JP6581502B2 - 初期段階の肺がんにおける予後指標としてのタンパク質コーディング遺伝子及び非コーディング遺伝子の発現 - Google Patents

Description

連邦政府による援助を受けた研究のもと行われた発明に対する権利の陳述
本成果は、全米がん研究所所内研究プログラムによりサポートされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

関連出願
本出願は、２０１２年８月２０日付で出願された米国仮特許出願番号第６１／６９１，１１８号の優先権を主張し、その全体が参照により本明細書に援用される。

治療目的の外科手術は、ステージＩの非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）患者に対する標準治療である（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅ Ｃａｎｃｅｒ Ｎｅｔｗｏｒｋ，ＮＣＣＮ，Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ，ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｃｎ．ｏｒｇ）。しかしながら、外科手術に成功し、組織学的に陰性のリンパ節であっても、２０％〜３０％のステージＩのＮＳＣＬＣ患者は再発する。補助化学療法はステージＩＩ又はＩＩＩＡ疾患の患者における生存を改善し得るが、ステージＩ患者におけるその利益には議論の余地がある。

したがって、補助療法による利益を受け得る高い再発リスクにあるステージＩ肺がん患者を同定することができるバイオマーカーの開発は、従来技術において依然として必要とされている。

以下に記載されるように、本発明は、初期段階の肺腺がんに対する新規なバイオマーカーを提供する。本発明は、部分的に、疾患の増悪リスクが高い患者を高い信頼性で同定するため、多様な患者集団において初期段階の肺がんの階級化に臨床上有用であり、これらの患者に対して適切な治療経路の選択を補助するのに有用であり得る分子指標を提供する。

態様では、本発明は肺がんを伴う被験体の予後を判定する方法を提供する。実施形態では、上記方法は、被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを検出することを含む。実施形態では、上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを参照と比較することを含む。実施形態では、上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルが上記参照に比べて増加しているか、又はＤＬＣ１のレベルが上記参照に比べて減少している場合に上記被験体を予後不良であると同定することを含む。

実施形態では、上記参照が、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体は、上記参照に比べてＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルが増加し、且つ上記参照に比べてＤＬＣ１のレベルが減少している場合に予後不良であると同定される。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有する場合に、上記被験体は予後不良であると同定される。

態様では、本発明は肺がんを伴う被験体の予後を判定する方法を提供する。実施形態では、上記方法は上記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを検出することを含む。実施形態では、上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを参照と比較することを含む。実施形態では、上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１及びｍｉＲ−２１のレベルが上記参照に比べて増加しているか、又はＤＬＣ１のレベルが上記参照に比べて減少している場合に上記被験体を予後不良であると同定することを含む。

実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体は、上記参照に比べてＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルが増加し、且つ上記参照に比べてＤＬＣ１のレベルが減少している場合に予後不良であると同定される。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有し、且つ上記被験体が上記参照に比べてより高いｍｉＲ−２１レベルを有する場合に、上記被験体は予後不良であると同定される。

態様では、本発明は、肺がんを発症するリスクにある被験体を診断する方法を提供する。実施形態では、上記方法は、上記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを検出することを含む。実施形態では、上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを参照と比較することを含む。実施形態では、上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルが上記参照に比べて増加しているか、又はＤＬＣ１のレベルが上記参照に比べて減少している場合に上記被験体が肺がんを発症するリスクにあると同定することを含む。

実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルが上記参照に比べて増加し、且つＤＬＣ１のレベルが上記参照に比べて減少している場合に肺がんを発症するリスクにあると同定される。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有する場合に、上記被験体は肺がんを発症するリスクにあると同定される

態様では、本発明は、肺がんを発症するリスクにある被験体を診断する方法を提供する。実施形態では、上記方法は、上記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを検出することを含む。実施形態では、上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを参照と比較することを含む。実施形態では、上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１及びｍｉＲ−２１のレベルが上記参照に比べて増加しているか、又はＤＬＣ１のレベルが上記参照に比べて減少している場合に上記被験体が肺がんを発症するリスクにあると同定することを含む。

実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体は、上記参照に比べてＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルが増加し、且つ上記参照に比べてＤＬＣ１のレベルが減少している場合に肺がんを発症するリスクにあると同定される。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有し、且つ上記被験体が上記参照に比べてより高いｍｉＲ−２１レベルを有する場合に、上記被験体は肺がんを発症するリスクにあると同定される。

態様では、本発明は、被験体において肺がんの再発リスクを診断する方法を提供する。実施形態では、上記方法は、上記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを検出することを含む。実施形態では、上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを参照と比較することを含む。実施形態では、上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルが上記参照に比べて増加しているか、又はＤＬＣ１のレベルが上記参照に比べて減少している場合に上記被験体が肺がんを再発するリスクにあると同定することを含む。

実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１、のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体は、上記参照に比べてＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルが増加し、且つ上記参照に比べてＤＬＣ１のレベルが減少している場合に肺がんを再発するリスクにあると同定される。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有する場合に、上記被験体は肺がんを再発するリスクにあると同定される。

態様では、本発明は、被験体において肺がんの再発リスクを診断する方法を提供する。実施形態では、上記方法は、被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを検出することを含む。実施形態では、上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを参照と比較することを含む。実施形態では、上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルが上記参照に比べて増加しているか、又はＤＬＣ１のレベルが上記参照に比べて減少している場合に、上記被験体が肺がんを再発するリスクにあると同定することを含む。

実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体は、上記参照に比べてＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルが増加し、且つ上記参照に比べてＤＬＣ１のレベルが減少している場合に肺がんを再発するリスクにあると同定される。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有し、且つ上記被験体が上記参照に比べてより高いｍｉＲ−２１レベルを有する場合に、上記被験体は肺がんを再発するリスクにあると同定される。

態様では、本発明は、被験体に適切な治療法を選択する方法を提供する。実施形態では、上記方法は、上記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを検出することを含み、ここで、上記試料は肺から得られた組織試料である。実施形態では、上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを参照と比較することを含む。実施形態では、上記参照に比べてＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルの増加、又は上記参照に比べてＤＬＣ１のレベルの減少が、がんの治療法が上記被験体に適していることを示す。

いくつかの関連する実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有する場合に肺がんの治療法が上記被験体に適していると同定される。

態様では、本発明は、被験体に適切な治療法を選択する方法を提供する。実施形態では、上記方法は、上記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを検出することを含み、ここで、上記試料は肺から得られた組織試料である。実施形態では、上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを参照と比較することを含む。実施形態では、上記参照に関するＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１及びｍｉＲ−２１のレベルの増加、又は上記参照に関するＤＬＣ１のレベルの減少が、肺がんの治療法が上記被験体に適していることを示す。

いくつかの関連する実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有し、且つ上記被験体が上記参照に比べてより高いｍｉＲ−２１レベルを有する場合に、肺がんの治療法が上記被験体に適していると同定される。

態様では、本発明は、（ａ）被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを検出すること、（ｂ）ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを参照と比較すること、並びに（ｃ）上記参照に比べて増加したＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベル、又は上記参照に比べて減少したＤＬＣ１のレベルが、陽性の臨床転帰の可能性の増加と負相関すること、を含む肺がんと診断された被験体の臨床転帰を予測する方法を提供する。

いくつかの関連する実施形態では、前記臨床転帰は、無再発期間（ＲＦＩ）、全生存（ＯＳ）の時間の増加、無病生存（ＤＦＳ）の時間の増加、無遠隔再発期間（ＤＲＦＩ）の期間の増加、又は長期生存の用語で表される。

他の関連する実施形態では、上記方法は、上記被験体のリスク群への分類をさらに含む。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、上記試料は、肺から得られた組織試料であり得る。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、上記肺がんは初期段階である。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、予後不良である、肺がんを発症するリスクにある、再発のリスクにある、又は肺がんの治療法に適していると同定された場合、上記被験体をより精密な追跡調査を割り当てる。実施形態では、予後不良である、肺がんを発症するリスクにある、再発のリスクにある、又は肺がんの治療法に適していると同定された場合、上記被験体をより頻繁なスクリーニングに割り当てる。いくつかの実施形態では、予後不良である、肺がんを発症するリスクにある、再発のリスクにある、又は肺がんの治療法に適していると同定された場合、上記被験体をより頻繁なＣＴスキャンに割り当てる。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、予後不良である、肺がんを発症するリスクにある、再発のリスクにある、又は肺がんの治療法に適していると同定された場合、上記被験体は臨床試験に選択される。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、予後不良である、肺がんを発症するリスクにある、再発のリスクにある、又は肺がんの治療法に適していると同定された場合、上記被験体に補助放射線療法を行う。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、予後不良である、肺がんを発症するリスクにある、再発のリスクにある、又は肺がんの治療法に適していると同定された場合、上記被験体に補助化学療法を行う。実施形態では、上記補助化学療法は、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アルトレタミン、アミホスチン、アミノグルテチミド アナグレリド、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、アザチオプリン、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン（Ｂｅｘａｒｏｔｉｎｅ）、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デニロイキンジフチトクス、デシタビン、ドセタキセル、デキサメタゾン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポエチンアルファ、エポチロン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴセレリン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、イリノテカン、イクサベピロン、ラパチニブ、ロイコボリン、ロイプロリド、レナリドミド、レトロゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ネララビン、ニロチニブ、ニルタミド、オクトレオチド、オファツムマブ、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラロキシフェン、レチノイン酸、リツキシマブ、ロミプロスチム、サルグラモスチム、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、タモキシフェン、テムシロリムス、テモゾラミド、テニポシド、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、バルルビシン、ＶＥＧＦ阻害剤及びトラップ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、又はそれらの組合せである。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、上記肺がんは非小細肺がんである。関連する実施形態では、上記肺がんはステージＩＡ又はステージＩＢである。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、上記被験体は哺乳動物（例えば、ヒト）である。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１及び／又はｍｉＲ−２１の上記レベルの検出は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１及び／又はｍｉＲ−２１の上記ＲＮＡレベルを測定することを含む。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１及び／又はｍｉＲ−２１の上記レベルが、マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇアッセイ、クロマトグラフィー、質量分析、分光測定、免疫測定法、又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出される。関連する実施形態では、上記ｍｉＲ−２１のレベルはマイクロＲＮＡアッセイにより検出される。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、上記方法は、上記方法を要約する報告を作成する工程をさらに含む。

態様では、本発明は、肺がんの診断を補助するキットを提供する。実施形態では、上記キットは、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１又はそれらの組合せを検出又は捕捉することが可能な少なくとも１つの試薬を含有する。関連する実施形態では、上記試薬は、抗体、質量分析プローブ、又はマイクロアレイである。さらに別の関連する実施形態では、上記キットは、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１又はそれらの組合せのレベルを分析する試薬を使用するための指示書を含有する。

態様では、本発明は、肺がんの診断を補助するキットを提供する。実施形態では、上記キットは、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、ｍｉＲ−２１又はそれらの組合せを検出又は捕捉することが可能な少なくとも１つの試薬を含有する。関連する実施形態では、上記試薬は、抗体、質量分析プローブ、又はマイクロアレイである。さらに別の関連する実施形態では、上記キットは、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、ｍｉＲ−２１又はそれらの組合せのレベルを分析する試薬を使用するための指示書を含有する。

本発明の更なる目的及び利点は、一部は以下の記載において述べられ、一部はその記載から自明であり、又は本発明の実施により習得され得る。本発明の目的及び利点は、添付の特許請求の範囲において指摘される事項を包含する、本明細書に開示される要素及び組合せにより実現され、成し遂げられる。上述の一般的な記載及び下記の詳細な説明はいずれも例示且つ解説に過ぎず、特許請求の範囲に記載される本発明を限定するものではないと理解される。本明細書に組み込まれ、一部を構成する付随する図面は、本発明のいくつかの実施形態を解説し、上記記載と共に本発明の原理を説明する役割を果たす。

定義
本発明の理解を促すため、多くの用語及び表現を以下に定義する。

本明細書で使用される単数形「ある（ａ）」、「ある（ａｎ）」、及び「その（ｔｈｅ）」は、文脈に別段の指示がない限り、複数形を包含する。そのため、例えば、「あるバイオマーカー」に対する参照は、１以上のバイオマーカーに対する参照を包含する。

具体的に述べられず、文脈から自明でない限り、本明細書で使用される「又は、若しくは」の用語は、包括的であると理解される。

本明細書で使用される「包含する、挙げる」の用語は、「包含する、挙げるが限定されない」という表現を意味し、それとほぼ同じ意味で使用される。

本明細書で使用される「含む」、「含んでいる」、「含有している」、「有している」等の用語は、米国特許法においてそれらの起因する意味を有することができ、「包含する」、「包含している」等を意味することができる。「本質的になっている」又は「本質的になる」等は、米国特許法においてそれらの起因する意味を有し、その用語に制約はなく、列挙される基本的又は新規な特徴が列挙されるものを超える存在によって変化されない限り、列挙されるよりも多い存在を斟酌するが、先行技術の実施形態を除外する。

「物質」により、任意の小分子化合物、抗体、核酸分子、若しくはポリペプチド、又はそれらのフラグメントが意味される。

「変更」又は「変化」により、増加又は減少が意味される。変更は、わずか１％、２％、３％、４％、５％、１０％、２０％、３０％、又は４０％、５０％、６０％、さらに７０％、７５％、８０％、９０％、又は１００％に匹敵してもよい。

「ＢＲＣＡ１」により、Ｉ型乳がん易罹患性タンパク質（ｂｒｅａｓｔ ｃａｎｃｅｒ ｔｙｐｅ １ ｓｕｓｃｅｐｔｉｂｉｌｉｔｙ ｐｒｏｔｅｉｎ）をコードするポリヌクレオチドが意味される。ＢＲＣＡ１核酸分子の例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００７２９４で提供される。

ＢＲＣＡ１ヌクレオチド配列（ＮＭ＿００７２９４）の例を以下に提示する：

「ＢＲＣＡ１ポリペプチド」又は「ＢＲＣＡ１」により、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＣ３７５９４に対して少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド又はそのフラグメントが意味される。

ＢＲＣＡ１ポリペプチド配列（ＡＡＣ３７５９４）の例を以下に提示する：

本明細書で使用される「バイオマーカー」又は「マーカー」は、一般的には、別の表現型状態（例えば、疾患、障害、又は病気を有しない）と比較した、１つの表現型状態（例えば、疾患、障害、又は病気を有する）の被験体から取得された試料中に差次的に存在する分子（例えば、ポリペプチド又はポリヌクレオチド）を指す。第１の表現型状態におけるバイオマーカーの平均又は中央値のレベルを第２の表現系状態に関して算出して統計学的有意差を表す場合、バイオマーカーは、種々の表現型状態間に差次的に存在する。統計学的有意性の一般的な検定として、とりわけ、ｔ検定、ＡＮＯＶＡ、クラスカル−ワリス、ウィルコクソン、マン−ホイットニー及びオッズ比が挙げられる。バイオマーカーは、単独で又は組み合わせて、被験体が目的の表現型状態に属する相対的見込みの基準を提供する。バイオマーカーは、それ自体、例えば疾患（診断法）、薬物の治療効果（セラノスティックス）、及び薬物毒性に関するマーカーとしての使用を見出し得る。

本明細書で使用される「精密な追跡調査」、「追跡調査の増加」等の用語は、疾患、障害、又は病状、例えば、非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）に関して被験体を評価する頻度又は範囲を増加することを指す。評価の頻度及び範囲の増加は、疾患、障害、又は病状若しくは進行の状態／進行をモニタリングする患者の検査の頻度を増加することを指すことができる。また、評価の頻度及び範囲の増加は、患者に対してより詳細な診断検査を行うことを指す。例えば、胸部Ｘ線写真は、肺がんの診断に使用される標準的な手段である。更なる診断検査として、ＣＴ画像法及び気管支鏡検査又は組織病理学用に腫瘍を得るためのＣＴガイド生検が挙げられる。より精密な追跡調査は、被験体が疾患、障害又は病状を発症するリスクが増加していると同定される場合に必要な可能性がある。また、より精密な追跡調査は、被験体が再発のリスクにあると同定される場合に必要な可能性がある。

「検出する」により、物質の存在、不在、レベル、又は濃度を同定することを指す。

「検出可能」により、目的の分子に連結された場合に後者を検出可能とする部分が意味される。かかる検出は、分光光学的、光化学的、生化学的、免疫化学的、又は化学的な手段を介するものであってもよい。例えば、有用なラベルとして、放射性同位元素、磁気ビーズ、金属ビーズ、コロイド粒子、蛍光発光色素、高電子密度試薬、酵素（例えば、ＥＬＩＳＡに一般的に使用される）、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテンが挙げられる。

本明細書で使用される「判定する、測定する」、「判断する」、「アッセイする」、「測定する」、及び「検出する」の用語は、定量的及び定性的な測定の両方を指し、「判定する、測定する」の用語それ自体は、明細書において「アッセイする」、「測定する」等とほぼ同じ意味で使用される。定量的測定が意図される場合、分析物等の「量を測定する」の表現が使用される。定量的及び／又は定性的な測定が意図される場合、分析物の「レベルを測定する」又は分析物を「検出する」の表現が使用される。

「疾患」により、細胞、組織、又は器官の正常な機能を損傷するか又はそれを妨げる任意の病状又は障害が意味される。疾患の例はがんである。

「ＤＬＣ１」により、肝臓がん１タンパク質における欠失（ｄｅｌｅｔｅｄ）をコードするポリヌクレオチドが意味される。ＤＬＣ１核酸分子の例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＢＣ０４９８４２で提示される。

ＤＬＣ１ヌクレオチド配列（ＢＣ０４９８４２）の例を以下に提示する：

「ＤＬＣ１ポリペプチド」又は「ＤＬＣ１」により、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＨ４９８４２に対して少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド又はそのフラグメントが意味される。

ＤＬＣ１ポリペプチド配列（ＡＡＨ４９８４２）の例を以下に提示する：

「薬物」により、被験体において薬理学的効果を誘導することが可能な化合物、組成物、物質（例えば、薬剤）が意味される。薬物は、薬剤として患者に適切に投与された場合、所望の治療効果を有する。

「ＨＩＦ１Ａ」により、低酸素誘導因子１タンパク質をコードするポリヌクレオチドが意味される。ＨＩＦ１Ａ核酸分子の例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＭ＿００１５３０、ＮＭ＿１８１０５４、及びＮＭ＿００１２４３０８４で提供される。

ＨＩＦ１Ａ核酸配列（ＮＭ＿００１５３０）の例を以下に提示する：

ＨＩＦ１Ａヌクレオチド配列（ＮＭ＿１８１０５４）の例を以下に提示する：

ＨＩＦ１Ａヌクレオチド配列（ＮＭ＿００１２４３０８４）の例を以下に提示する：

「ＨＩＦ１Ａポリペプチド」又は「ＨＩＦ１Ａ」により、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＦ２０１４９、ＡＡＦ２０１４０又はＡＡＦ２０１３９に対して少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド又はそのフラグメントが意味される。

ＨＩＦ１Ａポリペプチド配列（ＡＡＦ２０１４９）の例を以下に提示する：

ＨＩＦ１Ａポリペプチド配列（ＡＡＦ２０１４０）の例を以下に提示する：

ＨＩＦ１Ａポリペプチド配列（ＡＡＦ２０１３９）の例を以下に提示する：

「増加」により、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、１００％、２００％、３００％、４００％、５００％、１０００％、又はそれよりも多い正の変更が意味される。

「ｍｉＲ−２１」により、ＭＩＲ２１遺伝子によりコードされるマイクロＲＮＡが意味される。ｍｉＲ−２１核酸分子の例は、ＮＣＢＩアクセッション番号ＮＲ＿０２９４９３．１で提供される。

ｍｉＲ−２１配列（ＮＲ＿０２９４９３．１）の例を以下に提示する：

「天然の」により、内因性、又は試料に由来することが意味される。

「定期的な」により、一定の間隔であることが意味される。定期的な患者のモニタリングは、例えば、毎日、週２回、月２回、毎月、年２回、又は毎年行われる検査スケジュールを包含する。

「予測」の用語は、陽性又は陰性に関わらず、患者が特定の臨床転帰を有する可能性を指すため本明細書で使用される。本発明の予測方法は、任意の特定の患者に対して最も適した治療様式を選択することにより臨床上の治療決定をするため使用される。本発明の予測方法は、患者が治療計画に好ましい反応をする可能性があるかどうかを予測することにおいて価値のある手段である。予測は、予後因子を包含してもよい。

「陽性の臨床転帰」の用語は、無再発期間（ＲＦＩ）の期間の増加、全生存（ＯＳ）の時間の増加、無病生存（ＤＦＳ）の時間の増加、無遠隔再発期間（ＤＲＦＩ）の期間の増加等の当該技術分野で通常使用される評価基準を包含する、患者の状態の任意の評価基準における改善を意味する。陽性臨床転帰の見込みの増加は、がん再発の見込みの減少に対応する。

「長期」生存の用語は、少なくとも３年、より好ましくは少なくとも５年の生存を指すため本明細書で使用される。

「無再発期間（ＲＦＩ）」は、肺がんの最初の再発までの年単位の時間を指すため本明細書で使用される。

「全生存（ＯＳ）」の用語は、治療又は手術から任意の原因による死亡までの年単位の時間を指すため本明細書で使用される。

「無病生存（ＤＦＳ）」の用語は、肺がん再発又は任意の原因による死亡までの年単位の時間を指すため本明細書で使用される。

「無遠隔再発期間（ＤＲＦＩ）」の用語は、治療又は手術から最初の解剖学的に遠隔のがん再発までの時間（年単位）を指すため本明細書で使用される。

本明細書で使用される「予防する」、「予防すること」、「予防」、「予防的治療」等の用語は、疾患又は病状、例えば、ＮＳＣＬＣを有していないが、それを発症するリスクにあるか又はそれに罹患しやすい被験体において疾患又は病状を発症する可能性を低減することを指す。

「減少する」により、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、又は１００％の負の変更が意味される。

「参照」により、比較の基準が意味される。例えば、患者の試料中に存在するＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及び／又はｍｉＲ−２１のレベルは、対応する健康な細胞若しくは組織、又は疾患細胞若しくは組織（例えば、ＮＳＣＬＣを有する被験体に由来する細胞若しくは組織）における化合物（複数の場合がある）のレベルと比較され得る。

本明細書で使用される「試料」の用語は、任意の組織、細胞、体液、又は器官に由来する他の材料等の生体試料を包含する。

「選択的（又は特異的）にハイブリダイズする」の表現は、その配列が複合混合物（例えば、全細胞又はライブラリＤＮＡ又はＲＮＡ）中に存在する場合にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で特定のヌクレオチド配列にのみ分子が結合、二重化又はハイブリダズをすることを指す。

「被験体」又は「患者」の用語は、治療、観察、又は実験の対象である動物を指す。単なる例に過ぎないが、被験体として、これらに限定されないが、ヒト、又は非ヒト哺乳動物、例えば、非ヒト霊長類、マウス、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、若しくはネコ等を包含する哺乳動物が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書で使用される「治療する」、「治療すること」、「治療」等の用語は、疾患若しくは病状、例えばＮＳＣＬＣ、及び／又はそれらと関連する症状の軽減又は緩和を指す。疾患又は病状を治療することは、疾患、病状、又はそれらと関連する症状が完全に取り除かれることを必要としないが、これが排除されるものではないことが理解される。

「ＸＰＯ１」又は「ＣＲＭ１」により、エクスポーチン１タンパク質をコードするポリヌクレオチドが意味される。ＸＰＯ１核酸分子の例はＮＣＢＩアクセッション番号Ｙ０８６１４で提供される。

ＸＰＯ１ヌクレオチド配列（Ｙ０８６１４）の例を以下に提示する：

「ＸＰＯ１ポリペプチド」、「ＸＰＯ１」、「ＣＲＭポリペプチド」又は「ＣＲＭ１」により、ＮＣＢＩアクセッション番号ＡＡＨ３２８４７に対して少なくとも８５％のアミノ酸同一性を有するポリペプチド又はそのフラグメントが意味される。

ＨＩＦ１Ａポリペプチド配列（ＡＡＨ３２８４７）の例を以下に提示する：

具体的に述べられておらず、文脈から自明でない限り、本明細書で使用される「約」の用語は、当該技術分野で通常の許容範囲内、例えば、その平均の２つの標準偏差の範囲内と理解される。約は、規定された値の１０％、９％、８％、７％、６％、５％、４％、３％、２％、１％、０．５％、０．１％、０．０５％、又は０．０１％内と理解され得る。文脈から別段の指示が明らかでない限り、本明細書に提示される全ての数値は、用語約により修飾される。

本明細書で提示される範囲は、その範囲内の全ての値の省略表現と理解される。例えば、１〜５０の範囲は、任意の数、数の組合せ、又は１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、若しくは５０からなる群に由来する部分範囲を含むと理解される。

本明細書における変数の任意の定義において化学基の一覧の列挙は、任意の単一の基としての変数、又は列挙される基の組合せの定義を包含する。本明細書の変数又は態様に関する実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態として、又は任意の他の実施形態若しくはそれらの一部との組合せの実施形態を包含する。

本明細書に提示される任意の化合物、組成物、又は方法を、本明細書に提示される他の組成物及び方法のいずれかの１又は複数と組み合わせることができる。

図１は、４つのコーディング遺伝子サインの同定に関する研究の概略図を包含する図である。 図２は、マイクロアレイ実験の検証を示すグラフを包含する図である。グラフは、検査した全ての腫瘍に亘る各遺伝子に関するマイクロアレイ発現値とｑＲＴ−ＰＣＲ発現値との相関を示す。 図３は、独立したコホートに由来するＡＪＣＣ第６版のステージＩ〜ＩＩの肺がんにおける上記４つのコーディング遺伝子サインの三分位値によるカプラン−マイヤー生存曲線を包含する図である。日本コホート（ｎ＝１９９）は、無再発生存を評価項目として使用する。米国／ノルウェーコホート（ｎ＝９５）は、がん特異的死亡率を評価項目として使用する。Ｄｉｒｅｃｔｏｒｓコホート（ｎ＝３７８）、バッタチャライーコホート（ｎ＝１００）、及びトミダコホート（ｎ＝９２）は全生存を評価項目として使用する。 図４は、独立したコホートによるステージＩ肺がんにおける４つのコーディング遺伝子指標の三分位数によるカプラン−マイヤー生存曲線を包含する図である。上記４つのコーディング遺伝子指標は、日本コホート（Ｐ＜０．００１、ｎ＝１４９）、米国／ノルウェーコホート（Ｐ＜０．００１、ｎ＝６７）、Ｄｉｒｅｃｔｏｒｓコホート（Ｐ＜０．００１、ｎ＝２７６）、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅコホート（Ｐ＝０．０３６、ｎ＝７６）及びＴｏｍｉｄａコホート（Ｐ＝０．００８、ｎ＝７９）を包含する５つ全てのコホートに関して、ステージＩ肺腺がんにおける予後と有意に関連した。 図５は、ＴＮＭステージＩ非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）において４つのコーディング遺伝子指標とｍｉＲ−２１発現の組合せが、いずれか単独よりも良好な無再発及びがん特異的死亡率を予測することを示すグラフである。日本コホートにおける４遺伝子指標に関するカプラン−マイヤー（ＫＭ）曲線；日本コホートにおける非コーディングｍｉＲ−２１に関するＫＭ曲線；及び日本コホートにおける４つのコーディング遺伝子指標と非コーディングｍｉＲ−２１の組合せに関するＫＭ曲線を包含する。これらの分析は、ＡＪＣＣ第７版ＴＮＭ病期分類により階級化される。この図面については、ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇヒトマイクロＲＮＡアッセイバージョン１によりｍｉＲ−２１を測定した。 図６は、ＴＮＭステージＩ非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）において４つのコーディング遺伝子とｍｉＲ−２１発現の組合せが、いずれか単独よりも良好な無再発及びがん特異的死亡率を予測することを示すグラフを包含する図である。米国／ノルウェーコホートにおける４遺伝子指標に関するカプラン−マイヤー（ＫＭ）曲線；米国／ノルウェーコホートにおける非コーディングｍｉＲ−２１に関するＫＭ曲線；及び米国／ノルウェーコホートにおける４つのコーディング遺伝子指標と非コーディングｍｉＲ−２１の組合せに関するＫＭ曲線を包含する。これらの分析は、ＡＪＣＣ第７版ＴＮＭ病期分類により階級化される。この図面については、ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇヒトマイクロＲＮＡアッセイバージョン１によりｍｉＲ−２１を測定した。 図７は、ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇヒトマイクロＲＮＡアッセイに基づく腫瘍及び非腫瘍細胞における１細胞当たりのｍｉＲ−２１の推定コピー数を示すグラフを包含する図である。 図８は、ＴＮＭステージによる日本コホートにおける上記４つのコーディング遺伝子指標に関するカプラン−マイヤー（ＫＭ）曲線を包含する図である。４つのコーディング遺伝子指標と非コーディングｍｉＲ−２１発現の組合せが、いずれか単独よりも良好に日本コホート（ＡＪＣＣ第６版病期分類を使用）における無再発を予測する。 図９は、ＴＮＭステージによる米国／ノルウェーコホートにおける上記４つのコーディング遺伝子指標に関するカプラン−マイヤー（ＫＭ）曲線を包含する図である。４つのコーディング遺伝子指標と非コーディングｍｉＲ−２１発現の組合せが、いずれか単独よりも良好に米国／ノルウェーコホート（ＡＪＣＣ第６版病期分類を使用）におけるがん特異的死亡率を予測する。 図１０は、日本人コホートにおける上記４遺伝子指標（ｑＲＴ−ＰＣＲを使用）及びｍｉＲ−２１発現（ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇヒトマイクロＲＮＡアッセイを使用）のカプラン−マイヤー分析を包含する図である。これらのデータは、上記４遺伝子指標及びｍｉＲ−２１発現と、ＴＮＭステージにより階級化される無増悪生存期間との関連を示す。各指標は、各ＴＮＭステージサブグループにおける予後と有意に関連し、２つの指標の組合せの成績は各々単独よりも優れている。したがって、上記４遺伝子指標及びｍｉＲ−２１（単独又は組み合わせて）は、初期段階の肺がんの予後バイオマーカーである。さらに、ｍｉＲ−２１の測定にｎａｎｏｓｔｒｉｎｇを使用することにより、ｑＲＴ−ＰＣＲよりも強い予後との関連をもたらす。 図１１は、日本コホート及び米国／ノルウェーコホート（ＡＪＣＣ第７版）に関する上記４つの遺伝子サイン及びｍｉＲ−２１発現のＣｏｘ回帰分析を示す表を包含する図である。この表では、ｍｉＲ−２１を日本コホートにおいてｑＲＴ−ＰＣＲにより測定し、米国／ノルウェーコホートにおいてＮａｎｏｓｔｒｉｎｇヒトマイクロＲＮＡアッセイにより測定した。 図１２は、ｎＣｏｕｎｔｅｒヒトｍｉＲＮＡアッセイの結果を示す図である。ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２６及びｍｉＲ−２９は、最も発現の高いマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−２１を除く）であり、これらのいずれのマイクロＲＮＡも予後と関連しなかった。 図１３は、日本人コホートにおける上記４遺伝子指標（ｑＲＴ−ＰＣＲを使用）及びｍｉＲ−２１発現（ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇヒトマイクロＲＮＡアッセイを使用）のカプラン−マイヤー分析を包含する図である。これらのデータは、上記４遺伝子指標及びｍｉＲ−２１発現とＴＮＭステージにより階級化される無増悪生存期間との関連を示す。各指標は、各ＴＮＭステージサブグループにおける予後と有意に関連し、２つの指標の組合せの成績は各々単独よりも優れている。したがって、上記４遺伝子指標及びｍｉＲ−２１（単独又は組み合わせて）は、初期段階の肺がんの予後バイオマーカーである。これらの分析は、ＡＪＣＣ第６版ＴＮＭ病期分類により階級化される。さらに、ｍｉＲ−２１の測定にｎａｎｏｓｔｒｉｎｇを使用することにより、ｑＲＴ−ＰＣＲよりも強い予後との関連をもたらす。 図１４は、米国／ノルウェーコホートにおける上記４遺伝子指標（ｑＲＴ−ＰＣＲを使用）及びｍｉＲ−２１発現（ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇヒトマイクロＲＮＡアッセイを使用）のカプラン−マイヤー分析を包含する図である。これらのデータは、上記４遺伝子指標及びｍｉＲ−２１発現とＴＮＭステージにより階級化される無増悪生存期間との関連を示す。各指標は、各ＴＮＭステージサブグループにおける予後と有意に関連し、２つの指標の組合せの成績は各々単独よりも優れている。したがって、上記４遺伝子指標及びｍｉＲ−２１（単独又は組み合わせて）は、初期段階の肺がんの予後バイオマーカーである。これらの分析は、ＡＪＣＣ第６版ＴＮＭ病期分類により階級化される。さらに、ｍｉＲ−２１の測定にｎａｎｏｓｔｒｉｎｇを使用することにより、ｑＲＴ−ＰＣＲよりも強い予後との関連をもたらす。 図１５（Ａ〜Ｄ）は、１つの肺腫瘍細胞当たりのｍｉＲ−２１のコピー数の推定を示す図である。（Ｄ）は、肺腫瘍細胞が、１細胞当たり平均でおよそ５０，０００コピーのｍｉＲ−２１を有することを示す。これは、合成ｍｉＲ−２１及び既知量の腫瘍ＲＮＡの段階希釈の標準曲線を使用して算出された。（Ａ）ｑＲＴ−ＰＣＲにより定量された合成ｍｉＲ−２１の１０倍希釈に基づいて、ｍｉＲ−２１の増幅プロットは、１回のＰＣＲ反応当たりわずか６コピーのｍｉＲ−２１を検出する少なくとも９ログのダイナミックレンジを実証する。また、ｓｐｉｋｅｄ−ｉｎ Ｃｅｌ−ｍｉＲ−５４の増幅プロットも示され、全ての反応が同様の逆転写効率を有することを示す。（Ｂ）得られたＣｔ値を使用してｍｉＲ−２１の標準曲線を構築し、絶対コピー数を算出した。（Ｃ、Ｄ）３つの独立したコホートに由来する肺腫瘍ＲＮＡ試料（ｎ＝４９）を使用することにより、ｍｉＲ−２１コピーは１細胞当たりおよそ５０，０００と推定された（１細胞当たり２０ｐｇの全ＲＮＡとする）。 図１６は、肺がん細胞株Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ２３に関する１細胞当たりの全ＲＮＡが、それぞれ、１９．４ｐｇ／細胞及び２０．１ｐｇ／細胞と推定されることを示すグラフを包含する図である。 図１７は、本研究で提示される肺がんコホートに加えて、ＢＲＣＡ１発現の増加が他のタイプのヒトがんのより悪い予後と関連することを示す図である。 図１８は、ｍｉＲ−２１指標及び上記４つのコーディング遺伝子指標のいずれもが異なる組織片において高度に再現可能であることを示すグラフであり、単一の生検による測定で十分であることを示唆する図である。 図１９は、データ選択フローチャートを示す概略図である。 図２０は、回収したデータセットのリスト及びそれらが選択基準に基づいて含まれたか除外されたかを示す表である。 図２１（Ａ及びＢ）は、ステージＩ肺腺がん患者の１２の独立したコホートにおける上記４コーディング遺伝子指標の成績を示すグラフを包含する図である（Ａ、５つのオリジナルコホート；Ｂ、７つの新たなコホート）。各コホートについて、三分位数に基づいて高、中、又は低に症例を分類した。傾向に関するログランク検定によりＰ値を得た。 図２２（Ａ〜Ｃ）は、ステージＩ肺腺がんの１２の独立したコホートにおける４コーディング遺伝子指標の予後の影響のメタアナリシスを示す図である。その複合分析は、全生存データを含む９コホートを包含した。 図２３（Ａ〜Ｄ）（Ａ）全生存を含む９つの独立したデータセットによるステージＩ肺腺がん（ＡＤＣ）患者の複合コホートにおける上記４コーディング遺伝子指標のカプラン−マイヤー分析である。症例を、各コホートのステージＩ患者の三分位数に基づいて高、中又は低に分類した。（Ｂ）、（Ｃ）それぞれ、ステージＩＡ及びＩＢのＡＤＣ腫瘍に対するサブグループ分析である。（Ｄ）８つの独立したデータセットによるステージＩ扁平上皮がん（ＳＱＣ）患者における上記４コーディング遺伝子指標の複合分析である（補足図面２も参照されたい）。傾向に関するログランク検定によりＰ値を得た。 図２４は、ステージＩ肺扁平上皮がん患者の独立した９つのコホートにおける上記４つのコーディング遺伝子の成績を示す一連のグラフを包含する図である。各コホートについて、症例を、三分位数に基づいて高、中又は低に分類した。傾向に関するログランク検定によりＰ値を得た。

発明の詳細な説明
本発明の実施は、別段の指示がない限り、当該技術の範囲内の分子生物学（組換え技術を包含する）、微生物学、細胞生物学、及び生化学の従来技術を採用する。かかる技術は、“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ”２．ｓｕｐ．ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）；“Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ”（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；”Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ“（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ”（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）；“Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ”，４．ｓｕｐ．ｔｈ ｅｄｉｔｉｏｎ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ＆Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．，１９８７）；”Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ“（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；”Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ”（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７）；及び“ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ”，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）等の文献に十分説明される。

本発明は、少なくとも部分的には、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１が初期段階の肺がんのバイオマーカーであるという発見に基づく。したがって、本発明は、初期段階の肺がんの診断、治療、及び予防に有用な方法及びキットを提供する。本発明は、初期段階の肺がんと同定された患者を治療するための治療法を評価する方法及びキットをさらに提供する。

一般に、遺伝子発現プロファイリングの方法を、ポリヌクレオチドのハイブリダイゼーション分析に基づく方法、及びポリヌクレオチドのシーケンシングに基づく方法の２つの大きなグループに分けることができる。試料中のｍＲＮＡ発現の定量のため最も一般的に当該技術分野で通常使用される方法として、ノザンブロッティング及びｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション（Ｐａｒｋｅｒ＆Ｂａｒｎｅｓ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １０６：２４７−２８３（１９９９））、ＲＮＡｓｅプロテクションアッセイ（Ｈｏｄ，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １３：８５２−８５４（１９９２））、並びに逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）（Ｗｅｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ８：２６３−２６４（１９９２））が挙げられる。代替的には、ＤＮＡ二重鎖、ＲＮＡ二重鎖、及びＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッド二重鎖、又はＤＮＡ−タンパク質二重鎖を包含する特異的な二重鎖を認識し得る抗体を採用してもよい。シーケンシングに基づく遺伝子発現分析の代表的な方法として、遺伝子発現の逐次分析法（ＳＡＧＥ）、及び大規模並列シグネチャーシーケンシング（ＭＰＳＳ）による遺伝子発現分析が挙げられる。

マイクロアレイ及び定量的逆転写酵素ポリメラーゼ連鎖反応（ｑＲＴ−ＰＣＲ）によるタンパク質コーディング又は非コーディング遺伝子発現プロファイリングは、ステージＩ肺がん（Ｌｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｍｅｄ．３：ｅ４６７（２００６）；Ｂｉａｎｃｈｉ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１７：３４３６−４４（２００７）；Ｌｅｅ，Ｅ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１４：７３９７−４０４（２００８）；Ｒａｐｏｎｉ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．６６：７４６６−７２（２００６）；Ｃｈｅｎ，Ｈ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５６：１１−２０（２００７）；Ｔｏｍｉｄａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ． Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２７：２７９３−９（２００９）；Ｗａｎ，Ｙ．Ｗ．ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｏｎｅ ５：ｅ１２２２２（２０１０）；及びＳａｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７：１８７５−８２（２０１１）を包含する様々なタイプのがんを伴う患者に関する予後指標を開発するため使用されてきた（Ｒａｍａｓｗａｍｙ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎｅｔ．３３：４９−５４（２００３）；Ｌｕｄｗｉｇ，Ｊ．Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｒｅｖ．Ｃａｎｃｅｒ ５：８４５−５６（２００５）；Ｌｏｓｓｏｓ，Ｉ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５０：１８２８−３７（２００４）；Ｂｅｅｒ，Ｄ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８：８１６−２４（２００２）；Ｔｓａｏ，Ｍ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５３：１３３−４４（２００５）；及び Ｅｎｄｏｈ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２２：８１１−９（２００４））。多くの場合、単一のコホートで報告される関連は、更なる患者集団において有効ではない。Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．１０２：４６４−７４（２０１０）を参照されたい。

ステージＩの肺がん患者に対するロバストで幅広く有用な予後バイオマーカーを確立するため、ステージＩの肺がんに関する予後コーディング遺伝子発現指標を開発した。マイクロアレイデータ及び文献によるサポートの組合せに基づいて選択した遺伝子を使用して遺伝子指標を開発し、その成績を複数の独立した患者コホートにおいて検査した。この戦略は、臨床情報を含む公的に利用可能な遺伝子発現データセットの探索を組み込み、図１に解説される。さらに、コーディング遺伝子指標は、非タンパク質コーディングマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−２１の発現分析により以前に得られたデータと組み合わせることによって精度が高められる。Ｓａｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７：１８７５−８２（２０１１）。ｍｉＲ−２１と組み合わせた上記遺伝子指標の使用は、ステージＩ肺腺がんにおけるがん特異的死亡率との関連の改善をもたらした。したがって、任意にｍｉＲ−２１と組み合わせた上記遺伝子指標は肺がんの治療に診断価値を有する。

診断及び診断アッセイ
肺がんは、肺組織における制御不能の細胞成長を特徴とする疾患であり、米国で男性及び女性の両方における最も一般的なタイプのがんである。米国がん協会によれば、毎年ほぼ２２０，０００人の人々が肺がんと診断されている。

肺がんには、２つの主なタイプ、すなわち小細胞肺がん（ＳＣＬＣ）及び非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）がある。ＮＳＣＬＣは、米国において肺がん症例の８０％〜８５％もを構成し、ＮＳＣＬＣのタイプは、がんに見出される細胞の種類及び顕微鏡下でどのように細胞が見えるかについて名付けられる。ＮＳＣＬＣには、（ｉ）魚の鱗のように見える薄く、平たい細胞である扁平上皮細胞において始まる扁平上皮がん、（ｉｉ）いくつかのタイプの大きな肺細胞において始まる大細胞がん、及び（ｉｉｉ）肺胞に沿った細胞において始まる腺がんの３つの主なタイプがある。

ＮＳＣＬＣの診断は、生検試料等の疑わしい組織の病理学者による検査によって行われる。ＮＳＣＬＣの診断の後、患者の疾患は、患者の全身状態及び年齢、咳及び呼吸困難等の症状の重症度、ＮＳＣＬＣの特定のタイプ、及びがん病期分類を使用して予後（回復の可能性）に割り当てられる。病期分類は、腫瘍の大きさ、腫瘍が肺のみに存在するか、又は身体の他の場所に広がっているかどうかを考慮に入れる。その後、これらの検討に基づいてＮＳＣＬＣ患者に対する特定の治療の選択肢を選択し、上記がんの病期分類は治療選択の重要な要素である。初期段階のＮＳＣＬＣ（腫瘍が局在化し、且つ３ｃｍ未満であるステージＩＡ、又は腫瘍が局在化し、且つ３ｃｍより大きいステージＩＢ）を伴う患者は、外科的切除で腫瘍を除去することによって治癒する可能性があるが、現在の診断法では、どの患者が手術後に再発するかを予測することができない。さらに、手術に成功しても、およそ３分の１の患者において肺がんは局所的又は遠隔部位に再発する可能性がある。

初期段階の肺がんの治療のための補助治療法（例えば、放射線及び化学療法）の使用は議論の的となっているが、再発リスクの高い個体は、追加の治療法の使用による利益を受ける。したがって、これらの個体により精密なモニター及び補助治療を行うため、再発リスクの高い初期段階の肺がん患者を同定することが望ましい。この趣旨で、本発明は、補助治療（すなわち、放射線及び化学療法等の非外科的治療法）による利益を受ける初期段階の肺がんを有する個体を同定することができる新規な遺伝子指標を提供する。

したがって、本発明は、肺がんを伴う被験体において予後を判定する方法を特徴とする。実施形態では、上記方法は、上記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを検出することを含む。上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを参照と比較し、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルが上記参照に比べて増加しているか、又はＤＬＣ１のレベルが上記参照に比べて減少している場合に上記被験体を予後不良であると同定することをさらに含む。関連する実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体は、上記参照に比べてＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルが増加し、且つ上記参照に比べてＤＬＣ１のレベルが減少している場合に予後不良であると同定される。さらに、他の関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有する場合に、上記被験体は予後不良であると同定される。

実施形態では、上記方法は、上記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを検出することを含む。上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを参照と比較し、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１及びｍｉＲ−２１のレベルが上記参照に比べて増加しているか、又はＤＬＣ１のレベルが上記参照に比べて減少している場合に上記被験体を予後不良であると同定することをさらに含む。関連する実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体は、上記参照に比べてＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルが増加し、且つ上記参照に比べてＤＬＣ１のレベルが減少している場合に予後不良であると同定される。さらに、別の関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有し、且つ上記被験体が上記参照に比べてより高いｍｉＲ−２１レベルを有する場合に、上記被験体は予後不良であると同定される。

態様では、本発明は、肺がんを発症するリスクにある被験体を診断する方法を特徴とする。実施形態では、上記方法は、上記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを検出することを含む。上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを参照と比較し、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルが上記参照に比べて増加しているか、又はＤＬＣ１のレベルが上記参照に比べて減少している場合に上記被験体が肺がんを発症するリスクにあると同定することをさらに含む。関連する実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体は、上記参照に比べてＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルが増加し、且つ上記参照に比べてＤＬＣ１のレベルが減少している場合に肺がんを発症するリスクにあると同定される。さらに、他の関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有する場合に、上記被験体は肺がんを発症するリスクにあると同定される。

実施形態では、上記方法は、上記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを検出することを含む。上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを参照と比較し、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１及びｍｉＲ−２１のレベルが上記参照に比べて増加しているか、又はＤＬＣ１のレベルが上記参照に比べて減少している場合に上記被験体が肺がんを発症するリスクにあると同定することをさらに含む。関連する実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体は、上記参照に比べてＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルが増加し、且つ上記参照に比べてＤＬＣ１のレベルが減少している場合に肺がんを発症するリスクにあると同定される。さらに、他の関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有し、且つ上記被験体が上記参照に比べてより高いｍｉＲ−２１レベルを有する場合に、上記被験体は肺がんを発症するリスクにあると同定される。

態様では、本発明は、被験体において肺がんの再発リスクを診断する方法を特徴とする。実施形態では、上記方法は、上記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを検出することを含む。上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを参照と比較し、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルが上記参照に比べて増加しているか、又はＤＬＣ１のレベルが上記参照に比べて減少している場合に上記被験体が肺がんを再発するリスクにあると同定することをさらに含む。関連する実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体は、上記参照に比べてＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルが増加し、且つ上記参照に比べてＤＬＣ１のレベルが減少している場合に肺がんを発症するリスクにあると同定される。さらに、他の関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有する場合に、上記被験体は肺がんを再発するリスクにあると同定される。

実施形態では、上記方法は、上記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを検出することを含む。上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを参照と比較し、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１及びｍｉＲ−２１のレベルが上記参照に比べて増加しているか、又はＤＬＣ１のレベルが上記参照に比べて減少している場合に上記被験体が肺がんを再発するリスクにあると同定することをさらに含む。関連する実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体は、上記参照に比べてＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルが増加し、且つ上記参照に比べてＤＬＣ１のレベルが減少している場合に肺がんを再発するリスクにあると同定される。さらに、他の関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有し、且つ上記被験体が上記参照に比べてより高いｍｉＲ−２１レベルを有する場合に、上記被験体は肺がんを再発するリスクにあると同定される。

態様では、本発明は、被験体に適切な治療法を選択する方法を特徴とする。実施形態では、上記方法は、上記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを検出することを含む。上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを参照と比較することをさらに含み、ここで、上記参照に比べてＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルの増加、又は上記参照に比べてＤＬＣ１のレベルの減少が、肺がん治療が上記被験体に適していることを示す。関連する実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有する場合に、肺がん治療が上記被験体に適していると同定される。

実施形態では、上記方法は、被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを検出することを含む。上記方法は、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを参照と比較することをさらに含み、ここで、上記参照に比べてＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１及びｍｉＲ−２１のレベルの増加、又は上記参照に比べてＤＬＣ１のレベルの減少が、肺がん治療法が上記被験体に適していることを示す。関連する実施形態では、上記参照は、健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルである。いくつかの関連する実施形態では、上記被験体が、上記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有し、且つ上記被験体が上記参照に比べてより高いｍｉＲ−２１レベルを有する場合に、肺がん治療法が上記被験体に適していると同定される。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、上記試料は、上記被験体に由来する生体試料であってもよい。上記生体試料は、組織試料（例えば、細胞試料、生検試料等）であってもよく、これらに限定されないが、血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、及び尿を包含する体液であってもよい。試料は、任意に、当該技術分野でよく知られている濃縮及び分離の方法を使用してバイオマーカー（複数の場合がある）の濃縮のため処理されてもよい。実施形態では、上記試料は、肺から得られた組織試料である。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、上記被験体は予後不良である、肺がんを発症するリスクにある、肺がんを再発するリスクにある、又は肺がんの治療法に適していると同定された場合に、より精密な追跡調査に割り当てられる。実施形態では、上記被験体は予後不良である、肺がんを発症するリスクにある、再発するリスクにある、又は肺がんの治療法に適していると同定された場合に、より頻繁なスクリーニングに割り当てられる。いくつかの実施形態では、上記被験体は予後不良である、肺がんを発症するリスクにある、再発するリスクにある、又は肺がんの治療法に適していると同定された場合に、より頻繁なＣＴスキャンに割り当てられる。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、上記被験体は予後不良である、肺がんを発症するリスクにある、再発するリスクにある、又は肺がんの治療法に適していると同定された場合に、臨床試験に選択される。

上記態様及び実施形態のいずれかでは、予後不良である、肺がんを発症するリスクにある、肺がんを再発するリスクにある、又は肺がんの治療法に適していると同定された場合に、上記被験体に補助化学療法を行うことができる。補助化学療法は、当該技術分野でよく知られている任意の化学療法剤であってもよい。例えば、それらの内容の全体が参照により本明細書に援用される、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇｓ：Ｄｅｓｉｇｎ，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ（Ｃａｎｃｅｒ Ｅｔｉｏｌｏｇｙ，Ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ）（ｅｄｓ．Ｓｐｅｎｃｅｒ，Ｐ．＆Ｈｏｌｔ，Ｗ．）（Ｎｏｖａ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，２０１１）；Ｃｌｉｎｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ａｎｔｉｎｅｏｐｌａｓｔｉｃ Ｔｈｅｒａｐｙ：Ａ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｈａｎｄｂｏｏｋ （ｅｄ． Ｇｕｌｌａｔｔｅ）（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｎｕｒｓｉｎｇ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００７）；Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ａｎｄ Ｂｉｏｔｈｅｒａｐｙ Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅｓ ａｎｄ Ｒｅｃｏｍｍｅｎｄａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｐｒａｃｔｉｃｅ（ｅｄｓ．Ｐｏｌｏｖｉｃｈ，Ｍ． ｅｔ ａｌ．）（Ｏｎｃｏｌｏｇｙ Ｎｕｒｓｉｎｇ Ｓｏｃｉｅｔｙ，２００９）；Ｐｈｙｓｉｃｉａｎｓ’Ｃａｎｃｅｒ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ Ｄｒｕｇ Ｍａｎｕａｌ ２０１２（ｅｄｓ．Ｃｈｕ，Ｅ．＆ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．，Ｖ．Ｔ．）（Ｊｏｎｅｓ＆Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｌｅａｒｎｉｎｇ，２０１１）；ＤｅＶｉｔａ，Ｈｅｌｌｍａｎ，ａｎｄ Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ’ｓ Ｃａｎｃｅｒ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔｉｃｅ ｏｆ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．ＤｅＶｉｔａ，Ｊｒ．，Ｖ．Ｔ．ｅｔ ａｌ．）（Ｌｉｐｐｉｎｃｏｔｔ Ｗｉｌｌｉａｍｓ＆Ｗｉｌｋｉｎｓ，２０１１）；及びＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒａｄｉａｔｉｏｎ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ（ｅｄｓ．Ｇｕｎｄｅｒｓｏｎ，Ｌ．Ｌ．＆Ｔｅｐｐｅｒ，Ｊ．Ｅ．）（Ｓａｕｎｄｅｒｓ）（２０１１）を参照されたい。化学療法剤の例として、これらに限定されないが、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アルトレタミン、アミホスチン、アミノグルテチミド アナグレリド、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、アザチオプリン、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン（Ｂｅｘａｒｏｔｉｎｅ）、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デニロイキンジフチトクス、デシタビン、ドセタキセル、デキサメタゾン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポエチンアルファ、エポチロン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴセレリン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、イリノテカン、イクサベピロン、ラパチニブ、ロイコボリン、ロイプロリド、レナリドミド、レトロゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ネララビン、ニロチニブ、ニルタミド、オクトレオチド、オファツムマブ、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラロキシフェン、レチノイン酸、リツキシマブ、ロミプロスチム、サルグラモスチム、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、タモキシフェン、テムシロリムス、テモゾラミド、テニポシド、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、バルルビシン、ＶＥＧＦ阻害剤及びトラップ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、及びボリノスタットが挙げられる。

上記の態様及び実施形態のいずれかでは、予後不良である、肺がんを発症するリスクにある、肺がんを再発するリスクにある、又は肺がんの治療法に適していると同定された場合に、上記被験体に補助放射線療法を行うことができる。

上記の態様及び実施形態のいずれかでは、上記肺がんは非小細胞肺がん（ＮＳＣＬＣ）である。実施形態では、上記肺がんはステージＩＡ又はステージＩＢのＮＳＣＬＣである。

上記の態様及び実施形態のいずれかでは、上記被験体は哺乳動物（例えば、ヒト）である。

上記の態様及び実施形態のいずれかでは、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１、及び／又はｍｉＲ−２１のレベルは、参照に比べて１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍又はそれより多く増加する。上記の態様及び実施形態のいずれかでは、ＤＬＣ１のレベルは、参照に比べて１．５倍、２倍、２．５倍、３倍、３．５倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、１１倍、１２倍、１３倍、１４倍、１５倍又はそれより多く減少する。

上記の態様及び実施形態のいずれかでは、被験体が参照集団に属しているか、又は属していないかを分類できるように、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及び／又はｍｉＲ−２１のプロファイルを、被験体試料から得て、参照集団から得られた参照プロファイルと比較してもよい。関連付けは、検査試料中の上記マーカーの存在又は不在と、対照における同一のマーカーの検出頻度を考慮に入れてもよい。関連付けは、状態の判定を容易にするため、かかる因子の両方を考慮に入れてもよい。

ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１の検出
任意の好適な方法を使用してＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及び／又はｍｉＲ−２１を検出することができる。本発明の実施は、上記マーカーを検出し、実施形態において定量することができる１又は組み合わせた方法により成功させることができる。

上記マーカーの検出を、同一又は異なる試料、同一又は別々のアッセイにおいて行うことができ、同一又は異なる反応混合物において行ってもよい。上記マーカーが異なる試料においてアッセイされる場合、上記試料は、通常、同じ手順（例えば、採血、採尿、組織抽出等）の間か、又は時間経過に起因する不正確な結果を回避するため比較的わずかな短い時間間隔で被験体から得られる。上記マーカーが別々のアッセイで検出される場合、アッセイされる上記試料は、検査される被験体から得られた同一の試料に由来してもよく、異なる試料に由来してもよい。

ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及び／又はｍｉＲ−２１は、限定されないが、質量分析、クロマトグラフィー、分光法（例えば、ＮＭＲ）、元素分析、従来の化学的方法、イムノアッセイ、マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ（例えば、ｑＲＴ−ＰＣＲ）、ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇアッセイ、ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーション等を包含する当該技術分野でよく知られた１又は複数の方法を使用して検出され得る。

実施形態では、上記マーカーは、質量分析を使用して検出される。質量分析に基づく方法は、バイオマーカーの質量の変化を利用して検出を容易にする。質量分析を、例えば、１回又は２回、液体又はガスクロマトグラフィーを通した後に質量分析を行って試料中の分析物を分離する他のアッセイと組み合わせることができる。質量分析による分析用に生体試料を調製する方法は、当該技術分野でよく知られている。使用に適した質量分析計として、限定されないが、エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ−ＭＳ）、ＥＳＩＭＳ／ＭＳ、ＥＳＩ−ＭＳ／（ＭＳ）ｎ（ｎはゼロより大きい整数である）、マトリクス支援レーザー脱着／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、電子衝撃イオン化質量分析（ＥＩ−ＭＳ）、化学イオン化質量分析（ＣＩ−ＭＳ）、表面増強レーザー脱離／イオン化 − 飛行時間型質量分析（ＳＥＬＤＩ−ＴＯＦ−ＭＳ）、シリコン上脱離／イオン化（ＤＩＯＳ）、二次イオン質量分析（ＳＩＭＳ）、四重極飛行時間（Ｑ−ＴＯＦ）、大気圧化学イオン化質量分析（ＡＰＣＩ−ＭＳ）、ＡＰＣＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＣＩ（ＭＳ）１１、大気圧光イオン化質量分析（ＡＰＰＩ−ＭＳ）、ＡＰＰＩ−ＭＳ／ＭＳ、ＡＰＰＩ−（ＭＳ）、四重極、フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）、イオントラップ、及びこれらの方法のハイブリッド、例えば、エレクトロスプレーイオン化四重極飛行時間型質量分析（ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦＭＳ）、及び二次元ガスクロマトグラフィー電子衝撃イオン化質量分析（ＧＣｘＧＣ−ＥＩ−ＭＳ）が挙げられる。

上記方法は、自動化（Ｖｉｌｌａｎｕｅｖａ，ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ（２００６）１（２）：８８０−８９１）又は半自動化されたフォーマットで行われてもよい。例えば、液体クロマトグラフィー装置（ＬＣ−ＭＳ／ＭＳ又はＬＣ−ＭＳ）又はガスクロマトグラフィー装置（ＧＣ−ＭＳ又はＧＣ−ＭＳ／ＭＳ）に制御可能に連結されたＭＳにより、これを成し遂げることができる。ＭＳを行う方法は当該技術分野で既知であり、例えば、米国特許出願公開第２００５００２３４５４号及び第２００５００３５２８６、米国特許第５，８００，９７９号、並びにそこに開示される引用文献において開示されている。

試料は、採取層において採取される。その後、マトリクス支援レーザー脱離／イオン化（ＭＡＬＤＩ）、エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）等に基づく分光学的方法によりそれらを分析してもよい。

質量精度及びＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ ＭＳの感度を改善する他の技術は、採取膜上に得られた分析物の分析に使用され得る。これらは、遅延イオン抽出、エネルギー反射器及びイオントラップモジュールの使用を包含する。さらに、ポストソース分解及びＭＳ―ＭＳ分析は、更なる構造分析を提供するのに有用である。ＥＳＩにより、上記試料は液相であり、上記分析はイオントラップ、ＴＯＦ、シングル四重極又はマルチ四重極質量分析計によってもよい。かかる装置（シングル四重極以外）の使用は、ＭＳ−ＭＳ又はＭＳ^ｎ分析を行うことを可能とする。タンデム質量分析は、複数の反応を同時にモニターすることを可能とする。

毛細管注入は、例えば、少量の試料を、真空を損なうことなく質量分析計に効率的に導入することができることから、所望のＭＳの実行に上記マーカーを導入するのに採用され得る。毛細管カラムは、ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）及び液体クロマトグラフィー（ＬＣ）を包含する他の分離技術を伴うＭＳのイオン化源を連結するため日常的に使用される。ＧＣ及びＬＣは、質量分析の前に溶液をその異なる成分に分離するため役立つ場合がある。かかる技術は、例えば、ＭＳと容易に組み合わせられる。上記技術の１つのバリエーションは、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が、現在、統合された試料の分離／及び質量分析計の分析のため質量分析計に直接連結され得ることである。

また、必要に応じて、本発明の実施に四重極型質量分析装置を採用してもよい。フーリエ変換イオンサイクロトロン共鳴（ＦＴＭＳ）もまた、一部の発明の実施形態に使用され得る。それにより、タンデムＭＳ実験の高い解像度及び能力を与える。ＦＴＭＳは、磁場の存在における荷電粒子周回の原理に基づく。ＥＳＩ及びＭＡＬＤＩに連結されると、ＦＴＭＳは、わずか０．００１％のエラーを伴う高い正確性を与える。

実施形態では、本発明の診断方法は、複合スペクトルに由来する顕著なピークを同定することをさらに含んでもよい。また、上記方法は、異常値のスペクトルを検索することをさらに含んでもよい。他の実施形態では、本発明の方法は、距離依存性Ｋ最近傍を判定することをさらに含む。

実施形態では、上記バイオマーカー（複数の場合がある）を検出し特性評価するためにイオン移動度分光法を使用することができる。イオン移動度分光法の原理は、イオンの異なる移動度に基づく。具体的には、イオン化により生じた試料のイオンは、電場の影響のもと管を通して、例えばそれらの質量、電荷又は形状の相違により、異なる速度で移動する。イオン（典型的には、電流の形態）は、その後、試料中のバイオマーカー又は他の物質を同定するのに使用され得る検出器において記録される。イオン移動度分光法の１つの利点は、大気圧で操作できることである。

実施形態では、上記手順は、ＵＰＬＣ−ＥＳＩ−ＱＴＯＦＭＳとして知られる、飛行時間（ＴＯＦ）分析によるエレクトロスプレーイオン化四重極型質量分析である。

実施形態では、上記マーカーの検出は、当該技術分野でよく知られている化学的方法を含む。実施形態では、上記化学的方法は、化学的抽出である。実施形態では、上記化学的方法は、化学的誘導体化である。

実施形態では、上記マーカーの検出は、当該技術分野でよく知られているクロマトグラフィー法の使用を含む。かかるクロマトグラフィー法として、限定されないが、カラムクロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性（逆相）液体クロマトグラフィー、又は薄層、ガス、若しくは液体クロマトグラフィー（例えば、高速液体クロマトグラフィー）等の他のクロマトグラフィー、又はそれらの任意の組合せが挙げられる。

実施形態では、上記マーカーの検出は、当該技術分野でよく知られている分光法の使用を含む。かかるクロマトグラフィー法として、限定されないが、ＮＭＲ、ＩＲ等が挙げられる。

実施形態では、上記マーカーの検出は、当該技術分野でよく知られている元素分析法を含む。かかる元素分析法として、限定されないが、燃焼分析、重量測定、原子分光法等が挙げられる。

実施形態では、上記マーカーの検出は、イムノアッセイの使用を含む。実施形態では、上記イムノアッセイは、抗体の使用を含む。好適なイムノアッセイとして、限定されないが、ＥＬＩＳＡ、フローチャンバー接着アッセイ、比色分析法（例えば、抗体に基づく比色分析法）、バイオチップ（例えば、抗体に基づくバイオチップ）等が挙げられる。

実施形態では、上記マーカーの検出は、マイクロアレイ又は定量的ＲＴ−ＰＣＲの使用を含む。例えば、その全体が参照により本明細書に援用される米国特許出願公開第２０１１／０１５２３５７号Ａ１を参照されたい。

実施形態では、上記マーカー検出は、マイクロＲＮＡアッセイを含む。

分析物（例えば、マーカー）は、例えば、気相イオン分光法、光学的方法、電気化学的方法、原子間力顕微鏡法及び高周波法から選択される多様な検出方法により検出され得る。１つの実施形態では、質量分析法、例えば、ＳＥＬＤＩが使用される。光学的方法として、例えば、蛍光発光、発光、化学発光、吸光度、反射率、透過率、複屈折又は屈折率（例えば、表面プラスモン共鳴、偏光解析法、共鳴ミラー法、格子カプラ導波法（ｇｒａｔｉｎｇ ｃｏｕｐｌｅｒ ｗａｖｅｇｕｉｄｅ ｍｅｔｈｏｄ）又は干渉法）の検出が挙げられる。光学的方法として、顕微鏡法（共焦点及び非共焦点の両方）、画像化法及び非画像化法が挙げられる。様々なフォーマット（例えば、ＥＬＩＳＡ）のイムノアッセイが、固相上に捕捉された分析物の検出に普及している方法である。電気化学的方法として、ボルタメトリー（ｖｏｌｔａｍｅｔｒｙ）法及び電流測定方法が挙げられる。高周波法として、多極共振解析が挙げられる。

特定の実施形態では、本発明は、目的のタンパク質コーディング遺伝子の全て及びｍｉＲ−２１を同じプラットフォーム上で測定することが可能な単一のアッセイを特徴とする。例えば、マルチプレックスｑＰＣＲアッセイ、マイクロアレイに基づく技術、及び同じ時に同時に複数の遺伝子を測定することができる任意のＤＮＡハイブリダイゼーション技術の使用が挙げられる。

上記マーカーの検出のための異なるアッセイフォーマットに対して提供する本明細書に記載されるアッセイの他の変化は、当業者であれば本開示を読むことにより容易にわかるであろう。

報告
本発明の方法が、商業的な診断目的で実施される場合、一般的には、１又は複数の選択された遺伝子の正規化された発現レベルの報告又は要約を生じる。本発明の方法は、肺がんと診断された被験体の臨床転帰の予測を含む報告を生じる。本発明の方法及び報告は、データベースにおいて上記報告を保管することをさらに包含することができる。代替的には、上記方法は、上記被験体に関する記録をデータベース内にさらに作成し、またデータを記録に追加することができる。１つの実施形態では、上記報告は書面の報告であり、別の実施形態では、上記報告は音声報告であり、別の実施形態では、上記報告は電子記録である。上記報告は内科医及び／又は患者に提供されることが予定される。上記報告の受理は、上記データ及び報告を包含するサーバーコンピューターへのネットワーク接続を確立すること、並びにそのサーバーコンピューターからデータ及び報告を要求することをさらに包含することができる。

また、本発明により提供される方法は、全部又は一部が自動化されてもよい。

診断キット
本発明は、診断用キット、又は初期段階の肺がん患者に対して治療を選択するためのキットを提供する。

実施形態では、上記キットは、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及び／又はｍｉＲ−２１を検出及び／又は捕捉することが可能な１又は複数の試薬を包含する。関連する実施形態では、上記試薬は、抗体、質量分析プローブ、又はマイクロアレイである。

実施形態では、上記キットは、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及び／又はｍｉＲ−２１を保持する吸着剤を包含する。関連する実施形態では、上記キットは、検査試料と上記吸着剤を接触すること、及び上記吸着剤により保持されるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及び／又はｍｉＲ−２１を検出することに関する指示書をさらに含有する。

実施形態では、上記試薬及び／又は吸着剤は、固形支持体（例えば、チップ、マイクロタイタープレート、ビーズ、樹脂等）上に提供される。

実施形態では、上記キットは、その中で、試薬／吸着剤の組合せ及び洗浄溶液が、その試薬／吸着剤の上のバイオマーカーの捕捉を可能とする、洗浄溶液（複数の場合がある）又は洗浄溶液を作製するための指示書を包含する。

実施形態では、上記キットは、所望であれば較正用の基準（複数の場合がある）として使用され得るＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及び／又はｍｉＲ−２１を包含する。

実施形態では、上記キットは、上記キットの構成成分（例えば、試薬、吸着剤、固形支持体等）を収納する容器（複数の場合がある）を含有してもよい。かかる容器は、箱、アンプル、ボトル、バイアル、チューブ、袋、パウチ、ブリスターパック、又は当該技術分野で既知の他の好適な容器の形態であってもよい。かかる容器は、プラスチック、ガラス、ラミネート紙、金属箔等で作製されてもよい。

実施形態では、上記キットは、本明細書で記載される任意の方法（例えば、診断、モニタリング、特性評価、及び初期段階の肺がんに対する治療の選択等）において上記キットを使用するための指示書をさらに含有する。実施形態では、上記指示書は、試薬、支持体及び／若しくは吸着剤の記載、警告、指示、禁忌、動物研究データ、臨床研究データ、並びに／又は参照の少なくとも１つを包含する。上記指示書は、（ある場合には）容器に直接印刷されてもよく、又は容器に付けられたラベル、又は容器において若しくは容器と共に別のシート、パンフレット、カード、若しくはフォルダであってもよい。

生体試料の種類
ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及び／又はｍｉＲ−２１のレベルは、異なるタイプの試料において測定される。実施形態では、上記マーカーのレベルは、生体試料において測定される。好適な生体試料として、限定されないが、組織試料（例えば、生検による）及び生体液（例えば、血液、血清、血漿、脳脊髄液、唾液、尿、又は本発明の方法で有用な任意の他の生体液）が挙げられる。実施形態では、上記試料は、患者に由来する肺組織試料である。

本発明は、ここに記載される実施例に限定されると解釈されるべきではなく、むしろ、本発明は、本明細書に提示される全ての適用及び当業者の技術の範囲内の全ての同等のバリエーションを包含すると解釈されるべきであることが理解されなければならない。

タンパク質コーディング及び非コーディング遺伝子発現は、ステージＩの肺がんを包含する様々なタイプのがんを伴う患者に関する予後指標の開発に使用されてきた。多くの例では、単一のコホートにおいて報告される関連は、更なる患者集団において臨床上有用な情報を提供することができなかった（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ｊ，Ｓｉｍｏｎ Ｒ．Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ｒｅａｄｙ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ？Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２０１０；１０２：４６４−７４）。本発明は、少なくとも部分的に、治療法についての決定及び術後サーベイランスを改善するための初期段階の肺がんにおける臨床上有用な予後指標の開発に基づく。分析は、生体関連指標の開発可能性を最大化するため、肺がん及び／又はがんの予後に関連する既知の機構的役割を伴う４２の遺伝子に焦点を当てた。地理的及び民族的に多様な集団に由来する２９１の原発性腫瘍を定量的ＲＴ−ＰＣＲにより分析して予後とのロバストな関連を有する遺伝子を同定した。試料サイズは、このタスクを達成するために十分な力があるようにした。その後、Ｃｏｘ回帰に基づく指標を、上記４つタンパク質コーディング遺伝子の線形遺伝子発現値及び全てのデータを使用して生じさせ、方法論及びスクリプトは、結果を再現することを可能とするために読者に公的に利用可能である。ＴＮＭステージＩＡ及びステージＩＢの階級化分析を行って、補助化学療法による利益を受けるであろう高リスク患者を同定した。３つの大きな、公的に利用可能な肺腺がんマイクロアレイデータセットを評価することにより予後指標のロバストネスを検査した。全ての統計学的モデルを、年齢、喫煙及びステージ等の臨床上関連するリスク因子に関して調整する単変数及び多変数モデルの両方により評価した。最後に、このコーディング遺伝子指標を、初期段階の肺がんにおいて無再発生存及びがん特異的死亡率と関連することが示されているマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−２１の発現（Ｓａｉｔｏ Ｍ，Ｓｃｈｅｔｔｅｒ ＡＪ，Ｍｏｌｌｅｒｕｐ Ｓ，Ｋｏｈｎｏ Ｔ，Ｓｋａｕｇ Ｖ，Ｂｏｗｍａｎ ＥＤ，ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅａｒｌｙ−Ｓｔａｇｅ，Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ： Ａ Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｒｅｅ Ｃｏｈｏｒｔｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１；１７：１８７５−８２）と組み合わせて、この組合せが、ステージＩ肺腺がんにおける予後との関連を改善したかどうかを判定した。

実施例１：ＸＰＯ１、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＣＡ９、ＤＬＣ１、及びＣＣＴ３の発現は日本コホートにおけるステージＩ〜ＩＩの肺がんの無再発生存と関連する
コーディング遺伝子指標の開発に使用した戦略を図１に示す。肺がんにおける役割に関する文献のサポートに基づいて４２の遺伝子を選択した（下記表２を参照されたい）。

マイクロアレイデータを、日本コホート（ｎ＝１４８）からのＴＮＭステージＩ（ＡＪＣＣ第６版）の肺がん患者について分析し、それら遺伝子と無再発生存の関連を調査した。７つの遺伝子（ＤＮＭＴ１、ＸＰＯ１、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＣＡ９、ＤＬＣ１、及びＣＣＴ３）は、無再発生存と有意に関連し（Ｐ＜０．０１）、更なる分析のため選択された（表２を参照されたい）。ｑＲＴ−ＰＣＲ測定は、７つ遺伝子のうちの６つに関してマイクロアレイデータと有意に（Ｐ＜０．００１）相関した（図２）。ｑＲＴ−ＰＣＲによるＤＮＭＴ１発現は、マイクロアレイデータと相関せず、更なる分析から省略した。

各遺伝子に関するｑＲＴ−ＰＣＲ発現を、日本コホート（ｎ＝１９９）に関する中央値発現に基づいて二分した。ＢＲＣＡ１（ハザード比［ＨＲ］＝２．０５、９５％信頼区間［ＣＩ］、１．１７〜３．５８、Ｐ＝０．０１２）、ＨＩＦ１Ａ（ＨＲ＝１．７９、９５％ＣＩ、１．０３〜３．１１、Ｐ＝０．０３８）、ＣＡ９（ＨＲ＝３．２５、９５％ＣＩ、１．７９〜５．９０、Ｐ＝０．００１）、ＣＣＴ３（ＨＲ＝２．１４、９５％ＣＩ、１．２２〜３．７４、Ｐ＝０．００８）、ＤＬＣ１（ＨＲ＝０．４４、９５％ＣＩ、０．２５〜０．７７、Ｐ＝０．００４）、及びＸＰＯ１（ＨＲ＝２．０２、９５％ＣＩ、１．１５〜３．５３、Ｐ＝０．０１４）は、それぞれ、無再発生存（ＲＦＳ）と有意に関連し（下記表３）、マイクロアレイの結果をさらに検証した。

実施例２：ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１は、統合した米国／ノルウェーコホートがん特異的死亡率と関連した
６つの遺伝子の全てを統合した米国／ノルウェーコホート（ステージＩ〜ＩＩ、ｎ＝９２）においてｑＲＴ−ＰＣＲにより測定した。ＢＲＣＡ１（ＨＲ＝３．２１、９５％ＣＩ、１．７０〜６．０７、Ｐ＜０．００１）、ＨＩＦ１Ａ（ＨＲ＝２．０１、９５％ＣＩ、１．０７〜３．５７、Ｐ＝０．０２９）、ＤＬＣ１（ＨＲ＝０．４５、９５％ＣＩ、０．２５〜０．８５、Ｐ＝０．０１３）、及びＸＰＯ１（ＨＲ＝２．０６、９５％ＣＩ、１．１２〜３．７６、Ｐ＝０．０１９）の発現は、各々、Ｃｏｘ回帰により統合した米国／ノルウェーコホートにおいてがん特異的死亡率と有意に関連した（上記表３）。

実施例３：４つのコーディング遺伝子指標は、５つの独立したコホートにおける予後と関連する
ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１は、世界の異なる地域に由来する複数のコホートにおける予後と関連し、それらが有用な予後バイオマーカーとなり得る強力な証拠を提供することが実証された。肺がんに対するロバストな予後指標を作成する試みでは、これら４つのコーディング遺伝子の発現を使用してＣｏｘ回帰モデルを開発した。ＮＳＣＬＣにおける予後因子研究に関するガイドラインは、ステージＩの患者と並んで再発リスクの低いステージＩＩの患者における結果を包含することを推奨する（Ｓｕｂｒａｍａｎｉａｎ Ｊ，Ｓｉｍｏｎ Ｒ．Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ−ｂａｓｅｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｓｉｇｎａｔｕｒｅｓ ｉｎ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：ｒｅａｄｙ ｆｏｒ ｃｌｉｎｉｃａｌ ｕｓｅ？Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２０１０；１０２：４６４−７４）。したがって、４つの遺伝子の各々の線形発現値に対する多変数Ｃｏｘ回帰を使用して、日本コホート（ｎ＝１９９）におけるステージＩ及びＩＩの患者の全てに対して遺伝子指標を構築した。得られたモデルは、「指標スコア＝（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）」であった。このモデルは、ｑＲＴ−ＰＣＲ発現データを使用して日本コホート及び米国／ノルウェーコホートに適用され、マイクロアレイ発現データを使用して３つの公的に利用可能なデータセット（Ｄｉｒｅｃｔｏｒｓコホート、ｎ＝３７８；Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅコホート、ｎ＝１００；Ｔｏｍｉｄａコホート、ｎ＝９２）に適用された。これらのコホートの特性は、下記に示される表４に見出される。

三分位値に基づいて、得られた指標スコアを低、中、又は高に分類した。４つのコーディング遺伝子指標は、５つ全てのコホート：日本コホート（Ｐ＜０．００１）、米国／ノルウェーコホート（Ｐ＝０．００１）、Ｄｉｒｅｃｔｏｒｓコホート（Ｐ＝０．００２）、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅコホート（Ｐ＝０．０１９）及びＴｏｍｉｄａコホート（Ｐ＝０．０１４）でステージＩ〜ＩＩの患者において予後と有意に関連した（図３）。これらの結果は、４つのコーディング遺伝子指標がロバストであり、民族的及び地理的に多様な集団において再現可能な予測を導くという強力な証拠を提供する。

実施例４：４遺伝子指標は５つの独立したコホートにおけるステージＩ肺がんの予後と関連する
初期段階の肺がんに対する予後遺伝子指標を開発するため、上記研究はステージＩ患者に焦点が絞られた。４つのコーディング遺伝子指標は、日本コホート（Ｐ＜０．００１、ｎ＝１４９）、米国／ノルウェーコホート（Ｐ＜０．００１、ｎ＝６７）、Ｄｉｒｅｃｔｏｒｓコホート（Ｐ＜０．００１、ｎ＝２７６）、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅコホート（Ｐ＝０．０３６、ｎ＝７６）及びＴｏｍｉｄａコホート（Ｐ＝０．００８、ｎ＝７９）５つ全てのコホートについてステージＩ肺腺がんの予後と有意に関連した（図４）。単変数Ｃｏｘ回帰モデルでは、高リスク群は、日本コホート（ＨＲ＝３．８４、９５％ＣＩ、１．５３〜９．６４、Ｐ＝０．００４）、米国／ノルウェーコホート（ＨＲ＝８．０３、９５％ＣＩ、２．５４〜２５．２８、Ｐ＜０．０００５）、Ｄｉｒｅｃｔｏｒｓコホート（ＨＲ＝２．６８、９５％ＣＩ、１．５０〜４．７９、Ｐ＝０．００１）、Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅコホート（ＨＲ＝２．６１、９５％ＣＩ、１．０４〜６．５６、Ｐ＝０．０４２）、及びＴｏｍｉｄａコホート（ＨＲ＝４．７３、９５％ＣＩ、１．３２〜１６．９６、Ｐ＝０．０１７）において予後と関連した。多変数Ｃｏｘ回帰は、これらの関連が他の臨床上の特性から独立していることを実証した（下記表５）。これらのデータは、４つのコーディング遺伝子指標を、がん再発のリスクが高いステージＩ患者の同定を補助するため他の臨床上の特性と共に使用できることを示唆する。

サブグループ分析をステージＩＢ患者に対して行った（図４）。４遺伝子指標は、日本コホート（Ｐ＝０．０２９、ｎ＝４９））、米国／ノルウェーコホート（Ｐ＝０．０１３、ｎ＝３８）、Ｄｉｒｅｃｔｏｒｓコホート（Ｐ＝０．００３、ｎ＝１６２）、及びＢｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅコホート（Ｐ＝０．０２０、ｎ＝４０）においてステージＩＢ患者の予後と有意に関連し、このタンパク質コーディング遺伝子指標の肺がんの予後バイオマーカーとしての可能性をさらに実証する。

この研究では患者を診断する際にＡＪＣＣ第６版に基づいて病期分類した。４つの遺伝子指標を開発し、ＡＪＣＣ第６版病期分類情報に基づいて検証した。２００９年にＡＪＣＣ第７版のＴＮＭ病期分類が開発され、出版された。ＡＪＣＣ第７版の病期分類によりどのように上記指標がはたらくのかを測定するため、利用可能なデータを有する症例について患者をＡＪＣＣ第７版に再度病期分類し（下記表１）、日本コホート（Ｐ＜０．００１、図５）及び米国／ノルウェーコホート（Ｐ＝０．００３、図６）の両方でＡＪＣＣ第７版ＴＮＭステージＩ肺がん患者において上記４つの遺伝子指標が有意に関連したことを見出した。

実施例５：４つのコーディング遺伝子指標及び非コーディング遺伝子ｍｉＲ−２１は、ステージＩ肺腺がんにおける予後と独立して関連する
以前、腫瘍におけるｍｉＲ−２１の高発現は、ステージＩの肺腺がんの不良な予後と関連することが報告された（Ｓａｉｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ｏｆ ＭｉｃｒｏＲＮＡ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｐｒｏｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ Ｅａｒｌｙ−Ｓｔａｇｅ，Ｎｏｎ−Ｓｍａｌｌ Ｃｅｌｌ Ｌｕｎｇ Ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ：Ａ Ｒｅｔｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｒｅｅ Ｃｏｈｏｒｔｓ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１；１７：１８７５−８２）。その研究は、本研究と同じ日本コホート及び米国／ノルウェーコホートを利用し、ｍｉＲ−２１と４つのコーディング遺伝子指標の組合せが予後の実用性を改善するかどうかを判定する機会を与える。

以前、ｑＲＴ−ＰＣＲを使用し、肺腫瘍においてｍｉＲ−２１を測定した。この研究での患者は、診断の際にＡＪＣＣ第６版に基づいて病期分類された。したがって、上記４つの遺伝子指標が開発され、ＡＪＣＣ第６版病期分類情報に基づいて検証された。２００９年にＡＪＣＣ第７版ＴＮＭ病期分類が開発され、出版された。この指標が現在のＡＪＣＣ第７版病期分類によりどのようにはたらくかを判定するため、利用可能なデータを含む症例についてＡＪＣＣ第７版に再度病期分類し（図１０）、４つの遺伝子指標は、日本コホート（Ｐ＝０．０００５、図５）及び米国／ノルウェーコホート（Ｐ＝０．００２６、図６）の両方でＡＪＣＣ第７版ＴＮＭステージＩ肺がん患者において有意に関連したことを見出した。

本研究は、肺腫瘍及び近辺の非がん性組織において１細胞当たりのｍｉＲ−２１のコピー数を推定した。このため、ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇヒトマイクロＲＮＡアッセイを使用して、米国及びノルウェーのコホートの全体的なマイクロＲＮＡ発現パターンを測定した。腫瘍は、１４４４の推定された中央値コピー数を伴うおよそ２．４倍高いｍｉＲ−２１発現を有し、一方、非がん性組織は中央値コピー数５９１．２であった（図７）。

ｍｉＲ−２１と予後との関連を調査するため、ｑＲＴ−ＰＣＲデータ（日本コホート）又はＮａｎｏｓｔｒｉｎｇデータ（米国及びノルウェーのコホート）のいずれかに基づく中央発現値に基づいて高又は低に患者を二分した。以前に報告されるように、ｍｉＲ−２１は、日本コホート及び米国及びノルウェーコホートの両方のＴＮＭステージＩ患者のより悪い予後と有意に関連する。興味深いことに、ｍｉＲ−２１と予後との関連は、以前に報告されたｍｉＲ−２１のｑＲＴ−ＰＣＲ測定と比較して、ｍｉＲ−２１を測定するのにＮａｎｏｓｔｒｉｎｇを使用する場合に、米国及びノルウェーコホートにおいてより強かった。これらのデータを、ＡＪＣＣ第７版病期分類（図５及び図６）及びＡＪＣＣ第６版病期分類（図８及び図９）の両方に基づいて分析した。その後、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇを使用して日本コホートにおけるマイクロＲＮＡ発現を測定したところ、ここでも、ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇデータとｑＲＴ−ＰＣＲデータ間の関連は、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇデータが予後とのより強い関連を与えることを示した（図１０及び図１１と比較した図５及び図６）。

次に、ｍｉＲ−２１と上記４つの遺伝子指標の組合せがいずれか単独の場合よりも優れているかどうかを判定した。この目的のため、４つの遺伝子サインの中央値に基づいて患者を二分した。カプラン−マイヤー分析（図５及び図６）は、４つの遺伝子指標スコアが低く、且つｍｉＲ−２１の低い患者（低リスクに分類される）は、最も良好な予後を有していたことを実証した。ＴＮＭステージ群に関わらず、一般に、これらのマーカーの１つのみにより高リスクと分類された患者は中間の予後を有し、高い４遺伝子指標／高いｍｉＲ−２１の患者（高リスクに分類される）は、最も悪い予後を有した。これは、ＡＪＣＣ第７版（図５及び図６）及びＡＪＣＣ第６版（図８及び図９）に基づく病期分類に当てはまった。多変数分析は、高い４遺伝子指標（ＨＲ、２．２８；９５％ＣＩ、１．１５−４．５１、Ｐ＝０．０１８）、及び高いｍｉＲ−２１（ＨＲ、２．０６；９５％ＣＩ、１．１３−３．７６、Ｐ＝０．０１９）が、日本コホートにおいて互いに独立であることを示した（下記表６）。米国／ノルウェーコホートに対する多変数分析は、高い４遺伝子指標（ＨＲ、１．８７；９５％ＣＩ、０．９６−３．６３、Ｐ＝０．０６５）及び高いｍｉＲ−２１（ＨＲ、３．２６；９５％ＣＩ、１．６０−６．６４、Ｐ＝０．００１）は、各々、予後と関連することを示した（表６）。分析をＴＮＭステージＩ患者に限定した場合、同様の結果が見られた（表６）。これらの結果は、４つのコーディング遺伝子指標及びｍｉＲ−２１発現は、ステージＩ肺腺がんの予後バイオマーカーとして共に使用され得ることを示す。ＴＮＭステージＩＢ肺がんの複合分析において同様の結果が観察された（図９）。

次に、ｍｉＲ−２１を測定する別の方法が、より容易に病院へと移転できる方法で同じ結果を提供するかどうかを調査した。このため、最小限の試料調製で増幅せずに、数百のマイクロＲＮＡのデジタル検出をする方法を提供するｎＣｏｕｎｔｅｒヒトｍｉＲＮＡアッセイを使用した。ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１６、ｍｉＲ−１２６及びｍｉＲ−２９は最も発現が高いマイクロＲＮＡ（ｍｉＲ−２１を除く）であり、これらのマイクロＲＮＡのいずれも予後と関連しなかった（図１２）。したがって、ｍｉＲ−２１発現を、これら５つのマイクロＲＮＡの幾何平均に対して正規化した。ｍｉＲ−２１のｎＣｏｕｎｔｅｒヒトｍｉＲＮＡアッセイの測定とｑＲＴ−ＰＣＲを使用する以前の報告を比較した場合、同様の結果が観察された。ｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイを使用することにより、ｍｉＲ−２１の中央値より高い発現は、日本コホート及び米国／ノルウェーコホートの両方のステージＩ患者において、より悪い予後と有意に関連した。興味深いことに、ｍｉＲ−２１と予後との関連は、以前に報告されたｍｉＲ−２１のｑＲＴ−ＰＣＲ測定と比べて、ｍｉＲ−２１を測定するためにｎＣｏｕｎｔｅｒアッセイを使用する場合により強かった。これらの結果をＡＪＣＣ第７版病期分類（図５、図６）、及びＡＪＣＣ第６版病期分類（図１３及び図１４）の両方に基づいて分析した。

ｍｉＲ−２１と４つの遺伝子指標の組合せがいずれか単独の場合よりも優れているかどうかを判定するため評価を行った。カプラン−マイヤー分析（図５及び図６）は、４つの遺伝子指標スコアが低く、且つｍｉＲ−２１が低い患者（低リスクに分類される）が最も良好な予後を有していたことを実証する。一般に、ＴＮＭステージ群に関わらず、これらのマーカーのうちの１つのみにより高リスクに分類された患者は中間の予後を有し、４遺伝子指標／ｍｉＲ−２１が高い患者（高リスクに分類される）は最も悪い予後を有していた。多変数分析は、日本コホート及び米国／ノルウェーコホートにおいて４遺伝子指標及びｍｉＲ−２１の両方が互いに統計学的に独立であることを示した（表６）。これらの結果は、４つのコーディング遺伝子指標及びｍｉＲ−２１発現を、ステージＩ肺腺がんの予後バイオマーカーとして共に使用できることを示唆する。

ｍｉＲ−２１発現の増加が乏しい生存と関連することが明らかである一方、この発現レベルが１細胞当たりのコピーに関して何であるのかということは不明である。次に、肺腫瘍細胞が平均で１細胞当たりおよそ５０，０００コピーのｍｉＲ−２１を有すると推定した。これは、段階希釈した合成ｍｉＲ−２１の標準曲線（図１５）及び既知量の腫瘍ＲＮＡを使用して算出した。肺がん細胞株Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ２３に関して１細胞当たりの全ＲＮＡを、それぞれ、１９．４ｐｇ／細胞及び２０．１ｐｇ／細胞と推定した（図１６）。したがって、１腫瘍細胞当たり２０ｐｇのＲＮＡを使用して、腫瘍細胞当たりのｍｉＲ−２１のコピーを算出した。これらのコピー数の推定は、肺組織に関する他の公表された推定と同様であった（Ｌｅｅ ＥＪ，Ｂａｅｋ Ｍ，Ｇｕｓｅｖ Ｙ，Ｂｒａｃｋｅｔｔ ＤＪ，Ｎｕｏｖｏ ＧＪ，Ｓｃｈｍｉｔｔｇｅｎ ＴＤ．Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｉｃｒｏＲＮＡ ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ ｐａｔｔｅｒｎｓ ｉｎ ｔｉｓｓｕｅｓ，ｃｅｌｌ ｌｉｎｅｓ，ａｎｄ ｔｕｍｏｒｓ．ＲＮＡ．２００８；１４：３５−４２．）。

実施例６：４つのコーディング遺伝子指標及び非コーディングｍｉＲ−２１に対する腫瘍の不均一性の効果
更なる実験において、同じ腫瘍の２つの異なる組織片を調査することにより、どのように腫瘍の不均一性がタンパク質コーディング遺伝子指標及びｍｉＲ−２１の両方に影響を及ぼし得るのかも試験した。ｍｉＲ−２１及び上記４つのコーディング遺伝子指標の両方が、同じ腫瘍に由来する組織片において再現性が高いことが見出され、単一の生検による測定で十分であることを示唆する（図１８）。

本明細書に記載される研究の目的は、臨床決定を導くのに役立つ初期段階の肺がんに対する予後遺伝子指標を構築することであった。本明細書に詳述されるように、予後遺伝子指標を、５つの独立した患者コホートにおいて同定し、検証した。上記４つのコーディング遺伝子指標と予後のロバストな関連は、民族的及び地理的に多様な集団に亘りステージＩ患者に有意であり、上記遺伝子指標を補助化学療法による利益を受け得る高リスクの初期段階の肺がん患者を同定するのに使用できることを示す。

上記４つのコーディング遺伝子指標と予後との関連は、民族的及び地理的に多様な集団を超えてステージＩ患者に有意であり、この指標が補助化学療法による利益を受け得る高リスクの初期段階の肺がん患者を同定する可能性があることを示唆する。

ステージＩのＮＳＣＬＣの現在の標準治療は、化学療法を伴わない、肺葉切除及び縦隔リンパ節郭清法である。補助療法による利益を受ける可能性のあるステージＩＡ患者、及び補助化学療法を免れる可能性のあるステージＩＢ患者を同定するためのバイオマーカーが必要とされている。ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＢＲＣＡ１、及びＸＰＯ１を含む、この４つのコーディング遺伝子指標をステージＩの患者に対して治療決定を導くのに使用できることが本発明の知見である。高リスクと定義されるステージＩの患者は、より初期の又はより積極的な介入に適している可能性がある。一部の研究は、ＴＮＭステージＩＢ患者は術後の補助化学療法を受けるべきであることを示唆し（Ｋａｔｏ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｔｒｉａｌ ｏｆ ａｄｊｕｖａｎｔ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ｕｒａｃｉｌ−ｔｅｇａｆｕｒ ｆｏｒ ａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ ｏｆ ｔｈｅ ｌｕｎｇ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００４；３５０：１７１３−２１；Ｒｏｓｅｌｌｉ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｐｏｓｔｓｕｒｇｉｃａｌ ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ｉｎ ｓｔａｇｅ ＩＢ ｎｏｎｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ：Ｌｏｎｇ−ｔｅｒｍ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｉｎ ａ ｒａｎｄｏｍｉｚｅｄ ｓｔｕｄｙ．Ｉｎｔ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００６；１１９：９５５−６０）、他方はこれに同意していない（Ｗｉｎｔｏｎ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ ｐｌｕｓ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｖｓ．ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｒｅｓｅｃｔｅｄ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２００５；３５２：２５８９−９７；Ｄｏｕｉｌｌａｒｄ ＪＹ，ｅｔ ａｌ．Ａｄｊｕｖａｎｔ ｖｉｎｏｒｅｌｂｉｎｅ ｐｌｕｓ ｃｉｓｐｌａｔｉｎ ｖｅｒｓｕｓ ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ ｉｎ ｐａｔｉｅｎｔｓ ｗｉｔｈ ｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ ｒｅｓｅｃｔｅｄ ｓｔａｇｅ ＩＢ−ＩＩＩＡ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ−ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ（Ａｄｊｕｖａｎｔ Ｎａｖｅｌｂｉｎｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｔｒｉａｌｉｓｔ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ ［ＡＮＩＴＡ］）：ａ ｒａｎｄｏｍｉｓｅｄ ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ ｔｒｉａｌ．Ｌａｎｃｅｔ Ｏｎｃｏｌ．２００６；７：７１９−２７；Ｗａｋｅｌｅｅ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｏｐｔｉｍａｌ ａｄｊｕｖａｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｎｏｎ−ｓｍａｌｌ ｃｅｌｌ ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ−−ｈｏｗ ｔｏ ｈａｎｄｌｅ ｓｔａｇｅ Ｉ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｏｎｃｏｌｏｇｉｓｔ．２００７；１２：３３１−７．）。ＮＣＣＮガイドラインは、適切な治療を決定するのを援助するため、ＮＳＣＬＣの再発又は転移はＥＧＦＲ突然変異又はＥＭＬ４−ＡＬＫ融合の存在に関して評価するべきであると示す。高リスクの初期段階の患者にどの治療法を受けさせるべきなのかについてのガイダンスの提供を援助するため、ここに提示される上記４つのコーディング遺伝子指標が単独又はＥＧＦＲ及びＡＬＫの状態と共に使用され得るかどうかについて、更なる研究により取り組む必要がある。

ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１及びＢＲＣＡ１は、いずれもがん生物学において関係があるとされており、因果的に攻撃的な疾患と関連する可能性がある。したがって、これらのいずれかの遺伝子発現の変更は、腫瘍生物学を変更して、より転移しやすいか、又は化学療法に対する抵抗性を急速に確立する、より攻撃的な腫瘍を生み出す可能性がある。ＨＩＦ１Ａの過剰発現は、複数のタイプのがん腫で共通の事象であり、攻撃的な腫瘍挙動及び全体的に乏しい予後と関連している（Ｇｉａｔｒｏｍａｎｏｌａｋｉ Ａ，ｅｔ ａｌ．Ｂｒ Ｊ Ｃａｎｃｅｒ．２００１；８５：８８１−９０；Ｂｉｒｎｅｒ Ｐ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０００；６０：４６９３−６；Ｚｈｏｎｇ Ｈ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１９９９；５９：５８３０−５；Ａｅｂｅｒｓｏｌｄ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｈｙｐｏｘｉａ−ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｆａｃｔｏｒ−１ａｌｐｈａ：ａ ｎｏｖｅｌ ｐｒｅｄｉｃｔｉｖｅ ａｎｄ ｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃ ｐａｒａｍｅｔｅｒ ｉｎ ｔｈｅ ｒａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｏｒｏｐｈａｒｙｎｇｅａｌ ｃａｎｃｅｒ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２００１；６１：２９１１−６．）。ＨＩＦ１Ａは、Ｌａｕ ｅｔ ａｌ．（Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ．２００７；２５：５５６２−９）により報告された肺がん予後指標の一部であった ＸＰＯ１は核処理及びマイクロＲＮＡの核細胞質の輸送の両方を調節することができ（Ｂｕｓｓｉｎｇ Ｉ，ｅｔ ａｌ．ＥＭＢＯ Ｊ．２０１０；２９：１８３０−９；Ｃａｓｔａｎｏｔｔｏ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００９；１０６：２１６５５−９．）、ＢＲＣＡ１（Ｂｒｏｄｉｅ ＫＭ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１２；２８７：７７０１−１６．）、及びＴＰ５３（Ｃａｉ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００８；１０５：１６９５８−６３；Ｆｒｅｅｄｍａｎ ＤＡ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．１９９８；１８：７２８８−９３．）、ＸＰＯ１もまた、Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌにより報告された肺がん予後指標の一部であり（Ｗａｎ ＹＷ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１０；５：ｅ１２２２２）ＤＬＣ１は肺がんを包含する多くの腫瘍タイプにおいてしばしば欠失するか発現が停止される腫瘍抑制遺伝子である（Ｙｕａｎ ＢＺ，ｅｔ ａｌ．Ｏｎｃｏｇｅｎｅ．２００４；２３：１４０５−１１；Ｄｕｒｋｉｎ ＭＥ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｅｌｌ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００７；１１：１１８５−２０７）。特に、ＤＬＣ１メチル化は、肺転移性疾患の存在と有意に関連した（Ｃａｓｔｒｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ．２０１０；８：８６）。ＢＲＣＡ１の生殖細胞変異は、乳がん及び卵巣がんに対する家族性の易罹患性と著しく関連する（Ｂｌａｃｋ ＤＭ，ｅｔ ａｌ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．１９９３；９：２２−６）。しかしながら、ＢＲＣＡ１の過剰発現は、そのＤＮＡ修復及び抗アポトーシス細胞経路における役割により、化学療法剤に対して抵抗性をもたらす（Ｋｅｎｎｅｄｙ ＲＤ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｎａｔｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ．２００４；９６：１６５９−６８）。しかしながら、最近の研究は、ＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡの高発現は、補助化学療法を受けなかった肺がん患者の乏しい予後の標識であることを示した（Ｒｏｓｅｌｌ Ｒ，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２００７；２：ｅ１１２９）。本研究における日本コホートは、主に補助化学療法を受けなかった患者で構成される。そのため、ＢＲＣＡ１の生存促進性の役割は、内因性の酸化損傷に対する抵抗性を含むため、化学療法抵抗性の増強を超えて拡大される可能性がある（Ｓａｈａ Ｔ，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１０；２８５：１９０９２−１０５）。本研究で提示される肺がんコホートに加えて、ＢＲＣＡ１発現の増加は、他のタイプのヒトがんのより悪い予後と関連する（図１７）。ＢＲＣＡ１は、ＤＮＡ修復及びＤＮＡ組換えを包含する複数の機能を有する（Ｓｉｌｖｅｒ ＤＰ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖ．２０１２；２：６７９−８４．）。ＢＲＣＡ１は、腫瘍において高いレベルで見出される内因性のＤＮＡ二本鎖切断のＤＮＡ修復を増強し得る（Ｈａｌａｚｏｎｅｔｉｓ ＴＤ，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ．２００８；３１９：１３５２−５．）。したがって、ＢＲＣＡ１の上昇は、がん細胞の生存を高め、肺がん症例の乏しい予後に寄与する可能性があり、更なる研究が正当化される。いくつかの臨床研究は、現在、化学療法との関連でＢＲＣＡ１ ｍＲＮＡレベルを研究する目的でステージＩＩ〜ＩＶのＮＳＣＬＣ患者を募集している（臨床試験の政府登録でＮＣＴ００４７８６９９、ＮＣＴ００６１７６５６、及びＮＣＴ００７０５５４９）。

本明細書に記載される研究では、上記コーディング遺伝子指標とｍｉＲ−２１の組合せは、予後の予測においていずれか単独よりも優れていることを証明した。ｍｉＲ−２１の過剰発現は、肺がんを包含する固形腫瘍に亘って説明されている（Ｓａｉｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．２０１１，Ｖｏｌｉｎｉａ Ｓ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００６；１０３：２２５７−６１）。これは、肺腫瘍でｍｉＲ−２１に関して１細胞当たりのコピー数を推定する最初の報告である。ＮａｎｏｓｔｒｉｎｇヒトマイクロＲＮＡアッセイによるｍｉＲ−２１の測定は、ｑＲＴ−ＰＣＲによってｍｉＲ−２１を測定するよりもロバストな予後指標であり得る。それ自体に限定されないが、Ｓａｉｔｏ Ｍ．，ｅｔ ａｌ．２０１１に記載されるように、Ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇアッセイが正規化コントロールとして５つの高発現マイクロＲＮＡを使用し、これがＲＮＵ６６を正規化コントロールとして使用するよりも安定な可能性があることがこれに対する可能性のある理由である。

ｍｉＲ−２１は、肺がんにおいて発がん性の役割を有する。ｍｉＲ−２１に加えてＯｎｃｏｍｉＲが動物モデルにおいて実証されている（Ｍｅｄｉｎａ ＰＰ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１０；４６７：８６−９０．）。ＮＳＣＬＣのマウスモデルでは、ｍｉＲ−２１過剰発現は、腫瘍形成を増強し、その欠失は腫瘍形成を減少することから、ｍｉＲ−２１と肺の発がんとの直接的なリンクをもたらす（Ｈａｔｌｅｙ ＭＥ，ｅｔ ａｌ Ｃａｎｃｅｒ Ｃｅｌｌ．２０１０；１８：２８２−９３．）。ｍｉＲ−２１は、がんの顕著な特徴と関連するがん細胞表現型に関与する多くの遺伝子（Ｓｃｈｅｔｔｅｒ ＡＪ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｊ．２０１２；１８：２４４−５２．）を標的とする（Ｈａｎａｈａｎ Ｄ，ｅｔ ａｌ．Ｃｅｌｌ．２０１１；１４４：６４６−７４．）。さらに、ｍｉＲ−２１はＳＯＤ３を減少し（Ｚｈａｎｇ Ｘ，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１２；７２：４７０７−１３．）、肺がん細胞におけるアポトーシスの誘導に対する抵抗性を増加する（Ｓｅｉｋｅ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２００９；１０６：１２０８５−９０）。これら及び他の研究は、肺がんに対する可能性のある治療標的としてｍｉＲ−２１を同定した（Ｃｒｏｃｅ ＣＭ，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１１；１７：９３５−６）。

結論として、本明細書に報告される結果は、肺腺がん、特にステージＩにおける治療決定を導くのに役立つように臨床背景におけるコーディング及び非コーディング遺伝子発現分析の使用を支持する証拠を提供する。

実施例７：ステージＩ肺腺がんの予後指標としての４遺伝子指標のメタアナリシス
以前に、４つの遺伝子のｍＲＮＡ発現レベルに基づく予後指標を開発し、検証した。この４遺伝子指標は、高リスクの疾患憎悪にあるステージＩ肺腺がん患者を同定し、これらの患者に対する治療決定を導くのに役立つ可能性がある。初期の研究は、世界の様々な地域に由来する５つの独立したコホートの患者を評価し、上記４遺伝子指標がロバストでほとんどの肺腺がんに代表的であることを示唆した。この指標をさらに検証する試みにおいて、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ又はＯｎｃｏｍｉｎｅにより同定され得る公的に利用可能なデータセットの全てに試験を行った。本明細書には、１０６９名のＴＮＭステージＩの肺腺がん患者からなる１２のコホートのメタアナリシスが記載される。メタアナリシスは、不均一性の証拠を伴わずに全てのコホートに亘って一貫した結果を見出した（Ｉ２＝０．０％、ｐ＝０．９８）。上記４つの遺伝子指標は、１２のコホートのうちの１０における予後と有意に関連した（ｐ＜０．０５）。プールした推定は、上記予後指標が、全てのステージＩ（ハザード比［ＨＲ］、２．２６；９５％信頼区間［ＣＩ］、１．９３〜３．６７；Ｐ＜０．０００１）の患者、及びステージＩＡ（ＨＲ、２．６９；９５％ＣＩ、１．６６−４．３５；Ｐ＜０．０００１）及びステージＩＢ（ＨＲ、２．６９；９５％ＣＩ、１．７４−４．１６；Ｐ＜０．０００１）の患者の階級化分析における予後と関連することを見出した。これらの結果は、上記４遺伝子指標が、治療決定を導くため、初期段階の患者をリスクにさらに階級化する臨床上の有用性を有し得ることを示唆する。上記４遺伝子指標は、扁平上皮がんの組織学を伴う患者における予後とは関連せず、肺腺がんにおいてのみ実用性を有し得ることを示す。

研究の選択
「肺がん」、「非小細胞肺がん」、「肺腺がん」、「肺腺がん（複数）」及び「ＮＳＣＬＣ」の検索用語により、２０１３年６月にＧＥＯ（Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）を検索した。回収したＧＥＯシリーズを生物（ホモサピエンス）及びシリーズタイプ（アレイによる発現プロファイリング）によりフィルターにかけ、同様に、試料の数（３０を超える試料を有するシリーズ）によりソートした。最初のＧＥＯ検索により同定された９２のＧＥＯシリーズを、ＧＥＯアクセッションディスプレイに記載される名称、要約及び全体計画に基づいてスクリーニングした。データセットが細胞株／異種移植片試料のみ、非腫瘍標本（例えば、気管支上皮細胞、血液、体液）のみを分析していた場合、又は原発性ＡＤＣ腫瘍を含有していない場合はデータセットを除外した。また、１又は複数のサブシリーズから成るいくつかのスーパーシリーズを除外し（重複データのため）、遺伝子発現データを含む対応するサブシリーズを回収し、肺がんに関連する臨床研究の４６のＧＥＯデータセットを残した。この検索と並行して、ＯＮＣＯＭＩＮＥ（ミシガン州アナーバーのＣｏｍｐｅｎｄｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｏｎｃｏｍｉｎｅ．ｃｏｍ）を使用して、生存状況を含むＡＤＣ患者を有する公的なマイクロアレイデータセットを同定した。ＯＮＣＯＭＩＮＥ検索は、１０のデータセットを同定し、そのうち５つはＧＥＯに寄託されていなかった。得られた５１の原発性ＡＤＣ試料を含有するデータセットを、Ｓｅｒｉｅｓ Ｍａｔｒｉｘ Ｆｉｌｅのｔｈｅ Ｓａｍｐｌｅ Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ、又はＯＮＣＯＭＩＮＥのｔｈｅ Ｄａｔａｓｅｔ Ｄｅｔａｉｌに基づいてさらに検討した。全ての公的に利用可能なデータセットに対する選択基準は、各データセットが３０超のＡＤＣのＴＮＭステージＩ患者の生存情報を包含し、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１及びＸＰＯ１に関する発現データを有することを必要とした。基準に合致しなかった４０のデータセットを除去した後、Ｂｏｔｌｉｎｇコホート（ＧＳＥ３７７４５）（Ｂｏｔｌｉｎｇ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９：１９４−２０４，２０１３．）、Ｔａｎｇコホート（ＧＳＥ４２１２７）（Ｔａｎｇ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１９：１５７７−８６，２０１３．）、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘコホート（ＧＳＥ３０２１９）（Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ，５：１８６ｒａ６６，２０１３．）、Ｍａｔｓｕｙａｍａコホート（ＧＳＥ１１９６９）（Ｍａｔｓｕｙａｍａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｃａｒｃｉｎｏｇ，５０：３０１−９，２０１１．）、Ｗｉｌｋｅｒｓｏｎコホート（ＧＳＥ２６９３９）（Ｗｉｌｋｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７：ｅ３６５３０，２０１２）、Ｌｅｅコホート（ＧＳＥ８８９４／ＯＮＣＯＭＩＮＥ）（Ｌｅｅ，Ｅ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１４：７３９７−４０４，２００８）、Ｂｉｌｄコホート（ＧＳＥ３１４１／ＯＮＣＯＭＩＮＥ）（Ｂｉｌｄ，Ａ．Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ，４３９：３５３−７，２００６．）、並びにＢｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅコホート（ＯＮＣＯＭＩＮＥ）（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ，９８：１３７９０−５，２００１．）、Ｄｉｒｅｃｔｏｒｓコホート（ＯＮＣＯＭＩＮＥ）（Ｓｈｅｄｄｅｎ，Ｋ．，ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｍｅｄ，１４：８２２−７，２００８．）、日本コホート（ＧＳＥ３１２１０）（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，２０１１．）、Ｔｏｍｉｄａコホート（ＧＳＥ１３２１３）（Ｔｏｍｉｄａ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２７：２７９３−９，２００９．）を包含する１１の独立したマイクロアレイデータセットを見出した。それらのうち、本研究のため前者の７つのコホートをＧＥＯ又はＯＮＣＯＭＩＮＥ（利用可能な場合）から新たに得たのに対し、後者の４データセットは以前の研究において既に分析されたオリジナルのコホートであった（Ａｋａｇｉ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７３：３８２１−３８３２，２０１３．）。選択フローチャート及び回収したデータセットの一覧を図１９及び図２０の表に提示する。

ＳＱＣ患者における上記４遺伝子分析のため、ステージＩのＳＱＣの複数のコホートを使用した。上記に言及されたＡＤＣデータセットのうちＢｏｔｌｉｎｇ、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘ、Ｔａｎｇ、Ｍａｔｓｕｙａｍａ、Ｌｅｅ及びＢｉｌｄのデータセットを包含する６つのコホートは、これらのコホートも生存情報を有する扁平上皮がん（ＳＱＣ）患者に関する発現データを含有したことから、含められた。１つのＳＱＣデータセットを、Ｗｉｌｋｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｗｉｌｋｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，１６：４８６４−７５，２０１０．）により寄託され、それらのＡＤＣデータ（ＧＳＥ２６９３９、ＷｉｌｋｅｒｓｏｎＡＤＣコホート）から分離されたＧＥＯ（ＧＳＥ１７７１０）から得た（Ｗｉｌｋｅｒｓｏｎ，Ｍ．Ｄ．，ｅｔ ａｌ．ＰＬｏＳ Ｏｎｅ，７：ｅ３６５３０，２０１２．）。さらに、Ｒａｐｏｎｉコホート（ＳＱＣのみ）（Ｒａｐｏｎｉ，Ｍ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，６６：７４６６−７２，２００６．）、Ｌａｒｓｅｎコホート（ＳＱＣのみ）（Ｌａｒｓｅｎ，Ｊ．Ｅ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，２８：７６０−６，２００７．）、及びＺｈｕコホート（ＡＤＣ及びＳＱＣ）（Ｚｈｕ，Ｃ．Ｑ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２８：４４１７−２４，２０１０．）を包含する、ＯＮＣＯＭＩＮＥで見出された生存情報を含む３つのＳＱＣデータセットのうち、Ｒａｐｏｎｉコホート及びＺｈｕコホートをＳＱＣ分析に含めた。Ｚｈｕコホートについて、ＳＱＣ患者のみを分析し、一方、既に相当数のＡＤＣ患者がＤｉｒｅｃｔｏｒｓコホートの一部（ＣＡＮ／ＤＦ）として使用されていたことから、ＡＤＣ患者（ｎ＝１４、ステージＩ）は無視した（Ｚｈｕ，Ｃ．Ｑ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｌｉｎ Ｏｎｃｏｌ，２８：４４１７−２４，２０１０．）。Ｌａｒｓｅｎコホートは、ＢＲＣＡ１遺伝子がそのプラットフォームで利用可能でなかったことから、除外した。

遺伝子発現データ分析
この研究はステージＩの患者に焦点を絞った。５つのオリジナルコホートの上記４遺伝子分析は、以前に記載されるように（Ａｋａｇｉ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ，７３：３８２１−３８３２，２０１３）ＡＪＣＣ ＴＮＭ第６版を使用した。７つの新たなコホートに関し、各々のもともとの論文においてＴＮＭ版が第６版又は第７版のいずれかが明記されていなかったが、ほとんどの腫瘍が２００９年のＴＮＭ第７版の開発前に採取されたことから、ＡＪＣＣ ＴＮＭ第６版に基づくと推測された。Ｒｏｕｓｓｅａｕｘコホートについて、各患者について提供されたＴＮＭ分類に従って、Ｔ１Ｎ０腫瘍をステージＩＡと同定し、一方、Ｔ２Ｎ０腫瘍をステージＩＢと同定した。全ての利用可能な公的データベースから得られたステージＩ症例のうち、Ｔａｎｇコホートの２つのＡＤＣ及び１つのＳＱＣ、Ｌｅｅコホートの３つのＡＤＣ及び４つのＳＱＣを、これらの症例について生存情報が提供されていなかったため、分析から除外した。

全ての分析について、正規化した発現値を各データセットから得て、さらに加工しなかった。マイクロアレイ発現データを使用して上記４遺伝子指標を構築するため、最も信頼性のある情報価値のあるプローブを選択するための基準を作成した。簡潔には、各コホートのステージＩのＡＤＣ症例を使用して同じ遺伝子の各プローブのペアワイズの相関を分析し、その後、任意の他のプローブと相関するプローブ、或いは最も高い発現を伴うプローブを各プラットフォームについて選択した（下記表７に示される）。

１より多いプローブを選択した場合、それらを平均した。４コーディング遺伝子指標［（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）］を、マイクロアレイ発現データを使用して新たに得られた全てのコホートに適用し、得られた指標スコアを三分位数に基づいて低、中、又は高に分類した。上記４コーディング遺伝子指標と生存の関連を、Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ５．０（Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ）を使用する傾向に関するカプラン−マイヤーログランク検定により判断した。Ｃｏｘ回帰分析をＳＰＳＳ １１．０（ＳＰＳＳ Ｉｎｃ）を使用して行い、全ての単変数及び多変数モデルを適切な場合にコホートメンバーシップに対して調整した。フォレストプロット分析をＳｔａｔａ １１．２（Ｓｔａｇａ−Ｃｏｒｐ ＬＰ）を使用して行った。複合ＨＲに関する異質性の検定を、Ｉ二乗統計学を使用して行った（Ｈｉｇｇｉｎｓ，Ｊ．Ｐ．，ｅｔ ａｌ．ＢＭＪ，３２７：５５７−６０，２００３．）。

適格な研究
この遺伝子発現に基づく指標の目的が手術後の追加の介入による利益を受ける可能性がある高リスクのステージＩ ＡＤＣ患者を同定することであるため、本研究において全ての分析をステージＩの原発性ＡＤＣ腫瘍に限定した。体系的な検索は、図１９及び図２０の表に記載されるように、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１及びＸＰＯ１を包含する４つ全ての遺伝子に関する遺伝子発現データを含む十分な生存情報を有する３０症例より多いステージＩのＡＤＣ患者からなる１１のマイクロアレイデータセットを同定した。ステージＩのＡＤＣの５つの独立したコホートを各々ｑＲＴ−ＰＣＲ及び／又はマイクロアレイで分析した最近の論文で、１１のデータセットのうち４つを以前に分析した。したがって、この体系的な検索により７つの独立したコホートを新たに得て、合計１２のコホートを本研究に含めた。上記１２のコホートの特性を下記表８に要約する。

本明細書に記載される分析は、５４６のステージＩＡ及び５１８のステージＩＢの症例（５つの症例はステージＩＡ又はステージＩＢと明示されていなかった）からなる、合計１０６９名の患者を包含する。これらのコホートは、日本、ノルウェー、スウェーデン、フランス、韓国、並びに米国の少なくとも８つの異なる研究所を包含する６つの異なる国に由来する。１２のコホートのうち９つは全生存情報を有していたが、２つのコホートは無再発生存を使用し、１つのコホートはがん特異的生存を使用した。各コホートにおいて、ＲＮＡ試料を凍結組織検体から単離し、ｑＲＴ−ＰＣＲ及びＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘ、Ｉｌｌｕｍｉｎａ、Ａｇｉｌｅｎｔマイクロアレイを包含する、様々なプラットフォームに基づく遺伝子発現分析に供した。

４遺伝子指標を１２の独立したコホートにおいて試験した
上記４遺伝子指標を、４つの遺伝子に関するマイクロアレイ発現データを使用してこれらの新しいコホートの各々に適用し、その後、各コホートのステージＩ患者における指標スコアの三分位数に基づいて、症例を高、中、又は低に分類した。以前に報告された結果と同様（図２１Ａ）、カプラン−マイヤー分析により、Ｔａｎｇコホート（ｐ＝０．０４６）、Ｒｏｕｓｓｅａｕｘコホート（ｐ＝０．０４４）、Ｗｉｌｋｅｒｓｏｎコホート（ｐ＝０．０１４）、Ｍａｔｓｕｙａｍａコホート（ｐ＝０．０２８）、Ｌｅｅコホート（ｐ＝０．０１０）、Ｂｏｔｌｉｎｇコホート（ｐ＝０．０５８）及びＢｉｌｄコホート（ｐ＝０．１２０）を包含する７つ全ての新たに得られたコホートにおいて上記４遺伝子指標と予後に非常に一致した関連が見出された（図２１Ｂ）。

複合コホートにおける４遺伝子指標のメタアナリシス
１２のコホートのうち、全生存情報を含む９つのコホートを、８１７のステージＩ症例を包含する複合モデルで分析した。重要なことには、複数のコホートに亘り不均質性及び矛盾のいずれも検出されず（Ｉ二乗＝０．０％、ｐ＝０．９８０）、これらの結果がほとんどの肺腺がんに代表的であり、選択バイアスの結果ではないことを示唆する（図２２）。上記指標により定義されたより高いリスクの患者は、ステージＩ分析において複合した全体傾向ＨＲ１．７３（９５％ＣＩ，１．４７−２．０２）を伴って、より乏しい全生存と有意に関連した（図２２Ａ）。複合したステージＩ患者に対する対応するカプラン−マイヤー分析を図３Ａに示す。さらに、ステージＩＡ及びＩＢについて別々に、これらのサブグループにおけるこの指標の予後への影響に取り組むため階級化した分析を行った。それぞれ、ステージＩＡ（傾向ＨＲ、１．６１；９５％ＣＩ、１．２７〜２．０６）分析及びステージＩＢ（傾向ＨＲ、１．７６；９５％ＣＩ、１．４１〜２．１９）分析の両方において、４遺伝子指標と全生存の有意な関連が見出された（図２Ｂ及び図Ｃ、図３Ｂ及び図Ｃ）。

４遺伝子指標はステージＩＡ患者、同様にステージＩＢ患者に対して独立した予後バイオマーカーである
上記指標がステージＩＡ、同様にステージＩＢのサブグループにおいても生存と有意に関連するとして、各ステージに関し、複合コホートを使用してＣｏｘ回帰分析を行った（以下に示される表９）。

全ての単変数及び多変数Ｃｏｘ分析をコホートメンバーシップに対して調整し、多変数モデルを、年齢、性別及びＴＮＭステージについて調整した。ほとんどの公的なデータセットは完全な臨床情報を提供していないことから、Ｃｏｘ分析に対して喫煙状態又は補助化学療法等の他のパラメーターを適用しなかった。単変数分析では、より高齢の男性でＴＮＭステージＩＢであって、上記指標により定義された高リスクの患者は、各々、より悪い転帰と有意に関連した。多変数モデルは、高リスク群は、ステージＩ分析（ＨＲ、２．６６；９５％ＣＩ、１．９３−３．６７；Ｐ＜０．０００１）のみならず、ステージＩＡ（ＨＲ、２．６９；９５％ＣＩ、１．６６−４．３５；Ｐ＜０．０００１）分析、また同様にステージＩＢ（ＨＲ、２．６９；９５％ＣＩ、１．７４−４．１６；Ｐ＜０．０００１）分析においても、乏しい全生存と有意に関連し、他のパラメーターから独立であったことを明らかにした。

４遺伝子指標は腺がん患者にのみ適用される
この指標の有意性について、ＮＳＣＬＣの別の主要な組織学タイプである扁平上皮がん（ＳＱＣ）において取り組んだ。３３７名のステージＩのＳＱＣ患者からなる９つの独立したコホートを得て、４遺伝子指標を各コホートに適用した（下記に示される表１０）。

また、全生存情報を有する８つのコホートを組み合わせた（ｎ＝２９２）。しかしながら、ＳＱＣ分析のいずれにおいても有意な関連は見出されず（図２３Ｄ、図２４）、４遺伝子指標はＡＤＣに特異的であることを示す。この指標がＡＤＣ患者のみに基づいて構築されたことから、これは合理的である。また、ＳＱＣ及びＡＤＣは互いに分子的に明確に異なる存在であることが示唆された（Ｈｅｒｂｓｔ，Ｒ．Ｓ．，Ｈｅｙｍａｃｈ，Ｊ．Ｖ．，ａｎｄ Ｌｉｐｐｍａｎ，Ｓ．Ｍ．Ｌｕｎｇ ｃａｎｃｅｒ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ，３５９：１３６７−８０，２００８）。

本研究は、以前に同定された上記４遺伝子指標が初期段階の肺腺がんに対するロバストな予後指標であるかどうかを検査するため計画された。利用可能な公的に利用可能なデータセットのいずれもが、この研究に使用された。４遺伝子指標は、１２のコホートに由来する１０００を超えるＴＮＭステージＩ肺腺がん症例についてロバストな指標であった。これらの結果は、ＴＮＭステージＩＡ又はステージＩＢの患者を評価する場合に有意であり、全ての関連は利用可能な臨床パラメーターから独立していた。これ（Ｒｈｉｓ）は、広範囲に検査され、これを検証された肺腺がんにおけるＲＮＡに基づく指標の最初の報告である。これらの結果は、この指標が、初期段階の肺がんの治療決定を導くのに役立ち得ることを示唆する。

補助化学療法を用いない根治目的の手術は、補助化学療法がこの患者集団の利益になるという明らかな証拠がないことから、ほとんどのＴＮＭステージＩ患者に対する標準治療である。しかしながら、これらの患者の多くは、より初期の介入による利益を受ける可能性がある検出不可能な微小転移を有する。４遺伝子指標は、治療的介入に適した高リスク患者集団を同定でき、この患者群に対して改善された生存転帰をもたらす。

プールされた推定は、４つの遺伝子、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１及びＸＰＯ１の各々は、肺腺がん患者の１２のコホートの全てのプールされた分析において、ステージＩ ＡＤＣ患者における生存と有意に関連したことを実証し、これらの遺伝子の各々が４遺伝子指標に包含されることを支持する（表１１）。

以下の方法及び材料を使用して本明細書に報告される結果を得た。

患者及び組織試料
日本東京の国立がんセンター病院（日本コホート、ｎ＝１９９）、米国のメトロポリタンボルチモア地域（米国コホートｍ、ｎ＝６７）、及びノルウェー国ベルゲンのハウケラン大学病院（ノルウェーコホート、ｎ＝２５）による肺腺がんを伴う患者の３つのコホートに由来する２９１の腫瘍試料を分析した。日本コホートを１９９８年〜２００８年の間、国立がんセンター病院から集めた。米国コホートを１９８７年〜２００９年の間に集めた。ノルウェーコホート（ｎ＝２５）を１９８８年〜２００３年の間に集めた。これらのコホートについて更なる情報は他にも記載されている（Ｓａｉｔｏ Ｍ，ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１；１７：１８７５−８２）。

術前の化学療法又は放射線治療を受けずに外科的切除を経た患者の原発性肺腫瘍及び近辺の非がん性の組織を入手した。手術直後に組織をスナップ凍結し、−８０℃で保存した。組織学により、世界保健機構腫瘍系分類に従って分類した。純粋な腺がん又は細気管支肺胞上皮がん（ＢＡＣ）成分を含む腺がんと診断された患者のみを使用し、ｉｎ ｓｉｔｕの腺がん（以前は純粋なＢＡＣ）の患者は除外した。

患者層を上記表１に列挙する。症例は、当初は対がん米国合同委員会（ＡＪＣＣ）第６版に基づいて病期分類され、可能な場合ＡＪＣＣ第７版により再度病期分類された。米国及びノルウェーコホートは、同様の５年生存率、ＴＮＭ病期分類、性別及び診断時の年齢を示した。そのため、全ての更なる分析に対して検出力を増加するため、それらを複合した。全ての患者は組織標本の採取に同意した。米国国立衛生研究所の施設内治験審査委員会（ＩＲＢ）、ノルウェーにおける医学及び健康の研究倫理委員会の地方委員会、日本の国立がんセンターのＩＲＢの承認のもとこの研究を行った。

ＲＮＡの単離及びｍＲＮＡの測定
ＴＲＩＺＯＬ（カリフォルニア州カールスバドのＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して凍結組織試料からＲＮＡを抽出し、Ｂｉｏａｎａｌｙｚｅｒ ２１００ ｓｙｓｔｅｍ（カリフォルニア州サンタクララのＡｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により判断した。臨床転帰を知らされずにデータ採取を完了した。Ｔａｑｍａｎ Ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｓｓａｙｓ（カリフォルニア州フォスターシティのＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を９６．９６ ｄｙｎａｍｉｃ ａｒｒａｙｓ（カリフォルニア州サウスサンフランシスコのＦｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）に二連でロードし、製造業者の指示書に従ってＢｉｏＭａｒｋ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（カリフォルニア州サウスサンフランシスコのＦｌｕｉｄｉｇｍ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を使用してｑＲＴ−ＰＣＲ反応を行った。Ｔａｑｍａｎアッセイは、ＤＮＭＴ１（Ａｓｓａｙ ＩＤ Ｈｓ００１５４７４９＿ｍ１）、ＢＲＣＡ１（ＩＤ Ｈｓ００１７３２３３＿ｍ１）、ＨＩＦ１Ａ（ＩＤ Ｈｓ００９３６３７１＿ｍ１）、ＣＡ９（ＩＤ Ｈｓ００１５４２０８＿ｍ１）、ＣＣＴ３（ＩＤ Ｈｓ００１９５６２３＿ｍ１）、ＤＬＣ１（ＩＤ Ｈｓ００１８３４３６＿ｍ１）、及びＸＰＯ１（ＩＤ Ｈｓ００４１８９６３＿ｍ１）を包含した。１８Ｓ（ＩＤ Ｈｓ０３００３６３１＿ｍ１）を正規化コントロールとして使用した。検出不可能なシグナルを欠如データとして処理した。ＢＲＣＡ１とＢＲＣＡ１−ＩＲＩＳの発現の関連を調査するため、製造業者の指示書に従い、７９００ ＨＴ Ｆａｓｔ Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ Ｓｙｓｔｅｍ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてＰＯＷＥＲ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）を使用してＢＲＣＡ１−ＩＲＩＳ及びＧＡＰＤＨに対してｑＲＴ−ＰＣＲを三連で行った。ＢＲＣＡ１−ＩＲＩＳに対する特異的プライマーをＣｈｏｃｋ ｅｔ ａｌ．（Ｃｈｏｃｋ，Ｋ．Ｌ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１０；７０：８７８２−９１）に従って合成した。Ｔａｑｍａｎアッセイによる米国コホートのＢＲＣＡ１発現の最も高い又は最も低い三分位数における２０のｃＤＮＡ試料をこの分析に供した。非コーディングマイクロＲＮＡであるｍｉＲ−２１の発現レベルは、これらの患者試料の全てにおいて以前に測定され、その方法はＳａｉｔｏ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１７：１８７５−８２（２０１１）に詳述される。

遺伝子発現アレイ
公的に利用可能な遺伝子発現データセット
日本コホート（Ｏｋａｙａｍａ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．７２：１００−１１（２０１２））を使用して作成されたマイクロアレイデータは、Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（アクセッション番号ＧＳＥ３１２１０）で利用可能である。Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ（Ｂｈａｔｔａｃｈａｒｊｅｅ，Ａ．ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９８：１３７９０−５（２００１））及び国立がん研究所Ｄｉｒｅｃｔｏｒｓチャレンジコホート（Ｓｈｅｄｄｅｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｍｅｄ．１４：８２２−７（２００８））を包含する、更なる公的に利用可能なマイクロアレイデータを検証に使用し、ＯＮＣＯＭＩＮＥ ２．０（ミシガン州アナーバーのＣｏｍｐｅｎｄｉａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）により得た。Ｔｏｍｉｄａコホート（Ｔｏｍｉｄａ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｏｎｃｏｌ．２７：２７９３−９（２００９））をＧｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｏｍｎｉｂｕｓ（アクセッション番号ＧＳＥ１３２１３）から得た。全ての公的に利用可能なデータセットに関する選択基準は、各データセットが５０名超のＴＮＭステージＩ患者に関する生存情報を包含し、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１及びＸＰＯ１の発現データを有することを必要とした。正規化した発現値を各データセットから得て、さらに加工することはなかった。遺伝子サインを構築するため、ＢＲＣＡ１に対応する２つのプローブに関する発現値をＯｎｃｏｍｉｎｅ ２．０コホートにおいて平均した。ＴｏｍｉｄａコホートにおいてＤＬＣ１に対し３つのプローブ（Ａ＿２３＿Ｐ２５２７２１、Ａ＿２４＿Ｐ９４０１１５及びＡ＿２３＿Ｐ２５２７２１）が存在した。Ａ＿２３＿Ｐ２５２７２１は、値が欠如していることから除外し、他の２つを平均した。

統計学的分析及び遺伝子指標の開発
Ｇｒａｐｈｐａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ５．０（カリフォルニア州サンディエゴのＧｒａｐｈｐａｄ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｉｎｃ）を使用するカプラン−マイヤーログランク検定により遺伝子発現と生存の関連を評価するため各遺伝子に関する中央発現値に基づいて患者を二分した。Ｓｔａｔａ １１．２（テキサス州カレッジステーションのＳｔａｇａＣｏｒｐ ＬＰ）Ｃｏｘ回帰を行った。日本コホートによるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１に対する連続発現値に関する多変数Ｃｏｘ回帰モデルに由来する係数を使用して、全てのコホートについて４つのコーディング遺伝子指標スコアを構築した。傾向に対するＰにより、また適切な場合にはログランク検定により、有意性について４つのコーディング遺伝子指標と生存の間の関連を判断した。Ｃｏｘ回帰分析のため、年齢を連続変数として処理し、喫煙状態を２０パックイヤー超と２０パックイヤー未満に二分した。４つのコーディング遺伝子指標を作成するための遺伝子発現データ、臨床情報及びｓｔａｔａコーディングはダウンロード用に公的に利用可能である（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ３．ｃａｎｃｅｒ．ｇｏｖ／ｉｎｔｒａ／ｌｈｃ／Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔａｌ＿Ｄａｔａ＿ａｎｄ＿ｃｏｄｉｎｇ＿ＣＲ．ｚｉｐ）。

マイクロＲＮＡ測定
製造業者の指示書に従って、全体的なマイクロＲＮＡ発現パターンを、１００ｎｇの全ＲＮＡを使用するＮａｎｏｓｔｒｉｎｇヒトマイクロＲＮＡアッセイ（ワシントン州シアトルのＮａｎｏｓｔｒｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）により測定した。ｍｉＲ−２１を包含しない５つの最も高く発現したｍｉＲ（ｍｉＲ−７２０、ｍｉＲ−２６ａ、ｍｉＲ−１２６、ｍｉＲ−１６及びｍｉＲ−２９ａ）の平均発現に基づいて、ｍｉＲ−２１発現値を正規化した。５つの最も高いマイクロＲＮＡの発現を使用することは、正規化対照としてより低く発現したマイクロＲＮＡを使用するよりも正確であると考えられた。

ｑＲＴ−ＰＣＲによる１細胞当たりのｍｉＲ−２１コピー数の絶対的定量
１つの腫瘍細胞当たりのｍｉＲ−２１のコピーを算出するため、最初に２つの肺腺がん細胞株、Ａ５４９及びＮＣＩ−Ｈ２３に由来する一連の全ＲＮＡ抽出物を使用して、１細胞当たりの全ＲＮＡ含有量を推定した。簡潔には、トリプシン処理した細胞を数え、一連の細胞懸濁物（三連の１００Ｋ、３３０Ｋ、１．０Ｍ、３．３．Ｍ、１０Ｍの細胞）をペレット化し、洗浄した後、Ｔｒｉｚｏｌによる全ＲＮＡ抽出に供した。全ＲＮＡ量をＮａｎｏｄｒｏｐにより測定し、このデータを使用して１細胞当たりのＲＮＡの量を推定するための標準曲線を作成した。

合成ｍｉＲ−２１（米国アイオワ州コーラルヴィルのＩｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）の段階希釈の標準曲線に対する肺腫瘍中のｍｉＲ−２１のレベルの比較に基づいて、ｍｉＲ−２１のコピー数を算出した。合成Ｃ．エレガンスｍｉＲ−５４を、逆転写及びＰＣＲの両方のクオリティコントロールとして全ての試料に添加した。３つの独立したコホートに由来する４９の腫瘍について、４０ｎｇの全ＲＮＡを逆転写に使用した。リアルタイムＰＣＲを三連（ｍｉＲ−２１）又は二連（ｃｅｌ−ｍｉＲ−５４）で行った。ｑＲＴ−ＰＣＲを以前に記載される標準的なＴａｑｍａｎ ＰＣＲプロトコル（Ｓａｉｔｏ Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｃｌｉｎ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．２０１１；１７：１８７５−８２）を使用して行った。合成ｍｉＲ−２１の標準曲線を作製することにより、ｍｉＲ−２１の絶対コピー数を測定した。

他の実施形態
上述の記載より、様々な用途及び条件に適合させるため本明細書に記載される発明に対して、変化及び修飾が行われてもよいことが明らかである。かかる実施形態もまた、下記特許請求の範囲に含まれる。

本明細書における任意の変数の定義において要素の一覧の列挙は、任意の単一の要素又は要素の一覧の組合せ（若しくは部分的組合せ）としてのその変数の定義を包含する。本明細書において実施形態の列挙は、任意の単一の実施形態又は任意の他の実施形態若しくはその一部との組合せとしてのその実施形態を包含する。

参照による援用
本明細書で言及される全ての特許、刊行物、ＣＡＳ番号、及びアクセッション番号は、独立した特許及び刊行物の各々が具体的且つ個別に参照により援用されることが示されるのと同じ程度に参照により本明細書に援用される。

Claims (21)

1. 肺がんを伴う被験体の予後を判定する方法であって、
   （ａ）前記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを検出すること、
   （ｂ）ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルを参照と比較すること、ここで、該参照は健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、及びＸＰＯ１のレベルであり、並びに
   （ｃ）ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、及びＸＰＯ１のレベルが前記参照に比べて増加し、且つＤＬＣ１のレベルが前記参照に比べて減少している場合に前記被験体を予後不良であると同定すること、
   を含む前記方法。
2. （ａ）が更に試料中のｍｉＲ−２１のレベルを検出することを含み、（ｂ）が更にｍｉＲ−２１のレベルを参照と比較することを含み、（ｃ）が更にｍｉＲ−２１のレベルが参照に比べて増加している場合に被験体を予後不良であると同定することを含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記被験体が、前記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有する場合に、前記被験体が予後不良であると同定される、請求項１に記載の方法。
4. 肺がんを伴う被験体の予後を判定する方法であって、
   （ａ）前記被験体から得られた試料中のＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを検出すること、
   （ｂ）ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１、及びｍｉＲ−２１のレベルを参照と比較すること、ここで、該参照は健康な対照におけるＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１及びｍｉＲ−２１のレベルであり、並びに
   （ｃ）ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＸＰＯ１及びｍｉＲ−２１のレベルが前記参照に比べて増加し、且つＤＬＣ１のレベルが前記参照に比べて減少している場合に前記被験体を予後不良であると同定すること、
   を含む前記方法。
5. 前記被験体が、前記参照に比べてより高い（０．１０４×ＢＲＣＡ１）＋（０．１３３×ＨＩＦ１Ａ）＋（−０．２４６×ＤＬＣ１）＋（０．３７８×ＸＰＯ１）の指標スコアを有し、且つ前記被験体が前記参照に比べてより高いｍｉＲ−２１レベルを有する場合に、前記被験体が予後不良であると同定される、請求項４に記載の方法。
6. （ｃ）において、被験体を予後不良であると同定することが、被験体を陽性の臨床転帰の可能性が低いと同定することであり、前記臨床転帰が無再発生存（ＲＦＩ）、全生存（ＯＳ）の時間の増加、無病生存（ＤＦＳ）の時間の増加、無遠隔再発期間（ＤＲＦＩ）の期間の増加、又は長期生存の用語で表される、請求項１又は４に記載の方法。
7. 予後不良であると同定された場合、前記被験体を、肺がんの再発のリスクを有する、又は肺がんの治療法に適していると同定することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. 前記試料が前記肺から得られた組織試料である、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 予後不良であると同定された場合、前記被験体により精密な追跡調査を割り当てる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 予後不良であると同定された場合、前記被験体により頻繁にスクリーニングを割り当てる、請求項９に記載の方法。
11. 予後不良であると同定された場合、前記被験体により頻繁にＣＴスキャンを割り当てる請求項１０に記載の方法。
12. 予後不良であると同定された場合、前記被験体を補助放射線療法による利益を受ける個体と同定する、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 予後不良であると同定された場合、前記被験体を補助化学療法による利益を受ける個体と同定する、請求項１〜１２のいずれか一項に記載の方法。
14. 前記補助化学療法が、アルデスロイキン、アレムツズマブ、アリトレチノイン、アルトレタミン、アミホスチン、アミノグルテチミド アナグレリド、アナストロゾール、三酸化ヒ素、アスパラギナーゼ、アザシチジン、アザチオプリン、ベンダムスチン、ベバシズマブ、ベキサロテン（Ｂｅｘａｒｏｔｉｎｅ）、ビカルタミド、ブレオマイシン、ボルテゾミブ、ブスルファン、カペシタビン、カルボプラチン、カルムスチン、セツキシマブ、クロラムブシル、シスプラチン、クラドリビン、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、ダクチノマイシン、ダサチニブ、ダウノルビシン、デニロイキンジフチトクス、デシタビン、ドセタキセル、デキサメタゾン、ドキシフルリジン、ドキソルビシン、エピルビシン、エポエチンアルファ、エポチロン、エルロチニブ、エストラムスチン、エトポシド、エベロリムス、エキセメスタン、フィルグラスチム、フロクスウリジン、フルダラビン、フルオロウラシル、フルオキシメステロン、フルタミド、ゲフィチニブ、ゲムシタビン、ゲムツズマブオゾガマイシン、ゴセレリン、ヘキサメチルメラミン、ヒドロキシウレア、イブリツモマブ、イダルビシン、イホスファミド、イマチニブ、インターフェロンアルファ、インターフェロンベータ、イリノテカン、イクサベピロン、ラパチニブ、ロイコボリン、ロイプロリド、レナリドミド、レトロゾール、ロムスチン、メクロレタミン、メゲストロール、メルファラン、メルカプトプリン、メトトレキサート、マイトマイシン、ミトキサントロン、ネララビン、ニロチニブ、ニルタミド、オクトレオチド、オファツムマブ、オプレルベキン、オキサリプラチン、パクリタキセル、パニツムマブ、ペメトレキセド、ペントスタチン、プロカルバジン、ラロキシフェン、レチノイン酸、リツキシマブ、ロミプロスチム、サルグラモスチム、ソラフェニブ、ストレプトゾシン、スニチニブ、タモキシフェン、テムシロリムス、テモゾラミド、テニポシド、サリドマイド、チオグアニン、チオテパ、チオグアニン、トポテカン、トレミフェン、トシツモマブ、トラスツズマブ、トレチノイン、バルルビシン、ＶＥＧＦ阻害剤及びトラップ、ビンブラスチン、ビンクリスチン、ビンデシン、ビノレルビン、ボリノスタット、又はそれらの組合せである、請求項１３に記載の方法。
15. 前記肺がんが非小細胞肺がんである、請求項１〜１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 前記肺がんがステージ１Ａ又はステージ１Ｂである、請求項１５に記載の方法。
17. 前記被験体がヒトである、請求項１〜１６のいずれか一項に記載の方法。
18. 前記肺がんが初期段階である、請求項１〜１７のいずれか一項に記載の方法。
19. ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１及び／又はｍｉＲ−２１の前記レベルの検出が、ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１及び／又はｍｉＲ−２１のＲＮＡレベルを測定することを含む、請求項１〜１８のいずれか一項に記載の方法。
20. ＢＲＣＡ１、ＨＩＦ１Ａ、ＤＬＣ１、ＸＰＯ１及び／又はｍｉＲ−２１の前記レベルが、マイクロアレイ、ＲＴ−ＰＣＲ、ｑＲＴ−ＰＣＲ、ｎａｎｏｓｔｒｉｎｇアッセイ、クロマトグラフィー、質量分析、分光測定、免疫測定法、又はｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより検出される、請求項１〜１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記ｍｉＲ−２１のレベルがマイクロＲＮＡ分析により検出される、請求項２０に記載の方法。

Images