JP6778112B2 - 抗インフルエンザウイルス剤、及び抗インフルエンザウイルス剤のスクリーニング方法 - Google Patents

抗インフルエンザウイルス剤、及び抗インフルエンザウイルス剤のスクリーニング方法 Download PDF

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Description

本発明は、ヒトをはじめとする宿主細胞の生体分子を標的とした抗インフルエンザウイルス剤、及び当該抗インフルエンザウイルス剤の候補分子をスクリーニングする方法に関する。
本願は、２０１４年９月２２日に、日本に出願された特願２０１４−１９２７５２号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
インフルエンザウイルスは、毎年流行病を引き起こし、ときには何百万人もの犠牲者を出すパンデミックを引き起こす。このため、より有効な抗インフルエンザウイルス剤の開発が求められている。抗インフルエンザウイルス剤の標的分子としては、ウイルスタンパク質よりも、ウイルスの感染や複製に寄与する宿主細胞の生体分子の方が好ましい。宿主細胞の生体分子の方が、ウイルスタンパクに比べて薬剤による選択圧による変異が生じ難いためである。
近年、６個のゲノムワイドスクリーニングにより、インフルエンザウイルスのライフサイクルに何等かの役割を果たしていると考えられる合計１４４９個のヒト遺伝子（１１０個のハエ（Drosophila）遺伝子のヒトオルソログを含む。）が同定された（非特許文献１〜６参照。）。各ゲノムワイドスクリーニングの結果は、それぞれ部分的にしか一致しないが、これは、実験条件が相違するためと推察される。
Brass，et al.，Cell，2009，vol.139，p.1243〜1254． Hao，et al．，Nature，2008，vol.454，p.890〜893． Karlas，et al．，Nature，2010，vol.463，p.818〜822． Konig，et al．，Nature，2010，vol.463，p.813〜817． Shapira，et al．，Cell，2009，vol.139，p.1255〜1267． Sui，et al．，Virology，2009，vol.387，p.473〜481． Neumann，et al.，Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，1999，vol.96，p.9345〜9350． Tobita，et al.，Medical microbiology and immunology，1975，vol.162，p.9〜14. Ozawa et al., Journal of General Virology，2011，vol. 92，p.2879〜2888. Octaviani et al.，Journal of Virology，2010，vol.84，p.10918〜10922. Kawakami et al.，Journal of Virological Methods，2011，vol.173，p.1〜6. Wishart et al.，Nucleic Acids Research，2006，vol.34，p.D668〜672. Patterson et al.，Journal of General Virology，1979，vol.43，p.223〜229. Widjaja et al.，Journal of Virology，2010，vol.84，p.9625〜9631. Noda et al.，Nature，2006，vol.439，p.490〜492.
幾つかのゲノムワイドスクリーニングにより、インフルエンザウイルスの複製等にかかわる宿主細胞のタンパク質が特定されている。しかし、これらのタンパク質がインフルエンザ感染症にどのように影響するかについては未だ明らかにされておらず、新たな抗インフルエンザウイルス剤の候補分子となり得るのかどうかは不明である。
本発明は、ヒトをはじめとする宿主細胞内の生体分子であって、インフルエンザウイルスのライフサイクルに関与するタンパク質を標的とした抗インフルエンザウイルス剤、及び新たな抗インフルエンザウイルス剤の候補分子のスクリーニング方法を提供することを主たる目的とする。
本発明者らは、鋭意研究した結果、ヒト胚腎臓由来のＨＥＫ２９３細胞の細胞溶解液を用いた免疫沈降法により、インフルエンザウイルスタンパク質と相互作用を有する１２９２個のヒトタンパク質を特定し、次いで、ＲＮＡ干渉を利用し、これらのヒトタンパク質の中から、発現量を抑制した場合に宿主細胞の増殖性を大きく損なうことなく、インフルエンザウイルスの増殖が顕著に抑制されるタンパク質を特定することにより、本発明を完成させた。
すなわち、本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤、及び抗インフルエンザウイルス剤のスクリーニング方法は、下記［１］〜［５］である。
［１］ ＪＡＫ１遺伝子の発現を抑制させる作用を有する化合物を含み、前記化合物がＪＡＫ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びこれらを細胞内で生産させることができるＲＮＡｉ誘導ベクターからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする、抗インフルエンザウイルス剤。
［２］ ルキソリチニブ及びトファシチニブからなる群より選択される１種以上であるＪＡＫ１の機能を抑制させる作用を有する化合物を含むことを特徴とする、抗インフルエンザウイルス剤。
［３］抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物をスクリーニングする方法であって、
ＪＡＫ１遺伝子の発現又はＪＡＫ１の機能に対する抑制又は阻害能がある化合物を、抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物としてスクリーニングすることを特徴とする、抗インフルエンザウイルス剤のスクリーニング方法。
［４］ 細胞に、抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物か否かを評価する対象の化合物を導入する工程と、
前記化合物を導入した細胞中における前記遺伝子の発現量を測定する工程と、
ＪＡＫ１遺伝子の発現量が、前記化合物が導入される前の細胞よりも有意に低減された場合に、当該化合物を抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物として選抜する工程と、
を有する、前記［３］の抗インフルエンザウイルス剤のスクリーニング方法。
［５］ ＪＡＫ１の酵素活性を、抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物か否かを評価する対象の化合物の存在下で測定する工程と、
前記化合物の存在下におけるＪＡＫ１の酵素活性が、前記化合物の非存在下よりも低下した場合に、当該化合物を抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物として選抜する工程と、
を有する、前記［３］の抗インフルエンザウイルス剤のスクリーニング方法。
本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤は、インフルエンザウイルスを構成する物質ではなく、宿主細胞のタンパク質を標的としているため、薬剤による選択圧による変異が生じ難いという利点がある。
また、本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤のスクリーニング方法は、インフルエンザウイルスの感染や複製に関与する宿主細胞のタンパク質を標的とした抗インフルエンザウイルス剤の候補分子をスクリーニングできるため、新たな抗インフルエンザウイルス剤の設計及び製造に好適である。
実施例２において、Golgicide Aで処理した細胞のウイルス力価（log10(PFU/mL)）と細胞生存率（％）の測定結果を示した図である。 実施例２において、Ruxolitinibで処理した細胞のウイルス力価（log10(PFU/mL)）と細胞生存率（％）の測定結果を示した図である。 実施例３において、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞（上段）と、ＪＡＫ１遺伝子のｓｉＲＮＡを導入した細胞（下段）の電子顕微鏡写真である。
＜抗インフルエンザウイルス剤＞
本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤は、インフルエンザウイルスタンパク質と相互作用する宿主細胞タンパク質であって、宿主細胞内において発現が抑制されると、宿主細胞の増殖性を過度に損なうことなく、インフルエンザウイルスの複製が抑制されるタンパク質をコードする遺伝子（以下、「抗Ｆｌｕ遺伝子」ということがある。）の発現を抑制させる作用、又は前記タンパク質の機能を抑制させる作用を有する。抗Ｆｌｕ遺伝子としては、具体的には、ＪＡＫ１遺伝子、ＣＨＥＲＰ遺伝子、ＤＤＸ２１遺伝子、ＤＮＡＪＣ１１遺伝子、ＥＥＦ１Ａ２遺伝子、ＨＮＲＮＰＫ遺伝子、ＩＴＭ２Ｂ遺伝子、ＭＲＣＬ３遺伝子、ＭＹＨ１０遺伝子、ＮＤＵＦＳ８遺伝子、ＰＳＭＤ１３遺伝子、ＲＰＬ２６遺伝子、ＳＤＦ２Ｌ１遺伝子、ＳＤＦ４遺伝子、ＳＦＲＳ２Ｂ遺伝子、ＳＮＲＰＣ遺伝子、ＳＱＳＴＭ１遺伝子、ＴＡＦ１５遺伝子、ＴＯＭＭ４０遺伝子、ＴＲＭ２Ｂ遺伝子、ＵＳＰ９Ｘ遺伝子、ＢＡＳＰ１遺伝子、ＴＨＯＣ２遺伝子、ＰＰＰ６Ｃ遺伝子、ＴＥＳＣ遺伝子、ＰＣＤＨＢ１２遺伝子、ＣＣＤＣ５６遺伝子、ＣＬＴＣ遺伝子、ＣＹＣ１遺伝子、ＮＩＢＰ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１５遺伝子、Ｃ１４ｏｒｆ１７３遺伝子、ＡＮＰ３２Ｂ遺伝子、ＢＡＧ３遺伝子、ＢＲＤ８遺伝子、ＣＣＤＣ１３５遺伝子、ＤＤＸ５５遺伝子、ＤＰＭ３遺伝子、ＥＥＦ２遺伝子、ＩＧＦ２ＢＰ２遺伝子、ＫＲＴ１４遺伝子、Ｓ１００Ａ４遺伝子、ＡＳＣＣ３Ｌ１遺伝子、Ｃ１９ｏｒｆ４３遺伝子、ＤＫＦＺｐ５６４Ｋ１４２遺伝子、ＦＡＭ７３Ｂ遺伝子、ＦＬＪ２０３０３遺伝子、ＧＢＦ１遺伝子、ＮＣＬＮ遺伝子、ＬＲＰＰＲＣ遺伝子、又はＲＣＮ１遺伝子が挙げられる。後記実施例に示すように、これらの抗Ｆｌｕ遺伝子がコードするタンパク質は、１１種のインフルエンザウイルスタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２、及びＰＢ１−Ｆ２）と直接的又は間接的に結合するタンパク質であり、両者の相互作用がインフルエンザウイルスのライフサイクルに重要な役割を果たす。
本発明に係る抗Ｆｌｕ遺伝子のうち、ＪＡＫ１遺伝子、ＣＨＥＲＰ遺伝子、ＤＤＸ２１遺伝子、ＤＮＡＪＣ１１遺伝子、ＥＥＦ１Ａ２遺伝子、ＨＮＲＮＰＫ遺伝子、ＩＴＭ２Ｂ遺伝子、ＭＲＣＬ３遺伝子、ＭＹＨ１０遺伝子、ＮＤＵＦＳ８遺伝子、ＰＳＭＤ１３遺伝子、ＲＰＬ２６遺伝子、ＳＤＦ２Ｌ１遺伝子、ＳＤＦ４遺伝子、ＳＦＲＳ２Ｂ遺伝子、ＳＮＲＰＣ遺伝子、ＳＱＳＴＭ１遺伝子、ＴＡＦ１５遺伝子、ＴＯＭＭ４０遺伝子、ＴＲＭ２Ｂ遺伝子、ＵＳＰ９Ｘ遺伝子、ＢＡＳＰ１遺伝子、ＴＨＯＣ２遺伝子、ＰＰＰ６Ｃ遺伝子、ＴＥＳＣ遺伝子、及びＰＣＤＨＢ１２遺伝子は、宿主細胞内におけるインフルエンザウイルスのｖＲＮＡ又はＮＰタンパク質のインフルエンザウイルス様粒子への取込みに関与するタンパク質をコードする遺伝子である。このため、これらの遺伝子の発現を抑制させる作用、又はこれらの遺伝子がコードするタンパク質の機能を抑制させる作用を有する物質を宿主細胞に投与することにより、宿主細胞内においてｖＲＮＡ又はＮＰタンパク質のインフルエンザウイルス様粒子への取込みが抑制される結果、抗インフルエンザウイルス効果（インフルエンザウィルスの複製阻害効果）が奏される。
本発明に係る抗Ｆｌｕ遺伝子のうち、ＣＣＤＣ５６遺伝子、ＣＬＴＣ遺伝子、ＣＹＣ１遺伝子、ＮＩＢＰ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１５遺伝子、Ｃ１４ｏｒｆ１７３遺伝子、ＡＮＰ３２Ｂ遺伝子、ＢＡＧ３遺伝子、ＢＲＤ８遺伝子、ＣＣＤＣ１３５遺伝子、ＤＤＸ５５遺伝子、ＤＰＭ３遺伝子、ＥＥＦ２遺伝子、ＩＧＦ２ＢＰ２遺伝子、ＫＲＴ１４遺伝子、及びＳ１００Ａ４遺伝子は、宿主細胞内におけるインフルエンザウイルスの複製又は転写に関与するタンパク質をコードする。このため、これらの遺伝子の発現を抑制させる作用、又はこれらの遺伝子がコードするタンパク質の機能を抑制させる作用を有する物質を宿主細胞に投与することにより、宿主細胞内においてインフルエンザウイルスの複製又は転写が抑制される結果、抗インフルエンザウイルス効果が奏される。
本発明に係る抗Ｆｌｕ遺伝子のうち、ＡＳＣＣ３Ｌ１遺伝子、ＢＲＤ８遺伝子、Ｃ１９ｏｒｆ４３遺伝子、ＤＤＸ５５遺伝子、ＤＫＦＺｐ５６４Ｋ１４２遺伝子、ＤＰＭ３遺伝子、ＥＥＦ２遺伝子、ＦＡＭ７３Ｂ遺伝子、ＦＬＪ２０３０３遺伝子、ＧＢＦ１遺伝子、ＮＣＬＮ遺伝子、Ｃ１４ｏｒｆ１７３遺伝子、ＬＲＰＰＲＣ遺伝子、及びＲＣＮ１遺伝子は、宿主細胞内におけるインフルエンザウイルス様粒子の形成に関与するタンパク質をコードする。このため、これらの遺伝子の発現を抑制させる作用、又はこれらの遺伝子がコードするタンパク質の機能を抑制させる作用を有する物質を宿主細胞に投与することにより、宿主細胞内においてインフルエンザウイルス様粒子の形成が抑制される結果、抗インフルエンザウイルス効果が奏される。
本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤としては、本発明に係る抗Ｆｌｕ遺伝子の発現を抑制させる作用を有する物質を有効成分とするものが挙げられる。抗Ｆｌｕ遺伝子の発現を抑制させる作用を有する物質としては、例えば、抗Ｆｌｕ遺伝子のｃＤＮＡの部分領域（ＲＮＡｉ（ＲＮＡ干渉）標的領域）のセンス鎖とアンチセンス鎖からなる二本鎖構造を有するｓｉＲＮＡ（ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ）、ｓｈＲＮＡ（ｓｈｏｒｔ ｈａｉｒｐｉｎ ＲＮＡ）又はｍｉＲＮＡ（ｍｉｃｒｏ ＲＮＡ）が挙げられる。また、宿主細胞内において、ｓｉＲＮＡ等を生産させることができるＲＮＡｉ誘導ベクターであってもよい。ｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びＲＮＡｉ誘導ベクターの作製は、標的とする抗Ｆｌｕ遺伝子のｃＤＮＡの塩基配列情報から、常法により設計し製造することができる。また、ＲＮＡｉ誘導ベクターは、市販の各種ＲＮＡｉベクターの塩基配列に、ＲＮＡｉ標的領域の塩基配列を挿入することによって作製することもできる。
本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤としては、本発明に係る抗Ｆｌｕ遺伝子がコードするタンパク質の機能（以下、単に「本発明に係る抗Ｆｌｕ遺伝子の機能」ということがある。）を抑制させる作用を有する物質を有効成分とするものが挙げられる。抗Ｆｌｕ遺伝子の機能を抑制させる作用を有する物質としては、本発明に係る抗Ｆｌｕ遺伝子がコードするタンパク質（以下、単に「本発明に係る抗Ｆｌｕタンパク質」ということがある。）に対する抗体のように、本発明に係る抗Ｆｌｕタンパク質と結合することにより、当該タンパク質の機能を抑制する物質が挙げられる。当該抗体としては、モノクローナル抗体でもよく、ポリクローナル抗体でもよい。また、キメラ抗体、一本鎖抗体、ヒト化抗体等の人工的に合成された抗体であってもよい。これらの抗体は、常法により製造することができる。
本発明に係る抗Ｆｌｕタンパク質が酵素であった場合、抗Ｆｌｕ遺伝子の機能を抑制させる作用を有する物質としては、当該酵素に対する阻害剤であってもよい。
本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤としては、１種類の抗Ｆｌｕ遺伝子の発現や機能を抑制する作用を有するものであってもよく、２種類以上の抗Ｆｌｕ遺伝子の発現や機能を抑制する作用を有するものであってもよい。
本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤としては、ＪＡＫ１遺伝子、ＧＢＦ１遺伝子、及びＵＳＰ９Ｘ遺伝子からなる群より選択される１種以上の抗Ｆｌｕ遺伝子の発現や機能を抑制する作用を有するものが好ましく、ＪＡＫ１遺伝子及びＧＢＦ１遺伝子からなる群より選択される１種以上の抗Ｆｌｕ遺伝子の発現や機能を抑制する作用を有するものがより好ましく、ＪＡＫ１遺伝子の発現や機能を抑制する作用を有するものがさらに好ましい。
ＪＡＫ１遺伝子の機能を抑制する作用を有する物質としては、Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ Ｎｏ．：９４１６７８−４９−５）やＴｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ（ＣＡＳ Ｎｏ．：４７７６００−７５−２）等のＪＡＫ阻害剤が挙げられる。Ｒｕｘｏｌｉｔｉｎｉｂは骨髄線維症の治療薬として、Ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂはリウマチ薬として、それぞれ承認されており、人体に対して比較的安全に使用可能な物質である。また、ＧＢＦ１遺伝子の機能を抑制する作用を有する物質としては、Ｇｏｌｇｉｃｉｄｅ Ａ（ＣＡＳ Ｎｏ．：１００５０３６−７３−６）が挙げられる。Ｇｏｌｇｉｃｉｄｅ Ａは、投与濃度を適切に設定することによって宿主細胞の増殖に影響を及ぼすことなくインフルエンザウイルスの増殖を抑制することができる。
その他、Ｔｏｆａｃｉｔｉｎｉｂ（ＣＰ−６９０５５０）Ｃｉｔｒａｔｅ（3-((3R,4R)-4-methyl-3-(methyl(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)amino)piperidin-1-yl)-3-oxopropanenitrile）、Ｔｙｒｐｈｏｓｔｉｎ Ｂ４２（ＡＧ−４９０）（(E)-N-benzyl-2-cyano-3-(3,4-dihydroxyphenyl)acrylamide）、Ｂａｒｉｃｉｔｉｎｉｂ（ＬＹ３００９１０４、ＩＮＣＢ０２８０５０）（2-[1-ethylsulfonyl-3-[4-(7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)pyrazol-1-yl]azetidin-3-yl]acetonitrile）、ＡＴ９２８３（1-cyclopropyl-3-(3-(5-(morpholinomethyl)-1H-benzo[d]imidazol-2-yl)-1H-pyrazol-4-yl)urea）、Ｍｏｍｅｌｏｔｉｎｉｂ（ＣＹＴ３８７）（N-(cyanomethyl)-4-(2-(4-morpholinophenylamino)pyrimidin-4-yl)benzamide）、ＣＥＰ３３７７９（[1,2,4]Triazolo[1,5-a]pyridin-2-amine, N-[3-(4-methyl-1-piperazinyl)phenyl]-8-[4-(methylsulfonyl)phenyl]-）、ＮＶＰ−ＢＳＫ８０５（8-(3,5-difluoro-4-(morpholinomethyl)phenyl)-2-(1-(piperidin-4-yl)-1H-pyrazol-4-yl)quinoxaline）、ＺＭ３９９２３（1-Propanone, 3-[(1-methylethyl)(phenylmethyl)amino]-1-(2-naphthalenyl)-, hydrochloride (1:1)）、Ｆｉｌｇｏｔｉｎｉｂ（ＧＬＰＧ０６３４）（N-[5-[4-[(1,1-Dioxido-4-thiomorpholinyl)methyl]phenyl][1,2,4]triazolo[1,5-a]pyridin-2-yl]cyclopropanecarboxamide）、ＪＡＮＥＸ−１（4-[(6,7-dimethoxy-4-quinazolinyl)amino]-phenol）、ＮＶＰ−ＢＳＫ８０５（4-[[2,6-difluoro-4-[3-(1-piperidin-4-ylpyrazol-4-yl)quinoxalin-5-yl]phenyl]methyl]morpholine;dihydrochloride）、ＳＢ１３１７（20-Oxa-5,7,14,27-tetraazatetracyclo[19.3.1.12,6.18,12]heptacosa-1(25),2,4,6(27),8,10,12(26),16,21,23-decaene, 14-methyl-）等のＪＡＫ阻害剤も、本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤として用いられる。また、ＵＳＰ９Ｘ遺伝子の機能を抑制する作用を有する物質としては、ＤＵＢ阻害剤であるＷＰ１１３０（Ｄｅｇｒａｓｙｎ）（(2E)-3-(6-bromo-2-pyridinyl)-2-cyano-N-[1S-phenylbutyl]-2-propenamide）が挙げられる。
本発明に係る抗Ｆｌｕ遺伝子の発現を抑制させる作用を有する物質を有効成分とする場合、本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤としては、抗Ｆｌｕ遺伝子の発現量を、当該抗インフルエンザウイルス剤の非存在下と比べて、５０％以上低下させられるものであることが好ましく、７５％以上低下させられるものであることがより好ましく、８０％以上低下させられるものであることがさらに好ましい。同様に、抗Ｆｌｕ遺伝子の機能を抑制させる作用を有する物質を有効成分とする場合、本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤としては、抗Ｆｌｕ遺伝子の機能を、当該抗インフルエンザウイルス剤の非存在下と比べて、５０％以上低下させられるものであることが好ましく、７５％以上低下させられるものであることがより好ましく、８０％以上低下させられるものであることがさらに好ましい。
本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤は、動物に対するインフルエンザウイルスの感染予防や、インフルエンザウイルスに感染した動物に対する治療に用いることができる。インフルエンザウイルスへの感染予防又はインフルエンザに対する治療のために本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤が投与される動物としては、例えば、ヒト、サル、ブタ、ウマ、イヌ、ネコ、トラ等の哺乳類；ニワトリ、アヒル、ウズラ、ガチョウ、カモ、シチメンチョウ、セキセイインコ、オウム、オシドリ、ハクチョウ等の鳥類が挙げられる。本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤としては、ヒトに対するインフルエンザウイルスの感染予防や、インフルエンザウイルスに感染した動物に対する治療に用いられるものであることが好ましい。
インフルエンザの治療は、インフルエンザウイルスに感染した動物又はインフルエンザウイルスへの感染を予防する必要のある動物に対して、本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤を有効量投与することにより行える。抗インフルエンザウイルス剤の有効量は、投与された動物に対し、投与されていない場合に比べて体内のインフルエンザウイルスの量を低減させられる量、又はインフルエンザウイルスに対する感染を防止できる量であればよく、当該抗インフルエンザウイルス剤により重篤な副作用が生じない量であることが好ましい。各抗インフルエンザウイルス剤の有効量は、抗インフルエンザウイルス剤の種類、投与対象の動物の種類、投与方法等を考慮して実験的に求めることができる。例えば、インフルエンザウイルスを感染させた実験動物に対して投与した場合に、投与していない実験動物と比べて当該実験動物の体内におけるインフルエンザウイルス量を、ＰＦＵで７０％以下、好ましくは８０％以下、より好ましくは９０％以下にできる量を、有効量と規定することもできる。
本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤は、経口投与、静注、鼻腔又は口腔への直接投与、経皮投与等の各種投与形態に適した剤型に、常法により製剤化できる。当該剤型としては、錠剤、散剤、顆粒剤、カプセル剤、チュアブル剤、シロップ剤、液剤、懸濁剤、注射剤、含嗽剤、噴霧剤、貼付剤、軟膏剤等が挙げられる。
本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤は、抗Ｆｌｕ遺伝子の発現や機能を抑制する作用を有する物質に加えて、各種添加剤を含有していてもよい。当該添加剤としては、賦形剤、結合剤、滑沢剤、湿潤剤、溶剤、崩壊剤、溶解補助剤、懸濁化剤、乳化剤、等張化剤、安定化剤、緩衝剤、防腐剤、抗酸化剤、矯味矯臭剤、着色剤等が挙げられる。これらの添加剤としては、薬学上許容される物質であって、医薬の製剤化に使用されているものの中から適宜選択して使用することができる。
＜抗インフルエンザウイルス剤のスクリーニング方法＞
本発明に係る抗インフルエンザウイルス剤のスクリーニング方法（以下、「本発明に係るスクリーニング方法」ということがある。）は、抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物をスクリーニングする方法であって、本発明に係る抗Ｆｌｕ遺伝子の発現又は機能に対する抑制又は阻害能がある候補化合物を、抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物としてスクリーニングすることを特徴とする。本発明に係るスクリーニング方法においては、１種類の抗Ｆｌｕ遺伝子の発現又は機能に対する抑制又は阻害能がある物質をスクリーニングする方法であってもよく、２種類以上の抗Ｆｌｕ遺伝子の発現又は機能に対する抑制又は阻害能がある物質をスクリーニングする方法であってもよい。
具体的には、抗Ｆｌｕ遺伝子の発現に対する抑制能又は阻害能がある物質のスクリーニングは、まず、細胞に、抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物か否かを評価する対象の化合物を導入し、抗Ｆｌｕ遺伝子の発現が抑制されたか否かを調べる。抗Ｆｌｕ遺伝子の発現が有意に抑制された場合には、当該化合物を抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物として選抜する。すなわち、細胞に、抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物か否かを評価する対象の化合物を導入する工程と、当該化合物を導入した細胞中における抗Ｆｌｕ遺伝子の発現量を測定する工程と、当該抗Ｆｌｕ遺伝子の発現量が、当該化合物が導入される前の細胞における当該抗Ｆｌｕ遺伝子の発現量よりも有意に低減された場合に、当該化合物を抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物として選抜する工程と、により行う。
スクリーニングに使用する細胞は、インフルエンザウイルスの宿主となる生物種の細胞であることが好ましく、取扱いの利便性から、哺乳類や鳥類の培養細胞株であることがより好ましく、ヒトの培養細胞株であることがさらに好ましい。また、評価対象の化合物は、エレクトロポレーション法、リポフェクション法、リン酸カルシウム法等により、細胞内へ導入することができる。評価対象の化合物が低分子化合物である場合には、当該化合物を培養液に添加することにより、当該化合物を細胞内へ導入することができる。
抗Ｆｌｕ遺伝子の発現量の変化は、ｍＲＮＡレベルで評価してもよく、タンパク質レベルで評価してもよい。例えば、ＲＴ−ＰＣＲ法等の核酸増幅反応を利用したり、免疫組織化学法やウェスタンブロット法により、抗Ｆｌｕ遺伝子の発現量を定量的に比較することができる。具体的には、例えば、評価対象の化合物を導入した状態で１〜２日間培養した細胞から抽出されたＲＮＡから逆転写反応により合成されたｃＤＮＡを鋳型として抗Ｆｌｕ遺伝子のｃＤＮＡの全長又は一部分を増幅するＰＣＲを行う。得られた増幅産物量が、当該化合物を導入する前の細胞から同様にして得られた増幅産物量よりも有意に減少している場合に、当該化合物は抗Ｆｌｕ遺伝子の発現に対する抑制能又は阻害能があると評価される。また、例えば、評価対象の化合物を導入した状態で１〜２日間培養した細胞と当該化合物を導入する前の細胞に対して、細胞内の抗Ｆｌｕタンパク質を蛍光標識した抗体を用いて染色し、細胞当たりの蛍光強度を比較する。当該化合物を導入した細胞の細胞当たりの蛍光強度が、当該化合物を導入していない細胞よりも有意に小さい場合には、当該化合物は抗Ｆｌｕ遺伝子の発現に対する抑制又は阻害能があると評価される。また、例えば、評価対象の化合物を導入した状態で１〜２日間培養した細胞と当該化合物を導入する前の細胞の細胞抽出液（ライセート）を電気泳動して分離した後に膜に転写し、当該膜上の抗Ｆｌｕタンパク質バンドを蛍光標識した抗体を用いて染色し、バンドの蛍光強度を比較する。当該化合物を導入した細胞に由来する抗Ｆｌｕタンパク質バンドの蛍光強度が、当該化合物を導入していない細胞よりも有意に小さい場合には、当該化合物は抗Ｆｌｕ遺伝子の発現に対する抑制又は阻害能があると評価される。
抗Ｆｌｕタンパク質の機能が、特定の生体分子との相互作用である場合には、例えば、抗Ｆｌｕタンパク質と当該特定の生体分子との結合アッセイを、評価対象の化合物の存在下と非存在下において行い、評価対象の化合物の存在下において非存在下よりも両者の結合性が低下した場合に、当該化合物は抗Ｆｌｕ遺伝子の機能に対する抑制又は阻害能があると評価される。また、抗Ｆｌｕタンパク質が酵素である場合には、例えば、抗Ｆｌｕタンパク質の酵素活性を評価対象の化合物の存在下と非存在下において測定し、評価対象の化合物の存在下において非存在下よりも抗Ｆｌｕタンパク質の酵素活性が低下した場合に、当該化合物は抗Ｆｌｕ遺伝子の機能に対する抑制又は阻害能があると評価される。
次に、実施例等により本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらの例によって限定されるものではない。
＜細胞の培養＞
以下の実施例において、ＨＥＫ２９３細胞及びＡ５４９細胞（ヒト肺上皮細胞由来）は、１０％ＦＣＳ（ウシ胎児血清）と抗生物質を含有させたＤＭＥＭ培地（シグマアルドリッチ社製）で、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で培養した。ＭＤＣＫ（Madin-Darby canine kidney）細胞は、５％ＮＣＳ（ウシ新生児血清）含有イーグル最小必須培地（Eagle's MEM）（GIBCO社製）で、５％二酸化炭素雰囲気下、３７℃で培養した。
＜インフルエンザウイルス＞
以下の実施例において使用したインフルエンザウイルスは、特に記載のない限り、Ａ型インフルエンザウイルス（Ａ／ＷＳＮ／３３，Ｈ１Ｎ１サブタイプ；ＷＳＮ）を用いた。当該ウイルスは、マウスに適応したヒト由来インフルエンザウイルスであり、リバースジェネティックスを用いた手法（非特許文献７参照。）により作製されたものであり、ＭＤＣＫ細胞中で増殖させた。また、ウイルスの力価は、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイにより測定した（非特許文献８参照。）。
ＰＢ２−ＫＯ／Ｒｌｕｃウイルス（ホタルルシフェラーゼ遺伝子を有するＰＢ２ノックアウトウイルス）は、複製能が欠落したウイルスであり、ポリメラーゼＰＢ２タンパク質のコード領域に、レニラルシフェラーゼをコードするレポーター遺伝子を有する。ＰＢ２−ＫＯ／Ｒｌｕｃウイルスは、pPolIPB2(120)Rluc(120)（ＰＢ２セグメントに由来するＮ末端及びＣ末端の１２０塩基に挟まれたレニラルシフェラーゼ遺伝子をコードするプラスミド）と、７つのウイルスＲＮＡセグメントをコードするプラスミドとから製造した。ＰＢ２−ＫＯ／Ｒｌｕｃウイルスの増殖と力価の測定は、ＰＢ２タンパク質を恒常的に発現しているＭＤＣＫ細胞中にて行った（非特許文献９参照。）。
＜抗体＞
以下の実施例において使用したマウス抗ＨＡ抗体（ＷＳ３−５４）、マウス抗ＮＡ抗体（ＷＳ５−２９）、及びマウス抗Ｍ１抗体（ＷＳ−２７／５２）は、国立感染症研究所の高下恵美主任研究官から提供されたものを用いた。マウス抗Ａｉｃｈｉ ＮＰ抗体（２Ｓ−３４７／３）及びウサギ抗ＷＳＮウイルス抗体（Ｒ３０９）は、発明者らが常法により作製したものを用いた。抗β−アクチン（ＡＣ−７４）抗体は、シグマアルドリッチ社から購入したものを用いた。
［実施例１］
＜インフルエンザウイルスタンパク質と相互作用する宿主タンパク質の同定＞
本発明者らは、まず、免疫沈降法により、インフルエンザウイルスタンパク質と相互作用する宿主タンパク質を同定した。
具体的には、まず、１１種のインフルエンザウイルスタンパク質（ＰＢ２、ＰＢ１、ＰＡ、ＨＡ、ＮＰ、ＮＡ、Ｍ１、Ｍ２、ＮＳ１、ＮＳ２、及びＰＢ１−Ｆ２）について、それぞれ、Ｎ末端又はＣ末端にＦｌａｇタグを融合させたＦｌａｇ融合タンパク質をコードするプラスミドを、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトとした。トランスフェクションは、TransIT 293 reagent（Mirus Bio Corp製）を用いて行った。トランスフェクションから２４時間培養した細胞を、細胞溶解バッファー（50 mM Tris-HCl (pH 7.5)，150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.5% Nonidet P-40, protease inhibitor mixture Complete Mini (Roche, Mannheim, Germany)）に混合し、４℃、１時間インキュベートすることにより溶解させてライセートを得た。得られたライセートを遠心分離処理して回収した上清に、抗Ｆｌａｇ抗体が結合したアフィニティゲル（anti-FLAG M2 Affinity Gel、シグマアルドリッチ社製）を混合して４℃、１８時間インキュベートした。その後、アフィニティゲルを、細胞溶解バッファーで３回、次いでＩＰ（免疫沈降）バッファー（50 mM Tris-HCl (pH 7.5), 150 mM NaCl, 1 mM EDTA）で２回洗浄した後、０．５ｍｇ／ｍＬのＦＬＡＧペプチド（F1804，シグマアルドリッチ社製) を含有させたＩＰバッファーで４℃、２時間撹拌した。その後、遠心分離処理によりアフィニティゲルを除去し、上清を回収した。
回収された上清を、Ultrafree-MC filter（ミリポア社製）でフィルター濾過した後、含有されているタンパク質を、ｎａｎｏＬＣ−ＭＳ／ＭＳ（nanoflow liquid chromatography tandem mass spectrometry）分析により同定した。マススペクトリデータの解析には、Dina（ケーワイエーテクノロジーズ社製）を組み合わせたQ-STAR Elite（エービー・サイエックス社製）を用いた。免疫共沈降したＨＥＫ２９３細胞（宿主細胞）のタンパク質の同定は、得られたＭＳ／ＭＳシグナルを、ＲｅｆＳｅｑ（National Center for Biotechnology Informationヒトタンパク質データベース）と比較して行った。当該比較は、マスコットアルゴリズム（version 2.2.04；Matrix Science社製）を用い、下記の条件で行った：variable modifications, oxidation (Met), N-acetylation; maximum missed cleavages, 2; peptide mass tolerance, 200 ppm; MS/MS tolerance, 0.5 Da.）。タンパク質の同定は、マスコットスコアが有意に閾値を超えるＭＳ／ＭＳシグナルが少なくとも１つあることを条件とした。
この結果、３８８個の宿主タンパク質がＰＢ２タンパク質と免疫共沈降し、３２２個の宿主タンパク質がＰＢ１タンパク質と免疫共沈降し、３０４個の宿主タンパク質がＰＡタンパク質と免疫共沈降し、３５１個の宿主タンパク質がＨＡタンパク質と免疫共沈降し、５７４個の宿主タンパク質がＮＰタンパク質と免疫共沈降し、６７５個の宿主タンパク質がＮＡタンパク質と免疫共沈降し、６５９個の宿主タンパク質がＭ１タンパク質と免疫共沈降し、５３１個の宿主タンパク質がＭ２タンパク質と免疫共沈降し、１１３個の宿主タンパク質がＮＳ１タンパク質と免疫共沈降し、４２個の宿主タンパク質がＮＳ２タンパク質と免疫共沈降し、８１個の宿主タンパク質がＰＢ１−Ｆ２タンパク質と免疫共沈降した。つまり、合計１２９２個の宿主タンパク質が、１１種のインフルエンザウイルスタンパク質のいずれかと免疫共沈降した。
＜ｓｉＲＮＡ＞
次いで、免疫沈降により同定された１２９２個の宿主タンパク質をコードする遺伝子について、ＲＮＡ干渉を行い、これらのタンパク質が実際にインフルエンザウイルスの増殖に関与するか否かを調べた。使用するｓｉＲＮＡは、各宿主遺伝子について、それぞれ、ゲノムワイド Ｈｕｍａｎ ｓｉＲＮＡ Ｌｉｂｒａｒｙ（FlexiTube siRNA；キアゲン社製）から２種類を選択して用いた。また、ネガティブコントロールとして、AllStars Negative Control siRNA（キアゲン社製）（コントロールｓｉＲＮＡ）を用いた。また、ＷＳＮウイルスのＮＰ遺伝子のｓｉＲＮＡ（GGA UCU UAU UUC UUC GGA GUU）は、シグマアルドリッチ社から購入した。
具体的には、まず、RNAiMAX Reagent（Invitrogen社製）を用いて、ＨＥＫ２９３細胞に、２種類のｓｉＲＮＡを２５ｎＭずつ（最終濃度：５０ｎＭ）、２回トランスフェクションした。
＜細胞の生残性＞
ｓｉＲＮＡの２回目のトランスフェクションから２４時間経過後の細胞の生存性を、CellTiter−Glo assay system（プロメガ社製）を添付の指示書に従って用いて調べた。コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞の生細胞数に対する、各ｓｉＲＮＡを導入した細胞の生細胞数の割合を、細胞生存率（％）として算出した。
＜ｑＲＴ−ＰＣＲ＞
ｓｉＲＮＡのトランスフェクション前とトランスフェクションから４８時間経過後の細胞について、ｑＲＴ−ＰＣＲ（quantitative reverse transcription-PCR）を行い、ｓｉＲＮＡにより標的の宿主遺伝子の発現が抑制されたかを確認した。
具体的には、まず、前記＜ｓｉＲＮＡ＞と同様にしてｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、２回目のトランスフェクションから４８時間経過後の細胞を、前記細胞溶解バッファーに溶解させてライセートを調製した。調製されたライセートから、Maxwell 16 LEV simplyRNA Tissue Kit（プロメガ社製）を用いて、総ＲＮＡを抽出し、これを鋳型として、ReverTra Ace qPCR RT Master Mix（東洋紡社製）又はSuperScript III Reverse Transcriptase（Invitrogen社製）を用いて逆転写反応を行った。合成されたｃＤＮＡを鋳型とし、各宿主遺伝子に特異的なプライマーセットとTHUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（東洋紡社製）を用いて、定量的ＰＣＲを行った。各宿主遺伝子のｍＲＮＡ発現量レベルの比較は、β−アクチンを内在性標準物質とし、ΔΔＣｔ法により算出した。コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるｍＲＮＡ発現量に対する、各ｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるｍＲＮＡ発現量の割合を、ノックダウン効率（％）として算出した。
＜ウイルスの増殖性＞
２つの２４ウェルディッシュに、前記＜ｓｉＲＮＡ＞と同様にしてｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、２回目のトランスフェクション後の細胞に５０ｐｆｕ（plaque-forming unit）のインフルエンザウイルスを感染させた。ウイルス感染から４８時間経過後、培養上清を回収し、ＭＤＣＫ細胞を用いたプラークアッセイにより、ウイルスの力価を調べた。各ｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるウイルス力価の常用対数値を、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞におけるウイルス力価の常用対数値で割った値を、ウイルス力価の変化量として算出した。
この結果、３２３個の宿主遺伝子において、ｓｉＲＮＡのトランスフェクションにより遺伝子発現レベルが低下した。この３２３個のうち、２９９個の宿主遺伝子では、常用対数値で２以上インフルエンザウイルスの力価が低下し（すなわち、ウイルス力価の変化量が−２以上）、２４個の宿主遺伝子では、常用対数値で１以上インフルエンザウイルスの力価が向上した（すなわち、ウイルス力価の変化量が１以上）。中でも、以下の９１個の宿主遺伝子は、宿主細胞の生存性が８０％以上維持されているにもかかわらず、常用対数値で３以上インフルエンザウイルスの力価が低下しており、抗インフルエンザウイルス剤の標的として有用であることが示唆された：ＡＮＰ３２Ｂ遺伝子、ＡＰ２Ａ２遺伝子、ＡＳＣＣ３Ｌ１遺伝子、ＡＴＰ５Ｏ遺伝子、ＢＡＧ３遺伝子、ＢＡＳＰ１遺伝子、ＢＲＤ８遺伝子、ＢＵＢ３遺伝子、Ｃ１４ｏｒｆ１７３遺伝子、Ｃ１９ｏｒｆ４３遺伝子、ＣＡＰＲＩＮ１遺伝子、ＣＣＤＣ１３５遺伝子、ＣＣＤＣ５６遺伝子、ＣＨＥＲＰ遺伝子、ＣＩＲＢＰ遺伝子、ＣＬＴＣ遺伝子、ＣＮＯＴ１遺伝子、ＣＴＮＮＢ１遺伝子、ＣＹＣ１遺伝子、ＤＤＸ２１遺伝子、ＤＤＸ５５遺伝子、ＤＫＦＺｐ５６４Ｋ１４２遺伝子、ＤＮＡＪＣ１１遺伝子、ＤＰＭ３遺伝子、ＥＥＦ１Ａ２遺伝子、ＥＥＦ２遺伝子、ＦＡＭ７３Ｂ遺伝子、ＦＬＪ２０３０３遺伝子、ＧＢＦ１遺伝子、ＧＥＭＩＮ４遺伝子、ＨＮＲＮＰＫ遺伝子、ＩＡＲＳ遺伝子、ＩＧＦ２ＢＰ２遺伝子、ＩＴＧＡ３遺伝子、ＩＴＧＢ４ＢＰ遺伝子、ＩＴＭ２Ｂ遺伝子、ＪＡＫ１遺伝子、ＫＩＡＡ０６６４遺伝子、ＫＲＴ１４遺伝子、ＬＲＰＰＲＣ遺伝子、ＭＲＣＬ３遺伝子、ＭＹＨ１０遺伝子、ＮＣＡＰＤ３遺伝子、ＮＣＬＮ遺伝子、ＮＤＵＦＡ１０遺伝子、ＮＤＵＦＳ８遺伝子、ＮＦＩＡ遺伝子、ＮＩＢＰ遺伝子、ＮＵＰ１６０遺伝子、ＮＵＰ２０５遺伝子、ＰＣＤＨＢ１２遺伝子、ＰＨＢ遺伝子、ＰＰＰ６Ｃ遺伝子、ＰＳＭＡ４遺伝子、ＰＳＭＡ５遺伝子、ＰＳＭＢ２遺伝子、ＰＳＭＣ１遺伝子、ＰＳＭＣ４遺伝子、ＰＳＭＣ６遺伝子、ＰＳＭＤ１１遺伝子、ＰＳＭＤ１２遺伝子、ＰＳＭＤ１３遺伝子、ＰＳＭＤ１４遺伝子、ＰＳＭＤ２遺伝子、ＰＳＭＤ６遺伝子、ＲＣＮ１遺伝子、ＲＰＬ２６遺伝子、Ｓ１００Ａ４遺伝子、ＳＡＭＨＤ１遺伝子、ＳＤＦ２Ｌ１遺伝子、ＳＤＦ４遺伝子、ＳＦ３Ａ２遺伝子、ＳＦ３Ｂ２遺伝子、ＳＦ３Ｂ４遺伝子、ＳＦＲＳ１０遺伝子、ＳＦＲＳ２Ｂ遺伝子、ＳＮＲＰ７０遺伝子、ＳＮＲＰＣ遺伝子、ＳＮＲＰＤ３遺伝子、ＳＱＳＴＭ１遺伝子、ＳＴＫ３８遺伝子、ＴＡＦ１５遺伝子、ＴＥＳＣ遺伝子、ＴＨＯＣ２遺伝子、ＴＯＭＭ４０遺伝子、ＴＲＩＭ２８遺伝子、ＵＡＰ１遺伝子、ＵＳＰ９Ｘ遺伝子、ＶＣＰ遺伝子、ＸＰＯ１遺伝子、ＺＣ３Ｈ１５遺伝子。
前記９１個の宿主遺伝子のウイルス力価の変化量、細胞生存率（％）、及びノックダウン効率（％）を、表１〜３に示す。
＜細胞内タンパク質の合成に対する影響＞
これらの９１個の宿主遺伝子発現の抑制が、細胞内タンパク質合成に影響を及ぼすか否かを調べた。
具体的には、前記＜ｓｉＲＮＡ＞と同様にしてｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、２回目のトランスフェクションから２４時間経過後の細胞に、細胞内で機能するＲＮＡポリメラーゼIIプロモーター（例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター）の制御下でレニラルシフェラーゼを発現させるプラスミドを、コントロールとして用いた。
トランスフェクションから４８時間経過後の細胞に対して、Renilla Luciferase Assay System（プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼ活性は、GloMax-96 Microplate Luminometer（プロメガ社製）を用いて計測した。
コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞のレニラルシフェラーゼ活性に対する、各ｓｉＲＮＡを導入した細胞のレニラルシフェラーゼ活性の割合を、細胞内タンパク質の合成効率（％）として算出した。算出した細胞内タンパク質の合成効率（％）を表４に示す。この結果、前記９１個の宿主遺伝子のうち、２８個の宿主遺伝子（ＡＴＰ５Ｏ遺伝子、ＣＮＯＴ１遺伝子、ＧＥＭＩＮ４遺伝子、ＩＴＧＢ４ＢＰ遺伝子、ＮＣＡＰＤ３遺伝子、ＮＵＰ１６０遺伝子、ＮＵＰ２０５遺伝子、ＰＳＭＡ４遺伝子、ＰＳＭＡ５遺伝子、ＰＳＭＢ２遺伝子、ＰＳＭＣ１遺伝子、ＰＳＭＣ４遺伝子、ＰＳＭＤ１１遺伝子、ＰＳＭＤ２遺伝子、ＰＳＭＤ６遺伝子、ＳＦ３Ａ２遺伝子、ＳＦ３Ｂ４遺伝子、ＳＮＲＰＤ３遺伝子、ＶＣＰ遺伝子、ＰＳＭＣ６遺伝子、ＰＳＭＤ１２遺伝子、ＰＳＭＤ１４遺伝子、ＳＡＭＨＤ１遺伝子、ＳＦ３Ｂ２遺伝子、ＳＮＲＰ７０遺伝子、ＣＡＰＲＩＮ１遺伝子、ＰＨＢ遺伝子、及びＳＦＲＳ１０遺伝子）のｓｉＲＮＡを導入した細胞において、ホタルルシフェラーゼ活性がコントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞に比べて８０％以上（ｐ＜０．０５）も低下していた。この結果から、これらの宿主遺伝子は宿主細胞における転写や翻訳に関与しており、これらの宿主遺伝子の発現を低下させることにより、インフルエンザウイルスの転写や翻訳が抑制され、ひいてはインフルエンザウイルスの複製が阻害されることが示唆された。
＜ミニレプリコンアッセイ＞
前記９１個の宿主遺伝子が、ウイルスゲノム複製及び転写に関与しているか否かを、インフルエンザウイルスのＲＮＡポリメラーゼ活性を調べるミニレプリコンアッセイ（非特許文献１０参照。）により調べた。より詳細には、ミニレプリコンアッセイは、ホタルルシフェラーゼレポータータンパク質をコードするウイルス様ＲＮＡの複製活性に基づくウイルス複製複合体（ＰＢ２タンパク質、ＰＢ１タンパク質、ＰＡタンパク質、及びＮＰタンパク質を含有する複合体）の活性を調べるアッセイである。
具体的には、前記＜ｓｉＲＮＡ＞と同様にしてｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、２回目のトランスフェクションから２４時間経過後の細胞に、ＰＡを発現させるためのプラスミド、ＰＢ１を発現させるためのプラスミド、ＰＢ２を発現させるためのプラスミド、ＮＰを発現させるためのプラスミド、及びホタルルシフェラーゼをコードするウイルス様ＲＮＡを発現させるためのプラスミド（ｐＰｏｌＩＮＰ（０）ｌｕｃ２（０））をトランスフェクションした。なお、ＰＡ、ＰＢ１、ＰＢ２又はＮＰを発現させるためのプラスミドは、それぞれ、プラスミドｐＣＡＧＧＳのマルチクローニングサイトに各タンパク質をコードするｃＤＮＡを組み込んだものである。また、宿主細胞内で機能するＲＮＡポリメラーゼIIプロモーター（例えば、ニワトリβ−アクチンプロモーター）の制御下でレニラルシフェラーゼを発現させるプラスミドを、コントロールとして用いた。
トランスフェクションから４８時間経過後の細胞に対して、Dual-Glo Luciferase assay system（プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った。ルシフェラーゼ活性は、GloMax-96 Microplate Luminometer（プロメガ社製）を用いて計測した。ウイルスＲＮＡポリメラーゼ活性は、レニラルシフェラーゼ活性によりノーマライズされたホタルルシフェラーゼ活性として算出した。
コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞のホタルルシフェラーゼ活性に対する、各ｓｉＲＮＡを導入した細胞のホタルルシフェラーゼ活性の割合を、ウイルスポリメラーゼ活性（％）として算出した。このウイルスポリメラーゼ活性は、ホタルルシフェラーゼレポータータンパク質の発現レベルを示し、ウイルスゲノム複製及び転写の効率の指標となる。算出したウイルスポリメラーゼ活性（％）を表５に示す。この結果、前記９１個の宿主遺伝子のうち、９個の宿主遺伝子（ＢＵＢ３遺伝子、ＣＣＤＣ５６遺伝子、ＣＬＴＣ遺伝子、ＣＹＣ１遺伝子、ＮＩＢＰ遺伝子、ＺＣ３Ｈ１５遺伝子、Ｃ１４ｏｒｆ１７３遺伝子、ＣＴＮＮＢ１遺伝子、及びＡＮＰ３２Ｂ遺伝子）のｓｉＲＮＡを導入した細胞において、ウイルスポリメラーゼ活性、すなわちウイルスゲノム複製及び転写が、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞に比べて５０％以上（ｐ＜０．０５）も低下していた。この結果から、これらの宿主遺伝子がウイルスゲノム複製及び転写に関与しており、これらの宿主遺伝子の発現を低下させることにより、インフルエンザウイルスのゲノム複製及び転写が抑制されることが示唆された。
＜ＰＢ２−ＫＯ／Ｒｌｕｃウイルスアッセイ＞
前記９１個の宿主遺伝子について、ウイルスのライフサイクルの初期段階に関与するか否かを調べるため、ＰＢ２−ＫＯ／Ｒｌｕｃウイルスアッセイを行い、ウイルスの侵入効率を調べた。
具体的には、前記＜ｓｉＲＮＡ＞と同様にしてｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、２回目のトランスフェクションから２４時間経過後の細胞に、ＰＢ２−ＫＯ／Ｒｌｕｃウイルスを感染させた。感染から８時間経過後の細胞に対して、Renilla Luciferase Assay System（プロメガ社製）を用いて、ルシフェラーゼアッセイを行った。蛍光は、GloMax-96 Microplate Luminometer（プロメガ社製）を用いて計測した。
コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞のレニラルシフェラーゼ活性に対する、各ｓｉＲＮＡを導入した細胞のレニラルシフェラーゼ活性の割合を、ウイルスの侵入効率（％）として算出した。算出したウイルス侵入効率（％）を表６に示す。この結果、前記９１個の宿主遺伝子のうち、２３個の宿主遺伝子（ＳＦ３Ａ２遺伝子、ＧＥＭＩＮ４遺伝子、ＳＦＲＳ１０遺伝子、ＢＡＧ３遺伝子、ＣＡＰＲＩＮ１遺伝子、ＣＣＤＣ１３５遺伝子、ＩＧＦ２ＢＰ２遺伝子、ＫＲＴ１４遺伝子、ＡＴＰ５Ｏ遺伝子、ＳＡＭＨＤ１遺伝子、ＰＳＭＤ６遺伝子、ＢＲＤ８遺伝子、ＰＳＭＤ１１遺伝子、ＳＦ３Ｂ２遺伝子、ＳＦ３Ｂ４遺伝子、ＤＰＭ３遺伝子、ＮＣＡＰＤ３遺伝子、ＥＥＦ２遺伝子、ＰＨＢ遺伝子、ＮＵＰ２０５遺伝子、Ｓ１００Ａ４遺伝子、ＰＳＭＤ１４遺伝子、及びＤＤＸ５５遺伝子）において、ウイルス侵入効率が、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞に比べて５０％以上（ｐ＜０．０５）も低下していた。この結果から、これらの宿主遺伝子はインフルエンザウイルスの宿主細胞への侵入に関与しており、これらの宿主遺伝子の発現を低下させることにより、インフルエンザウイルスの宿主細胞への侵入が阻害され、ひいてはインフルエンザウイルスの複製が阻害されることが示唆された。
また、これらの２３個の宿主遺伝子のうち、９個の宿主遺伝子（ＢＡＧ３遺伝子、ＢＲＤ８遺伝子、ＣＣＤＣ１３５遺伝子、ＤＤＸ５５遺伝子、ＤＰＭ３遺伝子、ＥＥＦ２遺伝子、ＩＧＦ２ＢＰ２遺伝子、ＫＲＴ１４遺伝子、及びＳ１００Ａ４遺伝子）は、宿主細胞の転写や翻訳には関与せず、インフルエンザウイルスの転写や翻訳に特異的に関与していることがわかった。また、これらの９個の宿主遺伝子は、前記のミニレプリコンアッセイではインフルエンザウイルスの複製の阻害活性は確認できなかったことから、これらの宿主遺伝子は、ウイルスの宿主細胞表面への結合、宿主細胞への取込み、ｖＲＮＰ（ウイルスリボ核酸タンパク質）複合体の核への移行等のウイルスのライフサイクルの初期段階において重要な役割を果たしていることが示唆された。
＜ＶＬＰフォーメーションアッセイ＞
前記９１個の宿主遺伝子が、ウイルス粒子形成に関与しているか否かを、ウイルス様粒子（virus-like particle、ＶＬＰ）フォーメーションアッセイにより調べた。
具体的には、前記＜ｓｉＲＮＡ＞と同様にしてｓｉＲＮＡをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞に、ＨＡを発現させるためのプラスミド、ＮＡを発現させるためのプラスミド、及びＭ１を発現させるためのプラスミドを、TransIT293 transfection reagent（Mirus社製）を用いてトランスフェクションした。なお、ＨＡ、ＮＡ、又はＭ１を発現させるためのプラスミドは、それぞれ、プラスミドｐＣＡＧＧＳのマルチクローニングサイトに各タンパク質をコードするｃＤＮＡを組み込んだものである。
プラスミドトランスフェクションから４８時間経過後の細胞を、１００ｍＭ ＤＴＴを含有させたSDS Sample Buffer Solution（和光純薬社製）により溶解させた。得られたライセートを回収し、遠心分離処理（３０００×ｇ、４℃、５分間）を行って、ＶＬＰを含む上清を細胞残渣から分離して回収した。得られた上清を、超遠心用チューブに注入した３０質量／容量％シュクロースを含有するＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水）の上にのせ、超遠心分離処理（５００００ｒｐｍ、４℃、１時間、SW55Ti Rotor）を行った。得られた沈殿物を、１００ｍＭ ＤＴＴを含有させたSDS Sample Buffer Solution（和光純薬社製）に溶解させたものを、ウェスタンブロッティング用サンプルとした。
調製されたウェスタンブロッティング用サンプルにTris-Glycine SDS sample buffer（Invitrogen社製）を混合したサンプルを、4%-20% Mini-PROTEAN TGX gradient gels（バイオ・ラッド社製）にアプライしてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、分離したタンパク質をＰＶＤＦ膜に転写し、転写膜をBlocking One solution（ナカライテスク社製）を用いてブロッキングした。当該転写膜を、一次抗体溶液（ウサギ抗ＷＳＮウイルス抗体（Ｒ３０９）又は抗β−アクチン（ＡＣ−７４）抗体を、Can Get Signal（東洋紡社製）に付属の溶液solution Iで希釈した溶液）中で、室温で少なくとも１時間インキュベートした。次いで、当該転写膜を０．０５容量％のＴｗｅｅｎ−２０を含有させたＴＢＳ（ＴＢＳＴ）で３回洗浄した後、二次抗体溶液（西洋ワサビペルオキシダーゼを連結したＥＣＬロバ抗マウスＩｇＧ抗体（ＧＥヘルスケア社製）を、Can Get Signal（東洋紡社製）に付属の溶液solution IIで希釈した溶液）中でインキュベートした後、ＴＢＳＴで３回洗浄した。当該転写膜を、ECL Prime Western blotting detection reagent（ＧＥヘルスケア社製）中でインキュベートした後、化学発光によるシグナルをVersaDoc Imaging System（バイオ・ラッド社製）によりＶＬＰ中のＨＡタンパク質及びＭ１タンパク質のバンドとβ−アクチンのバンドを検出した。
ＶＬＰの産生量は、ライセート中のＨＡタンパク質又はＭ１タンパク質の量に対するＶＬＰ中のＨＡタンパク質又はＭ１タンパク質の量の割合として算出した。コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞のＶＬＰの産生量に対する、各ｓｉＲＮＡを導入した細胞のＶＬＰの産生量の割合を、ＶＬＰの産生効率（％）として算出した。ＨＡタンパク質に基づくＶＬＰ生産効率（％）の結果を表７に、Ｍ１タンパク質に基づくＶＬＰ生産効率（％）の結果を表８に、それぞれ示す。この結果、前記９１個の宿主遺伝子のうち、１５個の宿主遺伝子（ＡＳＣＣ３Ｌ１遺伝子、ＢＲＤ８遺伝子、Ｃ１９ｏｒｆ４３遺伝子、ＤＤＸ５５遺伝子、ＤＫＦＺｐ５６４Ｋ１４２遺伝子、ＤＰＭ３遺伝子、ＥＥＦ２遺伝子、ＦＡＭ７３Ｂ遺伝子、ＦＬＪ２０３０３遺伝子、ＧＢＦ１遺伝子、ＮＣＬＮ遺伝子、Ｃ１４ｏｒｆ１７３遺伝子、ＸＰＯ１遺伝子、ＬＲＰＰＲＣ遺伝子、及びＲＣＮ１遺伝子）において、ＶＬＰの産生効率が、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞に比べて５０％以上（ｐ＜０．０５）も低下していた。この結果から、これらの宿主遺伝子はＶＬＰの形成に関与しており、これらの宿主遺伝子の発現を低下させることにより、ＶＬＰの形成が阻害され、ひいてはインフルエンザウイルスの複製が阻害されることが示唆された。
＜子孫ウイルス粒子へのｖＲＮＰの取込み効率＞
前記９１個の宿主遺伝子が、子孫ウイルス粒子へのｖＲＮＰの取込みに関与しているか否かを調べるため、ｖＲＮＡ及びＮＰの子孫ウイルス粒子への取込みを調べた。
具体的には、まず、前記＜ｓｉＲＮＡ＞と同様にしてｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、２回目のトランスフェクション後の細胞に、ＭＯＩ（multiplicity of infection）が５のインフルエンザウイルスを感染させた。感染から１２時間経過後に、放出されたウイルス粒子を含む培養上清を、遠心分離処理（３０００×ｇ、４℃、５分間）により細胞残渣から分離して回収した。得られた上清を、超遠心用チューブに注入した３０重量／容量％シュクロースを含有するＰＢＳの上にのせ、超遠心分離処理（５００００ｒｐｍ、４℃、１時間、SW55Ti Rotor）を行った。ウイルス粒子を含む沈殿物をＰＢＳ中でホモジナイズし、Maxwell 16 LEV simplyRNA Tissue Kitを用いてウイルスＲＮＡを抽出した。上清中のウイルスＲＮＡ量と細胞中のウイルスＲＮＡ量を、Kawakamiらの方法（非特許文献１１参照。）に準じて、鎖特異的リアルタイムＰＣＲにより定量した。なお、総ＲＮＡを鋳型とした逆転写反応は、SuperScript III Reverse Transcriptaseと、５’末端に１９塩基からなるタグ配列を付加したインフルエンザウイルスゲノム特異的プライマー（vRNAtag_NP_1F；ggccgtcatggtggcgaatAGCAAAAGCAGGGTAGATAATCACTC（小文字部分がタグ配列））を用いて行った。また、定量的ＰＣＲは、前記タグ配列に特異的なプライマー（vRNAtag；GGCCGTCATGGTGGCGAAT）と、ウイルスゲノムに特異的なプライマー（WSN-NP_100R；GTTCTCCATCAGTCTCCATC）と、６−ＦＡＭ／ＺＥＮ／ＩＢＦＱで標識されたプローブ（IDT，WSN-NP_46-70；ATGGCGACCAAAGGCACCAAACGAT）と、THUNDERBIRD Probe qPCR Mixを用いて行った。
子孫ウイルス粒子へのｖＲＮＡ及びＮＰタンパク質の取込み量は、培養上清から回収されたウイルス中におけるｖＲＮＡ又はＮＰタンパク質の量をライセート中におけるｖＲＮＡ又はＮＰタンパク質の量で割った値により決定した。コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞の子孫ウイルス粒子へのｖＲＮＡの取込み量に対する、各ｓｉＲＮＡを導入した細胞の子孫ウイルス粒子へのｖＲＮＡの取込み量の割合を、ｖＲＮＡの取込み効率（％）として算出した。コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞の子孫ウイルス粒子へのＮＰタンパク質の取込み量に対する、各ｓｉＲＮＡを導入した細胞の子孫ウイルス粒子へのＮＰタンパク質の取込み量の割合を、ＮＰタンパク質の取込み効率（％）として算出した。算出結果を表９及び１０に示す。この結果、前記９１個の宿主遺伝子のうち、１６個の宿主遺伝子（ＨＮＲＮＰＫ遺伝子、ＤＤＸ２１遺伝子、ＪＡＫ１遺伝子、ＥＥＦ１Ａ２遺伝子、ＳＦＲＳ２Ｂ遺伝子、ＤＮＡＪＣ１１遺伝子、ＳＱＳＴＭ１遺伝子、ＢＡＳＰ１遺伝子、ＰＣＤＨＢ１２遺伝子、ＫＩＡＡ０６６４遺伝子、ＳＮＲＰＣ遺伝子、ＰＰＰ６Ｃ遺伝子、ＭＲＣＬ３遺伝子、ＩＴＭ２Ｂ遺伝子、ＴＡＦ１５遺伝子、及びＳＤＦ４遺伝子）のｓｉＲＮＡを導入した細胞において、子孫ウイルス粒子へのｖＲＮＡの取込み効率が、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞に比べて５０％以上（ｐ＜０．０５）も低下しており、２７個の宿主遺伝子（ＳＦＲＳ２Ｂ遺伝子、ＢＡＳＰ１遺伝子、ＴＨＯＣ２遺伝子、ＳＮＲＰＣ遺伝子、ＫＩＡＡ０６６４遺伝子、ＰＰＰ６Ｃ遺伝子、ＨＮＲＮＰＫ遺伝子、ＩＴＭ２Ｂ遺伝子、ＳＱＳＴＭ１遺伝子、ＲＰＬ２６遺伝子、ＮＤＵＦＳ８遺伝子、ＳＤＦ２Ｌ１遺伝子、ＪＡＫ１遺伝子、ＤＤＸ２１遺伝子、ＥＥＦ１Ａ２遺伝子、ＴＲＩＭ２８遺伝子、ＳＤＦ４遺伝子、ＵＳＰ９Ｘ遺伝子、ＰＳＭＤ１３遺伝子、ＴＡＦ１５遺伝子、ＣＩＲＢＰ遺伝子、ＣＨＥＲＰ遺伝子、ＴＥＳＣ遺伝子、ＭＹＨ１０遺伝子、ＴＯＭＭ４０遺伝子、ＭＲＣＬ３遺伝子、及びＰＣＤＨＢ１２遺伝子）のｓｉＲＮＡを導入した細胞において、子孫ウイルス粒子へのＮＰタンパク質の取込み効率が、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞に比べて５０％以上（ｐ＜０．０５）も低下していた。この結果から、これらの宿主遺伝子は子孫ウイルス粒子へのｖＲＮＡ又はＮＰタンパク質の取込みに関与しており、これらの宿主遺伝子の発現を低下させることにより、ｖＲＮＡ又はＮＰタンパク質の子孫ウイルス粒子への取込みが抑制され、ひいてはインフルエンザウイルスの複製が阻害されることが示唆された。
［実施例２］
実施例１において、ｓｉＲＮＡ導入によりインフルエンザウイルスの力価が常用対数値で２以上低下した２９９個の宿主遺伝子について、公知の阻害剤が抗インフルエンザウイルス剤として使用可能かどうかを調べた。
まず、DrugBank database（非特許文献１２参照。）、IPA（Ingenuity）、及び製薬メーカー（Millipore、シグマアルドリッチ、Selleck Chemicals）のデータベースから、これらの宿主遺伝子の機能の阻害剤となる化合物を調べた。この結果、４４個の宿主遺伝子に対する阻害剤として６１個の化合物がみつかった。
前記６１個の化合物から表１１に示す１１個の阻害剤を選択し、これらの化合物のインフルエンザウイルスの複製に対する影響を調べた。これらのうち、BortezomibとColchicineは、インフルエンザウイルスの複製阻害剤として公知である（非特許文献１３及び１４参照。）。
具体的には、ＨＥＫ２９３細胞又はＡ５４９細胞に、ＭＯＩが０．００１のインフルエンザウイルスを感染させた。感染から１時間経過した細胞を洗浄した後、各阻害剤を含有する培養液中で培養した。コントロールとして、各阻害剤に代えて、ＤＭＳＯ溶液（最終濃度：１容量％）を用いた。阻害剤存在下で４８時間培養した後、培養上清を回収し、実施例１と同様にして、ウイルスの力価を求めた。また、細胞の生存率（％）は、CellTiter−Glo assay system（プロメガ社製）を添付の指示書に従って用い、コントロール（ＤＭＳＯ溶液）を含有する培地で培養した細胞の生細胞数に対する、各阻害剤を含有する培地で培養した細胞を、細胞生存率（％）として算出した。
この結果、2,3-Butanedione 2-Monoxime（30mM）、及びWP1130（50μM）は、ウイルス力価を常用対数値で５以上も低下させることができたが、細胞生存率も顕著に低下し、宿主細胞に対する毒性が強いことがわかった。公知の抗インフルエンザウイルス剤であるBortezomib（0.2μM）とColchicine（2.5μM）は、Ａ５４９細胞において、ひどい細胞毒性を示すことなく、ウイルス力価を常用対数値で４（Bortezomib）又は２（Colchicine）以上も低下させることができた。一方で、これまでインフルエンザウイルスの複製との関係性は指摘されてこなかったGolgicide A（10μM）とRuxolitinib（30μM）は、有意にウイルス力価を低下させることができた。Ruxolitinib（30μM）は、目立った細胞毒性は示さず、Golgicide A（10μM）は、ＨＥＫ２９３細胞で細胞生存率の低下が確認されたが、Ａ５４９細胞では確認されなかった。Golgicide Aの結果を図１に、Ruxolitinibの結果を図２に、それぞれ示す。これらの結果から、Histone acetyltransferase inhibitor II、Genistein、2,3-Butanedione 2-Monoxime、WP1130、Golgicide A及びRuxolitinibは、Bortezomib及びColchicineと同様に、抗インフルエンザウイルス作用を有していること、中でも、Golgicide A及びRuxolitinibは、宿主細胞への毒性が比較的小さく、抗インフルエンザウイルス剤として非常に有用であることがわかった。
［実施例３］
Ruxolitinibは、チロシンキナーゼであるＪＡＫ１に対する阻害剤である。実施例１に示すように、ｓｉＲＮＡ導入によりＪＡＫ１の発現を低下させた細胞におけるＭ１タンパク質に基づくＶＬＰ産生効率は、５７．７％であり、カットオフ値として設けた５０％に近かった。そこで、ＪＡＫ１のｓｉＲＮＡを導入した細胞を電子顕微鏡により観察し、インフルエンザウイルスのウイルス粒子形成に対するＪＡＫ１遺伝子の発現低下の影響を調べた。
具体的には、まず、前記＜ｓｉＲＮＡ＞と同様にしてＪＡＫ１遺伝子のｓｉＲＮＡ又はコントロールｓｉＲＮＡをＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクションし、２回目のトランスフェクション後の細胞に、ＭＯＩが５のインフルエンザウイルスを感染させた。感染から１２時間経過後の細胞から、Nodaらの方法（非特許文献１５）に従い、細胞の超薄切片を調製し、これを電子顕微鏡により観察した。電子顕微鏡は、Tecnai（登録商標） F20 electron microscope（FEI社製）を用いた。
コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞の電子顕微鏡写真（上段）と、ＪＡＫ１遺伝子のｓｉＲＮＡを導入した細胞の電子顕微鏡写真（下段）を、図３に示す。ＪＡＫ１遺伝子のｓｉＲＮＡを導入した細胞では、コントロールｓｉＲＮＡを導入した細胞よりも形成されているウイルス様粒子が明らかに少なく、ＪＡＫ１遺伝子の発現を低下させることにより、ウイルス粒子の形成が低下することがわかった。これらの結果から、ＪＡＫ１は、インフルエンザウイルス複製サイクルの後期に重要な役割を果たしていることが示唆された。
［実施例４］
表１２に示すタンパク質阻害剤を被験化合物として、細胞に対する毒性と、インフルエンザウイルスの増殖に対する効果を調べた。
＜細胞毒性試験＞
まず、被験化合物溶液として、被験化合物を終濃度として１０００、１００、１０、１、０．１、０．０１、又は０．００１μＭとなるように、１％ジメチルスルフォキシド含有ＭＥＭで調製した。
ＭＤＣＫ細胞、Ａ５４９細胞、及びＨＥＫ２９３細胞を、最小必須培地（minimum essential medium；MEM)でそれぞれ６．２５×１０５細胞／ｍＬ、２．５×１０６細胞／ｍＬ、１．２５×１０５細胞／ｍＬの濃度に調製した細胞液を、９６穴プレートに０．１ｍＬ／穴ずつ添加して細胞を播種した。当該９６穴プレート中の細胞を、炭酸ガス培養器中、３７℃で培養し、播種日の翌日にＭＥＭで洗浄した。洗浄後の９６穴プレート中の細胞に、各被験化合物溶液０．１ｍＬを一の濃度につき３穴に添加した後、当該９６穴プレート中の細胞を、炭酸ガス培養器中、３７℃で４８時間培養した。培養後にCell Counting Kit-8溶液（同仁化学研究所製）を各穴に１０μＬずつ添加し、さらに数時間３７℃で培養した。培養後、マイクロプレートリーダーで、当該９６穴プレートの各穴の溶液の４５０ｎｍの吸光度を測定した。被験化合物の代わりに溶媒（１％ジメチルスルフォキシド含有ＭＥＭ）を添加した時の吸光度値を全細胞が生存する１００％とし、吸光度が５０％となる時の被験化合物の終濃度値を５０％細胞毒性濃度（ＣＣ５０値）として算出した。
＜抗ウイルス効果試験＞
まず、被験化合物溶液として、被験化合物を終濃度として１０００、１００、１０、１、０．１、０．０１、又は０．００１μＭとなるように、１％ジメチルスルフォキシド含有ＭＥＭで調製した。
ＭＤＣＫ細胞、Ａ５４９細胞、及びＨＥＫ２９３細胞をＭＥＭでそれぞれ１．２５×１０６細胞／ｍＬ、５×１０６細胞／ｍＬ、２．５×１０５細胞／ｍＬの濃度に調製した細胞液を、９６穴プレートに０．１ｍＬ／穴ずつ添加して細胞を播種した。当該９６穴プレート中の細胞を、炭酸ガス培養器中３７℃で培養し、播種日の翌日にＭＥＭで洗浄した。洗浄後の９６穴プレート中の細胞に、各被験化合物溶液０．１ｍＬを一の濃度につき３穴に添加した後、当該９６穴プレート中の細胞を、炭酸ガス培養器中、３７℃で１時間培養した。培養後、各穴から被検化合物溶液を除去し、５０μＬのインフルエンザウイルスＡ／ＷＳＮ ＲＧ＃１−１株をＭＯＩ（細胞１個当たりのウイルスの感染個数）が０．００１になるように感染させ、炭酸ガス培養器中、３７℃で１時間培養した。培養後、各穴からウイルス液を除去し、１μｇ／ｍＬトリプシンを含有する被験化合物溶液を０．１ｍＬ／穴ずつ添加し、さらに３７℃で４８時間培養した。培養後の各穴のウイルスの有無を調べ、同じ濃度の被検化合物を添加した培養穴の半分（５０％）でウイルスが無しと計算される被験化合物の終濃度値を５０％ウイルス増殖阻害濃度（ＩＣ５０）として算出した。なお、各培養穴のウイルスの有無は、各培養穴から採取した５０μＬの培養液に、１％モルモット赤血球を含有する赤血球溶液５０μＬを添加した場合の凝集の有無を判定することにより行った。
各タンパク質阻害剤のＣＣ５０及びＩＣ５０の常用対数値を表１３に示す。表中、空欄は、ＩＣ５０とＣＣ５０の差が１０倍未満（常用対数値で差が１未満）であったものである。この結果、これらのタンパク質阻害剤は、少なくともＭＤＣＫ細胞、Ａ５４９細胞、及びＨＥＫ２９３細胞のいずれかにおいて、ＩＣ５０がＣＣ５０の１０倍以上低い濃度となった。つまり、これらのタンパク質阻害剤は、宿主細胞の増殖性を大きく損なうことなく、インフルエンザウイルスの増殖を抑制することが可能であり、抗インフルエンザウイルス剤の有効成分として好適であった。

Claims (5)

  1. ＪＡＫ１遺伝子の発現を抑制させる作用を有する化合物を含み、前記化合物がＪＡＫ１遺伝子に対するｓｉＲＮＡ、ｓｈＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、及びこれらを細胞内で生産させることができるＲＮＡｉ誘導ベクターからなる群より選択される１種以上であることを特徴とする、抗インフルエンザウイルス剤。
  2. ルキソリチニブ及びトファシチニブからなる群より選択される１種以上であるＪＡＫ１の機能を抑制させる作用を有する化合物を含むことを特徴とする、抗インフルエンザウイルス剤。
  3. 抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物をスクリーニングする方法であって、
    ＪＡＫ１遺伝子の発現又はＪＡＫ１の機能に対する抑制又は阻害能がある化合物を、抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物としてスクリーニングすることを特徴とする、抗インフルエンザウイルス剤のスクリーニング方法。
  4. 細胞に、抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物か否かを評価する対象の化合物を導入する工程と、
    前記化合物を導入した細胞中における前記遺伝子の発現量を測定する工程と、
    ＪＡＫ１遺伝子の発現量が、前記化合物が導入される前の細胞よりも有意に低減された場合に、当該化合物を抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物として選抜する工程と、
    を有する、請求項３に記載の抗インフルエンザウイルス剤のスクリーニング方法。
  5. ＪＡＫ１の酵素活性を、抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物か否かを評価する対象の化合物の存在下で測定する工程と、
    前記化合物の存在下におけるＪＡＫ１の酵素活性が、前記化合物の非存在下よりも低下した場合に、当該化合物を抗インフルエンザウイルス剤の候補化合物として選抜する工程と、
    を有する、請求項３に記載の抗インフルエンザウイルス剤のスクリーニング方法。
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