JP6606085B2 - 増加されたコロニー生成力及び増殖力を有するヒト細胞の製造方法 - Google Patents

Description

本明細書は、成体の分化した細胞を、再プログラム化および／または逆分化を引き起こすことにより多能性幹細胞へと誘導する方法、当該方法によって製造された多能性幹細胞および当該多能性幹細胞を含む組成物に関する。

また、本明細書は、多能性幹細胞を含む薬学組成物または化粧品組成物に関する。

また、本明細書は、幹細胞活性化用、皮膚細胞増殖用、皮膚再生用または抗老化用組成物に関する。

幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は、生体組織を構成する多様な細胞に分化することのできる細胞であって、胚、胎児および成体の各組織において得ることのできる分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）される前の段階の未分化細胞を総称する。様々な幹細胞の分類のうち、多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とは、生体を構成する内胚葉、中胚葉、外胚葉の３つの胚葉（ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）のいずれにも分化することのできる多機能性を持った幹細胞を指す。

幹細胞を分類するにあたっては、解剖学的な存在部位に基づいて、細胞の機能に基づいて、細胞表面に発現された抗原の種類に基づいて、転写因子に基づいて、細胞が生成するタンパク質に基づいて、そして、当該幹細胞が作られ得る特定の細胞の種類に基づいて、分類することができる。

このような様々な分類の中でもっともよく利用される、比較的明確な分類は、幹細胞が分離された個体に基づくものである。胚（ｅｍｂｒｙｏ）から分離された場合の胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＥＳ ｃｅｌｌ）と、成体から分離された場合の成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）とに分けることができる。

他のよく利用される分類は、一つの幹細胞から何種類の分化した細胞を作り出すことができるかに基づいて、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）、複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）、および単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞に分けることができ、一般的に胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ、ＥＳ ｃｅｌｌ）は多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）幹細胞に、成体幹細胞（ａｄｕｌｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）は複能性（ｍｕｌｔｉｐｏｔｅｎｃｙ）および単能性（ｕｎｉｐｏｔｅｎｔ）幹細胞に区別することができる。

受精後、発生初期である胚盤胞期（ｂｌａｓｔｏｃｙｔ）の内部細胞塊（細胞内塊、ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）は、将来胎児を形成する部分であって、この内部細胞塊から形成された胚性幹細胞（ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ， ＥＳ ｃｅｌｌ）は、一つの個体を構成するすべての組織の細胞に分化され得る潜在力を持った多能性幹細胞（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ）ということができる。すなわち、胚性幹細胞は、無制限的に増殖が可能な未分化細胞であり、すべての細胞に分化することができ、また、成体幹細胞とは異なり、胚（ｇｅｒｍ）細胞も作ることができるため、次の世代への遺伝が可能である。

このような多能性幹細胞である胚性幹細胞は、細胞の製造過程において胚の破壊という深刻な宗教的かつ倫理的な問題点が存在し、制限された胚から由来するため、各個体間の免疫適合性部材によって、細胞治療剤として開発の際、移植拒絶反応を避けることができない。このような問題点を克服するための代替手段として、成体から由来する細胞を利用して、カスタム型胚性幹細胞または胚性幹細胞のような万能性を持った細胞を人為的に製造するためのいくつかの方法が試みられてきた。

代表的な方法として、体細胞核置換法（ｓｏｍａｔｉｃ ｃｅｌｌ ｎｕｃｌｅａｒ ｔｒａｎｓｆｅｒ、ＳＣＮＴ）、細胞融合法（ｆｕｓｉｏｎ ｗｉｔｈ ＥＳ ｃｅｌｌ）、特定因子注入法（ｒｅｐｒｏｇｒａｍｍｉｎｇ ｂｙ ｄｅｆｉｎｅｄ ｆａｃｔｏｒ）がある。体細胞核置換法は、その効率が非常に低く、倫理的な問題を内包し得る卵子が大量に必要であるという点で、大きな制限点がある。細胞融合法は、誘導された細胞は、２対の遺伝子をさらに持っているため、細胞の安定性の側面において大きな問題点がある。もっとも最近発表された技術である特定因子注入法は、発癌遺伝子を含むウイルスを利用した方法で、癌細胞の形成という深刻な問題点がある。

細胞治療剤の開発のためのカスタム型多能性幹細胞を確保するために、倫理的な問題がなく、かつ安定性、安全性が確保された製造方法の開発が要求されている。

このような要求に伴い、体細胞に４種類の遺伝子を導入することにより、逆分化を通じて幹細胞であるカスタム多能性幹細胞を誘導する方法が研究された（非特許文献１）。これは、成体細胞を利用するため倫理的に問題とならず、自家細胞を使用するため免疫拒否反応がなく、従来の問題点を解決するための足場を設けた。

本発明者らは、動物由来の誘導多能性幹細胞（ｉＰＳ， ｉｎｄｕｃｅｄ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）の抽出物により逆分化幹細胞を獲得したことがあるが、これにはいくつかの制約がある。

第一に、この方法を遂行するためには、多量（２０ｍｇ以上）のｉＰＳＣ抽出が必要である。したがって、費用および労働力が多く要求されるヒト由来の逆分化幹細胞から抽出物を分離して、これを利用した逆分化誘導は、まだ成功できていない状態である。たとえば、２０ｍｇの抽出物を得るために、ヒト由来の逆分化幹細胞を準備しようとするならば、熟練した技術者が３カ月以上この作業に邁進する必要があり、その費用は相当なものである。

第二に、動物幹細胞またはそれに相応する逆分化幹細胞の場合、抽出物を分離する過程において完全に破砕されずに生き残るため、逆分化を誘導する体細胞に処理したとき、逆分化が誘導された細胞と抽出物に残っている逆分化幹細胞との区別が容易でなく、実験の成功を直ちに知ることができず、これらの誘電体（ｇｅｎｏｍｉｃ）ＤＮＡを分析して初めて知ることができる。結局のところ、時間と費用が多く浪費される素地がある。

第三に、未だタンパク質でヒト由来の逆分化幹細胞が作られた事例が極めて稀であるため、ウイルスで作られたヒト由来の逆分化幹細胞の抽出物を利用しなければならない。このとき、ウイルスによって誘発された癌誘発物質などが混ざっていることがあるので、その後の臨床適用に障害となり得る。

米国特許出願公開第２００８／００９５８６６号明細書 韓国特許公開第１０−２０１１−００３２９８９号公報 韓国特許公開第１０−１９９８−００３４２９３号公報 韓国特許第１０−１１２１８８３号公報

Takahashi K, Yamanaka S(2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126:663-676 XU, Y.N. et al., "ES cell extract-induced expression of pluripotent factors in somatic cells", The Anatomical Record, 2009.08., Vol.292, pp1229-1234 Denis V. Bochkov et.al., Shikimic acid: review of its analytical, isolation, and purification techniques from plant and microbial sources, J chem. Biol. (2012)5; 5~17

本発明の一側面は、上述したような従来技術の問題点を解決するために案出されたものであって、倫理的問題がなく、かつ安定性、安全性が確保された多能性幹細胞の製造方法を提示する。また、従来技術では、実現することが困難であったヒト由来の逆分化幹細胞を誘導する方法を提示する。

本発明者らは、成体から由来する細胞を利用して、細胞を分離した成体と同一の遺伝的背景を持つ多能性幹細胞を誘導することのできる方法を開発するに至った。したがって、多様な遺伝的背景を持つ成体由来細胞から同一の結果を導出することにより、本発明の方法が多能性幹細胞を作り出すことのできる適切な発明であることを提示する。

上述したような課題を解決するために、本発明の一側面は、シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、植物幹細胞抽出物、またはこれらを含む組成物を、成体由来細胞に処理して幹細胞を誘導する方法を提供する。

具体的に、本発明の一側面は、植物幹細胞または多様な方法で誘導されたあらゆる種類の誘導多能性植物幹細胞から、その有効成分を含む抽出物を抽出するステップ；前記抽出物を成体由来細胞に注入するステップ；および、前記抽出物が注入された細胞を、培養過程を経て胚性幹細胞といった万能性を持った細胞を作製するステップを含む、カスタム型多能性幹細胞を製造する方法を提供する。

また、本発明の一側面は、シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、植物幹細胞抽出物またはこれらを含む組成物を成体由来細胞に注入するステップ；および、シキミ酸、抽出物または組成物が注入された細胞を培養するステップをさらに含んで、幹細胞を製造する方法を提供する。

前記抽出物は、カルス抽出物であってよい。

本発明の一具現例において、前記方法は、抽出物の注入前に、前記成体細胞に対して細胞膜透過促進化合物を処理するステップをさらに含んでよい。前記細胞膜透過促進化合物は、ストレプトリジンＯ（ｓｔｒｅｐｔｏｌｙｓｉｎ Ｏ）とジギトニン（ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）を含んでよいが、本発明に係るシキミ酸または抽出物が細胞膜内に注入されることを容易にするものであれば、これらに制限されるものではない。

本発明の他の具現例において、前記方法は、前記抽出物が注入された成体由来細胞を支持細胞層に移し、さらに培養するステップをさらに含んでよい。前記支持細胞は、ＳＴＯ細胞を含んでよいが、これに限定されるものではない。

また、本発明の一側面は、植物幹細胞、カルスまたは多様な方法で誘導されたあらゆる種類の誘導多能性植物幹細胞において、その有効成分を含む抽出物を抽出するステップ；前記抽出物を成体由来細胞に注入するステップ；および、前記抽出物が注入された細胞を一般細胞培養液で培養し、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）層のある培養条件に移してさらに胚性幹細胞培養液で培養するステップを含む、カスタム型多能性幹細胞の製造方法を提供する。

また、本発明の一側面は、前記方法によって製造された幹細胞を提供する。

また、本発明の一側面は、幹細胞を含む組成物を提供する。また、本発明は、シキミ酸（Ｓｈｉｋｉｍｉｃ ａｃｉｄ）、これを含有する植物抽出物または植物幹細胞抽出物を使用して、成体の分化した細胞を再プログラム化および／または逆分化を引き起こすことによりカスタム型多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ： ｉＰＳＣ）を誘導する方法、前記方法によって製造された多能性幹細胞および前記多能性幹細胞を含む細胞治療剤に関する。

また、本発明に使用されるシキミ酸を含有する植物抽出物または植物幹細胞抽出物は、セコイアデンドロン（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、キショウブ（Ｉｒｉｓ ｐｓｅｕｄｏａｃｏｒｕｓ）、キクイモ（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ｔｕｂｅｒｏｓｕｓ）、アオトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｐｕｎｇｅｎｓ）、シロトウヒ（Ｐｉｃｅａ ｇｌａｕｃａ）、シルバートップアッシュ（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｓｉｅｂｅｒｉａｎａ）、ユーカリプタス・レグナンス（Ｅｕｃａｌｙｐｔｕｓ ｒｅｇｎａｎｓ）、ベイスギ（Ｔｈｕｊａ ｐｌｉｃａｔａ）、ナツメヤシ（Ｒｅｄ Ｃｅｄａ， Ｐｈｏｅｎｉｘ ｄａｃｔｙｌｉｆｅｒａ）、ダリア（Ｄａｈｌｉａ ｖａｒｉａｂｉｌｉｓ）、エゾノコリンゴ（Ｍａｌｕｓ ｂａｃｃａｔａ）、セイヨウナシ（Ｐｙｒｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓ）、コムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ）、アカマツ（Ｐｉｎｕｓ ｄｅｎｓｉｆｌｏｒａａ）、クロマツ（Ｐｉｎｕｓ ｔｈｕｎｂｅｒｇｉｉ）、シキミ（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ ａｎｉｓａｔｕｍ）、タイサンボク（Ｍａｇｎｏｌｉａ ｇｒａｎｄｉｆｌｏｒａ）、ドクダミ（Ｈｏｕｔｔｕｙｎｉａ ｃｏｒｄａｔａ）、ユキノシタ（Ｓａｘｉｆｒａｇａ ｓｔｏｌｏｎｉｆｅｒａ）、テルミナリア・アルジュナ（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ａｒｊｕｎａ）、マスチックノキ（Ｐｉｓｔａｃｉａ ｌｅｎｔｉｓｃｕｓ）、ゴールデンカラント（Ｒｉｂｅｓ ａｕｒｅｕｍ）、コンフリー（Ｓｙｍｐｈｙｔｕｍ ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ）、ホワイトコホシュ（Ａｃｔａｅａ ｐａｃｈｙｐｏｄａ）、シログキウリノキ（Ａｌａｎｇｉｕｍ ｓａｌｖｉｆｏｌｌｉｕｍ）、イチョウ（Ｇｉｎｇｋｏ ｂｉｌｏｂａ）、ベラトラム・バリッド（Ｖｅｒａｔｒｕｍ ｖｉｒｉｄｅ）、オニナベナ（Ｄｉｐｓａｃｕｓ ｌａｃｉｎｉａｔｕｓ）、アガスタキ（Ａｇａｓｔａｃｈｅ ｕｒｔｉｃｉｆｏｌｉａ）、オオグルマ（Ｉｎｕｌａ ｈｅｌｅｎｉｕｍ）、セイヨウオトギリソウ（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｓｐｐ）、マルバツユクサ（Ｃｏｍｍｅｌｉｎａ ｂｅｎｇａｌｅｎｓｉｓ）、ギムネマ（糖殺草）（Ｇｙｍｎｅｍａ ｓｙｌｖｅｓｔｒｉｓ）、訶子（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｃｈｅｂｕｌａ）、アメリカシキミ（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ ｆｌｏｒｉｄａｎｕｍ）、シキミ科（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ ｄｉｆｆｅｎｇｒｉ）、紅茴香（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ ｈｅｎｒｙｉ）、八角茴香（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ ｖｅｒｕｍ）、窄叶紅茴香（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ ｌａｎｃｅｏｌａｔｕｍ）、シキミ科（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ ｐａｃｈｙｐｈｙｌｌｕｍ）、シキミ（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ ａｎｉｓａｔｕｍ）、シキミ（Ｉｌｌｉｃｉｕｍ ｒｅｌｉｇｉｏｓｕｍ）、ヘミデスムス・インディカス（Ｈｅｍｉｄｅｓｍｕｓ ｉｎｄｉｃｕｓ， Ｓａｒｖｉａ）、シスタス・インカヌス（Ｃｉｓｔｕｓ ｉｎｃａｎｕｓ）、ホソバキンゴジカ（Ｓｉｄａ ａｃｕｔａ）、インテレクトツリー（Ｃｅｌａｓｔｒｕｓ ｐａｎｉｃｕｌａｔａ）、トゲバンレイシ（Ｇｌｙｃｏｓｍｉｓ ｍｕｒｉｃａｔａ）、ナツシロギク（Ｔａｎａｃｅｔｕｍ ｐａｒｔｈｅｎｉｕｍ， Ｐｙｒｅｔｈｒｕｍ）、パンコムギ（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ）、ヒペリカム（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｄｏｌａｂｒｉｆｏｒｍｅ）、ディプサクス・ピロスス（Ｄｉｐｓａｃｕｓ ｐｉｌｏｓｕｓ）、ミズオトギリ（Ｔｒｉａｄｅｎｕｍ ｗａｌｔｅｒｉ）、ヒペリカム・フロンドサム（Ｈｙｐｅｒｉｃｕｍ ｆｌｏｎｄｏｓｕｍ）、およびテルミナリア・パリド（Ｔｅｒｍｉｎａｌｉａ ｐａｌｌｉｄ）の抽出物からなる群より選択された一つ以上の抽出物が含まれてよい（非特許文献３を参照）。

また、前記方法によって製造された幹細胞を含む、幹細胞活性化用、皮膚再生用、もしくは抗老化用組成物、またはこれを含む薬学もしくは美容組成物に関する。

本発明によれば、幹細胞作製のもっとも良い方法で、植物幹細胞または多様な方法で誘導されたあらゆる種類の誘導多能性植物幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｐｌａｎｔ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ）の抽出物、シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物またはこれらを含む組成物を利用することができる。また、この方法は、多様な遺伝的背景を持つ人間を含むあらゆる種の細胞にすべてに適用され得る大規模な作製方法となるであろう。また、本発明の方法は、植物由来幹細胞抽出物を使用することにより、倫理的な問題がなく、かつ安全性が確保されたカスタム多能性幹細胞の製造を可能にする。

本発明の方法により多能性幹細胞を誘導する実験過程全体を示す模式図である。 植物幹細胞抽出物を処理して５日目に観察された誘導多能性幹細胞を示す図である。 植物幹細胞抽出物を処理して８日目、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）に移して２日目に観察された誘導多能性幹細胞を示す図である。 植物幹細胞抽出物を処理して３２日目、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）に移して４回の継代培養後に観察された誘導多能性幹細胞を示す図（Ａ）、および、典型的な胚性幹細胞を示す図（Ｂ）である。 植物幹細胞抽出物を処理して３２日目、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）に移して４回の継代培養後に観察された誘導多能性幹細胞のリン酸加水分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色結果を示す図である。 植物幹細胞抽出物を処理して５０日目、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）に移して７回の継代培養後に観察された誘導多能性幹細胞を示す図と、その細胞のリン酸加水分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色結果を示す図（Ａ）、およびＹａｍａｎａｋａの４ ｆａｃｔｏｒウイルスを利用して誘導されたヒト多能性幹細胞とリン酸加水分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色結果を示す図（Ｂ）である。 本発明の方法で誘導された多能性幹細胞の遺伝子発現を示す図である。 本発明に係るセコイアカルス抽出物のＨＰＬＣ結果を示すグラフである。ここでＳｈｉｋｉｍｉｃ ａｃｉｄは、本明細書［化学式１］の構造を有するシキミ酸を示す。 本発明の方法により、シキミ酸またはこれを含む植物幹細胞抽出物を利用して多能性幹細胞を誘導する実験過程全体を示す模式図である。 シキミ酸またはセコイアカルス抽出物を処理した後、ＨＤＦにおいてＯｃｔ３／４遺伝子の発現を示す図である。 シキミ酸を濃度別に処理した後、ＨＤＦにおいてＯｃｔ３／４遺伝子の発現を示す図である。 シキミ酸またはセコイアカルス抽出物を処理した後、ＡＬＰの発現増加を示す図である。 シキミ酸を濃度別に処理した後、ＡＬＰの発現増加を示す図である。 シキミ酸またはセコイアカルス抽出物を処理した後、真皮細胞のコロニー生成力を示す図である。 シキミ酸を濃度別に処理した後、真皮細胞のコロニー生成力を示す図である。 シキミ酸またはセコイアカルス抽出物を処理した後、真皮細胞のコロニー生成 力を示すグラフである。 シキミ酸を濃度別に処理した後、真皮細胞のコロニー生成力を示すグラフである。 シキミ酸またはセコイアカルス抽出物を処理した後、真皮細胞の増殖力増加を示すグラフである。

２０１３年１０月１７日に出願された韓国特許出願番号１０‐２０１３‐０１２３８６０号は、あらゆる目的で全体が本明細書に参照として含まれる。また、本出願は、その全体が本明細書において参照として含まれる韓国特許出願番号１０‐２０１３‐０１２３８６０号の利益を主張する。

本発明の目的を達成するために、本発明の一側面は、
ａ）植物幹細胞または誘導された植物多能性幹細胞から、その有効成分を含む抽出物を抽出するステップ；
ｂ）前記抽出物を成体由来細胞に注入するステップ；および
ｃ）前記抽出物が注入された細胞を、培養過程を経て、胚性幹細胞といった万能性を持った細胞を作製するステップを含む、カスタム型多能性幹細胞を誘導する方法を提供する。

また、本発明の一側面は、シキミ酸；シキミ酸を含む植物抽出物；シキミ酸を含む植物幹細胞抽出物；またはこれらを含む組成物を、成体由来細胞に処理することを含む、幹細胞の製造方法を提供する。

また、本発明の一側面は、シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、シキミ酸を含む植物幹細胞抽出物、またはこれらを含む組成物を成体由来細胞に注入するステップ；および、シキミ酸、抽出物または組成物が注入された細胞を培養するステップをさらに含む、幹細胞を製造する方法を提供する。

本明細書において、抽出物は、カルス抽出物であってよい。

本発明の一側面において、植物抽出物または植物幹細胞抽出物は、シキミ酸（ｓｈｉｋｉｍｉｃ ａｃｉｄ）、コーヒー酸（ｃａｆｆｅｉｃ ａｃｉｄ）またはフェルラ酸（ｆｅｒｕｌｉｃ ａｃｉｄ）を含んでよい。

本明細書において、「シキミ酸」は、下記化学式１を有してよく、その前駆体、誘導体等を含むもっとも広範囲な概念を意味する。また、シキミ酸の分子量は、１７４．１５ｇ／モルであってよい。

本明細書において、「コーヒー酸」は、下記化学式２を有してよく、その前駆体誘導体等を含むもっとも広範囲な概念を意味し、その分子量は、１８０．１６ｇ／モルであってよい。また、コーヒー酸は、コーヒー豆を含む胚のような果物や、バジル、タイム、バナナ、タラゴン、オレガノ、タンポポ等といった薬用植物に含まれているフェノール化合物を意味する。

本明細書において、「フェルラ酸」は、下記化学式３を有してよく、その前駆体誘導体等を含むもっとも広範囲な概念を意味し、その分子量は、１９１．１８ｇ／モルであってよい。また、フェルラ酸は、植物の細胞壁を形成するリグニンの前駆体に該当し、植物の細胞壁に豊富に含まれている成分であって、小麦やオーツ麦、コーヒー、リンゴ、オレンジ、ピーナッツ等の植物の種子に含まれている。

本発明において使用されている用語「幹細胞」は、組織および器官の特殊化された細胞を形成するように、非制限的に再生することのできるマスター細胞を指す。幹細胞は、発達可能な万能性または多能性細胞である。幹細胞は、２つの娘幹細胞、または１つの娘幹細胞と１つの由来（「転移（ｔｒａｎｓｉｔ）」）細胞に分裂されてよく、その後組織の成熟し、完全な形態の細胞へと増殖される。

本発明において使用されている用語「胚性幹細胞」は、受精後、発生初期である胚盤胞期（ｂｌａｓｔｏｃｙｔ）の内部細胞塊（細胞内塊、ｉｎｎｅｒ ｃｅｌｌ ｍａｓｓ）から分離後に培養した細胞であって、多能性（ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｃｙ）を有する細胞を指す。

本発明において使用されている用語「逆分化幹細胞または誘導された多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ， ｉＰＳ）抽出物」は、試験管内において多様な方法で誘導および培養した逆分化幹細胞または誘導された多能性幹細胞（ｉｎｄｕｃｅｄ Ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ Ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ， ｉＰＳ）を、物理‐化学的方法を通じて細かく破砕後、遠心分離等の方法で分離した物質を指す。

本発明において使用されている用語「植物幹細胞」は、形成層由来の植物幹細胞である。特に、植物の導管と師管の境界線上に挟まれた形成層において、物理的にまったく損傷を受けていない状態の純粋な植物幹細胞（ＣＭＣ Ｃａｍｂｉａｌ Ｍｅｒｉｓｔｅｍａｔｉｃ Ｃｅｌｌ）を含む。また、本明細書において、「植物幹細胞」は、多様な方法で誘導されたあらゆる種類の誘導多能性植物幹細胞を含むものとあって、もっとも広範囲な概念である。

本発明において使用されている用語「カルス」（Ｃａｌｌｕｓ、あるいは、癒合組織、創傷組織、癒傷組織）は、分化されていない不定形の細胞塊であって、植物体に損傷が生じたときに、損傷部周辺に生じる分裂組織が形成された腫瘍組織が代表的である。植物は、細胞分裂をする分裂組織とそうでない永久組織とにより大きく構成されているが、最初、分裂組織の細胞を栄養培地に入れ、育てるとカルスが形成される。その後、不定胚が形成され、植物体に分化される。このカルスは、しばしば「植物幹細胞」とも呼ばれる。本発明に使用されるカルスの種類には、制限がない。

本発明において使用されている用語「多能性幹細胞」は、生体を構成する３つの胚葉（ｇｅｒｍ ｌａｙｅｒ）、すなわち、内胚葉（ｅｎｄｏｄｅｒｍ）、中胚葉（ｍｅｓｏｄｅｒｍ）、外胚葉（ｅｃｔｏｄｅｒｍ）のすべてに分化することのできる多機能性（万能性）を有する幹細胞を指す。伝統的に、胚性幹細胞は、このカテゴリに属する幹細胞と言うことができる。

本発明において使用されている用語「カスタム型多能性幹細胞」は、多能性幹細胞を作製するために使用した供与細胞と誘導された多能性幹細胞が遺伝的に同一であることを指し、これは、カスタム型多能性幹細胞が供与細胞から起源して誘導された細胞であることを示す。

本明細書において、「カスタム型多能性幹細胞」、「逆分化幹細胞」、「誘導（された）多能性幹細胞」は、相互交換的に使用されることがある。

本発明において使用されている用語「成体由来細胞」は、胚細胞とは反対する用語であって、生まれてから生存する成体に由来する細胞を指す。

本発明において使用されている用語「分化（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）」は、細胞が分裂増殖して成長する間に、互いに構造や機能が特殊化する現象、すなわち、生物の細胞、組織等がそれぞれに与えられた役割を遂行するために、形態や機能が変わっていくことを言う。一般的に、比較的単純な系が２つ以上の質的に異なる部分系に分離される現象である。たとえば、個体発生において最初同質的であった卵部分間で頭や胴体等の区別が生じたり、細胞にも筋細胞とか神経細胞等の区別が生じたりするように、最初はほぼ同質であったある生物系の部分間で質的な差が生じること、または、その結果として質的に区別し得る部域または部分系に分かれている状態を、分化という。

本発明の一側面において、植物は、セコイアであってよい。

本発明の一側面において、植物幹細胞は、カルス（ｃａｌｌｕｓ）であってよい。

本発明の一側面において、植物幹細胞は、セコイア幹細胞であってよい。

本発明の一側面において、植物幹細胞抽出物は、カルス抽出物であってよい。

本発明の一側面において、抽出物は、セコイアカルス抽出物であってよい。

本発明の一側面において、セコイアは、セコイアデンドロン（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）であってよい。

本発明の一側面において、抽出物または組成物は、シキミ酸を含んでよい。

本発明は、一側面において、組成物は、その組成物の総体積を基準として、シキミ酸を１０μＭ〜３０ｍＭの濃度で含んでよい。また、本発明の一側面において、組成物は、その組成物の総体積を基準として、シキミ酸、植物抽出物または植物幹細胞抽出物を１０μＭ以上、２０μＭ以上、３０μＭ以上、５０μＭ以上、１００μＭ以上、１ｍＭ以上、５ｍＭ以上、１０ｍＭ以上、２０ｍＭ、または３０ｍＭ以上含んでよく、１Ｍ以下または１００Ｍ以下含んでよい。組成物に含まれるシキミ酸の含有量が１０μＭ以下である場合、本発明に係る効果を発現することが困難となり得、３０ｍＭ以上である場合、皮膚に刺激を与え得る。好ましくは、シキミ酸は、組成物の総体積を基準として、０．１ｍＭ以上、０．５ｍＭ以上、０．６ｍＭ以上、０．７ｍＭ以上、０．８ｍＭ以上、または０．９ｍＭ以上の濃度で含まれてよく、または５ｍＭ以下、４ｍＭ以下、３ｍＭ以下、２ｍＭ以下、１．５ｍＭ以下、１．４ｍＭ以下、１．３ｍＭ以下、１．２ｍＭ以下、または１．１ｍＭ以下の濃度で含まれてよい。さらに好ましくは、シキミ酸は、組成物の総体積を基準として、０．８ｍＭ〜１．２ｍＭの濃度で含まれてよい。もっとも好ましくは、シキミ酸は、組成物の総体積を基準として、１ｍＭの濃度で含まれてよい。

本発明の一側面において、植物抽出物または植物幹細胞抽出物は、その抽出物の総体積を基準として、シキミ酸を０．０００１％（ｗ／ｖ）〜４５％（ｗ／ｖ）含んでよい。このような範囲のシキミ酸を含む場合、優れたＯｃｔ３／４遺伝子発現効果、ＡＬＰ発現効果、線維芽細胞の増殖促進効果を有し得る。前記のような観点から、本明細書において、植物抽出物または植物幹細胞抽出物は、その抽出物の総体積を基準として、シキミ酸を、０．００１％（ｗ／ｖ）以上、０．０１％（ｗ／ｖ）以上、０．１％（ｗ／ｖ）以上、１％（ｗ／ｖ）以上、５％（ｗ／ｖ）以上、１０％（ｗ／ｖ）以上、１５％（ｗ／ｖ）以上、２０％（ｗ／ｖ）以上、２５％（ｗ／ｖ）以上、または３０％（ｗ／ｖ）以上含んでよく、４５％（ｗ／ｖ）以下、４０％（ｗ／ｖ）以下、３８％（ｗ／ｖ）以下、３６％（ｗ／ｖ）以下、３４％（ｗ／ｖ）以下、３３％（ｗ／ｖ）以下、または３２％（ｗ／ｖ）以下含んでよい。好ましくは、本明細書において、植物抽出物または植物幹細胞抽出物は、その抽出物の総体積を基準として、シキミ酸を３２％（ｗ／ｖ）〜３４％（ｗ／ｖ）含んでよく、より好ましくは、３２．７５％（ｗ／ｖ）含んでよい。

本発明の一側面において、組成物は、その組成物の総体積を基準として、植物抽出物または植物幹細胞抽出物を、前記シキミ酸および抽出物の濃度を考慮して、抽出物に含まれるシキミ酸の濃度が前述した組成物の総体積を基準として含まれるシキミ酸の濃度となるように含んでよい。たとえば、組成物の総体積を基準として、組成物に含まれる植物抽出物または植物幹細胞抽出物は、０．００１μｇ／ｍｌ以上、０．０１μｇ／ｍｌ以上、０．１μｇ／ｍｌ以上、１μｇ／ｍｌ以上、１０μｇ／ｍｌ以上、５０μｇ／ｍｌ以上、１００μｇ／ｍｌ以上、０．３ｍｇ／ｍｌ以上、０．４ｍｇ／ｍｌ以上、０．５ｍｇ／ｍｌ以上、０．６ｍｇ／ｍｌ以上、０．７ｍｇ／ｍｌ以上、１ｍｇ／ｍｌ以上、１．５ｍｇ／ｍｌ以上、２ｍｇ／ｍｌ以上、５ｍｇ／ｍｌ以上、１０ｍｇ／ｍｌ以上、２０ｍｇ／ｍｌ以上、または５０ｍｇ／ｍｌ以上であってよく、１ｇ／ｍｌ以下、または１０ｇ／ｍｌ以下であってよい。

本明細書において、植物抽出物または植物幹細胞抽出物に含まれるシキミ酸の測定は、Ｗａｔｅｒｓ １５２５μ Ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣ Ｐｕｍｐを利用して、Ｇｅｍｉｎｉ ５ｕ Ｃ１８ １１０ Ａ（５μｍ、４．６ｍｍ ×２５０ｎｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）カラムで、２５０ｎｍ×４．６０ｍｍ、５ミクロンの規格を有するものであり、移動相の溶媒Ａを水（０．１％ＴＦＡ含有）とし、溶媒Ｂをアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）として測定したものであってよい。

本明細書において、「セコイア」は、セコイアスギ（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）、セコイアデンドロン（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）、またはメタセコイア（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ）を含むものである。

セコイアスギ（Ｓｅｑｕｏｉａ ｓｅｍｐｅｒｖｉｒｅｎｓ）は、マツ目ヒノキ科の木で、アメリカスギとも呼ばれ、アメリカ・カリフォルニアの北西海岸とオレゴンの南西部、ニュージーランド等でのみ育つ。樹齢は２５００〜３０００年程度であり、最大高さが１１２ｍにもなる世界でもっとも大きな木である。直径２．５〜４．５ｍ、高さ５０〜１００ｍで、樹皮は、厚さが２０〜３０ｃｍに達する。葉は、イチイと類似し、長さ１〜３ｃｍ、先端が尖って主脈がはっきりとしている。葉の表面は濃い緑色で、裏面は白色を帯びる。

セコイアデンドロン（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ）は、セコイアデンドロン属の唯一の種であり、アメリカ・カリフォルニアのシエラネバダ山脈西側の海抜高度１５００〜２５００ｍで育ち、直径３．５〜６ｍ、高さ６０〜９０ｍに達し、根の近くの直径は１０ｍ前後である。葉は、スギと類似し、長さ１ｃｍ程度で、螺旋状に配列されるが、成熟した枝に付いた葉は、鱗のように生じる。

メタセコイア（Ｍｅｔａｓｅｑｕｏｉａ ｇｌｙｐｔｏｓｔｒｏｂｏｉｄｅｓ）は、ヒノキ科の木で、メタセコイア属の中で唯一生存している種である。原産地では、樹高３５ｍまで伸び、樹皮は、白味を帯びた褐色で、縦方向に剥がれる。枝は横に広がり、葉は二列に対生し、長さ１０〜２３ｍｍ、幅１．５〜２ｍｍの線状である。先端が尖り、茶色、赤色に紅葉する。花は、２〜３月に雌雄同株で咲き、雄花は、総状花序で、葉腋が枝先に吊り下がって下に伸び、２０の雄しべがある。雌花は、枝先に吊り下がり、３月に開花する。果実は、球果で、長さ１８〜２５ｍｍの丸形状であり、褐色に熟し、開いて羽根の付いた楕円形状の種子が出てくる。落葉針葉喬木で、原産地は中国四川省、湖北省であり、韓国、中国等に分布し、主に公園樹として植栽される。

カルス（Ｃａｌｌｕｓ、あるいは、癒合組織、創傷組織、癒傷組織）は、分化されていない不定形の細胞塊であって、植物体に損傷が生じたときに、損傷部周辺に生じる分裂組織が形成された腫瘍組織が代表的である。植物は、細胞分裂をする分裂組織とそうでない永久組織とにより大きく構成されているが、最初、分裂組織の細胞を栄養培地に入れ、育てるとカルスが形成される。その後、不定胚が形成され、植物体に分化される。このカルスは、しばしば「植物幹細胞」とも呼ばれる。

本明細書において、「抽出物」は、抽出方法、抽出溶媒、抽出された成分または抽出物の形態を問わず、天然物の成分を取り出すことにより得られた物質をすべて含むものであり、また、天然物の成分を取り出して得られた物質を抽出した後、他の方法で加工または処理して得られ得る物質をすべて含む広範囲な概念である。

本明細書において使用されるセコイアは、抽出物の形で含まれてよく、また、生薬自体の粉砕物、または生薬の乾燥粉砕物として含まれてよいが、これらに制限されるものではない。併せて、この明細書において使用されるセコイアは、その入手方法に制限がなく、栽培して使用しても、また、市販されているものを購入して使用してもよく、セコイアの地上部および地下部を含む、その全部を意味してよい。地上部の場合、セコイアの果実、葉および茎等を含んでよく、地下部の場合、根等を含んでよいが、これらに制限されるものではない。

本明細書において、「植物抽出物」は、抽出方法、抽出溶媒、抽出された成分または抽出物の形態を問わず、セコイアといった植物の成分を取り出すことにより得られた物質をすべて含むものであり、その成分を取り出す過程において、熱、酸（ａｃｉｄ）、塩基（ｂａｓｅ）、酵素等で処理する工程を含む抽出方法を通じて得られた物質を含み、また、セコイアといった植物の成分を取り出して得られた物質を抽出した後、他の方法で加工または処理して得られ得る物質をすべて含む広範囲な概念である。

本明細書において、「植物幹細胞抽出物」は、抽出方法、抽出溶媒、抽出された成分または抽出物の形態を問わず、セコイア等の植物幹細胞を培養した後、その有効成分を取り出すことにより得られる物質をすべて含むものであり、その成分を取り出す過程において、熱、酸（ａｃｉｄ）、塩基（ｂａｓｅ）、酵素等で処理する工程を含む抽出方法を通じて得られた物質を含み、また、セコイア等の植物幹細胞の有効成分を取り出して得られた物質を抽出した後、他の方法で加工または処理して得られ得る物質をすべて含む広範囲な概念である。

本発明の方法は、植物幹細胞または多様な方法で誘導されたあらゆる種類の誘導多能性植物幹細胞を培養し、これから抽出物を製造するステップを含むが、これは、当業界に公知となっている一般的な方法に従って遂行してよい。たとえば、植物幹細胞または多様な方法で誘導されたあらゆる種類の誘導多能性植物幹細胞を培養し、これをタンパク質分解酵素で処理した後、浮遊液を収集したり、植物幹細胞を６５℃で２時間反応させてフィルタリングしたりすることにより、各細胞に由来するタンパク質またはシキミ酸を抽出してよい。本発明の一実施例において、カルスパウダーを使用してよい。

本明細書において、セコイアカルス抽出物は、i）セコイアからカルス（ｃａｌｌｕｓ）を誘導するステップ；ii）カルスを固体培養（ｓｏｌｉｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）して幹細胞株（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を確立するステップ；iii）細胞株を、懸濁培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）を通じて、有効成分を大量に生産するステップ；および、生産された有効成分を抽出するステップを通じて得てよい。

本明細書において、セコイアカルスから有効成分を抽出する方法は、韓国公開特許第２００７‐０１１３１９３号に公知となっている抽出方法のように、前記植物の組織外植体（ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｌａｎｔ）から由来する細胞株の植物性培養方法で抽出してよく、また、セコイア由来の安定した植物細胞株に５炭素原子以下のアルコールの混合物を加えて、溶出させて抽出してよいが、前記抽出方法に限定されるものではない。

また、本明細書において、セコイアカルス抽出物またはセコイアカルスパウダーは、商業的に購入して使用されてもよい。

本明細書において、セコイアカルス抽出物は、セコイアカルスパウダーを溶媒に溶解させて製造されるものであってよく、このとき、溶媒は、水、有機溶媒および水と有機溶媒の混合物からなる群より選択された一つ以上を含む。前記水は、蒸留水または精製水を含んでよく、有機溶媒は、Ｃ_１〜Ｃ_５の低級アルコールを例として挙げることのできるアルコール、アセトン、エーテル、酢酸エチル、ジエチルエーテル、エチルメチルケトンおよびクロロホルムからなる群より選択された一つ以上、およびヘキサン、塩化メチレン、酢酸エチル、ｎ‐ブタノール、ＢＧ（ブチレングリコール）とＥｔＯＨ（エタノール）の混合溶媒またはＤＭＳＯ（ｄｉｍｅｔｈｙｌ ｓｕｌｆｏｘｉｄｅ）溶媒等を含んでよいが、これらに制限されるものではない。

前記抽出物の製造と関連して、既存のタンパク質抽出方法を応用して、高濃度のタンパク質抽出物を製造してよいということは、当業者が容易に認識することができる。前記植物由来のシキミ酸またはタンパク質抽出物の濃度は、抽出物を含む組成物の体積全体を基準として、１０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌが好ましく、より好ましくは５００μｇ／ｍｌ前後である。タンパク質抽出物の濃度が前記範囲を外れると、カスタム型多能性幹細胞の誘導効率が低下したり、抽出物の処理された細胞が死滅したりするおそれがあるためである。

本発明の方法は、植物幹細胞または多様な方法で誘導されたあらゆる種類の誘導多能性植物幹細胞から分離したタンパク質抽出物を、成体由来細胞に注入するステップを含む。

前記成体由来細胞は、ヒト由来皮膚線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）またはヒト真皮線維芽細胞（Ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）を含んでよい。

注入のために、細胞膜透過促進化合物（たとえば、ストレプトリジンＯまたはジギトニン）を細胞に処理して可逆的な小孔を空けて（透過化、ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）、抽出物が細胞内に流入され得るように処置する。透過化過程を経た後、抽出物とともに培養（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）する過程を通じて、成体由来細胞内にシキミ酸、植物抽出物、植物幹細胞抽出物、多様な方法で誘導されたあらゆる種類の誘導多能性植物幹細胞抽出物またはこれらを含む組成物を注入する。

本発明の一側面において、多能性幹細胞の製造方法は、
１．本明細書に係るシキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、植物幹細胞抽出物またはこれらを含む組成物を製造するステップ；
２．シキミ酸、抽出物または組成物を成体由来細胞に注入するステップ；
３．前記成体由来細胞を、一般細胞培養液を使用して培養するステップ；
４．前記培養された細胞を支持細胞層のある培養条件に移して、さらに培養する段階；
５．培養された多能性幹細胞を回収するステップ；
を含むものであってよい。

具体的に、シキミ酸、抽出物または組成物を成体由来細胞に注入するステップは、
１．成体由来細胞をバラした細胞とした後、再懸濁してチューブに移すステップ；
２．遠心分離後、細胞ペレットを再懸濁して水槽で反応させるステップ；
３．細胞膜透過促進化合物を添加するステップ；
４．サンプルを水槽で上下に混ぜながら反応させるステップ；
５．反応が終わったサンプルを遠心分離するステップ；
６．細胞ペレットをシキミ酸、抽出物または組成物に再懸濁するステップ；
７．ＡＴＰ‐再生システムを通じて、水槽を上下に混ぜ、反応させるステップ；
８．反応後、ＥＳ細胞培地を添加して培養器で反応させるステップ；
９．洗浄後、細胞ペレットを胚性幹細胞培養培地に再懸濁させた後、ディッシュに播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）するステップ；
を含むものであってよい。

本発明は、シキミ酸、抽出物または組成物が注入された細胞を培養過程を経て、胚性幹細胞のような万能性を持った細胞を作製する段階を含む。

前記シキミ酸、抽出物または組成物の注入過程の後、一般細胞培養液を使用して、これらが注入された成体由来細胞を培養した後、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）層のある培養条件に移して、さらに培養する過程を遂行してよい。

より具体的には、前記シキミ酸、抽出物または組成物の注入過程の後、コロニーが形成されるまで、一般細胞培養液（ＤＭＥＭ、５〜１５％のＦＢＳ、１０〜１００Ｕ／ｍｌのペニシリン、２０〜８０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン）を使用して抽出物が注入された成体由来細胞を培養した後、コロニーが発生した後には、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）層のある培養条件に移して、胚性幹細胞培養液において５〜８日ごとに継代培養し、培地は毎日交換し、培養する過程を遂行してよい。本発明の支持細胞は、ＳＴＯ細胞を含んでよいが、これに制限されるものではない。

前記抽出物によって誘導された多能性幹細胞は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）／Ｆ１２に、１５〜２５％のＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、１〜４ｍＭのＬ‐グルタミン、０．０５〜０．２ｍＭの非必須アミノ酸、０．０５〜０．２ｍＭのβ‐メルカプトエタノール、３０〜７０Ｕ／ｍｌのペニシリン、３０〜７０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、および１〜３０μｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加された培養液で培養してよい。前記ＤＭＥＭに添加される化合物の濃度は、本発明の効果を達成し得る範囲内で変えてよいということは、当業者が容易に認識することができる。

また、本発明は、ａ）植物幹細胞または多様な方法で誘導されたあらゆる種類の誘導多能性植物幹細胞からタンパク質を分離する抽出物製造ステップ；
ｂ）細胞膜透過促進化合物を成体由来細胞に処理し、前記抽出物を成体由来細胞に注入するステップ；および
ｃ）前記抽出物が注入された細胞を、一般細胞培養液で培養した後、支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ）層のある培養条件に移してから、胚性幹細胞培養液で培養するステップを含む、カスタム型多能性幹細胞を誘導する方法を提供する。

本発明の方法は、シキミ酸、植物抽出物、植物幹細胞もしくは多様な方法で誘導されたあらゆる種類の誘導多能性植物幹細胞抽出物またはこれらを含む組成物を利用して、成体由来細胞から胚性幹細胞と区分ができない程度で、かつそのような万能性を持った細胞を作ることができることにその特徴がある。

本発明者らは、前記本発明の方法を通じて、多能性幹細胞が誘導されることを確認した。

具体的に、細胞の形状において、本発明によって誘導された多能性幹細胞は、その形状が胚性幹細胞とほぼ同一であることを知ることができる（図４参照）。また、胚性幹細胞の特徴的な遺伝子（Ｎａｎｏｇ， Ｏｃｔ４）の発現有無を調査した結果、本発明によって誘導された多能性幹細胞から、胚性幹細胞と同一に前記遺伝子が発現されることを確認した（図７および図１０参照）。

また、本発明の一側面は、本発明の一側面である方法によって誘導された多能性幹細胞を提供する。

本発明者らは、前記方法を通じて８〜１２回の継代培養を成功して、幹細胞の特徴である自己複製（ｓｅｌｆ‐ｒｅｎｅｗａｌ）が行われることを確認した（図６参照）。

また、本発明の一側面は、本発明の一側面である方法によって製造された多能性幹細胞を含む組成物を提供する。

本発明の一側面は、シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物およびシキミ酸を含む植物幹細胞抽出物のうち一つ以上を有効成分として含む組成物に関する。

本発明の一側面において、組成物は、薬学組成物、食品組成物または美容組成物であってよい。

本発明の一側面において、組成物は、幹細胞活性化用、皮膚再生用、または抗老化用組成物であってよい。

本発明は、一側面において、幹細胞活性化が必要な個体に、シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、シキミ酸を含む植物幹細胞抽出物、またはこれらのうち一つ以上を含む組成物を投与するステップを含む幹細胞活性化方法に関するものであってよい。前記投与は、本明細書に記載されている投与方法または投与量に従うものであってよい。

本発明は、一側面において、皮膚再生が必要な個体に、シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、シキミ酸を含む植物幹細胞抽出物、またはこれらのうち一つ以上を含む組成物を投与するステップを含む皮膚再生方法に関するものであってよい。

本発明は、一側面において、抗老化が必要な個体に、シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、シキミ酸を含む植物幹細胞抽出物、またはこれらのうち一つ以上を含む組成物を投与するステップを含む抗老化方法に関するものであってよい。

本発明は、一側面において、シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、シキミ酸を含む植物幹細胞抽出物、またはこれらのうち一つ以上を含む組成物の、幹細胞活性化用途、皮膚再生用途、または抗老化用途に関するものであってよい。

本発明は、一側面において、幹細胞活性化、皮膚再生、または抗老化に使用するための、シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、シキミ酸を含む植物幹細胞抽出物、またはこれらのうち一つ以上を含む組成物に関するものであってよい。

本発明の一側面において、組成物は、細胞治療剤であってよい。

具体的に、前記細胞治療剤は、肝細胞、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞、筋肉細胞、神経細胞、心筋細胞、血管内皮細胞等の形成に使用されてよい。

本発明は、一側面において、細胞治療が必要な個体に、シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、シキミ酸を含む植物幹細胞抽出物、またはこれらのうち一つ以上を含む組成物を投与することを含む細胞治療方法に関するものであってよい。

本発明は、一側面において、シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、シキミ酸を含む植物幹細胞抽出物、またはこれらのうち一つ以上を含む組成物の細胞治療用途に関するものであってよい。

本発明は、一側面において、細胞治療に使用するための、シキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、シキミ酸を含む植物幹細胞抽出物、またはこれらのうち一つ以上を含む組成物に関するものであってよい。

本発明において使用されている用語「細胞治療剤」は、ヒトから分離、培養、および特殊な操作を通じて製造された細胞および組織で、治療、診断および予防の目的で使用される医薬品（米国ＦＤＡ規定）であって、細胞あるいは組織の機能を復元させるために、生きている者が、同種、または異種細胞を体外で増殖、選別し、または他の方法で細胞の生物学的特性を変化させる等の一連の行為を通じて、治療、診断および予防の目的で使用される医薬品を指す。細胞治療剤は、細胞の分化の程度に応じて、体細胞治療剤、幹細胞治療剤に大きく分類され、本発明は、特に幹細胞治療剤に関する。

本発明の一側面は、本明細書によるシキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、植物幹細胞抽出物または多能性幹細胞を含む食品組成物を提供する。本発明の一側面において、前記組成物は、本発明が目的とする主効果を損なわない範囲内で、主効果に相乗効果を与え得る他の成分等を含有してよい。たとえば、物性改善のために、香料、色素、殺菌剤、酸化防止剤、防腐剤、保湿剤、増粘剤、無機塩類、乳化剤および合成高分子物質等の添加剤をさらに含んでよい。その他にも、水溶性ビタミン、油溶性ビタミン、高分子ペプチド、高分子多糖および海藻エキス等の補助成分をさらに含んでもよい。前記成分は、剤形または使用目的に応じて、当業者が困難なく適宜選定して配合してよく、その添加量は、本発明の目的および効果を損なわない範囲内で選択されてよい。たとえば、前記成分の添加量は、組成物重量全体を基準として、０．０１〜５重量％、より具体的には、０．０１〜３重量％の範囲であってよい。本発明の一側面において、前記食品組成物は、健康食品組成物、機能性食品組成物、補助栄養剤、加工食品組成物、食品添加物等を含むが、これらに制限されるものではない。

本発明の一側面は、本明細書によるシキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、植物幹細胞抽出物または多能性幹細胞を含む美容組成物を提供する。前記美容組成物は、化粧品学または皮膚科学的に許容可能な媒質または基剤を含有する。これは、局所適用に適合したあらゆる剤形で、たとえば、溶液、ゲル、固体、混練無水生成物、水相に油相を分散させて得たエマルジョン、油相に水相を分散させて得たエマルジョン、マルチエマルジョン、懸濁液、マイクロエマルジョン、マイクロカプセル、微細顆粒球、イオン型（リポソーム）および非イオン型の小嚢分散剤、泡沫（ｆｏａｍ）、圧縮された推進剤をさらに含有するエアロゾルまたはパッチ形態で使用されてよい。これら組成物は、当該分野における通常的な方法に従って製造されてよい。

前記化粧品組成物は、上述した物質以外に、主効果を損なわない範囲内で、好ましくは、主効果に相乗効果を与え得る他の成分を含有することも差し支えなく、本発明の有効成分以外に、他の成分をその他化粧品組成物の剤形または使用目的に応じて、当業者が困難なく適宜選定して配合してよい。たとえば、本発明の化粧品組成物は、前記有効成分とともに、必要に応じて、通常化粧品組成物に配合される他の成分を含んでよく、その例として、乳脂成分、保湿剤、エモリエント剤、界面活性剤、有機および無機顔料、有機粉体、紫外線吸収剤、防腐剤、殺菌剤、酸化防止剤、安定化剤、増粘剤、グリセリン、ｐＨ調整剤、アルコール、色素、香料、血行促進剤、冷感剤、制汗剤、精製水等を挙げることができる。前記化粧品組成物に含まれてよいその他配合成分は、これに限定されるものではなく、また、前記成分の配合量は、本発明の目的および効果を損なわない範囲内で可能である。

前記化粧品組成物の剤形は、特に限定されず、目的とするところに応じて適切に選択してよい。たとえば、柔軟化粧水、栄養化粧水、エッセンス、栄養クリーム、マッサージクリーム、パック、ゲル、メイクアップベース、ファンデーション、パウダー、リップスティック、パッチ、噴霧剤、アイクリーム、アイエッセンス、クレンジングクリーム、クレンジングフォーム、クレンジングウォーター、クレンザー、毛髪シャンプー、毛髪コンディショニング、毛髪トリートメント、毛髪エッセンス、毛髪ローション、頭皮ヘアトニック、頭皮エッセンス、ヘアジェル、ヘアスプレー、ヘアパック、ボディローション、ボディクリーム、ボディオイルおよびボディエッセンスからなる群より選択された一つ以上の剤形に製造されてよいが、これらに制限されるものではない。

本発明の一側面は、本明細書によるシキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、植物幹細胞抽出物または多能性幹細胞を含む薬学組成物を提供する。このような薬学組成物は、有効成分以外に、防腐剤、安定化剤、水和剤、乳化促進剤、浸透圧調節のための塩および／または緩衝剤、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースまたはグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸およびそのマグネシウムまたはカルシウム塩、またはポリエチレングリコール）または結合剤（例：マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカンス、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースまたはポリビニルピロリドン）等の薬剤学的補助剤、またはその他治療的として有用な物質をさらに含んでよい。場合によっては、澱粉、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩といった崩解剤、吸収剤、着色剤、香味剤、または甘味剤等の他の薬剤学的添加剤を含んでよい。

前記薬学組成物は、通常的な方法に従って、多様な経口または非経口投与剤の形態で剤形化してよい。

前記経口投与剤は、たとえば、錠剤、丸剤、硬質および軟質カプセル剤、液剤、懸濁剤、乳化剤、シロップ剤、粉剤、散剤、細粒剤、顆粒剤、ペレット剤等があり、これら剤形は、有効成分以外に、界面活性剤、希釈剤（例：ラクトース、デキストロース、スクロース、マンニトール、ソルビトール、セルロースおよびグリシン）、滑沢剤（例：シリカ、タルク、ステアリン酸およびそのマグネシウムまたはカルシウム塩、およびポリエチレングリコール）を含有してよい。錠剤はまた、マグネシウムアルミニウムシリケート、澱粉ペースト、ゼラチン、トラガカンス、メチルセルロース、ナトリウムカルボキシメチルセルロースおよびポリビニルピロリドンといった結合剤を含有してよく、場合によっては、澱粉、寒天、アルギン酸またはそのナトリウム塩といった崩解剤、吸収剤、着色剤、香味剤、および甘味剤等の薬剤学的添加剤を含有してよい。前記錠剤は、通常的な混合、顆粒化またはコーティング方法によって製造されてよい。

また、前記非経口投与剤は、たとえば、注射剤、点滴剤、軟膏、ローション、ゲル、クリーム、スプレー、懸濁剤、乳剤、坐剤、パッチ等の剤型であってよいが、これらに制限されるものではではない。

本発明の一側面に係る前記薬学組成物は、非経口、直腸、局所、経皮、皮下等に投与されてよい。前記組成物は、各投与法に適合した剤形および基準に準ずる。特に、静脈注射の場合、これに適合しないすべての添加物を排除し、組成物自体の純度もまた非常に高く製造される。

前記有効成分の適用量は、治療を受ける対象の年齢、性別、体重、疾患、病理状態、投与経路および処方者の判断に応じて変わり得る。こうした因子に基づいた適用量の決定は、当業者の水準内にある。一般的な投与量は、３０μｇ／ｍｌ〜１ｍｇ／ｍｌが好ましいが、これに制限されるものではない。

本発明の一側面において、本明細書による方法で製造された多能性幹細胞の場合、薬学組成物において注射剤の剤形で使用されることが好ましい。本明細書による方法で製造された多能性幹細胞の場合、皮膚に注射してシワを除去する用途として普遍的に使用されているボトックスと同様に、皮膚に注射されて皮膚幹細胞を活性化させ、皮膚細胞の増殖を促進する等の効果を通じて、皮膚再生、抗老化、弾力増進、シワ改善といった効果を発現し得るものである。

本発明の一側面は、本明細書によるシキミ酸、シキミ酸を含む植物抽出物、植物幹細胞抽出物または多能性幹細胞を含む実験用試薬または培地組成物を含むが、これらに制限されない組成物もまた提供する。

以下、下記実施例を挙げつつ、本発明の実施形態を具体的に説明するが、下記実施例は、本発明を例示するものであるだけに過ぎず、本発明の内容が下記実施例に限定されるものではない。

［実施例１］植物細胞抽出物を成体由来細胞に注入するステップ
本発明者らは、植物由来幹細胞抽出物としてカルスパウダーを使用した。本発明に使用され得るカルスパウダーには制限がなく、商業的に購入して使用してもよい。

セコイアカルス抽出物は、セコイアの葉からカルス（ｃａｌｌｕｓ）を誘導した後、固体培養（ｓｏｌｉｄ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）して幹細胞（ｓｔｅｍ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）を確立し、懸濁培養（ｓｕｓｐｅｎｓｉｏｎ ｃｅｌｌ ｃｕｌｔｕｒｅ）を通じて有効成分を大量に生産した後、抽出して得る。セコイアカルスから有効成分を抽出する方法は、韓国公開特許第２００７‐０１１３１９３号に公知となっている抽出方法のように、前記植物の組織外植体（ｔｉｓｓｕｅ ｅｘｐｌａｎｔ）から由来する細胞株の植物性培養方法で抽出してよく、セコイア由来の安定した植物細胞株に、５炭素原子以下のアルコールの混合物を加えて溶出させて抽出してよいが、前記抽出方法に限定されるものではない。

下記実施例においては、商業的に購入したセコイアカルスパウダー（ｓｅｑｕｏｉａ ｃａｌｌｕｓ ｐｏｗｅｒ）（（株）ＢＩＯ‐ＦＤ＆Ｃで購入）を使用した。具体的に、ヒト由来皮膚線維芽細胞（ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ）を、トリプシン‐ＥＤＴＡを用いて個々の細胞にした後、コールド（ｃｏｌｄ）ＰＢＳ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅ ｂｕｆｆｅｒｅｄ ｓａｌｉｎｅ）で洗浄した。細胞ペレットをコールド（ｃｏｌｄ）Ｃａ２‐およびとＭｇ２‐フリー（ｆｒｅｅ）ＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ´ｓ ｂａｌａｎｃｅｄ ｓａｌｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）１００μｌ／１００，０００細胞となるように再懸濁し、１．５ｍｌチューブに移した。１２０ｇ、５分間、４℃で、水平ローター（ｓｗｉｎｇ‐ｏｕｔ ｒｏｔｏｒ）で遠心分離した後、上澄み液は捨て、細胞ペレットを再びコールド（ｃｏｌｄ）ＨＢＳＳ ９７．７μｌで再懸濁し、３７℃の水槽（ｗａｔｅｒ ｂａｔｈ）で２分間反応させた。ストレプトリジンＯ（ＳＬＯ、コールド（ｃｏｌｄ）ＨＢＳＳ中に１：１０で希釈された１００ ｇ／ｍｌをストック）２．３μｌを添加した（最終ＳＬＯ濃度：２３０ ｎｇ／ｍｌ）。または、この過程において、ＳＬＯに代えて、ジギトニン（２０μｇ／ｍｌ）と輸送溶液（ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）（１１０ｍＭの酢酸カリウム（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、５ｍＭの酢酸ナトリウム（ｓｏｄｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、２ｍＭの酢酸マグネシウム（ｍａｇｎｅｓｉｕｍ ａｃｅｔａｔｅ）、１ｍＭのＥＧＴＡ、２ｍＭのＤＴＴ、タンパク質分解酵素阻害剤混合物（ｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｃｏｃｋｔａｉｌ）、２０ｍＭのＨＥＰＥＳ ｐＨ７．３）２００μｌを添加してよい。サンプルを３７℃の水槽で５０分間反応させるが、１０分に１回、上下に混ぜた。反応が終わったサンプルを氷の上に載置し、コールド（ｃｏｌｄ）ＨＢＳＳ ２００μｌを添加した後、１２０ｇ、５分間、４℃で、水平ローター（ｓｗｉｎｇ‐ｏｕｔ ｒｏｔｏｒ）で遠心分離する。このような細胞透過（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）過程を経た後、細胞ペレットを１μｌ／１０００細胞となるように、２００μｌの植物幹細胞抽出物で再懸濁した。植物幹細胞抽出物としては、カルスパウダーを使用した（５００μｇ／ｍｌ）。そして、ＡＴＰ‐再生システム（１０ｍＭのクレアチンリン酸、および２５ｇ／ｍｌのクレアチンキナーゼ）、それぞれ１ｍＭのヌクレオシド三リン酸を添加し、３７℃の水槽で１時間反応させるが、１０分に１回ずつ、上下に混ぜた。反応が終わった後、原形質膜を再縫合するために、２ｍＭのＣａＣｌ_２が含有されたＥＳ細胞培地１ｍｌを添加して、３７℃の培養器で２時間反応させた。ＰＢＳ洗浄の後、細胞ペレットを胚性幹細胞培養培地に再懸濁させた後、０．１％ゼラチンがコーティングされたディッシュに播種（ｓｅｅｄｉｎｇ）した。

［実施例２］抽出物が注入された細胞を、培養過程を経て、胚性幹細胞のような万能性を持った細胞を作製するステップ
ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）に、１０％ＦＢＳ、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシンが添加された一般細胞培養培地において、３７℃を維持し、５％ＣＯ_２が供給される培養器で培養した。０．１％ゼラチンがコーティングされたディッシュに、植物幹細胞抽出物（カルスパウダー）が注入された成体由来細胞（ヒト由来皮膚線維芽細胞）を前記培地で培養して、最初２日後に培地を交換した。１０日間毎日培地を交換し、培養した後、マイトマイシンＣ（ＭＭＣ）が処理された支持細胞（ｆｅｅｄｅｒ ｃｅｌｌ、ＳＴＯ ｃｅｌｌ）上に、１：２の比率で移した。その後、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ´ｓ Ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ Ｍｅｄｉｕｍ）／Ｆ１２に、２０％ＫＳＲ（Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｓｅｒｕｍ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ）、２ｍＭのＬ‐グルタミン、０．１ｍＭの非必須アミノ酸、０．１ｍＭｍｐβ‐メルカプトエタノール、５０Ｕ／ｍｌのペニシリン、５０ｍｇ／ｍｌのストレプトマイシン、１０μｇ／ｍｌのｂＦＧＦが添加された培養液において、培地を毎日交換し、７日に一度の周期で新しい支持細胞上に移した。平均的に約２１日目の分析に必要なカスタム型幹細胞を培養することができた。

図１は、本発明の方法により多能性幹細胞を誘導する実験過程全体を示す模式図である。図２〜図４は、それぞれ培養５日目、１０日目、および３２日目の多能性幹細胞が誘導されたことを示し、図５および図６は、それぞれ培養３２日目と培養５０日目のリン酸加水分解酵素（ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ ）染色所見を示す。リン酸加水分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色は、通常の染色キットを利用して確認した。

図６に示されたところのように、本発明の方法により誘導された多能性幹細胞が、胚性幹細胞の特徴であるリン酸加水分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ）染色陽性所見（紫色）を示すことが分かる。

［実施例３］カスタム型多能性幹細胞の特性分析（遺伝子発現分析）
培養された細胞を回収した後、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、全ＲＮＡを分離した。逆転写‐ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）を利用してｃＤＮＡを合成した後、Ｎａｎｏｇ，Ｏｃｔ‐３／４および対照遺伝子であるＧＡＰＤＨ遺伝子に特異的なプライマーを利用して、ＰＣＲを行った。ＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動により分析して、これら遺伝子の発現を確認した後、図７に示した。

図７に示されたところのように、本発明の方法により誘導された多能性幹細胞（ｈｉＰＳ）は、胚性幹細胞（ｈＥＳ）の特徴的なＮａｎｏｇ，Ｏｃｔ‐３／４の遺伝子発現を示すことが分かる。

［実施例４］シキミ酸を含むセコイアカルス抽出物（Ｓｅｑｕｏｉａｄｅｎｄｒｏｎ ｇｉｇａｎｔｅｕｍ Ｃａｌｌｕｓ ｃｕｌｔｕｒｅ ｅｘｔｒａｃｔ）の製造
実施例１によるセコイアカルスパウダー２０ｍｇを１ｍｌのＤＭＳＯ溶媒に溶解させ、同様に、セコイアカルスパウダー１ｇを１０ｍｌのＢＧとＥｔＯＨを混合した溶媒に溶解させて、シキミ酸を含むセコイアカルス抽出物を製造し、これを以下の試験例において試料として使用した。

［試験例１］セコイアカルス抽出物の成分分析
実施例４の方法によって得られたセコイア抽出物のうち、ＢＧとＥｔＯＨが混合された溶媒に溶解されたセコイアカルス抽出物を、ＨＰＬＣ機械を利用して、その成分を分析した。

本試験例において、抽出物の分析は、Ｗａｔｅｒｓ １５２５μ Ｂｉｎａｒｙ ＨＰＬＣ Ｐｕｍｐを利用して測定したものであり、２５０×４．６０ｍｍ、５ミクロンの規格を有するＧｅｍｉｎｉ ５ｕ Ｃ１８ １１０ Ａ（５μｍ、４．６×２５０ｎｍ、Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ社）カラムを使用し、移動相の溶媒Ａを水（０．１％ＴＦＡ含有）とし、溶媒Ｂをアセトニトリル（０．１％ＴＦＡ含有）として、２３０ｎｍのＵＶランプを使用したものであり、流速は１ｍｌ／分、進行時間（Ｒｕｎ ｔｉｍｅ）は４６分、抽出物の注入量は２０μｌとして測定したものである。

セコイア抽出物のＬＣスペクトルは、図８のとおりであり、その結果を下記表１に示した。表１において、％Ａｒｅａは、セコイア抽出物に含まれている物質の％（ｗ／ｖ）を示すものであり、これを通じて、セコイアカルス抽出物には、他の成分よりもシキミ酸が多く含有されていることが分かる。また、セコイアカルス抽出物には、シキミ酸の他にも、コーヒー酸およびフェルラ酸が含まれていることを確認することができる。

［試験例２‐１］Ｏｃｔ３／４の発現増加確認実験
ヒト真皮繊維芽細胞（Ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ， ＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌ）（ＣＣ‐２５０９， Ｌｏｎｚａ， ＵＳＡ）５×１０^５個に、透過化バッファー（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）とジギトニン（ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）１０μｇ／ｍｌを処理し、実施例４によるセコイアカルス抽出物（ＢＧとＥｔＯＨの混合溶媒）２０μｇ／ｍｌおよびシキミ酸５μｇ／ｍｌをそれぞれ処理した。何の処理もしなかったＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌを陰性対照群として設定した。処理後３日目に、細胞を４チャンバースライド（ｃｈａｍｂｅｒ ｓｌｉｄｅ）に５，０００個ずつ付け、その１日後である４日目に、ＰＢＳにある３．８％ホルムアルデヒド（３８％パラホルムアルデヒドを希釈したもの）で固定させて、室温で１０分間置いた後、ｏｃｔ３／４抗体（Ｇｅｎｅｔｅｘ， ＧＴＸ１００６２２， ｘ２００）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)４８８ ヤギ抗ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ）ＩｇＧを利用して免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏ‐ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を実施し、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＬＳＭ５１０で４００倍で観察してイメージ画像を得た。観察を通じて得られたイメージ画像は、図１０に示した。また、ＯＣＴ３／４ ＩＣＣ実験の結果得られたＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅのイメージ画像を、サンプルあたり４枚以上、平均５枚ずつ分析して、ＯＣＴ３／４陽性細胞（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｅｌｌ）の比率を求め、その平均、標準偏差を求めて表２に示した。

図１０から見られるように、実験例４によるセコイアカルス抽出物を処理したＨＤＦの場合、陰性対照群であるノーマル（ｎｏｒｍａｌ）ＨＤＦに比べて、Ｏｃｔ３／４遺伝子が多く発現されたことを確認することができ、これは、シキミ酸で処理したものよりも多いものと確認される。

また、表２から見られるように、Ｏｃｔ３／４遺伝子に対して陽性である細胞のパーセントを見ると、セコイアカルス抽出物をＢＧ（Ｂｕｔｙｌ ｇｌｙｃｏｌ）およびＥｔＯＨの溶媒で抽出した場合、陽性である細胞の個数の平均パーセントが３３％でもっとも高く、これは、シキミ酸よりも高い数値に該当することを確認した。

［試験例２‐２］Ｏｃｔ３／４の発現増加確認実験
ヒト真皮繊維芽細胞（Ｎｅｏｎａｔａｌ ｈｕｍａｎ ｄｅｒｍａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ， ＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌ）（ＣＣ‐２５０９， Ｌｏｎｚａ， ＵＳＡ）１×１０^６個に、シキミ酸１０μＭ、１０ｍＭをそれぞれ処理した。何の処理もしなかったＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌを陰性対照群として設定した。処理後５日目に、細胞を４チャンバースライドに５，０００個ずつ付け、その３日後である８日目に、ＰＢＳにある３．８％ホルムアルデヒド（３８％パラホルムアルデヒドを希釈したもの）で固定させて、室温で１０分間置いた後、ｏｃｔ３／４抗体（Ｇｅｎｅｔｅｘ， ＧＴＸ１００６２２， ｘ２００）およびＡｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ(R)４８８ ヤギ抗ウサギ（ｇｏａｔ ａｎｔｉ‐ｒａｂｂｉｔ）ＩｇＧを利用して免疫組織化学（Ｉｍｍｕｎｏ‐ｃｙｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）を実施し、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ ＬＳＭ５１０で４００倍で観察して、イメージ画像を得た。観察を通じて得られたイメージ画像は、図１１に示した。また、ＯＣＴ３／４ ＩＣＣ実験の結果得られたＣａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｃｏｎｆｏｃａｌ ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅのイメージ画像を、サンプルあたり４枚以上、平均５枚ずつ分析して、ＯＣＴ３／４陽性細胞の比率を求め、その平均、標準偏差を求めて表３に示した。

図１１から見られるように、シキミ酸を処理したＨＤＦの場合、無処理ノーマル（ｎｏｒｍａｌ）ＨＤＦに比べて、Ｏｃｔ３／４遺伝子が多く発現されたことを確認することができ、これは、シキミ酸が多いほど増加するものと確認される。

また、表３から見られるように、Ｏｃｔ３／４遺伝子に対して陽性である細胞のパーセントを見ると、水を溶媒としてシキミ酸を処理した場合、陽性である細胞の個数の平均パーセントが２７〜２９％と示され、これは、無処理群に比べて有意に高い数値に該当することを確認した。

したがって、以上のような結果を通じて、セコイアカルス抽出物の主成分であるシキミ酸は、カスタム型多能性幹細胞を誘導するのに核心的な役割をするＯｃｔ３／４遺伝子を顕著に発現させる効果を持っていることを確認することができる。本発明に係るシキミ酸またはこれを含む抽出物を体細胞に注入すれば、Ｏｃｔ３／４遺伝子を発現させてカスタム型多能性幹細胞を誘導することができる。

［試験例３‐１］幹細胞活性マーカーであるアルカリ性リン酸加水分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， ＡＬＰ）の発現増加確認実験
ＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌ（ＣＣ‐２５０９， Ｌｏｎｚａ， ＵＳＡ）５×１０^５個に、透過化バッファー（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）とジギトニン（ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）１０μｇ／ｍｌを処理し、実施例４によるセコイアカルス抽出物（ＢＧとＥｔＯＨの混合溶媒）２０μｇ／ｍｌおよびシキミ酸５μｇ／ｍｌを処理した。何の処理もしなかったＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌを陰性対照群として設定した。６日目に、細胞を１２ウェルプレート（ｗｅｌｌ ｐｌａｔｅ）に５，０００個ずつ付け、その５日後である１１日目に、ＰＢＳにある３．８％ホルムアルデヒドで固定させて、室温で１５分間置いた後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ(R) ＡＬＰ基質溶液（ｓｕｂｓｔｒａｔｅ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）２００μｌをＡＬＰバッファー（ｂｕｆｆｅｒ）１０ｍｌに希釈して０．５ｍｌずつ処理し、２０時間後にＯｌｙｍｐｕｓ ＣＫＸ４１光学顕微鏡で４０倍で観察した。観察を通じて得られた結果は、図１２に示した。

図１２から見られるように、セコイアカルス抽出物を処理したＨＤＦの場合、ノーマル（ｎｏｒｍａｌ）ＨＤＦに比べて染色された部分が多く、これは、ＡＬＰの発現が顕著に増加したことを示す。また、セコイアカルス抽出物を処理したものは、シキミ酸を処理したものよりもＡＬＰが多く発現されたことを確認することができる。

繊維芽細胞がカスタム型多能性幹細胞へと進行する過程において、ＡＬＰは、Ｏｃｔ４等の遺伝子を細胞内に発現させた後、３日後から発現し始めるものであって、逆分化幹細胞の形成初期に重要な役割を果たしていると知られているマーカー（ｍａｒｋｅｒ）である。したがって、本発明に係るセコイアカルス抽出物を体細胞に注入すれば、ＡＬＰの発現が顕著に増加することになり、また、Ｏｃｔ４遺伝子を発現させることになるため、カスタム型多能性幹細胞を誘導することができる。

本実験結果に照らして、本発明に係るセコイアカルス抽出物は、幹細胞活性マーカーであるＡＬＰの発現を促進することに照らして、幹細胞を活性させる顕著な効果を示すということを確認することができる。

［試験例３-２］幹細胞活性マーカーであるアルカリ性リン酸加水分解酵素（Ａｌｋａｌｉｎｅ ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ， ＡＬＰ）の発現増加確認実験
ＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌ（ＣＣ‐２５０９， Ｌｏｎｚａ， ＵＳＡ）１×１０^６個に、シキミ酸１０μＭ、１０ｍＭをそれぞれ処理した。何の処理もしなかったＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌを陰性対照群として設定した。５日目に、細胞を６ウェルプレートに１００，０００個ずつ付け、その７日後である１２日目に、ＰＢＳにある３．８％ホルムアルデヒドで固定させて、室温で１５分間置いた後、ＮＢＴ／ＢＣＩＰ(R) ＡＬＰ基質溶液２００μｌをＡＬＰバッファー１０ｍｌに希釈して０．５ｍｌずつ処理し、２０時間後にＯｌｙｍｐｕｓ ＣＫＸ４１光学顕微鏡で４０倍で観察した。観察を通じて得られた結果は、図１３に示した。

図１３から見られるように、シキミ酸を処理したＨＤＦの場合、ノーマル（ｎｏｒｍａｌ）ＨＤＦに比べて藍色に濃く染色された部分が多く、これは、ＡＬＰの発現が顕著に増加したことを示す。また、シキミ酸の濃度が増加するほどＡＬＰが多く発現されたことを確認することができる。

繊維芽細胞がカスタム型多能性幹細胞へと進行する過程において、ＡＬＰは、Ｏｃｔ４等の遺伝子を細胞内に発現させた後、３日後から発現し始めるものであって、逆分化幹細胞の形成初期に重要な役割を果たしていると知られているマーカーである。したがって、本発明に係るシキミ酸およびこれを含有する植物抽出物を体細胞に注入すれば、ＡＬＰの発現が顕著に増加することになり、また、Ｏｃｔ４遺伝子を発現させることになるため、カスタム型多能性幹細胞を誘導することができる。

本実験の結果に照らして、本発明に係るシキミ酸およびこれを含有する植物抽出物は、幹細胞活性マーカーであるＡＬＰの発現を促進することに照らして、幹細胞を活性させる顕著な効果を示すことを確認することができる。

［試験例４‐１］真皮細胞のコロニー生成力増加実験
ＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌ（ＣＣ‐２５０９， Ｌｏｎｚａ， ＵＳＡ）５×１０^５個に、透過化バッファー（Ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）とジギトニン（ｄｉｇｉｔｏｎｉｎ）１０μｇ／ｍｌを処理し、０．４μｍフィルターで濾過した実施例４によるセコイアカルス抽出物（ＢＧとＥｔＯＨの混合溶媒）１００ｐｐｍ、２００ｐｐｍと、ＤＭＳＯ溶液２０ｐｐｍを処理した。何の処理もしなかったＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌを陰性対照群として設定した。これを継代培養してから１０日目に、細胞を６０ｍｍプレートに２００個ずつ付けた後、２３日目に、氷の上でアイス‐コールド（ｉｃｅ‐ｃｏｌｄ）ＰＢＳで洗浄し、−２０度で保管したアイス‐コールド（ｉｃｅ‐ｃｏｌｄ）メタノールで細胞を１０分間固定した。エタノール原液（Ｅｔｈａｎｏｌ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）にある１％クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）を、ＰＢＳに１／１０で希釈して実験溶液（ｗｏｒｋｉｎｇ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）を作成した後、これを細胞に５〜１０分間処理して染色した後、ＰＢＳで４回洗浄し、写真撮影をした。定量分析のために、５０％エタノール、４０％ＤＷ、１０％酢酸で構成された溶離バッファー（ｅｌｕｔｉｏｎ ｂｕｆｆｅｒ）を準備した後、５分間細胞に処理して溶出させた。その後、９６ウェルプレートに２００μｌずつ移して、５８０ｎｍで吸光度を測定した。写真撮影による結果は、図１４に示した。そして、吸光度測定による結果は、陰性対照群を基準とした倍数の結果として、図１６に示した。

また、図１６から見られるように、セコイアカルス抽出物を処理した場合、陰性対照群に比べてコロニー生成力の増加程度が約２．６倍に増加し、これは、統計的に有意なものである。また、シキミ酸の場合、陰性対照群に比べて約３．８倍増加した。

また、図１５から見られるように、セコイアカルス抽出物を処理した場合、陰性対照群に比べてコロニー生成力の増加程度が約２．６倍に増加し、これは、統計的に有意なものである。また、シキミ酸の場合、陰性対照群に比べて約３．８倍増加した。

したがって、本発明に係るセコイアカルス抽出物は、繊維芽細胞の増殖を顕著に促進するということを確認することができる。
また、真皮細胞の繊維芽細胞の増殖を顕著に促進することに照らして、本発明に係るセコイア抽出物は、皮膚再生を促進する効果を示すということを確認することができる。

［試験例４‐２］真皮細胞のコロニー生成力増加実験
ＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌ（ＣＣ‐２５０９， Ｌｏｎｚａ， ＵＳＡ）１×１０^６個に、シキミ酸１０μＭ、５０μＭ、１００μＭ、１ｍＭ、１０ｍＭをそれぞれ処理した。何の処理もしなかったＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌを陰性対照群として設定した。これを継代培養してから５日目に、細胞を６０ｍｍプレートに２００個ずつ付けた後、１７日目に、氷の上でアイス‐コールド（ｉｃｅ‐ｃｏｌｄ）ＰＢＳで洗浄し、−２０度で保管したアイス‐コールド（ｉｃｅ‐ｃｏｌｄ）メタノールで細胞を１０分間固定した。エタノール原液（Ｅｔｈａｎｏｌ ｓｔｏｃｋ ｓｏｌｕｔｉｏｎ）にある１％クリスタルバイオレット（ｃｒｙｓｔａｌ ｖｉｏｌｅｔ）を、ＰＢＳに１／１０で希釈して実験溶液を作成した後、これを細胞に５〜１０分間処理して染色した後、ＰＢＳで４回洗浄し、写真撮影をした。定量分析のために、５０％エタノール、４０％ＤＷ、１０％酢酸で構成された溶離バッファーを準備した後、５分間細胞に処理して溶出させた。その後、９６ウェルプレートに２００μｌずつ移して、５８０ｎｍで吸光度を測定した。写真撮影による結果は、図１５に示した。そして、吸光度測定による結果は、陰性対照群を基準にした倍数の結果として、図１７に示した。

図１５から見られるように、シキミ酸を処理した場合、何の処理もしなかったＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌである陰性対照群に比べて染色された部分が相当に多く、これは、真皮細胞が活発に分化してコロニーを多く生成したことを意味し、細胞分化を促進することを確認することができる。

また、図１７から見られるように、シキミ酸を処理した場合、陰性対照群に比べてコロニー生成力の増加程度が約１．２７〜５．０６倍に増加し、これは、統計的に有意なものである。特に、シキミ酸を１ｍＭ処理した場合にコロニーの生成力がもっとも多く増加し、このことを通じて、１ｍＭ濃度のシキミ酸を処理することが、もっとも多く細胞の増殖を促進するということを確認することができる。

したがって、本発明に係るシキミ酸は、繊維芽細胞の増殖を顕著に促進するということを確認することができる。

また、真皮細胞の繊維芽細胞の増殖を顕著に促進することに照らして、本発明に係るシキミ酸およびこれを含有したセコイア抽出物は、皮膚再生を促進する効果を示すということを確認することができる。

［試験例５］真皮細胞の増殖力増加実験
９６ウェルプレートに、ＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌ（ＣＣ‐２５０９， Ｌｏｎｚａ， ＵＳＡ）を２，０００個ずつ付けた後、その翌日に、実施例４によるセコイアカルス抽出物（ＢＧおよびＥｔＯＨ溶媒）２０μｇ／ｍｌおよびシキミ酸５μｇ／ｍｌを処理した。何の処理もしなかったＮＨＤＦ‐Ｎｅｏｎａｔａｌを陰性対照群として設定した。これを７日間培養し（７日目にコンフルエンシー（Ｃｏｎｆｌｕｅｎｃｙ）が９０％以下になるように）、その６日後に、ＷＳＴ‐１を１０μｌずつ処理し、４５０ｎｍで吸光度を測定した。陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）サンプルを基準とした倍数での結果を、グラフで図１８に示した。

図１８から見られるように、本発明に係るセコイアカルス抽出物を処理する場合、陰性対照群に比べて細胞分裂の程度が約１．５倍以上増加したことを確認することができ、これは、統計的に有意なものである。また、シキミ酸の場合、正常対照群に比べて２倍増加した。

したがって、本発明に係るセコイアカルス抽出物は、繊維芽細胞の分裂を顕著に促進するということを確認することができる。

また、真皮細胞の繊維芽細胞分裂を顕著に促進することに照らして、本発明に係るセコイア抽出物は、皮膚再生を促進する効果を示すということを確認することができる。

上述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明が属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更せずに、他の具体的な形態に容易に変形が可能であることを理解することができるであろう。したがって、以上において記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解されなければならない。

以下、前記組成物の剤形例について説明するが、これは、本発明を限定するものでなく、単に具体的に説明するためのものである。

［製剤例１］軟質カプセル
シキミ酸または実施例４によるセコイアカルス抽出物４０μｇ、ビタミンＥ ９ｍｇ、ビタミンＣ ９ｍｇ、パーム油２ｍｇ、植物性硬化油８ｍｇ、黄蝋４ｍｇおよびレシチン９ｍｇを混合し、通常の方法に従って混合して軟質カプセル充填液を製造する。１カプセルあたり４００ｍｇずつ充填して、軟質カプセルを製造する。そして、前記とは別途に、ゼラチン６６重量部、グリセリン２４重量部およびソルビトール液１０重量部の比率でソフトカプセルシートを製造し、前記充填液を充填させて、本発明に係る組成物４００ｍｇが含有された軟質カプセルを製造する。

［製剤例２］錠剤
シキミ酸または実施例４によるセコイアカルス抽出物４０μｇ、ビタミンＥ ９ｍｇ、ビタミンＣ ９ｍｇ、ガラクトオリゴ糖２００ｍｇ、乳糖６０ｍｇおよび麦芽糖１４０ｍｇを混合し、流動層乾燥機を利用して顆粒した後、糖エステル（ｓｕｇａｒ ｅｓｔｅｒ）６ｍｇを添加する。これら組成物５００ｍｇを、通常の方法で打錠して、錠剤を製造する。

［製剤例３］ドリンク剤
シキミ酸または実施例４によるセコイアカルス抽出物４０μｇ、ビタミンＥ ９ｍｇ、ビタミンＣ ９ｍｇ、ブドウ糖１０ｇ、クエン酸０．６ｇおよび液状オリゴ糖２５ｇを混合した後、精製水３００ｍｌを加えて、各ボトルに２００ｍｌずつとなるように充填する。ボトルに充填した後、１３０℃で４〜５秒間殺菌してドリンク剤を製造する。

［製剤例４］顆粒剤
シキミ酸または実施例４によるセコイアカルス抽出物４０μｇ、ビタミンＥ ９ｍｇ、ビタミンＣ ９ｍｇ、無水結晶ブドウ糖２５０ｍｇおよび澱粉５５０ｍｇを混合し、流動層造粒機を使用して顆粒に成形した後、包に充填して顆粒剤を製造する。

［製剤例５］注射剤
下記表４に記載された組成に従い、通常的な方法で注射剤を製造した。

通常の注射剤の製造方法に従い、１アンプルあたり（２ｍｌ）前記含量で注射剤を製造する。

［製剤例６］柔軟化粧水（スキンローション）
下記表５に記載された組成に従い、通常的な方法で柔軟化粧水を製造した。

［製剤例７］栄養化粧水（ミルクローション）
下記表６に記載された組成に従い、通常的な方法で栄養化粧水を製造した。

［製剤例８］栄養クリーム
下記表７に記載された組成に従い、通常的な方法で栄養クリームを製造した。

［製剤例９］マッサージクリーム
下記表８に記載された組成に従い、通常的な方法でマッサージクリームを製造した。

［製剤例１０］パック
下記表９に記載された組成に従い、通常的な方法でパックを製造した。

［製剤例１１］健康食品
下記表１０に記載された組成に従い、通常的な方法で健康食品を製造した。

前記ビタミンおよびミネラルの混合物の組成比は、比較的健康食品に適合した成分を好ましい実施例で混合組成したが、その配合比を任意に変形実施してもよい。

［製剤例１２］健康飲料
下記表１１に記載された組成に従い、通常的な方法で健康飲料を製造した。

通常の健康飲料の製造方法に従って前記成分を混合した後、約１時間の間、８５℃で攪拌、加熱した後、作られた溶液を濾過して滅菌する。

［製剤例１３］多能性幹細胞を含む注射剤
下記表１２に記載された組成に従い、通常的な方法で、本明細書の実施例２による多能性幹細胞を含む注射剤を製造した。

本発明の属する分野における通常の知識を有する者であれば、前記内容を基に、本発明の範疇内で多様な応用、変形を行うことが可能であろう。

Claims (6)

1. シキミ酸またはシキミ酸を含む組成物によって、繊維芽細胞を処理することを含む、増加されたコロニー生成力及び増殖力を有するヒト細胞の製造方法であって、
   前記繊維芽細胞を処理するシキミ酸の濃度が１０μＭ〜３０ｍＭである、
   製造方法。
2. シキミ酸または前記組成物を前記繊維芽細胞に注入するステップ；および、シキミ酸または前記組成物が注入された細胞を培養するステップを含む、
   請求項１に記載の製造方法。
3. シキミ酸または前記組成物の注入前に、前記繊維芽細胞に細胞膜透過促進物質を処理するステップをさらに含む、
   請求項２に記載の製造方法。
4. 前記細胞膜透過促進化合物は、ストレプトリジンＯまたはジギトニンである、
   請求項３に記載の製造方法。
5. シキミ酸または前記組成物が注入された前記繊維芽細胞を、支持細胞層に移して、さらに培養するステップをさらに含む、
   請求項２に記載の製造方法。
6. 前記支持細胞は、ＳＴＯ細胞である、請求項５に記載の製造方法。