JP6800633B2 - 非ヒト動物において腎機能の低下を抑制する方法 - Google Patents

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Description

本発明は非ヒト動物において腎機能の低下を抑制する方法に関する。
本発明は非ヒト動物において腎機能の低下を抑制するための非ヒト動物用薬剤に関する。
ネコはペットとして昔から人間に愛着のある動物であるが、最近では「伴侶、仲間、相棒としての動物」として人間社会の一員としての地位が確立しつつある。一方、医学、薬学、獣医学、心理学などで従来から実験動物として使用されており、医薬品の安全性試験、効果検定にも使用される。このようにネコの社会的重要性が高まっている状況の中では、ネコの疾病や伝染病に対する関心が高く、その有効な治療法が望まれている。近年ネコの疾病治療においても医薬用タンパク質が注目されており、主としてヒト用の医薬用タンパク質が転用されている。しかし、ヒト用の医薬用タンパク質はネコが本来持つ生体内タンパク質とアミノ酸配列が異なるため、生体内での効果が異なる可能性がある。また、アミノ酸配列の差異により、異物として認識されることによりアレルギーを起こす可能性もあり、悪くすればアナフィラキシー様症状を引き起こす。
そこで本出願人は、ネコ用の医薬用タンパク質であるネコ由来エリスロポエチン（ｆＥＰＯ）を、トランスジェニック鳥類を用いて生産し、ネコでの腎性貧血等の疾患の治療に用いることを開示している（特許文献１、２）。
一方、慢性腎臓病（ＣＫＤ）は、ヒトに関して米国腎臓財団（ＮＫＦ）が２００１年に発表した腎疾患管理のガイドライン（Ｋｉｎｎｅｙ Ｄｉｓｅａｓｅ Ｏｕｔｃｏｍｅｓ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｉｎｉｔｉａｔｉｖｅ： Ｋ／ＤＯＱＩ）のなかで初めて提唱した疾患概念である（非特許文献１）。ＣＫＤは初期の腎機能低下状態から腎不全の末期までをも含む広い概念である。獣医学においてもＣＫＤの概念が導入され、非特許文献２では、（１）少なくとも３か月間存在する腎ダメージ（組織、血液、尿検査又は画像診断から証明されるもの）、又は、（２）少なくとも３か月間存在する糸状体ろ過率（ＧＦＲ）の低下（正常値から５０％以上のＧＦＲ低下）の少なくとも一方を満たすときＣＫＤと定義されている(非特許文献１、非特許文献２)。国際腎臓研究協会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｓｏｃｉｅｔｙ，ＩＲＩＳ）により非ヒト動物に対するＣＫＤをステージＩ〜ステージＩＶに分類するＩＲＩＳ病期分類システムが公表されている（非特許文献１、３、４）。
ＥＰＯはホルモンの一種であり赤血球の産生を調節する作用を有し、具体的には、ＥＰＯは赤芽球前駆細胞に働いて赤血球へと分化させる。腎性貧血は、腎機能が低下して腎不全の段階に至ると腎臓でのＥＰＯ生成量が減少し、それに伴い赤血球の産生量が低下することにより発症する。この他にも腎性貧血の原因としては種々の原因が考えられる。例えば、慢性腎臓病による長期間の食欲低下による栄養状態の悪化も腎性貧血の原因の１つと考えられている。さらに、尿毒症期には、尿毒素の影響で赤血球寿命の短縮が起こり、貧血を助長することが知られている。さらに高窒素血症では、奇形赤血球や破砕赤血球が出現しやすく、溶血も起こりやすいと言われている。これまでに、腎性貧血の非ヒト動物に対しネコ由来ＥＰＯを投与することで赤血球の産生を刺激する腎性貧血の治療方法が特許文献３等に開示されている。腎性貧血は、ＩＲＩＳ病期分類によるＣＫＤの後期（ステージＩＩＩ又はステージＩＶ）で現れる症状である。例えば特許文献３の実施例３３ではステージＩＩＩ又はステージＩＶのＣＫＤに罹患したネコの貧血を治療するためにネコ由来ＥＰＯを投与している。
特開２００７−８９５７８号公報 特開２０１０−１１１５９５号公報 特表２０１２−５０４１３６号公報
桑原康人，動物臨床医学，２０（３），７１−７５，２０１１ Ｐｏｌｚｉｎ ＤＪ， ｅｔ ａｌ： Ｃｈｒｏｎｉｃ ｋｉｄｎｅｙ ｄｉｓｅａｓｅ． Ｉｎ ｔｈｅ Ｔｅｘｔｂｏｏｋ ｏｆ Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ６ｔｈ ｅｄ， Ｅｔｔｉｎｇｅｒ ＳＪ ＆ Ｆｅｌｄｍａｎ ＥＣ ｅｄｓ， １７５６， Ｗ． Ｂ． Ｓａｕｎｄｅｒｓ， Ｐｈｉｌａｄｅｌｐｈｉａ （２００５） ジョナサン・エリオット及びグレゴリー・Ｆ・グラウアー編集、「ＢＳＡＶＩＡ 犬と猫の腎臓病と泌尿器病マニュアルＩＩ」、第１５５頁から第１６２頁、Ｎｅｗ ＬＬＬ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｉｒｉｓ−ｋｉｄｎｅｙ．ｃｏｍ／ｐｄｆ／ｎ３７８．００８−ｉｒｉｓ−ｗｅｂｓｉｔｅ−ｓｔａｇｉｎｇ−ｏｆ−ｃｋｄ−ｐｄｆ．ｐｄｆ
従来の、ＥＰＯによる非ヒト動物での腎性貧血の治療は、ＣＫＤの動物において不足するＥＰＯを投与することにより体内でのＥＰＯの量を高めて赤血球産生を促すというものであり、既に低下している腎臓のＥＰＯ産生能力をＥＰＯ投与により代替するものに過ぎず、腎機能が低下することを抑制するものではない。
ＣＫＤの早期の段階（例えばＩＲＩＳ病期分類でのステージＩ又はステージＩＩ）では、腎臓によるＥＰＯ産生機能はまだ十分に残存している。この段階では、ＥＰＯの不足を補うことよりも、腎機能の低下を抑制してＣＫＤの進展を抑制することが重要である。しかしながら、非ヒト動物での腎機能の低下を抑制するための満足できる手段はこれまでに提供されていない。
そこで本発明は、非ヒト動物において腎機能の低下を抑制するための手段を提供することを解決課題とする。
上記課題を解決するための手段として本明細書では以下の発明を開示する。
（１）非ヒト動物において腎機能の低下を抑制する方法であって、
非ヒト動物にネコ由来エリスロポエチンを投与する投与工程を含む方法。
（２）前記腎機能の低下が慢性腎臓病に起因する、（１）に記載の方法。
（３）前記投与工程が、前記動物に前記エリスロポエチンを、７日以上３０日以下の期間の時間間隔で投与する工程である、（１）又は（２）に記載の方法。
（４）前記期間あたりの前記エリスロポエチンの投与量が３μｇ／ｋｇ体重以上、４００μｇ／ｋｇ体重以下である、（３）に記載の方法。
（５）前記動物が、少なくとも投与工程の開始時において、貧血を発症していない、慢性腎臓病に罹患した又は罹患の疑いのある非ヒト動物である、（１）〜（４）のいずれかに記載の方法。
（６）前記動物が、少なくとも投与工程の開始時において、国際腎臓研究会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｓｏｃｉｅｔｙ）が規定する慢性腎臓病のステージＩ又はステージＩＩに分類される慢性腎臓病に罹患した又は罹患の疑いのある非ヒト動物である、（１）〜（５）のいずれかに記載の方法。
（７）少なくとも投与工程開始時において、前記動物における血中クレアチニン濃度が２．７ｍｇ／ｄＬ以下である、（１）〜（６）のいずれかに記載の方法。
（８）鉄を補給する工程、輸液する工程、透析する工程、食事療法を行う工程、降圧剤を投与する工程、吸着剤を投与する工程、ビタミンを投与する工程、及び、利尿剤を投与する工程からなる群から選択される少なくとも１つの工程を更に含む、（１）〜（７）のいずれかに記載の方法。
（９）ネコ由来エリスロポエチンを含有する、非ヒト動物において腎機能の低下を抑制するための非ヒト動物用薬剤。
（１０）前記腎機能の低下が慢性腎臓病に起因する、（９）に記載の非ヒト動物用薬剤。
（１１）前記動物に前記エリスロポエチンを、７日以上３０日以下の期間の時間間隔で投与するための、（９）又は（１０）に記載の非ヒト動物用薬剤。
（１２）前記期間あたりの前記エリスロポエチンの投与量が３μｇ／ｋｇ体重以上、４００μｇ／ｋｇ体重以下となるように投与するための、（１１）に記載の非ヒト動物用薬剤。
（１３）少なくとも投与の開始時において、貧血を発症していない、慢性腎臓病に罹患した又は罹患の疑いのある非ヒト動物に投与するための、（９）〜（１２）のいずれかに記載の非ヒト動物用薬剤。
（１４）少なくとも投与の開始時において、国際腎臓研究会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｓｏｃｉｅｔｙ）が規定する慢性腎臓病のステージＩ又はステージＩＩに分類される慢性腎臓病に罹患した又は罹患の疑いのある非ヒト動物に投与するための、（９）〜（１３）のいずれかに記載の非ヒト動物用薬剤。
（１５）少なくとも投与の開始時において、血中クレアチニン濃度が２．７ｍｇ／ｄＬ以下である非ヒト動物に投与するための、（９）〜（１４）のいずれかに記載の非ヒト動物用薬剤。
（１６）非ヒト動物において腎機能の低下を抑制するための非ヒト動物用薬剤の製造における、ネコ由来エリスロポエチンの使用。
（１７）前記非ヒト動物用薬剤が、（１）〜（８）のいずれかに記載の方法に用いるための非ヒト動物用薬剤である、（１６）に記載の使用。
（１８）非ヒト動物において腎機能の低下を抑制するためのネコ由来エリスロポエチン。
（１９）（１）〜（８）のいずれかに記載の方法により非ヒト動物において腎機能の低下を抑制するためのネコ由来エリスロポエチン。
本発明の方法によれば、非ヒト動物において腎機能の低下を抑制することが可能である。
試験１及び試験２での実験スケジュールを説明するための図である。 試験１での、実験期間中における動物の生理学的データを示すグラフである。（Ａ）体重、（Ｂ）摂餌量、（Ｃ）飲水量、（Ｄ）尿量を示す。摂餌量、飲水量、尿量は体重（Ｂ．Ｗ．）により補正した値を示している。グラフは全て個体ごとの値を示す。 試験１での、実験期間中における動物の血球成分及び血漿成分の変化を示すグラフである。（Ｅ）赤血球（ＲＢＣ）、（Ｆ）血中尿素窒素（ＢＵＮ）、（Ｇ）クレアチニン（Ｃｒｅ）濃度を示す。グラフは全て個体ごとの値を示す。 試験２での、実験期間中における動物の（Ａ）尿量、（Ｂ）血中尿素窒素（ＢＵＮ）、（Ｃ）クレアチニン（Ｃｒｅ）濃度の変化を示すグラフである。ＰＥＧ化ｆＥＰＯは０、２、４、６、８、１０週に投与した。 試験３において、雄性ネコに［１２５Ｉ］ＰＥＧ化ｆＥＰＯを７３．２μｇ／ｋｇ（１０．３Ｍｂｑ）の用量で単回皮下投与したときの血漿中放射能濃度の推移を示すグラフである。 試験４における（Ａ）網状赤血球数及び（Ｂ）赤血球数の各群での平均値の推移を示す。 試験５において、健常ネコに対してＰＥＧ化ｆＥＰＯを４用量で単回皮下投与した場合の網状赤血球数の推移を示すグラフである。各用量群の平均値を示す。
＜ネコ由来エリスロポエチン＞
以下、エリスロポエチンを「ＥＰＯ」と記載する場合がある。またネコ由来エリスロポエチンを「ｆＥＰＯ」と記載する場合がある。
ｆＥＰＯをコードするＤＮＡ塩基配列を配列番号１に示す。配列番号１に示す塩基配列がコードするアミノ酸配列は配列番号２に示す通りであり、このうち第１〜第２６アミノ酸残基はシグナル配列であるため、ｆＥＰＯプレタンパク質ともいう。そして、前記ｆＥＰＯプレタンパク質のシグナル配列が除かれ、且つ第１９２アミノ酸基が欠失したアミノ酸配列が成熟ｆＥＰＯであり、成熟ｆＥＰＯのアミノ酸配列は配列番号３に示す通りである。ｆＥＰＯとしてはまた、配列番号２のｆＥＰＯプレタンパク質のアミノ酸配列を一部に含むポリペプチドや、配列番号３の成熟ｆＥＰＯのアミノ酸配列を一部に含むポリペプチドであってもよい。
ｆＥＰＯとしてはまた、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるｆＥＰＯプレタンパク質及び配列番号３に示すアミノ酸配列からなる成熟ｆＥＰＯに限らず、その活性変異体も使用できる。活性変異体は、好ましくは、本願明細書の実施例に示す活性測定条件において、配列番号２に示すアミノ酸配列からなるｆＥＰＯプレタンパク質、或いは、配列番号３に示すアミノ酸配列からなる成熟ｆＥＰＯを用いた場合の１０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは６０％以上、更に好ましくは８０％以上の活性を示すポリペプチドである。上記の活性変異体には、例えば、配列番号２又は３に示すアミノ酸配列において、１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチド、より好ましくは配列番号２又は３に示すアミノ酸配列においてそのＮ末端及び／又はＣ末端に、合計で１〜複数個のアミノ酸が付加、欠失、又は置換されたアミノ酸配列からなるポリペプチドや、配列番号２又は３に示すアミノ酸配列に対して８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、９５％以上、９７％以上、９８％以上又は９９％以上のアミノ酸同一性を有するアミノ酸配列からなるポリペプチドが該当する。配列番号２に示すアミノ酸配列からなるｆＥＰＯプレタンパク質の活性変異体は、より好ましくは、配列番号２のＮ末端、Ｃ末端、第１〜第２６残基の部分及び第１９２残基から選択される少なくとも一か所において上記で挙げたような変異を含む。配列番号３に示すアミノ酸配列からなる成熟ｆＥＰＯは、Ｎ末端に開始コドンがコードするメチオニン残基が付加されていてもよい。本明細書において「複数個」とは、例えば、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上であり、また、５０個以下、４５個以下、４０個以下、３５個以下、３０個以下、２９個以下、２８個以下、２７個以下、２６個以下、２５個以下、２４個以下、２３個以下、２２個以下、２１個以下、２０個以下、１９個以下、１８個以下、１７個以下、１６個以下、１５個以下、１４個以下、１３個以下、１２個以下、１１個以下をいう。「アミノ酸同一性」とは、二つのアミノ酸配列を整列（アラインメント）し、必要に応じてギャップを導入して、両者のアミノ酸一致度が最も高くなるようにしたときの、配列番号２又は３に示すタンパク質の全アミノ酸残基数に対する同一アミノ酸残基の割合（％）をいう。アミノ酸同一性は、ＢＬＡＳＴやＦＡＳＴＡによるタンパク質の検索システムを用いて算出することができる（Ｋａｒｌｉｎ，Ｓ．ｅｔ ａｌ．， １９９３， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ９０： ５８７３−５８７７；Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｓ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．， １９９０， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．， ２１５： ４０３−４１０；Ｐｅａｒｓｏｎ，Ｗ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．， １９８８， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ， ８５： ２４４４−２４４８）。また、アミノ酸の置換は、保存的アミノ酸置換が望ましい。「保存的アミノ酸置換」とは、電荷、側鎖、極性、芳香族性等の性質の類似するアミノ酸間の置換をいう。性質の類似するアミノ酸は、例えば、塩基性アミノ酸（アルギニン、リジン、ヒスチジン）、酸性アミノ酸（アスパラギン酸、グルタミン酸）、無電荷極性アミノ酸（グリシン、アスパラギン、グルタミン、セリン、トレオニン、システイン、チロシン）、無極性アミノ酸（ロイシン、イソロイシン、アラニン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、メチオニン）、分枝鎖アミノ酸（ロイシン、バリン、イソロイシン）、芳香族アミノ酸（フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、ヒスチジン）等に分類することができる。
ｆＥＰＯとしては、一般的に入手可能な動物細胞（例えばＣＨＯ細胞）、植物細胞、原核生物、酵母を宿主としｆＥＰＯをコードする外来遺伝子が導入されｆＥＰＯを発現するように遺伝子組み換えされたトランスジェニック細胞で製造されたものや、ｆＥＰＯをコードする外来遺伝子が導入されｆＥＰＯを発現するように遺伝子組み換えされたトランスジェニック動物又はトランスジェニック植物で製造されたもの、無細胞タンパク質合成系を用いて製造されたもの等が利用できるが、これらに限定されるものではない。前記トランスジェニック動物としては鳥類が挙げられ、鳥類としてはニワトリ、ウズラ、七面鳥、カモ、アヒル、ダチョウ、ガチョウ、オナガドリ、チャボ、ハト、エミュー、キジ、ホロホロチョウ等の家禽鳥類が好ましく、特にニワトリが好ましい。トランスジェニック鳥類は、卵中にｆＥＰＯを蓄積するものが好ましい。卵中にｆＥＰＯを発現するトランスジェニック鳥類を作出し、その卵からｆＥＰＯを取得する方法は特許文献１等に記載の通りである。前記トランスジェニック植物としては特に限定されず、単子葉植物であっても双子葉植物よく、単子葉植物としては、例えばイネ科（イネ、オオムギ、コムギ、トウモロコシ、サトウキビ、シバ、ソルガム、アワ、ヒエ等）、ユリ科（アスパラガス、ユリ、タマネギ、ニラ、カタクリ等）、ショウガ科（ショウガ、ミョウガ、ウコン等）に属する植物が挙げられ、双子葉植物としては、例えばアブラナ科（シロイヌナズナ、キャベツ、ナタネ、カリフラワー、ブロッコリー、ダイコン等）、ナス科（トマト、ナス、ジャガイモ、タバコ等）、マメ科（ダイズ、エンドウ、インゲン、アルファルファ等）、ウリ科（キュウリ、メロン、カボチャ等）、セリ科（ニンジン、セロリ、ミツバ等）、キク科（レタス等）、アオイ科（ワタ、オクラ等）、アカザ科（シュガービート、ホウレンソウ等）、フトモモ科（ユーカリ、クローブ等）、ヤナギ科（ポプラ等）に属する植物が挙げられるが、これらに限定はされない。
ｆＥＰＯのポリペプチドは１つ以上の糖鎖や、その他の基により修飾されていてもよい。ｆＥＰＯを修飾する糖鎖の種類と数は特に限定されず、使用する発現系（すなわちトランスジェニック細胞、トランスジェニック動物、トランスジェニック植物、無細胞タンパク質合成系等）に応じた種類と数の糖鎖により修飾されることが一般的である。例えば、使用する発現系がニワトリであった場合の糖鎖修飾は、主に、トリマンノシルコアにβ-Ｎ-アセチルグルコサミン残基を含む糖鎖が２〜５本結合した糖鎖による修飾である。
本発明で用いるｆＥＰＯは、水溶性長鎖分子で化学修飾されたものであってもよい。水溶性長鎖分子としては特に限定されないが、例えばＰＥＧ（ポリエチレングリコール）、ポリアミノ酸、ポリプロピレングリコール等が使用できる。これらは反応前駆体を作製し、合成反応によりタンパク質に付加することができる。このうち、ＰＥＧは抗原性がなく無毒であるため、修飾タンパク質の抗原性を低下させ、副作用としての抗タンパク質抗体の発現を抑える点からも有効である。
付加されるＰＥＧ等の水溶性長鎖分子の分子量の増大に伴い、水溶性長鎖分子−ｆＥＰＯ複合体の血中寿命は増大する。しかし、極めて高分子の水溶性長鎖分子を付加することはｆＥＰＯの造血活性を阻害するため（ＷＯ０２／０３２９５７）、水溶性長鎖分子の重量平均分子量は、５ｋＤａ以上、４０ｋＤａ以下がインビボ造血効果を最大にする上で好ましく、より好ましくは１０ｋＤａ以上であり、より好ましくは３０ｋＤａ以下である。更に好ましくは２０ｋＤａである。
ｆＥＰＯには少なくとも３個所の水溶性長鎖分子の結合可能部位があり、ひとつのｆＥＰＯポリペプチドに結合する水溶性長鎖分子は１（モノ）、２（ジ）、３（トリ）分子が可能であるが、複数箇所にＰＥＧが結合することでＥＰＯのレセプター結合能が阻害されインビボ活性を低下させることから、モノ体又はジ体が好ましく、ジ体が特に好ましい。
本発明において「化学修飾」とは、特定の官能基を化学的に変化させて、活性や反応性などの機能を変化させることを指し、ｆＥＰＯをＰＥＧ等の水溶性長鎖分子で化学修飾するとは、ｆＥＰＯを構成するポリペプチドが有する官能基（例えば１級アミノ基）と、水溶性長鎖分子が有する官能基とを反応させて共有結合を形成し、ｆＥＰＯを構成するポリペプチドに水溶性長鎖分子を付加することを指す。
ｆＥＰＯを水溶性長鎖分子で化学修飾する方法としては、ｆＥＰＯと水溶性長鎖分子をモル比で約１：１〜１０となる割合で混合後、４〜３７℃で混和しながら３０〜１８０分間反応させ、反応停止剤として１００ｍＭグリシン溶液を約１／１０量加え、４〜３７℃で１時間混和しながら反応を停止させる手法などが挙げられる。
水溶性長鎖分子修飾ｆＥＰＯは、水溶性長鎖分子の付加数が１又は２以上であって、水溶性長鎖分子修飾された１分子のゲルろ過カラムクロマトグラフィーにより測定した水系溶媒中における見かけの分子量が１００ｋＤａから９００ｋＤａであるものが好ましく、水溶性長鎖分子の付加数が１であって、上記見かけの分子量が１００ｋＤａから５００ｋＤａであるものがより好ましい。上記ゲルろ過カラムクロマトグラフィーによる見かけの分子量の測定は、低圧クロマト装置ＡＫＴＡ ｅｘｐｌｏｒｅｒ １００（アマシャム社製）及びゲルろ過カラムＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００ １０／３００（アマシャム社製）を用いて行う。
一般に、水溶性長鎖分子をタンパク質に共有結合させる方法としては、タンパク質、又は糖鎖の酸化活性可能な官能基であるポリオール、ラクトール、アミン、カルボン酸又はカルボン酸誘導体との化学反応がある。またスルホネートエステル活性化ポリマー、例えばスルホネートエステル活性化ＰＥＧを用いる方法などがある。ＥＰＯに付加する場合にもこれらの方法で付加することができる。
以下、水溶性長鎖高分子がＰＥＧである場合の好ましい形態について説明する。
ＰＥＧをタンパク質に共有結合させるために用いるＰＥＧ化反応前駆体としては、長鎖分子の片末端をメトキシ化したものが使用できる。さらにメトキシ化されていない末端を、ｆＥＰＯが有するアミノ基等の求核性基による求核反応を受けて共有結合を形成し得る基に改変した（例えば、スクシンイミジル脂肪酸エステル化した）ＰＥＧが開発されており、なかでも次式：
ＣＨ３−Ｏ−（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）ｎ−Ｘ−Ｙ
（式中、
Ｙはスクシンイミジルオキシ基等の脱離基を表し、
Ｘは
−（ＣＨ２）ｍ−Ｃ（＝Ｏ）−
で表される基であり、
ｍは１以上、８以下、より好ましくは４以上、より好ましくは６以下、最も好ましくは５の整数であり、
ｎは重合度を示す整数である）
で表されるものが反応性の点から好ましい。前記式で表されるＰＥＧ化反応前駆体をヒトＥＰＯと反応させると、Ｎ末端のアミノ酸のアミノ基又はリジン残基に選択的に付加することが知られている。ＥＰＯには複数のリジン残基が存在するため、反応が進むにつれＰＥＧの付加数は増え、付加数の異なる異性体混合物となる。配列番号２からなるｆＥＰＯにおいてはアラニン２７、リジン７１及び／又はリジン７８が、配列番号３からなる成熟ｆＥＰＯにおいてはアラニン１、リジン４５及び／又はリジン５２が、それぞれＰＥＧ化されることが好ましい。
本発明において「ネコ由来エリスロポエチン」、「ネコＥＰＯ」、「ｆＥＰＯ」といった用語は、特に限定の無い限り、上述のような化学修飾されたネコ由来エリスロポエチンも包含し、且つ、上記のような成熟ｆＥＰＯやｆＥＰＯプレタンパク質等の各種態様のネコ由来エリスロポエチンを包含する概念である。ネコ由来エリスロポエチンがＰＥＧ化されている態様であることを特に明示する必要がある場合には「ＰＥＧ化ｆＥＰＯ」と特定する場合があり、他の態様を特定する場合も必要に応じて同様に表現する。
上記のような発現系を用いて調製され、必要に応じて化学修飾されたｆＥＰＯは、一般的なタンパク質の精製手段である塩析法、吸着カラムクロマトグラフ法、イオン交換カラムクロマトグラフ法、サイズ排除クロマトグラフ法、抗体カラム法を単独、もしくは組み合わせて精製し回収することができるが、これらのみに限定されるものではない。吸着カラムクロマトグラフ法としては、ブルーセファロースクロマトグラフ、ヘパリンクロマトグラフ等があり、イオン交換カラムクロマトグラフ法としては、陽イオン交換クロマトグラフや陰イオン交換クロマトグラフ法等がある。非ヒト動物用医薬品として許容される程度にまで他のタンパク質等の夾雑物を除去した精製ｆＥＰＯを用いることが好ましい。
本発明で用いるｆＥＰＯは非ヒト動物に後述する各種投与経路により投与可能な形態であればよく、どのような形態であってもよいが、好ましくは、ｆＥＰＯと、非ヒト動物への投与が許容される他の成分とを組み合わせた、非ヒト動物への投与用の組成物の形態である。
＜対象となる非ヒト動物＞
本発明に係る、腎機能の低下を抑制する方法及び慢性腎臓病を抑制する方法の対象となる「非ヒト動物」とは、ヒトを除く動物であればよく特に限定されないが、好ましくは、非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物としてはイヌ、ネコ、げっ歯類（ラット、マウス）等の、愛玩動物又は実験用動物、ウシ、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ブタ等の家畜、あるいは動物園などで飼育・展示公開されるライオン、トラ、ゾウ、キリン、シマウマ、コアラ、パンダ等が挙げられる。特に好ましい非ヒト動物としては、ネコ目（Ｃａｒｎｉｖｏｒａ）に属する哺乳動物であり、特にネコ（Ｆｅｌｉｓ ｓｉｌｖｅｓｔｒｉｓ ｃａｔｕｓ）、ライオン（Ｐａｎｔｈｅｒａ ｌｅｏ）、トラ（Ｐａｎｔｈｅｒａ ｔｉｇｒｉｓ）等のネコ科動物（Ｆｅｌｉｄａｅ）、イヌ（Ｃａｎｉｓ ｌｕｐｕｓ ｆａｍｉｌｉａｒｉｓ）等のイヌ科動物（Ｃａｎｉｄａｅ）が挙げられる。非ヒト動物としては特にネコ、イヌ、ラット（Ｒａｔｔｕｓ ｎｏｒｖｅｇｉｃｕｓ）が好ましい。ｆＥＰＯはイヌ由来エリスロポエチンと配列同一性が高いことから、ネコ科動物及びラットと同様に、イヌを含むイヌ科動物に対しても本発明の方法は特に有効である。
＜本発明の方法＞
本発明の方法は、非ヒト動物において腎機能の低下を抑制する方法であって、非ヒト動物にｆＥＰＯを投与する投与工程を含む方法に関する。
ここで「腎機能の低下の抑制」とは、腎臓が有する機能、特に、慢性腎臓病（ＣＫＤ）に起因する腎臓の機能の低下を抑制することを指す。本発明において、低下を抑制すべき腎機能としては、尿細管での再吸収、老廃物の排泄（尿毒素の排泄）、糸状体ろ過、体液の水分バランスの調整、体液の電解質（ナトリウム、塩素、カリウム、カルシウム等の電解質）のバランス調整、体液の酸塩基平衡の調整（ｐＨ調整）、ホルモンの分泌等の腎機能が挙げられる。本発明は特に、多飲多尿、血中クレアチニン濃度の上昇、及び血中尿素窒素濃度の上昇からなる群から選択される１以上の変化を生じる腎機能の低下を抑制するうえで効果的である。本発明者らは、驚くべきことに、非ヒト動物でのこれらの腎機能の低下が、ｆＥＰＯを投与することにより抑制されること、すなわち腎機能が保護されること、を見出した。これらの効果は「腎保護」効果と呼ぶことができる。特に、ｆＥＰＯ投与により腎機能を保護する効果は、ｆＥＰＯ投与により造血を促進する効果とは異質な効果である。
本発明の方法におけるｆＥＰＯの投与頻度は特に限定されないが、好ましくは７日以上の期間、より好ましくは７日以上３０日以下の期間の時間間隔で投与する。当該期間としては具体的には８日以上、９日以上、１０日以上、１１日以上、１２日以上、１３日以上、１４日以上、１５日以上、１６日以上、１７日以上、１８日以上、１９日以上、２０日以上、２１日以上、２２日以上、２３日以上、２４日以上、２５日以上、２６日以上、２７日以上、２８日以上または２９日以上である下限値と、２９日以下、２８日以下、２７日以下、２６日以下、２５日以下、２４日以下、２３日以下、２２日以下、２１日以下、２０日以下、１９日以下、１８日以下、１７日以下、１６日以下、１５日以下、１４日以下、１３日以下、１２日以下、１１日以下、１０日以下、９日以下または８日以下である上限値との好ましい組み合わせにより特定される期間である。ｆＥＰＯを用いた腎性貧血の治療においては、ｆＥＰＯの体内濃度を持続的に高く保持する必要があるため１週間に２回又は３回といった高頻度の投与が必要と考えられるが、腎機能の低下を抑制する目的では上記のような比較的長期間の時間間隔での投与で十分である。また、比較的長期間の時間間隔で投与できることから、動物が受ける苦痛や、動物の飼い主の通院の負担が少なく済むため好ましい。ｆＥＰＯを前記期間の時間間隔で投与するとは、ｆＥＰＯを対象動物へ投与する処理を前記期間毎に行うことを指し、前記の各期間内に行う投与を「１回」の投与とする。ここで「１回」の投与は、単一の投与操作による投与であってもよいし、一定範囲の時間、好ましくは３６時間以下、より好ましくは２４時間以下、より好ましくは１２時間以下、より好ましくは６時間以下の時間の間に行われる複数の投与操作による投与であってもよい。対象動物または飼い主の負担を軽減するためには、「１回」の投与が、単一の投与操作による投与であるか、２４時間以下、より好ましくは１２時間以下、より好ましくは６時間以下の時間の間に行われる複数（好ましくは２又は３）の投与操作による投与であり、単一の投与操作による投与であることが特に好ましい。例えば毎週同じ曜日にｆＥＰＯの投与を行う場合は、７日の時間間隔での投与（または７日に１回の頻度での投与）であり、隔週で同じ曜日にｆＥＰＯの投与を行う場合は１４日の時間間隔での投与（または１４日に１回の頻度での投与）であり、投与を受ける１日の間であれば複数の投与操作によりｆＥＰＯを投与してもよい。また、例えば、毎週月曜日から火曜日にかけて完了する単一または複数の投与操作により１回のｆＥＰＯの投与を行う場合も７日の時間間隔での投与（または７日に１回の頻度での投与）であり、隔週で月曜日から火曜日にかけて完了する単一また複数の投与操作により１回のｆＥＰＯの投与を行う場合も１４日の時間間隔での投与（または１４日に１回の頻度での投与）であり、他の場合も同様である。腎機能の低下は一般的に長期間掛けて徐々に進行することから、ｆＥＰＯの投与は前記の時間間隔で継続的に行うことが好ましい。
ｆＥＰＯの前記期間あたりの投与量（すなわち１回の投与量）は特に限定されず、前記の投与間隔の長さや、求められる腎機能の低下の抑制の程度に応じて適宜設定することができる。本発明におけるｆＥＰＯの投与量は、全て、配列番号３に示すアミノ酸配列からなり、水溶性長鎖分子等より化学修飾がされていない、成熟ｆＥＰＯのポリペプチドとして換算した重量に基づく投与量を指す。投与されるｆＥＰＯは、既述の通り、水溶性長鎖分子等より化学修飾されたｆＥＰＯなどの各種形態であることができる、いずれの形態であっても、ｆＥＰＯの投与量は、配列番号３に示すアミノ酸配からなるポリペプチドとして換算した重量での投与量により表すことができる。ｆＥＰＯの前記期間あたりの投与量としては好ましくは３μｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは５ｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは７ｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは９ｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは１０ｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは１５ｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは２０ｇ／ｋｇ体重以上、好ましくは２５ｇ／ｋｇ体重以上であり、好ましくは４００ｇ／ｋｇ体重以下、好ましくは３５０ｇ／ｋｇ体重以下、好ましくは３００ｇ／ｋｇ体重以下、好ましくは２５０ｇ／ｋｇ体重以下、好ましくは２００ｇ／ｋｇ体重以下、好ましくは１５０ｇ／ｋｇ体重以下、好ましくは１００ｇ／ｋｇ体重以下である。ｆＥＰＯの投与量がこの範囲であれば、目的とする腎機能低下の抑制効果を実現することができ、なおかつ、投与を継続的に繰り返しても副作用を生じにくいと考えられる。
上記のｆＥＰＯの量は、定量しようとするｆＥＰＯから調製したｆＥＰＯ水溶液を試料とし、光路長Ｌｃｍの石英セル及び分光光度計を用いて波長２８０ｎｍと３２０ｎｍの吸光度を測定し、次式により前記水溶液のｆＥＰＯ濃度を求め、該濃度に基づいて算出することができる。
式：ｆＥＰＯ濃度（ｍｇ/ｍＬ）＝（Ａｂｓ２８０−Ａｂｓ３２０）×０．９５９／Ｌ
上記算式の係数「０．９５９」は、成熟ｆＥＰＯの配列番号３のアミノ酸配列を考慮した試験により求めた、吸光度差（Ａｂｓ２８０−Ａｂｓ３２０）についてのｆＥＰＯのモル吸光係数１．９０×１０４（Ｌ・モル−１・ｃｍ−１）を元に算出したものである。したがって、上記の測定法及び算式によれば、配列番号３に示すアミノ酸配からなるポリペプチドとして換算したｆＥＰＯ量を正確に評価することができる。
一方、既存のｆＥＰＯの定量法としては、ＥＰＯ依存性細胞株であるＢａＦ／ＥＰＯＲによる細胞増殖アッセイ（特開平１０−９４３９３）、抗ヒトＥＰＯ抗体を用いた免疫アッセイ法（ＥＬＩＳＡ法等）等がある。このうち、ＢａＦ／ＥＰＯＲによる細胞増殖アッセイは、ヒトＥＰＯと親和性が高い受容体を表面に有する細胞を用いるアッセイ系であり、ｆＥＰＯを定量するには適していない。同様に、抗ヒトＥＰＯ抗体を用いた免疫アッセイ法は使用する抗体がｆＥＰＯに特異的ではないためｆＥＰＯの定量には適していない。従来のｆＥＰＯの定量では、これらの方法を用い、既知量のｆＥＰＯを試料として検量線を作成したうえで分析対象試料のｆＥＰＯ量を測定していたため、ｆＥＰＯの正確な定量は容易ではなかった。従ってこのような従来の方法により求めたｆＥＰＯ量と、ｆＥＰＯ水溶液の波長２８０ｎｍと３２０ｎｍの吸光度を測定し上記算式により求めた正確なｆＥＰＯ量とを単純に値のみを比較することは合理的ではない。
本発明の方法においてｆＥＰＯの非ヒト動物への投与経路は特に限定されないが、経口投与であっても、非経口投与であってもよく、非経口投与としては静脈内投与、皮下投与、皮内投与、筋肉内投与、経皮投与、経粘膜投与（経鼻投与、点眼による投与等）等が挙げられる。投与経路としては特に皮下投与又は皮内投与が好ましい。
本発明の方法の一形態では、投与対象となる非ヒト動物は、少なくとも投与工程の開始時において腎機能の低下の抑制を必要とする非ヒト動物である。腎機能の低下の抑制を必要とする非ヒト動物は、典型的には、慢性腎臓病に罹患した又は罹患の疑いのある非ヒト動物である。慢性腎臓病に罹患している又は疑いがあるかどうかの判断は獣医師の専門的判断によるものとし、非特許文献２の定義に従い、（１）少なくとも３か月間存在する腎ダメージ（組織、血液、尿検査又は画像診断から証明されるもの）、又は、（２）少なくとも３か月間存在する糸状体ろ過率（ＧＦＲ）の低下（正常値から５０％以上のＧＦＲ低下）の少なくとも一方を満たすとき、又はその疑いのある場合に、慢性腎臓病に罹患している又は疑いがあると判断することができる。また、より簡便に、国際腎臓研究会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｓｏｃｉｅｔｙ）が規定する慢性腎臓病の分類システム（非特許文献１、３及び４参照）に従い判断することも可能である。該分類システムによりステージＩ以上に分類できる場合、非ヒト動物は慢性腎臓病に罹患しているということができ、「リスクあり（ａｔ ｒｉｓｋ）」と分類できる場合、非ヒト動物は慢性腎臓病に罹患の疑いがあるということができる。また、慢性腎臓病の症状を呈しているが獣医師による確定的な診断がされていない場合も、慢性腎臓病に罹患の疑いがあるということができる。
本発明の方法の一形態では、より好ましくは、投与対象となる非ヒト動物が、少なくとも投与工程の開始時において貧血を発症していない、特に、腎性貧血を発症していない。貧血を発症しているか否かの判断は獣医師の専門的判断による。ヘマトクリット値が正常値の範囲の下限値を下回ることを指標として貧血を発症していると判断することができ、前記下限値以上であれば貧血を発症していないと判断することができる。ヘマトクリット値の正常値の範囲及びその下限値は動物種に応じて適宜設定することができ、特に限定されない。例えば、成体でのヘマトクリット値がネコで２４％以下、イヌで３６％以下、ラットで４０％以下である場合に貧血を発症していると判断することができ、ヘマトクリット値がネコで２４％よりも大きい、イヌで３６％よりも大きい、ラットで４０％よりも大きい値である場合に貧血を発症していないと判断することができる。腎性貧血は、腎疾患の進行に伴い内因性エリスロポエチンの産生が低下し、栄養低下、鉄欠乏、出血傾向、赤血球寿命の短縮などと相まって引き起こされる貧血である。腎性貧血は通常慢性腎臓病の後期に現れる症状であり、貧血が発症する前であれば腎機能はまだ十分に残存している段階であるから、この段階からｆＥＰＯの投与を開始すると、腎機能の低下を抑制する効果が特に高く、慢性腎臓病の進展を効果的に遅延することができる。前記分類システムによるとステージＩ又はステージＩＩに分類される慢性腎臓病に罹患した又は罹患の疑いのある非ヒト動物は、腎性貧血を発症していない。
本発明の方法の一形態では、投与対象となる非ヒト動物が、少なくとも投与工程の開始時において、前記分類システムにおいてステージＩ又はステージＩＩに分類される慢性腎臓病に罹患した又は罹患の疑いのある段階から、ｆＥＰＯ投与工程を開始することが好ましい。
慢性腎臓病の前記分類システムにおいて、「リスクあり（ａｔ ｒｉｓｋ）」とは、対象となる非ヒト動物について、その経歴（ｈｉｓｔｏｒｙ）から、幾つかの要因により将来に慢性腎臓病に罹患するリスクが増していると示唆されることを指す。前記要因としては、腎毒性薬剤への曝露、出血、地域での伝染病の蔓延、及び、老齢から選択される１種以上の要因等が例示できる。
慢性腎臓病の前記分類システムにおいて、ステージＩは、高窒素血症ではなく（ｎｏｎａｚｏｔｅｍｉｃ）、且つ、その他の腎臓異常が存在する段階である。ステージＩでは血中クレアチニン濃度は、ネコについては１．６ｍｇ／ｄＬ未満であり、イヌについては１．４ｍｇ／ｄＬ未満である。前記他の腎臓異常としては、（Ａ）腎臓以外に原因が特定できない尿濃縮能の低下、（Ｂ）腎臓の触診及び／又は画像診断の異常、（Ｃ）腎性蛋白尿、（Ｄ）腎生検結果の異常、及び（Ｅ）連続的に採取したサンプルでの血中クレアチニン濃度の上昇、から選択される１種以上が例示できる。
慢性腎臓病の前記分類システムにおいて、ステージＩＩは、軽度の高窒素血症（ｍｉｌｄ ｒｅｎａｌ ａｚｏｔｅｍｉａ）を指す。ステージＩＩの基準となる血中クレアチニン濃度は、ネコについて１．６〜２．７ｍｇ／ｄＬであり、イヌについては１．４〜１．９ｍｇ／ｄＬである。
本発明の方法の一形態では、ネコ及びイヌ以外の非ヒト動物に対しても、初期の慢性腎臓病に罹患した又は罹患の疑いのある段階から、ｆＥＰＯ投与工程を開始することが好ましい。
ここで、非ヒト動物が初期の慢性腎臓病であるか否かは、腎臓異常の有無と、血中クレアチニン濃度とに基づいて判定することができる。例えば非ヒト動物において、腎臓異常が認められるが、血中クレアチニン濃度が同種の動物と比較して正常値の範囲内である場合に、該非ヒト動物は初期の慢性腎臓病に罹患した段階にあると言える。ここで腎臓異常としては、ＩＲＩＳのステージＩに関して挙げた前記（Ａ）〜（Ｅ）から選択される１種以上が例示できる。ラットにおいては、血中クレアチニン濃度が０．５ｍｇ／ｄＬ以下であれば、正常値の範囲内と言える。
投与対象となる非ヒト動物が、慢性腎臓病の後期に至っていないことは血中クレアチニン濃度を指標として判断することできる。非ヒト動物が、少なくとも投与工程開始時において血中クレアチニン濃度が好ましくは２．７ｍｇ／ｄＬ以下である場合に、非ヒト動物が慢性腎臓病の後期には至っていないと判断することができ、この段階からｆＥＰＯ投与を開始すると腎機能の低下を抑制する効果が特に高い。より具体的には、非ヒト動物がネコである場合、少なくとも投与工程開始時において血中クレアチニン濃度が好ましくは２．７ｍｇ／ｄＬ以下、より好ましくは１．６ｍｇ／ｄＬ未満であり、非ヒト動物がイヌである場合、少なくとも投与工程開始時において血中クレアチニン濃度が好ましくは１．９ｍｇ／ｄＬ以下、より好ましくは１．４ｍｇ／ｄＬ未満であり、非ヒト動物がラットである場合、少なくとも投与工程開始時において血中クレアチニン濃度が好ましくは０．５ｍｇ／ｄＬ以下、より好ましくは０．４ｍｇ／ｄＬ未満である場合に、非ヒト動物が慢性腎臓病の後期には至っていないと判断することができる。
血中クレアチニン濃度の測定は酵素法を用いて行うことができ、市販のクレアチニン濃度測定用のキットを用いて行うことができる。
なお、「血中クレアチニン濃度」は、血漿を試料として測定したとき「血漿クレアチニン濃度」と呼ばれ、血清を試料として測定したとき「血清クレアチニン濃度」と呼ばれるが、いずれも同じ値となる。なお下記の実施例では血中クレアチニン濃度の測定に血漿を試料として測定した。
また、非ヒト動物が、慢性腎疾患に罹患した又は罹患の疑いがあるが貧血を発症していない場合、例えば上記で挙げたような腎臓異常が認められるがヘマトクリット値が同種の動物と比較して正常値の範囲内である場合に、該非ヒト動物は初期の慢性腎疾患に罹患していると判断できる。貧血を発症していないと判断できるヘマトクリット値の範囲の例は既述の通りである。
＜他の方法との併用＞
本発明に係る、腎機能の低下を抑制する方法は他の工程と組み合わせて行ってもよい。他の工程としては、鉄を補給する工程、輸液する工程、透析する工程、食事療法を行う工程、降圧剤を投与する工程、吸着剤を投与する工程、及び、ビタミンを投与する工程からなる群から選択される少なくとも１つの工程が例示できる。他の工程は、好ましくは、腎機能の低下を抑制する方法として有用な工程である。特に、造血促進作用を直接の目的として使用されるものではない、輸液する工程、降圧剤を投与する工程、及び、利尿剤を投与する工程から選択される少なくとも１つを、腎機能の低下を抑制するための本発明のｆＥＰＯ投与方法に併用することが好ましい。
鉄の補給を補給する工程は、腎性貧血を抑制しようとする場合に有効である。鉄の補給は鉄剤を経口的又は非経口的に投与することにより行うことができる。鉄剤としては一般名として硫酸鉄、クエン酸第一鉄ナトリウム、オロチン酸第一鉄、フマル酸第一鉄、スレオニン鉄、ピロリン酸第二鉄、コンドロイチン硫酸鉄、含糖酸化鉄、グルコン酸第二鉄、シデフェロン等が使用でき、このうち硫酸鉄、クエン酸第一鉄ナトリウム、オロチン酸第一鉄、フマル酸第一鉄、スレオニン鉄及びピロリン酸第二鉄は経口投与に適しており、コンドロイチン硫酸鉄、含糖酸化鉄、グルコン酸第二鉄及びシデフェロンは非経口投与（具体的には静脈内投与）に適している。
輸液する工程は、腎機能の低下、特に、体液の水分バランス調整、体液の電解質バランス調整及び体液の酸塩基平衡調整から選択される１以上の腎機能の低下を抑制する方法として有効である。腎機能の低下を抑制する本発明の方法において、ｆＥＰＯを投与する工程と、輸液する工程とを併用することにより、輸液する輸液剤の量及び輸液の頻度を低減することができ、対象となる非ヒト動物及びその飼い主の負担を軽減することができる。
輸液剤は例えば「小動物の薬物治療学，尾崎博，浅井史敏，辻本元，オーム社，東京（２０１０）」、「輸液製剤組成一覧表，輸液製剤協議会（組成表検索｜輸液製剤協議会）」等の一般的な文献に記載されたものを使用することができ、以下に具体例を説明する。
輸液剤は、電解質輸液剤、水分輸液剤、栄養輸液剤、血漿増量剤等に分類でき、いずれも好適に使用することができる。
電解質輸液剤としては等張性細胞外液類液、低張性複合電解質、高張性（単一）電解質輸液剤が挙げられる。等張性細胞外液類液としては生理食塩水、リンゲル液、乳酸リンゲル液（ハルトマン液）、酢酸リンゲル液及び重炭酸リンゲル液が例示できる。低張性複合電解質としては開始液（１号液）、細胞内修復液（２号液、脱水補水液）、維持液（３号液）、術後回復液（４号液）、及び、フィジオ７０液等の他の液剤が例示できる。高張性（単一）電解質輸液剤としてはＮａＣｌ輸液剤、Ｋ輸液剤、Ｃａ輸液剤、Ｍｇ輸液剤、Ｐ輸液剤、アルカリ化剤（炭酸水素ナトリウム、乳酸ナトリウム）及び酸性化剤（塩化アンモニウム）が例示できる。
水分輸液剤としては５％ブドウ糖液が例示できる。
栄養輸液剤としては熱量産生剤及び非熱産生剤が挙げられる。熱量産生剤としては等質輸液剤（ブドウ糖液、キシリトール液、ソルビトール液、マルトース液）、脂質輸液剤（ダイズ油）、アミノ酸輸液剤（高濃度アミノ酸液、腎不全用アミノ酸液、肝不全用アミノ酸液、小児用アミノ酸液）、及び、高カロリー輸液剤（糖、電解質、アミノ酸、ビタミン、脂質、微量元素が一部又は全て混合された輸液剤）が例示できる。非熱産生剤としてはビタミン剤、微量元素（塩化第二鉄・硫酸亜鉛水和物配合剤、塩化マンガン・硫酸亜鉛水和物配合剤等）が例示できる。
血漿増量剤としては膠質輸液、浸透圧輸液剤が挙げられる。膠質輸液としては低分子デキストラン、ヒドロキシエチルデンプン又はゼラチンを含有する膠質輸液が例示できる。浸透圧輸液剤としてはマンニトール又はグリセロールを含有する浸透圧輸液剤が例示できる。
透析する工程は、腎機能の低下、特に老廃物を排泄する機能の低下を抑制する方法として有効である。腎機能の低下を抑制する本発明の方法において、ｆＥＰＯを投与する工程と、透析する工程とを併用することにより、透析の頻度を低減することができ、対象となる非ヒト動物及びその飼い主の負担を軽減することができる。
食事療法を行う工程は、腎機能の低下を抑制する方法として有効である。腎機能の低下を抑制する本発明の方法において、ｆＥＰＯを投与する工程と、食事療法を行う工程とを併用することにより、通常の食品を摂取する頻度及び量を高めることができ、対象となる非ヒト動物及びその飼い主の負担を軽減することができる。
腎機能の低下を抑制するための食事療法では、一般的には、タンパク質、塩分（電解質）、カリウム及びリンから選択される１種以上の成分の摂取量が制限された食事を摂取させることができる。タンパク質制限食では、タンパク質低減による摂取カロリーの減少を抑制するために油脂を配合することが一般的である。
食事療法では、ヒトにおいて一般的に用いられている健康食品素材、栄養補助食品素材等を配合した食事を摂取させてもよく、腎機能の低下を抑制するための食事に更にこれらの素材の１種以上を配合してもよいし、通常の食事にこれらの素材の１種以上を配合してもよい。
上記健康食品素材としては特に限定されず、漢方薬（例えば、胃苓湯、温経湯、温清飲、黄耆建中湯、黄連解毒湯、黄連湯、葛根湯、加味帰脾湯、加味逍遙散、甘麦大棗湯、桔梗湯、帰脾湯、九味檳榔湯、荊芥連翹湯、桂枝加芍薬大黄湯、桂皮加芍薬湯、桂皮加竜骨牡蛎湯、桂枝湯、桂枝人参湯、桂枝茯苓丸、啓脾湯、香蘇散、五虎湯、五積散、牛車腎気丸、五淋散、柴陥湯、柴胡加竜骨牡蛎湯、柴胡桂枝乾姜湯、柴胡桂枝湯、柴胡清肝湯、柴朴湯、柴苓湯、酸棗仁湯、滋陰降火湯、四逆散、四君子湯、四物湯、炙甘草湯、芍薬甘草湯、十全大補湯、十味敗毒湯、小建中湯、小柴胡湯、小青竜湯、消風散、辛夷清肺湯、神秘湯、真武湯、清上防風湯、清暑益気湯、清心蓮子飲、清肺湯、疎経活血湯、大黄甘草湯、大黄牡丹皮湯、大建中湯、大柴胡湯、大柴胡湯去大黄、大承気湯、大防風湯、治打撲一方、調胃承気湯、釣藤散、腸癰湯、猪苓湯、猪苓湯合四物湯、通導散、桃核承気湯、当帰飲子、当帰建中湯、当帰芍薬散、当帰湯、二陳湯、女神散、人参湯、人参養栄湯、排膿散及湯、麦門冬湯、八味地黄丸、半夏厚朴湯、半夏瀉心湯、白虎加人参湯、茯苓飲、茯苓飲合半夏厚朴湯、平胃散、防已黄耆湯、防風通聖散、補中益気湯、麻黄湯、麻黄附子細辛湯、麻杏甘石湯、麻子仁丸、木防已湯、抑肝散、抑肝散加陳皮半夏、六君子湯、立効散、竜胆瀉肝湯、苓甘姜味辛夏仁湯、六味丸など）、茶葉（例えば、緑茶、玄米茶、抹茶、煎茶、ほうじ茶、焙茶、ジャスミン茶、ウーロン茶、紅茶、黒茶、花茶、青茶、白茶など）、ハーブ（例えばイタリアンパセリ、エリキャンペーン、オリーブ、オレガノ、カールドン、カモミール、カレープラント、キャットニップ、キャラウェイ、クリスマスローズ、クリムソンクローバ、コーンフラワー、コモンマロウ、サラダバーネット、サントリナ、シナモン、ジャスミン、ステビア、セージ、セイヨウボダイジュ、センテッドゼラニウム、セントジョーンズワート、ソープワート、ソロモンズシール、タイム、タンジー、チャービル、チャイブ、ナスタチウム、ナツメ、バジル、ハニーサックル、ヒソップ、フラックス、フェンネル、フォックスグローブ、ブラックリーホーリーホック、フレンチマリーゴールド、ベトニー、ヘリオトロープ、ベルガモット、ヘンプアグリモニー、ヘンルーダ、ポットマリーゴールド、ボリジ、ホワイトホアハウンド、マートル、マーレイン、マジョラム、ミント、ヤロウ、ラベンダー、レディースベッドストロー、レモングラス、レモンバーベナ、レモンバーム、ローズ、ローズマリー、ロケット、ワイルドストロベリー、ワイルドパンジー、わすれな草など）、プロポリス、イチョウ葉、青汁およびこれらの抽出物などが挙げられる。
前記栄養補助食品素材としては特に限定されず、アミノ酸類、金属イオン類、蛋白質類、糖類、脂肪酸類（特にω３不飽和脂肪酸、ω６不飽和脂肪酸、ω９不飽和脂肪酸等の魚油等の油脂に由来の多価不飽和脂肪酸）、酵母抽出物、野菜抽出物、魚肉抽出物、果実、果実抽出物、Ｎ‐アセチルグルコサミン、Ｓ‐アデノシルメチオニン、テトラヒドロビオプテリン、補酵素Ｑなどが挙げられる。
降圧剤を投与する工程は、腎機能の低下を抑制する方法として有効である。腎機能の低下を抑制する本発明の方法において、ｆＥＰＯを投与する工程と、降圧剤を投与する工程とを併用することにより、降圧剤の投与頻度及び投与量を低減することができ、対象となる非ヒト動物及びその飼い主の負担を軽減することができる。
降圧剤はβ遮断薬、α、β遮断薬、α遮断薬、交感神経抑制薬、カルシウム拮抗薬、ＡＣＥ阻害薬、ＡＩＩ受容体拮抗薬、直接的レニン阻害薬、血管平滑筋作用薬等に分類することができ、いずれも本発明に使用することができる。β遮断薬としてはプロプラノロール、ニプラジロール、チリソロール、ナドロール、カルテオロール、ピンドロール、アテノロール、メトプロロール、ベタキソロール、ビソプロロール、アセブトロール、セリプロロールが例示できる。α、β遮断薬としてはラベタロール、アモスラロール、カルベジロール、アロチノロール、ベバントロールが例示できる。α遮断薬としてはプラゾシン、ドキサゾシン、ブナゾシン、テラゾシン、ウラピジルが例示できる。交感神経抑制薬としてはクロニジン、αメチルドパ、グアナベンズ、グアンファシン、レセルピン、トリメタファンが例示できる。カルシウム拮抗薬としてはジルチアゼム、ニフェジピン、ニカルジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ニルバジピン、アムロジピン、ベニジピン、エホニジピン、アゼルニジピン、マニジピン、シルニジピン、アラニジピン、フェロジピン、バルニジピンが例示できる。ＡＣＥ阻害薬としてはカプトプリル、エナラプリル、リシノプリル、アラセプリル、イミダプリル、テモカプリル、ペリンドプリル、デラプリル、ベナゼプリル、シラザプリル、キナプリル、トランドラプリルが例示できる。ＡＩＩ受容体拮抗薬としてはロサルタン、カンデサルタンシレキセチル、バルサルタン、テルミサルタン、イルベサルタン、オルメサルタン、アジルサルタンが例示できる。直接的レニン阻害薬としてはアリスキレンが例示できる。血管平滑筋作用薬としてはヒドララジン、ブドララジンが例示できる。
吸着剤を投与する工程は、腎機能の低下、特に老廃物を排泄する機能の低下を抑制する方法として有効である。腎機能の低下を抑制する本発明の方法において、ｆＥＰＯを投与する工程と、吸着剤を投与する工程とを併用することにより、吸着剤の投与頻度及び投与量を低減することができ、対象となる非ヒト動物及びその飼い主の負担を軽減することができる。
本発明で使用できる吸着剤としては特に限定されないが、活性炭（薬用炭）、ケイ酸アルミニウム、ケイ酸マグネシウム、沈降炭酸カルシウム、セベラマー塩酸塩、ビキサロマー、クエン酸第二鉄水和物、炭酸ランタン、ポリスチレンスルホン酸カルシウム、ポリスチレンスルホン酸ナトリウム、コレスチミド、ニセリトロール等が例示できる。
ビタミンを投与する工程は、腎機能の低下を抑制する方法として有効である。腎機能の低下を抑制する本発明の方法において、ｆＥＰＯを投与する工程と、ビタミンを投与する工程とを併用することにより、ビタミンの投与頻度及び投与量を低減することができ、対象となる非ヒト動物及びその飼い主の負担を軽減することができる。
本発明で使用できるビタミンとしては特に限定されないが、例えばビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ及びビタミンＫ並びにこれらの誘導体からなる群から選択される１種以上のビタミンが挙げられ、特にビタミンＤが例示できる。
利尿剤を投与する工程は、腎機能の低下を抑制する方法として有効である。利尿剤の低下を抑制する本発明の方法において、ｆＥＰＯを投与する工程と、利尿剤を投与する工程とを併用することにより、利尿剤の投与頻度及び投与量を低減することができ、対象となる非ヒト動物及びその飼い主の負担を軽減することができる。
本発明で使用できる利尿剤としては特に限定されないが、トリクロルメチアジド、ヒドロクロロチアジド、ベンチルヒドロクロロチアジド、インダパミド、メフルシド、トリパミド、メチクラン、フロセミド、エタクリン酸、トラセミド、スピロノラクトン、トリアムテレン、エプレレノン等が例示できる。
血圧降下剤、吸着剤、利尿剤についての上記の具体例は「ＮＥＷ薬理学（改訂第４版），田中千賀子，加藤隆一編，南光堂出版，東京（２００２）」、「高血圧治療ガイドライン２０１４，日本高血圧学会発行（https://www.jpnsh.jp/data/jsh2014/jsh2014v1_1.pdf）」等に開示されている。
＜非ヒト動物用薬剤＞
本発明はまた、ｆＥＰＯを含有する、非ヒト動物において腎機能の低下を抑制するための非ヒト動物用薬剤に関する。
本発明はまた、前記薬剤を製造するためのｆＥＰＯの使用に関する。
前記薬剤は、少なくともｆＥＰＯを含んでいればよく、薬学的に許容される他の成分を更に含んでいてもよく、好ましくはｆＥＰＯと薬学的に許容される他の成分とを含んだ薬剤組成物である。
本発明の薬剤の形態は投与経路に応じて適宜選択され、例えば、注射剤、点滴剤、注入剤、外用液剤、貼付剤、塗布剤（クリーム剤、軟膏剤等）、吸入剤、噴霧剤、坐剤、レクタルカプセル剤、皮下埋め込み型徐放製剤、ミセル製剤、ゲル化製剤、リポソーム製剤、及び、膣内投与のためのペッサリー等の非経口投与用の製剤の形態や、経口投与用の製剤の形態が挙げられる。注射剤、点滴剤の適用としては、静脈内、皮下、皮内、筋肉内、臓器内、鼻腔内、点眼、脳内、腹腔内、病巣などが挙げられる。注射剤はプレフィルドシリンジ製剤の形態であってもよい。注入剤の適用としては、直腸内、膣内などが挙げられる。経口投与用の各種製剤としては、錠剤、丸剤、カプセル剤、散剤、細粒剤、顆粒剤等の固形剤や、エキス剤、エリキシル剤、シロップ剤、チンキ剤、リモナーデ剤等の液剤が挙げられる。これらの形態の薬剤のうち、ｆＥＰＯが液中に溶解した製剤を以下で「溶液製剤」と呼ぶ。注射剤、点滴剤、注入剤等が溶液製剤の一例である。前記薬剤が溶液製剤の形態である場合、対象とする非ヒト動物の体液の浸透圧及びｐＨと同じ浸透圧及びｐＨを有するｆＥＰＯ含有溶液製剤は、該動物に皮下投与した際に痛みを引き起こしにくいため好ましい。例えば浸透圧が約２８０ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏであり、ｐＨが約７．４である体液を有する非ヒト動物に投与するのに適した溶液製剤を製造する場合には、該溶液製剤は、浸透圧が好ましくは２００ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏ以上、４００ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏ以下、より好ましくは２５０ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏ以上、より好ましくは３００ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏ以下であり、ｐＨが好ましくは７．０以上、８．０以下、より好ましくは７．３以上、より好ましくは７．７以下である。また、非ヒト動物の体液の浸透圧をＸｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏとしたとき、前記溶液製剤の浸透圧は好ましくは（Ｘ±１００）ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏ、より好ましくは（Ｘ±５０）ｍＯｓｍ／ＫｇＨ２Ｏとすることもできる。非ヒト動物の体液のｐＨをＹとしたとき、前記溶液製剤のｐＨは好ましくは（Ｙ±０．５）、より好ましくは（Ｙ±０．１）とすることもできる。ここで浸透圧とｐＨは２０〜２５℃において測定した値を指す。
本発明の薬剤が含み得る薬学的に許容される他の成分は特に限定されず、目的とする形態に応じて適宜選択すればよい。薬学的に許容される他の成分としては、溶媒（水等）、賦形剤、崩壊剤、結合剤、安定化剤、ｐＨ調節剤、浸透圧調節剤、界面活性剤、滑沢剤、コーティング剤、着色剤、凝集防止剤、吸収促進剤、溶解補助剤、香料、甘味料、防腐剤、保存剤、抗酸化剤等が挙げられる。
本発明の薬剤は、上記の、非ヒト動物において腎機能の低下を抑制する本発明の方法に用いることができ、その用い方の具体的な態様は既述の通りである。本発明の薬剤は、上記の他の方法と併用することができる。
本発明の薬剤は、好ましくは、前記期間あたりに前記の好適な投与量のｆＥＰＯが投与されるようにｆＥＰＯを含む。すなわち、本発明の薬剤の、前記期間（好ましくは７日以上、３０日以下の期間、或いは上記の更に好適な期間）の間隔で投与される分量あたりに、前記の好適な投与量（好ましくは３μｇ／ｋｇ体重以上、４００μｇ／ｋｇ体重以下、或いは上記の更に好適な投与量）のｆＥＰＯが含まれることが好ましい。前記分量の薬剤は、単一の投与操作で投与される分量の薬剤であってもよいし、複数の投与操作に分けて投与される分量の薬剤であってもよい。
以下実施例により本発明を詳述するが、本発明はこれらの実施例により限定されるものではない。商品名を記載している場合は特に記述のない限り添付の説明書の指示に従った。
下記の試験においてＰＥＧ化ネコエリスロポエチン（ＰＥＧ化ｆＥＰＯ）の投与量及び量は、いずれも、配列番号３に示すアミノ酸配列からなる、水溶性長鎖分子等より化学修飾がされていない、成熟ｆＥＰＯのポリペプチドとして換算した重量での投与量である。
また、下記の動物試験において「ＰＥＧ化ｆＥＰＯ」とは、いずれも成熟ｆＥＰＯ（配列番号３）がＰＥＧ化されたものを指す。
＜調製例：ＰＥＧ化ｆＥＰＯの調製＞
以下の手順でトランスジェニックニワトリによりネコ由来エリスロポエチン（ｆＥＰＯ）含有卵白を調製し、ＰＥＧ化したのち、投与用製剤を調製した。
（１．トランスジェニックニワトリを用いたｆＥＰＯを含有する卵白の調製）
ｆＥＰＯ含有卵白の調製は特開２００７−８９５７８に記載の方法を基礎とし改変を加えた方法により行ったが、その工程の要点を以下に記載する。
（１．１．ニワトリ胚へのレトロウイルスベクターのマイクロインジェクションと人工孵化）
ｆＥＰＯ発現用レトロウイルスベクターを、ニワトリ胚へマイクロインジェクションし、ｆＥＰＯを発現するトランスジェニックニワトリを作製した。マイクロインジェクションと人工孵化は無菌条件下で行った。
ｆＥＰＯ（プレタンパク質の全長）をコードするＤＮＡ塩基配列を配列番号１に示す。
特開２００７−８９５７８の実施例５の方法で調製された、ｆＥＰＯ発現用レトロウイルスベクターを含む溶液を用いた。ウイルス力価の測定法は特開２００７−８９５７８の実施例３に記載の通りである。
ニワトリ受精卵の外側を消毒液（株式会社昭和フランキ製）及びエタノールで除菌した。孵卵機Ｐ−００８（Ｂ）型（株式会社昭和フランキ製）を３８℃、湿度５０〜６０％の環境になるようセットし、電源を入れた時刻を孵卵開始時刻（０時間）とし、以後１５分毎に９０°転卵しながら孵卵を行った。
孵卵開始から約５５時間経過後孵卵器から卵を取り出し、鈍端部に１ｍｍ程度の穴を開けた。つづいて卵の側面の中央よりやや上部に直径７〜１０ｍｍ程度の穴をあけた。実体顕微鏡システムＳＺＸ１２（オリンパス社製）下で、フェムトチップＩＩ（エッペンドルフ社製）に特開２００７−８９５７８の実施例５に記載の手順で調製したウイルス液約２μｌを注入し、フェムトジェット（エッペンドルフ社製）を用いて前記穴からニワトリ胚の心臓に注入した。
ウイルス液を注入後スコッチテープＢＫ−１５（住友スリーエム社製）で穴をふさぎ、孵卵器に戻して孵卵を続けた。孵卵器の転卵を３０分毎に３０°転卵に変更した。孵卵開始から１週間後に孵卵器に６０ｃｃ／ｍｉｎで酸素を供給し孵卵を行った。孵卵開始から１９日目に転卵をとめ、自然に孵化するのを待った。自然に孵化し誕生した雛を飼育して成長させて、トランスジェニックニワトリの雌性成体を得た。飼料として、幼雛ＳＸセーフティー及びネオセーフティー１７（豊橋飼料株式会社製）を用いた。トランスジェニックニワトリが産卵した卵中におけるｆＥＰＯの発現を、後述のＢａＦ／ＥＰＯＲによる細胞増殖アッセイにより確認した。卵白中のｆＥＰＯ活性は１．４×１０４ Ｕ／ｍＬであることが確認された。
卵白中にｆＥＰＯ活性が確認されたニワトリ個体の卵を回収し、ダイアモンドカッター型割卵機（ミタカ電機社製）を用いて割卵し、卵白分離スリット（ミタカ電機社製）を用いて卵白と卵黄を分離し、卵白のみを回収した。回収した卵白は１ｍｍ口径の卵白ストレーナー（三共技研社製）を通液することでせん断した。せん断した卵白１０〜２０Ｌを、２０Ｌ容量のタンクへ回収した後、撹拌機を用いて攪拌混合した。精製に使用するまで、−８０℃のフリーザー（日本フリーザー社製 ＣＬＮ−５０ＣＤ１）を用いて凍結保管した。
（１．２．ｆＥＰＯの活性測定）
卵白中のｆＥＰＯの活性は、ＥＰＯ依存性細胞株であるＢａＦ／ＥＰＯＲによる細胞増殖アッセイ（特開平１０−９４３９３）により評価した。細胞増殖アッセイはエポジン（中外製薬株式会社製）を標準エリスロポエチンとして、増殖の検量線を描きそれを元に未知サンプルのエリスロポエチン活性を測った。ＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞用培地として５％の牛胎児血清（Ｆｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）と５０ｕｎｉｔｓ／ｍｌのペニシリン、ストレプトマイシンを含むＲＰＭＩ１６４０リキッド培地（日水製薬株式会社製）を用いた。通常のＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞の培養の際には終濃度１Ｕ／ｍｌとなるようにエポジンを加えた。細胞増殖アッセイには対数増殖期にある細胞を用いた。
ＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞で細胞増殖アッセイをおこなうため、まず培地中のエポジンを除去した。培養したＢａＦ／ＥＰＯＲ細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。上清を取り除き、沈殿にエポジンを含まない培地を１０ｍｌ加え懸濁した。同様の操作を３度行い培地中のエポジンを除去した。細胞を計数し、エポジンを含まない培地で５５５５５Ｃｅｌｌｓ／ｍｌの濃度になるように希釈した。９６穴マイクロタイタープレートの各ウェルに９０μｌずつ播種した。これに、培地で２５、１６、１０、６．４、４．０、２．５、１．６、１．０Ｕ／ｍｌとなるよう希釈したエポジンを１０μｌずつ加え、一様になるよう懸濁した（エリスロポエチンの終濃度はそれぞれ２．５、１．６、１．０、０．６４、０．４、０．２５、０．１６、０．１Ｕ／ｍｌとなる）。
アッセイに用いるサンプルは培地で２〜４倍程度ずつ段階希釈し、検量線の測定範囲内に入るようにし、播種した細胞中に１０μｌずつ加え、一様になるよう懸濁した。標準サンプル、未知サンプル共に同じものを３点測った。２日間培養し、Ｃｅｌｌ Ｃｏｕｎｔｉｎｇ Ｋｉｔ−８（同人化学研究所社製）溶液を各ウェルに１０μｌずつ添加した。１〜４時間呈色反応を行った後、０．１ｍｏｌ／ｌの塩酸を１０μｌ加え反応を停止し、マイクロプレートリーダーを用い、４５０ｎｍの吸光度を測定した。標準サンプルの測定結果を対数近似し、近似式を求めた。求めた近似式より未知サンプルの活性を換算した。
活性測定に用いる卵白は、超音波や物理的手法により全体を一様となるように調製した。調製したサンプルは活性測定時まで−８０℃で凍結保存した。
（２．ｆＥＰＯの精製）
上記１で得られたｆＥＰＯ含有ニワトリ卵白液から、複数のカラムクロマトグラフィー、限外ろ過等の手段を組み合わせて精製ｆＥＰＯ画分を得た。
精製ｆＥＰＯ画分は緩衝液として５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８．３５）を含み、ｆＥＰＯ濃度は２．３ｍｇ／ｍＬ、生物学的活性は２．８×１０５Ｕ／ｍｇであった（１．２．ｆＥＰＯの活性測定に記載の方法による）。
（３．ｆＥＰＯのＰＥＧ化）
上記２．で得られた精製ｆＥＰＯ画分に以下のＰＥＧ化剤を添加した。
ＳＵＮＢＲＩＧＨＴ ＭＥ−２００ＨＳ（平均分子量２０Ｋの直鎖ＰＥＧのＰＥＧ化剤、日油株式会社製）
ｆＥＰＯとＰＥＧ化剤とがモル比で１：５となる割合で精製ｆＥＰＯ画分とＰＥＧ化剤を混合後、４℃で混和しながら２時間反応させた。２時間反応後、反応停止剤として１００ｍＭグリシン溶液を１／１０量加え、４℃で１時間混和しながら反応を停止させた。
次いで、ＰＥＧ化反応液を１０倍量の５０ｍＭ酢酸−酢酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ４．５）で希釈し、０．２μｍフィルターろ過後、クロマトグラフィーにより、モノＰＥＧ体、ジＰＥＧ体、オリゴＰＥＧ体および未反応ＰＥＧ、未反応ｆＥＰＯを分離回収した。
回収されたモノＰＥＧ体及びジＰＥＧ体のピークに相当する溶出画分を均質に撹拌し「ＭＣＳＰ溶出画分」とした。
上記のＭＣＳＰ溶出画分から限外ろ過、ウイルス除去等の工程を経てＰＥＧ化ｆＥＰＯ原薬を調製した。
（４．製剤化）
上記ＰＥＧ化ｆＥＰＯ原薬から下記表１の組成の液状組成物を製造した。
ＰＥＧ化ｆＥＰＯ濃度：分光光度計と光路長２ｃｍの石英セルを用いて波長２８０ｎｍと３２０ｎｍの吸光度を測定し、次式からＰＥＧ化ｆＥＰＯ濃度を算出したところ０．１１ｍｇ／ｍＬであった。
式：ＰＥＧ化ｆＥＰＯ濃度（ｍｇ/ｍＬ）＝（Ａｂｓ２８０-Ａｂｓ３２０）×０．９５９／２
生物活性測定：上記１．２．ｆＥＰＯの活性測定に記載の方法に従って生物学的活性を求めた。製剤を希釈（２０００倍〜５０００倍）して培養液に加えた。２日間３７℃５％ＣＯ２雰囲気下で培養した後に、セルカウンティングキット８（同仁化学）を加えて、細胞数を測定した。標準曲線を作成して、活性を読み取り、製剤の比活性を算出した結果、１．８×１０４Ｕ／ｍｇだった。
＜試験１：慢性腎臓病モデルラットへのＰＥＧ化ｆＥＰＯの長期投与＞
（概要）
前記調製例で調製したＰＥＧ化ネコエリスロポエチン（以下ＰＥＧ化ｆＥＰＯ）の慢性腎臓病に対する薬効評価を日本獣医生命科学大学・獣医学科形態機能学分野・獣医生理学研究室で維持している腎低形成症（ＨＰＫ）ラットを用いて実施した。１０週齢の雄のＨＰＫラット、ならびに雄の正常ラットに対し、３０週齢に達するまで１４日毎に３６．６μｇ／ｋｇ体重の用量でＰＥＧ化ｆＥＰＯの長期反復投与を行った。３６．６μｇ／ｋｇの投与により、正常ラットにおいて長期にわたる造血の亢進が観察された。溶媒の生理食塩水投与のＨＰＫラットが血中尿素窒素（ＢＵＮ）とクレアチニン（Ｃｒｅ）の上昇傾向を示したのに対し、ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与ではそれらが低減された。また、生理食塩水投与のＨＰＫでは顕著な多飲多尿が進行したが、ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与により多飲多尿の発生が抑制された。ＰＥＧ化ｆＥＰＯの長期投与は腎機能の悪化を阻止することが示唆された。
（目的）
ＰＥＧ化ｆＥＰＯはネコに対して複数回の投与が可能で、体内に長く保持されるため（試験３、４、５参照）、早期からの少ない投与回数で腎不全の病態進行の阻止や予後の改善をもたらすと期待される。そこで本試験では、ＨＰＫラットに対し、病態初期からＰＥＧ化ｆＥＰＯの長期連続投与を行い、腎保護作用や腎不全の病態悪化抑制作用などを示すかどうかを確認することを目的とする。
（方法）
ＨＰＫラットの生産を随時行い、得られたラット個体が実験開始日齢（１０週齢）に達した時点で被験物質の投与を開始し、サンプルの採取を行った。
このＨＰＫラットは、生まれつき腎臓に異常があり、ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与の開始時点において貧血を発症しておらず、且つ、血中Ｃｒｅ濃度は正常値である。したがって、このＨＰＫラットは、少なくともＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与の開始時点において、ＩＲＩＳ病期分類でのステージＩに相当する初期の慢性腎臓病を罹患していると言える。
被験物質：
前記調製例で調製したＰＥＧ化ｆＥＰＯ
投与液調製：
前記調製例で調製した被験物質を、使用直前まで冷蔵保存しておき、投与直前に溶液を室温に静置し、室温程度になったものを２７Ｇの注射針を用いて皮下投与した。
飼育環境：
飼料はＣＲ−ＬＰＦ（オリエンタル酵母社製）を自由摂取させ、飲水は給水ボトル（トキワ科学社製）から水道水を自由飲水させた。
投与：
ＰＥＧ化ｆＥＰＯ３６．６μｇ／ｋｇ体重を皮下投与した。対照群には生理食塩水を同じ液量投与した。全ての群に対し１４日毎に投与を実施した（表２）。
検査方法：
動物の一般症状は原則毎日観察した。体重は１週間毎に測定した。腎機能の経時的な変化を評価するために、イソフルラン麻酔下で頸静脈から血液を採取し、ＥＤＴＡ血で血算の計数を行い、ヘパリン添加血漿でＣｒｅやＢＵＮ等の腎機能マーカーの評価を実施した。
また、採血に先立って、代謝ケージを用いて採血直前の２４時間における１）摂餌量、２）飲水量、３）尿量、並びに４）タンパク質や５）Ｃｒｅの尿中排泄量、６）尿沈渣の検査を実施した。動物は採血３日前より代謝ケージに移し、順化させた。代謝ケージでの測定は４週に１回行った。実験のスケジュールを図１に示す。
図１に示す通り、投与と採血（ＥＤＴＡ血を用いた血算の算定）は１週毎に交互に行い、その際必ず体重を測定し、動物の一般状態を観察した。初回投与日を０ｗとして、投与開始の１週間前（−１ｗ）にプレのデータを採取した。以降は１ｗ：採血、２ｗ：投与、３ｗ：採血、４ｗ：投与というように、１９ｗまで実験を継続した。ヘパリン加血漿の採取と代謝ケージによる測定は、２回の採血に対し１回、すなわち４週に１回実施した。
（結果）
実験に際し、多数のＨＰＫラットを確保することが困難であったため、ＰＥＧ化ｆＥＰＯと溶媒に対して１匹ずつを用いて実験を行った。ＨＰＫでは体重が正常より軽く、生理食塩水投与のＨＰＫラットはＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与のＨＰＫに比べて体重の増加がより緩やかであった（図２−１Ａ）。
摂餌量の推移では遺伝子型および投与の有無に依存した影響は見られなかった（図２−１Ｂ）。生理食塩水投与のＨＰＫでは飲水量と尿量が１１週以降増加したが、ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与は飲水量と尿量の増加が抑制されている様に見えた（図２−１ＣおよびＤ）。
血液学的検査では、赤血球数はＥＰＯ投与の正常個体において持続的な赤血球の増加が観察されたが、ＥＰＯ投与のＨＰＫでは明らかな造血亢進は観察されなかった（図２−２Ｅ）。
ＢＵＮおよび血漿Ｃｒｅは生理食塩水投与のＨＰＫラットで上昇傾向を示したのに対して、ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与ではそれらの上昇がある程度低減した（図２−２ＦおよびＧ）。
（考察）
ＨＰＫラットは希釈尿を呈することから、ＨＰＫラットで認められる多飲多尿は尿細管での濃縮障害によるもので、これは個々の肥大したネフロンによる高濾過状態に対応した尿細管での水の吸収ができていないためであると考えられる。さらに日齢の進行に伴って重篤化する糸球体障壁の障害による漏出タンパク質の増加や間質の線維化は尿細管の吸収障害をさらに悪化させる可能性があるが、ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与で尿量が比較的低値で維持したことから、これらの病理学的異常の進行が一部抑制されたと考えられる。
これまでのＨＰＫラットの病態解析から、ＨＰＫラットは７０日齢以降腎機能不全が悪化し、ＢＵＮや血漿Ｃｒｅが徐々に上昇し、多飲多尿や蛋白尿の重篤化、低アルブミン血症や高脂血症、高血圧、腎性貧血の重篤化、上皮小体の機能亢進症などを呈することがわかっている。本実験では、生理食塩水投与のＨＰＫラットにおいてＢＵＮと血漿Ｃｒｅが上昇し、これまでの報告と一致してＨＰＫラットで腎臓の排泄能の悪化が起こったことが確認されたが、ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与によりＢＵＮや血漿Ｃｒｅの上昇が低減したことから、腎排泄能の悪化、すなわち糸球体濾過量の低下が一部軽減されたことが示唆される。
＜試験２：慢性腎臓病モデルラットへのＰＥＧ化ｆＥＰＯの長期投与＞
ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与量を７３．２μｇ／ｋｇ体重とする試験群を加えた以外は試験１と同様の手順で試験開始後１１週齢までＰＥＧ化ｆＥＰＯを雄のＨＰＫラット及び雄の正常ラットに対して投与した試験を行った。
尿量、ＢＵＮ、血漿Ｃｒｅの測定結果をそれぞれ図３Ａ、Ｂ、Ｃに示す。試験１と同様に、生理食塩水投与のＨＰＫでは尿量が経時的に増加したが、ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与により尿量の増加が抑制された（図３Ａ）。また、ＢＵＮおよび血漿Ｃｒｅは生理食塩水投与のＨＰＫラットで上昇傾向を示したのに対して、ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与ではそれらの上昇を低減することができた（図３Ｂ、Ｃ）。
＜試験３：ＰＥＧ化ｆＥＰＯのネコでの薬物動態試験＞
（目的）
［１２５Ｉ］ＰＥＧ化ｆＥＰＯを雄性ネコに単回皮下投与したときの放射能の血漿中濃度推移を調べることを目的とする。
（実験操作）
［１２５Ｉ］ＰＥＧ化ｆＥＰＯは、前記調製例の手順で調製されたＰＥＧ化ｆＥＰＯに常法により１２５Ｉ標識したものである。調製した［１２５Ｉ］ＰＥＧ化ｆＥＰＯの比放射能は９８．７ＭＢｑ／ｍＬであった。
供試動物として、投与時に１０月齢、体重３．６ｋｇのネコ（系統：Ｎａｒｃ：Ｃａｔｕｓ、雄性）を１匹用いた。このネコに非絶食下でステンレス注射針を装着したポリプロピレン製注射筒を用いて［１２５Ｉ］ＰＥＧ化ｆＥＰＯを７３．２μｇ（１０．３Ｍｂｑ）／０．８ｍＬ／ｋｇ体重の用量で頚背部に単回皮下投与した。
［１２５Ｉ］ＰＥＧ化ｆＥＰＯの単回皮下投与後、投与後０．５、１、２４、９６、１６８、３３６、５０４、６７２時間の時点で血液を採取した。
採取した血液から血漿を調製し、放射能測定用容器に分取して放射能を測定した。
放射能の測定はガンマカウンタで行った。測定した血漿中放射能濃度（ｃｐｍ／ｍＬ）と、［１２５Ｉ］ＰＥＧ化ｆＥＰＯの比放射能（ｃｐｍ／ｎｇ）とから、血漿中放射能濃度（ｎｇ ｅｑｕｉｖ．／ｍＬ）を算出した。
（結果）
［１２５Ｉ］ＰＥＧ化ｆＥＰＯを雄性ネコに７３．２μｇ（１０．３Ｍｂｑ）／ｋｇ体重の用量で単回皮下投与したときの放射能の血漿中濃度およびその時間推移を図４に示した。
［１２５Ｉ］ＰＥＧ化ｆＥＰＯを単回皮下投与したときの放射能の血漿中濃度は投与後２４時間で最高値を示した（２２０ｎｇ ｅｑｕｉｖ．／ｍＬ）。その後、血漿中濃度は緩やかに減少し、投与後１６８時間で１１８ｎｇ ｅｑｕｉｖ．／ｍＬ、投与後６７２時間で７．３６ｎｇ ｅｑｕｉｖ．／ｍＬであった。投与後３３６から６７２時間での消失半減期は約１３６時間であった。
以上の結果では、ＰＥＧ化ｆＥＰＯは投与後約１か月間は血中に維持されることが示された。このことから、ＰＥＧ化ｆＥＰＯは、投与後約１か月間は薬効を持続することができることが分かる。
＜試験４：ＰＥＧ化ｆＥＰＯを健常ネコへ３カ月継続投与した場合の安全性評価＞
（目的）
本試験４は、健常ネコに対しＰＥＧ化ｆＥＰＯ３６．６μｇ／ｋｇ、７３．２μｇ／ｋｇを反復投与し、安全性を評価することを目的とする。
（試験系）
供試動物：健常ネコ８匹（２〜５歳、雄性）、ＰＥＧ化ｆＥＰＯを投与した各群はｎ＝３、溶媒を投与した対照群はｎ＝４
被験物質：前記調製例と同様の手順で得たＰＥＧ化ｆＥＰＯ、または、溶媒（ＰＥＧ化ｆＥＰＯを含まない以外は表１に示す組成の緩衝水溶液）
投与量：ＰＥＧ化ｆＥＰＯとして３６．６、７３．２μｇ／ｋｇ体重
投与頻度・期間：７日に１回投与、３ヶ月（１２回投与）
サンプリングポイント：投与５日後
評価項目※：血算、網状赤血球数、血液生化学、鉄、中和抗体、体重
※血液検査項目
・末梢血液一般
・網状赤血球数
・総鉄結合能（ＴＩＢＣ）、不飽和鉄結合能（ＵＩＢＣ）
・総蛋白（ＴＰ）、血清アルブミン（Ａｌｂ）、アルブミン／グロブリン比（Ａ／Ｇ比）、尿素窒素（ＢＵＮ）、クレアチニン（Ｃｒｅ）、中性脂肪（ＴＧ）、総コレステロール（Ｔ−ＣＨＯ）、乳酸脱水素酵素（ＬＤＨ）、クレアチンホスホキナーゼ（ＣＰＫ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＧＰＴ）、アスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（ＧＯＴ）、アルカリフォスファターゼ（ＡＬＰ）、カルシウム（Ｃａ）、リン酸塩（Ｐ）、血清鉄（Ｆｅ）、ガンマグルタミルトランスペプチダーゼ（γーＧＴＰ）、血清アミロイドＡ（ＳＡＡ）
（血液学的検査（有効性／薬効のマーカー））
ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与量３６．６μｇ／ｋｇ、７３．２μｇ／ｋｇの両群で投与開始から網状赤血球数、赤血球数、ヘマトクリット値、ヘモグロビン濃度の増加が認められた。これらの変化はＰＥＧ化ｆＥＰＯの投与による変化であると考えられた。
網状赤血球数の、初回の投与からの日数による各群での平均値の推移を図５Ａに示す。溶媒投与群（対照群）においては、投与前と比較して増減は繰り返すものの、溶媒投与に起因する変化は認められなかった。ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与群において、試験期間中に増減を繰り返しながら増加し、３６．６μｇ／ｋｇ投与群においては、投与後７５日、７３．２μｇ／ｋｇ投与群においては、投与後５４、７５および８２日で有意差が認められた。
赤血球数の、初回の投与からの日数による各群での平均値の推移を図５Ｂに示す。溶媒投与群においては、投与前と比較して増減は繰り返すものの、溶媒投与に起因する変化は認められなかった。ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与群において、試験期間中に増減を繰り返しながら増加し、３６．６μｇ／ｋｇ投与群においては、投与後６１、７５および８２日、７３．２μｇ／ｋｇ投与群においては、投与後２６、４０、４７、５４、６１、６８、７５および８２日で有意差が認められた。
また、Ｆｅについては、両ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与群で投与開始から５日目にかけて急激な減少が認められたものの試験期間中は正常範囲下限値を推移した。両ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与群で初回投与後にＴＩＢＣ、ＵＩＢＣの増加が認められた。これらの変化はＰＥＧ化ｆＥＰＯの投与による変化であると考えられた。
更に、両ＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与群で投与開始から平均赤血球容積（ＭＣＶ）、平均赤血球血色素量（ＭＣＨ）の低下が認められた。これらの変化はＰＥＧ化ｆＥＰＯの投与による変化であると考えられた。平均赤血球色素濃度（ＭＣＨＣ）、白血球（ＷＢＣ）は全頭で試験期間を通じて異常は認められなかった。
（体重推移（安全性のマーカー））
体重に関しては、全ての個体で試験期間を通じてＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与による影響は認められなかった。
（血液生化学検査（安全性のマーカー））
ＴＧ、ＳＡＡ、ＴＰ、Ａｌｂ、Ｃａ、Ｐ、ＢＵＮ、Ｃｒｅ、ＧＯＴ、ＧＰＴ、ＬＤＨ、ＣＰＫ、ＡＬＰ、γ−ＧＴＰおよびＴ−ＣＨＯでは対照群、ＰＥＧ化ｆＥＰＯ３６．６μｇ／ｋｇ投与群、ＰＥＧ化ｆＥＰＯ７３．２μｇ／ｋｇ投与群のいずれにおいても、一過性に正常値を逸脱する個体があったものの、試験期間中にＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与による影響は認められなかった。
（試験４まとめ）
以上の結果から、健常ネコにおける３ヶ月間の反復投与ではＰＥＧ化ｆＥＰＯの安全性に問題はないことが分かる。
＜試験５：ＰＥＧ化ｆＥＰＯの薬効の用量依存性の確認＞
（目的）
ネコでの慢性腎臓病の抑制のためのＰＥＧ化ｆＥＰＯの投与量としては、３６．６μｇ／ｋｇ体重又は７３．２μｇ／ｋｇ体重が想定される。そこで、本試験５は安全性試験のために、想定投与量よりも過剰のＰＥＧ化ｆＥＰＯをネコに投与して薬効を比較し安全性を評価することを目的とする。
（方法）
供試動物：健常ネコ（３〜４歳、雄性）
被験物質：前記調製例と同様の手順で得たＰＥＧ化ｆＥＰＯ、溶媒（ＰＥＧ化ｆＥＰＯを含まない以外は表１に示す組成の緩衝水溶液）
投与量：ＰＥＧ化ｆＥＰＯとして３６．６、７３．２、２１９．６、３６６．０μｇ／ｋｇ体重を単回投与
評価ポイント：投与前、投与後１週間毎日採血、以降隔日採血し、投与後４５日程度（網状赤血球数がベースに戻る）まで継続
評価項目：網状赤血球数
（試験群）
８匹のネコ個体を個体番号で識別した。各個体の体重とＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与量は次表の通りとした。
（結果）
図６に、網状赤血球数の測定結果をＰＥＧ化ｆＥＰＯ投与量の群での平均値として示す。
薬効のピークは、投与量に依存することなく、いずれの群においても投与後４〜５日であった。
また、各個体は過去に複数回ＰＥＧ化ｆＥＰＯの投与を受けた実績のある個体であったが、アナフィキラシーショックのような副作用は観察されなかった。

Claims (13)

  1. 非ヒト動物において腎機能の低下を抑制する方法であって、
    非ヒト動物にネコ由来エリスロポエチンを投与する投与工程を含み、
    前記動物が、少なくとも投与工程の開始時において、貧血を発症していない、慢性腎臓病に罹患した又は罹患の疑いのある非ヒト動物である、
    方法。
  2. 前記腎機能の低下が慢性腎臓病に起因する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記投与工程が、前記動物に前記エリスロポエチンを、７日以上３０日以下の期間の時間間隔で投与する工程である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 前記期間あたりの前記エリスロポエチンの投与量が３μｇ／ｋｇ体重以上、４００μｇ／ｋｇ体重以下である、請求項３に記載の方法。
  5. 前記動物が、少なくとも投与工程の開始時において、国際腎臓研究会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｓｏｃｉｅｔｙ）が規定する慢性腎臓病のステージＩ又はステージＩＩに分類される慢性腎臓病に罹患した又は罹患の疑いのある非ヒト動物である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
  6. 少なくとも投与工程開始時において、前記動物における血中クレアチニン濃度が２．７ｍｇ／ｄＬ以下である、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
  7. 鉄を補給する工程、輸液する工程、透析する工程、食事療法を行う工程、降圧剤を投与する工程、吸着剤を投与する工程、ビタミンを投与する工程、及び、利尿剤を投与する工程からなる群から選択される少なくとも１つの工程を更に含む、請求項１〜６のいずれか１項に記載の方法。
  8. ネコ由来エリスロポエチンを含有する、少なくとも投与の開始時において、貧血を発症していない、慢性腎臓病に罹患した又は罹患の疑いのある非ヒト動物に投与することにより、前記非ヒト動物において腎機能の低下を抑制するための非ヒト動物用薬剤。
  9. 前記腎機能の低下が慢性腎臓病に起因する、請求項８に記載の非ヒト動物用薬剤。
  10. 前記動物に前記エリスロポエチンを、７日以上３０日以下の期間の時間間隔で投与するための、請求項８又は９に記載の非ヒト動物用薬剤。
  11. 前記期間あたりの前記エリスロポエチンの投与量が３μｇ／ｋｇ体重以上、４００μｇ／ｋｇ体重以下となるように投与するための、請求項１０に記載の非ヒト動物用薬剤。
  12. 少なくとも投与の開始時において、国際腎臓研究会（Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｒｅｎａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ Ｓｏｃｉｅｔｙ）が規定する慢性腎臓病のステージＩ又はステージＩＩに分類される慢性腎臓病に罹患した又は罹患の疑いのある非ヒト動物に投与するための、請求項８〜１１のいずれか１項に記載の非ヒト動物用薬剤。
  13. 少なくとも投与の開始時において、血中クレアチニン濃度が２．７ｍｇ／ｄＬ以下である非ヒト動物に投与するための、請求項８〜１２のいずれか１項に記載の非ヒト動物用薬剤。
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