JP6568193B2 - エピトープ - Google Patents

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Description

本発明は、抗原のエピトープを含むポリペプチドに関する。本発明はまた、当該ポリペプチドを含むアレルギーの診断キット、診断用組成物、及び診断方法に関する。本発明はまた、当該ポリペプチドを含む医薬組成物、及び当該ポリペプチドが除去若しくは低減された原料又は加工品に関する。本発明はさらに、当該ポリペプチドが除去若しくは低減された加工品の製造方法に関する。本発明はさらにまた、対象物における当該ポリペプチドを含む抗原の有無を判定するためのテスターに関する。
アレルギー患者の血液及び組織中では、特定の抗原（以下、アレルゲンともいう）に特異的なＩｇＥ抗体が産生される。このＩｇＥ抗体と特定の抗原の相互作用により生じた生理学的結果によりアレルギー反応が惹起される。抗原とは、広義にはアレルギー症状を引き起こす食品・食材等を示し、狭義には特異的なＩｇＥ抗体が結合する、食品・食材等に含まれるタンパク質（以下、アレルゲンコンポーネントともいう）をいう。
従来のアレルギー検査薬においては、単にアレルゲン候補の食品・食材等をすりつぶして抗原試薬を作成していることが多い（特許文献１）。このため、従来の抗原試薬中に含まれる多数のタンパク質の中で、ＩｇＥ抗体との結合について陽性反応が判定可能な閾値を超える含有量のタンパク質がアレルゲンコンポーネントであった場合にのみ、アレルギー検査における陽性反応を検出することが可能であり、診断効率は十分に高いとはいえない状態であった。
アレルゲン候補の食品・食材等において、いくつかのアレルゲンコンポーネントが示唆され、検査キットとして商品化もされているが、アレルギー検査の信頼度を高めるためには、アレルゲンコンポーネントを網羅的に特定する必要があるところ、上記アレルゲンコンポーネントの測定による患者検出率はまだまだ不十分である。
一方、アレルゲン特異的ＩｇＥ抗体は、アレルゲンコンポーネント中の特定のアミノ酸配列であるエピトープを認識して結合することから、エピトープを含むポリペプチドを用いることにより、交差性（または交差抗原性とも称する）まで考慮した診断が可能である。しかしながら、アレルゲンコンポーネントについてエピトープまで解析されている例は若干数あるもの（非特許文献１）の極めて少ないのが現状である。また、エピトープを利用したアレルギーの診断キットも現時点では市場に存在しない。
特開２００２−２８６７１６
Matsuo, H., et al., J. Biol. Chem., (2004), Vol.279, No.13, pp.12135-12140
本発明は、抗原のエピトープを含むポリペプチドを提供する。本発明はまた、当該ポリペプチドを含むアレルギーの診断キット、診断用組成物、及び診断方法を提供する。本発明はまた、当該ポリペプチドを含む医薬組成物、及び当該ポリペプチドを含む抗原が除去若しくは低減された原料又は加工品を提供する。本発明はさらに、当該抗原が除去若しくは低減された加工品の製造方法に関する。本発明はさらにまた、対象物における当該ポリペプチドを含む抗原の有無を判定するためのテスターを提供する。
本発明者らは、上記課題を解決するために、小麦に対するアレルギー反応の形態の一つである、小麦依存性運動誘発アナフィラキシー（WDEIA：Wheat-dependent exercise-induced anaphylaxis）の主な抗原であるω−５グリアジンのエピトープについて鋭意研究を行った。その結果、エピトープを見出すことに成功した。
エピトープは比較的短いアミノ酸配列を有するものであるため、異なるアレルゲンコンポーネントにも同一のアミノ酸配列が存在すれば、当該ＩｇＥ抗体は、複数のアレルゲンコンポーネントに結合可能である。異なるアレルゲンコンポーネントに共通するエピトープが存在する結果、両者にアレルギー患者のＩｇＥ抗体が結合するため、その抗原は交差性を有する。したがって、本願により特定されたエピトープは、交差性を含めたアレルギーの診断や治療、および当該エピトープを含む複数のアレルゲンコンポーネントの検出等を可能にするものである。
当該知見に基づいて、本発明は完成された。すなわち、別の態様において、本発明は以下のとおりであってよい。
［１］アレルギー患者のＩｇＥ抗体に特異的に結合するポリペプチドであって、配列番号１〜１４からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
［２］アミノ酸残基数が５００以下である、［１］に記載のポリペプチド。
［３］［１］又は［２］に記載のポリペプチドの少なくとも一つを含む、アレルギーの診断キット。
［４］アレルギーの診断用組成物であって、［１］又は［２］に記載のポリペプチドの少なくとも一つを抗原として含む、前記診断用組成物。
［５］対象のアレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程：
（ｉ）対象から得られた試料を抗原に接触させる、ここで当該試料はＩｇＥ抗体が含まれる溶液である；
（ｉｉ）対象から得られた試料中のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合を検出する；
（ｉｉｉ）対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がアレルギーであることの指標が提供される；
を含み、ここで当該抗原は、［１］又は［２］に記載のポリペプチドの少なくとも一つである、前記方法。
［６］［１］又は［２］に記載のポリペプチドの少なくとも一つを含む医薬組成物。
［７］アレルギーを治療するための、［６］に記載の医薬組成物。
［８］［１］又は［２］に記載のポリペプチドの少なくとも一つと結合する抗体を含むことを特徴とする、対象物における抗原の有無を判定するためのテスター。
［９］抗原が除去若しくは低減されていることを特徴とする原料又は加工品であって、当該抗原は［１］又は［２］に記載のポリペプチドの少なくとも一つである、前記原料又は加工品。
［１０］抗原が除去若しくは低減されている加工品の製造方法であって、当該加工品の製造過程で抗原が除去若しくは低減されていることを確認するステップを有し、ここで当該抗原は［１］又は［２］に記載のポリペプチドの少なくとも一つである、前記製造方法。
［１１］［１］に記載のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列の一部および／またはその相補鎖の一部を含むプライマーを含むことを特徴とする、対象物におけるアレルギーの原因となる抗原の有無を判定するためのテスター。
本発明により、抗原のエピトープを含む新規ポリペプチドを提供することができる。本発明のポリペプチドを利用することにより、アレルギーの高感度な診断キット、診断用組成物、及び診断方法、当該ポリペプチドを含む医薬組成物、対象物における当該ポリペプチドを含む抗原の有無を判定するためのテスター、並びに当該ポリペプチドが除去若しくは低減された原料又は加工品、及びその加工品の製造方法を提供することができる。
図１は、作成したペプチドアレイにおける配列番号６および配列番号１３のアミノ酸配列を有するペプチドのスポットに対する、ヒト血清を用いた化学発光の測定結果を示す図である。Ｐ１〜Ｐ３はＷＤＥＩＡ患者１〜３の血清を、Ｎ１およびＮ２は健常者１および２の血清を用いたことを示す。 図２は、オーバーラッピングの手法により、パンコムギω−５グリアジンの全長アミノ酸配列（UniProtアクセッション番号：Q402I5、配列番号５１）における、配列番号１５および２３中のエピトープとして機能する最少のアミノ酸数を有するペプチド（配列番号２２および２９）を決定した結果を示す図である。横軸の数値は、４５０ｎｍの発色強度を吸光度計で測定した値を示す（Ａｂｓ．）。Ｐ１は患者１の血清を用いたことを示す。 図３は、アラニンスキャンの手法により、配列番号２２および２９について、抗原性の発現のために重要な位置を検討した結果を示す図である。横軸の数値は、４５０ｎｍの発色強度を吸光度計で測定した値を示す（Ａｂｓ．）。図中、二重波線は値を省略していることを示し、Ｐ１は患者１の血清を、Ｎ１およびＮ２は健常者１および２の血清を、２ｎｄは二次抗体の抗ヒトＩｇＥ抗体のみを用いたことを示す。
以下に本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
本明細書で特段に定義されない限り、本発明に関連して用いられる科学用語及び技術用語は、当業者によって一般に理解される意味を有するものとする。
本明細書においてアレルギーとは、ある抗原に感作されている生体に、再びその抗原が入った場合に起こる、生体に不都合な過敏反応を示す状態をいう。抗原と接触した場合、あるいは当該抗原を摂取した場合に、アレルギー反応を生じ得る。ここで接触は物体に触れることをいい、特に人体に対しては皮膚、粘膜（眼、口唇等）等に付着することをいう。また、摂取は体内に取り込むことをいい、吸入、経口等の手段で取り込むことをいう。一般的に食物を摂取した場合に生じるアレルギー反応を特に食物アレルギーという。好ましい態様においてアレルギーは食物アレルギーであってもよい。食物におけるアレルギーの多くにおいてＩｇＥ抗体が関与しており、ＩｇＥ抗体は、肥満細胞、好塩基球等と結合する。抗原が再びアレルギー患者の体内に入ると、当該抗原は肥満細胞、好塩基球等と結合したＩｇＥ抗体と組み合わさり、ＩｇＥ抗体−抗原相互作用の生理学的効果を生ずる。これらの生理学的効果として、ヒスタミン、セロトニン、ヘパリン、好酸球遊走因子または各種ロイコトリエン等の放出が挙げられる。これらの放出物質は、ＩｇＥ抗体と特定の抗原の組み合わせにより起こるアレルギー反応を惹起する。詳しくは、ＩｇＥ抗体は、特定の抗原中の特定のアミノ酸配列であるエピトープを認識して結合し、当該抗原によるアレルギー反応は、上記の経路を通じて現れる。
本発明が対象とするアレルギーは、使用するエピトープを含む抗原に対するアレルギーである限り、特に限定されない。そのようなアレルギーはイネ科、アブラナ科、バラ科、パパイア科、マメ科、ブドウ科、クルミ科、トウダイグサ科、ヒユ科、パイナップル科、ナス科、キジカクシ科、ウリ科、ミカン科、ヒノキ科、もしくはカバノキ科の植物、またはマユハキタケ科の菌類に対するアレルギーを含んでいてもよい。イネ科の植物としては、コムギ属のパンコムギ（学名Triticum aestivum）、ヒトツブコムギ（学名Triticum monococcum）、トリティカム ディココイデス（学名Triticum dicoccoides）、ウラルツコムギ（学名Triticum urartu）、エギロプス属のタルホコムギ（学名Aegilops tauschii）、エギロプス ウニアリスタタ（学名Aegilops uniaristata）、チノピラム属のチノピラム エロンガタム（学名Thinopyrum elongatum）、プサチロスタチス属のプサチロスタチス ジュンセア（学名Psathyrostachys juncea）、モロコシ属のモロコシ（学名Sorghum bicolor）等が挙げられ、アブラナ科の植物としては、アブラナ属のセイヨウアブラナ（学名Brassica napus）、ラファナス属のラディッシュ（学名Raphanus sativus）等が挙げられ、バラ科の植物としては、サクラ属のセイヨウミザクラ（学名Prunus avium）、ウメ（学名Prunus mume）、モモ属のモモ（学名Prunus persica）、リンゴ属のリンゴ（学名Malus domestica）等が挙げられ、パパイア科の植物としては、パパイア属のパパイア（学名Carica papaya）等が挙げられ、マメ科の植物としては、キマメ属のキマメ（学名Cajanus cajan）、ササゲ属のアズキ（学名Vigna angularis）、ダイズ属のダイズ（学名Glycine max）、ツルマメ（学名Glycine soja）、インゲンマメ属のインゲンマメ（学名Phaseolus vulgaris）、ヒヨコマメ属のヒヨコマメ（学名Cicer arietinum）等が挙げられ、ブドウ科の植物としては、ブドウ属のヨーロッパブドウ（学名Vitis vinifera）等が挙げられ、クルミ科の植物としては、クルミ属のシナノグルミ（学名Juglans regia）等が挙げられ、トウダイグサ科の植物としては、イモノキ属のキャッサバ（学名Manihot esculenta）、パラゴムノキ属のパラゴムノキ（学名Hevea brasiliensis）等が挙げられ、ヒユ科の植物としては、アカザ属のキヌア（学名Chenopodium quinoa）、ホウレンソウ属のホウレンソウ（学名Spinacia oleracea）等が挙げられ、パイナップル科の植物としては、アナナス属のパイナップル（学名Ananas comosus）等が挙げられ、ナス科の植物としては、ナス属のジャガイモ（学名Solanum tuberosum）等が挙げられ、キジカクシ科の植物としては、クサスギカズラ属のアスパラガス（学名Asparagus officinalis）等が挙げられ、ウリ科の植物としては、キュウリ属のメロン（学名Cucumis melo）等が挙げられ、ミカン科の植物としてはミカン属のオレンジ（学名Citrus sinensis）、クレメンタイン（学名Citrus clementina）等が挙げられ、ヒノキ科の植物としては、スギ属のスギ（学名Cryptomeria japonica）等が挙げられ、カバノキ科の植物としては、カバノキ属のシラカンバ（学名Betula platyphylla）等が挙げられ、マユハキタケ科の菌類としては、コウジカビ属のアスペルギルス タルコサス（学名Aspergillus turcosus）等が挙げられる。
本明細書において小麦に対するアレルギーとは、コムギ連（学名Triticeae）に属する植物に含まれるタンパク質等を抗原として生じるアレルギー反応を有する状態をいう。コムギ連には、例えばパンコムギ、クラブコムギ（学名Triticum compactum）、デュラムコムギ（学名Triticum durum）等のコムギ属（学名Triticum）、タルホコムギ等のエギロプス属（学名Aegilops）、チノピラム エロンガタム等のチノピラム属（学名Thynopyrum）が挙げられる。好ましい態様において小麦に対するアレルギー反応は、主な抗原としてω−５グリアジンが関与することが知られる小麦依存性運動誘発アナフィラキシーであってもよい。
以下、本明細書において抗原とは、アレルギー反応を惹起させる物質であり、アレルゲンコンポーネントとも称される。抗原は好ましくはタンパク質である。
本明細書においてタンパク質とは、アミノ酸がペプチド結合により連結された構造を有する分子である。タンパク質に含まれるアミノ酸の数は特に限定されない。本明細書において「ポリペプチド」の用語もまた、アミノ酸がペプチド結合により連結された構造を有する分子を意味する。ポリペプチドに含まれるアミノ酸の数は特に限定されない。「ポリペプチド」は、「タンパク質」を含む概念である。また、２〜５０個程度のアミノ酸がペプチド結合により連結されたポリペプチドを、特にペプチドと呼ぶことがある。また、アミノ酸に関して光学異性体があり得る場合は、特に明示しなければＬ体を示す。本明細書で用いるタンパク質、ポリペプチドまたはペプチドのアミノ酸配列の表記法は、標準的用法及び当業界で慣用されている表記法に基づき、アミノ酸の一文字表記で表され、左方向はアミノ末端方向であり、そして右方向はカルボキシ末端方向である。なお、アミノ酸の一文字表記においてＸは、両端のアミノ酸と結合できるアミノ基およびカルボキシル基を有する物質であればいずれでもよく、特に２０種類の天然のアミノ酸のいずれかであってもよいことを表す。
本明細書において、「別のアミノ酸に置換された」とは、元の配列のアミノ酸に対して異なるアミノ酸に置換されていることを意味する。好ましい態様において、置換は保存的置換である。保存的置換とは、特定のアミノ酸残基を類似の物理化学的特徴を有する残基で置き換えることであるが、元の配列の構造に関する特徴を実質的に変化させなければいかなる置換であってもよく、例えば、置換アミノ酸が、元の配列に存在するらせんを破壊したり、元の配列を特徴付ける他の種類の二次構造を破壊したりしなければいかなる置換であってもよい。以下に、アミノ酸残基の保存的置換について置換可能な残基ごとに分類して例示するが、置換可能なアミノ酸残基は以下に記載されているものに限定されるものではない。
Ａ群：ロイシン、イソロイシン、バリン、アラニン、メチオニン
Ｂ群：アスパラギン酸、グルタミン酸
Ｃ群：アスパラギン、グルタミン
Ｄ群：リジン、アルギニン、
Ｅ群：セリン、スレオニン
Ｆ群：フェニルアラニン、チロシン
非保存的置換の場合は、上記種類のうち、ある１つのメンバーと他の種類のメンバーとを交換することができる。例えば、不用意な糖鎖修飾を排除するために上記のＢ、Ｄ、Ｅ群のアミノ酸をそれ以外の群のアミノ酸に置換してもよい。または、３次構造でタンパク質中に折りたたまれることを防ぐためにシステインを欠失させるか、他のアミノ酸に置換してもよい。あるいは、親水性／疎水性のバランスが保たれるように、または合成を容易にするために親水度を上げるように、アミノ酸に関する疎水性／親水性の指標であるアミノ酸のハイドロパシー指数（J. Kyte 及びR. Doolittle, J. Mol. Biol., Vol.157, p.105-132, 1982）を考慮して、アミノ酸を置換してもよい。
別の態様として、元のアミノ酸よりも立体障害の少ないアミノ酸への置換、例えばＦ群からＡ、Ｂ、Ｃ、Ｄ、Ｅ群への置換；電荷を持つアミノ酸から電荷を持たないアミノ酸への置換、例えばＢ群からＣ群への置換、をしてもよい。そうすることで、ＩｇＥ抗体との結合性が向上することがある。
本明細書において、２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査及び数学的計算によって決定することができる。また、コンピュータープログラムを用いて同一性％を決定することもできる。そのようなコンピュータープログラムとしては、例えば、ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ（Altschulら、 J. Mol. Biol., 215:403-410(1990)）、及びＣｌｕｓｔａｌＷ等があげられる。特に、ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は、Altschulら(Nucl. Acids. Res., 25, p.3389-3402, 1997)に記載されたもので、米国バイオテクノロジー情報センター（ＮＣＢＩ）やDNA Data Bank of Japan（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから公的に入手することができる（ＢＬＡＳＴマニュアル、Altschulら NCB/NLM/NIH Bethesda, MD 20894；Altschulら）。また、遺伝情報処理ソフトウエアGENETYX Ver.7（ゼネティックス）、DNASIS Pro（日立ソフト）、Vector NTI（Infomax）等のプログラムを用いて決定することもできる。
抗原のエピトープ
ω−５グリアジンについて、実施例１および２に示すとおり、エピトープおよびそのエピトープ内でアレルギー患者のＩｇＥ抗体との結合性に重要なアミノ酸を特定した。
本発明は、アレルギー患者のＩｇＥ抗体に特異的に結合するアミノ酸配列を含むポリペプチドとして、以下（１）〜（６）からなる群より選択されるポリペプチドを提供する。
（１）配列番号６及び１３からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（２）XEXPXXQ（配列番号１）、好ましくはQEXPXXQ（配列番号２）、より好ましくはQEXPXQQ（配列番号３）、さらに好ましくはQXEXPXXQ（配列番号４）、最も好ましくはFPQXEXPXXQ（配列番号５）のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（３）PXQXXPQQ（配列番号８）、好ましくはPQQXXPQQ（配列番号９）、より好ましくはFPXQXXPQQ（配列番号１０）、さらに好ましくはPXQXXPQQH（配列番号１１）、最も好ましくはFPXQXXPQQH（配列番号１２）のアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（４）QEFPQQQ（配列番号２２）の１、３、５、６番目に相当するアミノ酸のいずれか１、２、３、又は４個のアミノ酸が別のアミノ酸、好ましくはアラニンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。好ましくは、配列番号２２の３、５、６番目に相当するアミノ酸のいずれか１、２、又は３個のアミノ酸が別のアミノ酸、好ましくはアラニンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。より好ましくは、配列番号２２の３、５番目に相当するアミノ酸のいずれか１又は２個のアミノ酸が別のアミノ酸、好ましくはアラニンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。さらに好ましくは、QQEFPQQQ（配列番号４６）の２、４、６、７番目に相当するアミノ酸のいずれか１、２、３、又は４個のアミノ酸が別のアミノ酸、好ましくはアラニンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。最も好ましくは、FPQQEFPQQQ（配列番号４７）の４、６、８、９番目に相当するアミノ酸のいずれか１、２、３、又は４個のアミノ酸が別のアミノ酸、好ましくはアラニンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（５）PQQQPPQQ（配列番号２９）の２、４、５番目に相当するアミノ酸のいずれか１、２、又は３個のアミノ酸が別のアミノ酸、好ましくはアラニンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。好ましくは、配列番号２９の４、５番目に相当するアミノ酸のいずれか１又は２個のアミノ酸が別のアミノ酸、好ましくはアラニンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。より好ましくは、FPQQQPPQQ（配列番号４８）の３、５、６番目に相当するアミノ酸のいずれか１、２、又は３個のアミノ酸が別のアミノ酸、好ましくはアラニンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。さらに好ましくは、PQQQPPQQH（配列番号４９）の２、４、５番目に相当するアミノ酸のいずれか１、２、又は３個のアミノ酸が別のアミノ酸、好ましくはアラニンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。最も好ましくは、FPQQQPPQQH（配列番号５０）の３、５、６番目に相当するアミノ酸のいずれか１、２、又は３個のアミノ酸が別のアミノ酸、好ましくはアラニンに置換されたアミノ酸配列を含むポリペプチド。
（６）配列番号７及び配列番号１４からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列を含むポリペプチド。
但し、前記（１）〜（６）配列のポリペプチドは、パンコムギのω−５グリアジンの全長アミノ酸配列（配列番号５１）に対して同一または９０％以上、８０％以上もしくは７０％以上の同一性を有する変異体を含まないものであってもよい。
なお、配列番号６及び１３は、それぞれパンコムギのω−５グリアジンの全長アミノ酸配列（配列番号５１）のアミノ酸２２１〜２３５（配列番号６）及び１６１〜１７５（配列番号１３）に相当する。
上記（２）及び（３）のポリペプチドについて、Ｘで表される残基は、実施例１に示すアラニンスキャンの手法（非特許文献１）により、アラニンに置換してもアレルギー患者のＩｇＥ抗体への結合性が維持された部位のアミノ酸残基である。このような部位については、他のいずれかのアミノ酸に置換した場合も当該ＩｇＥ抗体への結合性を維持する蓋然性が高いことは、当業者に周知である。
上記（１）〜（６）のポリペプチドの長さは特に限定されない。好ましい態様において、上記（１）〜（６）のポリペプチドの長さは、１０００アミノ酸以下、７００アミノ酸以下、５００アミノ酸以下、３００アミノ酸以下、２００アミノ酸以下、１００アミノ酸以下、５０アミノ酸以下、３０アミノ酸以下、２０アミノ酸以下、１０アミノ酸以下、または５アミノ酸以下であってもよい。
上記（１）〜（６）のポリペプチドは、ペプチドの固相合成など化学合成の手法により調製してもよい。または、エピトープを含むポリペプチドは、当業者に周知の遺伝子組換え技術により組換えタンパク質として発現させ、そして当業者に周知のタンパク質精製方法により分離・精製することによって得てもよい。
診断キット・診断方法
本発明は、対象のアレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程：
（ｉ）対象から得られた試料を抗原に接触させる、ここで当該試料はＩｇＥ抗体が含まれる溶液である；
（ｉｉ）対象から得られた試料中のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合を検出する；
（ｉｉｉ）対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がアレルギーであることの指標が提供される；
を含み、ここで当該抗原は上記（１）〜（６）のポリペプチドの少なくとも一つであるポリペプチド、または２以上の上記（１）〜（６）のポリペプチドがスペーサーを介してもしくは介さずに連結されたポリペプチドである、前記方法を提供する。
以下、上記（１）〜（６）のポリペプチドの少なくとも一つであるポリペプチド、または２以上の上記（１）〜（６）のポリペプチドがスペーサーを介してもしくは介さずに連結されたポリペプチドを、本明細書において「上記（１）〜（６）を含む抗原」と記載する。スペーサーの種類は特に限定されず、複数のペプチドを連結するのに当業者が通常使用するものを利用できる。スペーサーは例えば、Ａｃｐ（６）-ＯＨなどの炭化水素鎖であってもよい。
対象から得られた試料とは、対象から採取されたＩｇ抗体、特にＩｇＥ抗体、が含まれる溶液である。そのような溶液には、例えば、血液、唾液、痰、鼻水、尿、汗、涙が含まれる。対象から得られた試料は、上記（１）〜（６）を含む抗原に接触させる前に、試料中のＩｇＥ抗体濃度を高めるための前処理が施されていてもよい。試料の前処理としては、例えば血液から血清、血漿を得ることが含まれてもよい。またさらに、上記（１）〜（６）を含む抗原との結合部分であるＦａｂ部分を精製してもよい。特に好ましい態様において、上記工程（ｉ）は、対象から得られた血清中のＩｇＥ抗体と抗原を接触させることにより行われる。
ＩｇＥ抗体は、ＩｇＥ抗体そのものであってもよく、ＩｇＥ抗体が結合した肥満細胞等であってもよい。
対象から得られた試料と上記（１）〜（６）を含む抗原との接触およびその結合の検出は、既知の方法により行うことが可能である。そのような方法には、例えば、ＥＬＩＳＡ（Enzyme-Linked Immunosorvent Assay）、サンドイッチ免疫測定法、イムノブロット、免疫沈降法、イムノクロマト法による検出を用いることができる。これらはいずれも、上記（１）〜（６）を含む抗原に対象のＩｇＥ抗体を接触させて結合させ、上記（１）〜（６）を含む抗原に特異的に結合したＩｇＥ抗体に対して酵素標識した二次抗体を作用させ、酵素の基質（通常は、発色あるいは発光試薬）を加えて酵素反応の生成物を検出することにより、上記（１）〜（６）を含む抗原と対象のＩｇＥ抗体の結合を検出する手法である。もしくは、蛍光標識した二次抗体を検出する方法である。あるいは、表面プラズモン共鳴（SPR）等の、上記（１）〜（６）を含む抗原とＩｇＥ抗体の結合を評価可能な測定方法による検出を用いることもできる。複数種の上記（１）〜（６）を含む抗原特異的ＩｇＥ抗体が混合されていてもよい。
上記（１）〜（６）を含む抗原は、担体に固定されている状態であってもよい。この場合は上記工程（ｉ）および（ｉｉ）においてＥＬＩＳＡ、サンドイッチ免疫測定法、イムノクロマト法、表面プラズモン共鳴等が利用でき、上記工程（ｉ）は、対象から得られた試料を、上記（１）〜（６）を含む抗原を固定した面に接触させることにより行う。また、対象のＩｇＥ抗体が担体に固定されている状態のものを利用し、上記の手法により上記（１）〜（６）を含む抗原との結合を検出してもよい。
上記（１）〜（６）を含む抗原は担体に固定されていない状態であってもよい。この場合は、上記工程（ｉ）および（ｉｉ）において、フローサイトメトリー等が利用でき、レーザー光によりＩｇＥ抗体が結合した上記（１）〜（６）を含む抗原の存在を確認できる。この方法は例えば、上記（１）〜（６）を含む抗原の接触により好塩基球が活性化したときに現れる表面抗原ＣＤ２０３ｃを検出する方法である、好塩基球活性化試験（ＢＡＴ）が挙げられる。また、上記（１）〜（６）を含む抗原を試料中の血球にさらに接触させることにより、ヒスタミンを遊離するかどうかを調べるヒスタミン遊離試験（ＨＲＴ）も挙げられる。
上記（１）〜（６）を含む抗原は、アレルギー患者のＩｇＥ抗体と特異的に結合する抗原である。したがって、対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がアレルギーであることの指標が提供される。
本発明はまた、上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つを含むアレルギーの診断キットを提供する。本発明の診断キットは、上記のアレルギーを診断するための指標を提供する方法、または下記の診断方法に用いてもよい。本発明の診断キットは、上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つを含むほか、酵素標識された抗ＩｇＥ抗体および当該酵素の基質となる発色基質または発光基質を含んでいてもよい。また、蛍光標識された抗ＩｇＥ抗体を用いてもよい。本発明の診断キットにおいて、上記（１）〜（６）を含む抗原は担体に固定化された状態で提供されてもよい。本発明の診断キットはまた、診断のための手順についての説明書や当該説明を含むパッケージと共に提供されてもよい。
別の態様において、上記の診断キットは、アレルギーについてのコンパニオン診断薬を含む。コンパニオン診断薬とは、医薬品の効果が期待される患者の特定または医薬品の重篤な副作用リスクを有する患者の特定、あるいは医薬品を用いた治療の最適化のために当該医薬品の反応性を検討するために用いるものである。ここで治療の最適化とは、例えば、用法容量の決定や投与中止の判断、どのアレルゲンコンポーネントを使って免疫寛容するかの確認等が含まれる。
本発明はまた、上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つを含むアレルギーの診断用組成物を提供する。本発明の診断用組成物は、下記の診断方法に用いることができる。本発明の診断用組成物は、必要に応じて本発明の抗原とともに一般的に用いられる、薬学的に許容される担体や添加剤を含んでいてもよい。
一態様において、本発明は、対象のアレルギーを診断する方法であって、以下の工程：
（ｉ）対象から得られた試料を抗原に接触させる；
（ｉｉ）対象から得られた試料中のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合を検出する；
（ｉｉｉ）対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がアレルギーであると判断する；
ことを含み、ここで当該抗原は上記（１）〜（６）を含む抗原として特定されるタンパク質の少なくとも一つである、前記方法を提供する。ここにおいて（ｉ）および（ｉｉ）の各工程は、アレルギーを診断するための指標を提供する方法の各工程について説明したとおりに行われる。
別の態様において、本発明は、対象のアレルギーを診断する方法であって、上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つを対象に投与することを含む、前記方法を提供する。当該方法は、皮膚に上記（１）〜（６）を含む抗原を適用することを特徴とする皮膚テストの形式で行ってもよい。皮膚テストには、皮膚上に診断用組成物を適用した後に、出血しない程度に微少な傷をつけることで皮膚に上記（１）〜（６）を含む抗原を浸透させて皮膚反応を観察するプリックテスト、診断用組成物を適用した上に皮膚を少し引っ掻いて反応を観察するスクラッチテスト、クリームや軟膏などの形態の診断用組成物を皮膚に適用して反応を観察するパッチテスト、上記（１）〜（６）を含む抗原を皮内に投与して反応を観察する皮内テスト、などの形態が含まれる。上記（１）〜（６）を含む抗原を適用した部分の皮膚に腫れなどの皮膚反応が生じた場合、その対象はアレルギーを有すると診断する。ここで、皮膚に適用する上記（１）〜（６）を含む抗原の量は、例えば、１回あたり１００μｇ以下の用量であってよい。
アレルギーの診断においては、抗原の特定を目的とした負荷試験がしばしば行われている。上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つは、アレルギーであることを診断するための負荷試験の有効成分として用いることができる。ここで、負荷試験に用いるアレルゲンコンポーネントとしては、発現精製したポリペプチドであってもよく、例えば、イネにスギ花粉抗原の遺伝子を形質転換し、その抗原タンパク質を米内に発現させた花粉米のように、食品・食材において発現させたものであってもよい。
また別の態様において、本発明はアレルギーの診断に使用するための上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つを提供する。
さらなる別の態様において、本発明はアレルギーの診断薬の製造のための上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つの使用を提供する。
本項目において、診断または検出対象となるアレルギーは、上記（１）〜（６）を含む抗原に対するアレルギーであってよい。すなわち、アレルギーの検出は、単一の上記（１）〜（６）を含む抗原に対するアレルギーのみならず、交差性を含めたアレルギーを検出するものであり得る。
医薬組成物・治療方法
本発明は、上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つを含む医薬組成物を提供する。一態様において、上記の医薬組成物は、アレルギーを治療するために用いられる。アレルギーの治療とは、体内に取り込んでも発症しない抗原の限界量を増やすことであり、最終的には通常の抗原の摂取量では発症しない状態（寛解）を目指すものである。
本発明はまた、アレルギーの治療を必要とする患者に対して、上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つを投与することを含む、アレルギーを治療する方法を提供する。
別の態様において、本発明はアレルギーの治療に使用するための上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つを提供する。さらに別の態様において本発明は、アレルギーの治療薬の製造のための上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つの使用を提供する。
アレルギーの治療においては、患者に抗原を投与することで免疫寛容へと誘導することを目標とした、減感作療法がしばしば行われている。上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つは、アレルギーに対する減感作療法のための有効成分として用いることができる。ここで、減感作療法に用いるアレルゲンコンポーネントとしては、発現精製したポリペプチドであってもよく、例えば花粉米のように、食品・食材において発現させたものであってもよい。
本発明の医薬組成物は、通常の投与経路により投与することができる。通常の投与経路には例えば、経口、舌下、経皮、皮内、皮下、血液内、鼻腔内、筋肉内、腹腔内、直腸内の投与が含まれる。
本発明の医薬組成物は、必要に応じて上記（１）〜（６）を含む抗原と共に、一般的に用いられる薬学的に許容されるアジュバント、賦形剤、または各種の添加剤（例えば安定剤、溶解補助剤、乳濁化剤、緩衝剤、保存剤、着色剤等）を常法により添加した医薬組成物として用いることができる。医薬組成物の剤型は、投与経路に応じて当業者が適宜選択することができる。例えば、錠剤、カプセル剤、トローチ、舌下錠、注射剤、鼻腔内噴霧剤、パップ剤、液剤、クリーム剤、ローション剤、等の形態であってよい。本発明の医薬組成物の投与量、投与回数および／または投与期間は、投与経路、症状、年齢や体重などの患者の特性等に応じて医師が適宜選択することができる。例えば、成人の場合、１回あたり１００μｇ以下の用量で投与してもよい。投与間隔は、例えば、毎日、毎週１回、月に２回、又は３ヶ月に１回程度であってよい。投与期間は例えば、数週間から数年であってよい。投与期間内において、投与量を段階的に増加させる投与方法であってもよい。
本項目において、治療対象となるアレルギーは、上記（１）〜（６）を含む抗原に対するアレルギーであってよい。すなわち、アレルギーの治療は、単一の上記（１）〜（６）を含む抗原に対するアレルギーのみならず、交差性を含めたアレルギーを治療するものであり得る。
テスター
本発明は、上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つに対する抗体を含むテスターを提供する。
当該抗体は、常法により作製することができる。例えば、ウサギなどの哺乳動物を、上記（１）〜（６）を含む抗原で免疫することにより作製してもよい。当該抗体は、Ｉｇ抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、またはそれらの抗原結合フラグメント（例えば、Ｆａｂ、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’）であってもよい。
また、上記のテスターにおいて、当該抗体は担体に結合した形で提供されていてもよい。担体は、抗体と上記（１）〜（６）を含む抗原の結合の検出に利用可能な担体であれば特に限定されない。当業者に公知の任意の担体が利用できる。また、上記（１）〜（６）を含む抗原に対する抗体が、上記「抗原のエピトープ」の項目に記載されたエピトープに対する抗体であることが好ましい。それにより、交差性を含めて検出できるテスターとすることができる。
上記（１）〜（６）を含む抗原含有の有無を調べる方法としては、例えば、以下の方法が挙げられる。
・作製した抗体を含むテスターを原料・加工品等から得られた試料に接触させて、例えばＥＬＩＳＡ法を用いて当該抗体と試料中の上記（１）〜（６）を含む抗原との結合を検出し、当該抗体と上記（１）〜（６）を含む抗原との結合が検出された場合に、対象原料・加工品等に当該抗原が残留していると判断する方法。
・ろ紙などに原料・加工品等をしみこませ、そこに含まれる上記（１）〜（６）を含む抗原を検出するように、抗体溶液を反応させる方法。
本発明の別の態様において、エピトープに対応するプライマーを含むことを特徴とする、対象物におけるアレルギーの上記（１）〜（６）を含む抗原の有無を判定するためのテスターを含む。非限定的に、上記プライマーは例えば、上記（１）〜（６）で特定したアミノ酸配列をコードする核酸の塩基配列の一部および／またはその相補鎖の一部を含むように設計されたものであってもよい。具体的態様として、抗原がω−５グリアジンである場合、上記プライマーは、ω−５グリアジン遺伝子の全長塩基配列（EMBL-Bank/ENAアクセッション番号：BAE20328.1、配列番号５２）の塩基配列の一部および／または配列番号５２の塩基配列の相補鎖の一部を含むように設計される。例えば、配列番号５２の塩基配列の５’末端もしくは中央部分の配列および／または配列番号５２の塩基配列の相補鎖の５’末端の配列、あるいは配列番号５２で示される塩基配列の５’末端の配列および／または配列番号５２の塩基配列の相補鎖の５’末端もしくは中央部分の配列の、好ましくは、１２塩基、１５塩基、２０塩基、２５塩基の塩基配列を有するように設計される。また、上記プライマーは、上記（１）〜（６）で特定したアミノ酸配列であるエピトープを含むタンパク質をコードする核酸において、当該エピトープをコードする部分の上流側の領域の塩基配列またはそのエピトープをコードする部分の相補鎖の上流側の領域の塩基配列となるように設計されたものであってもよい。ここで、抗原がω−５グリアジンである場合の全長配列におけるエピトープの位置は、上記「抗原のエピトープ」の項目において特定した通りである。また、特にｍＲＮＡを対象とする場合は、ポリＡテールの相補プライマーを有していてもよい。
例えば、試料から得られたＤＮＡまたはｍＲＮＡを鋳型として、前記プライマーを用い、ＲＴ−ＰＣＲを含むＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction）でＤＮＡを増幅し、増幅されたＤＮＡの配列において、上記（１）〜（６）で特定したアミノ酸配列をコードする核酸を含むか否かを判定することで、上記（１）〜（６）を含む抗原の有無を判断する。また、ｍＲＮＡを対象にＰＣＲで増幅する方法は、ＲＡＣＥ法等が例示できる。増幅されたＤＮＡにおいて可能な３通りのオープンリーディングフレームがコードするアミノ酸配列の一つが、上記（１）〜（６）で特定したアミノ酸配列（例えば、配列番号１または８）を含む場合、抗原を有すると判断する。ＤＮＡが増幅されない場合は、抗原を有しないと判断する。具体的態様として、抗原がω−５グリアジンである場合、増幅されたＤＮＡにおいて可能な３通りのオープンリーディングフレームがコードするアミノ酸配列を配列番号２２または２９と比較することで、抗原の有無を判断する。ＤＮＡが増幅されない場合は、抗原を有しないと判断する。
一態様において、上記のテスターは、原料または加工品製造ライン中などの対象物中の上記（１）〜（６）を含む抗原含有の有無を調べるために用いられる。原料は食材であってもよく、化粧品原料、医薬品原料等であってもよい。加工品は食用加工品であってもよく、化粧品、医薬品等であってもよい。上記テスターは、原料として含まれる生物種の探索用として用いてもよく、製造業者による製造ラインおよび出荷前製品の品質検査用として用いてもよく、喫食者または使用者自身による対象原料・加工品の抗原含有の有無のチェック用として用いてもよい。
アレルゲン除去原料等
本発明は、上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つが除去又は低減されていることを特徴とする原料または加工品を提供する。
原料または加工品において本発明の抗原を除去又は低減する方法は限定されない。抗原の除去又は低減は、上記（１）〜（６）を含む抗原が除去又は低減される限り、いかなる方法によって行われてもよい。
上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つが除去又は低減されているとは、抗原全体が除去または低減されていることにより達成されてもよく、あるいは抗原タンパク質から、上記（１）〜（６）で特定する配列部分が切断または取り除かれることにより達成されてもよい。「取り除かれる」には、上記（１）〜（６）で特定する配列部分のすべてまたは一部の欠失および改変を含む。
例えば、上記（１）〜（６）を含む抗原が除去又は低減された原料は、遺伝子ノックアウト技術を用いて、上記（１）〜（６）を含む抗原の発現がノックアウトされた原料を調製してもよい。遺伝子ノックアウト技術は、遺伝子改変等の当業者に公知の手法のいずれかを用いることができる。
上記（１）〜（６）を含む抗原が除去又は低減された加工品は、精製ペプチドを原料として用いた粉ミルクのように、上記（１）〜（６）を含む抗原が除去又は低減された原料を用いた加工品であってもよい。通常の原料を用いる場合は、加工品の調製前または調製後に上記（１）〜（６）を含む抗原を除去又は低減する処理を行う。通常の原料を用いた加工品において上記（１）〜（６）を含む抗原を除去又は低減する方法として、高圧処理および中性塩溶液による溶出や、高温スチーム等の、原料中のタンパク質成分を除去する方法や、熱処理および酸処理による加水分解・変性・アミノ酸変化（側鎖の化学修飾・脱離等）する方法が挙げられる。上記（１）〜（６）を含む抗原を切断する方法としては、特定の消化酵素で切断する処理をする方法が挙げられる。
アレルゲン除去加工品の製造方法
本発明は、抗原が除去又は低減されている加工品の製造方法であって、当該加工品の製造過程で抗原が除去又は低減されていることを確認するステップを有し、ここで当該抗原は上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つである、前記製造方法を提供する。
当該製造方法において、抗原が除去又は低減されているとは、上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つが除去又は低減されているか、前記抗原から、上記（１）〜（６）で特定する配列部分が切断または取り除かれていることを意味する。
加工品の製造過程で抗原が除去又は低減されていることを確認する手法は、特に限定されず、上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つを検出可能ないかなる手法を用いてもよい。例えば、当該加工品の製造過程で生じる材料を含む試料と、上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つに対する抗体との結合性により、当該加工品中の当該ポリペプチドまたは抗原の存在の有無を確認してもよい。そのような方法の詳細は、上記「診断キット・診断方法」の項目において記載した通りである。すなわち、上記製造方法においては、上記「診断キット・診断方法」の項目における「対象のＩｇＥ抗体」を「上記（１）〜（６）を含む抗原の少なくとも一つに対する抗体」と置き換え、上記「診断キット・診断方法」の項目における「抗原」を「加工品の製造過程で生じる材料を含む試料」と置き換えて、上記「診断キット・診断方法」の項目において記載した手法を加工品の製造過程で抗原が除去又は低減されていることを確認するために用いることができる。また、上記「テスター」の項目で記載したテスターを使用することもできる。
以下に本発明の実施例を説明する。本発明の技術的範囲は、これらの実施例によって限定されない。
実施例１：エピトープの同定
ω−５グリアジンのエピトープ
ω−５グリアジンについて、以下の手順によりエピトープの同定を行った。
（Ａ）エピトープマッピング（１）
パンコムギのω−５グリアジンの全長アミノ酸配列（配列番号５１）に対応するオーバーラップペプチド（長さ：１５アミノ酸）のライブラリーによって、エピトープマッピングを行った。
合成する各ペプチドは、１０アミノ酸ずつシフトさせた。すなわち各ペプチドは、前のペプチドおよび後のペプチドと、それぞれ５アミノ酸の重複を有する。
ペプチドアレイの調製のため、Intavis CelluSpots（商標）技術を使用した。すなわち次の手順、（１）アミノ修飾セルロースディスク上に自動化合成装置（Intavis MultiPep RS）を用いて目的のペプチドを合成し、（２）前記アミノ修飾セルロースディスクを溶解させてセルロース結合ペプチド溶液を得て、（３）コーティングを施したスライドガラス上に前記セルロース結合ペプチドをスポットすることにより、ペプチドアレイを調製した。各手順の詳細は以下のとおりである。
（１）ペプチドの合成
３８４ウェル合成プレート中のアミノ修飾セルロースディスク上で、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）化学反応を利用して、ペプチド合成を段階的に行った。すなわち、Ｆｍｏｃ基がアミノ基に結合したアミノ酸をジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のＮ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ）および１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）の溶液で活性化し、前記セルロースディスクに滴下してセルロースディスク上のアミノ基へ前記Ｆｍｏｃ基結合アミノ酸を結合させ（カップリング）、未反応のアミノ基を無水酢酸によりキャッピングしてＤＭＦにより洗浄し、さらにピペリジンで処理してＤＭＦにより洗浄して、セルロースディスク上のアミノ基に結合したアミノ酸のアミノ基からＦｍｏｃ基を除去した。前記セルロースディスク上のアミノ基に結合したアミノ酸に対して、上記カップリング、キャッピング、およびＦｍｏｃ基の除去を反復して行うことにより、アミノ末端を伸長させてペプチド合成を行った。
（２）アミノ修飾セルロースディスクの溶解
上記「（１）ペプチドの合成」で得られた目的のペプチドが結合したセルロースディスクを９６ウェルプレートに移し、アミノ酸の側鎖の脱保護のため、トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）、ジクロロメタン、トリイソプロピルシラン（ＴＩＰＳ）、および水の側鎖脱保護混合液で処理した。その後、脱保護されたセルロース結合ペプチドを、ＴＦＡ、ペルフルオロメタンスルホン酸（ＴＦＭＳＡ）、ＴＩＰＳ、および水の混合液で溶解し、テトラブチルメチルエーテル（ＴＢＭＥ）で沈殿させ、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中に再懸濁し、ＮａＣｌ、クエン酸Ｎａ、および水の混合液と混合し、スライドスポット用ペプチド溶液を得た。
（３）セルロース結合ペプチド溶液のスポット
上記「（２）アミノ修飾セルロースディスクの溶解」で得られたスライドスポット用ペプチド溶液を、Intavisスライドスポッティングロボットを用いて、Intavis CelluSpots（商標）スライド上にスポットし、これを乾燥させてペプチドアレイを調製した。
前記ペプチドアレイを用いて、抗原抗体反応によりＷＤＥＩＡ患者の血清中のＩｇＥ抗体が結合するか否かを各ペプチド断片について測定した。測定は以下の手順に従って行った。
（１）ペプチドを、５％スキムミルク／ＰＢＳＴ溶液（非イオン界面活性剤Tween 20を０．１％含むＰＢＳバッファー）中で、室温で１時間振盪した。
（２）２％血清／５％スキムミルク／ＰＢＳＴ溶液中で、室温で１時間振盪した。
（３）ＰＢＳＴ溶液で５分洗浄した（×３回）。
（４）抗ヒトＩｇＥ抗体−ＨＲＰ（１：１０，０００、５％スキムミルク／ＰＢＳＴ溶液）を添加し、室温で１時間振盪した。
（５）ＰＢＳＴ溶液で５分洗浄した（×３回）。
（６）Pierce ECL Plus Western Blotting Substrate（Thermo社製）を添加し、室温で５分間振盪した。
（７）Amersham Imager 600を使用して、上記（１）〜（６）の処理を施したペプチドの化学発光を測定した。
その結果、既知のエピトープを含まない、スポットＮｏ．１のペプチド（配列番号６）およびスポットＮｏ．２のペプチド（配列番号１３）に、患者特異的にＩｇＥ抗体が結合したことが確認された（図１）。これらのペプチドは、パンコムギのω−５グリアジンの全長アミノ酸配列（配列番号５１）のアミノ酸２２１〜２３５および１６１〜１７５にそれぞれ相当した。
（Ｂ）エピトープマッピング（２）：オーバーラッピング
上記（Ａ）により患者特異的に血清中ＩｇＥ抗体が結合したペプチドの配列（配列番号６および１３）を基に、当該ペプチドの配列およびパンコムギのω−５グリアジンの全長アミノ酸配列（配列番号５１）における当該ペプチドの前後の配列を付加した配列において、オーバーラップペプチド断片（長さ：１０アミノ酸）のライブラリーを作成し、エピトープマッピングを行った。
合成する各ペプチドは、１アミノ酸ずつシフトさせた。すなわち各ペプチドは、前のペプチドおよび後のペプチドと、それぞれ９アミノ酸の重複を有する。
ライブラリーは次の手順で作成した。すなわち、（１）アミノ修飾樹脂上において自動化合成装置（Intavis MultiPep RS）で目的のペプチドを合成し、（２）前記アミノ修飾樹脂からペプチドを溶出することで作成した。各手順の詳細は以下のとおりである。
（１）ペプチドの合成
９６ウェルプレート中のアミノ修飾樹脂上で、上記（Ａ）と同様の方法で、目的のペプチドを合成した。合成した目的のペプチドのアミノ末端には、Ｆｍｏｃ−Ａｃｐ（６）−ＯＨ由来のアミノカプロン酸をスペーサーとして挟んで、ビオチンを結合させた。
（２）アミノ修飾樹脂からペプチドの溶出
得られた目的のペプチドが結合した前記アミノ修飾樹脂に対して、ＴＦＡ、ＴＩＰＳおよび水の混合液で処理して、前記アミノ修飾樹脂からペプチドを溶出させた。その後、ＴＢＭＥで当該ペプチドを沈殿し、目的のペプチドを得てライブラリーを作成した。
前記ライブラリーを用いて、抗原抗体反応により患者の血清中のＩｇＥ抗体が結合するか否かを各ペプチド断片について測定し、患者のＩｇＥ抗体が結合したペプチドに共通する配列を割り出すことにより、エピトープとして機能する最少のアミノ酸配列を有するペプチドを決定した。測定は以下の手順に従って、ＥＬＩＳＡ法により行った。
（１）ライブラリーのビオチン結合ペプチドをＰＢＳＴ溶液で１０μｇ／ｍｌに調製し、アビジンコートＥＬＩＳＡプレート中において室温で１時間振盪した。
（２）ＰＢＳＴ溶液で洗浄した。
（３）１％スキムミルク／ＰＢＳＴ溶液中で、室温で１時間振盪した。
（４）２％血清／１％スキムミルク／ＰＢＳＴ溶液中で、室温で１時間振盪した。
（５）ＰＢＳＴ溶液で洗浄した。
（６）抗ヒトＩｇＥ抗体−ＨＲＰ（１：１０，０００、１％スキムミルク／ＰＢＳＴ溶液）を添加し、室温で１時間振盪した。
（７）ＰＢＳＴ溶液で洗浄した。
（８）TMB ELISA（Thermo社製）２０μＬを添加し、室温で１５分間振盪した。
（９）２Ｍ硫酸２０μＬを添加して、酵素反応を停止した。
（１０）４５０ｎｍの吸光度を測定した。
配列番号６を基に作成したライブラリーにおける、パンコムギのω−５グリアジンの部分配列QFPQQQFPQQEFPQQQQFPQQQIAR（配列番号１５）について、オーバーラッピングの手法で得られた測定結果および配列番号１３を基に作成したライブラリーにおける、パンコムギのω−５グリアジンの部分配列QFLQQQQFPQQQPPQQHQFPQQQL（配列番号２３）について、オーバーラッピングの手法で得られた測定結果を図２にそれぞれ示す。各図の横軸はそれぞれ吸光度を示している。
その結果、配列番号１５については、配列番号１８および２０、特に配列番号２０のアミノ酸配列を有するポリペプチドについて、患者のＩｇＥ抗体との強い結合が観察された。配列番号１７および１９については、患者のＩｇＥ抗体との結合が若干弱く観察された。配列番号１６および２１については、患者のＩｇＥ抗体との結合が観察されなかった。この結果、配列番号１７〜２０に共通する配列である、配列番号２２がエピトープとして機能する最少のアミノ酸配列であると同定された（図２）。
配列番号２３については、配列番号２５および２６、特に配列番号２６のアミノ酸配列を有するポリペプチドについて、患者のＩｇＥ抗体との強い結合が観察された。配列番号２７については、患者のＩｇＥ抗体との結合が若干弱く観察された。配列番号２４および２８については、患者のＩｇＥ抗体との結合が観察されなかった。この結果、配列番号２５〜２７に共通する配列である、配列番号２９がエピトープとして機能する最少のアミノ酸配列であると同定された（図２）。
一方、図２に示されている配列番号４３〜４５のアミノ酸配列はω−５グリアジンの既知のエピトープ（非特許文献１）であるが、本試験において患者のＩｇＥ抗体との反応性は乏しかった。
（Ｃ）エピトープマッピング（３）：アラニンスキャン
上記（Ｂ）で同定した配列番号２２のアミノ酸配列、および配列番号２９のアミノ酸配列について、アラニンスキャンと呼ばれる手法（非特許文献１）により、それぞれ配列番号６および配列番号１３のアミノ酸配列中においてアミノ末端側から１アミノ酸ずつアラニンに置換したペプチド断片のライブラリーを、上記（Ｂ）と同様の手法で調製し、上記（Ｂ）と同様の手法で患者および健常者の血清中のＩｇＥ抗体が結合するか否かを各ペプチド断片について測定した。アラニン置換により患者のＩｇＥ抗体への結合性が喪失あるいは減少し、健常者のＩｇＥ抗体への結合性が発生した位置のアミノ酸は、本来の抗原性の発現のために重要なアミノ酸、または本来の抗原性の発現に影響するアミノ酸と判断した。また、アラニン置換によっても患者のＩｇＥ抗体への結合性が維持され、健常者のＩｇＥ抗体への結合性も発生しなかった位置のアミノ酸は、本来の抗原性の発現のためには重要ではなく、置換が可能なアミノ酸と判断した。この解析により、本来の抗原性の発現のために重要な共通配列を見出した。
配列番号２２のアミノ酸配列について行ったアラニンスキャンの結果および配列番号２９のアミノ酸配列について行ったアラニンスキャンの結果を図３にそれぞれ示す。各図の横軸はそれぞれ吸光度を示している。
その結果、配列番号２２については、４番目および７番目のアミノ酸のそれぞれをアラニンに置換した配列番号３３および３０は、患者のＩｇＥ抗体への結合性が喪失あるいは減少していた。配列番号３３は、さらに健常者のＩｇＥ抗体への結合性、配列番号３０は、さらに二次抗体の抗ヒトＩｇＥ抗体への結合性も発生していた。そして、２番目のアミノ酸をアラニンに置換した配列番号３４は、患者のＩｇＥ抗体への結合性がやや増大していたものの、健常者のＩｇＥ抗体への結合性が発生していた。よって、これら２番目、４番目、および７番目のアミノ酸が本来の抗原性の発現のために特に重要なアミノ酸であることが明らかとなった。また、１番目および６番目のアミノ酸のそれぞれをアラニンに置換した配列番号３５および３１は、患者のＩｇＥ抗体への結合性はやや減少していたものの、発生した健常者のＩｇＥ抗体や二次抗体の抗ヒトＩｇＥ抗体への結合性の程度は比較的低く、これらのアミノ酸は本来の抗原性の発現に影響するアミノ酸であると判断した。なお、３番目のアミノ酸をアラニンに置換した配列番号７は、患者のＩｇＥ抗体への結合性が維持されており、健常者のＩｇＥ抗体や二次抗体の抗ヒトＩｇＥ抗体への結合性もほとんど発生しなかった。そして、５番目のアミノ酸をアラニンに置換した配列番号３２は、患者のＩｇＥ抗体への結合性は減少していたものの、健常者のＩｇＥ抗体や二次抗体の抗ヒトＩｇＥ抗体への結合性は発生しなかった。よって、これら３番目および５番目のアミノ酸は置換が可能なアミノ酸であると判断した。さらに注目すべきことに、配列番号７は、患者のＩｇＥ抗体への結合性が顕著に増大していた（図３）。
配列番号２９については、１番目、３番目、および６〜８番目のアミノ酸のそれぞれをアラニンに置換した配列番号４２、４０、および３８〜３６は、患者のＩｇＥ抗体への結合性が喪失しており、これらのアミノ酸が本来の抗原性の発現のために特に重要なアミノ酸であることが明らかとなった。配列番号４０は、さらに二次抗体の抗ヒトＩｇＥ抗体への結合性も発生していた。また、２番目のアミノ酸をアラニンに置換した配列番号４１は、患者のＩｇＥ抗体への結合性の減少の程度が比較的低く、本来の抗原性の発現に影響するアミノ酸であると判断した。４および５番目のアミノ酸のそれぞれをアラニンに置換した配列番号３９および１４は、患者のＩｇＥ抗体への結合性が維持されており、健常者のＩｇＥ抗体への結合性も発生しなかったことから、置換が可能なアミノ酸であると判断した。さらに注目すべきことに、配列番号１４は、患者のＩｇＥ抗体への結合性が顕著に増大していた（図３）。
実施例２：アミノ酸配列を基にした交差性の検討
配列番号６および１３のポリペプチドについて、患者のＩｇＥ抗体との結合性に重要なアミノ酸を上記（Ｃ）で特定し、それぞれから配列番号１および８（以下、鍵配列と記載することがある）を得た。配列番号６および配列番号１３をクエリ配列とし、鍵配列である配列番号１および配列番号８をそれぞれについてのＰＨＩパターン配列とし、ＰＨＩ−ＢＬＡＳＴの初期設定パラメータにおけるＰＨＩ−ＢＬＡＳＴでの解析により、アミノ酸配列を基にした交差性の検討を行った。
その結果、配列番号６をクエリ配列とし、鍵配列である配列番号１をＰＨＩパターン配列とした場合には、パンコムギ、ヒトツブコムギ等のイネ科植物、セイヨウアブラナ、ラディッシュ等のアブラナ科植物、セイヨウミザクラ、モモ等のバラ科植物、パパイア等のパパイア科植物、キマメ、ダイズ等のマメ科植物、ヨーロッパブドウ等のブドウ科植物、シナノグルミ等のクルミ科植物、キャッサバ、パラゴムノキ等のトウダイグサ科植物、キヌア、ホウレンソウ等のヒユ科植物、パイナップル等のパイナップル科植物、ジャガイモ等のナス科植物、アスパラガス等のキジカクシ科植物、メロン等のウリ科植物、オレンジ、クレメンタイン等のミカン科植物、スギ等のヒノキ科植物、シラカンバ等のカバノキ科植物、アスペルギルス タルコサス等の菌類のタンパク質がヒットした。このことは、配列番号１が、種間だけでなく、属や植物界をも越えた抗原の交差性を検出するのに利用できることを示す。
配列番号１３をクエリ配列とし、鍵配列である配列番号８をＰＨＩパターン配列とした場合には、上記のイネ科植物、アブラナ科植物、バラ科植物、パパイア科植物、マメ科植物、ブドウ科植物、クルミ科植物、トウダイグサ科植物、ヒユ科植物、パイナップル科植物、ナス科植物、キジカクシ科植物、ウリ科植物、ミカン科植物、ヒノキ科植物、カバノキ科植物、菌類等のタンパク質がヒットした。このことは、配列番号８が、種間や属を越えた抗原の交差性を検出するのに利用できることを示す。

Claims (10)

  1. アレルギー患者のＩｇＥ抗体に特異的に結合するポリペプチドであって、配列番号１１、１２および２５からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列からなるポリペプチド。
  2. 請求項１に記載のポリペプチドの少なくとも一つを含む、アレルギーの診断キット。
  3. 対象から得られたＩｇＥ抗体が含まれる溶液についてのアレルギーの診断キットであって、配列番号１１、１２および２５からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする、前記診断キット。
  4. アレルギーの診断用組成物であって、請求項１に記載のポリペプチドの少なくとも一つを抗原として含む、前記診断用組成物。
  5. 対象から得られたＩｇＥ抗体が含まれる溶液についてのアレルギーの診断用組成物であって、配列番号１１、１２および２５からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列からなるポリペプチドを含むことを特徴とする、前記診断用組成物。
  6. 対象のアレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程：
    （ｉ）対象から得られた試料を抗原に接触させる、ここで当該試料はＩｇＥ抗体が含まれる溶液である；
    （ｉｉ）対象から得られた試料中のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合を検出する；
    （ｉｉｉ）対象のＩｇＥ抗体と当該抗原との結合が検出された場合、対象がアレルギーであることの指標が提供される；
    を含み、ここで当該抗原は、請求項１に記載のポリペプチドの少なくとも一つである、前記方法。
  7. 対象のアレルギーを診断するための指標を提供する方法であって、以下の工程：
    （ｉ）対象から得られたＩｇＥ抗体が含まれる溶液中のＩｇＥ抗体と、配列番号１１、１２および２５からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列からなるポリペプチドとの結合を検出する；
    （ｉｉ）対象のＩｇＥ抗体と当該アミノ酸配列との結合性が検出された場合、対象がアレルギーであることの指標が提供される；
    を含む、前記方法。
  8. 請求項１に記載のポリペプチドの少なくとも一つと結合する抗体を含むテスター組成物を用いることを特徴とする、対象物における配列番号１１、１２および２５からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列の有無を判定するための方法。
  9. 請求項１に記載のポリペプチドをコードする核酸の塩基配列の一部および／またはその相補鎖の一部を含むプライマーを含むことを特徴とする、対象物におけるアレルギーの原因となる請求項１に記載のポリペプチドの有無を判定するためのテスター組成物。
  10. 請求項９に記載のテスター組成物を用いることを特徴とする、対象物における配列番号１１、１２および２５からなる群より選択される少なくとも一つのアミノ酸配列をコードする核酸の有無を判定するための方法。
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