JP6593684B2

JP6593684B2 - ４倍体ポプラの作出方法

Info

Publication number: JP6593684B2
Application number: JP2015125160A
Authority: JP
Inventors: 正明梅田; 秀和岩川
Original assignee: 国立大学法人奈良先端科学技術大学院大学
Priority date: 2015-06-22
Filing date: 2015-06-22
Publication date: 2019-10-23
Anticipated expiration: 2035-06-22
Also published as: JP2017006050A

Description

本発明は、高バイオマス性を有する４倍体ポプラの作出方法に関するものである。

近年、植物バイオマスの資源化が進められている。植物バイオマスの資源化を実現する上で、原料となる植物バイオマスを効率的に生産する技術開発は極めて重要である。植物バイオマスの中でも、食糧資源と拮抗せず、大規模原料供給が可能な木本系バイオマスとしてポプラやユーカリが注目されている。ここで、ポプラ(poplar)とは、ヤナギ科(Salicaceae family)のヤマナラシ属またはポプラ属に属する樹木（広葉樹）の慣用名であり、成長が早く活着が良く、並木や街路樹、防風林として植生されているものである。
そこで、生産するポプラやユーカリの地上部器官を巨大化して生産量を向上させる方法が考えられる。この点、地球上の被子植物の内、約７０％の被子植物はＤＮＡ倍加により細胞を肥大化させ、器官サイズを大きくしている。ところが、バイオマス生産の原料として注目されているポプラやユーカリではＤＮＡ倍加が起こらないと言われている。

一方で、ユーカリ属について、生産性の向上した個体を短期間に作成できるユーカリ属４倍体の作成方法が知られている（特許文献１を参照）。特許文献１のユーカリ属４倍体の作成方法は、２倍体であるユーカリ属の組織切片について染色体の倍加処理を行い、次いでこの組織切片を培養することにより染色体が倍加した組織を発生させ、この組織から個体を再生して、ユーカリ属４倍体を作成するものである。
しかし、バイオマス生産の原料としてはユーカリ属だけではなくポプラ等も有用であるが、特許文献１に開示された方法は、パルプ材として有用なユーカリ属について４倍体を作成するものに過ぎない。
また、特許文献１の明細書段落００１２によると、ＤＮＡ倍加処理方法として、シュートをコルヒチン等の溶液中に浸漬することにより行うことが、最も一般的としており、実施例においても、コルヒチン水溶液に２４時間浸漬することで倍加処理を行っている。ここで、シュートとは、茎とその上にできる多数の葉からなる単位をいう。
しかしながら、染色体の倍加処理を行う際、ユーカリ属のシュート切片をコルヒチン等の溶液に浸漬して倍加処理を行う方法では、培養のための培地以外に、倍加処理を行うための大規模な装置が必要であり、煩雑であった。
さらに、倍加処理後に、植物ホルモンとしてＢＡＰもしくはカイネチン、ショ糖、ゲランガムもしくは寒天を含有する培地或はそれらを改変した培地により組織培養を行わなければならない方法であったため、かかる点においても簡便な方法とはいえなかった。

また、ウリ科植物の分裂組織につきアミプロホスメチルを用いて染色体の倍加処理を行う染色体倍加方法が知られている（特許文献２を参照）。特許文献２のウリ科植物の染色体倍加方法は、コルヒチン等の倍加誘発剤を用いずにアミプロホスメチルを用いて倍加処理を行うものであり、倍加効率が高いとされている。
しかし、アミプロホスメチルは、通常、除草剤として用いられているため、植物体に薬害を発生させる危険性があるという問題があった。
また、特許文献２に開示されたウリ科植物の染色体倍加方法においても、染色体の倍加処理を行う際、ウリ科植物のシュート切片をアミプロホスメチル水溶液に浸漬して倍加処理を行っているが、特許文献１と同様、かかる方法は煩雑であり、簡便な方法とはいえなかった。
さらに、倍加処理後に組織培養を介する方法であるため、かかる点においても簡便な方法とはいえなかった。
なお、特許文献２の明細書段落０００３には、温室で栽培中のメロンの腋芽に脱脂綿を乗せコルヒチンを滴下し処理する方法も試みたが倍加シュートは得られなかったと記載されており、従来は、植物の腋芽にコルヒチンを滴下する程度では倍加シュートは得られないのが常識とされていた。ここで、腋芽とは、葉の付け根から出る芽のことをいう。

特開２００１-３２０９９４号公報特開平６-２３７６５７号公報

上述した特許文献１及び２におけるＤＮＡ倍加方法は、何れもポプラを対象としたものではない。また、特許文献１及び２におけるＤＮＡ倍加方法では、何れも倍加処理方法が煩雑であり、かつ、倍加処理後に組織培養を介する方法であるため、簡便な方法ともいえなかった。
かかる状況に鑑みて、本発明は、簡便な方法によりポプラのＤＮＡ倍加処理を行い、かつ、組織培養を介さずに、２倍体ポプラから４倍体ポプラを安定的に作出する方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決すべく、本発明者は、ＤＮＡ倍加処理方法につき鋭意検討した結果、コルヒチン溶液にシュート切片を浸漬するのではなく、シュートの腋芽（葉の付け根から出る芽のこと、脇芽或は側芽とも呼ばれる。）にコルヒチン溶液の雫を乗せることで、簡易にＤＮＡ倍加処理が行えることを知見した。また、培養方法としては植え継ぎを行うことで簡易に培養が行えることを知見した。

すなわち、本発明の４倍体ポプラの作出方法は、２倍体ポプラのシュートの腋芽に対してコルヒチン溶液を滴下して培養し、出てきた側枝を植え継いで４倍体ポプラを作出することを特徴とする。
コルヒチン処理の対象としては、ポプラを用いる。ここで、コルヒチン処理とは、微小管（紡錘体）の形成を阻害することで、細胞分裂を阻害し、その結果、細胞分裂がなされずに染色体を倍加させるものである。
また、コルヒチン処理の方法としては、２倍体ポプラのシュートの腋芽に対して行うものである。ＤＮＡ倍加処理後は、植え継ぎを行うことで、細胞培養によらずに培養を行うことが可能である。

本発明の４倍体ポプラの作出方法に用いられるコルヒチン溶液の濃度は、０．００２ｗ／ｖ％以上、０．１ｗ／ｖ％未満であることが好ましく、より好ましくは、０．００５ｗ／ｖ％以上、０．０５ｗ／ｖ％未満である。これは、低濃度とすることで、緩やかな倍加を行うためである。
ここで、０．００２％未満であるとＤＮＡ倍加促進効果が弱く、また、０．１ｗ／ｖ％以上であると、微小管形成を高度に阻害することによる二次的影響が現れるので、上記濃度範囲に調製する。

本発明の４倍体ポプラの作出方法に用いられるコルヒチン溶液には、ゲル化剤が添加されたことが好ましい。これは、腋芽にコルヒチン溶液を乗せた場合に腋芽からコルヒチン溶液が流れ落ちることを防ぐため、添加されるものである。ゲル化剤としては、アガーが好適に用いられる。

本発明の４倍体ポプラの作出方法において、コルヒチン溶液の滴下は、植え継いで育成したシュートの下葉を残して主茎を切除したものの葉の根元の腋芽に対して行うことが好ましい。なお、コルヒチン処理は、１箇所だけではなく、各々の葉の腋芽に行う。

本発明の４倍体ポプラの作出方法において、コルヒチン溶液の滴下の頻度は、２回であることが好ましい。また、滴下間隔は１日であることが好ましい。

本発明の４倍体ポプラの作出方法において、腋芽に乗せるコルヒチン溶液量は、腋芽に雫の玉ができる量、かつ、腋芽から流れ落ちない量であることが好ましい。これは、本発明におけるコルヒチン処理は腋芽に乗せるという簡易な方法で行うため、腋芽に乗せるコルヒチン溶液量が多いと腋芽から流れ落ちてしまい、正常なコルヒチン処理がなされないこととなるからである。

本発明の４倍体ポプラの作出方法においては、コルヒチン溶液の滴下後、４倍体ポプラの倍数性が安定するまで、植え継ぎを繰り返すことが好ましい。植え継ぎを繰り返す回数としては、２〜４回が好ましく、より好ましくは３回である。

本発明の４倍体ポプラの作出方法は、コルヒチン溶液を用いた４倍体ポプラの作出方法であって、下記１）〜５）のステップから成る。
１）２倍体ポプラのシュートを培地へ植え継ぎ、植え継ぎから略２８日後にシュートの下の葉を少なくとも１枚残して主茎を切除するコルヒチン処理準備ステップ
２）シュートの腋芽にコルヒチン溶液を乗せ、略２４時間培養を行った後、残った雫を除く第１のコルヒチン処理ステップ
３）第１のコルヒチン処理ステップの後、腋芽に新たにコルヒチン溶液を乗せ、さらに略２４時間培養後、残っている雫を除き、滅菌水を乗せて洗浄する第２のコルヒチン処理ステップ
４）略１ヵ月培養し、出てきた側枝を新しい培地に植え継ぎ、側枝の下葉の倍数性を測定して、４倍体ポプラを作出状況を確認する作出状況確認ステップ
５）４倍体ポプラの倍数性が安定するまで、植え継ぎと倍数性の測定を繰り返す倍数性安定化ステップ

第２のコルヒチン処理ステップは、第１のコルヒチン処理ステップのみでは、紡錘体の形成（細胞分裂）を十分に阻害できないために行うものである。すなわち、コルヒチンは細胞周期の内の紡錘体の形成（細胞分裂）を開始する時期（Ｍ期）を阻害するが、細胞周期が１周するのに約１日かかることから、すべての細胞がＭ期に到達してからコルヒチンの作用を受けるようにするため、このように２４時間後に再び第２のコルヒチン処理を行う。第２のコルヒチン処理ステップにおいて、洗浄作業は、数回繰り返し、５〜１０分間行う。本発明の４倍体ポプラの作出方法を用いた場合でも、すべてのシュートにつき４倍体ポプラを作出することができるわけではなく、その確率は総ライン数に対して５〜７％である。

本発明の４倍体ポプラの作出方法によれば、簡便なＤＮＡ倍加処理により、４倍体のポプラを安定的に作出することができるといった効果がある。

実施例１の４倍体ポプラの作出方法のフロー図実施例１の４倍体ポプラの作出手順の説明図実施例１の４倍体ポプラの作出方法のＤＮＡ倍数性解析結果の比較グラフ、（１）コルヒチン処理を行っていない２倍体ポプラ、（２）コルヒチン処理を行った２倍体と４倍体のキメラのポプラ、（３）コルヒチン処理を行った４倍体ポプラ、（４）コルヒチン処理を行った４倍体と８倍体のキメラのポプラ。実施例１の４倍体ポプラの作出方法におけるシュートの倍加状況、（１）初代が４倍体のポプラの継代による倍数性の変化、（２）初代が４倍体と８倍体のキメラのポプラの継代による倍数性の変化、（３）初代が４倍体，８倍体及び１６倍体のキメラのポプラの継代による倍数性の変化、（４）初代が８倍体のポプラの継代による倍数性の変化、（５）初代が８倍体と１６倍体のキメラのポプラの継代による倍数性の変化。実施例１の２倍体と４倍体ポプラの木部細胞面積及び木部細胞数の比較グラフＣＯ_２固定化に関する２倍体と４倍体ポプラの比較データ、（１）光合成有効放射量による比較、（２）葉内ＣＯ_２濃度による比較。実施例１の２倍体と４倍体ポプラの下からの葉の枚数と葉面積の相関図、（１）２倍体ポプラ、（２）４倍体ポプラ。実施例１の２倍体と４倍体ポプラのＣＯ_２固定速度に関する比較グラフ、（１）総葉面積、（２）個体あたりのＣＯ_２固定速度。実施例１の２倍体と４倍体ポプラの茎についての比較グラフ、（１）茎の高さ、（２）茎の太さ、（３）茎の体積。実施例１の２倍体と４倍体ポプラの重量についての比較グラフ、（１）生重量、（２）乾重量。実施例２の４倍体ユーカリの作出方法のＤＮＡ倍数性解析結果の比較グラフ、（１）コルヒチン処理を行っていない２倍体ユーカリ、（２）コルヒチン処理を行った２倍体と４倍体のキメラのユーカリ、（３）コルヒチン処理を行った４倍体ユーカリ。

以下、本発明の実施形態の一例を、図面を参照しながら詳細に説明していく。なお、本発明の範囲は、以下の実施例や図示例に限定されるものではなく、幾多の変更及び変形が可能である。

図１は、実施例１の４倍体ポプラの作出方法のフロー図を示している。
図１に示されるように、まず、２倍体ポプラのシュートの植え継ぎを行う（Ｓ０１）。そして、２８日経過後、下の葉を２〜４枚残し、主茎を切除する（Ｓ０２）。次に、シュートの腋芽にコルヒチン溶液を乗せる（Ｓ０３）。かかる状態で２４時間培養を行い、培養後、残った雫を除く（Ｓ０４）。さらに、シュートの腋芽にコルヒチン溶液を乗せる（Ｓ０５）。かかる状態で２４時間培養を行い、培養後、残った雫を除く（Ｓ０６）。そして、滅菌水で腋芽を洗浄する（Ｓ０７）。その後、４週間培養し（Ｓ０８）、出てきた側枝を新しい培地に植え継ぎ、側枝の下葉の倍数性を測定する（Ｓ０９）。このとき、ＤＮＡ倍加が確認できた個体の主茎を、葉を４枚程度残すように切除し、新しい培地に植え継ぎ、２８日間培養する（Ｓ１０）。この植え継ぎを４倍体ポプラの倍数性パターン（Ploidy pattern）が安定するまで繰り返す（Ｓ１１）。すなわち、植え継ぎに側枝を用いるのは、コルヒチン処理後だけであり、その後は、主茎の先端側を切除して植え継ぎに用いる。そして、その倍数性パターンが４倍体（４ｎ）に収束する個体を選抜していく。
なお、１回の植え継ぎだけでは、倍数性パターンの安定化を確認できないので、少なくとも２回の植え継ぎが必要である。安定化のためには３回植え継ぎを行っても構わない。

実施例１の４倍体ポプラの作出手順について、図２を参照して説明する。
まず、コルヒチン処理準備ステップについて説明する。最初に、コルヒチン処理の対象となる２倍体ポプラのシュート１ａをポット６の中に設けられた培地７に植え継ぐ。植え継ぎを行ってから２８日後にシュート１ａ下の葉を３枚程度残して主茎を切除する。
図２（１）は、コルヒチン処理準備ステップが完了し、これから第１のコルヒチン処理ステップに移行する状態を示している。図２（１）に示されるように、２倍体ポプラのシュート１ａは、ポット６の中に設けられた培地７に植え継がれている。シュート１ａは、茎３と葉（４ａ，４ｂ，４ｃ）から成り、根５はシュート１ａから伸びたものである。シュート１ａは、下の葉を３枚程度残して主茎が切除されている。

次に、第１のコルヒチン処理ステップについて説明する。
コルヒチン処理は、葉４ａの根元の腋芽８にピペット１０を用いてコルヒチン溶液２を乗せることで行う。ここで用いたコルヒチン溶液は、コルヒチン濃度が０．０１ｗ／ｖ％であり、これにゲル化剤としてアガーを添加している。アガーの濃度は０．２ｗ／ｖ％である。アガーは、腋芽８の上に乗せたコルヒチン溶液２が腋芽８から流れ落ちないように、安定的に留めるための粘性のゲル化剤として用いている。
図２（２）はコルヒチン溶液２が腋芽８の上に乗せられた状態を示している。図２（２）に示されるように、腋芽８に乗せるコルヒチン溶液２の量は、雫の球ができ、かつ、雫が流れ落ちないくらいの量にする。雫が流れ落ちないようにし、かかる状態で２４時間培養を行う。２４時間培養後、残ったコルヒチン溶液２の雫を除く。

次に、第２のコルヒチン処理ステップについて説明する。
第１のコルヒチン処理ステップにおいて、残ったコルヒチン溶液２の雫を除いた後、腋芽８に新たにコルヒチン溶液２を乗せる。さらに２４時間培養後、残っている雫を除き、滅菌水（図示せず）を乗せて洗浄する作業を２回、繰り返し行う。

次に、作出状況確認ステップについて説明する。
図２（３）は、第２のコルヒチン処理ステップが完了後、４週間培養を行った状態を示している。図２（３）に示されるように、４週間シュート１ａを培養したことにより側枝が伸びた状態となっている。出てきた側枝については切除し、シュート１ｂとして新しい培地に植え継ぎを行う。図２（４）は、切除した側枝を植え継ぎ培養を行った状態を示している。図２（４）に示されるように、切除した側枝はシュート１ｂとして新しい培地に植え継がれている。その際に、シュート１ｂの下葉の倍数性を測定し、作出状況を確認する。

次に、倍数性安定化ステップについて説明する。
作出状況確認後、４倍体ポプラの倍数性パターンが安定するまで、２８日毎に主茎を植え継いで、倍数性を測定する。ここで、シュート１ａから植え継がれたシュート１ｂだけではなく、コルヒチン処理した他の腋芽由来のシュートも含め、異なる腋芽から発生した個体の単位をラインと呼ぶ。１つのラインにつき複数回の植え継ぎを行い、その度に繰り返しシュートが得られることになる。

倍数性安定化ステップにおいて、個々のラインにおけるシュートの倍数性が安定しているかを判定するためには、各シュートの倍数性を測定する必要があるが、倍数性の測定は、フローサイトメトリーと呼ばれる分析方法により行う。フローサイトメトリーとは、試料の細胞や核などを蛍光性の色素で染色し、その蛍光強度をフローサイトメーターという分析装置で読み取り、相対的なＤＮＡ量を測定する分析方法である。すなわち、通常の２倍体の蛍光強度のピーク値を２Ｃとすると、蛍光強度のピーク値は、４倍体では２倍体のおよそ２倍（４Ｃ）、８倍体では２倍体のおよそ４倍（８Ｃ）と、倍数性に比例して大きくなることになる。

図３は、実施例１の４倍体ポプラの作出方法のＤＮＡ倍数性解析結果の比較グラフを示し、（１）はコルヒチン処理を行っていない２倍体ポプラ、（２）はコルヒチン処理を行った２倍体と４倍体のキメラのポプラ、（３）はコルヒチン処理を行った４倍体ポプラ、（４）はコルヒチン処理を行った４倍体と８倍体のキメラのポプラを示している。蛍光強度を示す横軸上に表示された点線は、蛍光強度のピーク値が現れている場合に倍数性が認められる基準となる蛍光強度（２Ｃ，４Ｃ，８Ｃ）を示し、蛍光強度（２Ｃ）は２倍体、蛍光強度（４Ｃ）は４倍体、蛍光強度（８Ｃ）は８倍体を示す基準となる。また、２ｎとは２倍体を示し、４ｎは４倍体、８ｎは８倍体、１６ｎは１６倍体をそれぞれ示す。なお、「２ｎ，４ｎ」とは２倍体と４倍体のキメラのポプラを示す。ここで、キメラとは、同一個体内に異なったＤＮＡ倍数性を持つ細胞が混じっていることをいう。

（１）のグラフでは、コルヒチン処理を行っていない２倍体ポプラを用い、ピーク値が現れている蛍光強度を、２倍体ポプラを示す基準となる蛍光強度（２Ｃ）として設定している。かかる基準を元に、４倍体ポプラを示す基準となる蛍光強度（４Ｃ）及び８倍体ポプラを示す基準となる蛍光強度（８Ｃ）を設定して測定を行う。
（２）のグラフでは、蛍光強度（２Ｃ，４Ｃ）付近に蛍光強度のピーク値が現れているため、２倍体と４倍体のキメラのポプラであることが測定できる。
（３）のグラフでは、蛍光強度（４Ｃ）付近に蛍光強度のピーク値が現れているため、４倍体ポプラであることが測定できる。
（４）のグラフでは、蛍光強度（４Ｃ，８Ｃ）付近に蛍光強度のピーク値が現れているため、４倍体と８倍体のキメラのポプラであることが測定できる。

下記表１は、コルヒチン処理後のシュートの倍加状況を上記方法により解析した一覧を示している。コルヒチン処理後に発生した側枝を１回植え継いで測定したものであり、倍数性パターンは未だ安定していない段階である。

上記表１に示されるように、コルヒチン処理後、１回植え継ぎを行った結果、総ライン数３６１の内、４倍体ポプラが２６作出されていることが確認できている。安定化前とはいえ、そもそもＤＮＡ倍加が起こり難いポプラにおいては、約７．２０％（２６／３６１）という数値は、非常に高い数値であるといえる。

図４は、実施例１の４倍体ポプラの作出方法におけるシュートの倍加状況を示し、（１）は初代が４倍体のポプラの継代による倍数性の変化、（２）は初代が４倍体と８倍体のキメラのポプラの継代による倍数性の変化、（３）は初代が４倍体，８倍体及び１６倍体のキメラのポプラの継代による倍数性の変化、（４）は初代が８倍体のポプラの継代による倍数性の変化、（５）は初代が８倍体と１６倍体のキメラのポプラの継代による倍数性の変化を示している。
ここでは、１回植え継ぎを行ったラインにおけるシュートを初代のシュートと呼んでいる。

図４（１）に示されるように、初代のシュートが４倍体のポプラとなっているライン数は２６であるが、もう一度植え継ぎを行った２代目のシュートでは、２倍体ポプラが４、２倍体と４倍体のキメラのポプラが９に、４倍体ポプラが１３になっている。２代目に４倍体ポプラとなったシュートをさらに植え継いだ３代目のシュートでは、２倍体と４倍体のキメラのポプラが１に、４倍体ポプラが１０になっている。

図４（２）に示されるように、初代のシュートが４倍体と８倍体のキメラのポプラとなっているライン数は２８であるが、もう一度植え継ぎを行った２代目のシュートでは、２倍体ポプラが７に、２倍体と４倍体のキメラのポプラが９に、４倍体ポプラが８に、４倍体と８倍体のキメラのポプラが３になっている。
また、２代目に４倍体ポプラとなったシュートをさらに植え継いだ３代目のシュートでは、４倍体ポプラが８になっている。２代目に４倍体と８倍体のキメラのポプラとなったシュートをさらに植え継いだ３代目のシュートでは、４倍体と８倍体のキメラのポプラが１になっている。

図４（３）に示されるように、初代のシュートが４倍体，８倍体及び１６倍体のキメラのポプラとなっているライン数は７であるが、もう一度植え継ぎを行った２代目のシュートでは、２倍体ポプラが１に、２倍体と４倍体のキメラのポプラが５に、４倍体ポプラが１に、４倍体，８倍体及び１６倍体のキメラのポプラが０になっている。２代目に４倍体ポプラとなったシュートをさらに植え継いだ３代目のシュートでは、２倍体と４倍体のキメラのポプラが１になっている。

図４（４）に示されるように、初代のシュートが８倍体のポプラとなっているライン数は４であるが、もう一度植え継ぎを行った２代目のシュートでは、２倍体ポプラが１に、８倍体ポプラが２になっている。２代目に８倍体ポプラとなったシュートをさらに植え継いだ３代目のシュートでは、８倍体ポプラが２になっている。

図４（５）に示されるように、初代のシュートが８倍体と１６倍体のキメラのポプラとなっているライン数は２であるが、もう一度植え継ぎを行った２代目のシュートでは、４倍体ポプラが１になっている。

図５は、実施例１の２倍体と４倍体ポプラの木部細胞面積及び木部細胞数の比較グラフを示している。なお、２倍体を示す２ｎの後の＃は各々の個体をナンバリングしたものである。
図５に示されるように、２倍体ポプラと４倍体ポプラでは、木部細胞面積については、２倍体ポプラが７０〜８５ｍｍ^２であるのに対し、４倍体ポプラは１１０〜１４５ｍｍ^２である。
また、木部細胞数については、２倍体ポプラと４倍体ポプラの何れについても５〜７個となっており、殆ど違いは無いことが分かる。
木部細胞数については殆ど違いが無いにもかかわらず、木部細胞面積については４倍体ポプラは２倍体ポプラより１．５倍以上広い面積を有しているので、４倍体ポプラの木部細胞は、２倍体ポプラより１．５倍以上大きいことが確認できた。

図６は、ＣＯ_２固定化に関する２倍体と４倍体ポプラの比較データを示し、（１）は光合成有効放射量による比較、（２）は葉内ＣＯ_２濃度による比較を示している。なお、グラフ縦軸を示すＣＯ_２固定速度とは、単位時間・単位葉面積あたりのＣＯ_２固定量のことである。
図６（１）に示されるように、丸印で示される２倍体ポプラ（２ｎ），三角印で示される４倍体ポプラ（４ｎ＃１３）及び四角印で示される４倍体ポプラ（４ｎ＃１６）の葉につき、照射する光量を変化させた場合のＣＯ_２固定速度については、２倍体ポプラ（２ｎ）と４倍体ポプラ（４ｎ＃１３，４ｎ＃１６）のＣＯ_２固定速度に有意差は認められなかった。
図６（２）に示されるように、丸印で示される２倍体ポプラ（２ｎ），三角印で示される４倍体ポプラ（４ｎ＃１３）及び四角印で示される４倍体ポプラ（４ｎ＃１６）の葉につき、葉内のＣＯ_２濃度を変化させた場合のＣＯ_２固定速度については、大気中のＣＯ_２濃度に近い４００ｐｐｍ以下では、２倍体ポプラ（２ｎ）と４倍体ポプラ（４ｎ＃１３，４ｎ＃１６）のＣＯ_２固定速度に有意差は認められなかった。

図７は、実施例１の２倍体と４倍体ポプラの下からの葉の枚数と葉面積の相関図を示し、（１）は２倍体ポプラ、（２）は４倍体ポプラを示している。
図７に示されるように、（１）の２倍体ポプラにおいては、葉面積は最大のものでも約３０ｃｍ^２であるが、（２）の４倍体ポプラにおいては、葉面積は最大のものになると６０ｃｍ^２以上であることが分かる。また、それ以外についても２倍体ポプラよりも４倍体ポプラの方が、葉面積が広い傾向にあることがわかる。

図８は、実施例１の２倍体と４倍体ポプラのＣＯ_２固定速度に関する比較グラフを示し、（１）は総葉面積、（２）は個体あたりのＣＯ_２固定速度を示している。
図８（１）に示されるように、２倍体ポプラの総葉面積は４３４ｃｍ^２であるのに対し、４倍体ポプラの総葉面積は６８３ｃｍ^２である。したがって、４倍体ポプラの総葉面積は２倍体ポプラの総葉面積の約１．６倍となっており、葉についても巨大化されていることが分かる。
また、図８（２）に示されるように、個体あたりのＣＯ_２固定速度についても、２倍体ポプラの個体あたりのＣＯ_２固定速度は１６．９μｍｏｌＣＯ_２／ｍｉｎであるのに対し、４倍体ポプラの個体あたりのＣＯ_２固定速度は２３．９μｍｏｌＣＯ_２／ｍｉｎである。したがって、４倍体ポプラの個体あたりのＣＯ_２固定速度は２倍体ポプラの個体あたりのＣＯ_２固定速度の約１．４倍となっており、ＣＯ_２固定速度についても上昇していることが分かる。

図９は、実施例１の２倍体と４倍体ポプラの茎についての比較グラフを示し、（１）は茎の高さ、（２）は茎の太さ、（３）は茎の体積を示している。
図９に示されるように、２倍体ポプラ（２ｎ）と４倍体ポプラ（４ｎ＃１３，４ｎ＃１６）では、（１）茎の高さ、（２）茎の太さ、（３）茎の体積の何れについても２倍体ポプラ（２ｎ）よりも４倍体ポプラ（４ｎ＃１３，４ｎ＃１６）の方が高い数値を示している。特に（３）茎の体積については、２倍体ポプラ（２ｎ）と４倍体ポプラ（４ｎ＃１６）では２倍以上の差となっており、木部の巨大化に成功していることが分かる。

図１０は、実施例１の２倍体と４倍体ポプラの重量についての比較グラフを示し、（１）は生重量、（２）は乾重量を示している。ここで、生重量は水分を含んだ状態であり、乾重量は水分を含まない状態である。
図１０（１）及び（２）に示されるように、２倍体ポプラ（２ｎ）と４倍体ポプラ（４ｎ＃１３，４ｎ＃１６）では、葉及び茎の総重量について、生重量と乾重量の何れにおいても４倍体ポプラ（４ｎ＃１３，４ｎ＃１６）の方が高い数値を示している。２倍体ポプラ（２ｎ）と４倍体ポプラ（４ｎ＃１３）では、特に、その差は顕著であり、約１．５倍以上の差となっている。このように重量の点からも、４倍体ポプラの作出方法では、木部の巨大化に成功していることがわかる。

ここで、２倍体ポプラではなく２倍体ユーカリを用いて、本発明のＤＮＡ倍加処理を行った結果を説明する。２倍体ユーカリを用いるという点以外は、上記の処理と同じ条件、やり方を行っている。
図１１は、４倍体ユーカリの作出方法のＤＮＡ倍数性解析結果の比較グラフを示し、（１）はコルヒチン処理を行っていない２倍体ユーカリ、（２）はコルヒチン処理を行った２倍体と４倍体のキメラのユーカリ、（３）はコルヒチン処理を行った４倍体ユーカリを示している。倍数性の測定についても、同様に、フローサイトメトリーと呼ばれる分析方法により行う。

（１）のグラフでは、コルヒチン処理を行っていない２倍体ユーカリを用い、ピーク値が現れている蛍光強度を、２倍体ユーカリを示す基準となる蛍光強度（２Ｃ）として設定している。かかる基準を元に、４倍体ユーカリを示す基準となる蛍光強度（４Ｃ）を設定して測定を行う。
（２）のグラフでは、蛍光強度（２Ｃ，４Ｃ）付近に蛍光強度のピーク値が現れているため、２倍体と４倍体のキメラのユーカリであることが測定できる。
（３）のグラフでは、蛍光強度（４Ｃ）付近に蛍光強度のピーク値が現れているため、４倍体ユーカリであることが測定できる。
下記表２は実施例２の４倍体ユーカリの作出結果を示した表である。

上記表２に示されるように、コルヒチン処理後、１回植え継ぎを行った結果、総ライン数８１の内、４倍体ユーカリが３個体、作出されていることがわかる。約３．７０％（３／８１）という割合は、４倍体ポプラの作出割合よりも低い値である。

本発明は、植物バイオマスの資源化に有用である。

１シュート
２コルヒチン溶液
３茎
４葉
５根
６ポット
７培地
８腋芽
１０ピペット

Claims

２倍体ポプラのシュートの腋芽に対してコルヒチン溶液を滴下して培養し、出てきた側枝を切除し植え継いで、倍数性パターンが４倍体以上の個体を選抜して主茎を植え継ぎ、倍数性パターンが４倍体に収束するまで植え継ぎを繰り返し、４倍体ポプラを作出することを特徴とする４倍体ポプラの作出方法。
前記コルヒチン溶液の濃度は、０．００２ｗ／ｖ％以上、０．１ｗ／ｖ％未満であることを特徴とする請求項１に記載の４倍体ポプラの作出方法。
前記コルヒチン溶液の濃度は、０．００５ｗ／ｖ％以上、０．０５ｗ／ｖ％未満であることを特徴とする請求項１に記載の４倍体ポプラの作出方法。
コルヒチン溶液には、ゲル化剤が添加されたことを特徴とする請求項１〜３の何れかに記載の４倍体ポプラの作出方法。
コルヒチン溶液の滴下は、植え継いで育成したシュートの下葉を残して主茎を切除したものの葉の根元の腋芽に対して行うことを特徴とする請求項１〜４の何れかに記載の４倍体ポプラの作出方法。
コルヒチン溶液の滴下の頻度は、２回、滴下間隔は１日であることを特徴とする請求項１〜５の何れかに記載の４倍体ポプラの作出方法。
コルヒチン溶液量は、腋芽に雫の玉ができる量、かつ、腋芽から流れ落ちない量であることを特徴とする請求項６に記載の４倍体ポプラの作出方法。
１）２倍体ポプラのシュートを培地へ植え継ぎ、植え継ぎから略２８日後にシュートの下の葉を少なくとも１枚残して主茎を切除するコルヒチン処理準備ステップと、
２）シュートの腋芽にコルヒチン溶液を乗せ、略２４時間培養を行った後、残った雫を除く第１のコルヒチン処理ステップと、
３）第１のコルヒチン処理ステップの後、腋芽に新たにコルヒチン溶液を乗せ、さらに略２４時間培養後、残っている雫を除き、滅菌水を乗せて洗浄する第２のコルヒチン処理ステップと、
４）略１ヵ月培養し、出てきた側枝を切除し、新しい培地に植え継ぎ、側枝の下葉の倍数性を測定して、倍数性パターンが４倍体以上の個体を選抜して主茎を植え継ぎ、４倍体ポプラの作出状況を確認する作出状況確認ステップと、
５）倍数性パターンが４倍体に収束するまで、植え継ぎと倍数性パターンの測定を繰り返す倍数性安定化ステップ、
から成ることを特徴とする４倍体ポプラの作出方法。