JP6721189B2 - ｖＷＦに結合するＤＮＡアプタマー - Google Patents

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Description

本発明は、人工塩基を含む、vWFに結合するDNAアプタマー、該DNAアプタマーを含む医薬組成物、及び該DNAアプタマーを用いてvWFを検出する方法等に関する。
標的分子に対して結合活性を有する核酸断片は、核酸アプタマーと呼ばれ、核酸医薬品として医療への幅広い応用が期待されている。核酸アプタマーは、ランダムな塩基配列で構成される核酸断片ライブラリーの中から、標的分子に結合する核酸断片を選別及び単離するin vitroセレクション（SELEX法）によって作出することができる。
一方、vWFは血中に存在する血液凝固因子の一つであり、その遺伝子変異はフォン・ウィルブランド病等に関与することや、vWFへの自己抗体の産生によって後天性の血栓性血小板減少性紫斑病等が引き起こされることが知られている。これまでにvWFに対する核酸アプタマーが幾つか開発されている（非特許文献１及び非特許文献２）。しかしながら、従来の核酸アプタマーは、20種類のアミノ酸から成るタンパク質である抗体と比較して、構成する塩基の種類が4種類しかないことから、そのバリエーションに限りがあり、結合能、解離速度、及び安定性等の性能について、十分満足できるものではなかった。そのため、核酸アプタマーを治療及び診断をはじめとする医療分野に用いるには、これらの性能を改善することが重要であった。
Sadler, J.E., 1998, Annu. Rev. Biochem., 67, pp. 395-424. Gilbert, J.C. et al, 2007, Circulation, 116, pp. 2678-2686.
したがって、従来の核酸アプタマーよりも結合能、解離速度、及び／又は安定性が優れたvWFに対するアプタマーの開発が求められていた。
本発明者は、vWFを標的として、本発明者が開発した人工塩基対技術を用いた2種類のSELEX法（WO2013/073602に記載のプレデターミン法及びランダムライブラリー法）を実施することにより、vWFに強く結合する、人工塩基を含むDNAアプタマーを得た。また、得られたDNAアプタマーについてさらなる研究を行った結果、従来の核酸アプタマーであるARC1172に比べて、KD及び／又はkoffの点で、優れた結合能（例えば、10倍以上低いKD及び／又はkoff）を示した。また、得られたDNAアプタマーは、優れたTm値及び／又は核酸分解酵素耐性を有していた。
本発明は、上記知見に基づくものであり、以下の態様を包含する。
（１）以下の（i）又は（ii）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー：
（i）配列番号13〜16、19及び20のいずれかに示される塩基配列、又は
（ii）（i）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
（２）（i）の塩基配列が、配列番号13、14、19又は20に示される配列である、（１）に記載のDNAアプタマー。
（３）1〜5個のGC対を塩基配列の末端に含む、（１）又は（２）に記載のDNAアプタマー。
（４）塩基配列の3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
前記ミニヘアピン構造が、
5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：
（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
（B）GNA又はGNNA（ここで、各Nは、独立に、G、T、A若しくはCのいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域
からなり、
かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、
（１）〜（３）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（５）以下の（i）又は（ii）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー：
（i）配列番号18若しくは21に示される塩基配列、又は
（ii）（i）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
（６）（１）〜（５）のいずれかに記載の塩基配列からなる、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー。
（７）以下の（I）又は（II）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー：
（I）配列番号1〜4、9及び11のいずれかに示される塩基配列、又は
（II）（I）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
（８）（I）の塩基配列が、配列番号1又は11に示される配列である、（７）に記載のDNAアプタマー。
（９）1〜5個のGC対を塩基配列の末端に含む、（７）又は（８）に記載のDNAアプタマー。
（１０）塩基配列の3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
前記ミニヘアピン構造が、
5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：
（A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
（B）GNA又はGNNA（ここで、各Nは、独立に、G、T、A若しくはCのいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
（C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域
からなり、
かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、
（７）〜（９）のいずれかに記載のDNAアプタマー。
（１１）以下の（I）又は（II）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー：
（I）配列番号12に示される塩基配列、又は
（II）（I）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
（１２）（７）〜（１１）のいずれかに記載の塩基配列からなる、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー。
（１３）（１）〜（１２）のいずれかに記載のDNAアプタマーを含むvWFタンパク質検出剤。
（１４）（１）〜（１２）のいずれかに記載のDNAアプタマーを含むvWFタンパク質検出用キット。
（１５）（１）〜（１２）のいずれかに記載のDNAアプタマーを含む医薬組成物。
（１６）血栓症、血栓性血小板減少性紫斑病、頭蓋内塞栓、脳塞栓症、頸動脈狭窄、血栓性微小血管症、及び急性心筋梗塞症からなる群から選択される疾患の治療及び／又は予防のための、（１５）に記載の医薬組成物。
（１７）被験体から得られたサンプルを、（１）〜（１２）のいずれかに記載のDNAアプタマーと接触させる工程、及び
前記サンプルと前記DNAアプタマーの結合に基づいてvWFタンパク質を検出する工程、
を含む、vWFタンパク質を検出する方法。
本明細書は本願の優先権の基礎となる日本国特許出願番号2015-214848号の開示内容を包含する。
本発明により、従来の核酸アプタマーよりも結合能、解離速度、及び／又は安定性が優れたvWFに対するDNAアプタマーが提供される。また、本発明のDNAアプタマーにより、vWFの検出法、血栓症等の疾患の罹患の有無の診断を補助する方法、並びに血栓症等の疾患の治療及び／又は予防のための医薬組成物が提供される。
実施例3で調製した各DNAアプタマーの予測される二次構造を示す。aで示すvWF1-DsDsDs（配列番号1）を元に、3'末端側のDsをAに置換したbで示すvWF1-DsDsA（配列番号2）、中間部のDsをAに置換したcで示すvWF1-DsADs（配列番号3）、5'末端側のDsをAに置換したdで示すvWF1-ADsDs（配列番号4）、及び中間部と3'末端側のDsをAに置換したeで示すvWF1-DsAA（配列番号5）を調製した。人工塩基であるDsを四角で、DsをAに置換した部位を矢頭で示す。図中、太線はワトソンクリック塩基対を形成し得る塩基を、通常の線は塩基がホスホジエステル結合を介して連結されていることを示す。太線及び通常の線の意味は以下の図1-2、3、6-1、及び6-2について同様である。 実施例3で調製した各DNAアプタマーの予測される二次構造を示す。vWF1-DsDsDs（配列番号1）を元に、5'末端側と3'末端側のDsをAに置換したfで示すvWF1-ADsA（配列番号6）、5'末端側と中間部のDsをAに置換したgで示すvWF1-AADs（配列番号7）、全てのDsをAに置換したhで示すvWF1-AAA（配列番号8）、3'末端側のDsをAに置換し、ステム部分の末端のAT対を除いたiで示すvWF1-R1Ds（配列番号9）を調製した。また、陽性対照として既存のvWF結合性DNAアプタマーであるjで示すARC1172（配列番号10）も調製した。人工塩基であるDsを四角で、DsをAに置換した部位を矢頭で示す。 実施例3で調製した各DNAアプタマーのvWF A1ドメインに対するゲルシフトアッセイの結果を示す。図2Aは、電気泳動を行った際の、SYBR GOLDによるDNAアプタマーの染色結果を示す。図2Bは、ARC1172のゲルシフト率（レーン全体のバンドを100%としたときの、複合体のバンドの割合）を1.0として、各オリゴのシフト率（結合率）を相対シフト率としてグラフ化したものである。結合反応は37℃で、泳動は4℃で行った。複合体はvWF A1ドメインに結合したDNAアプタマーを、遊離は遊離状態のDNAアプタマーを示す。a〜jは、それぞれ図1-1及び1-2のa〜jによって示されるアプタマーを用いた際の結果を示す。 実施例4において、SPRによる結合活性測定に使用したDNAアプタマーの二次構造を示す。aで示すvWF1-DsDsDs（配列番号1）を元に、三つのDsをAに置換したhで示すvWF1-AAA（配列番号8）、ステム領域のAT対の一部をGC対に置換したkで示すvWF1-DsDsDs-GC（配列番号11）、vWF1-DsDsDs-GC の3'末端にミニヘアピンを付加したlで示すvWF1-DsDsDs-mhGC（配列番号12）を調製した。Dsを四角で、DsをAに置換した部位及びAT対をGC対に置換した部位を矢頭で、ミニヘアピンを付加した部位を矢頭を付した四角で示す。 各種DNAアプタマーのSPRによるvWF A1ドメインタンパク質に対する結合解析結果を示す。AはvWF1-DsDsDsの、BはvWF1-DsDsDs-GCの、CはvWF1-DsDsDs-mhGCの、DはvWF1-AAAの、EはARC1172の結果を示す。 各種DNAアプタマーのTm値の測定結果を示す。Aは各温度におけるDNAアプタマーの標準吸光度を、Bは各温度におけるDNAアプタマーの標準化吸光度の一次導関数を示す。 実施例8で調製したDNAアプタマーの予測される二次構造を示す。mで示すvWF2-DsDsDs（配列番号13）を元に、中間部のDsをAに置換したnで示すvWF2-DsADs（配列番号14）、中間部及び3'末端側のDsをAに置換したoで示すvWF2-DsAA（配列番号15）、並びに5'末端側及び中間部のDsをAに置換したpで示すvWF2-AADs（配列番号16）を調製した。Dsを四角で、DsをAに置換した部位を矢頭で示す。 実施例8で調製したDNAアプタマーの予測される二次構造を示す。vWF2-DsDsDs（配列番号13）を元に、全てのDsをAに置換したqで示すvWF2-AAA（配列番号17）、ステム部分のA-T塩基対をG-C塩基対に置換し、かつ3'末端にミニヘアピンDNAを付加したrで示すvWF2-DsDsDs-mhGC（配列番号18）、さらにWF2-DsDsDs-mhGC（配列番号18）の中間部のループ部分をミニヘアピンDNAのループ部分配列（5′-GAA-3′）に置換したsで示すvWF2-DsDsDs-2mhGC（配列番号21）を調製した。また、陽性対照として既存のvWF結合性DNAアプタマーであるjで示すARC1172（配列番号10）も調製した。Dsを四角で、DsをAに置換した部位及びAT対をGC対に置換した部位を矢頭で、ミニヘアピンを付加した部位及びミニヘアピンDNAのループ部分に置換した部位を矢頭を付した四角で示す。 各種DNAアプタマーのvWF A1ドメインに対するゲルシフトアッセイによる結合解析結果（異なる温度でのゲルシフトアッセイ）を示す。A〜Cはそれぞれ、4℃/300V、25℃/40W、及び37℃/40Wで電気泳動を行った際の、SYBR GOLDによるDNAアプタマーの染色結果である。複合体はvWF A1ドメインに結合したDNAアプタマーを、遊離は遊離状態のDNAアプタマーを示す。m〜sは、それぞれ図6-1及び6-2のm〜sによって示されるアプタマーを用いた場合の結果を示す。jはARC1172を用いた場合の結果を示す。 各種DNAアプタマーのSPRによるvWF A1ドメインタンパク質に対する結合解析結果を示す。AはARC1172の、BはvWF2-DsDsDsの、CはvWF2-DsDsDs-2mhGCの結果を示す。 各種DNAアプタマーのヒト血清中における核酸分解酵素に対する安定性解析結果を示す。レーン左端のcはcontrolを指し、DNAアプタマーを加えていない血清のみの結果を示す。未分解のバンドを矢頭で示す。AはvWF2-DsDsDsの、BはvWF2-DsDsDs-mhGCの、CはvWF2-DsDsDs-2mhGCの、DはvWF2-AAAの、EはARC1172の結果を示す。 各種DNAアプタマーのTm値の測定結果を示す。Aは各温度におけるDNAアプタマーの標準吸光度を、Bは各温度におけるDNAアプタマーの標準化吸光度の一次導関数を示す。
１．定義
本明細書で使用する一般的な用語の定義について以下で説明する。
本明細書において「核酸」又は「核酸分子」とは、原則としてヌクレオチドを構成単位とし、それらがホスホジエステル結合によって連結した生体高分子をいう。
本明細書において「天然型ヌクレオチド」とは、自然界に存在するヌクレオチドであって、アデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの天然型塩基を有するデオキシリボヌクレオチドから構成されるDNA、及びアデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの天然塩基を有するリボヌクレオチドから構成されるRNA、又はそれらの組み合わせが挙げられる。
本明細書において「非天然型ヌクレオチド」とは、その塩基が人工塩基で構成されている自然界に存在しないヌクレオチドをいう。本発明における非天然型ヌクレオチドを構成するリン酸基及び糖は、天然型ヌクレオチドのリン酸基及び糖と構造的に同一である。
本明細書において「人工塩基」又は「塩基類似体」とは、天然型ヌクレオチドを構成する天然型塩基に類似の性質を有する人工的に構築された化学物質であって、天然型塩基と同様に、人工塩基対を形成することのできる相手となる塩基類似体（本明細書では、以降「相補的人工塩基」とする）を有する。本明細書において「人工塩基対合」とは、天然型塩基のアデニンとチミン、アデニンとウラシル、又はグアニンとシトシンのように、一対の相補的人工塩基が互いに形成する塩基対合をいう。人工塩基対合は、天然型塩基間の塩基対合に見られる水素結合を介した化学的結合、人工塩基間の分子構造に基づく嵌合を介した物理的結合、及び疎水性相互作用を介したスタッキング効果を含む。
人工塩基が有する「天然型塩基に類似の性質」には、人工塩基対合による相補性によって核酸の複製又は転写（逆転写を含む）が可能な性質を含む。人工塩基は、天然型塩基と同様に、人工塩基対合において排他的選択性を有する。したがって、基質ヌクレオチドに一対の相補的人工塩基を有する非天然型ヌクレオチドが存在すれば、非天然型ヌクレオチドを含む核酸分子であっても、人工塩基間の相補性によって、天然型ヌクレオチドと同様に正確な複製や転写ができる。それ故、非天然型ヌクレオチドを含みながら、PCR等の核酸増幅法によるDNA分子の増幅等が可能となる。
上記人工塩基の具体例として、Ds（7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl；本明細書では「Ds」とする）、Pn(2-nitropyrrole-1-yl；本明細書では「Pn」とする）、Pa（2-formyl-1H-pyrrole-1-yl；本明細書では「Pa」とする）、P(2-amino-imidazo[1,2-a]-1,3,5-triazin-4(8H)-one；本明細書では「P」とする）、Z(6-amino-5-nitro-2(1H)-pyridone；本明細書では「Z」とする）、5SICS（6-methylisoquinoline-1(2H)-thione；本明細書では「5SICS」とする）、NaM（3-methoxynaphthalen-2-yl；本明細書では「NaM」とする）、及びMMO2（2-methoxy-4-methylphenyl；本明細書では「MMO2」とする）が挙げられる。これらの人工塩基において、Dsの相補的人工塩基には、Pn、及びPaが挙げられる。Pの相補的人工塩基には、Zが挙げられる。5SICSの相補的人工塩基には、NaM、及びMMO2が挙げられる。
なお、人工塩基は、複製や転写の際、相補的人工塩基を有する非天然型ヌクレオチドが基質に含まれない場合には、相補的人工塩基と構造的に及び／又は性質的に近い天然型塩基と代替的に塩基対合することができる。この場合、鋳型となった核酸分子における非天然型ヌクレオチドは、複製又は転写後に天然型ヌクレオチドに置換されることとなる。例えば、Dsの場合、A又はTに置換されることが知られている。
本明細書において、「修飾塩基」とは、人工的に化学修飾された塩基を意味する。修飾塩基として、例えば、修飾化ピリミジン（例えば、5-ヒドロキシシトシン、5-フルオロウラシル、4-チオウラシル、5-(3-インドール-2-エチル)ウラシル、5-(4-ヒドロキシフェニル-2-エチル)ウラシル）、修飾化プリン（例えば、6-メチルアデニン、6-チオグアノシン）及び他の複素環塩基等が挙げられる。
本明細書において、「DNAアプタマー」とは、DNAで構成されるアプタマーであって、水素結合等を介した一本鎖核酸分子の二次構造、さらに三次構造に基づいて形成される立体構造によって標的分子と強固、かつ特異的に結合するリガンド分子をいう。DNAアプタマーが標的分子の生理活性等の機能を特異的に阻害又は抑制する能力を持つ場合には、DNAアプタマーは、標的分子の機能阻害剤となり得る。本明細書において「標的分子の機能阻害」とは、標的分子が有する触媒機能又は遺伝子発現制御機能（転写、翻訳、輸送等の制御を含む）、アポトーシス制御機能のような生物学的機能を阻害又は抑制することをいう。本明細書において「標的分子」とは、DNAアプタマーの結合対象となり得る物質をいい、本発明では標的分子としてvWFが挙げられる。
本明細書において、「vWF」は、von Willebrand factor（フォン・ウィルブランド因子）タンパク質（本明細書では、「vWFタンパク質」とも表記する）を指す。vWFは血中に存在する血液凝固因子の一つであり、その遺伝子変異はフォン・ウィルブランド病等の様々な疾患に関与することや、vWFへの自己抗体の産生によって後天性の血栓性血小板減少性紫斑病等が引き起こされることが知られている。本発明において、vWFの由来となる生物種は問わないが、例えば哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトのvWFが挙げられる。
vWFは、例えば、（a）配列番号28で示されるアミノ酸配列、（b）配列番号28で示されるアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列、又は（c）配列番号28で示されるアミノ酸配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。vWFはこれらのアミノ酸配列のいずれかからなるものであってもよい。本明細書において、同一性の値は、複数の配列間の同一性を演算するソフトウェア（例えば、FASTA、DANASYS、及びBLAST）を用いてデフォルトの設定で算出した値を示す。
本明細書において、vWFのA1ドメインとは、血小板上のGPIb受容体に対する結合能を有するvWF中のドメインを意味する。vWFのA1ドメインは、例えば、（a）配列番号28の1238位〜1481位のアミノ酸配列、（b）配列番号28の1238位〜1481位のアミノ酸配列において1又は数個のアミノ酸が付加、欠失、及び／又は置換されたアミノ酸配列、又は（c）配列番号28の1238位〜1481位のアミノ酸配列に対して、例えば70%以上、80%以上、好ましくは90%以上、95%以上、97%以上、98%以上、若しくは99%以上の同一性を有するアミノ酸配列を含む。vWFのA1ドメインはこれらのアミノ酸配列のいずれかからなるものであってもよい。
本明細書において、「数個」とは、例えば1〜6個、1〜5個、1〜4個、1〜3個、又は1〜2個を意味する。
本明細書において、「ミニヘアピン構造」は、以下の第１核酸領域、第2核酸領域、及び第3核酸領域の3つのDNA核酸領域がそれぞれ5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された構造を有する。ミニヘアピン型DNAは、核酸分解酵素に対する分解耐性を高め、及び／又はDNAアプタマーのTm値を上げることでDNAアプタマーの熱安定性を増加させ得る。
「第1核酸領域」とは、2〜5個の任意のヌクレオチドからなる核酸領域である。前記ヌクレオチドは、グアニン（G）、アデニン（A）、シトシン（C）又はチミン（T）の塩基を有するデオキシリボヌクレオチドをいう。本核酸領域の塩基は、好ましくはグアニン又はシトシンである。これは、後述する第3核酸領域との間でステム構造を形成するにあたり、GC含量が多いほどTm値も増加し、前記ステム構造を安定的に保持することができるからである。したがって、第1核酸領域の全塩基配列がG及び／又はCで構成されていることがもっとも好ましい。
「第2核酸領域」とは、5'‐GNA‐3'又は5'‐GNNA‐3'の塩基配列からなる核酸領域である。配列中の各Nは、独立に、天然型塩基（G、A、T、若しくはC）のいずれか、例えばTからなる。
「第3核酸領域」とは、第1核酸領域に対して相補的な塩基配列を有する核酸領域である。したがって、第3核酸領域の塩基配列は、第1核酸領域の塩基配列によって定まり、また第1核酸領域と第3核酸領域は、分子内で塩基対を形成する。その結果、第1核酸領域と第3核酸領域は、互いに完全に塩基対合したステム部分を、また第1核酸領域と第3核酸領域の間に存在する第2核酸領域は、ループ部分をそれぞれ構成し、全体として、7〜14個のヌクレオチドからなるミニヘアピン型DNAが形成される。ミニヘアピン型DNAの例として、CGCGTAGCG（配列番号26）に示す塩基配列からなるDNAが挙げられる。
２．vWFに結合するDNAアプタマー
一態様において、本発明は、以下の（i）又は（ii）の塩基配列を含む、vWFに結合するDNAアプタマーに関する：
（i）配列番号13〜16、19及び20のいずれか、好ましくは配列番号13、14、19及び20のいずれかに示される塩基配列、又は
（ii）（i）に示される塩基配列において、Ds以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
一実施形態において、（i）の塩基配列は、その末端に塩基対、例えばGC対を1〜5個、例えば、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個含む。末端の塩基対は、DNAアプタマーのTm値を上昇させ、熱安定性を向上させ得る。（i）の塩基配列は、これらの塩基対に加えて、又はこれらの塩基対に替えて、ミニヘアピン構造を形成する配列（以下、本明細書では「ミニヘアピン配列」とも称する）を、例えば3'末端側に含んでよい。
（i）の配列にミニヘアピン配列を付加した配列の例として、配列番号19に示される配列にミニヘアピン配列を付加した配列番号18に示される配列、及び配列番号20に示される配列にミニヘアピン配列を付加した配列番号21に示される配列が挙げられる。
したがって、一実施形態において、本発明は、配列番号18若しくは21に示される塩基配列、又は配列番号18若しくは21に示される塩基配列において、Ds以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、置換、及び／又は挿入された塩基配列を含む、vWFに結合するDNAアプタマーに関する。
一実施形態において、本発明のDNAアプタマーは、上記（i）若しくは（ii）の塩基配列、又は該塩基配列の末端に塩基対及び／又はミニヘアピン配列を付加した塩基配列からなる。
（i）又は（ii）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、vWF、例えばvWFのA1ドメインに結合する。
（i）又は（ii）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、解離定数KD及び／又は解離速度koffの点で、優れたvWFへの結合能を有し得る。本明細書において、KDとは、koff（解離速度）／kon（結合速度）で表される解離定数を指す。KDの値が小さい程、標的への親和性が強く、また、koffの値が小さい程、標的と結合した後に解離しにくいことを意味する。
（i）又は（ii）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、BiacoreによるvWFとの結合解析で、1.0×10-7、1.0×10-8、1.0×10-9、好ましくは5.0×10-10、3.0×10-10、1.0×10-10、又は8.0×10-11M以下のKDを有し得る。
（i）又は（ii）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、BiacoreによるvWFとの結合解析で、1.0×10-1、好ましくは9.0×10-2、8.0×10-2、7.0×10-2、6.0×10-2、又は5.0×10-2（1/Ms）以下のkoffを有し得る。
一態様において、本発明は、以下の（I）又は（II）の塩基配列を含む、vWFに結合するDNAアプタマーに関する：
（I）配列番号1〜4、9及び11のいずれか、好ましくは配列番号1又は11に示される塩基配列、又は
（II）（I）に示される塩基配列において、Ds以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
一実施形態において、（I）の塩基配列は、その末端に塩基対、例えばGC対を1〜5個、例えば、1〜4個、1〜3個、1〜2個、又は1個含む。末端の塩基対は、DNAアプタマーのTm値を上昇させ、熱安定性を向上させ得る。（I）の塩基配列は、これらの塩基対に加えて、又はこれらの塩基対に替えて、ミニヘアピン配列を、例えば3'末端側に含んでよい。
（I）の配列にミニヘアピン配列を付加した配列の例として、配列番号11に示される配列にミニヘアピン配列を付加した配列番号12に示される配列が挙げられる。
したがって、一実施形態において、本発明は、配列番号12に示される塩基配列、又は配列番号12に示される塩基配列において、Ds以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、置換、及び／又は挿入された塩基配列を含む、vWFに結合するDNAアプタマーに関する。
一実施形態において、本発明のDNAアプタマーは、（I）若しくは（II）の塩基配列、又は該塩基配列の末端に塩基対及び／又はミニヘアピン配列を付加した塩基配列からなる。
（I）又は（II）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、vWF、例えばvWFのA1ドメインに結合する。
（I）又は（II）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、特に解離速度koffの点で、優れたvWFへの結合能を有し得る。例えば、（I）又は（II）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、BiacoreによるvWFとの結合解析で、1.0×10-1、1.0×10-2、好ましくは5.0×10-3、4.0×10-3、3.0×10-3、又は2.0×10-3（1/Ms）以下のkoffを有し得る。
また、（I）又は（II）の塩基配列を含む本発明のDNAアプタマーは、BiacoreによるvWFとの結合解析で、1.0×10-6、1.0×10-7、1.0×10-8、好ましくは5.0×10-9、4.0×10-9、3.0×10-9、又は2.0×10-9M以下のKDを有し得る。
（i）若しくは（ii）、又は（I）若しくは（II）の配列を含むDNAアプタマー（以下、単に「本発明のDNAアプタマー」とも記載する）の長さは、例えば、150mer以下、140mer以下、130mer以下、120mer以下、110mer以下、好ましくは100mer以下、90mer以下、80mer以下、70mer以下、60mer以下又は50mer以下である。
本発明のDNAアプタマーは、Dsに加えて、任意に塩基類似体、他の人工塩基、又は他の修飾塩基等を含んでよい。
本発明のDNAアプタマーは、他の物質、例えばポリエチレングリコール（PEG）（例えば、約20〜約60kDaのPEG重合体）、アミノ酸、ペプチド、inverted dT、脂質、色素、蛍光物質、酵素、放射性物質、ビオチン等を付加することにより修飾されていてもよい。これらの物質は、必要に応じて公知のリンカーを介して連結してもよい。本明細書におけるリンカーの例として、ヌクレオチドリンカー、ペプチドリンカー、及びジスルフィド結合を含むリンカー等が挙げられる。PEGを連結することにより、一般にDNAアプタマーの半減期を伸ばすことができることが知られている。
本発明のDNAアプタマーの製造方法は特に限定しない。本分野で公知の方法を用いればよい。例えば、本発明のDNAアプタマーは、上記の配列に基づいて公知の固相合成法に従って化学合成することができる。核酸の化学合成法については、例えば、Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, Volume 1, Section 3を参照されたい。また、このような化学合成については、多くのライフサイエンス系メーカー（例えば、タカラバイオ株式会社、Sigma-Aldrich Corporation等）が受託製造サービスを行っており、それらを利用することもできる。DNAアプタマーの配列に基づいて幾つかの断片を合成した後に、分子内アニールやリガーゼによるライゲーション等によって断片を連結することによりDNAアプタマーを作製してもよい。
化学合成後の本発明のDNAアプタマーは、使用前に当該分野で公知の方法によって精製することが好ましい。精製方法としては、例えば、ゲル精製法、アフィニティーカラム精製法、HPLC法等が挙げられる。
３．DNAアプタマーを含む医薬組成物
一態様において、本発明は、本発明のDNAアプタマーを含む医薬組成物に関する。本発明の医薬組成物は、本発明のDNAアプタマーが有するvWFへの結合能を失わない範囲において、他の薬剤を一以上含有することもできる。
一実施形態において、本発明は、DNAアプタマーと他の薬剤とを含む、薬剤を病変部位に送達するための医薬組成物に関する。他の薬剤はDNAアプタマーに結合させてもよく、それにより、DNAアプタマーのvWFへの結合能を利用して、薬剤を病変部位に効率的に送達することが可能となる。DNAアプタマーと薬剤の結合方法は限定されるものではない。
本発明の医薬組成物の予防及び／又は治療の対象となる疾患は、vWFの遺伝子変異又は過剰発現等、及びvWFに対する自己抗体の生産等がその疾患の原因となり得る疾患（本明細書では、以下「vWF関連疾患」とも記載する）である。vWF関連疾患の例として、例えば、血栓症、血栓性血小板減少性紫斑病、頭蓋内塞栓、脳塞栓症、頸動脈狭窄、血栓性微小血管症、及び急性心筋梗塞症等が挙げられる。
これらの疾患に罹患した被験体に医薬組成物を投与することにより治療効果が、これらの疾患に罹患するリスクがある被験体に医薬組成物を投与することにより予防効果が期待される。
本発明の医薬組成物は、製薬上許容可能な担体を含むことができる。「製薬上許容可能な担体」とは、製剤技術分野において通常使用する医薬組成物の製剤化や生体への適用を容易にし、その作用を阻害又は抑制しない範囲で添加される物質をいう。担体には、例えば、賦形剤、結合剤、崩壊剤、充填剤、乳化剤、流動添加調節剤、潤滑沢剤、又は安定化剤が挙げられる。
「賦形剤」としては、例えば、単糖、二糖類、シクロデキストリン及び多糖類のような糖（具体的には、限定はしないが、グルコース、スクロース、ラクトース、ラフィノース、マンニトール、ソルビトール、イノシトール、デキストリン、マルトデキストリン、デンプン及びセルロースを含む）、金属塩（例えば、リン酸ナトリウム若しくはリン酸カルシウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム）、クエン酸、酒石酸、グリシン、低、中、高分子量のポリエチレングリコール（PEG）、プルロニック、或いはそれらの組み合わせが挙げられる。
「結合剤」としては、例えば、トウモロコシ、コムギ、コメ、若しくはジャガイモのデンプンを用いたデンプン糊、ゼラチン、トラガカント、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム及び／又はポリビニルピロリドン等が挙げられる。
「崩壊剤」としては、例えば、前記デンプンや、カルボキシメチルデンプン、架橋ポリビニルピロリドン、アガー、アルギン酸若しくはアルギン酸ナトリウム又はそれらの塩が挙げられる。
「充填剤」としては、例えば、前記糖及び／又はリン酸カルシウム（例えば、リン酸三カルシウム、若しくはリン酸水素カルシウム）が挙げられる。
「乳化剤」としては、例えば、ソルビタン脂肪酸エステル、グリセリン脂肪酸エステル、ショ糖脂肪酸エステル、プロピレングリコール脂肪酸エステルが挙げられる。
「流動添加調節剤」及び「滑沢剤」としては、例えば、ケイ酸塩、タルク、ステアリン酸塩又はポリエチレングリコールが挙げられる。
「安定化剤」としては、例えば、アスコルビン酸や亜硫酸塩等の酸化防止剤、トレハロースやブドウ糖等の糖類が挙げられる。
このような担体は、必要に応じて適宜使用すればよい。本発明の医薬組成物は、上記の添加剤の他、必要に応じて矯味矯臭剤、溶解補助剤（可溶化剤）、懸濁剤、希釈剤、界面活性剤、吸収促進剤（例えば、第4級アンモニウム塩類、ラウリル硫酸ナトリウム等）、増量剤、付湿剤、保湿剤（例えば、グリセリン、澱粉等）、吸着剤（例えば、澱粉、乳糖、カオリン、ベントナイト、コロイド状ケイ酸等）、崩壊抑制剤（例えば、白糖、ステアリン、カカオバター、水素添加油等）、コーティング剤、着色剤、保存剤、香料、風味剤、甘味剤、緩衝剤、等張化剤、無痛化剤、溶解補助剤等を含むこともできる。
「界面活性剤」としては、例えば、リグノスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、フェノールスルホン酸、ジブチルナフタレンスルホン酸のアルカリ金属塩、アルカリ土類金属塩及びアンモニウム塩、アルキルアリールスルホネート、アルキルスルフェート、アルキルスルホネート、脂肪アルコールスルフェート、脂肪酸及び硫酸化脂肪アルコールグリコールエーテル、さらに、スルホン化ナフタレン及びナフタレン誘導体とホルムアルデヒドの縮合物、ナフタレン又はナフタレンスルホン酸とフェノール及びホルムアルデヒドの縮合物、ポリオキシエチレンオクチルフェニルエーテル、エトキシル化イソオクチルフェノール、オクチルフェノール、ノニルフェノール、アルキルフェニルポリグリコールエーテル、トリブチルフェニルポリグリコールエーテル、トリステアリルフェニルポリグリコールエーテル、アルキルアリールポリエーテルアルコール、アルコール及び脂肪アルコール／エチレンオキシドの縮合物、エトキシル化ヒマシ油、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、エトキシル化ポリオキシプロピレン、ラウリルアルコールポリグリコールエーテルアセタール、ソルビトールエステル、リグノ亜硫酸廃液、及びメチルセルロースが該当する。
本実施形態の医薬組成物は、一医薬組成物中に上記担体を一以上包含することが可能である。
本発明の医薬組成物の剤形は、有効成分を不活化させない形態であって、投与後、生体内でその薬理効果を発揮し得る形態であれば特に限定しない。通常は、投与方法及び／又は処方条件によって異なる。
例えば、経口投与に適した剤形としては、固形剤（錠剤、丸剤、舌下剤、カプセル剤、ドロップ剤、トローチ剤を含む）、顆粒剤、粉剤、散剤、液剤等を挙げることができる。さらに固形剤は、必要に応じ、当該分野で公知の剤皮を施した剤形、例えば、糖衣錠、ゼラチン被包錠、腸溶錠、フィルムコーティング錠、二重錠、多層錠とすることができる。
非経口投与は、全身投与及び局所投与に細分され、局所投与は、組織内投与、経表皮投与、経粘膜投与及び経直腸的投与にさらに細分されるが、医薬組成物も、それぞれの投与方法に適した剤形にすることができる。全身又は組織内投与に適した剤形としては、例えば、液剤である注射剤が挙げられる。経表皮投与又は経粘膜投与に適した剤形としては、例えば、液剤（塗布剤、点眼剤、点鼻剤、吸引剤を含む）、懸濁剤（乳剤、クリーム剤を含む）、粉剤（点鼻剤、吸引剤を含む）、ペースト剤、ゲル剤、軟膏剤、硬膏剤等を挙げることができる。経直腸的投与に適した剤形としては、例えば、坐剤等を挙げることができる。
なお、上記各剤形の具体的な形状、大きさについては、いずれもそれぞれの剤形において当該分野で公知の剤形の範囲内にあればよく、特に限定はしない。
本発明の医薬組成物を製造するには、原則として当該分野で公知の製剤化方法を応用すればよい。例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（Merck Publishing Co．，Easton，Pa．）に記載の方法を参照することができる。
例えば、注射剤の場合には、本発明のDNAアプタマーを製薬上許容可能な溶媒に溶解し、必要に応じて製薬上許容可能な担体を加え、当該分野で慣用されている方法により製造することができる。
「薬学的に許容可能な溶媒」としては、例えば、水、エタノール、プロピレングリコール、エトキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシ化イソステアリルアルコール、ポリオキシエチレンソルビタン脂肪酸エステル類等が挙げられる。これらは、必要に応じて血液と等張に調整されていることが好ましい。
本発明の医薬組成物は、目的とする癌等の疾患の治療又は予防のために製薬上有効な量を生体に投与することができる。投与する対象となる生体は、脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。
本発明の医薬組成物は、全身投与又は局所的投与のいずれにより投与されてもよい。疾患の種類、発症箇所又は進行度等に応じて適宜選択することができる。発症箇所が局部的な疾患であれば、注射などにより発症箇所及びその周辺に直接投与する局所的投与が好ましい。治療すべき箇所（組織又は器官）に本発明のDNAアプタマーを十分量投与することができ、また他の組織に影響を及ぼしにくいからである。一方、治療箇所を特定できない場合や発症が全身性の疾患の場合には、限定はしないが、静脈注射等による全身投与が好ましい。血流を介して本発明のDNAアプタマーを全身に行き渡らせることで、診断で発見できない病変部にも投与が可能となるからである。
本発明の医薬組成物は、有効成分が失活しないあらゆる適当な方法で投与することができる。例えば、非経口（例えば、注射、エアロゾル、塗布、点眼、点鼻）又は経口のいずれであってもよい。好ましくは、注射である。
注射による投与の場合、注入部位は、特に限定しない。有効成分であるDNAアプタマーが標的物質に結合することができれば、いずれの部位であってもよい。例えば、静脈内、動脈内、肝臓内、筋肉内、関節内、骨髄内、髄腔内、心室内、経肺、経皮、皮下、皮内、及び腹腔内等が挙げられる。
４．DNAアプタマーを用いる治療及び／又は予防方法
一態様において、本発明は本発明のDNAアプタマー又は上記医薬組成物を被験体に投与することを含む、疾患の治療及び／又は予防方法に関する。
本発明の医薬組成物の予防及び／又は治療の対象となる疾患は、vWF関連疾患である。例えば、血栓症、血栓性血小板減少性紫斑病、頭蓋内塞栓、脳塞栓症、頸動脈狭窄、血栓性微小血管症、及び急性心筋梗塞症等が挙げられる。
本明細書において、「被験体」となり得る動物種は、例えば哺乳動物、例えばヒト及びチンパンジーなどの霊長類、ラット及びマウス等の実験動物、ブタ、ウシ、ウマ、ヒツジ、及びヤギ等の家畜動物、並びにイヌ及びネコ等の愛玩動物、好ましくはヒトである。
５．DNAアプタマーを含む検出剤
一態様において、本発明は、本発明のDNAアプタマーを含むvWF検出剤に関する。本発明のvWF検出剤は、本発明のDNAアプタマーのvWFへの結合能を利用して、in vivo又はin vitroにおいてvWFを検出するための薬剤である。例えば、DNAアプタマーをあらかじめ蛍光試薬等で標識し、これを投与することによって、生体内でvWFの発現強度を決定し、またその局在を調べることができる。これによって、上記vWF関連疾患の診断を補助することが可能となり得る。本発明のDNAアプタマーは、イメージング及び組織染色等において有用である。
一実施形態において、本発明は、本発明のDNAアプタマーを含むvWF検出用組成物に関する。組成物の構成については上記医薬組成物と同様であるから、ここでは記載を省略する。
一態様において、本発明は、本発明のDNAアプタマーを含むvWF検出用キットに関する。本発明のキットは、本発明のDNAアプタマーに加えて、バッファー、標識試薬、及び／又は説明書等を含んでよい。
６．vWFの検出方法
一態様において、本発明は、vWFを検出する方法に関する。本方法は、被験体から得られたサンプルを、本発明のDNAアプタマーと接触させる工程、及びサンプルとDNAアプタマーの結合に基づいてvWFを検出する工程を含む。本方法によって、上記vWF関連疾患の診断を補助することが可能となり得る。
本方法において用いるサンプルとしては、組織及び生体試料が挙げられる。組織の例として、病変部位、例えば、脳、心臓、肝臓、膵臓、肺、骨髄、リンパ節、及び脾臓等が挙げられ、例えばこれらの組織の生検サンプルを用いることができる。生体試料の例として、例えば、血液、血漿、リンパ液、組織液、尿、並びに細胞、例えば末梢血細胞、毛母細胞、口腔細胞、鼻腔細胞、腸管細胞、膣内細胞、粘膜細胞、及び喀痰（肺胞細胞又は気肝細胞等を含み得る）等、好ましくは血液又は血漿が挙げられる。
本発明の検出方法の検出工程は、サンプルとDNAアプタマーの結合を利用するものであれば特に限定せず、公知の方法を用いればよい。例えば、SPR法、比濁法、比色法又は蛍光法を利用することができる。
SPR（表面プラズモン共鳴）は、金属薄膜にレーザー光を照射すると特定の入射角度（共鳴角）において反射光強度が著しく減衰する現象をいう。SPR法は、この現象を利用した測定方法で、センサ部である金属薄膜表面上の吸着物を高感度に測定することができる。本発明においては、例えば、予め本発明のDNAアプタマーを金属薄膜表面上に固定化しておき、その金属薄膜表面上に試料を通過させ、当該核酸分子と標的物質との結合によって生じる試料通過前後の金属表面上の吸着物の差を検出することにより試料中の標的物質を検出することができる。SPR法には、置換法、間接競合法等が知られるがいずれを用いてもよい。
比濁法は、溶液に光を照射し、溶液中に浮遊する物質によって散乱する散乱光の減衰又はその溶液を通過した透過光を、比色計等を用いて光学的に計測することにより溶液中の物質量を測定する方法である。本発明においては、試料中に本発明のDNAアプタマーを添加する前後の吸光度を計測することによって、試料中の標的物質を定量的に検出することができる。
また、標的物質に対する抗体と併用することにより標的物質を検出することもできる。例えば、ELISA法のサンドイッチ法を応用した方法を用いてもよい。この方法では、まず、固相担体に本発明のDNAアプタマーを固定しておき、次に試料を加えて、試料中に存在する標的物質と前記DNAアプタマーとを結合させる。続いて、試料を洗い流した後、抗標的物質抗体を加えて標的物質に結合させる。洗浄後、適当な標識をした二次抗体を用いて抗標的物質抗体を検出することにより、試料中の標的物質を検出することができる。固相担体としては、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリビニルトルエン、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリ塩化ビニル、ナイロン、ポリメタクリレート、ラテックス、ゼラチン、アガロース、セルロース、セファロース、ガラス、金属、セラミックス又は磁性体等の材質よりなるビーズ、マイクロプレート、試験管、スティック又は試験片等の形状の不溶性担体を用いることができる。
一態様において、本発明は、被験体においてvWF関連疾患の罹患の有無の診断を補助する方法に関する。本方法は、被験体に本発明のDNAアプタマー又は本発明のvWF検出用組成を投与する工程、及びDNAアプタマーを検出する工程を含む。例えば、生体内で特定の部位でDNAアプタマーが高濃度で検出された場合には、その部位において疾患が生じていると判断することができる。検出工程は、公知の方法を用いればよく、例えば上記蛍光法を用いることができる。
＜実施例1：DsプレデターミンDNAライブラリーを用いたvWFに結合するDNAアプタマーの選抜＞
WO2013/073602に記載のプレデターミン法に従って人工塩基Dsを含むDNAライブラリーの調製を行った。プレデターミン法で用いるライブラリーは、ランダムな塩基配列中の特定の固定された位置に人工塩基Dsを含むようにデザインされたものである。手短には、DNA断片（分子種総数は300 pmol、約2×1014分子）を1ラウンド目のライブラリーとして用い、標的タンパク質であるvWF A1ドメイン（U-Protein社、V003）を混合した後、磁気ビーズを用いて標的タンパク質に結合するDNAを選別及び単離し、さらにポリアクリルアミドゲル電気泳動を行いDNA-vWF A1ドメイン複合体を切り出すことにより選別及び単離後、PCR増幅を行い、計8ラウンドのセレクション操作を行った。各セレクションの条件は表1に示した。8ラウンドのセレクション終了後、配列の解析を行い、人工塩基Dsを含むDNAアプタマーの配列を得た。
Figure 0006721189
8ラウンド後に得られたDNAライブラリーのシークエンス解析の結果、解析対象となる総配列として420526配列が得られた。WO2013/073602に記載の解析方法によって、100クローン以上の配列群の中から、人工塩基が残存していると推測される配列の抽出を行ったところ、計406086配列が抽出された。その配列数を集計したところ、最上位配列は単一配列で、全体の80%以上、類似配列を含めると全体の90%を占めていた。
＜実施例2：DNAアプタマーの配列決定＞
人工塩基Dsの位置を正確に同定するため、以下の操作を行い、正確な配列決定を行った。
実施例1で得られた最上位配列に特異的になるようにデザインした25塩基からなるDNA断片のプローブ配列：5'-ACTCCCTCGGTTGTTGGCGAAAGTTG-3'（配列番号22）を用いた。このプローブは5'末端をビオチン化標識したものをThermo Fisher Scientific社から化学合成及び簡易精製済みのものを購入して使用した。8ラウンド後に得られたDNA断片をdDsTPとDiol1-dPxTPでPCR増幅して調製した一本鎖DNAライブラリーを、100 nM / 1×結合溶液（20 mM Tris-HCl、0.5 M NaCl、10 mM MgCl2、pH 7.6）となるように溶液で希釈し、その溶液20 μlとビオチン化プローブ（5 μM、1 μl）を混合した。その後、アニーリング操作（90℃3分、−0.1℃／秒で徐冷、−55℃ 15分）を行い、1×結合溶液に置換したストレプトアビジン磁気ビーズ（5μL）と混合し、55℃で5分間インキュベートすることでビオチン化プローブ及びプローブに相補的にハイブリダイズしたDNA断片を磁気ビーズに固定化した。磁気スタンドを使用して溶液を取り除き、プローブにハイブリダイズしていない余剰のDNA断片を取り除いた後、磁気ビーズを150 μLの1×結合溶液（55℃）で5回洗浄した。その後、洗浄後の磁気ビーズに滅菌水20 μLを添加し、75℃で5分間加熱した後に直ぐに溶液を回収することで、プローブにハイブリダイズしたDNA断片を回収した。
人工塩基Dsを含むDNAのシークエンシング解析では、通常のダイターミネーターによるシーケンス反応中に、人工塩基Dsに相補的な基質としてddPa'TP若しくはdPa'TP、又は人工塩基Dsの相補塩基であるPxに相補的な基質としてddDsTP若しくはdDsTPを加えると、シーケンスパターンが異なってくることから、シーケンスの鋳型に用いたDNA断片中の人工塩基Dsの有無、及び正確な位置を調べることができる。そこで、プローブを用いて回収したDNA断片を鋳型に用いて、以下の2種類の方法（（i）及び（ii））によってDNAシークエンシングを行った。
（i）回収したDNA溶液10 μlを用いてdDsTP、Diol1-dPxTP存在下、AccuPrime Pfx DNA ポリメラーゼを用いた15サイクルのPCR増幅後、ゲル精製により回収した断片を20 μlの水に溶かし、その溶液を鋳型として、0.05 mM ddPa'TP存在下、0.05 mM dPa'TP存在下、又は0.05 mM ddDsTP存在下、0.05 mM dDsTP存在下でシーケンスした（この方法では、回収したDNAが人工塩基Dsを保持していれば、DsはPCR中も保持される）。
（ii）回収したDNA溶液10 μlを用いて、0.05 mM dPa'TP存在下、AccuPrime Pfx DNA ポリメラーゼを用いた15サイクルのPCR増幅後、ゲル精製により回収した断片を20 μlの水に溶かし、その溶液を鋳型として、0.05 mM ddPa'TP存在下、0.05 mM dPa'TP存在下、又は0.05 mM ddDsTP存在下、0.05 mM dDsTP存在下でシーケンスした（この方法では、回収したDNAが人工塩基Dsを保持していれば、Dsの位置はPCR後にA若しくはTに置換される）。
具体的には、DNAシークエンシング反応は、全量20 μLにて、市販のBigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit（Thermo Fisher Scientific）を用いて行った。シーケンスプライマーには、5'- ACGACCGTTCTCTAATTTTGACGTT-3'（配列番号23）、及び5'-ACCAAATTATTGCGATACAGACCCT-3'（配列番号24）を用いて、PCR増幅及び精製した2本鎖DNA断片（0.15 pmol程度）、ddPa'TP若しくはdPa'TP、又はddDsTP若しくはdDsTP（500pmol）を反応溶液中に加え、25サイクルのPCR（96℃ 10秒、50℃ 5秒、60℃ 4分）を行った。未反応のダイターミネーターを脱塩カラム処理にて除去し、残りの溶液を減圧下で乾燥した。残存物にBlue-Dextranを希釈したホルムアミド溶液を4 μl加えて、その一部をABI377DNAシーケンサーにより解析した。配列のピークパターンは、Applied Biosystems PRISMシークエンシング解析ソフトv3.2ソフトウェアを用いて解析した。
シーケンスパターンを解析した結果、Px鎖側を鋳型としたシーケンス反応サンプルにおいて、人工塩基鋳型では3箇所に人工塩基を示すパターン（ギャップ）が現れたのに対して、天然置換DNAを鋳型としたシーケンス反応サンプルにおいてはAのピークが示されており、このことからタグ配列で示された2箇所のDsの位置（ランダム領域6番目と15番目）に加えて、19番目にも人工塩基Dsが存在することが分かった。
＜実施例3：DNAアプタマーのゲルシフトアッセイによる結合活性解析＞
配列同定した人工塩基Dsを3箇所に含むDNAアプタマーのvWF A1ドメインタンパクに対する結合を調べるために、プライマー領域を切り詰めた40-mer及び38-merのDNAアプタマーを調製した。調製した各DNAアプタマーの名称及び配列を表2に、セレクションで得られた塩基配列等から予測される二次構造を図1に示す。
Figure 0006721189
vWF1-DsDsDs（配列番号1）を元に、3'末端側のDsをAに置換したvWF1-DsDsA（配列番号2）、中間部のDsをAに置換したvWF1-DsADs（配列番号3）、5'末端側のDsをAに置換したvWF1-ADsDs（配列番号4）、中間部と3'末端側のDsをAに置換したvWF1-DsAA（配列番号5）、5'末端側と3'末端側のDsをAに置換したvWF1-ADsA（配列番号6）、5'末端側と中間部のDsをAに置換したvWF1-AADs（配列番号7）、全てのDsをAに置換したvWF1-AAA（配列番号8）、3'末端側のDsをAに置換し、ステム部分の末端のAT対を除いたvWF1-R1Ds（配列番号9）を調製した。また、陽性対照として既存のvWF結合性DNAアプタマーであるARC1172（配列番号10）も調製し、解析に用いた。各DNAアプタマーは、化学合成により常法に従って調製した。
合成したDNAアプタマーの結合能の解析はゲルシフトアッセイによって行った。具体的には、20μLの反応液（1×PBS、0.005% Nonidet P-40）中に、各DNAアプタマー（100 nM）、及びvWF A1ドメイン（100 nM、U-Protein社、V003）を懸濁し、37℃で30分間インキュベートした。その後、ブロモフェノールブルーを含む25％グリセロールを終濃度5％グリセロールとなるように加え、4℃で8％非変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行い、vWF A1ドメインに結合した各DNAアプタマーと遊離状態の各DNAアプタマーとを分離した。その後、1×TBE溶液で1/20000に希釈したSYBR Gold（Thermo Fisher Scientific）を用いてDNAアプタマーを染色し、バイオイメージアナライザーLAS-4000（富士フィルム）によって検出した。ゲルシフト率は、バンドから推定される複合体の量を、遊離及び複合体の量で割った数値の百分率として算出した。
結果を、図2に示す。ゲルシフトアッセイの結果、DsをAに置換したいずれのDNAアプタマー（vWF1-DsDsA（b）、vWF1-DsADs（c）、及びvWF1-ADsDs（d））においても結合の低下が認められたことから、3つの人工塩基Ds全てが結合に関与していることが示された。vWF1-ADsDs（d）においては結合の低下が小さかったことから、特に、5'側及び中間部のDsが強く結合に関与していることが示された。また、vWF1-DsDsDs（a）は、陽性対照とした既存のvWF結合性DNAアプタマーであるARC1172（j）よりも強い結合力を示した。
＜実施例4：DNAアプタマーのvWFに対する結合のBiacoreによる解析＞
得られたDNAアプタマーの結合能をGEヘルスケア社のBiacoreT200を用いた表面プラズモン共鳴（SPR）によって測定した。解析に用いた各種DNAアプタマーの配列を上記表2に、予測される二次構造を図3に示す。vWF1-DsDsDs（配列番号1）を元に、三つのDsをAに置換したvWF1-AAA（配列番号8）、ステム領域のAT対の一部をGC対に置換したvWF1-DsDsDs-GC（配列番号11）、vWF1-DsDsDs-GC の3'末端にミニヘアピンを付加したvWF1-DsDsDs-mhGC（配列番号12）を調製した。また、陽性対照として、ARC1172（配列番号10）を用いた。
これら各DNAアプタマーは、それぞれ図中に示される塩基配列を有する核酸をビオチン標識されたものとして化学合成によって調製し、変性アクリルアミドゲルにて精製した。それぞれの核酸断片はリン酸緩衝液（pH 7.4）にて混合し、95℃で加熱後25℃まで徐冷することでフォールディング（再構築）させて調製した。そして、SPRのセンサーチップとしてストレプトアビジンがコートされたSAチップ（GEヘルスケア）を用い、DNAアプタマーをチップへ不可逆的に固定化後、vWF A1ドメインへの結合を解析した。なお、SPRの測定条件は、ランニングバッファー（155 mM NaClを含むリン酸バッファー、0.05% Nonidet P-40）、設定温度37℃で行った。各DNAアプタマーのセンサーチップへの固定化は、25 nMとなるようにPBS溶液で希釈したDNA溶液をフォールディング処理（95℃、3分間加熱変性後、25℃まで徐冷）した後、最終濃度0.05％となるようにNonidet P-40を加えた。そのDNA溶液を流速5μL/minで40 μL（8分間相当）インジェクションすることで、SAチップに固定化した。また、固定化後、流速20μL/minで、50 mM NaOH溶液をインジェクション(5 μL、5回)することにより、SAチップに非特異的に吸着されているDNAアプタマーを洗浄した。固定化されたDNAアプタマーとvWF A1ドメインとの相互作用検出は、0 nM、0.3125 nM、0.625 nM、1.25 nM、2.5 nM、5 nM、10 nM及び20 nMのvWF A1ドメイン溶液（ランニングバッファーで希釈）をKinetic Injectioｎモードによってインジェクションすることでモニターした。測定条件は流速100 μL/min、タンパク質インジェクション時間は150秒である。チップの再生（結合タンパク質の解離及びDNAのリフォールディング）は50 mM NaOHの溶液を5 μL（15秒相当）インジェクション後、10分間ランニングバッファーを流すことで行った。各DNAアプタマーのセンサーグラムは、センサーチップに対するバルク効果や非特異的吸着によるレスポンス値を差し引くために、DNAを固定化していないセルをリファレンスのセルとして、そのレスポンス値を各DNAアプタマーのセンサーグラムから差し引いた。
結果を図4に示す。本測定の結果、各DNAアプタマーのKD値は、1.03 nM（vWF1-DsDsDs）、1.08 nM（vWF1-DsDsDs-GC）、0.78 nM（vWF1-DsDsDs-GCmh）であったことから、ミニヘアピンDNAを3'末端に付加することで結合力が向上していることが示された。ミニヘアピンDNAを付加したDNAアプタマー(vWF1-DsDsDs-GCmh)のKD値は、従来型のARC1172のKD値と同程度であるが、koffの値は従来の核酸アプタマーよりも顕著に低かった（ARC1172：koff＝0.162（1/s）、vWF1-DsDsDs-GCmh：koff=0.00159（1/s））。
＜実施例5：DNAアプタマーのTm値分析＞
各種DNAアプタマー（vWF1-DsDsDs、vWF1-DsDsDs-GC、vWF1-DsDsDs-GCmh、vWF1-AAA最終濃度：2 μM）の熱安定性（Tm値）を測定した。DNAアプタマーの吸光度変化を、紫外可視分光光度計 UV-2450（島津）により測定し、その一次微分から融解温度であるTm値を算出した。結果を図5に示す。vWF1-DsDsDsはTm = 65.7℃、vWF1-DsDsDs-GCはTm = 73.0℃、vWF1-DsDsDs-mhGCはTm = 74.7℃と、ステム部分のGC対の増加及びミニヘアピンDNAの付加により熱安定性が向上していることが示された。特に、vWF1-DsDsDs-GC及びvWF1-DsDsDs-mhGCは、既存のDNAアプタマーであるARC1172と比較してもTm値が10℃以上高く、熱安定性がARC1172より顕著に優れていた。一方で、DsをAに置換したvWF1-AAAはTm = 63.0℃と僅かに低下しており、Ds自体が熱安定性に関与していることが示された。
＜実施例6：ランダムDNAライブラリーを用いたvWFに結合するDNAアプタマーの選抜＞
WO2013/073602に記載のランダムライブラリー法に従って、人工塩基Dsを含むDNAライブラリーの調製を行った。ランダムライブラリー法で用いるライブラリーは、ランダムな塩基配列中のランダムな位置に所定の確率で人工塩基Dsを含むようにデザインされたものである。セレクション方法は実施例1の方法に従って行った。手短には、DNA断片（分子種総数は300 pmol、すなわち約2×1014分子）を1ラウンド目のライブラリーとして用い、標的タンパク質であるvWF A1ドメイン（U-Protein社、V003）を混合した後、磁気ビーズを用いて標的タンパク質に結合するDNAを選別及び単離し、さらにポリアクリルアミドゲル電気泳動によってDNA-vWF A1ドメイン複合体を切り出すことにより選別及び単離後、PCR増幅し、計7ラウンドのセレクション操作を行った。各セレクションラウンドの条件は表3に示した。7ラウンドのセレクション終了後、配列の解析を行い、人工塩基Dsを含むDNAアプタマー配列を得た。
Figure 0006721189
7ラウンド後に得られたDNAライブラリーのシークエンス解析の結果、解析対象となる総配列として151,495配列が得られた。上記解析方法によって、100クローン以上の配列群を抽出し、類似配列をもつクローンを集計したところ、最上位配列は単一配列で、全体の44%以上を占め、類似配列を含めると全体の84%を占めていた。最上位配列を含む配列群にはA又はTのみの出現率が高い部位が3箇所認められた。
＜実施例7：DNAアプタマーの配列決定＞
人工塩基Dsの位置を正確に同定するため、以下の操作を行い、正確な配列決定を行った。
実施例6で得られた最上位配列に特異的になるようにデザインした25塩基からなるDNA断片のプローブ配列：5'-CGTTGAGACCTGTTAGGTGCTCTTC-3'（配列番号25）を用いた。このプローブは、5'末端をビオチン化標識したものをThermo Fisher Scientific社から化学合成及び簡易精製済みのものを購入して使用した。プローブを用いたライブラリーからの目的配列の単離操作は実施例2と同様に行った。
人工塩基Dsを含むDNAのシークエンシング解析は、実施例2と同様の手法で行った。シーケンスパターンを解析した結果、Px鎖側を鋳型としたシーケンス反応サンプルにおいて、人工塩基鋳型では3箇所に人工塩基を示すパターン（ギャップ）が現れたのに対して、天然置換DNAを鋳型としたシーケンス反応サンプルにおいてはAのピークが示されており、このことから3箇所（ランダム領域9番目、21番目、32番目）に人工塩基Dsが存在することが分かった。
＜実施例8：DNAアプタマーのゲルシフトアッセイによる結合活性解析＞
配列同定した人工塩基Dsを3箇所に含むDNAアプタマーのvWF A1ドメインタンパクに対する結合を調べるために、プライマー領域を切り詰めたDNAアプタマーを作製し、ゲルシフトアッセイによって結合解析を行った。本実施例に使用したDNAアプタマーの配列を表4に、予想される二次構造を図6に示した。
Figure 0006721189
vWF2-DsDsDs（配列番号13）を元に、中間部のDsをAに置換したvWF2-DsADs（配列番号14）、中間部及び3'末端側のDsをAに置換したvWF2-DsAA（配列番号15）、5'末端側及び中間部のDsをAに置換したvWF2-AADs（配列番号16）、全てのDsをAに置換したvWF2-AAA（配列番号17）、ステム部分のA-T塩基対をG-C塩基対に置換し、かつ3'末端にミニヘアピンDNAを付加したvWF2-DsDsDs-mhGC（配列番号18）を調製した。また、WF2-DsDsDs-mhGC（配列番号18）を元に、WF2-DsDsDs-mhGCの中間部のループ部分をミニヘアピンDNAのループ部分配列（5′-GAA-3′）に置換したvWF2-DsDsDs-2mhGC（配列番号21）を調製した。また、既存のDNAアプタマーであるARC1172（配列番号10）も調製した。各DNAアプタマーは、化学合成により常法に従って調製した。
ゲルシフトアッセイは、泳動を4℃/300V、25℃/40W、37℃/40Wの三つの条件で行う以外は、実施例3と同様に行った。
結果を、図7に示す。ゲルシフトアッセイの結果、vWF2-DsDsDs（m）に対して、vWF2-DsADs（n）では結合の低下が認められず、vWF2-DsAA（o）及びvWF2-AADs（p）で結合の低下が認められたことから、3つの人工塩基Dsのうち5'側と3'側のDsが結合に関与していることが示された。特に、vWF2-DsAA（o）で大きな結合の低下が認められたことから、3'側のDsが結合に大きく関与していることが示された。また陽性対照として用いたARC1172（j）と比較すると、ARC1172は25℃〜37℃での電気泳動では結合がほぼ見られなくなっているのに対して、人工塩基Dsを含むvWF2-DsDsDs（m）、vWF2-DsADs（n）、vWF2-DsDsDs-mhGC（r）、及びvWF2-DsDsDs-2mhGC（s）は、25℃〜37℃の電気泳動でも結合を維持していた。
＜実施例9：DNAアプタマーのvWFに対する結合のBiacoreによる解析＞
得られたDNAアプタマーの結合能をGEヘルスケア社のBiacoreT200を用いた表面プラズモン共鳴（SPR）により測定した。解析に用いたDNAアプタマーの配列は、上記表4に示し、セレクションで得られた塩基配列等から予測される二次構造を図6に示した。
これら各DNAアプタマー変異体は、それぞれ図中に示される塩基配列を有する核酸を化学合成によって調製し、その後、変性アクリルアミドゲルにて精製した。それぞれの核酸断片はリン酸緩衝液（pH 7.4）にて混合し、95℃で加熱後25℃まで徐冷することでフォールディング（再構築）させて調製した。SPRによる結合解析は、DNAアプタマーとvWF A1ドメインとの相互作用検出を、0 nM、0.078125 nM、0.15625 nM、0.3125 nM、0.625 nM、1.25 nM、2.5 nM及び5 nMで行った以外は、実施例4と同様に行った。
結果を図8に示す。本測定の結果、各DNAアプタマーのKD値は、326 pM（ARC1172）、74.9 pM（vWF2-DsDsDs)、61.3 pM（Bio-vWF2-DsDsDs-2mhGC）であった。ミニヘアピンDNAを3'末端に付加し、内部のステムループをミニヘアピンに置換し、かつステム領域のA-T塩基対をG-C塩基対に置換することで結合力が向上した。本実施例で得られた人工塩基Dsを含むDNAアプタマーは、陽性対照として用いた既存のvWF結合性DNAアプタマーARC1172と比較して、より高い結合能を有していた（図8）。
＜実施例10：DNAアプタマーのヒト血清中における安定性解析＞
各DNAアプタマーのヒト血清中に含まれる核酸分解酵素に対する安定性を調べた。各DNAアプタマー（vWF2-DsDsDs、vWF2-DsDsDs-mhGC、vWF2-DsDsDs-2mhGC、vWF2-AAA、ARC1172、最終濃度2 μＭ）を、ヒト血清濃度が96％となるように混合し、この溶液を37℃でインキュベートした。0時間後、1時間後、6時間後、24時間後、48時間後、及び72時間後に混合溶液から10 μLを分取し、110μLの1×TBE、10M Urea溶液と混合して分解反応を止めた。反応後のサンプルを変性15％ポリアクリルアミドゲル電気泳動で分離した後、ゲルをSYBR GOLD（Thermo Fisher Scientific）で染色して1本鎖核酸を検出した。ヒト血清中の核酸分解酵素による分解産物のバンドパターンをバイオイメージャーLAS-4000（富士フィルム）で解析した。
結果を図9に、0h時間を100%としたときの、未分解のバンドの濃さから推定される各DNAアプタマーの各時間における残存割合（%）を表5に示す。
Figure 0006721189
vWF2-DsDsDs-mhGC及びvWF2-DsDsDs-2mhGCでは、vWF-DsDsDsに比べて残存する完全長DNAアプタマーの量が顕著に多く、これは血清中に含まれる核酸分解酵素に対する安定性が向上していたことを示唆している。陽性対照として用いたARC1172は37℃、72時間のインキュベートの後、その残存割合が20%であったのに対して、vWF2-DsDsDs-2mhGCでは72時間後でも75%が残存していた。以上より、本発明のDNAアプタマーはARC1172よりも核酸分解酵素に対する安定性が高く、ミニヘアピン配列を付加することにより、さらに血清中の核酸分解酵素に対する安定性を大幅に改善することができることが示された。
＜実施例11：DNAアプタマーの熱安定性解析＞
各DNAアプタマー（vWF2-DsDsDs、vWF2-DsADs、vWF2-DsAA、vWF2-AADs、vWF2-AAA、vWF2-DsDsDs-mhGC、vWF2-DsDsDs-2mhGC、最終濃度2 μM）の熱安定性（Tm値）を測定した。DNAアプタマーの吸光度変化を、紫外可視分光光度計 UV-2450（島津）により測定し、その一次微分から融解温度であるTm値を算出した。
結果を図10に示す。vWF2-DsDsDsはTm = 66.8℃、vWF2-DsADsはTm = 63.5℃、vWF2-DsAAはTm = 62.0℃、vWF2-AADsはTm = 61.5℃、vWF2-AAAはTm = 60.0℃、 vWF2-DsDsDs-mhGCはTm = 75.5℃、vWF2-DsDsDs-2mhGCはTm = 76.5℃であった。以上の通り、ステム配列中のA-T塩基対をG-C塩基対に置換し、3'末端にミニヘアピンDNAを付加することによって、Tm値が約9℃上昇し、さらに内部のステムループ部分をミニヘアピン配列に置き換えることで、Tm値が約10℃上昇した。以上の通り、より高い温度でも安定な構造をとるDNAアプタマーを作製することができた。
本明細書で引用した全ての刊行物、特許及び特許出願はそのまま引用により本明細書に組み入れられるものとする。

Claims (17)

  1. 以下の（i）又は（ii）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー： （i）配列番号13〜16、19及び20のいずれかに示される塩基配列、又は
    （ii）（i）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
  2. （i）の塩基配列が、配列番号13、14、19又は20に示される配列である、請求項１に記載のDNAアプタマー。
  3. 1〜5個のGC対を塩基配列の末端に含む、請求項１又は２に記載のDNAアプタマー。
  4. 塩基配列の3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
    前記ミニヘアピン構造が、
    5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：
    （A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
    （B）GNA又はGNNA（ここで、各Nは、独立に、G、T、A若しくはCのいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
    （C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域
    からなり、
    かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、
    請求項１〜３のいずれか一項に記載のDNAアプタマー。
  5. 以下の（i）又は（ii）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー： （i）配列番号18若しくは21に示される塩基配列、又は
    （ii）（i）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
  6. 請求項１〜５のいずれか一項に記載の塩基配列からなる、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー。
  7. 以下の（I）又は（II）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー： （I）配列番号1〜4、9及び11のいずれかに示される塩基配列、又は
    （II）（I）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
  8. （I）の塩基配列が、配列番号1又は11に示される配列である、請求項７に記載のDNAアプタマー。
  9. 1〜5個のGC対を塩基配列の末端に含む、請求項７又は８に記載のDNAアプタマー。
  10. 塩基配列の3'末端にミニヘアピン構造をさらに含み、
    前記ミニヘアピン構造が、
    5'末端側から3'末端側に向かって順番に連結された以下の（A）〜（C）の核酸領域：
    （A）2〜5個の任意のヌクレオチドからなる第1核酸領域、
    （B）GNA又はGNNA（ここで、各Nは、独立に、G、T、A若しくはCのいずれかである）の塩基配列からなる第2核酸領域、及び
    （C）第1核酸領域に相補的な塩基配列からなる第3核酸領域
    からなり、
    かつ、第1核酸領域及び第3核酸領域が互いに塩基対合したステム部分と第2核酸領域からなるループ部分によって構成される、
    請求項７〜９のいずれか一項に記載のDNAアプタマー。
  11. 以下の（I）又は（II）の塩基配列を含む、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー： （I）配列番号12に示される塩基配列、又は
    （II）（I）に示される塩基配列において、7-(2-thienyl)-3H-imidazo[4,5-b]pyridine-3-yl以外の位置において1又は数個のヌクレオチドが付加、欠失、及び／又は置換された塩基配列。
  12. 請求項７〜１１のいずれか一項に記載の塩基配列からなる、vWFタンパク質に結合するDNAアプタマー。
  13. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のDNAアプタマーを含むvWFタンパク質検出剤。
  14. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のDNAアプタマーを含むvWFタンパク質検出用キット。
  15. 請求項１〜１２のいずれか一項に記載のDNAアプタマーを含む医薬組成物。
  16. 血栓症、血栓性血小板減少性紫斑病、頭蓋内塞栓、脳塞栓症、頸動脈狭窄、血栓性微小血管症、及び急性心筋梗塞症からなる群から選択される疾患の治療及び／又は予防のための、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 被験体から得られたサンプルを、請求項１〜１２のいずれか一項に記載のDNAアプタマーと接触させる工程、及び
    前記サンプルと前記DNAアプタマーの結合に基づいてvWFタンパク質を検出する工程、
    を含む、vWFタンパク質を検出する方法。
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