℃で６〜１００時間処理する方法、又はアシュワガンダ葉を水に加えて７０〜１００℃にまで熱した後に、１〜３０℃にまで放冷する方法により得ることができる。

アシュワガンダ葉の水抽出物と混合されるシクロデキストリンとしては、特に限定されずに上記のα−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、及びこれらの誘導体等を用いることができ、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピルβ−シクロデキストリン、スルフォブチルエーテルβ−シクロデキストリン又は分岐型シクロデキストリンが好ましく、γ−シクロデキストリンが特に好ましい。γ−シクロデキストリンを用いると、得られる医薬組成物中のウィザノン／ウィザフェリンＡの比が高くなるため、医薬組成物が高い抗がん活性を有する。

本明細書において、抗がん活性とは、がんの増殖を抑制する活性を意味し、より詳細には、がん細胞に対して細胞毒性を有し、がん細胞に対する増殖及び浸潤の抑制、がん抑制タンパクｐ５３又はｐＲＢの活性化、テロメラーゼ活性の阻害、分化誘導等の作用を有することを意味する。本発明の医薬組成物は、単独で、あるいは他の抗がん剤を用いた化学療法あるいは放射線療法等と併用して、がんの治療又は予防に用いることができる。

本明細書において「がん」とは、膵臓がん、胃がん、大腸がん、腎臓がん、肝臓がん、骨髄がん、副腎がん、皮膚がん、メラノーマ、肺がん、小腸がん、前立腺がん、精巣がん、子宮がん、乳がん又は卵巣がん等の上皮組織に生じるがん、及び筋肉や骨等の非上皮性の部位に生じる悪性腫瘍である肉腫を含む固形がん、並びにその他の白血病や悪性リンパ腫等の液性がんの全てを包含する。本発明の医薬組成物は、なかでも固形がんの治療又は予防に有効である。

本発明の医薬組成物は、必要に応じて製薬上許容される担体と共に、有効成分であるアシュワガンダ葉の水抽出物を任意の剤形に製剤化してよく、種々の投与形態を採用可能である。剤形の具体例としては、錠剤、カプセル剤、液剤、粉剤、散剤、顆粒剤、注射剤等が挙げられる。投与経路は、経口及び非経口のいずれでもよく、非経口投与経路としては、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与等が挙げられる。

製薬上許容される担体としては、固形製剤では賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤等が挙げられる。液剤では溶剤、溶解補助剤、懸濁化剤、等張化剤、緩衝剤、無痛化剤等が挙げられる。また、必要に応じて防腐剤、抗酸化剤、着色剤、甘味剤、安定化剤等の製剤添加物を用いることもできる。

経口固形製剤を調製する場合は、有効成分であるアシュワガンダ葉の水抽出物に、必要に応じて賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味・矯臭剤等を加えた後、常法により錠剤、顆粒剤、カプセル剤等とすることができる。

３．シクロデキストリンを用いるアシュワガンダ葉の水抽出物の抗がん活性を増強させる方法
本発明は、シクロデキストリンを用いるアシュワガンダ葉の水抽出物の抗がん活性を増強させる方法にも関する。本発明の方法では、アシュワガンダ葉をシクロデキストリンの存在下で抽出することにより、得られるアシュワガンダ葉の水抽出物のウィザノン及びウィザフェリンＡの含量が高くなり、それによって該抽出物の抗がん活性を増強させることができる。また、アシュワガンダ葉の水抽出物を調製した後、該水抽出物にシクロデキストリンを添加する場合にも、得られる混合物中のウィザノン及びウィザフェリンＡの含量が高くなり、それによって該抽出物の抗がん活性を増強させることができる。

４．アシュワガンダ葉の乾燥粉末及びシクロデキストリンを含む医薬組成物
本発明は、アシュワガンダ葉の乾燥粉末及びシクロデキストリンを含む医薬組成物にも関する。アシュワガンダ葉の乾燥粉末を用いることにより、経済的かつ簡便にアシュワガンダ葉を含む医薬組成物を調製することができる。また、アシュワガンダ葉の乾燥粉末を用いることにより、アシュワガンダ葉中の成分が安定化され、バイオアベイラビリティーが向上する。

アシュワガンダ葉の乾燥粉末は、アシュワガンダ葉を乾燥し、粉砕することによって得ることができる。乾燥手段としては、その薬理効果を損なわなければ特に限定されずに、送風加熱乾燥機や、送風を行わない加熱乾燥機やマイクロ波減圧乾燥機等を挙げることができる。乾燥条件は、原料葉の状態によって異なるが、乾燥温度は、通常、２５〜７０℃である。粉砕手段としては、特に限定されずに、ミキサー、ピンミル、石臼型水冷粉砕機等の粉砕機を挙げることができる。

アシュワガンダ葉の乾燥粉末は、溶媒に溶解して用いてもよい。溶媒としては、特に限定されずに、水や有機溶媒を挙げることができる。

シクロデキストリンとしては、特に限定されずに、α−シクロデキストリン、β−シクロデキストリン、γ−シクロデキストリン、ヒドロキシプロピル−β−シクロデキストリン、スルフォブチルエーテル−β−シクロデキストリン及び分岐型シクロデキストリンを挙げることができるが、γ−シクロデキストリンを用いることが好ましい。γ−シクロデキストリンを用いることにより、医薬組成物が高い抗がん活性を有する。

アシュワガンダ葉の乾燥粉末及びシクロデキストリンを含む医薬組成物は、例えば、アシュワガンダ葉の抗がん活性、抗老化活性、抗酸化活性、神経分化誘導活性、筋分化誘導活性、抗色素沈着活性、抗炎症活性、抗関節炎活性、抗糖尿病活性、抗ストレス活性及び強壮効果を増強することができる。

上記の医薬組成物は、好ましくは、がん治療、老化抑制、酸化抑制、色素沈着抑制、炎症抑制、関節炎治療、糖尿病治療及びストレス抑制、並びにこれらの予防のために用いられ、より好ましくは、がん治療及びその予防のために用いられる。

本発明の医薬組成物は、同時に、別々に、又は順次に投与されるものである。本明細書で用いる「同時に」とは、ほぼ同じ時間に投与することをいい、「別々に」とは、異なった時間に別々に投与することをいい、例えば、１日目に１つの薬剤、２日目にもう１つの薬剤を投与するような場合をいう。「順次に」とは、順番に従って投与することをいい、例えば、最初に１つの薬剤を投与し、次いで、決められた時間後に、他の薬剤を投与するような場合をいう。投与経路は、経口及び非経口のいずれでもよく、非経口投与経路としては、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、腹腔内投与等が挙げられる。

本発明の医薬組成物は、必要に応じて製薬上許容される担体と共に、有効成分であるアシュワガンダ葉の乾燥粉末を任意の剤形に製剤化してよく、種々の投与形態を採用可能である。剤形の具体例としては、錠剤、カプセル剤、液剤、粉剤、散剤、顆粒剤、注射剤等が挙げられる。

以下、実施例を用いて本発明をさらに具体的に説明する。但し、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。

１．アシュワガンダ葉の水抽出物及び複合体の利用
１−１．アシュワガンダ葉の水抽出物及び複合体の調製
（実施例１）
α−シクロデキストリンを用いたアシュワガンダ葉の水抽出物の調製
５ｇの乾燥したアシュワガンダ（Withania somnifera）葉の粉末（インド原産、ｉＧＥＮＥ）に１００ｍＬの１０％のα−シクロデキストリン（ＣＡＶＡＭＡＸ（登録商標）Ｗ６ＦＯＯＤ、ワッカー社製）水溶液を加え、室温下、６０ｒｐｍで２０時間撹拌した。得られたスラリーを３５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、上澄みを０．２μｍのフィルタを用いてろ過してアシュワガンダ葉の水抽出物を得た。得られた水抽出物はそのまま後の試験に用いた。

（実施例２）
β−シクロデキストリンを用いたアシュワガンダ葉の水抽出物の調製
１０％のα−シクロデキストリン水溶液に代えて、２％のβ−シクロデキストリン（ＣＡＶＡＭＡＸ（登録商標）Ｗ７ＦＯＯＤ、ワッカー社製）水溶液を使用した以外は、実施例１と同様の方法で水抽出物を得た。

（実施例３）
γ−シクロデキストリンを用いたアシュワガンダ葉の水抽出物の調製
１０％のα−シクロデキストリン水溶液に代えて、１０％のγ−シクロデキストリン（ＣＡＶＡＭＡＸ（登録商標）Ｗ８ＦＯＯＤ、ワッカー社製）水溶液を使用した以外は、実施例１と同様の方法で水抽出物を得た。

（比較例１）
シクロデキストリンを用いないアシュワガンダ葉の水抽出物の調製
５ｇの乾燥したアシュワガンダ葉の粉末に１００ｍＬの滅菌水を加え、４０℃で一晩ゆっくりと撹拌した。得られたスラリー状の混合物を室温に戻し、ろ紙（ワットマン；グレードＮｏ．４）でろ過した後、１０，０００ｒｐｍで２０分間遠心分離し、上澄みを０．４５μｍのフィルタを用いて滅菌ろ過してアシュワガンダ葉の水抽出物を得た。得られた水抽出物はそのまま後の試験に用いた。

（実施例４）アシュワガンダ葉の水抽出物とγ−シクロデキストリンとの複合体
比較例１と同様の方法で得られたアシュワガンダ葉の水抽出物に、γ−シクロデキストリンを１０％の濃度となるように加えた。得られた混合物を、室温下６０ｒｐｍで２０時間撹拌した後、３５００ｒｐｍで５分間遠心分離し、得られた沈殿物をアシュワガンダ葉の水抽出物とγ−シクロデキストリンとの複合体として回収した。

１−２．構成成分の分析
実施例１−３及び比較例１の水抽出物並びに実施例４の複合体のウィザノン及びウィザフェリンＡの含量をＨＰＬＣ分析により測定した。実施例１−３及び比較例１の抽出物は、得られた水抽出物をそのままＨＰＬＣ分析に用いて、ウィザノン及びウィザフェリンＡの含量をそれぞれの標準品を用いて算出した。実施例４の複合体は、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解させた後、ＨＰＬＣ分析により、ウィザノン及びウィザフェリンＡの含量をそれぞれの標準品を用いて算出した。ＨＰＬＣは以下の条件で行った。
カラム：Ｌｕｎａ５ｕＣ１８（２）１００Ａ（５μｍ１５０（Ｌ）×４．６（Ｄ））
カラムオーブン：４５℃
Ａ溶液：１％メタノール
Ｂ溶液：メタノール：エタノール：ｉ−プロパノール＝５２．２５：４５．３０：２．４５
グラデーションプログラム：
イニシャル：Ａ６５％（Ｂ３５％）
→３０分：Ａ５５％（Ｂ４５％）
流速：１ｍＬ／分
検出器波長：２２０ｎｍ

結果を図１に示す。図１より、シクロデキストリンの存在下で抽出することにより（実施例１−３）、シクロデキストリンを用いずに抽出した場合（比較例１）と比較して、水抽出物中のウィザノン及びウィザフェリンＡの含量が高くなった。特に、β−シクロデキストリンを用いた場合（実施例２）には、シクロデキストリンを用いなかった場合（比較例１）と比較して、ウィザノン及びウィザフェリンＡの含量が著しく高くなった。また、実施例４の複合体では、シクロデキストリンを用いなかった場合（比較例１）と比較してウィザノンの含量が高くなった。実施例１−４及び比較例１のいずれの場合においても、水抽出物又は複合体中のウィザノンの含量は、ウィザフェリンＡの含量よりも高かったが、実施例４の複合体が最も高いウィザノン／ウィザフェリンＡ比を示した。

１−３．がん細胞に対するｉｎｖｉｔｒｏがん細胞毒性アッセイ
ヒト骨肉腫細胞（Ｕ２ＯＳ、American Type Culture Collection（ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）より入手）を、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ、インビトロジェン社）に１０％ウシ胎児血清を添加した培地を用い、加湿インキュベータ（３７℃、５％ＣＯ_２）中で培養した。細胞を４０〜６０％コンフルエントまで培養した後、所定の投与量の実施例１−３及び比較例１の水抽出物並びに実施例４の複合体でそれぞれ処理した。処理は、細胞を３７℃で培養しながら、典型的には４８時間かけて行った。

実施例１−３及び比較例１の水抽出物並びに実施例４の複合体の細胞毒性を、ＭＴＴ（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−イル）−２，５−ジフェニルテトラゾリウムブロミド）（ライフテクノロジー社）を用いたアッセイにより評価した。ここで、細胞生存は、黄色のＭＴＴが、生細胞のミトコンドリアデヒドロゲナーゼにより紫色のフォルマザンに変換されることによって評価した。上記の処理の後、ＭＴＴ（０．５ｍｇ／ｍＬ）を細胞培養培地に加え、４時間インキュベートした。次いで、ＭＴＴを含む培地を除去し、１００ｍＬのＤＭＳＯを各ウェルに加えてフォルマザン結晶を完全に溶解させた。マルチプレート分光光度計（ＴＥＣＡＮＩｎｆｉｎｉｔｅＭ２００Ｐｒｏ）を用いて５５０ｎｍで吸光度を測定した。

結果を図２に示す。図２より、実施例１−３の水抽出物及び実施例４の複合体は、比較例１の水抽出物よりも高い細胞毒性を示し、β−シクロデキストリンを用いて得られた実施例２の水抽出物は、最も高い細胞毒性を示した。実施例４の複合体は、比較例１の水抽出物と比較して、低い投与量でも十分な細胞毒性を示した。

１−４．ｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイ
ＨＴ１０８０細胞（ヒト繊維肉腫細胞、ＪＣＲＢ生物資源バンクより入手）による皮下異種移植モデルのマウスを用いて、実施例４の複合体及び比較例１の水抽出物についてｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイを行った。

Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（４週齢、雌、日本クレア社から購入）に、ＨＴ１０８０細胞（０．２ｍＬの成長培地に６×１０^６個）を１匹あたり２箇所に皮下注射した。対照群は２％カルボキシメチルセルロースで処理し、比較例１の水抽出物群は、５００ｍｇ／ｋｇ体重／回の比較例１の水抽出物を給餌により投与し、実施例４の複合体群は、５００ｍｇのアシュワガンダ葉の水抽出物（比較例１と同様の方法で得た）及び０．６２５ｍｇのγ−シクロデキストリン／ｋｇ体重／回を給餌により投与した。処理はＨＴ１０８０細胞の注射後８日目から開始し、隔日で１２回行った。１ヶ月にわたって腫瘍形成を観察し、皮下の腫瘍容積を、式Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２（Ｌ：腫瘍の長さ、Ｗ：腫瘍の幅）により算出した。このアッセイは各群につき３匹のマウスを用いて行い、２回繰り返した。

結果を、腫瘍容積については図３に示し、腫瘍の数については図４に示す。図３及び図４より、実施例４の複合体群では、比較例１の水抽出物群と比較して、腫瘍の数及び容積が顕著に減少し、腫瘍抑制効果がみられた。これにより、実施例４の複合体が高い抗がん活性を有することが示され、また、シクロデキストリンによりアシュワガンダ葉の水抽出物の抗がん活性を増強できることが示された。

２．アシュワガンダ葉の乾燥粉末とγ−シクロデキストリンの共投与
（実施例５）
アシュワガンダ葉の乾燥粉末の調製
アシュワガンダ葉の乾燥粉末は、ウィザノン／ウィザフェリンＡの比が高いアシュワガンダ葉を４５〜５０℃で乾燥し、粉砕することにより得た。得られた粉末は紫外線照射により滅菌し、真空パック中で２８℃以下で保存した。

ｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイ
ＨＴ１０８０細胞（ヒト繊維肉腫細胞、ＪＣＲＢ生物資源バンクより入手）による皮下異種移植モデルのマウスを用いて、アシュワガンダ葉の乾燥粉末及びγ−シクロデキストリンの共投与群と、アシュワガンダ葉の乾燥粉末の単独投与群のそれぞれについてｉｎｖｉｖｏ抗腫瘍アッセイを行った。

Ｂａｌｂ／ｃヌードマウス（４週齢、雌、日本クレア社から購入）に、ＨＴ１０８０細胞（０．２ｍＬの成長培地に６×１０^６個）を１匹あたり２箇所に皮下注射した。対照群は１％カルボキシメチルセルロースで処理し、アシュワガンダ葉乾燥粉末の単独投与群は、５０ｍｇ／ｋｇ体重／回のアシュワガンダ葉乾燥粉末を１％カルボキシメチルセルロースとともに給餌により投与し、アシュワガンダ葉乾燥粉末及びγ−シクロデキストリンの共投与群は、５０ｍｇ／ｋｇ体重／回のアシュワガンダ葉乾燥粉末と、１２．５ｍｇ又は２５ｍｇ／ｋｇ体重／回のγ−シクロデキストリン（ＣＡＶＡＭＡＸ（登録商標）Ｗ８ＦＯＯＤ、ワッカー社製）を、それぞれ、アシュワガンダ葉乾燥粉末の単独投与群と同様に投与した。処理はＨＴ１０８０細胞の注射後３日目から開始し、隔日で行った。１ヶ月にわたって体重及び腫瘍形成を観察し、皮下の腫瘍容積を、式Ｖ＝Ｌ×Ｗ^２／２（Ｌ：腫瘍の長さ、Ｗ：腫瘍の幅）により算出した。このアッセイは各群につき５匹のマウスを用いて行い、２回繰り返した。

図５（ａ）−（ｄ）に体重の変化についての結果を示す。図５（ａ）は、対照群の体重の変化を示し、図５（ｂ）は、アシュワガンダ葉乾燥粉末の単独投与群の体重の変化を示し、図５（ｃ）は、アシュワガンダ葉乾燥粉末と、２５ｍｇ／ｋｇ体重／回のγ−シクロデキストリンの共投与群の体重の変化を示し、図５（ｄ）は、アシュワガンダ葉乾燥粉末と、１２．５ｍｇ／ｋｇ体重／回の共投与群の体重の変化を示す。図５より、アシュワガンダ葉乾燥粉末の単独投与群、並びに、アシュワガンダ葉の乾燥粉末及びγ−シクロデキストリンの共投与群のいずれにおいても体重の変化に差はみられなかった。

図６に、対照群、アシュワガンダ葉乾燥粉末の単独投与群及びアシュワガンダ葉乾燥粉末と、２５ｍｇ／ｋｇ体重／回のγ−シクロデキストリンの共投与群の腫瘍容積についての結果を示す。図６より、アシュワガンダ葉乾燥粉末の単独投与群と、アシュワガンダ葉乾燥粉末及びγ−シクロデキストリンの共投与群では、対照群と比較して顕著な腫瘍成長抑制効果が見られたが、アシュワガンダ葉乾燥粉末及びγ−シクロデキストリンの共投与群は、アシュワガンダ葉乾燥粉末の単独投与群と比較してより高い抗がん活性を示した。

同様の検討をＨＴ１０８０細胞をマウスの尾静脈より注射し、肺に転移した腫瘍に対して行った。６週間後の肺を観察した結果、アシュワガンダ葉乾燥粉末の単独投与群、並びに、アシュワガンダ葉の乾燥粉末及びγ−シクロデキストリンの共投与群において、対照群と比較して腫瘍の数及び腫瘍容積の顕著な減少がみられた。

本発明の調製方法を用いることにより、アシュワガンダ葉の水抽出物中の有効成分のウィザノン及びウィザフェリンＡの含量が増加したアシュワガンダ葉の水抽出物を提供することが可能となる。また、本発明により、アシュワガンダ葉を含む医薬組成物をより経済的かつ簡便に提供することが可能となる。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims

アシュワガンダ葉をβ−シクロデキストリンの存在下で抽出することを特徴とするアシュワガンダ葉の水抽出物の調製方法。
β−シクロデキストリン又はγ−シクロデキストリンを用いるアシュワガンダ葉の水抽出物の抗がん活性を増強させる方法。
アシュワガンダ葉の水抽出物とγ−シクロデキストリンを混合して得られる組成物を含むがん治療又は予防用医薬組成物。
アシュワガンダ葉の乾燥粉末及びγ−シクロデキストリンを含む、同時に、別々に、又は順次に投与するためのがん治療又は予防用医薬組成物。