JP6535657B2 - 試料からの組織分離 - Google Patents

Description

本発明は、生物学的試料における関心のある領域からの生物学的試料の一部の分離に対する方法及び試料分離装置に関する。

特許文献１は、生物学的材料の層の一部を単離する方法を開示している。上記一部は、集束レーザビームを用いて切除され、次に、以前に試料に付けられた接着テープを用いて拾われる。

特許文献２は、生物学的試料及び安定化層を含む調製品から単離されることになる組織をレーザがカットする方法を開示している。安定化層は、例えば、ホイルであってもよい。別の実施形態において、前もって作製された穴を有する中間層が、空気グリッパーの開口部の前に配置される。

特許文献３は、支持基板とカバー基板との間の調製品の構成を開示しており、レーザが、３つの層全てから切除切片をカットする。

特許文献４は、対象キャリア上の生物学的材料が、透明な調製品、混合物及び／又は純物質から作製されたフィルムによって覆われる類似のアプローチを記載しており、レーザが、３つの層全てを切断する。

特許文献５は、体液に対する分析テープを生成する方法を開示しており、診断用補助ラベルが、キャリアテープまで移される。

ＵＳ２００３／０３２０８２ Ａ１ ＷＯ２００５／０３３６６８ Ａ１ ＷＯ０３／００８９３４ Ａ１ ＵＳ２００５／２５０２１９ Ａ１ ＵＳ２０１２／２７３１１２ Ａ１ ＵＳ２０１１／１５９４８５ Ａ１

上記背景技術に基づき、容易で正確な、生物学的検体等の試料からの試料の一部の分離を可能にする手段を有することが有利である。

この目的は、請求項１に記載の試料分離装置、及び、請求項２に記載の方法によって取り組まれる。好ましい実施形態は、従属請求項において開示されている。

第１の態様において、本発明の一実施形態は、生物学的試料における関心のある領域からの生物学的試料の一部の分離に対する試料分離装置に関する。上記生物学的試料における関心のある領域は、例えば、染色アッセイにおける特定の色等、特定の特徴を有する１つ又は複数の細胞若しくは細胞分画に相当してもよく、さらなる試験に対して生物学的試料における関心のある領域から生物学的試料の一部だけを抽出することが所望される。試料分離装置は、生物学的試料における関心のある領域に開口部を有するカバーシートを提供する「構造化ユニット」を含む。

カバーシートは、一般に、十分な安定性の（典型的には平らな）形状を有する、及び、シート内の／シートを通る開口部の製造を可能にするいかなる固体材料も含んでよい。シートは、例えば、（ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリカーボネート、ポリアミド、ＰＭＭＡ等の）ポリマー等の合成材料、若しくは、アクリレート、ポリウレタン、シリコーンのような充填粒子、架橋材料を有するポリマーバインダーの複合材料の層、又は、感圧性の接着剤、ゲル、モノマー混合物のような接着層を有したポリマーキャリア層の積層を含んでもよい。一部の実施形態において、カバーシートは、２つの状態：すなわち、最初は、開口部を有さない状態（「構造化されていないカバーシート」）、及び、最後は、開口部を有する状態（「構造化されたカバーシート」）で存在するということに留意するべきである。

カバーシートにおける開口部は、一般に、円形又は長方形等のシンプルな幾何学を含むいかなる任意の形状及びサイズを有してもよい。さらに、開口部は、カバーシートの領域内に配置されるいくつかばらばらのパッチ又は開口を含んでもよい。「試料における関心のある領域での」開口部の位置決めは、構造化されたカバーシートを、開口部が少なくとも部分的に上記試料の関心のある領域と重なるように所与の生物学的試料の上に配置することができるということを意味する。好ましくは、開口部及び試料における関心のある領域は、開口部の（ほぼ）全ての点が試料における関心のある領域の対応する点に置かれ、逆もまた同様であるように、互いに実質的に一致する。しかし、いかなる他のタイプの（部分的）重複も、（例えば、開口部が試料における関心のある領域のサブエリアのみを覆う場合等）可能である。

第２の態様によると、本発明の一実施形態は、生物学的試料における関心のある領域からの生物学的試料の一部の分離に対する方法に関する。当該方法は、以下のステップ：
（ａ）生物学的試料における関心のある領域に開口部を有するカバーシートの生成、
（ｂ）ステップ（ａ）の前、間、又は後で行うことができる、生物学的試料への上記カバーシートの適用、
を含む。

開口部を有する構造化されたカバーシートが、例えば、第一に（例えばカットする又はプリントすることによって）生成され、次に、試料に適用／移されてもよい。又は、構造化されていないカバーシートが、第一に、試料に適用されてもよく、開口部が、次に、所定の位置に（例えばカットすることによって）生成されてもよい。さらに、（例えばプリントすることによって）試料の上に１つのステップで開口部を有するカバーシートを生成することも可能である。

構造化されたカバーシートが生成されると（前もって生成されようと所定の位置に生成されようと）、任意で、いくつかの試料、特に、類似の関心のある領域を有する試料に順次適用されてもよい。そのような試料は、例えば、同じ生検から連続したスライスとして得ることができる。

当該方法は、一般に、上記の種類の試料分離装置を用いて実行することができる形成ステップを含む。上記の装置に対して提供される説明は、従って、当該方法に対して類似して有効であり、逆もまた同様である。

当該試料分離装置及び方法は、容易で正確な、生物学的試料における関心のある領域からの生物学的試料の一部の分離を可能にするという利点を有する。これは、ちょうど生物学的試料における関心のある領域の位置に開口部を有するカバーシートを生物学的試料に適用する（堆積させる）ことによって達成され、これによって、関心のある領域以外の領域へのアクセスを阻止しながら関心のある領域への接近を可能にする。従って、いかなる適した方法も、関心のある領域における生物学的試料の一部（のみ）を積極的に処理するために適用することができる。特に、上記の手順は、カバーシートによって遮蔽されていない領域において、すなわち、開口部／試料における関心のある領域においてのみ効果的であるため、関心のある領域の生物学的試料の一部の抽出に対する抽出手順を生物学的試料表面全体に適用することが可能である。

以下において、本発明の種々の好ましい実施形態が、より詳細に記載されることになり、それらの実施形態は、（当該方法又は装置のいずれかに対してのみ詳細に記載されているとしても）上記の方法及び試料分離装置に関して具体化することができる。

試料における関心のある領域からの試料の一部の「分離」は、一般的に、この試料の一部を試料の残りから（ある予め独特の態様又は特徴に関して）区別可能にする（逆もまた同様である）いかなるプロセスも意味する。この分離により、さらに、生じた区別を利用することによって、上記試料の一部は、次に例えば、試料の残りからは離れた所定の位置にて処理されてもよい。好ましい実施形態において、「分離」は、カバーシートにおける開口部を介した試料における関心のある領域からの試料の一部の除去を含むか又は含意する。当該試料分離装置は、好ましくは、この目的のために、すなわち、カバーシートにおける開口部を介して試料における関心のある領域から試料の一部を除去するために「除去ユニット」を含んでもよい。

先にすでに説明されたように、構造化されたカバーシートをいくつかの試料に順次適用することができるということは、本発明の全ての実施形態に含まれる。上記の実施形態に関して、これは、後の処理ステップに対して、十分な試料の一部を（開口部を介して）上記試料から除去することができるという利点を有する。

１つの好ましい実施形態において、カバーシートは、（少なくとも）１つの側に接着剤を含む。カバーシートは、従って、生物学的試料の表面に容易に付着することができる。カバーシートの開口部の外側の試料の部分は、通常、さらなる試験を受けることはない（が正しくは廃棄される）ため、接着剤は生物学的試料の一部に、及び／又は、抽出された試料の一部を用いて実行されることになるアッセイに適合するということは必要ではない場合が多くある。この理由により、いかなる既知の、又は、市販の（接着）テープも、典型的には、カバーシートとして使用することができる。

どのようにして最初に構造化されていないカバーシートを構造化することができるか、すなわち、そのようなカバーシートに、試料における関心のある領域に開口部を提供することができるかに関して種々の方法がある。一実施形態によると、開口部は、カッティングによって、最初に構造化されていないカバーシートにおいて生成される。そのようなカッティングは、原則的に、手動で行われてもよい。より頑強で正確且つ効率的なアプローチにおいて、カッティングは、例えば、アクチュエータによって制御される一部のレーザカッティング装置又はナイフの助けを借りて自動的に行われてもよい。

別の実施形態によると、開口部は、リソグラフィーによって生成される。好ましくは、カバーシートは、この実施形態において、試料の上又は別の基板の上に直接積層することができる（固体の）フォトレジストによって具体化される。フォトレジストは、従って、光を用いた選択的な照明によって、関心のある領域の内側又は外側で変質させられ、（変質させられようと変質させられまいと）関心のある領域でのフォトレジストの除去（例えばエッチング）が続けられる。この手順の結果が、試料の上にすでにあるか又は（基板からの剥離の後で）試料まで移動させることができる構造化されたカバーシートである。別のより好ましくない、リソグラフィーを使用する方法は、所与の構造化されていないカバーシートの上にフォトレジストを適用することによるカバーシートの構造化を含む。リソグラフィーの助けを借りて、小さい空間スケールの開口部を正確に生成することができる。リソグラフィーは、「オフライン」で、すなわち、カバーシートが試料に適用される前に適用されてもよく、又は、試料への構造化されていないカバーシートの適用後に行われてもよい。フォトレジストの照明は、好ましくは、例えばマイクロミラーアレイを使用して、マスクなしのアプローチにおいて行われる。

別の実施形態において、開口部を有するカバーシートは、材料を堆積させることによって逐次（逐一）積層され、従って、始めから、開口部を有して形成する、すなわち、構造化されていないカバーシートを介在して生成する必要なく形成することができる。

逐次的な堆積は、特に、プリント又はプロットプロセスであり得る。これらの手順の成果は、例えば、デジタルコンピュータによってよく制御することができ、デジタルコンピュータ上で、試料における関心のある領域を描くデータが入手可能である。

堆積される材料は、好ましくは、堆積後に物理的及び／又は化学的に変えられてもよい。従って、その特徴を、一方で堆積プロセスに対して、もう一方でその用途に対して最適であるように変えることができる。例えば、安定したカバーシートを提供するために、材料の粘度は、堆積プロセスの間は低くあるが、その後は高くあるべきである。堆積される材料は、例えば、加熱される、冷却される、放射線に曝露される、及び／又は、酸素等の薬品に曝露されてもよい。

生物学的試料は、好ましくは、容易に取り扱うことができるように、ある種のキャリア上に提供されることになる。キャリアは、特に、（顕微鏡）スライドガラスであってもよく、それは、容易に入手可能で、多くの装置と適合するようによく標準化されており、当然ながら、当面の生物学的試料の顕微鏡検査に適しているためである。

上述の実施形態のさらなる展開において、カバーシートは、キャリアとのその整列のための整列手段を含む。従って、キャリア上の試料における関心のある領域の位置と、カバーシートにおける開口部の位置との優れたマッチングを達成することができる。好ましくは、そのような整列は、（顕微鏡等の）さらなるツールを必要とすることなく手動で行うことができる。これは、例えば、カバーシートがキャリアの形状に少なくとも部分的に合う場合（例えば、どちらも同じサイズの長方形の端を有する場合）に達成される。ユーザは、従って、単にカバーシート及びキャリアの合う部分を重複の状態に至らせて、正しい（又は、少なくとも明確な）全てを考慮に入れた位置決めを達成することができる。好ましい実施形態において、整列は、オプティカルフィードバックに基づく計算された平行移動に従って試料及びカバーシートを位置決めするオートメーション化されたソリューションによって達成される。

カバーシートにおける開口部を介した試料における関心のある領域の試料の一部の、例えばその除去の間の処置は種々の方法で行われてもよく、それらの方法から、ユーザは、当面の試料及び試料の一部を用いた意図される手順を考慮して最も適切な１つを選ぶことができる。１つの特定の実施形態において、開口部での試料の一部は、試薬、特に、緩衝液等の溶液に曝露される、溶解される、並びに／又は、加熱される及び／若しくは冷却されてもよい。試料の一部の溶解は、試料が１つ又は複数の生物学的細胞を含む場合、及び、分子診断が、抽出された試料の一部を用いて実行されるべきである場合に可能である。核酸の抽出に対する適切な組織溶解液は、例えば、特許文献６において見つけることができる。

試料の一部の加熱が、一般に、（化学）反応を促進するため有利であり得る。さらに、加熱を使用して試料の一部を融かすことができ、流れによるその除去を可能にする。例えば、冷却を適用して、加熱された試料の一部を通常の温度まで戻すことができる。

試料の一部は、一般に、融解可能な材料、特に、約３０℃から約９０℃、好ましくは約４０℃から約７０℃の適度な温度にて融ける材料を含んでもよい。そのような材料の例はパラフィンであり、生物学的試料の調製、特に、顕微鏡調査に対する組織のスライスの調製に対して使用されることが多くある。融解可能な試料の一部の材料は、試料の一部の除去の間の熱の適用によって液化することができる。さらに、そのような材料を融かすことによって相分離を達成することができ、実際の関心のある生物学的材料からの上記材料の容易な分離を可能にする。

好ましい実施形態において、試料は、キシレン（又は同等の溶媒）における浸漬、続くエタノールとのキシレン置換によって、カバーシートの適用前に脱パラフィンされる。この手順を病理研究室において使用して、染色のための試料を調製することもできる。

本発明のさらなる実施形態によると、カバーが、特に、試料の一部の除去の間にカバーシートの開口部に配置されてもよい。従って、試料における関心のある領域を含むほぼ閉じられたチャンバを作製することができる。カバーには、特に、抽出流体を試料における関心のある領域に導くための入口、及び／又は、（液化された及び／又は溶解された）試料の一部を試料における関心のある領域から排出するための出口が提供されてもよい。カバーの簡単な具体化を、顕微鏡において使用されるカバースリップを用いて達成することができる。より多用途のソリューションを、例えば接着剤を有する専用のカバーを用いて達成して、緩衝液の導入及び除去を促進する規定の体積のチャンバを作製することができる。

本発明の別の実施形態において、アクチュエータが、特に電磁放射、熱及び／又は超音波の形でエネルギーを試料に加えるために提供されてもよい。エネルギーは、例えば、試料における関心のある領域からの試料の一部の除去の間に加えられてもよい。このように、試料及び／又は基板（キャリア）からの所望の試料の一部の剥離が支援され得る。アクチュエータは、任意で、加熱器、光源及び／又は超音波トランスデューサを含んでもよい。

一般に、試料における関心のある領域は、当面の適用に適したいかなる手順によっても選択及び規定されてよい。好ましい実施形態において、試料における関心のある領域は、試料に関する対象の画像における関心のある領域から得られる。上記画像における関心のある領域は、以下において、試料における関心のある領域と区別するために「画像における関心のある領域」と呼ばれることになる。「試料に関する対象」は、試料自体であってもよい。しかし、当面の試料が採取されるに従い同じ材料から生成されるさらなる（サブ）試料（「より高レベルの試料」）であってもよい。例えば、試料と同じ生検から生成される（好ましくは隣接する）スライスであってもよい。画像は、好ましくは、例えばデジタル走査型顕微鏡を用いて生成される顕微鏡画像であってもよい。さらに、画像における関心のある領域の画定は、例えば病理学者によって手動で、若しくは、画像分析ソフトウェアによって自動的に、又は、その組合せによって行われてもよい。

上述の、選択された画像における関心のある領域からの試料における関心のある領域の誘導、及び／又は、画像における関心のある領域の選択は、好ましくは、カバーシート構造化の能力を考慮に入れながら実行される。カバーシートの構造化が、例えば、カッティング技術によって達成される場合、典型的には、空間分解及び／又は境界の曲率に対してより少ない制限が存在することになる。これらの制限を考慮に入れることによって、実際の構造化手順によって具体化することができない試料における関心のある領域又は画像における関心のある領域の使用が回避されることになる。

所与の画像における関心のある領域は、任意で、２つ以上の試料における関心のある領域を得るために使用されてもよい。例えば、所与の生検からのいくつかのスライス等、例えば、いくつか個々の試料が単一の「より高レベルの試料」から得られる場合、通常、各個々の試料／スライス上で試料における関心のある領域を同定する必要がある。画像における関心のある領域は、従って、単一の参照に基づき同定可能であってもよいが、しかし、試料における関心のある領域の位置及びその形状も、各個々のスライスに対して異なり得る。従って、同じ組織ブロックから生じる連続したスライスから試料の一部を分離する目的で、同じ画像における関心のある領域を参照するいくつかの試料における関心のある領域があってもよい。異なる試料における関心のある領域は、通常、複数の関連するカバーシートの生成を要求するということに留意するべきである。

本発明の別の実施形態において、試料の画像が、試料における関心のある領域からの試料の一部の除去後に生成されてもよい。そのような画像は、所望の試料の一部が実際に除去されたかどうかを検証するのに有用であり得る。画像は、依然として定位置にカバーシートを有して（試料側から、若しくは、カバーシートの反対側から画像を得る）、又は、カバーシートの除去後に生成されてもよい。

別の実施形態において、試料の画像は、カバーシートの開口部の正確な位置決定のためのスライド上の試料の位置及び／又は変形を検証するために、カバーシートの適用前に生成されてもよい。任意で、試料の一部が除去される前に開口部の正確な位置を検証するために、画像を、カバーシートの適用後に得ることができる。

試料における関心のある領域から得られる試料の一部は、好ましくは、分子アッセイを受けさせてもよい。これに関連して、「分子アッセイ」という用語は、広い意味で理解されることになり、いかなる検査、試験又は実験も含み、それらによって、化学組成次第である試料における関心のある領域からの試料の一部の１つ又は複数のパラメータを決定することができる。一例として、分子アッセイは、（例えば腫瘍マーカー等）特定のタンパク質又は核酸配列の（定性的若しくは定量的な）検出を含んでもよい。特に、分子アッセイは、ＰＣＲ（例えば、ｑ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑｒｔ−ＰＣＲ又はデジタルＰＣＲ等）、シーケンシング（特に次世代シーケンシング）若しくはマイクロアレイハイブリダイゼーション、又は、別の分子アッセイ技術、或いは、これらの組合せを含んでもよい。

本発明の上記及び他の態様が、以下に記載の実施形態から明らかになり、以下に記載の実施形態を参考にして説明される。

同様の参照番号は、図において、同じ又は類似の構成要素を意味している。

本発明の一実施形態に従った試料の一部の抽出の概略図である。 レーザカッティングによるカバーシートの構造化を例示した図である。 上記構造化されたカバーシートの試料への適用を例示した図である。 カバーシートの開口部での試料における関心のある領域からの試料の一部の除去を例示した図である。 開口部を有するカバーシートのプリントを例示した図である。 図５のプリントされた材料の硬化を例示した図である。 試料抽出に対する開口部を有するカバーシートを使用した実験の結果を示した図である。

患者試料（例えば組織及び細胞等）の病理診断調査は、特に腫瘍学において、多くの治療方針決定の基礎である。生検からの標準的な薄いスライスが顕微鏡スライドガラス上に提示され、さらに、例えばヘマトキシリン・エオシン（ｓｈｏｒｔ Ｈ＆Ｅ）によって、特定のプロトコルに従って染色されて、組織の形態を可視化する。最近になって、疾患特異的バイオマーカーに対するｉｎ ｓｉｔｕ染色が、組織上に存在するタンパク質への抗体の特異的結合、いわゆる免疫組織化学的検査（ＩＨＣ）、及び、染色体又は遺伝子の一部に対する設計されたヌクレオチドの配列のハイブリダイゼーション（ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション、ＩＳＨ）等に基づき、標的薬物のコンパニオン診断に対して開発されている。評価は、一般的に、明視野顕微鏡を用いて行うことができる。スライドは、調査後、診断が再評価される必要がある場合のバックアップとして長期間保管することができる。

癌細胞における遺伝子突然変異の役割の理解が増すにつれて、分子診断（「ＭＤｘ」）が、標的療法を選択すること及び治療反応を予測することに対して必要不可欠な病理学の一部になっている。これは、ｑ−ＰＣＲマイクロアレイ及び／又は組織に対する（サンガー若しくは次世代）シーケンシングによって行うことができる。ＭＤｘ分析の感度及び特異性のために、組織スライスの関連領域のみを選択することは極めて重要である。非癌性組織による希釈は、誤診をもたらす恐れがある。

現在、病理学者は、ある種のペンを用いて、ＭＤｘに対して選択される必要がある領域を標識する。次に、検査技師が、選択された領域を、同じ生検の新たな（より厚い）スライスから、又は、組織ブロックからさえも除去するよう試みる。この手順は、以下の２つの理由から非常に不正確で扱いにくい。第一に、切片の標識は、特に、画像がデジタル走査によって取得された場合に手で行うのは困難である。病理学者は、病理学者の頭の中で画像を解釈し、手でスライドを標識する必要がある。第二に、検査技師は、何も失うことなく、又は、選択された領域の外側の試料の部分をはがすことなく、試料の一部を正確にこすり取る方法を見つける必要がある。さらに、試料の汚染が問題である。

要約すると、試料抽出に対する既知の手順は、以下の欠点のうち１つ又は複数の欠点を有する。
− 扱いにくい手作業による手順
− スライドからの試料の一部の不正確な選択
− 手作業による手順による汚染のリスク
− 不正確な選択による誤診のリスク
− 選択された試料の一部の証拠文献の欠如
− 標準化及び再現性の欠如。

以下において、上記の問題に取り組み、且つ、ＭＤｘ分析に対する病理組織学的調査の後に薄い切片から組織試料の一部を選択する新たな方法を提示する本発明の一実施形態が記載される。このアプローチの１つの特徴は、湿式処理であり、すなわち、例えば組織溶解液等における選択的溶解による試料の所望の切片の除去である。（関心のある領域の外側の）望まれていない試料の部分は、スライドの上に積層される構造化された層によって保護される。

図１は、体組織の試料１１の検査に適した機構における本発明の一実施形態を概略的に例示している。組織切片からの試料の選択的除去における第１のステップは、関心のある領域の決定である。これは、病理組織学的染色手順、続く診断のための病理学者による検査に基づき行うことができる。或いは、分析を、画像分析ソフトウェアツールによって支持することができるか、又は、完全に自動的に行うことさえできる。関心のある領域は、画像分析から得られるパラメータに従って特徴づけることができる。臨床プロトコルに従って要求されるＭＤｘ分析の種類に応じて、関心のある領域画定に対する要求を採用することができる。関心のある領域の病理学的選択の後で、さらなる要求を考慮に入れて、関心のある領域の最終的な設計に達することができる。次にその設計は、ここではテープカッティングツールとして具体化される構造化ユニットに移される。カッティングツールは、整列の容易さのために、試料を担持するスライドと部分的に正確に同じ大きさを典型的には有する１つのテープを切り抜く。テープは、次に、くだんのスライドまで手動で又は自動的に移され、そこに付着させられる。これらのステップは、次に、図１を参考にしてより詳細に記載される。

検査は試料調製ユニット１００にて始まり、そこでは、キャリアとして役立つ顕微鏡スライドガラス１０の上に体組織のスライス１１が調製される。典型的には、組織試料が、約４〜１０ミクロンの薄い切片をパラフィン包埋生検からカットすることによって得られる。いわゆるクーペ（ｃｏｕｐｅ）が、ミクロトーム処理によるひずみから緩和するために水膜上の顕微鏡スライドガラス１０の上に置かれ、次に、乾燥させられる。

さらに、試料１１は、任意で、例えばＨ＆Ｅ又はＩＨＣによって等、適切な染色１２によって染色されてもよい。異なる適用に対して利用可能な多くの染色プロトコルがある。染色プロトコルは、クーペを有するスライドを、試薬を含有する異なる溶液に浸漬することによって手動でベンチの上で実行することができるが、オートメーション化された様式で行うこともできる。

画像座標をスライド１０上の実際の座標に関連づけるための参照点として後に役立ち得る１つ又は複数のマーカーＭが、顕微鏡スライドガラス１０の上にプリントされるか、又は、顕微鏡スライドガラス１０に彫り刻まれてもよい。さらに、試料１１を有するスライド１０は、任意で、後の走査の間の高い画像品質を可能にするためにカバースリップ（図示せず）で覆われてもよい。

調製ステップの後で、試料１１を有するスライド１０は、特にデジタル走査型顕微鏡であってもよい画像生成ユニット２００まで移される。

試料のデジタル画像Ｉが、顕微鏡２００によって生成され、さらに、ディスプレイ（モニター）３０１、メモリ３０３、及び、キーボード及びマウスのような入力装置３０４を有するワークステーション３０２によってここでは具体化される試料選択ユニット３００まで伝えられる。試料の画像Ｉをモニター３０１上に表示して、病理学者による目視検査を可能にすることができる。病理学者は、画像内の関心のある領域Ｒ_Ｉを同定し、従って、その領域を標識することができる。

この「画像における関心のある領域」Ｒ_Ｉの同定は、好ましくは、自動画像分析ルーチンによって支援されても（又は完全に行われても）よい。領域は、全面積等に対して最適化することができ、任意で、（試料分離装置４００において）後に適用される試料抽出技術から生じる制約を考慮に入れる。計算の結果として、画像における関心のある領域Ｒ_Ｉは決定され、スクリーン３０１上で及び／又は試料スライドを見ながら顕微鏡２００内で可視化されてもよい。

画像における関心のある領域Ｒ_Ｉは、次に、カーソルの助けにより病理学者によって手動で調整する及び選択することができる。好ましくは、病理学者は、いかなる倍率においても位置を標識することができる。標識は、典型的には、存在する病変の悪性度又は異なる細胞タイプを決めるための基礎である組織形態学に基づき行われることになる。無限の数の画像を選択及び標識することができる。終了すると、ソフトウェアが、病理学者にとって適切な倍率で選択された画像における関心のある領域の概観を提供し、さらに、必要な分解にその領域を調整してもよく、それらは、分子試験に対する試料の物理的抽出の世話をする試料分離装置４００によって後に処理することができる。画像における関心のある領域Ｒ_Ｉの境界の実際の（画像−及び／又は試料−）座標、並びに、試料分離装置４００によって解釈することができる必要な参照を含有するファイルが作製される。

ＭＤｘに対する実際の試料が、次の組織のスライスから除去され、さらに、画像分析に対して使用されたスライスからは除去されない場合、画像における関心のある領域の解釈は、画像をオーバーレイするために、次のスライスの特徴を使用してソフトウェアによって行われなければならない。そのような特徴は、任意で化学染色反応の後で光学系によって次のスライスから得ることができる。

上記のファイルは、示された切片を直接除去する能力を持つ、及び、分子試験機器（又は試料調製機器）内に導入することができる試料保持器までそれらの切片を移す試料分離装置に対する入力として使用することができる。

示された実施形態において、試料１１を有する顕微鏡スライドガラス１０は、次に、選択された画像における関心のある領域Ｒ_Ｉに対応する試料における関心のある領域、Ｒ_Ｓが、試料の残りから抽出及び分離される試料分離装置４００まで移される。好ましくは、この試料における関心のある領域Ｒ_Ｓは、例えば試験管３０等、別の保持器まで移される。さらに、試料分離装置は、任意で、いくつかの領域を連続して除去し、さらに、それらを別の分子試験に付託する能力を持っていてもよい。

試料分離装置４００は、以下の２つのサブユニット、すなわち：
− 試料における関心のある領域に開口部２４を有するカバーシート２０を提供する「構造化ユニット」４１０、
− 上記の開口部２４を介して試料における関心のある領域から試料の一部を除去する除去ユニット４２０、
を含む。

図２においてより詳細に示されているように、「カバーシート」は、例えば、１つの側に接着剤２２を有するプラスチックのキャリアシート２１等を含む（市販の）テープ２０によって具体化されてもよい。従って、構造化ユニット４１０は、市販のオートメーション化されたテープカッター（例えば、Ｒｏｌａｎｄ ＤＧ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｊａｐａｎからのカッティングプロッタ）によって具体化されてもよい。構造化ユニット４１０を用いて、所望の試料における関心のある領域に対応する開口部２４が、例えばレーザ４１１を用いて、関連するテープ片２５を切り抜くことによってテープ２０において生成される。開口部２４は、一般に、いかなる形状も有してよく、特に、いくつかばらばらのパッチから成ってもよいということに留意するべきである。

図３においてより詳細に示されているように、構造化された（予めカットされた）テープ２０は、試料１１を有するスライド１０の上に（手動で又は自動的に）積層され、それによって、接着剤２２は試料に付着する。

図４においてより詳細に示されているように、スライド１０は、次に、試料の利用できる部分、すなわち試料における関心のある領域Ｒ_Ｓを溶解するために組織溶解液に浸漬される。組織溶解液の体積を限定するため、及び、便利さの理由から、好ましい実施形態は、テープ２０の上に置かれ、さらに、組織溶解液／抽出用緩衝液を導入するために開口を有する（ブロック矢印を参照）カバー２５を使用し、開口は、その後閉じることができる。

カバー２５を有するスライド２０は、好ましくは、加熱板４２１の上に置かれ、さらに、核酸の完全な溶解及び／又は抽出、並びに任意で、試料がホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織又は組織診断試料である場合にパラフィンの融解に対する所望の温度まで持っていかれてもよい。加熱後、試料のうち曝露された部分は溶け、さらに、ＦＦＰＥ試料の場合には、パラフィンが緩衝液から相分離される。冷却後、試料を含有する緩衝液は、エッペンドルフ試験管３０にピペットで移すか若しくは注ぐ、又さもなければ、所望のバイオマーカーの精製、増幅及び検出のために分子検査ユニット５００まで移すことができる。

好ましい実施形態において、（集束）超音波が超音波トランスデューサ４２２から加えられて、細胞溶解／抽出を加速してもよい。

さらに、好結果のＭＤｘ試験に対する十分な試料を得るために、構造化されたカバーシート２０を再利用して、同じ画像における関心のある領域を参考にした（同じ生検から得られる）さらなる（連続した）スライスから試料の一部を抽出することができる。例えば、同じ試料における関心のある領域が、（関心のある領域における腫瘍細胞の数及びＭＤｘ試験の種類に応じて）同じ組織ブロック由来の１０個までのスライスから除去されてもよい。

追加的又は代替的に、１つの画像における関心のある領域が、任意で、２つ以上の試料における関心のある領域に関するカバーシートをいくつか生成するために使用されてもよい。例えば、いくつかのスライスが所与の生検から生成される場合、例えば、試料における関心のある領域の位置及びその形状もスライス毎に異なり得るため、通常、各個々のスライス上で試料における関心のある領域を同定することが必要である。

新たな画像が、試料における関心のある領域Ｒ_Ｓの抽出の前及び／又は後で、組織スライド１０から走査されて、その選択を確かめ且つ制御してもよい。この画像は、元の画像及びＭＤｘ分析の結果と共に、ワークステーション３０２上で記録保存されてもよい。

試料の残りを有する顕微鏡スライドガラス１０は、任意で、後の利用及び検証のために保管ユニット６００において保管することができるか、又は、単純に廃棄されてもよい。スライド１０を用いた後の処理ステップは、特に、別の関心のある領域を用いた、例えば少なくとも１つの新たな（特に異なる）染色及び／又は少なくとも１つの新たな（特に異なる）分子アッセイを含むフォローアップ検査を含んでもよい。

分子検査ユニット５００において、癌細胞における一点の遺伝子突然変異若しくはいかなる他のＤＮＡ突然変異、ＤＮＡ欠失、ＤＮＡ挿入、ＤＮＡ再配列又はコピー数増幅、或いは、他の構造変化を検出するため、及び／又は、癌細胞における遺伝子のＲＮＡ発現若しくは他の転写されたＤＮＡ配列の程度を決定するためのＰＣＲ（ｑ−ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲ，ｑｒｔ−ＰＣＲ、デジタルＰＣＲ等のようないくつかの技術がこの用語には含まれる）、或いは、例えば、全ゲノム若しくは全エクソームに対する、又は、より小さなゲノムの領域、エクソーム若しくはトランスクリプトームを標的とした、及び、種々の深さにおける、癌細胞における遺伝的変異のより広い範囲を決定するためのＲＮＡ又はＤＮＡシーケンシング（次世代シーケンシング）のようないくつかの分子技術が、選択された試料における関心のある領域の分析に対して利用可能であり得る。結果は、予後、又或いは、標的薬物による等の特定の治療に対する感受性に関連している癌細胞の遺伝的突然変異及びその対応するＲＮＡ発現特性の観点から、又は、すでに開始されたか又は終了した治療の効果を実際に評価する（治療モニタリングの）ために解釈される。

図５及び６は、開口部２４を有するカバーシート２０を生成する「構造化ユニット」４１０´の代わりとなる実施形態を例示しており、「構造化ユニット」４１０´は、ユニット４１０の代わりに使用して、オートメーション化された柔軟且つ正確な、標準的な顕微鏡スライドガラスからの組織の選択を可能にすることができる。

一般的な手順は、上記の手順と類似しており：第一に、関心のある領域が、好ましくは画像分析及び染色された組織の解釈に基づき、試料の画像から画像における関心のある領域として選択される。次に、この画像における関心のある領域を描くファイルが、画像における関心のある領域に対応する（さらに、試料の適用後には、試料における関心のある領域に対応する）開口部２４を有するカバーシート２０を生成することになる構造化ユニット４１０´まで移される。

構造化ユニット４１０´における決定された画像における関心のある領域の投影は整列を要求する。それを達成する２つの主な選択肢が、画像における関心のある領域の決定に使用された同定可能なスライドが使用されるかどうかに応じて存在する。その場合、さらなる画像処理を必要とすることなく、機械的整列を使用することができる。隣接する組織のスライスを有した新たなスライドの場合、新たなスライドは、構造化ユニット４１０´によって画像化される必要がある。

この実施形態の主な新規のステップは、保護的なカバーシート２０が、プリント又はプロット等の材料堆積技術によって生成されることである。

図５はこれを、プリントの場合に対して例示している。プリンタのノズル４１２は、ｘ及びｙの方向において列ごとに順次動かされて、生成されることになるカバーシート２０の領域全体をカバーする。材料が、画像／試料における関心のある領域に対応する所望される開口部２４のポイントを除く全てのポイントにてノズルから堆積される。

異なるインクが利用可能である場合、異なるプリント技術が、このステップに対して利用可能である。堆積される材料に対する主な要求は、開口部における試料の一部の分離の条件に耐えなければいけない、すなわち、上げられた温度（プロトコルに応じて、これは８０℃までになり得る）、及び、上げられたｐＨにて緩衝液において溶けてはいけないということである。基板及び組織に対する優れた接着も要求される。典型的には、カバー又はキャップがカバーシートの上に適用されて、従来の分離緩衝液の導入のための体積がつくりだされる（図４を参照）。保護的なカバーシートの上のキャップの接着も要求される。整列の制御の容易さのため、明瞭に可視の色のカバーシート２０を有することが有益である。

例えばインクジェット等の大部分のプリント技術は、低粘度のインクを要求する。これは、例えば以下の異なる方法、すなわち：
（ｉ）高粘度の材料を加熱するステップ、
（ｉｉ）低粘度の前駆材料を使用し、プリント後にそれを変えるステップ、又は
（ｉｉｉ）低粘度の溶媒において材料の溶液を作製し、プリント後にその溶媒を除去するステップ、
において達成することができる。

カバーシート２０は、任意で、例えば照射、加熱又はその組合せによって、安定化のために、プリント後にさらに処理することができる。さらに、使用するのが容易な病理学に対する溶液を有することが一般的に所望される。従って、危険な溶媒又は材料の使用による環境保護を要求しない実施形態が好ましい。

上記の考慮に応ずる１つの好ましい実施形態において、ホットメルトインクがプリントのために使用される。これは、加熱されるプリントノズル（４１２）及びインク補給を要求するが、（いずれにしても生じる冷却以外は）プリント後の処理は要求しない。この目的に対する材料は、例えば、ワックス、ＡＢＳポリマー及び／又はＰＬＡポリマーを含む。

別の好ましい実施形態において、ＵＶ硬化可能インクがプリントのために使用される。プリント後、カバーシートはＵＶ又はＵＶ−ＶＩＳ放射に曝露される一方、プリントヘッドはその放射への曝露から保護される。図６はこれを、ＵＶランプ４１３からのＵＶ照射へのプリントされたカバーシート２０の曝露に対して例示している。この目的に対する材料は、例えば、エポキシド、アクリレート、エノール及び／又はシリコーンを含む。

別の好ましい実施形態において、湿気への曝露により凝固する水により硬化可能なインクが使用されてもよい。この目的に対する材料は、例えばシリコーンを含む。

別の実施形態において、２つの反応性成分が、別々にプリントされ、スライド上に堆積されると反応して安定した層を形成してもよい。この目的に対する材料は、例えば、エポキシド及びアミン、イソチオシアネート及びアミン、無水物及びアミン、並びに／又は、エノール及びアミンを含む。

別の実施形態において、ポリマー溶液がプリントされ、さらに、乾燥させられてガラス化する。そのようなシステムは、好ましくは、水、メタノール、エタノール等のような環境に優しい溶媒を使用する。このシステムには、溶媒を周囲に蒸発させることができない場合に溶媒を収集するために、活性炭フィルタ又は凝縮容器を提供することができる。要求される溶媒の量は非常に少ない（典型的には、プリントされる体積は、１つの試料あたり０．１ｍｌ未満になり、さらに、典型的な試料の数は、１つの実験及び１日あたり１０未満になり、１日あたり１ｍｌ未満の溶媒という推定添加量をもたらす）。

マルチノズルプリンタ、ドロップオンデマンド型又はコンティニアスドロップ型プリンタを利用することができる。プリントに対する代替案として、プロットを使用することができる。その場合、材料の連続流が提供され、さらに、プロッティングヘッドが、要求された表面をカバーするように動かされる。これは、より高い粘度の材料（溶液及び／若しくは反応性混合物、並びに／又は、ホットメルト）の使用を可能にする。

開口部２４の設計は、好ましくは、試料における関心のある領域及びプリント技術からの設計の制約を考慮に入れてコンピュータプログラムによって行われる。開口部を含有するカバーシート２０は、マスクを必要とすることなく生成され、従って、いかなる調製、コスト又は時間も要求しない。いかなる形状も、サブｍｍの分解にてつくりだすことができる。

構造化ユニット４１０´において生成されるカバーシート２０の使用は、上記のものであり：試料への構造化されたカバーシートの適用後、組織の一部は溶液へ曝露され、この溶液は、（開口部の内側の）試料における関心のある領域内の生体分子を溶かすが、試料における関心のある領域の外側からの生体分子は、カバーシートの保護層によって覆われているために溶かさない。次に、生体分子を有する緩衝液は、例えば、後の任意のさらなるＰＣＲによる精製、増幅及び検出、シーケンシング又は他の分子診断技術としての分子診断分析に提供される。

任意で、カバーを、スライドの上に適用／接着して、ピペットによってカバー内のアクセスポートを介して適用及び除去することができる溶解液又は組織溶解液を制限することができる。或いは、溶解及び／又は抽出ステップのより洗練された専用の実施形態を使用することができる。

試料の一部の抽出後、残りの試料を廃棄することができ、或いは、カバーシートを、適切な処理を用いて剥がすことができ、さらに、異なる分析に対して、異なる開口部を有する別のカバーシートを生成することができる。分離緩衝液において保護層の溶液はないため、分子分析への干渉は発生しない。

記載されるアプローチは、非常に単純で頑強であり、汚染をもたらし得るひっかき行動による、開放性で機械的且つ手動の除去を回避する。このアプローチは、分子病理学において、特に、癌細胞における分子変化の同定に基づく腫瘍学における患者層別化に対して適用することができる。

要約すると、本発明の一実施形態は、ｑＰＣＲ及び／又はシーケンシングのような分子診断分析のための、病理組織学的調査後の、信頼でき便利で、好ましくは、オートメーション化された、薄い切片を有する組織スライドからの試料の一部の選択を可能にする一例として記載されてきた。１つの特徴は、湿式処理であり、すなわち、組織溶解液における選択的溶解による試料の所望の切片の除去である。当該方法は、分析に対して選択された部分以外、全ての試料を覆うことに基づく。所望されるパターンは、以前に試料切片から、又は、結果的に染色された隣接するスライスから得られる画像上の領域の選択を可能にするソフトウェアツールによって作製される。関心のある領域は、特に、画像分析及び染色された組織の解釈に基づき選択されてもよい。関心のある領域データは、（異なる試料のスライスを使用する場合に試料スライド上に置き換えられる）関心のある領域に対応する開口部を有するカバーシートを提供する装置まで移される。

テープの構造化は、市販のオートメーション化されたテープカッターによって実行することができる。或いは、カバーシートは、関心のある領域の外側の試料上に連続層を形成する材料をプリント又はプロットすることによって提供されてもよい。材料の適用は、インクジェット、コンティニアスジェット若しくは３Ｄプリントによって、又は、同様にプロットによって行うことができる。材料は、任意で、ＵＶ照射、焼付け又は乾燥によって、適用後により安定した材料に変えられる前駆材料であり得る。典型的な材料は、熱可塑性ポリマー、モノマー、又は、反応性成分との非反応性成分の混合物であり得る。

覆われていない（関心のある領域）部分から、核酸（又は他のバイオマーカー）が、上げられた温度にて閉鎖装置内で組織溶解液において溶かされる。ＦＦＰＥ材料は、前処理を必要とすることなく、又は、脱パラフィン後に使用することができる。溶解後、溶かされた材料を装置から除去し、さらに、所望の分析機器まで移すことができるか、又或いは、装置を、専用のインターフェースを介して直接結合することができる。試料の一部を、ＰＣＲによるさらなる精製、増幅及び検出、シーケンシング又は他の分子診断技術のために移すことができる。

関心のある領域の外側の領域は、例えば、病理学者又はオートメーション化されたソフトウェア解釈システムによって行われる選択に基づき、選択された領域を連続層から自動的に切り抜くカッティングツールによって構造化された層（テープ）によって覆われ、カッティングツールは、その層を、試料スライスの上に適用し、開口部を同定された関心のある領域に整列させる。検査技師は、カバーを置いて、さらに、組織溶解液を導入する必要があるだけである。当該方法は、標準的なスライドガラス上の調査される組織切片に対して直接適用することができる。選択後の検査は、容易に行うことができる。分解は、テープ構造化技術によって決定することができ、とりわけ、高分解に対しては石版であり、さらに、中分解に対してはカッティングツールであり得る。当該システムは、関心のある領域の選択及び入力材料の特徴づけのために、デジタル病理スキャナ及び画像分析ソフトウェアにリンクさせることができる。

実験結果
記載されるアプローチを、ＱｉａｇｅｎのアッセイｍｉＲＮｅａｓｙ ＦＦＰＥによるＲＮＡ抽出を使用した、ＦＦＰＥ癌細胞ＳＫＢＲ３からのｍＲＮＡの選択的抽出に対する実験において試験した。以下のプロトコル：すなわち、
− ４つの切片の４μｍ厚のホルマリン固定パラフィン包埋ＳＫＢＲ３細胞のブロックからのカット、
− 脱パラフィン：３×キシレン ８分；１００％ＥｔＯＨ ５分＆３０秒
− 開口部を含有する黒いテープ（Ｍｅｔａｍａｒｋ Ｅ−ｓｅｒｉｅｓ，ＵＫ）の適用
− 黒いテープの上でハイブリダイゼーションチャンバの適用、
− 抽出：１００μｌ／試料への２４０μｌ ＰＫＤ＋５０μｌ プロテイナーゼＫの注入、チャンバの閉鎖；６０℃にて１５分、次に、８０℃にて１５分維持、
− ハイブリダイゼーションチャンバから流体の取出し、及び、１００μｌ ＰＫＤの添加
− ＲＮＡ精製、ｃＤＮＡ反応及びＰＣＲ
を適用した。

図７は、テープにおける２つのサイズ、すなわち、それぞれ３．５ｍｍ^２及び５ｍｍ^２の開口部に対するＨＥＲ２ｍＲＮＡ及びＧＡＰＤＨｍＲＮＡ（ハウスキーピング遺伝子）に対する閾値サイクル数（ＣＴ値、縦軸）の観点から結果を示している。

比較によって、以下の差、すなわち：ｍＲＮＡコピー数における相対比：２．２３（ＰＣＲにおけるＣＴの差から変換）；開口部の表面比：２．０４（５×５／３．５×３．５）；が明らかになる。

これによって、４・１０^３細胞という（染色から得られる）３．５×３．５ｍｍ^２の開口部の切片におけるＳＫＢＲ細胞核の推定数が生じる。

本発明は、図面及び上記の説明において詳細に例示及び記述されてきたけれども、そのような例示及び記述は、例示的又は例証的であり、拘束性はないと考慮されることになり；本発明は、開示された実施形態に限定されない。開示された実施形態に対する他の変化は、請求された発明を実行する際に、図面、明細書、及び付随の特許請求の範囲の調査から当業者により理解する及びもたらすことができる。特許請求の範囲において、「含む」という用語は、他の要素又はステップを除外せず、不定冠詞はその複数形を除外しない。１つのプロセッサ又は他のユニットは、特許請求の範囲において列挙されたいくつかの項目の機能を満たすことができる。特定の手段が互いに異なる従属項において記載されているという単なる事実は、これらの手段の組合せを役立つよう使用することができないと示しているわけではない。コンピュータプログラムは、他のハードウェアと共に若しくはその一部として供給される、光記憶媒体又は固体記憶媒体等、適したメディア上に記憶／分散させてもよいが、インターネット又は他の有線若しくは無線の通信システムを介して等、他の形状で分散させてもよい。特許請求の範囲におけるいかなる参照番号も、その範囲を限定するとして解釈されるべきではない。

Claims (16)

1. 生物学的試料における関心のある領域からの前記生物学的試料の一部の分離に対する試料分離装置であって、前記生物学的試料に関する画像を使用することによって、前記関心のある領域以外の領域へのアクセスを阻止しながら前記関心のある領域へのアクセスを可能にする開口部を有するカバーシートを提供する構造化ユニットを含み、前記開口部を介して、前記生物学的試料の一部が前記関心のある領域から除去されることができる、試料分離装置。
2. 生物学的試料における関心のある領域からの前記生物学的試料の一部の分離に対する方法であって、
   （ａ）前記生物学的試料に関する画像を使用することによって、前記関心のある領域以外の領域へのアクセスを阻止しながら前記関心のある領域へのアクセスを可能にする開口部を有するカバーシートが生成されるステップ、
   （ｂ）ステップ（ａ）の前、間又は後で、前記生物学的試料へ前記カバーシートが適用されるステップ、
   （ｃ）前記生物学的試料の一部が、前記カバーシートの前記開口部を介して前記関心のある領域から除去されるステップ、
   を含む方法。
3. 前記カバーシートは、１つの側に接着剤を含む、請求項１に記載の試料分離装置。
4. 前記開口部は、カッティングによって及び／又はリソグラフィーによって生成される、請求項１に記載の試料分離装置。
5. 前記開口部を有するカバーシートは、プリント又はプロットプロセスにおいて、材料を堆積させることによって逐次的に積層される、請求項１に記載の試料分離装置。
6. 堆積される前記材料は、加熱、冷却、放射線への曝露及び／又は薬品への曝露によって、堆積後に物理的及び／又は化学的に変えられる、請求項５に記載の試料分離装置。
7. 前記生物学的試料は、キャリアの上に配置される、請求項１に記載の試料分離装置。
8. 前記関心のある領域での前記生物学的試料の一部は、加熱される、冷却される、試薬へ曝露される、及び／又は、溶解される、請求項２に記載の方法。
9. カバーが、前記開口部の上に配置される、請求項１に記載の試料分離装置。
10. アクチュエータが、電磁放射、熱及び／又は超音波等のエネルギーを前記生物学的試料に加えるために提供される、請求項１に記載の試料分離装置。
11. 前記関心のある領域の画像が、前記生物学的試料に関する画像における関心のある領域から得られる、請求項２に記載の方法。
12. 前記生物学的試料の画像が、前記関心のある領域からの前記生物学的試料の一部の除去の前及び／又は後で生成される、請求項２に記載の方法。
13. 分子アッセイが、前記関心のある領域から得られた生物学的試料の一部を用いて実行される、請求項２に記載の方法。
14. 前記キャリアは、顕微鏡スライドガラスである、請求項７に記載の試料分離装置。
15. 前記試薬は緩衝液である、請求項８に記載の方法。
16. 前記生物学的試料に関する画像は、前記生物学的試料自体の画像、又は、前記生物学的試料と同じ材料から生成されるさらなる生物学的試料の画像である、請求項１１に記載の方法。

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