JP6725699B2 - Ｔｒａｉｌとｃｄを発現している間葉系幹細胞およびその使用 - Google Patents

Description

本発明は、ＴＲＡＩＬ（ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド）タンパク質およびＣＤ（シトシンデアミナーゼ）タンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルスベクター、およびそのベクターを用いて作製されたレンチウイルスによりトランスフェクトされた細胞に関連する。

細胞を用いた療法は全世界的に開発されており、特に幹細胞療法の市場は、毎年の平均成長率が１１．７％という着実な上昇傾向を示している。

成人の幹細胞である間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨、軟骨、筋肉、脂肪、および線維芽細胞などに分化することができる、多能性細胞である。加えてＭＳＣは骨髄、臍帯血、および脂肪など種々の成人組織から、比較的容易に得ることができる。ＭＳＣは炎症または損傷の部位に移動するというそれらの能力によって特徴付けられており、それは治療薬剤を送達するための送達ベヒクルとして大きな利点でもある。更にヒトの体の免疫機能は、Ｔ細胞、Ｂ細胞、樹枝状細胞、およびナチュラルキラー細胞などの免疫細胞の機能を阻害することにより調節することができる。加えてＭＳＣはインビトロで比較的容易に培養することができるという利点を有し、よって細胞治療剤としてＭＳＣを使用するための研究が活発に行われている。

しかしながら、そのようなＭＳＣの利点にも関わらず、細胞療法剤として臨床的に使用することができるＭＳＣを作製するには以下の問題がある。第１に、ＭＳＣの増殖には制限があるために、それらを大量に産生することは困難である。第２に、得られたＭＳＣは異成分からなるために、産生する毎に同じ効果を維持することは困難である。第３に、ＭＳＣ単独の使用は治療上有効ではない。

一方韓国特許番号１５８５０３２は、ヒドロゲル中で培養された間葉系幹細胞を含む細胞療法剤を開示している。上記の文書は、細胞療法剤として使用するために間葉系幹細胞を単離する工程において、前処理過程を短縮することにより、直接的に投与することができる組成物を提供している。しかしながら、上記で述べた間葉系幹細胞の問題と、その問題を解決するための方法は全く述べられていない。よって細胞治療剤として利用できる間葉系幹細胞の研究を行う必要がある。

技術分野
本発明の目的は、ＴＲＡＩＬタンパク質とＣＤタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルスと、上記の組み換えレンチウイルスによりトランスフェクトされた宿主細胞を提供することである。

本発明の他の目的は、上記の組み換えレンチウイルスまたは宿主細胞を含む医薬組成物を提供することである。

課題を解決する手段
本発明の１つの目的によれば、ＴＲＡＩＬタンパク質とＣＤタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルスベクターが提供される。

更に本発明の他の目的によれば、ＴＲＡＩＬタンパク質とＣＤタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルスが提供される。

更に本発明の他の目的によれば、上記の組み換えレンチウイルスによりトランスフェクトされた宿主細胞が提供される。

更に本発明の他の目的によれば、活性成分として上記の組み換えレンチウイルスを含む、癌を予防または治療するための医薬組成物が提供される。

更に本発明の他の目的によれば、活性成分として上記の宿主ウイルスを含む、癌を予防または治療するための医薬組成物が提供される。

発明の有利な効果
本発明のＴＲＡＩＬタンパク質とＣＤタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルスによりトランスフェクトされた宿主細胞は、ＴＲＡＩＬタンパク質とＣＤタンパク質を発現し、高い細胞増殖速度を維持する。加えて、異常な分化を阻害することができ、癌形成の可能性が阻止され、高い安全性を示す。よってそのレンチウイルスまたは宿主細胞は、細胞療法剤として有用となり得る。

図１は、不死化したＭＳＣと不死化していないＭＳＣの細胞増殖速度を比較したグラフであり、 ｉｍＳＭＣ：不死化したＭＳＣであり； ＭＳＣ：不死化していないＭＳＣであり； Ｘ軸：インキュベーション期間であり；および Ｙ軸：累積的集団倍加レベル（ＰＤＬ）である。 図２は、ｐＢＤ−４レンチウイルスベクター中に挿入された遺伝子コンストラクトの構造の略図であり、 ＴＲＥ：テトラサイクリン反応エレメントを含むプロモーターであり； ＴＲＡＩＬ：ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンドであり； ＩＲＥＳ：内部リボソーム侵入部位であり；および ＣＤ：ＣＤタンパク質である。 図３は、ＢＭ−０３細胞株の遺伝子操作の後のＭＳＣと、骨髄由来のＭＳＣの、表面抗原タンパク質ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、ＣＤ７３（これらはＭＳＣに固有の特性である）などの発現を比較している。 図４は、遺伝子操作の後のＢＭ−０３細胞株の分化能を示し、遺伝子操作の後のＢＭ−０３細胞株の脂質生成、骨生成、および軟骨形成の同定を行っている。 図５は、寄託された株であるＢＭ−０３の中で導入遺伝子（ＴＲＡＩＬとＣＤ）を検出した結果を示す。レーン１はマーカーを示し、レーン２は陰性コントロ−ルを示し、レーン３は陽性コントロ−ルを示し、レーン４から６はＢＭ−０３を示す。 図６は、ＦＡＣＳを用いたドキシサイクリン依存性のＴＲＡＩＬ発現を示す。 図７は、ＦＡＣＳにより試験された、ＴＲＡＩＬタンパク質とＣＤタンパク質を発現している間葉系幹細胞の５ＦＣ処理による細胞死を示す。 図８は、継代培養により得られたＢＭ−０３細胞のＰＤＬを示すグラフである。 図９は、遺伝子が導入されたＢＭ−０３細胞の核型の解析結果を示す。

発明の詳細な説明

発明を実施するための最良の形態
以下において本発明を詳細に述べる。

本発明はＴＲＡＩＬタンパク質とＣＤタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルスベクターを提供する。

本明細書中で使用されるとき、用語「ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（以下ＴＲＡＩＬと称する）」タンパク質は、ＴＮＦファミリーの中の２型膜貫通サイトカインに属する。ＴＲＡＩＬは自殺遺伝子の一つとして、形質転換細胞のアポトーシスを選択的に誘導する。特にＴＲＡＩＬは、細胞表面に存在する死受容体−４（ＤＲ−４）、ＤＲ−５、デコイ受容体またはデコイ受容体−２と結合し、アポトーシスのシグナル伝達システムを活性化する。ＴＲＡＩＬは正常細胞に対しては有毒ではなく、癌細胞のみにアポトーシスを特異的に誘導すると知られている。

本発明のＴＲＡＩＬタンパク質はヒト由来のタンパク質であってもよい。ＴＲＡＩＬタンパク質は、３つの受容体に結合可能なホモトリマーの型で存在している。本発明のＴＲＡＩＬタンパク質は、配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。ＴＲＡＩＬタンパク質は配列番号１のアミノ酸配列と、約７０％、８０％、９０％、９５％以上の相同性を有してもよい。一方ＴＲＡＩＬタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号２のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。加えて、ＴＲＡＩＬタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号２のヌクレオチド配列と、約７０％、８０％、９０％、９５％以上の相同性を有してもよい。

本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＤタンパク質」はシトシンデアミナーゼタンパク質であり、ＣＤとウラシルホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＵＰＲＴ）が連結した融合タンパク質の型であってもよく、本明細書中で使用されるとき、用語「ＣＤタンパク質」は「ＣＤ::ＵＰＲＴ」の代わりに使用することができる。

上記ＣＤタンパク質を発現している細胞のアポトーシスは、５−フルオロシトシン（５ＦＣ）を、強い細胞毒性を有する５−フルオロウラシル（５ＦＵ）に変えることによって誘導される。よってＣＤタンパク質遺伝子を含むレンチウイルスベクターを含んでいる細胞のアポトーシスを、５ＦＣによる処理で誘導することができる。

本発明によるＣＤタンパク質をコードしている遺伝子の配列は、サッカロマイセス・セレヴィシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のＣＤアーゼをコードしているＦＣＹ１遺伝子と、Ｎ末端から３５アミノ酸が欠損したＵＰＲＴアーゼをコードしているＦＵＲ１Δ１０５遺伝子を融合することにより、コドン最適化した配列である。そのような配列は、米国特許番号５，３３８，６７８、国際公開番号ＷＯ９６/１６１８３、および国際公開番号ＷＯ９９/５４４８１の中で述べられているものでもよい。１態様においてＣＤタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。加えてＣＤタンパク質は、配列番号３のアミノ酸配列と約７０％、８０％、９０％、または９５％以上の相同性を有してもよい。一方ＣＤタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号４のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。加えて、ＣＤタンパク質をコードするヌクレオチド配列は、配列番号４のヌクレオチド配列と約７０％、８０％、９０％、または９５％以上の相同性を有してもよい。

本明細書中で使用されるとき、用語「レンチウイルスベクター」は１種のレトロウイルスであって、それが一本鎖ＲＮＡの型のベクターとなったものであり、「レンチウイルス転移ベクター」ともいわれている。そのレンチウイルスベクターを感染の標的細胞のゲノムＤＮＡ中に挿入して遺伝子を安定に発現させ、有糸分裂および非有糸分裂の細胞に遺伝子を転移することができる。そのベクターはヒトの体の免疫反応を誘導しないので、その発現は連続的である。加えて、従来のウイルスベクターであるアデノウイルスベクターと比較して、大きなサイズの遺伝子を送達することができるという利点がある。

レンチウイルスベクターはさらに、チミジンキナーゼ（ＴＫ）タンパク質をコードする遺伝子を含んでもよい。ＴＫタンパク質はＡＴＰのγ位においてリン酸をチミジンに結合させることにより、チミジル酸生成反応を触媒する酵素であり、それによってチミジンは三リン酸の型に変換される。修飾されたチミジンはＤＮＡ複製に使用されず、それを含む細胞の死を誘導すると知られている。本明細書で使用されるＴＫタンパク質は、既知の配列の何れか１つであってもよい。１態様においてＴＫタンパク質は、配列番号５のアミノ酸配列を有しているポリペプチドであってもよい。一方ＴＫタンパク質をコードする遺伝子は、配列番号６のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。

本発明の組み換えレンチウイルスベクターは、１つまたは２つのプロモーターを含むことができる。そのプロモーターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト伸張因子−１アルファ（ＥＦ−１α）またはテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーターであってもよい。１態様において、その組み換えレンチウイルスベクターは、１つのプロモーターによりＴＲＡＩＬまたはＣＤタンパク質の発現を調節することができる。そのプロモーターは、発現するべきタンパク質をコードする遺伝子と作動可能に連結されることができる。

１態様によると、ＴＲＡＩＬとＣＤタンパク質はＴＲＥプロモーターに連結していてもよい。ＴＲＥプロモーターはテトラサイクリン転写活性化（ｔＴＡ）タンパク質により、プロモーターと連結した遺伝子の転写を活性化することができる。特にｔＴＡタンパク質はＴＲＥプロモーターと結合し、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンが存在しないときに転写を活性化するが、それに対して、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンが存在するときには、それはＴＲＥプロモーターと結合して転写を活性化することができない。よってＴＲＡＩＬまたはＣＤタンパク質の発現を、テトラサイクリンまたはドキシサイクリンの添加または枯渇により調節することができる。

用語「作動可能に連結」しているとは、特定のポリヌクレオチドが他のポリヌクレオチドと連結されることによって、それがその機能を行えることを意味する。特定のタンパク質をコードしている遺伝子がプロモーターと作動可能に連結しているという表現は、その連結が、その遺伝子がそのプロモーターの作用によりｍＲＮＡに転写され、タンパク質に翻訳されるように行われることを意味する。

二つ以上の遺伝子が、本発明のレンチウイルスベクター中の１つのプロモーターによってそれらが転写されるように連結されているときには、そのベクターは内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含んでもよく、それによって各タンパク質を単一の転写産物から発現させることができる。

用語「内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）」は、真核生物のタンパク質合成の間に、５‘−キャップ構造の代わりに、転写の中間領域からの翻訳を可能とするように機能する核酸配列をいう。ＩＲＥＳを使用することにより、種々の機能を行う多数のタンパク質を、単一の転写産物から作製することができる。１態様によると、ＴＲＡＩＬタンパク質とＣＤタンパク質がＩＲＥＳを介して連結した、本発明の組み換えレンチウイルスベクターは、単一の転写産物に転写することができ、その後にそれから各タンパク質を産生することができる。

本発明は、ＴＲＡＩＬタンパク質とＣＤタンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルスを提供する。

その組み換えレンチウイルスは、本発明のレンチウイルスベクター、パッケージングプラスミド、およびエンベローププラスミドにより、宿主細胞を形質転換し；および、形質転換した宿主細胞からレンチウイルスを単離する工程によって得ることができる。

用語「パッケージングプラスミド」と「エンベローププラスミド」は、本発明のレンチウイルスベクターからレンチウイルスを作製するためのヘルパーコンストラクト（例えばプラスミドまたは分離された核酸）を、効率的なトランスフェクションのために提供するものであってもよい。そのようなコンストラクトは、宿主細胞内でレンチウイルスベクターの調製およびパッケージングを行うために有用な要素を含む。上記の要素は、ｇａｐプレカーサーのような構造タンパク質；ｐｏｌプレカーサーのようなプロセシングタンパク質；プロテアーゼ；外被タンパク質；および、宿主細胞内でのタンパク質を調製とレンチウイルス粒子の製造に必要な発現ならびに調節シグナルなどを含む。

組み換えレンチウイルスの産生のために、クロンテックラボラトリー社により提供されるレンチ−Ｘレンチウイルス発現システム、アドジェーンにより提供されるパッケージングプラスミド（例えばｐＲＳＶ−Ｒｅｖ、ｐｓＰＡＸ、ｐＣｌ−ＶＳＶＧ、ｐＮＨＰなど）またはエンベローププラスミド（例えばｐＭＤ２．Ｇ、ｐＬＴＲ−Ｇ、ｐＨＥＦ−ＶＳＶＧなど）を使用することができる。

更に本発明は、上記の組み換えレンチウイルスによりトランスフェクトされた宿主細胞を提供する。

用語「トランスフェクション」は、ウイルス感染を介して、組み換えレンチウイルスベクター中に搭載された遺伝子を送達することをいう。

本発明による宿主細胞は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳ）、骨髄幹細胞（ＢＭＳＣ）、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、ヒト神経幹細胞（ｈＮＳＣ）、角膜縁（limbal）幹細胞、または口腔粘膜上皮細胞であってもよい。本発明の１態様において、宿主細胞は間葉系幹細胞であってもよい。

用語「間葉系幹細胞（ＭＳＣ）」とは、骨細胞、軟骨細胞、および脂肪細胞を含む、種々の細胞に分化することが可能な多能性間質細胞をいう。間葉系幹細胞は、骨、軟骨、脂肪、腱、神経組織、線維芽細胞および筋細胞などの特定の器官の細胞に分化することができる。これらの細胞は脂肪組織、骨髄、末梢血、臍帯血、骨膜、真皮、中胚葉由来組織などから単離または精製することができる。

その宿主細胞は下記の方法：
１）ｈＴＥＲＴとｃ−ｍｙｃ遺伝子を含むレンチウイルスによって宿主細胞を一次感染させ；
２）一次感染した宿主細胞を、ｔＴＡ遺伝子を含むレンチウイルスにより二次感染させ；
３）ＴＲＡＩＬ遺伝子とＣＤ遺伝子を含むレンチウイルスにより、二次感染した宿主細胞を三次感染させる、
によって調製することができる。

工程１）において、ｈＴＥＲＴとｃ−ｍｙｃは宿主細胞を不死化する遺伝子である。ｈＴＥＲＴとｃ−ｍｙｃ以外の不死化遺伝子として知られている遺伝子も、使用することができる。１態様によると、ｈＴＥＲＴとｃ−ｍｙｃタンパク質は、それぞれ、配列番号９と配列番号７のアミノ酸配列を有するポリペプチドであってもよい。一方、ｈＴＥＲＴとｃ−ｍｙｃタンパク質をコードする遺伝子は、それぞれ、配列番号１０と配列番号８のヌクレオチド配列を有するポリヌクレオチドであってもよい。

工程２）において、ｔＴＡは標的遺伝子の発現を調節することができる遺伝子であり、テトラサイクリン転写活性化因子を意味する。本明細書で使用するときＴｅｔ−ｏｆｆシステムは、上記で述べたようにテトラサイクリンまたはドキシサイクリンの存在または非存在に依り、標的タンパク質の発現を調節することができる。

工程２）の三次感染は、単一ベクター内にＴＲＡＩＬ遺伝子とＣＤ遺伝子の両者を含む、本発明のベクターを用いて行うことができる。しかしながら本発明の他の態様において、ＴＲＡＩＬ遺伝子とＣＤ遺伝子を、それぞれのコンストラクトとして調製し、２つのレンチウイルスベクターの中にそれぞれ挿入することができる。すなわち、ＴＲＡＩＬタンパク質をコードする遺伝子が発現するように調製された遺伝子コンストラクトが挿入されたレンチウイルスベクター、および、ＣＤタンパク質をコードする遺伝子が発現するように調製された遺伝子コンストラクトが挿入されたレンチウイルスベクターを、三次感染のために使用することができる。

上記の方法により調製された細胞をＢＭ−０３と名付け、寄託番号ＫＣＴＣ １３１８２ＢＰとして、韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）の微生物資源センターに２０１７年１月６日に寄託されている。

本発明は活性成分として上記の組み換えレンチウイルスまたは宿主細胞を含む、癌を予防または治療するための医薬組成物を提供する。

癌とは、何れの血液癌と固形癌を包含する癌全般をいう。癌の例には、胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、黒色腫、子宮頸癌、卵巣癌、直腸癌、子宮内膜癌、ホジキン病、脳腫瘍、肉腫、食道癌、小腸癌、甲状腺癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、膀胱癌、中枢神経系癌、脊髄腫瘍などを含んでもよい。

この医薬組成物は一種の細胞療法剤であり、さらに薬学的に許容される担体を含んでもよい。その担体は薬剤の調製に一般的に使用されるものでもよく、ラクトース、デキストロ−ス、スクロース、ソルビトール、マンニトール、澱粉、アカシアゴム、リン酸カルシウム、アルギン酸、ゼラチン、ケイ酸カルシウム、微結晶セルロース、ポリビニルピロリドン、セルロ−ス、水、シロップ、メチルセルロース、メチルヒドロキシ安息香酸、プロピルヒドロキシ安息香酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、鉱油などを含んでもよい。

加えて、本発明の医薬組成物は薬学的に許容される添加剤をさらに含んでもよく、それは、滑沢剤、湿潤剤、甘味剤、矯味剤、乳化剤、懸濁剤、保存剤、およびそれらの組み合わせからなる群から選択されてもよい。

その担体は本発明の医薬組成物の総重量に基づいて、約１重量％から約９９．９９重量％、好ましくは約９０重量％から約９９．９９重量％の量で含まれてもよく、薬学的に許容される添加剤は約０．１重量％から約２０重量％の量で含まれてもよい。

その医薬組成物は、薬学的に許容される担体および賦形剤と共に従来の方法に従って処方することにより単位剤形に調製することができ、または、複数回投与容器中に充填することにより調製することができる。本明細書中において、製剤は溶液、懸濁液、シロップもしくは油中もしくは水媒体中の乳液の形であってもよく、または、抽出物、粉末、散剤、顆粒剤、錠剤もしくはカプセルの形であってもよく、加えて分散剤または安定化剤を含んでもよい。

本発明は、本発明の医薬組成物を被験体に投与する工程を含む、上記で述べた癌を予防または治療するための方法も提供する。

その被験体は哺乳類、特にヒトであってもよい。医薬組成物の投与経路と用量は種々の手段で調整することができ、被験体へ投与する量は患者の状態と副作用の存在に依り、および最適な投与方法と用量は適切な範囲内で当業者が選択することができる。加えて医薬組成物を、治療されるべき疾患について治療効果を有すると知られている他の薬物または生理学的に活性な物質と組み合わせて投与してもよく、または、他の薬物との組み合わせ製剤の形に製剤化してもよい。

医薬組成物が非経口的に投与されるとき投与の例は、皮下投与、点眼、腹腔内投与、筋肉内投与、経口投与、直腸投与、眼窩内投与、脳内投与、頭蓋内投与、髄腔内投与、脳室内投与、くも膜下投与、経鼻投与、静脈内投与を含む。

上記の投与は１回以上、１回〜３回、特に２回に分割された用量で投与されてもよい。繰り返し投与の場合には、それらを１２〜４８時間、２４〜３６時間の間隔で、特に２４時間の間隔で投与してもよい。レンチウイルスの場合には投与を、大人については、１．０×１０^６〜１．０×１０^１２ＴＵ、特に１．０×１０^８〜１．０×１０^１０ＴＵの量で行ってもよい。一方細胞の場合には投与を、大人については、１．０×１０^５〜１．０×１０^１１細胞、特に１．０×１０^７〜１．０×１０^９細胞の量で行ってもよい。用量が高い場合には、投与を１日に数回行ってもよい。

発明の態様
これから先、下記の実施例を参照にして本発明を詳細に述べる。しかしながら、下記の実施例は本発明を説明することを意図するものであって、本発明はそれに限定されない。

例１．不死化間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の調製
１−１．不死化遺伝子を含むレンチウイルスベクターの調製
ＭＳＣを不死化するために、ｃ−ＭｙｃとｈＴＥＲＴ（これらは不死化遺伝子である）をそれぞれ含んでいるレンチウイルスベクターを調製した。Ｔｅｔ−ｏｆｆシステムを使用するために、この中にｔＴＡタンパク質を発現している遺伝子コンストラクトを共に挿入した。

第１に、ｐＷＰＴベクター（アドジェーン、米国）の発現カセット中のＥＦプロモーターをＣＭＶプロモーターに置き換え、その下流にＲＳＶプロモーターを加えることにより、ｐＢＤレンチウイルスベクターを調製した。

ｃ−Ｍｙｃ遺伝子（配列番号８）とチミジンキナーゼ（ＴＫ）遺伝子（配列番号６）を、ＩＲＥＳを介して連結してｐＢＤレンチウイルスベクター中に挿入し、ＣＭＶプロモーターにより発現を調節できるようにした。構築されたベクターをｐＢＤ−１と命名した。

一方ｈＴＥＲＴ遺伝子（配列番号１０）をｐＢＤレンチウイルスベクター中に挿入し、ＣＭＶプロモーターにより発現を調節できるようにした。ゼオマイシンに耐性を有する遺伝子（ＺｅｏＲ；配列番号１６）をその中に挿入し、ＲＳＶプロモーターにより発現を調節できるようにした。構築されたベクターをｐＢＤ−２と命名した。

加えて、ｔＴＡ（テトラサイクリントランス活性化因子）遺伝子（配列番号１２）をｐＢＤレンチウイルスベクター中に挿入し、ＣＭＶプロモーターにより発現を調節できるようにした。ピューロマイシンに対して耐性を有する遺伝子（ＰｕｒｏＲ；配列番号１４）をその中に挿入し、ＲＳＶプロモーターにより発現を調節できるようにした。構築されたベクターをｐＢＤ−３と命名した。

１−２．不死化遺伝子を含むレンチウイルスの調製
例１−１で構築されたレンチウイルスベクターを使用して、不死化遺伝子を含むレンチウイルスを下記の方法により調製した。

第１にレンチ−Ｘウイルス（クロンテックラボラトリー、米国）を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭを用いて１５０ｍｍディッシュ中で培養した。一方、ＥｎｄｏＦｒｅｅ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍａｘｉ Ｋｉｔ（キアゲン、米国）を用いて、ＤＨ５α大腸菌細胞からレンチウイルスベクターを抽出して定量化した。

培養されたレンチ−Ｘ細胞をＰＢＳで洗浄し、その後３ｍｌのＴｒｙｐＬＥ（登録商標）Ｓｅｌｅｃｔ ＣＴＳ（登録商標）（Ｇｉｂｃｏ、米国）を、その中に添加した。細胞を３７℃で約５分間放置し、その後それらの脱離を確かめた。脱離した細胞を、その中に１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭを７ｍｌ添加することにより中和した。中和した細胞を５０ｍｌチューブの中に収集し、１，５００ｒｐｍで５分間遠心分離した。得られた上清を取り除き、その中に１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭを１０ｍｌ添加することにより、細胞を再懸濁した。懸濁された細胞を血球計数器で計測し、その後１５０ｍｍディッシュの中に１．２×１０^７細胞の量で分注した。分注された細胞を約９０％の細胞飽和まで培養し、１２μｇのレンチウイルスベクター、１２μｇのｐｓＰＡＸ（アドジェーン；ｇａｇ−ｐｏｌ発現、パッケージングプラスミド）、および２．４μｇのｐＭＤ．Ｇプラスミド（アドジェーン；ＶＳＶＧ発現、エンベローププラスミド）の混合物で細胞を形質転換した。形質転換を促進するために、リポフェクタミン（インビトロゲン、米国）およびＰＬＵＳ ｒｅａｇｅｎｔ（インビトロゲン、米国）を使用した。形質転換の６時間後培地を、１０％ウシ胎児血清を補充したＤＭＥＭに置き換えた。４８時間の追加培養の後に上清を回収した。

得られた上清をレンチウイルス濃縮キット（レンチ−Ｘコンセントレーター、クロンテックラボラトリー、米国）と混合し、そして４℃で一晩培養した。それを４℃で４，０００ｒｐｍの条件下で２時間遠心分離してウイルスを得、ＦＢＳを含まないＤＭＥＭの０．５ｍｌ中にそれを再懸濁した。結果として、ｐＢＤ−１、ｐＢＤ−２、およびｐＢＤ−３レンチウイルスベクターから産生されたレンチウイルスは、それぞれ、４．０×１０^８ＴＵ/ｍｌ、２．０×１０^８ＴＵ/ｍｌ、および１．２×１０^９ＴＵ/ｍｌの濃度で調製された。

１−３．不死化間葉系幹細胞の調製
例１−２で調製された不死化遺伝子を含むレンチウイルスを用いて、不死化ＭＳＣを調製した。

第１に、骨髄由来ＭＳＣを下記の方法で作製した。具体的には、健康なドナーの腸骨稜から骨髄穿刺液を得た。凝集を阻止するために、滅菌容器中で穿刺液を２０ ＩＵ/ｍｌのヘパリンと混合した。骨髄混合溶液を４℃、７３９ｇの条件下で７分間遠心分離し、その後に上清を除去し、結果産物を１０倍（容積）の滅菌水と混合した。結果産物の混合液を同じ条件下で再び遠心分離し、細胞のペレットを得た。得られたペレットを２０％ＦＢＳと５ｎｇ/ｍｌ ｂ−ＦＧＦ（１００−１８Ｂ，ペプロテック、米国）を補充したＤＭＥＭ−低グルコース（１１８８５−０８３４、ギブコ、米国）の中に懸濁し、その後それを培養フラスコ中に分注した。それを３７℃、５％ＣＯ_２の条件下で２４〜４８時間培養し、その後新たな培地と置き換えた。細胞を継代培養し、一方３日〜４日の間隔で培地を新しいものと置き換えた。２週間培養した後に、蛍光細胞分析装置を用いてＭＳＣを確認した。

上記で調製されたＭＳＣを、例１−２で調製したｐＢＤ−１レンチウイルスに、Ｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎ（クロンテックラボラトリー、米国）を用いて１００ ＭＯＩで感染させた。感染させた細胞を同じ方法により、１００ ＭＯＩでｐＢＤ−２レンチウイルスベクターに感染させた。感染の後、安定化した細胞の培養培地に５００μｇ／ｍｌのゼオマイシンを添加することにより、ｐＢＤ−２レンチウイルスに感染した細胞を選択した。

選択された細胞を１００ ＭＯＩでｐＢＤ−３レンチウイルスベクターに感染させた。感染の後、安定化した細胞の培養培地に１μｇ／ｍｌのピューロマイシンを添加することにより、ｐＢＤ−３レンチウイルスに感染した細胞を選択した。

結果として、不死化遺伝子を含むＭＳＣの増殖速度と、不死化遺伝子を含まないＭＳＣの細胞増殖速度を図１に示す。図１に示すように、不死化遺伝子、ｃ−ｍｙｃ、およびｈＴＥＲＴを含むレンチウイルスに感染したＭＳＣは、１２０日の培養後でも高い細胞増殖速度を維持した。一方、不死化していないＭＳＣの細胞増殖速度は、４０日の培養後に急速に低下した。

例２．ＴＲＡＩＬとＣＤ遺伝子を含むレンチウイルスの構築
２−１．ＴＲＡＩＬとＣＤ遺伝子を含むレンチウイルスベクターの構築
ＴＲＡＩＬ遺伝子（配列番号２）とＣＤ遺伝子（配列番号４）を、調製したｐＢＤレンチウイルスベクターの中に挿入した。この中で、挿入されたＴＲＡＩＬとＣＤ遺伝子は、ＩＲＥＳ（内部リボソーム侵入部位）を介して連結され、発現がＴＲＥプロモーターにより調節されるように設計した。ＩＲＥＳは５’−キャップ構造がなくても翻訳の開始を許容するリボソーム結合部位であり、単独のｍＲＮＡにより２つのタンパク質の発現を可能とする。一方ＴＲＥプロモーターは、そのプロモーターと連結した遺伝子の発現を、ドキシサイクリンの添加の存在または不存在に依って調節することができる。

構築されたベクターをｐＢＤ−４と名付け、その遺伝子コンストラクトの構造を図２に示す。

２−２．ＴＲＡＩＬとＣＤ遺伝子を含むレンチウイルスの調製
例２−１で構築したＴＲＡＩＬとＣＤ遺伝子を含むレンチウイルスベクターを用いて、例１−２で述べたのと同じ方法によりレンチウイルスを作製した。作製されたレンチウイルスは７．６×１０^８ＴＵ／ｍｌの濃度で調製した。

例３．ＴＲＡＩＬとＣＤ遺伝子を含むレンチウイルスに感染したＭＳＣの調製
３−１．ＴＲＡＩＬとＣＤ遺伝子を含むレンチウイルスに感染したＭＳＣの調製
例１−３で調製した不死化ＭＳＣを、例２−２で調製したＴＲＡＩＬとＣＤ遺伝子を含むレンチウイルスに感染させることにより、ＴＲＡＩＬとＣＤ遺伝子を発現している細胞を調製した。例１−３で述べたのと同じ方法により感染を行った。感染の後に、１μｇ／ｍｌのドキシサイクリン（６３１３１１、クロンテック、米国）を安定化した細胞の培養培地に添加し、ＴＲＡＩＬとＣＤの発現が抑制された状態で細胞を培養した。細胞が安定化した後に、ドキシサイクリンが除去された細胞培地の中で７２時間細胞を培養することにより、ＴＲＡＩＬとＣＤの発現を誘導した。その後、表面上にＴＲＡＩＬを発現している細胞を、ＦＡＣＳを用いて単離した。

具体的に、ＴＲＡＩＬとＣＤ遺伝子を含むレンチウイルスに感染した細胞を、５×１０^５細胞/チューブでＦＡＣＳチューブに分注し、４℃と１，５００ｒｐｍの条件下で５分間遠心分離し、得られた上清を除去した。１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液（２％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）を添加することによって細胞をそれに再懸濁し、同じ条件下で遠心分離し、得られた上清を除去した。上記の洗浄操作をもう１回行った後に、細胞を１ｍｌのＦＡＣＳ緩衝液中に再懸濁した。再懸濁された細胞に、０．３μｌのＬＩＶＥ/ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ−ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ（ライフテクノロジーズ・モレキュラープローブス、米国）、および５μｌのＡＰＣ抗ヒトＣＤ２５３抗体（バイオレジェンド、カタログ番号３０８２１０、米国）、抗ＴＲＡＩＬ抗体を、２００μｌのＦＡＣＳ緩衝液を添加することにより調製した混合液を添加し、得られた混合液を４℃で３０分間反応させた。反応の後に上記と同じ方法で細胞を２回洗浄し、得られた上清を除去した。３００μｌの固定化緩衝液（２％ホルムルデヒドと１％ウシ胎児血清を含むＰＢＳ）を洗浄された細胞に添加し、４℃に少なくとも１５分間放置した。細胞をＦＡＣＳ（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤバイオサイエンス、米国）装置で解析し、ＴＲＡＩＬを発現している細胞を単離した。

単離された細胞を培養してコロニーを形成させた。形成されたコロニーから得られたモノクローナル細胞を培養し、細胞株を確立し、ＢＭ−０３と名付けた。細胞株ＢＭ−０３は寄託番号ＫＣＴＣ １３１８２ＢＰとして、韓国生命工学研究院（ＫＲＩＢＢ）の微生物資源センターに２０１７年１月６日に寄託されている。

３−２．確立された細胞株における表面抗原タンパク質発現の試験
遺伝子挿入前の骨髄由来ＭＳＣの表面抗原タンパク質の発現と、ＴＲＡＩＬとＣＤ遺伝子が挿入されたＢＭ−０３細胞株の表面抗原タンパク質の発現を、ヒトＭＳＣアッセイキット（Ｓｔｅｍｆｌｏｗ（登録商標）、カタログ番号５６２２４５、ＢＤ）を用いて解析した。各キットの中に含まれたマニュアルに従って実験を行い、その実験結果を図３に示す。

図３に示すように、（ＭＳＣが内在している特性である）表面抗原タンパク質ＣＤ９０、ＣＤ４４、ＣＤ１０５、およびＣＤ７３の、ＴＲＡＩＬとＣＤ治療遺伝子を発現させる操作を経たＢＭ−０３細胞株における発現は、骨髄由来のＭＳＣにおける発現と同じであることが実証された。

３−３．ＢＭ−０３細胞株の分化能の試験
ＢＭ−０３細胞株を１２穴のプレート中に、１×１０^４細胞/ｃｍ^２の濃度で播種し、脂質生成を試験した。一般的な培養培地を用いて、５％ＣＯ_２と３７℃の条件下でインキュベーターの中で２〜３日間細胞を培養し、その後に脂質生成分化培地（ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標） ａｄｉｐｏｇｅｎｅｓｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｋｉｔ、サーモフィッシャー・サイエンティフィック、Ａ１００７０−０１）で置き換えた。細胞を２１日間培養する一方で、培地を３日または４日毎に交換した。培養が完了したときに、細胞をオイルレッドＯ溶液で染色して顕微鏡で調べた。

骨形成を調べるために１２穴のプレート中に、５×１０^３細胞/ｃｍ^２の濃度で細胞を播種した。一般的な培養培地を用いて、５％ＣＯ_２と３７℃の条件下でインキュベーターの中で２〜３日間細胞を培養し、その後骨形成分化培地（ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標） ｏｓｔｅｏｇｅｎｅｓｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｋｉｔ、サーモフィッシャー・サイエンティフィック、Ａ１００７２−０１）で置き換えた。細胞を２１日間培養する一方で、培地を３日または４日毎に交換した。培養が完了したときに、細胞をアリザリンレッドＳで染色し、顕微鏡で調べた。

軟骨形成を調べるために１．６×１０^７細胞／ｍｌの濃度に細胞を懸濁し、５μｌの懸濁液を２４穴のプレート中に播種し、２時間培養した。５００μｌの軟骨形成分化培地（ＳｔｅｍＰｒｏ（登録商標） ｃｈｏｎｄｒｏｇｅｎｅｓｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ ｋｉｔ、サーモフィッシャー・サイエンティフィック、Ａ１００７１−０１）をそれに添加し、細胞を１４日間培養する一方で、培地を３日毎に交換した。培養の後に培地を吸引し、細胞をＤＰＢＳで洗い流してペレットを取り出した。凍結片（cryosection）とした後に細胞をアルシアンブルーで染色し、顕微鏡で調べた。結果を図４に示す。

図４に示されるように、ＴＲＡＩＬとＣＤ治療遺伝子を発現させる遺伝ための遺伝子操作を受けたＢＭ−０３細胞株は、ＭＳＣに内在する特性の分化能を有していた。

３−４．ＢＭ−０３細胞株の中に導入された遺伝子の試験
確立された細胞株であるＢＭ−０３のサンプルを、３７℃の恒温水浴中で約１分間解凍し、９ｍｌのＰＢＳを含んでいる１５ｍｌのチューブに移し、１，５００ｒｐｍで５分間の細胞沈降工程（Cell Down process）にかけた。ＰＢＳを完全に除去した後に、ペレットを１．５ｍｌチューブ中で２００μｌに懸濁し、移した。ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標）Ｔｉｓｓｕｅ（ＭＮ、７４０９５２．２５０）を用いてｇＤＮＡを調製し、下記の表１に示すように混合液を調製し、続いて下記の表２に示す工程によりＰＣＲを行った。この中に１００ｎｇのＢＭ−０３プラスミドＤＮＡを陽性コントロ−ルとして添加し、陰性コントロールとして１μｌの蒸留水を使用した。

１％アガロ−スゲルを電気泳動キット中に設置した。１０μｌのＤＮＡサイズマーカーを最初のウェルに搭載し、陰性コントロ−ル、陽性コントロ−ル、およびＢＭ−０３サンプル（×３）の各１０μｌを、それぞれ上記の順序で以下のウェルに搭載した。その後に１００Ｖで２０分間電気泳動を行い、ゲルの写真を撮った。結果を図５に示す。

図５に示されるように、３つのＢＭ−０３細胞株サンプルは全て、陽性コントロールとして同じサイズ（１．２ｋｂ）のＰＣＲ産物を示した。

３−５．確立された細胞株におけるＴＲＡＩＬとＣＤタンパク質の発現の同定
例３−１で確立されたＢＭ−１細胞株において、例３−１におけるのと同じ方法によってＴＲＡＩＬとＣＤタンパク質の発現を誘導し、ＦＡＣＳを行い、ドキシサイクリンの存在または非存在に従ってＴＲＡＩＬの発現を同定した。その後、ＴＲＡＩＬの発現が同定された細胞株においてＣＤタンパク質の発現を同定した。

具体的には、２μｇ/ｍｌのドキシサイクリンを含んでいる１０％ＰＢＳを補充したＤＭＥＭと、２μｇ/ｍｌのドキシサイクリンを含まない１０％ＰＢＳを補充したＤＭＥＭを用いて、Ｔ７５フラスコ中に５×１０^５の細胞数でＢＭ−０３細胞株を播種した。３日間培養した後に細胞を回収した。細胞の数を測定した後に、１群あたり５×１０^５の細胞を、ＰＥ抗ヒトＣＤ２５３（ＴＲＡＩＬ）抗体（バイオレジェンド、３０８２０６）とＰＥマウスＩｇＧ１、κアイソタイプコントロ−ル抗体（バイオレジェンド、４００１１２）で染色した。加えて、死んだ細胞を排除した後に発現を同定するために、ＬＩＶＥ/ＤＥＡＤ（登録商標）Ｆｉｘａｂｌｅ Ｎｅａｒ−ＩＲ Ｄｅａｄ Ｃｅｌｌ Ｓｔａｉｎ Ｋｉｔ（サーモスフィッシャー・サイエンティフィック Ｌ３４９７６）抗体を使用した。ＦＡＣＳ（ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａ、ＢＤバイオサイエンス）装置を用いてサンプルを解析した。同じ方法で細胞を培養した後に、ドキシサイクリンを除去することによりＣＤの発現を誘導した。１００μｇ/ｍｌの濃度でそれに５−ＦＣ（５−フルオロシトシン、シグマ）を添加して４８時間後、アポトーシスを観察した。その結果を図６と図７に示す。

図６に示されたように、ドキシサイクリンを添加したときにＴＲＡＩＬは発現しないことが見出されたが、ドキシサイクリンを除去した培地の中で培養されたＢＭ−０３細胞株においてＴＲＡＩＬは発現した。さらに図７において示されるように、もしＣＤタンパク質が発現したならば、細胞は５ＦＣにより殺されることが見出された。すなわちＣＤタンパク質の発現のせいで細胞は死ぬ。従って、調製された間葉系幹細胞中でＴＲＡＩＬタンパク質とＣＤタンパク質が発現し、それはＴｅｔ−ｏｆｆシステムによって調節されている。

３−６．細胞集団倍加数（ＰＤＬ）解析
２μｇ/ｍｌのドキシサイクリンを含む培地を使用して、４×１０^５細胞でＴ７５フラスコ中にＢＭ−０３細胞株を播種した。約３日間または４日間の継代培養により細胞を得て、細胞の総数を計測した。同じ数の細胞を播種し、ＰＤＬを３日または４日毎に測定した。ＰＤＬを下記の式１を用いて計算し、その結果を図８に示す。式１において、Ｘは当初のＰＤＬを表し、Ｉは培地内に播種された細胞の当初の数を表し、Ｙは最終的な細胞収量または増殖期の終わりにおける細胞数を表す。

図８に示されるように、長期継代培養において安定な増殖が観察された。

３−７．細胞の核型解析
ＢＭ−０３細胞株中に遺伝子が導入された細胞の染色体異常を調べるために、解析をエオン（EONE）生命科学研究所（韓国）に依頼し、プロトコールに従って行った。解析の結果を図９に示す。

図９に示されるように、遺伝子が導入されたＢＭ−０３細胞の染色体に異常は観察されず、よって正常な核型であると決定された。
以下に、当初の特許請求の範囲に記載していた発明を付記する。
［１］ ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）タンパク質、およびシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）タンパク質をコードする遺伝子を含む組み換えレンチウイルスベクター。
［２］ ＴＲＡＩＬタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、［１］に記載の組み換えレンチウイルスベクター。
［３］ ＣＤタンパク質が配列番号３のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、［１］に記載の組み換えレンチウイルスベクター。
［４］
１つまたは２つのプロモーターを含む、［１］に記載の組み換えレンチウイルスベクター。
［５］ プロモーターが、サイトメガウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト伸張因子−１アルファ（ＥＦ−１α）またはテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーターである、［４］に記載の組み換えレンチウイルスベクター。
［６］ 内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、［１］に記載の組み換えレンチウイルスベクター。
［７］ ＴＲＡＩＬタンパク質およびＣＤタンパク質をコードする遺伝子を含む、組み換えレンチウイルス。
［８］ ［７］に記載の組み換えレンチウイルスであって、前記組み換えレンチウイルスが、
［１］に記載のレンチウイルスベクター、パッケージングプラスミド、およびエンベローププラスミドにより、宿主細胞を形質転換し；および
形質転換した宿主細胞からレンチウイルスを単離する、
という工程を介して得られる組み換えレンチウイルス。
［９］ ［７］に記載の組み換えレンチウイルスによりトランスフェクトされた宿主細胞。
［１０］ 間葉系細胞である、［９］に記載の宿主細胞。
［１１］ 活性成分として［７］に記載の組み換えレンチウイルスを含む、癌を予防または治療するための医薬組成物。
［１２］ 前記癌が、胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、黒色腫、子宮頸癌、卵巣癌、直腸癌、子宮内膜癌、ホジキン病、脳腫瘍、肉腫、食道癌、小腸癌、甲状腺癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、膀胱癌、中枢神経系癌、および脊髄腫瘍からなる群から選択される、［１１］に記載の医薬組成物。
［１３］ 活性成分として［９］に記載の宿主細胞を含む、癌を予防または治療するための医薬組成物。
［微生物の寄託証］

Claims (8)

1. ＴＮＦ関連アポトーシス誘導リガンド（ＴＲＡＩＬ）タンパク質、およびシトシンデアミナーゼ（ＣＤ）タンパク質を発現している不死化した間葉系幹細胞であって、前記ＴＲＡＩＬは前記細胞の表面に発現されることを特徴とする不死化した間葉系幹細胞。
2. 前記ＴＲＡＩＬタンパク質が配列番号１のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の不死化した間葉系幹細胞。
3. 前記ＣＤタンパク質が配列番号３のアミノ酸配列からなるポリペプチドである、請求項１に記載の不死化した間葉系幹細胞。
4. 前記間葉系幹細胞はレンチウイルスベクターを使用して製造し、前記ベクターが１つまたは２つのプロモーターを含む、請求項１に記載の不死化した間葉系幹細胞。
5. 前記プロモーターが、サイトメガウイルス（ＣＭＶ）、呼吸器合胞体ウイルス（ＲＳＶ）、ヒト伸張因子−１アルファ（ＥＦ−１α）またはテトラサイクリン応答エレメント（ＴＲＥ）プロモーターである、請求項４に記載の不死化した間葉系幹細胞。
6. 前記ベクターが内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）を含む、請求項４に記載の不死化した間葉系幹細胞。
7. 請求項１に記載の不死化した間葉系幹細胞を有効成分として含む、癌を予防または治療するための医薬組成物。
8. 前記癌が、胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞肺癌、骨肉腫、膵臓癌、皮膚癌、頭頸部癌、黒色腫、子宮頸癌、卵巣癌、直腸癌、子宮内膜癌、ホジキン病、脳腫瘍、肉腫、食道癌、小腸癌、甲状腺癌、前立腺癌、白血病、リンパ腫、膀胱癌、中枢神経系癌、および脊髄腫瘍からなる群から選択される、請求項７に記載の医薬組成物。