JP6803328B2 - 大腸菌ベースでのベータラクタマーゼ生産 - Google Patents

大腸菌ベースでのベータラクタマーゼ生産 Download PDF

Info

Publication number
JP6803328B2
JP6803328B2 JP2017507851A JP2017507851A JP6803328B2 JP 6803328 B2 JP6803328 B2 JP 6803328B2 JP 2017507851 A JP2017507851 A JP 2017507851A JP 2017507851 A JP2017507851 A JP 2017507851A JP 6803328 B2 JP6803328 B2 JP 6803328B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
beta
lactamase
seq
coli
polypeptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
JP2017507851A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2017529833A5 (ja
JP2017529833A (ja
Inventor
ブリストル，アンドリュー
カレコ，マイケル
Original Assignee
シンセティック バイオロジクス，インコーポレイテッド
シンセティック バイオロジクス，インコーポレイテッド
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by シンセティック バイオロジクス，インコーポレイテッド, シンセティック バイオロジクス，インコーポレイテッド filed Critical シンセティック バイオロジクス，インコーポレイテッド
Publication of JP2017529833A publication Critical patent/JP2017529833A/ja
Publication of JP2017529833A5 publication Critical patent/JP2017529833A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP6803328B2 publication Critical patent/JP6803328B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/78—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5)
    • C12N9/86—Hydrolases (3) acting on carbon to nitrogen bonds other than peptide bonds (3.5) acting on amide bonds in cyclic amides, e.g. penicillinase (3.5.2)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y305/00—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5)
    • C12Y305/02—Hydrolases acting on carbon-nitrogen bonds, other than peptide bonds (3.5) in cyclic amides (3.5.2)
    • C12Y305/02006—Beta-lactamase (3.5.2.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１４年８月２８日出願の米国仮特許出願第６２／０４３，３６０号の利益を主張するものであり、その全内容は参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、部分的には、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）細胞を用いるベータラクタマーゼの改善された生産方法に関する。医薬製剤に適したものを含むベータラクタマーゼの高収量生産が、本発明の方法を用いて達成される。
電子送信されたテキストファイルの記述
本明細書と共に電子送信されたテキストファイル：配列表のコンピュータ読み取り可能な形式のコピー（ファイル名：ＳＹＮ−００５ＰＣ−ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ．ｔｘｔ；記録日：２０１５年８月２０日；ファイルサイズ：１９ＫＢ）の内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
β−ラクタム系抗生物質は、それらの分子構造中のβ−ラクタム環を特徴とする。β−ラクタム環の完全性は生物活性に必須であり、それはペプチドグリカン合成の最後の架橋反応を触媒する一組のトランスペプチダーゼの不活性化をもたらす。β−ラクタム抗生物質ファミリーのメンバーには、ペニシリン類、セファロスポリン類、クラバム類（又はオキサペナム類）、セファマイシン類及びカルバペネム類が含まれる。
ベータラクタマーゼは、β−ラクタム系抗生物質を加水分解する細菌の防御酵素である。グラム陰性細菌は、β−ラクタム系抗生物質に対する耐性を達成するためにベータラクタマーゼを生産する。特に、ベータラクタマーゼは、β−ラクタム環のアミド結合の不可逆的な加水分解を効率的に触媒でき、生物学的に不活性な生産物（複数可）をもたらす。
ヒトは、微生物細胞が哺乳類細胞の数を１０対１で上回ると推定される、哺乳類細胞と微生物細胞のコングロマリットである「超個体」と考えられ得る。この微生物成分、及びその微生物の遺伝的レパートリーであるマイクロバイオームは、ヒト宿主のそれよりもおよそ１００倍多い。驚くべきことに、外来生物のこの膨大な多様性にもかかわらず、ヒトの免疫系は、一般的に相乗作用の状態を維持している。これは、遠位ＧＩ管に特に当てはまり、遠位ＧＩ管は最大１０００種の異なる細菌種及び推定１×１０１４の過剰の微生物を収容し、ヒト宿主の健康状態を定義する上で中心的であると思われる。特にＧＩ管における、マイクロバイオームの慎重なバランスの喪失は、様々な疾患につながり得る。
疾患の特定の状況を治療するために必要とされる抗生物質による医学的処置は、ＧＩ管を含むマイクロバイオームで混乱を誘導し、さらなる疾患につながり得る。例えば、アンピシリン、セフトリアキソン、セフォペラゾン、及びピペラシリンのような特定の非経口投与用のβ−ラクタム類は、胆汁排泄を経由して小腸の近位部（十二指腸）へと一部排出される。腸管中の未吸収の残留ベータラクタム類は、正常な腸内細菌叢の生態系のバランスに望ましくない影響を引き起こし、例えば、クロストリジウム・ディフィシル感染症（ＣＤＩ）、抗生物質関連下痢症、バンコマイシン耐性腸球菌（ＶＲＥ）、拡張型ベータラクタマーゼ生産グラム陰性桿菌（ＥＳＢＬ）、及び真菌などの病原性細菌の異常増殖、並びに正常な腸内細菌叢と潜在的な病原細菌の両方のうちの抗生物質耐性株の選別をもたらし得る。
正常な腸内細菌叢の生態バランスを回避又はリバランスするための１つのアプローチは、例えば、ＧＩ管内で排泄された抗生物質又は吸収されない抗生物質を不活性化し、それによって正常な腸内細菌叢を維持し、潜在的病原性微生物と共にその異常増殖を防止することによるベータラクタマーゼの治療的使用である。
したがって、治療的介入で使用するための商業規模での効率的なベータラクタマーゼ生産方法に対する必要性が残っている。
本発明は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））細胞におけるベータラクタマーゼポリペプチドの改善された生産方法を提供する。本方法は、ベータラクタマーゼポリペプチドをコードする配列を含むベクターで形質転換された宿主大腸菌細胞を提供することを含む。大腸菌細胞は、細胞質でベータラクタマーゼの発現を誘導するために培養される。可溶性画分が大腸菌細胞からその後調製されてベータラクタマーゼポリペプチドを回収する。
本発明の方法は、高収量でベータラクタマーゼの生産を可能にする。一実施形態において、本方法は、培養液１リットル当たり少なくとも１０グラムのベータラクタマーゼポリペプチドを産生する。別の実施形態において、本方法は、培養液１リットル当たり少なくとも１５グラムのベータラクタマーゼポリペプチドを産生する。
様々な大腸菌細胞株を本発明に用いてよい。例えば、大腸菌細胞は、ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＷ３１１０から選択されてよい。ベータラクタマーゼポリペプチドは、大腸菌細胞の細胞質内で主に発現する。特定の実施形態において、ポリペプチドの発現は、培養物にイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）を添加することによって誘導される。
開示される方法は、ベータラクタマーゼ及びその誘導体を生産するために利用してよい。一実施形態において、ベータラクタマーゼポリペプチドは、Ｐ１Ａと少なくとも６０％の同一性を有する配列を含む。別の実施形態において、ベータラクタマーゼポリペプチドは、Ｐ２Ａと少なくとも６０％の同一性を有する配列を含む。さらに別の実施形態において、ベータラクタマーゼポリペプチドは、Ｐ３Ａと少なくとも６０％の同一性を有する配列を含む。さらなる実施形態において、ベータラクタマーゼポリペプチドは、Ｐ４Ａと少なくとも６０％の同一性を有する配列を含む。様々な実施形態において、本方法は、マイクロバイオーム保護治療に有用なベータラクタマーゼを生産するために使用される。
バッチエイジ（時）対気流（ＡＩＲＦＬ（ｌ／分）、上から２番目の線）、温度（ＴＥＭＰ（℃）、一番上の線）、攪拌速度（ＳＴＩＲＲ（ＲＰＭ）、下から２番目の線）、ｐＨ（３番目の線）、及び酸素のパーセント（ＰＯ２、一番下の線）のマルチ発酵槽コンピュータシステム（ＭＦＣＳ）ＣＬＤ９７７発酵プロットを示す。 バッチエイジ（時）対気流（ＡＩＲＦＬ（ｌ／分）、上から２番目の線）、温度（ＴＥＭＰ（℃）、一番上の線）、攪拌速度（ＳＴＩＲＲ（ＲＰＭ）、下から２番目の線）、ｐＨ（３番目の線）、及び酸素のパーセント（ＰＯ２、一番下の線）のＭＦＣＳ ＣＬＤ９９０発酵プロットを示す。 バッチエイジ（時）対ＣＬＤ９７７（３／１３Ｃ０３９）及びＣＬＤ９９０（４／１３Ｃ０４０）酸素摂取率（ＯＵＲ）及び二酸化炭素発生速度（ＣＥＲ）（ｍＭ／ｌ／時）のＭＦＣＳ発酵出口ガス分析プロットを示す。左から右に示されており、最初の線はＣＬＤ９７７ ＯＵＲに相当し、２番目の線は、ＣＬＤ９７７ ＣＥＲに相当し、３番目の線はＣＬＤ９９０ ＯＵＲに相当し、４番目の線はＣＬＤ９９０ ＣＥＲに相当する。 バッチ時間（時）対ＯＤ６００及び乾燥細胞重量（ＤＣＷ（ｇ／Ｌ））のＣＬＤ９７７（３／１３Ｃ０３９）並びにＣＬＤ９９０（４／１３Ｃ０４０）のバイオマスプロットを示す。ＣＬＤ９７７のＯＤ６００及びＤＣＷの線はそれぞれ、一番上の線及び下から２番目の線に相当する。ＣＬＤ９９０のＯＤ６００及びＤＣＷの線はそれぞれ、上から２番目の線及び一番下の線に相当する。 バッチフェーズの終了時及び発酵完了後（最終試料）のＣＬＤ９７７並びにＣＬＤ９９０の細菌グラム染色を示す。 対照標準物質と比較した、誘導前〜発酵終了時のＣＬＤ９７７（３／１３ＣＯ３９）タイムコース試料のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。 対照標準物質と比較した、誘導前〜発酵終了時のＣＬＤ９９０（４／１３Ｃ０４０）タイムコース試料のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。 対照標準物質と比較したＣＬＤ９７７（３／１３Ｃ０３９）及びＣＬＤ９９０（４／１３Ｃ０４０）からの超音波処理試料のＳＤＳ ＰＡＧＥ分析を示す。ＣＬＤ９７７及びＣＬＤ９９０は、主に可溶性タンパク質を産生した。不溶性画分については、かすかな生産物バンドのみが見られる。 対照１及び２並びに０．６、０．８、１．０、１．５、２．０、及び４ｍｇ／Ｌの参照標準希釈物についての時間（秒）対吸光度の標準曲線を示す。対照１及び２は、重複物として役割を果たす１．０μｇ／ｍＬのプリセット希釈物であった。 エンドポイント吸光度に対する標準濃度（ｍｇ／Ｌ）の標準エンドポイント曲線を示す。標準的な吸光度は、時間＝６０秒で測定されたものから時間＝０秒での標準吸光度を差し引いたものであった。具体的には、酵素反応は時間＝６０秒で測定した。吸光度を時間＝０秒で測定し、次いで、それを６０秒の測定値から差し引いた。標準曲線を作成するために、参照標準のいくつかの希釈物を試験した。 時間（秒）対１２時間、２４時間、４８時間でのＣＬＤ９８１（３／１３Ｃ０３７（３７とも呼ばれる））の吸光度、並びにペリプラズム浸透圧ショック画分（ＯＳ２）の吸光度の標準曲線を示す。具体的には、ＯＳ２は、大腸菌ペレットから調製された第２のバッファー画分であり、細胞膜周辺腔画分を表す。 時間（秒）対ＣＬＤ９８１（３／１３Ｃ０３７）ＯＳ１試料の吸光度の標準エンドポイント曲線を示す。 時間（秒）対誘導後１２時間、２４時間、４８時間のＣＬＤ９８２（４／１３Ｃ０３８（３８とも呼ばれる））の吸光度、並びに誘導後４８時間のＯＳ１及びＯＳ２の吸光度の標準曲線を示す。 時間（秒）対、対照１及び２（対照標準へと組み合わせられる）の吸光度並びに０．６、０．８、１．０、１．５、２．０、及び４ｍｇ／Ｌの参照標準物質希釈物の吸光度の標準曲線を示す。 標準濃度（ｍｇ／Ｌ）対エンドポイント吸光度の標準エンドポイント曲線を示す。標準的な吸光度は、時間＝６０秒で測定されたものから時間＝０秒での標準吸光度を差し引いたものであった。 時間（秒）対誘導後４８時間のＣＬＤ９８１（３７）及びＣＬＤ９８２（３８）のＯＳ１並びにＯＳ２の吸光度の標準曲線を示す。表３は、対照１及び２と共に、ＣＬＤ９８１及びＣＬＤ９８２のＯＳ１並びにＯＳ２についてのアッセイプレート２の活性並びに力価の結果のまとめである。 時間（秒）対、対照１及び２（対照標準へと組み合わせられる）の吸光度並びに０．６、０．８、１．０、１．５、２．０、及び４ｍｇ／Ｌの参照標準物質希釈物の吸光度の標準曲線を示す。 標準濃度（ｍｇ／Ｌ）対エンドポイント吸光度の標準エンドポイント曲線を示す。標準的な吸光度は、時間＝６０秒で測定されたものから時間＝０秒での標準吸光度を差し引いたものであった。 時間（秒）対、誘導後の最後から２番目及び最後の時点の両方（非標識＝超音波処理）並びに誘導後の最後の時点（バグバスター）についてのＣＬＤ９７７（３９）及びＣＬＤ９９０（４０）の吸光度の標準曲線を示す。
本発明は、ベータラクタマーゼポリペプチドが大腸菌細胞内で、高収量で過剰生産できるという驚くべき発見に一部基づいている。具体的には、高収量生産は、大腸菌細胞の細胞質でポリペプチドを発現させ、続いてこれらの細胞から調製した可溶性画分からポリペプチドを回収することによって達成される。
本発明に先立って、バチルス・リケニフォルミス由来のベータラクタマーゼなどのベータラクタマーゼは大腸菌細胞の細胞エンベロープ及びペリプラズム画分に主に見られることが十分に立証された。Ｍｅｚｅｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ（１９８３），２５８（１８）：１１２１１−１１２１８を参照されたい。特に、バチルス・リケニフォルミス由来のベータラクタマーゼは、細胞質内に全く存在しないことが判明している。同上。
さらに、大腸菌細胞からのベータラクタマーゼの生産は、一般的に効率的でなく、全収量は培養液１リットル当たりミリグラムスケールの酵素である。例えば、Ｓｈａｗら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｘｐｒ Ｐｕｒｉｆ．（１９９１），２（２−３）：１５１−１５７を参照されたい。ベータラクタマーゼがバチルス・リケニホルミスに由来するならば、バチルス株におけるこれらの酵素の生産はより高い収量を提供できることが期待される。しかしながら、本明細書に示す研究は、枯草菌細胞で生産した場合でも、ベータラクタマーゼの収量が低いことを示す。したがって、本発明が、培養液１リットル当たりグラムスケールのベータラクタマーゼの全収量を達成することは驚くべきことである。
したがって、本発明は、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））細胞におけるベータラクタマーゼポリペプチドの改善された生産方法を提供する。本方法は、ベータラクタマーゼポリペプチドをコードする配列を含むベクターで形質転換された宿主大腸菌細胞を提供することを含む。大腸菌細胞は、細胞質でベータラクタマーゼの発現を誘導するために培養される。可溶性画分が、ベータラクタマーゼポリペプチドの回収のために大腸菌細胞からその後調製される。
本発明は、大腸菌細胞においてベータラクタマーゼポリペプチドの高収量生産を可能にする。様々な実施形態において、本発明の方法は、培養液１リットル当たり少なくとも約１グラム、約２グラム、約３グラム、約４グラム、約５グラム、約６グラム、約７グラム、約８グラム、約９グラム、約１０グラム、約１１グラム、約１２グラム、約１３グラム、約１４グラム、約１５グラム、約１６グラム、約１７グラム、約１８グラム、約１９グラム、約２０グラム、約２２グラム、約２４グラム、約２６グラム、約２８グラム、約３０グラム、約３５グラム、約４０グラム、約４５グラム、又は約５０グラムのベータラクタマーゼポリペプチドの収量を提供する。一実施形態において、培養液１リットル当たり少なくとも約１０グラムのベータラクタマーゼポリペプチドが回収される。別の実施形態において、培養液１リットル当たり少なくとも約１５グラムのベータラクタマーゼポリペプチドが回収される。さらなる実施形態において、培養液１リットル当たり少なくとも約１８グラムのベータラクタマーゼポリペプチドが回収される。
様々な実施形態において、本方法は、例えば、その全内容が参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７，３１９，０３０号に記載されるものなどのバチルスベースの発現系と比較して、より高い収量及び改善された純度のうちの１以上を提供する。様々な実施形態において、本方法は、少なくとも１５０個のヌクレオチドの欠失領域がそのｓｉｇＧ遺伝子から除去された非胞子形成枯草菌株を用いて所望のポリペプチド生産物を生産する方法であって組換えポリペプチドをコードするポリヌクレオチド構築物でこの株を形質転換すること、ポリヌクレオチド構築物を発現させること、及び組換えポリペプチドを回収することを含む方法と比較して、より高い収量及び改善された純度のうちの１以上を提供する。いくつかの実施形態において、本方法は、ｓｉｇＧ遺伝子の２つの機能領域（すなわち、アミノ酸６７〜８０又は２２９〜２４８をコードする領域）のいずれかの少なくとも一部を除去することを含む。
様々な実施形態において、本方法は、例えば、米国特許第７，３１９，０３０号に記載されるものなどのバチルスベースの発現系に対して、大腸菌における約５倍、又は約７．５倍、又は約１０倍、又は約１５倍の収量の改善を提供する。
様々な大腸菌細胞を本発明で使用することができる。例示的な大腸菌細胞には、ＢＬ２１（ＤＥＳ）、Ｗ３１１０、ＤＨ５α、ＨＭＳ１７４、及びそれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態において、大腸菌細胞はＢＬ２１（ＤＥＳ）株である。別の実施形態において、大腸菌細胞はＷ３１１０株である。Ｗ３１１０の遺伝子型は、大腸菌Ｋ１２ Ｆ−、λ−、ＩＮ（ｒｒｎＤ−ｒｒｎＥ）１、ｒｐｈ−１である。これはグラム陰性で、桿状の通性嫌気性菌であり、その系譜については十分に説明されている（Ｂａｃｈｍａｎｎ，ＢＪ １９７２．Ｐｅｄｉｇｒｅｅｓ ｏｆ ｓｏｍｅ ｍｕｔａｎｔ ｓｔｒａｉｎｓ ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｋ−１２．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．Ｒｅｖ．３６（４）：５２５−５７）。Ｂ３２１４プラスミドでの形質転換前に、この株は改変されていなかった。
本発明は、高収量でベータラクタマーゼポリペプチドを生産するために用いられる。様々な態様において、ベータラクタマーゼポリペプチドは、配列番号１（バチルス・リケニフォルミスのＰｅｎＰ、すなわち、Ｐ１Ａ）の配列を有するか、又は配列番号１の１以上の変異によって誘導される。Ｐ１Ａ酵素の２６３個のアミノ酸配列（３１個のアミノ酸シグナル配列及びＮ末端のＱＡＳＫＴ（Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）ペンタペプチドの除去後、配列番号３を参照されたい）が本明細書に提供される。本明細書に記載するように、本発明の方法によって生産され得るベータラクタマーゼ誘導体を作製するために、この配列に変異を行ってよい。
配列番号１
EMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAASYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDDKLIAEATKVVMKALNMNGK
いくつかの実施形態において、本発明の方法によって生産されるベータラクタマーゼポリペプチドは、配列番号１と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、又は約６１％、又は約６２％、又は約６３％、又は約６４、又は約６５％、又は約６６％、又は約６７％、又は約６８％、又は約６９％、又は約７０％、又は約７１％、又は約７２％、又は約７３％、又は約７４％、又は約７５％、又は約７６％、又は約７７％、又は約７８％、又は約７９％、又は約８０％、又は約８１％、又は約８２％、又は約８３％、又は約８４％、又は約８５％、又は約８６％、又は約８７％、又は約８８％、又は約８９％、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、配列番号１は、この配列の最初の残基の前にＭｅｔ及び／又はＴｈｒを有してよい。様々な実施形態において、Ｍｅｔは切断されてよい。本明細書に記載するように、ベータラクタマーゼの誘導体を作製するために、最初の残基の前にＭｅｔ及び／又はＴｈｒを含む配列に変異を行ってよい。
配列番号３として、３１個のアミノ酸シグナル配列及びＮ末端のＱＡＳＫＴ（Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｌｙｓ−Ｔｈｒ）ペンタペプチドの除去前のＰ１Ａ酵素の２９９個のアミノ酸配列も本明細書に提供される：
配列番号３
MIQKRKRTVSFRLVLMCTLLFVSLPITKTSAQASKTEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAASYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDDKLIAEATKVVMKALNMNGK
いくつかの実施形態において、本発明の方法によって生産されるベータラクタマーゼポリペプチドは、配列番号３と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、又は約６１％、又は約６２％、又は約６３％、又は約６４、又は約６５％、又は約６６％、又は約６７％、又は約６８％、又は約６９％、又は約７０％、又は約７１％、又は約７２％、又は約７３％、又は約７４％、又は約７５％、又は約７６％、又は約７７％、又は約７８％、又は約７９％、又は約８０％、又は約８１％、又は約８２％、又は約８３％、又は約８４％、又は約８５％、又は約８６％、又は約８７％、又は約８８％、又は約８９％、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
さらに、ベータラクタマーゼポリペプチドは、配列番号１の最初の残基から上流側に追加の残基を含んでよい（例えば、ＪＢＣ ２５８（１８）：１１２１１，１９８３を参照されたく、この内容は、ｐｅｎＰ及びｐｅｎＰ１のエキソラージバージョン及びエキソスモールバージョンを含め、参照により本明細書に組み込まれる）。さらに、ベータラクタマーゼポリペプチドは、配列番号１の最後の残基から下流側にも追加の残基を含んでよい。
Ｐ１Ａのポリヌクレオチド配列（３１個のアミノ酸シグナル配列及びＮ末端のＱＡＫＳＴペンタペプチドの除去後）が配列番号２として提供される。本明細書に記載するように、ベータラクタマーゼ誘導体を作製するために、この配列に変異を行ってよい（遺伝コードの縮重を考慮することを含む）。
配列番号２
gagatgaaagatgattttgcaaaacttgaggaacaatttgatgcaaaactcgggatctttgcattggatacaggtacaaaccggacggtagcgtatcggccggatgagcgttttgcttttgcttcgacgattaaggctttaactgtaggcgtgcttttgcaacagaaatcaatagaagatctgaaccagagaataacatatacacgtgatgatcttgtaaactacaacccgattacggaaaagcacgttgatacgggaatgacgctcaaagagcttgcggatgcttcgcttcgatatagtgacaatgcggcacagaatctcattcttaaacaaattggcggacctgaaagtttgaaaaaggaactgaggaagattggtgatgaggttacaaatcccgaacgattcgaaccagagttaaatgaagtgaatccgggtgaaactcaggataccagtacagcaagagcacttgtcacaagccttcgagcctttgctcttgaagataaacttccaagtgaaaaacgcgagcttttaatcgattggatgaaacgaaataccactggagacgccttaatccgtgccggtgtgccggacggttgggaagtggctgataaaactggagcggcatcatatggaacccggaatgacattgccatcatttggccgccaaaaggagatcctgtcgttcttgcagtattatccagcagggataaaaaggacgccaagtatgatgataaacttattgcagaggcaacaaaggtggtaatgaaagccttaaacatgaacggcaaataa
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号２と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、又は約６１％、又は約６２％、又は約６３％、又は約６４％、又は約６５％、又は約６６、又は約６７％、又は約６８％、又は約６９％、又は約７０％、又は約７１％、又は約７２％、又は約７３％、又は約７４％、又は約７５％、又は約７６％、又は約７７％、又は約７８％、又は約７９％、又は約８０％、又は約８１％、又は約８２％、又は約８３％、又は約８４％、又は約８５％、又は約８６％、又は約８７％、又は約８８％、又は約８９％、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％）の配列同一性を有する。
３１個のアミノ酸シグナル配列及びＮ末端のＱＡＳＫＴペンタペプチドの除去前のＰ１Ａのポリヌクレオチド配列も配列番号４として提供される。本明細書に記載するように、ベータラクタマーゼ誘導体を作製するために、この配列に変異を行ってよい（遺伝コードの縮重を考慮することを含む）。
配列番号４
atgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgttatttgtcagtttgccgattacaaaaacatcagcgcaagcttccaagacggagatgaaagatgattttgcaaaacttgaggaacaatttgatgcaaaactcgggatctttgcattggatacaggtacaaaccggacggtagcgtatcggccggatgagcgttttgcttttgcttcgacgattaaggctttaactgtaggcgtgcttttgcaacagaaatcaatagaagatctgaaccagagaataacatatacacgtgatgatcttgtaaactacaacccgattacggaaaagcacgttgatacgggaatgacgctcaaagagcttgcggatgcttcgcttcgatatagtgacaatgcggcacagaatctcattcttaaacaaattggcggacctgaaagtttgaaaaaggaactgaggaagattggtgatgaggttacaaatcccgaacgattcgaaccagagttaaatgaagtgaatccgggtgaaactcaggataccagtacagcaagagcacttgtcacaagccttcgagcctttgctcttgaagataaacttccaagtgaaaaacgcgagcttttaatcgattggatgaaacgaaataccactggagacgccttaatccgtgccggtgtgccggacggttgggaagtggctgataaaactggagcggcatcatatggaacccggaatgacattgccatcatttggccgccaaaaggagatcctgtcgttcttgcagtattatccagcagggataaaaaggacgccaagtatgatgataaacttattgcagaggcaacaaaggtggtaatgaaagccttaaacatgaacggcaaataa
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号４と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、又は約６１％、又は約６２％、又は約６３％、又は約６４％、又は約６５％、又は約６６、又は約６７％、又は約６８％、又は約６９％、又は約７０％、又は約７１％、又は約７２％、又は約７３％、又は約７４％、又は約７５％、又は約７６％、又は約７７％、又は約７８％、又は約７９％、又は約８０％、又は約８１％、又は約８２％、又は約８３％、又は約８４％、又は約８５％、又は約８６％、又は約８７％、又は約８８％、又は約８９％、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％）の配列同一性を有する。
いくつかの実施形態において、ベータラクタマーゼ（例えば、クラスＡのベータラクタマーゼ）の変異誘発は、有利な酵素（例えば、広範囲の抗生物質を標的にできるもの）を誘導するために実行される。いくつかの実施形態において、ベータラクタマーゼ誘導体は、部位特異的変異誘発、ランダム変異誘発、及び／又は指向進化の手法によって得られる。いくつかの実施形態において、変異の設計は、とりわけ、以下のものの構造データ（例えば、結晶構造データ、ホモログモデルなど）に基づく：Ｐ１Ａ結晶構造（Ｋｎｏｘ ａｎｄ Ｍｏｅｗｓ，Ｊ．Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．，２２０，４３５−４５５（１９９１））、ＣＴＸ−Ｍ−４４（１ＢＺＡ（Ｉｂｕｋａら、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２８５巻，５号 ２０７９−２０８７（１９９９）、１ＩＹＳ（Ｉｂｕｋａら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２００３，４２（３６）：１０６３４−４３）、１ＩＹＯ、１ＩＹＰ及び１ＩＹＱ（Ｓｈｉｍａｍｕｒａら、２００２ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７７：４６６０１−０８）、Ｐｒｏｔｅｕｓ ｖｕｌｇａｒｉｓ Ｋ１（１ＨＺＯ，Ｎｕｇａｋａら、Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ．２００２ Ｍａｒ １５；３１７（１）：１０９−１７）及びＰｒｏｔｅｕｓ ｐｅｎｎｅｒｉ ＨｕｇＡ（Ｌｉａｓｓｉｎｅら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．２００２ Ｊａｎ；４６（１）：２１６−９．２００２）、並びにＢｏｎｎｅｔ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ ４８（１）：１−１４（２００４）（ＣＴＭ−Ｘについて）の中で概説されており、これらの文献の全ての内容は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）。いくつかの実施形態において、本変異は、以下のベータラクタマーゼのいずれか１つの構造データ（例えば、結晶構造データ、ホモログモデルなど）の分析によって通知される：Ｐ１Ａ（例えば、米国特許第５,６０７,６７１号を参照されたく、この内容は参照により本明細書に組み込まれる）、Ｐ２Ａ（例えば、ＷＯ２００７／１４７９４５を参照されたく、この内容は参照により本明細書に組み込まれる）、Ｐ３Ａ（例えば、ＷＯ２０１１／１４８０４１を参照されたく、この内容は参照により本明細書に組み込まれる）、ＣＴＸ−Ｍ−３、ＣＴＸ−Ｍ−４、ＣＴＸ−Ｍ−５、ＣＴＸ−Ｍ−９、ＣＴＸ−Ｍ−１０、ＣＴＸ−Ｍ−１４、ＣＴＸ−Ｍ−１５、ＣＴＸ−Ｍ−１６、ＣＴＸ−Ｍ−１８、ＣＴＸ−Ｍ−１９、ＣＴＸ−Ｍ−２５、ＣＴＸ−Ｍ−２６、ＣＴＸ−Ｍ−２７、ＣＴＸ−Ｍ−３２、ＣＴＸ−Ｍ−４４、ＣＴＸ−Ｍ−４５、及びＣＴＸ−Ｍ−５４。このような情報は、公知のデータベース、例えば、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔタンパク質配列データバンク、ＮＣＢＩ、及びＰＤＢで当業者に利用可能である。
いくつかの実施形態において、本発明の方法によって生産されるベータラクタマーゼポリペプチドは、配列番号１もしくは配列番号３又は配列番号１もしくは配列番号３と少なくとも３０、３５、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９.５、９９.８、９９.９％の同一性（又は配列番号１もしくは配列番号３と約６０％、約６５％、約７０％、又は約７５％、又は約８０％、又は約８５％、又は約９０、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％の同一性）を有する配列と比較して、１以上（例えば、約１、又は約２、又は約３、又は約４、又は約５、又は約６、又は約７、又は約８、又は約９、又は約１０、又は約１５、又は約２０、又は約３０、又は約４０、又は約５０、又は約６０、又は約７０、又は約８０、又は約９０、又は約１００、又は約１１０、又は約１２０、又は約１３０、又は約１４０、又は約１５０）の変異を含む。様々な実施形態において、配列番号１又は配列番号３の１以上のアミノ酸は、親水性アミノ酸（例えば、アルギニン（Ｒ）又はリジン（Ｋ）などの極性で正に荷電した親水性アミノ酸；アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、及びシステイン（Ｃ）などの極性で電荷が中性の親水性アミノ酸、アスパラギン酸（Ｄ）もしくはグルタミン酸（Ｅ）などの極性で負に荷電した親水性アミノ酸、又はヒスチジン（Ｈ）などの芳香族の、極性で正に荷電した親水性アミノ酸）又は疎水性アミノ酸（例えば、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、又はバリン（Ｖ）などの疎水性脂肪族アミノ酸、フェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、又はチロシン（Ｙ）などの疎水性芳香族アミノ酸）などの天然に存在するアミノ酸又は非古典的アミノ酸（例えば、セレノシステイン、ピロリジン、Ｎ−ホルミルメチオニンβ−アラニン、ＧＡＢＡ及びδ−アミノレブリン酸、４−アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、一般的なアミノ酸のＤ−異性体、２,４−ジアミノ酪酸、α−アミノイソ酪酸、４−アミノ酪酸、Ａｂｕ、２−アミノ酪酸、γ−Ａｂｕ、ε−Ａｈｘ、６−アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２−アミノイソ酪酸、３−アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコスメ（ｓａｒｃｏｓｍｅ）、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、t−ブチルグリシン、t−ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β−アラニン、フルオロアミノ酸、βメチルアミノ酸などのデザイナーアミノ酸、Ｃα−メチルアミノ酸、Ｎα−メチルアミノ酸、及び一般的なアミノ酸類似体）で置換されている。
例示的な実施形態において、本発明の変異には、配列番号１もしくは配列番号３又は配列番号１もしくは配列番号３と少なくとも３０、３５、４０、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、９９.５、９９.８、９９.９％の同一性（又は配列番号１もしくは配列番号３と約７０％、又は約７５％、又は約８０％、又は約８５％、又は約９０、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％の同一性）を有する配列に、以下の変異のうちの１以上（例えば、約１、又は約２、又は約３、又は約４、又は約５、又は約６、又は約７、又は約８、又は約９、又は約１０、又は約１５、又は約２０、又は約３０、又は約４０、又は約５０、又は約６０、又は約７０、又は約８０、又は約９０、又は約１００、又は約１１０、又は約１２０、又は約１３０、又は約１４０、又は約１５０）が含まれるが、これらに限定されない：Glu1Ala; Glu1Cys; Glu1Asp; Glu1Phe; Glu1Gly; Glu1His; Glu1Ile; Met1Lys; Glu1Leu; Glu1Met; Glu1Asn; Glu1Pro; Glu1Gln; Glu1Arg; Glu1Ser; Glu1Thr; Glu1Val; Glu1Trp; Glu1Tyr; Met2Ala; Met2Cys; Met2Asp; Met2Glu; Met2Phe; Met2Gly; Met2His; Met2Ile; Met1Lys; Met2Leu; Met2Asn; Met2Pro; Met2Gln; Met2Arg; Met2Ser; Met2Thr; Met2Val; Met2Trp; Met2Tyr; Lys3Ala; Lys3Cys; Lys3Asp; Lys3Glu; Lys3Phe; Lys3Gly; Lys3His; Lys3Ile; Lys3Leu; Lys3Met; Lys3Asn; Lys3Pro; Lys3Gln; Lys3Arg; Lys3Ser; Lys3Thr; Lys3Val; Lys3Trp; Lys3Tyr; Asp4Ala; Asp4Cys; Asp4Glu; Asp4Phe; Asp4Gly; Asp4His; Asp4Ile; Asp4Lys; Asp4Leu; Asp4Met; Asp4Asn; Asp4Pro; Asp4Gln; Asp4Arg; Asp4Ser; Asp4Thr; Asp4Val; Asp4Trp; Asp4Tyr; Asp5Ala; Asp5Cys; Asp5Glu; Asp5Phe; Asp5Gly; Asp5His; Asp5Ile; Asp5Lys; Asp5Leu; Asp5Met; Asp5Asn; Asp5Pro; Asp5Gln; Asp5Arg; Asp5Ser; Asp5Thr; Asp5Val; Asp5Trp; Asp5Tyr; Phe6Ala; Phe6Cys; Phe6Asp; Phe6Glu; Phe6Gly; Phe6His; Phe6Ile; Phe6Lys; Phe6Leu; Phe6Met; Phe6Asn; Phe6Pro; Phe6Gln; Phe6Arg; Phe6Ser; Phe6Thr; Phe6Val; Phe6Trp; Phe6Tyr; Ala7Cys; Ala7Asp; Ala7Glu; Ala7Phe; Ala7Gly; Ala7His; Ala7Ile; Ala7Lys; Ala7Leu; Ala7Met; Ala7Asn; Ala7Pro; Ala7Gln; Ala7Arg; Ala7Ser; Ala7Thr; Ala7Val; Ala7Trp; Ala7Tyr; Lys8Ala; Lys8Cys; Lys8Asp; Lys8Glu; Lys8Phe; Lys8Gly; Lys8His; Lys8Ile; Lys8Leu; Lys8Met; Lys8Asn; Lys8Pro; Lys8Gln; Lys8Arg; Lys8Ser; Lys8Thr; Lys8Val; Lys8Trp; Lys8Tyr; Leu9Ala; Leu9Cys; Leu9Asp; Leu9Glu; Leu9Phe; Leu9Gly; Leu9His; Leu9Ile; Leu9Lys; Leu9Met; Leu9Asn; Leu9Pro; Leu9Gln; Leu9Arg; Leu9Ser; Leu9Thr; Leu9Val; Leu9Trp; Leu9Tyr; Glu10Ala; Glu10Cys; Glu10Asp; Glu10Phe; Glu10Gly; Glu10His; Glu10Ile; Glu10Lys; Glu10Leu; Glu10Met; Glu10Asn; Glu10Pro; Glu10Gln; Glu10Arg; Glu10Ser; Glu10Thr; Glu10Val; Glu10Trp; Glu10Tyr; Glu11Ala; Glu11Cys; Glu11Asp; Glu11Phe; Glu11Gly; Glu11His; Glu11Ile; Glu11Lys; Glu11Leu; Glu11Met; Glu11Asn; Glu11Pro; Glu11Gln; Glu11Arg; Glu11Ser; Glu11Thr; Glu11Val; Glu11Trp; Glu11Tyr; Gln12Ala; Gln12Cys; Gln12Asp; Gln12Glu; Gln12Phe; Gln12Gly; Gln12His; Gln12Ile; Gln12Lys; Gln12Leu; Gln12Met; Gln12Asn; Gln12Pro; Gln12Arg; Gln12Ser; Gln12Thr; Gln12Val; Gln12Trp; Gln12Tyr; Phe13Ala; Phe13Cys; Phe13Asp; Phe13Glu; Phe13Gly; Phe13His; Phe13Ile; Phe13Lys; Phe13Leu; Phe13Met; Phe13Asn; Phe13Pro; Phe13Gln; Phe13Arg; Phe13Ser; Phe13Thr; Phe13Val; Phe13Trp; Phe13Tyr; Asp14Ala; Asp14Cys; Asp14Glu; Asp14Phe; Asp14Gly; Asp14His; Asp14Ile; Asp14Lys; Asp14Leu; Asp14Met; Asp14Asn; Asp14Pro; Asp14Gln; Asp14Arg; Asp14Ser; Asp14Thr; Asp14Val; Asp14Trp; Asp14Tyr; Ala15Cys; Ala15Asp; Ala15Glu; Ala15Phe; Ala15Gly; Ala15His; Ala15Ile; Ala15Lys; Ala15Leu; Ala15Met; Ala15Asn; Ala15Pro; Ala15Gln; Ala15Arg; Ala15Ser; Ala15Thr; Ala15Val; Ala15Trp; Ala15Tyr; Lys16Ala; Lys16Cys; Lys16Asp; Lys16Glu; Lys16Phe; Lys16Gly; Lys16His; Lys16Ile; Lys16Leu; Lys16Met; Lys16Asn; Lys16Pro; Lys16Gln; Lys16Arg; Lys16Ser; Lys16Thr; Lys16Val; Lys16Trp; Lys16Tyr; Leu17Ala; Leu17Cys; Leu17Asp; Leu17Glu; Leu17Phe; Leu17Gly; Leu17His; Leu17Ile; Leu17Lys; Leu17Met; Leu17Asn; Leu17Pro; Leu17Gln; Leu17Arg; Leu17Ser; Leu17Thr; Leu17Val; Leu17Trp; Leu17Tyr; Gly18Ala; Gly18Cys; Gly18Asp; Gly18Glu; Gly18Phe; Gly18His; Gly18Ile; Gly18Lys; Gly18Leu; Gly18Met; Gly18Asn; Gly18Pro; Gly18Gln; Gly18Arg; Gly18Ser; Gly18Thr; Gly18Val; Gly18Trp; Gly18Tyr; Ile19Ala; Ile19Cys; Ile19Asp; Ile19Glu; Ile19Phe; Ile19Gly; Ile19His; Ile19Lys; Ile19Leu; Ile19Met; Ile19Asn; Ile19Pro; Ile19Gln; Ile19Arg; Ile19Ser; Ile19Thr; Ile19Val; Ile19Trp; Ile19Tyr; Phe20Ala; Phe20Cys; Phe20Asp; Phe20Glu; Phe20Gly; Phe20His; Phe20Ile; Phe20Lys; Phe20Leu; Phe20Met; Phe20Asn; Phe20Pro; Phe20Gln; Phe20Arg; Phe20Ser; Phe20Thr; Phe20Val; Phe20Trp; Phe20Tyr; Ala21Cys; Ala21Asp; Ala21Glu; Ala21Phe; Ala21Gly; Ala21His; Ala21Ile; Ala21Lys; Ala21Leu; Ala21Met; Ala21Asn; Ala21Pro; Ala21Gln; Ala21Arg; Ala21Ser; Ala21Thr; Ala21Val; Ala21Trp; Ala21Tyr; Leu22Ala; Leu22Cys; Leu22Asp; Leu22Glu; Leu22Phe; Leu22Gly; Leu22His; Leu22Ile; Leu22Lys; Leu22Met; Leu22Asn; Leu22Pro; Leu22Gln; Leu22Arg; Leu22Ser; Leu22Thr; Leu22Val; Leu22Trp; Leu22Tyr; Asp23Ala; Asp23Cys; Asp23Glu; Asp23Phe; Asp23Gly; Asp23His; Asp23Ile; Asp23Lys; Asp23Leu; Asp23Met; Asp23Asn; Asp23Pro; Asp23Gln; Asp23Arg; Asp23Ser; Asp23Thr; Asp23Val; Asp23Trp; Asp23Tyr; Thr24Ala; Thr24Cys; Thr24Asp; Thr24Glu; Thr24Phe; Thr24Gly; Thr24His; Thr24Ile; Thr24Lys; Thr24Leu; Thr24Met; Thr24Asn; Thr24Pro; Thr24Gln; Thr24Arg; Thr24Ser; Thr24Val; Thr24Trp; Thr24Tyr; Gly25Ala; Gly25Cys; Gly25Asp; Gly25Glu; Gly25Phe; Gly25His; Gly25Ile; Gly25Lys; Gly25Leu; Gly25Met; Gly25Asn; Gly25Pro; Gly25Gln; Gly25Arg; Gly25Ser; Gly25Thr; Gly25Val; Gly25Trp; Gly25Tyr; Thr26Ala; Thr26Cys; Thr26Asp; Thr26Glu; Thr26Phe; Thr26Gly; Thr26His; Thr26Ile; Thr26Lys; Thr26Leu; Thr26Met; Thr26Asn; Thr26Pro; Thr26Gln; Thr26Arg; Thr26Ser; Thr26Val; Thr26Trp; Thr26Tyr; Asn27Ala; Asn27Cys; Asn27Asp; Asn27Glu; Asn27Phe; Asn27Gly; Asn27His; Asn27Ile; Asn27Lys; Asn27Leu; Asn27Met; Asn27Pro; Asn27Gln; Asn27Arg; Asn27Ser; Asn27Thr; Asn27Val; Asn27Trp; Asn27Tyr; Arg28Ala; Arg28Cys; Arg28Asp; Arg28Glu; Arg28Phe; Arg28Gly; Arg28His; Arg28Ile; Arg28Lys; Arg28Leu; Arg28Met; Arg28Asn; Arg28Pro; Arg28Gln; Arg28Ser; Arg28Thr; Arg28Val; Arg28Trp; Arg28Tyr; Thr29Ala; Thr29Cys; Thr29Asp; Thr29Glu; Thr29Phe; Thr29Gly; Thr29His; Thr29Ile; Thr29Lys; Thr29Leu; Thr29Met; Thr29Asn; Thr29Pro; Thr29Gln; Thr29Arg; Thr29Ser; Thr29Val; Thr29Trp; Thr29Tyr; Val30Ala; Val30Cys; Val30Asp; Val30Glu; Val30Phe; Val30Gly; Val30His; Val30Ile; Val30Lys; Val30Leu; Val30Met; Val30Asn; Val30Pro; Val30Gln; Val30Arg; Val30Ser; Val30Thr; Val30Trp; Val30Tyr; Ala31Ala; Ala31Cys; Ala31Asp; Ala31Glu; Ala31Phe; Ala31Gly; Ala31His; Ala31Ile; Ala31Lys; Ala31Leu; Ala31Met; Ala31Asn; Ala31Pro; Ala31Gln; Ala31Arg; Ala31Ser; Ala31Thr; Ala31Val; Ala31Trp; Ala31Tyr; Tyr32Ala; Tyr32Cys; Tyr32Asp; Tyr32Glu; Tyr32Phe; Tyr32Gly; Tyr32His; Tyr32Ile; Tyr32Lys; Tyr32Leu; Tyr32Met; Tyr32Asn; Tyr32Pro; Tyr32Gln; Tyr32Arg; Tyr32Ser; Tyr32Thr; Tyr32Val; Tyr32Trp; Arg33Ala; Arg33Cys; Arg33Asp; Arg33Glu; Arg33Phe; Arg33Gly; Arg33His; Arg33Ile; Arg33Lys; Arg33Leu; Arg33Met; Arg33Asn; Arg33Pro; Arg33Gln; Arg33Ser; Arg33Thr; Arg33Val; Arg33Trp; Arg33Tyr; Pro34Ala; Pro34Cys; Pro34Asp; Pro34Glu; Pro34Phe; Pro34Gly; Pro34His; Pro34Ile; Pro34Lys; Pro34Leu; Pro34Met; Pro34Asn; Pro34Gln; Pro34Arg; Pro34Ser; Pro34Thr; Pro34Val; Pro34Trp; Pro34Tyr; Asp35Ala; Asp35Cys; Asp35Glu; Asp35Phe; Asp35Gly; Asp35His; Asp35Ile; Asp35Lys; Asp35Leu; Asp35Met; Asp35Asn; Asp35Pro; Asp35Gln; Asp35Arg; Asp35Ser; Asp35Thr; Asp35Val; Asp35Trp; Asp35Tyr; Glu36Ala; Glu36Cys; Glu36Asp; Glu36Phe; Glu36Gly; Glu36His; Glu36Ile; Glu36Lys; Glu36Leu; Glu36Met; Glu36Asn; Glu36Pro; Glu36Gln; Glu36Arg; Glu36Ser; Glu36Thr; Glu36Val; Glu36Trp; Glu36Tyr; Arg37Ala; Arg37Cys; Arg37Asp; Arg37Glu; Arg37Phe; Arg37Gly; Arg37His; Arg37Ile; Arg37Lys; Arg37Leu; Arg37Met; Arg37Asn; Arg37Pro; Arg37Gln; Arg37Ser; Arg37Thr; Arg37Val; Arg37Trp; Arg37Tyr; Phe38Ala; Phe38Cys; Phe38Asp; Phe38Glu; Phe38Gly; Phe38His; Phe38Ile; Phe38Lys; Phe38Leu; Phe38Met; Phe38Asn; Phe38Pro; Phe38Gln; Phe38Arg; Phe38Ser; Phe38Thr; Phe38Val; Phe38Trp; Phe38Tyr; Ala39Cys; Ala39Asp; Ala39Glu; Ala39Phe; Ala39Gly; Ala39His; Ala39Ile; Ala39Lys; Ala39Leu; Ala39Met; Ala39Asn; Ala39Pro; Ala39Gln; Ala39Arg; Ala39Ser; Ala39Thr; Ala39Val; Ala39Trp; Ala39Tyr; Phe40Ala; Phe40Cys; Phe40Asp; Phe40Glu; Phe40Gly; Phe40His; Phe40Ile; Phe40Lys; Phe40Leu; Phe40Met; Phe40Asn; Phe40Pro; Phe40Gln; Phe40Arg; Phe40Ser; Phe40Thr; Phe40Val; Phe40Trp; Phe40Tyr; Ala41Cys; Ala41Asp; Ala41Glu; Ala41Phe; Ala41Gly; Ala41His; Ala41Ile; Ala41Lys; Ala41Leu; Ala41Met; Ala41Asn; Ala41Pro; Ala41Gln; Ala41Arg; Ala41Ser; Ala41Thr; Ala41Val; Ala41Trp; Ala41Tyr; Ser42Ala; Ser42Cys; Ser42Asp; Ser42Glu; Ser42Phe; Ser42Gly; Ser42His; Ser42Ile; Ser42Lys; Ser42Leu; Ser42Met; Ser42Asn; Ser42Pro; Ser42Gln; Ser42Arg; Ser42Thr; Ser42Val; Ser42Trp; Ser42Tyr; Thr43Ala; Thr43Cys; Thr43Asp; Thr43Glu; Thr43Phe; Thr43Gly; Thr43His; Thr43Ile; Thr43Lys; Thr43Leu; Thr43Met; Thr43Asn; Thr43Pro; Thr43Gln; Thr43Arg; Thr43Ser; Thr43Val; Thr43Trp; Thr43Tyr; Ile44Ala; Ile44Cys; Ile44Asp; Ile44Glu; Ile44Phe; Ile44Gly; Ile44His; Ile44Lys; Ile44Leu; Ile44Met; Ile44Asn; Ile44Pro; Ile44Gln; Ile44Arg; Ile44Ser; Ile44Thr; Ile44Val; Ile44Trp; Ile44Tyr; Lys45Ala; Lys45Cys; Lys45Asp; Lys45Glu; Lys45Phe; Lys45Gly; Lys45His; Lys45Ile; Lys45Leu; Lys45Met; Lys45Asn; Lys45Pro; Lys45Gln; Lys45Arg; Lys45Ser; Lys45Thr; Lys45Val; Lys45Trp; Lys45Tyr; Ala46Cys; Ala46Asp; Ala46Glu; Ala46Phe; Ala46Gly; Ala46His; Ala46Ile; Ala46Lys; Ala46Leu; Ala46Met; Ala46Asn; Ala46Pro; Ala46Gln; Ala46Arg; Ala46Ser; Ala46Thr; Ala46Val; Ala46Trp; Ala46Tyr; Leu47Ala; Leu47Cys; Leu47Asp; Leu47Glu; Leu47Phe; Leu47Gly; Leu47His; Leu47Ile; Leu47Lys; Leu47Met; Leu47Asn; Leu47Pro; Leu47Gln; Leu47Arg; Leu47Ser; Leu47Thr; Leu47Val; Leu47Trp; Leu47Tyr; Thr48Ala; Thr48Cys; Thr48Asp; Thr48Glu; Thr48Phe; Thr48Gly; Thr48His; Thr48Ile; Thr48Lys; Thr48Leu; Thr48Met; Thr48Asn; Thr48Pro; Thr48Gln; Thr48Arg; Thr48Ser; Thr48Val; Thr48Trp; Thr48Tyr; Val49Ala; Val49Cys; Val49Asp; Val49Glu; Val49Phe; Val49Gly; Val49His; Val49Ile; Val49Lys; Val49Leu; Val49Met; Val49Asn; Val49Pro; Val49Gln; Val49Arg; Val49Ser; Val49Thr; Val49Trp; Val49Tyr; Gly50Ala; Gly50Cys; Gly50Asp; Gly50Glu; Gly50Phe; Gly50His; Gly50Il
e; Gly50Lys; Gly50Leu; Gly50Met; Gly50Asn; Gly50Pro; Gly50Gln; Gly50Arg; Gly50Ser; Gly50Thr; Gly50Val; Gly50Trp; Gly50Tyr; Val51Ala; Val51Cys; Val51Asp; Val51Glu; Val51Phe; Val51Gly; Val51His; Val51Ile; Val51Lys; Val51Leu; Val51Met; Val51Asn; Val51Pro; Val51Gln; Val51Arg; Val51Ser; Val51Thr; Val51Trp; Val51Tyr; Leu52Ala; Leu52Cys; Leu52Asp; Leu52Glu; Leu52Phe; Leu52Gly; Leu52His; Leu52Ile; Leu52Lys; Leu52Met; Leu52Asn; Leu52Pro; Leu52Gln; Leu52Arg; Leu52Ser; Leu52Thr; Leu52Val; Leu52Trp; Leu52Tyr; Leu53Ala; Leu53Cys; Leu53Asp; Leu53Glu; Leu53Phe; Leu53Gly; Leu53His; Leu53Ile; Leu53Lys; Leu53Met; Leu53Asn; Leu53Pro; Leu53Gln; Leu53Arg; Leu53Ser; Leu53Thr; Leu53Val; Leu53Trp; Leu53Tyr; Gln54Ala; Gln54Cys; Gln54Asp; Gln54Glu; Gln54Phe; Gln54Gly; Gln54His; Gln54Ile; Gln54Lys; Gln54Leu; Gln54Met; Gln54Asn; Gln54Pro; Gln54Arg; Gln54Ser; Gln54Thr; Gln54Val; Gln54Trp; Gln54Tyr; Gln55Ala; Gln55Cys; Gln55Asp; Gln55Glu; Gln55Phe; Gln55Gly; Gln55His; Gln55Ile; Gln55Lys; Gln55Leu; Gln55Met; Gln55Asn; Gln55Pro; Gln55Arg; Gln55Ser; Gln55Thr; Gln55Val; Gln55Trp; Gln55Tyr; Lys56Ala; Lys56Cys; Lys56Asp; Lys56Glu; Lys56Phe; Lys56Gly; Lys56His; Lys56Ile; Lys56Leu; Lys56Met; Lys56Asn; Lys56Pro; Lys56Gln; Lys56Arg; Lys56Ser; Lys56Thr; Lys56Val; Lys56Trp; Lys56Tyr; Ser57Ala; Ser57Cys; Ser57Asp; Ser57Glu; Ser57Phe; Ser57Gly; Ser57His; Ser57Ile; Ser57Lys; Ser57Leu; Ser57Met; Ser57Asn; Ser57Pro; Ser57Gln; Ser57Arg; Ser57Thr; Ser57Val; Ser57Trp; Ser57Tyr; Ile58Ala; Ile58Cys; Ile58Asp; Ile58Glu; Ile58Phe; Ile58Gly; Ile58His; Ile58Lys; Ile58Leu; Ile58Met; Ile58Asn; Ile58Pro; Ile58Gln; Ile58Arg; Ile58Ser; Ile58Thr; Ile58Val; Ile58Trp; Ile58Tyr; Glu59Ala; Glu59Cys; Glu59Asp; Glu59Phe; Glu59Gly; Glu59His; Glu59Ile; Glu59Lys; Glu59Leu; Glu59Met; Glu59Asn; Glu59Pro; Glu59Gln; Glu59Arg; Glu59Ser; Glu59Thr; Glu59Val; Glu59Trp; Glu59Tyr; Asp60Ala; Asp60Cys; Asp60Glu; Asp60Phe; Asp60Gly; Asp60His; Asp60Ile; Asp60Lys; Asp60Leu; Asp60Met; Asp60Asn; Asp60Pro; Asp60Gln; Asp60Arg; Asp60Ser; Asp60Thr; Asp60Val; Asp60Trp; Asp60Tyr; Leu61Ala; Leu61Cys; Leu61Asp; Leu61Glu; Leu61Phe; Leu61Gly; Leu61His; Leu61Ile; Leu61Lys; Leu61Met; Leu61Asn; Leu61Pro; Leu61Gln; Leu61Arg; Leu61Ser; Leu61Thr; Leu61Val; Leu61Trp; Leu61Tyr; Asn62Ala; Asn62Cys; Asn62Asp; Asn62Glu; Asn62Phe; Asn62Gly; Asn62His; Asn62Ile; Asn62Lys; Asn62Leu; Asn62Met; Asn62Pro; Asn62Gln; Asn62Arg; Asn62Ser; Asn62Thr; Asn62Val; Asn62Trp; Asn62Tyr; Gln63Ala; Gln63Cys; Gln63Asp; Gln63Glu; Gln63Phe; Gln63Gly; Gln63His; Gln63Ile; Gln63Lys; Gln63Leu; Gln63Met; Gln63Asn; Gln63Pro; Gln63Arg; Gln63Ser; Gln63Thr; Gln63Val; Gln63Trp; Gln63Tyr; Arg64Ala; Arg64Cys; Arg64Asp; Arg64Glu; Arg64Phe; Arg64Gly; Arg64His; Arg64Ile; Arg64Lys; Arg64Leu; Arg64Met; Arg64Asn; Arg64Pro; Arg64Gln; Arg64Ser; Arg64Thr; Arg64Val; Arg64Trp; Arg64Tyr; Ile65Ala; Ile65Cys; Ile65Asp; Ile65Glu; Ile65Phe; Ile65Gly; Ile65His; Ile65Lys; Ile65Leu; Ile65Met; Ile65Asn; Ile65Pro; Ile65Gln; Ile65Arg; Ile65Ser; Ile65Thr; Ile65Val; Ile65Trp; Ile65Tyr; Thr66Ala; Thr66Cys; Thr66Asp; Thr66Glu; Thr66Phe; Thr66Gly; Thr66His; Thr66Ile; Thr66Lys; Thr66Leu; Thr66Met; Thr66Asn; Thr66Pro; Thr66Gln; Thr66Arg; Thr66Ser; Thr66Val; Thr66Trp; Thr66Tyr; Tyr67Ala; Tyr67Cys; Tyr67Asp; Tyr67Glu; Tyr67Phe; Tyr67Gly; Tyr67His; Tyr67Ile; Tyr67Lys; Tyr67Leu; Tyr67Met; Tyr67Asn; Tyr67Pro; Tyr67Gln; Tyr67Arg; Tyr67Ser; Tyr67Thr; Tyr67Val; Tyr67Trp; Thr68Ala; Thr68Cys; Thr68Asp; Thr68Glu; Thr68Phe; Thr68Gly; Thr68His; Thr68Ile; Thr68Lys; Thr68Leu; Thr68Met; Thr68Asn; Thr68Pro; Thr68Gln; Thr68Arg; Thr68Ser; Thr68Val; Thr68Trp; Thr68Tyr; Arg69Ala; Arg69Cys; Arg69Asp; Arg69Glu; Arg69Phe; Arg69Gly; Arg69His; Arg69Ile; Arg69Lys; Arg69Leu; Arg69Met; Arg69Asn; Arg69Pro; Arg69Gln; Arg69Ser; Arg69Thr; Arg69Val; Arg69Trp; Arg69Tyr; Asp70Ala; Asp70Cys; Asp70Glu; Asp70Phe; Asp70Gly; Asp70His; Asp70Ile; Asp70Lys; Asp70Leu; Asp70Met; Asp70Asn; Asp70Pro; Asp70Gln; Asp70Arg; Asp70Ser; Asp70Thr; Asp70Val; Asp70Trp; Asp70Tyr; Asp71Ala; Asp71Cys; Asp71Glu; Asp71Phe; Asp71Gly; Asp71His; Asp71Ile; Asp71Lys; Asp71Leu; Asp71Met; Asp71Asn; Asp71Pro; Asp71Gln; Asp71Arg; Asp71Ser; Asp71Thr; Asp71Val; Asp71Trp; Asp71Tyr; Leu72Ala; Leu72Cys; Leu72Asp; Leu72Glu; Leu72Phe; Leu72Gly; Leu72His; Leu72Ile; Leu72Lys; Leu72Met; Leu72Asn; Leu72Pro; Leu72Gln; Leu72Arg; Leu72Ser; Leu72Thr; Leu72Val; Leu72Trp; Leu72Tyr; Val73Ala; Val73Cys; Val73Asp; Val73Glu; Val73Phe; Val73Gly; Val73His; Val73Ile; Val73Lys; Val73Leu; Val73Met; Val73Asn; Val73Pro; Val73Gln; Val73Arg; Val73Ser; Val73Thr; Val73Trp; Val73Tyr; Asn74Ala; Asn74Cys; Asn74Asp; Asn74Glu; Asn74Phe; Asn74Gly; Asn74His; Asn74Ile; Asn74Lys; Asn74Leu; Asn74Met; Asn74Pro; Asn74Gln; Asn74Arg; Asn74Ser; Asn74Thr; Asn74Val; Asn74Trp; Asn74Tyr; Tyr75Ala; Tyr75Cys; Tyr75Asp; Tyr75Glu; Tyr75Phe; Tyr75Gly; Tyr75His; Tyr75Ile; Tyr75Lys; Tyr75Leu; Tyr75Met; Tyr75Asn; Tyr75Pro; Tyr75Gln; Tyr75Arg; Tyr75Ser; Tyr75Thr; Tyr75Val; Tyr75Trp; Asn76Ala; Asn76Cys; Asn76Asp; Asn76Glu; Asn76Phe; Asn76Gly; Asn76His; Asn76Ile; Asn76Lys; Asn76Leu; Asn76Met; Asn76Pro; Asn76Gln; Asn76Arg; Asn76Ser; Asn76Thr; Asn76Val; Asn76Trp; Asn76Tyr; Pro77Ala; Pro77Cys; Pro77Asp; Pro77Glu; Pro77Phe; Pro77Gly; Pro77His; Pro77Ile; Pro77Lys; Pro77Leu; Pro77Met; Pro77Asn; Pro77Gln; Pro77Arg; Pro77Ser; Pro77Thr; Pro77Val; Pro77Trp; Pro77Tyr; Ile78Ala; Ile78Cys; Ile78Asp; Ile78Glu; Ile78Phe; Ile78Gly; Ile78His; Ile78Lys; Ile78Leu; Ile78Met; Ile78Asn; Ile78Pro; Ile78Gln; Ile78Arg; Ile78Ser; Ile78Thr; Ile78Val; Ile78Trp; Ile78Tyr; Thr79Ala; Thr79Cys; Thr79Asp; Thr79Glu; Thr79Phe; Thr79Gly; Thr79His; Thr79Ile; Thr79Lys; Thr79Leu; Thr79Met; Thr79Asn; Thr79Pro; Thr79Gln; Thr79Arg; Thr79Ser; Thr79Val; Thr79Trp; Thr79Tyr; Glu80Ala; Glu80Cys; Glu80Asp; Glu80Phe; Glu80Gly; Glu80His; Glu80Ile; Glu80Lys; Glu80Leu; Glu80Met; Glu80Asn; Glu80Pro; Glu80Gln; Glu80Arg; Glu80Ser; Glu80Thr; Glu80Val; Glu80Trp; Glu80Tyr; Lys81Ala; Lys81Cys; Lys81Asp; Lys81Glu; Lys81Phe; Lys81Gly; Lys81His; Lys81Ile; Lys81Leu; Lys81Met; Lys81Asn; Lys81Pro; Lys81Gln; Lys81Arg; Lys81Ser; Lys81Thr; Lys81Val; Lys81Trp; Lys81Tyr; His82Ala; His82Cys; His82Asp; His82Glu; His82Phe; His82Gly; His82Ile; His82Lys; His82Leu; His82Met; His82Asn; His82Pro; His82Gln; His82Arg; His82Ser; His82Thr; His82Val; His82Trp; His82Tyr; Val83Ala; Val83Cys; Val83Asp; Val83Glu; Val83Phe; Val83Gly; Val83His; Val83Ile; Val83Lys; Val83Leu; Val83Met; Val83Asn; Val83Pro; Val83Gln; Val83Arg; Val83Ser; Val83Thr; Val83Trp; Val83Tyr; Asp84Ala; Asp84Cys; Asp84Glu; Asp84Phe; Asp84Gly; Asp84His; Asp84Ile; Asp84Lys; Asp84Leu; Asp84Met; Asp84Asn; Asp84Pro; Asp84Gln; Asp84Arg; Asp84Ser; Asp84Thr; Asp84Val; Asp84Trp; Asp84Tyr; Thr85Ala; Thr85Cys; Thr85Asp; Thr85Glu; Thr85Phe; Thr85Gly; Thr85His; Thr85Ile; Thr85Lys; Thr85Leu; Thr85Met; Thr85Asn; Thr85Pro; Thr85Gln; Thr85Arg; Thr85Ser; Thr85Val; Thr85Trp; Thr85Tyr; Gly86Ala; Gly86Cys; Gly86Asp; Gly86Glu; Gly86Phe; Gly86His; Gly86Ile; Gly86Lys; Gly86Leu; Gly86Met; Gly86Asn; Gly86Pro; Gly86Gln; Gly86Arg; Gly86Ser; Gly86Thr; Gly86Val; Gly86Trp; Gly86Tyr; Met87Ala; Met87Cys; Met87Asp; Met87Glu; Met87Phe; Met87Gly; Met87His; Met87Ile; Met87Lys; Met87Leu; Met87Asn; Met87Pro; Met87Gln; Met87Arg; Met87Ser; Met87Thr; Met87Val; Met87Trp; Met87Tyr; Thr88Ala; Thr88Cys; Thr88Asp; Thr88Glu; Thr88Phe; Thr88Gly; Thr88His; Thr88Ile; Thr88Lys; Thr88Leu; Thr88Met; Thr88Asn; Thr88Pro; Thr88Gln; Thr88Arg; Thr88Ser; Thr88Val; Thr88Trp; Thr88Tyr; Leu89Ala; Leu89Cys; Leu89Asp; Leu89Glu; Leu89Phe; Leu89Gly; Leu89His; Leu89Ile; Leu89Lys; Leu89Met; Leu89Asn; Leu89Pro; Leu89Gln; Leu89Arg; Leu89Ser; Leu89Thr; Leu89Val; Leu89Trp; Leu89Tyr; Lys90Ala; Lys90Cys; Lys90Asp; Lys90Glu; Lys90Phe; Lys90Gly; Lys90His; Lys90Ile; Lys90Leu; Lys90Met; Lys90Asn; Lys90Pro; Lys90Gln; Lys90Arg; Lys90Ser; Lys90Thr; Lys90Val; Lys90Trp; Lys90Tyr; Glu91Ala; Glu91Cys; Glu91Asp; Glu91Phe; Glu91Gly; Glu91His; Glu91Ile; Glu91Lys; Glu91Leu; Glu91Met; Glu91Asn; Glu91Pro; Glu91Gln; Glu91Arg; Glu91Ser; Glu91Thr; Glu91Val; Glu91Trp; Glu91Tyr; Leu92Ala; Leu92Cys; Leu92Asp; Leu92Glu; Leu92Phe; Leu92Gly; Leu92His; Leu92Ile; Leu92Lys; Leu92Met; Leu92Asn; Leu92Pro; Leu92Gln; Leu92Arg; Leu92Ser; Leu92Thr; Leu92Val; Leu92Trp; Leu92Tyr; Ala93Cys; Ala93Asp; Ala93Glu; Ala93Phe; Ala93Gly; Ala93His; Ala93Ile; Ala93Lys; Ala93Leu; Ala93Met; Ala93Asn; Ala93Pro; Ala93Gln; Ala93Arg; Ala93Ser; Ala93Thr; Ala93Val; Ala93Trp; Ala93Tyr; Asp94Ala; Asp94Cys; Asp94Glu; Asp94Phe; Asp94Gly; Asp94His; Asp94Ile; Asp94Lys; Asp94Leu; Asp94Met; Asp94Asn; Asp94Pro; Asp94Gln; Asp94Arg; Asp94Ser; Asp94Thr; Asp94Val; Asp94Trp; Asp94Tyr; Ala95Cys; Ala95Asp; Ala95Glu; Ala95Phe; Ala95Gly; Ala95His; Ala95Ile; Ala95Lys; Ala95Leu; Ala95Met; Ala95Asn; Ala95Pro; Ala95Gln; Ala95Arg; Ala95Ser; Ala95Thr; Ala95Val; Ala95Trp; Ala95Tyr; Ser96Ala; Ser96Cys; Ser96Asp; Ser96Glu; Ser96Phe; Ser96Gly; Ser96His; Ser96Ile; Ser96Lys; Ser96Leu; Ser96Met; Ser96Asn; Ser96Pro; Ser96Gln; Ser96Arg; Ser96Thr; Ser96Val; Ser96Trp; Ser96Tyr; Leu97Ala; Leu97Cys; Leu97Asp; Leu97Glu; Leu97Phe; Leu97Gly; Leu97His; Leu97Ile; Leu97Lys; Leu97Met; Leu97Asn; Leu97Pro; Leu97Gln; Leu97Arg; Leu97Ser; Leu97Thr; Leu97Val; Leu97Trp; Leu97Tyr; Arg98Ala; Arg98Cys; Arg98Asp; Arg98Glu; Arg98Phe; Arg98Gly; Arg98His; Arg98Ile; Arg98Lys; Arg98Leu; Arg98Met; Arg98Asn; Arg98Pro; Arg98Gln; Arg98Ser; Arg98Thr; Arg98Val; Arg98Trp; Arg98Tyr; Tyr99Ala; Tyr99Cys; Tyr99Asp; Tyr99Glu; Tyr99Phe; Tyr99Gly; Tyr99His; Tyr99Ile; Tyr99Lys; Tyr99Leu; Tyr99Met; Tyr99Asn; Tyr99Pro; Tyr99Gln; Tyr99Arg; Tyr99Ser; Tyr99Thr; Tyr99Val; Tyr99Trp; Ser100Ala; Ser100Cys; Ser100Asp; Ser100Glu; Ser100Phe; Ser100Gly; Ser100His; Ser100Ile; Ser100Lys; Ser100Leu; Ser100Met; Ser100Asn; Ser100Pro; Ser100Gln; Ser100Arg; Ser100Thr; Ser100Val; Ser100Trp; Ser100Tyr; Asp101Ala; Asp101Cys; Asp101Glu; Asp101Phe; Asp101Gly; Asp101His; Asp101Ile; Asp101Lys; Asp101Leu; Asp101Met; Asp101Asn; Asp101Pro; Asp101Gln; Asp101Arg; Asp101Ser; Asp101Thr; Asp101Val; Asp101Trp; Asp101Tyr; Asn102Ala; Asn102Cys; Asn102Asp; Asn102Glu; Asn102Phe; Asn102Gly; Asn102His; Asn102Ile; Asn102Lys; Asn102Leu; Asn102Met; Asn102Pro; Asn102Gln; Asn102Arg; Asn102Ser; Asn102Thr; Asn102Val; Asn102Trp; Asn102Tyr; Ala103Cys; Ala103Asp; Ala103Glu; Ala103Phe; Ala103Gly; Ala103His; Ala103Ile; Ala103Lys; Ala103Leu; Ala103Met; Ala103Asn; Ala103Pro; Ala103Gln; Ala103Arg; Ala103Ser; Ala103Thr; Ala10
3Val; Ala103Trp; Ala103Tyr; Ala104Cys; Ala104Asp; Ala104Glu; Ala104Phe; Ala104Gly; Ala104His; Ala104Ile; Ala104Lys; Ala104Leu; Ala104Met; Ala104Asn; Ala104Pro; Ala104Gln; Ala104Arg; Ala104Ser; Ala104Thr; Ala104Val; Ala104Trp; Ala104Tyr; Gln105Ala; Gln105Cys; Gln105Asp; Gln105Glu; Gln105Phe; Gln105Gly; Gln105His; Gln105Ile; Gln105Lys; Gln105Leu; Gln105Met; Gln105Asn; Gln105Pro; Gln105Arg; Gln105Ser; Gln105Thr; Gln105Val; Gln105Trp; Gln105Tyr; Asn106Ala; Asn106Cys; Asn106Asp; Asn106Glu; Asn106Phe; Asn106Gly; Asn106His; Asn106Ile; Asn106Lys; Asn106Leu; Asn106Met; Asn106Pro; Asn106Gln; Asn106Arg; Asn106Ser; Asn106Thr; Asn106Val; Asn106Trp; Asn106Tyr; Leu107Ala; Leu107Cys; Leu107Asp; Leu107Glu; Leu107Phe; Leu107Gly; Leu107His; Leu107Ile; Leu107Lys; Leu107Met; Leu107Asn; Leu107Pro; Leu107Gln; Leu107Arg; Leu107Ser; Leu107Thr; Leu107Val; Leu107Trp; Leu107Tyr; Ile108Ala; Ile108Cys; Ile108Asp; Ile108Glu; Ile108Phe; Ile108Gly; Ile108His; Ile108Lys; Ile108Leu; Ile108Met; Ile108Asn; Ile108Pro; Ile108Gln; Ile108Arg; Ile108Ser; Ile108Thr; Ile108Val; Ile108Trp; Ile108Tyr; Leu109Ala; Leu109Cys; Leu109Asp; Leu109Glu; Leu109Phe; Leu109Gly; Leu109His; Leu109Ile; Leu109Lys; Leu109Met; Leu109Asn; Leu109Pro; Leu109Gln; Leu109Arg; Leu109Ser; Leu109Thr; Leu109Val; Leu109Trp; Leu109Tyr; Lys110Ala; Lys110Cys; Lys110Asp; Lys110Glu; Lys110Phe; Lys110Gly; Lys110His; Lys110Ile; Lys110Leu; Lys110Met; Lys110Asn; Lys110Pro; Lys110Gln; Lys110Arg; Lys110Ser; Lys110Thr; Lys110Val; Lys110Trp; Lys110Tyr; Gln111Ala; Gln111Cys; Gln111Asp; Gln111Glu; Gln111Phe; Gln111Gly; Gln111His; Gln111Ile; Gln111Lys; Gln111Leu; Gln111Met; Gln111Asn; Gln111Pro; Gln111Arg; Gln111Ser; Gln111Thr; Gln111Val; Gln111Trp; Gln111Tyr; Ile112Ala; Ile112Cys; Ile112Asp; Ile112Glu; Ile112Phe; Ile112Gly; Ile112His; Ile112Lys; Ile112Leu; Ile112Met; Ile112Asn; Ile112Pro; Ile112Gln; Ile112Arg; Ile112Ser; Ile112Thr; Ile112Val; Ile112Trp; Ile112Tyr; Gly113Ala; Gly113Cys; Gly113Asp; Gly113Glu; Gly113Phe; Gly113His; Gly113Ile; Gly113Lys; Gly113Leu; Gly113Met; Gly113Asn; Gly113Pro; Gly113Gln; Gly113Arg; Gly113Ser; Gly113Thr; Gly113Val; Gly113Trp; Gly113Tyr; Gly114Ala; Gly114Cys; Gly114Asp; Gly114Glu; Gly114Phe; Gly114His; Gly114Ile; Gly114Lys; Gly114Leu; Gly114Met; Gly114Asn; Gly114Pro; Gly114Gln; Gly114Arg; Gly114Ser; Gly114Thr; Gly114Val; Gly114Trp; Gly114Tyr; Pro115Ala; Pro115Cys; Pro115Asp; Pro115Glu; Pro115Phe; Pro115Gly; Pro115His; Pro115Ile; Pro115Lys; Pro115Leu; Pro115Met; Pro115Asn; Pro115Gln; Pro115Arg; Pro115Ser; Pro115Thr; Pro115Val; Pro115Trp; Pro115Tyr; Glu116Ala; Glu116Cys; Glu116Asp; Glu116Phe; Glu116Gly; Glu116His; Glu116Ile; Glu116Lys; Glu116Leu; Glu116Met; Glu116Asn; Glu116Pro; Glu116Gln; Glu116Arg; Glu116Ser; Glu116Thr; Glu116Val; Glu116Trp; Glu116Tyr; Ser117Ala; Ser117Cys; Ser117Asp; Ser117Glu; Ser117Phe; Ser117Gly; Ser117His; Ser117Ile; Ser117Lys; Ser117Leu; Ser117Met; Ser117Asn; Ser117Pro; Ser117Gln; Ser117Arg; Ser117Thr; Ser117Val; Ser117Trp; Ser117Tyr; Leu118Ala; Leu118Cys; Leu118Asp; Leu118Glu; Leu118Phe; Leu118Gly; Leu118His; Leu118Ile; Leu118Lys; Leu118Met; Leu118Asn; Leu118Pro; Leu118Gln; Leu118Arg; Leu118Ser; Leu118Thr; Leu118Val; Leu118Trp; Leu118Tyr; Lys119Ala; Lys119Cys; Lys119Asp; Lys119Glu; Lys119Phe; Lys119Gly; Lys119His; Lys119Ile; Lys119Leu; Lys119Met; Lys119Asn; Lys119Pro; Lys119Gln; Lys119Arg; Lys119Ser; Lys119Thr; Lys119Val; Lys119Trp; Lys119Tyr; Lys120Ala; Lys120Cys; Lys120Asp; Lys120Glu; Lys120Phe; Lys120Gly; Lys120His; Lys120Ile; Lys120Leu; Lys120Met; Lys120Asn; Lys120Pro; Lys120Gln; Lys120Arg; Lys120Ser; Lys120Thr; Lys120Val; Lys120Trp; Lys120Tyr; Glu121Ala; Glu121Cys; Glu121Asp; Glu121Phe; Glu121Gly; Glu121His; Glu121Ile; Glu121Lys; Glu121Leu; Glu121Met; Glu121Asn; Glu121Pro; Glu121Gln; Glu121Arg; Glu121Ser; Glu121Thr; Glu121Val; Glu121Trp; Glu121Tyr; Leu122Ala; Leu122Cys; Leu122Asp; Leu122Glu; Leu122Phe; Leu122Gly; Leu122His; Leu122Ile; Leu122Lys; Leu122Met; Leu122Asn; Leu122Pro; Leu122Gln; Leu122Arg; Leu122Ser; Leu122Thr; Leu122Val; Leu122Trp; Leu122Tyr; Arg123Ala; Arg123Cys; Arg123Asp; Arg123Glu; Arg123Phe; Arg123Gly; Arg123His; Arg123Ile; Arg123Lys; Arg123Leu; Arg123Met; Arg123Asn; Arg123Pro; Arg123Gln; Arg123Ser; Arg123Thr; Arg123Val; Arg123Trp; Arg123Tyr; Lys124Ala; Lys124Cys; Lys124Asp; Lys124Glu; Lys124Phe; Lys124Gly; Lys124His; Lys124Ile; Lys124Leu; Lys124Met; Lys124Asn; Lys124Pro; Lys124Gln; Lys124Arg; Lys124Ser; Lys124Thr; Lys124Val; Lys124Trp; Lys124Tyr; Ile125Ala; Ile125Cys; Ile125Asp; Ile125Glu; Ile125Phe; Ile125Gly; Ile125His; Ile125Lys; Ile125Leu; Ile125Met; Ile125Asn; Ile125Pro; Ile125Gln; Ile125Arg; Ile125Ser; Ile125Thr; Ile125Val; Ile125Trp; Ile125Tyr; Gly126Ala; Gly126Cys; Gly126Asp; Gly126Glu; Gly126Phe; Gly126His; Gly126Ile; Gly126Lys; Gly126Leu; Gly126Met; Gly126Asn; Gly126Pro; Gly126Gln; Gly126Arg; Gly126Ser; Gly126Thr; Gly126Val; Gly126Trp; Gly126Tyr; Asp127Ala; Asp127Cys; Asp127Glu; Asp127Phe; Asp127Gly; Asp127His; Asp127Ile; Asp127Lys; Asp127Leu; Asp127Met; Asp127Asn; Asp127Pro; Asp127Gln; Asp127Arg; Asp127Ser; Asp127Thr; Asp127Val; Asp127Trp; Asp127Tyr; Glu128Ala; Glu128Cys; Glu128Asp; Glu128Phe; Glu128Gly; Glu128His; Glu128Ile; Glu128Lys; Glu128Leu; Glu128Met; Glu128Asn; Glu128Pro; Glu128Gln; Glu128Arg; Glu128Ser; Glu128Thr; Glu128Val; Glu128Trp; Glu128Tyr; Val129Ala; Val129Cys; Val129Asp; Val129Glu; Val129Phe; Val129Gly; Val129His; Val129Ile; Val129Lys; Val129Leu; Val129Met; Val129Asn; Val129Pro; Val129Gln; Val129Arg; Val129Ser; Val129Thr; Val129Trp; Val129Tyr; Thr130Ala; Thr130Cys; Thr130Asp; Thr130Glu; Thr130Phe; Thr130Gly; Thr130His; Thr130Ile; Thr130Lys; Thr130Leu; Thr130Met; Thr130Asn; Thr130Pro; Thr130Gln; Thr130Arg; Thr130Ser; Thr130Val; Thr130Trp; Thr130Tyr; Asn131Ala; Asn131Cys; Asn131Asp; Asn131Glu; Asn131Phe; Asn131Gly; Asn131His; Asn131Ile; Asn131Lys; Asn131Leu; Asn131Met; Asn131Pro; Asn131Gln; Asn131Arg; Asn131Ser; Asn131Thr; Asn131Val; Asn131Trp; Asn131Tyr; Pro132Ala; Pro132Cys; Pro132Asp; Pro132Glu; Pro132Phe; Pro132Gly; Pro132His; Pro132Ile; Pro132Lys; Pro132Leu; Pro132Met; Pro132Asn; Pro132Gln; Pro132Arg; Pro132Ser; Pro132Thr; Pro132Val; Pro132Trp; Pro132Tyr; Glu133Ala; Glu133Cys; Glu133Asp; Glu133Phe; Glu133Gly; Glu133His; Glu133Ile; Glu133Lys; Glu133Leu; Glu133Met; Glu133Asn; Glu133Pro; Glu133Gln; Glu133Arg; Glu133Ser; Glu133Thr; Glu133Val; Glu133Trp; Glu133Tyr; Arg134Ala; Arg134Cys; Arg134Asp; Arg134Glu; Arg134Phe; Arg134Gly; Arg134His; Arg134Ile; Arg134Lys; Arg134Leu; Arg134Met; Arg134Asn; Arg134Pro; Arg134Gln; Arg134Ser; Arg134Thr; Arg134Val; Arg134Trp; Arg134Tyr; Phe135Ala; Phe135Cys; Phe135Asp; Phe135Glu; Phe135Gly; Phe135His; Phe135Ile; Phe135Lys; Phe135Leu; Phe135Met; Phe135Asn; Phe135Pro; Phe135Gln; Phe135Arg; Phe135Ser; Phe135Thr; Phe135Val; Phe135Trp; Phe135Tyr; Glu136Ala; Glu136Cys; Glu136Asp; Glu136Phe; Glu136Gly; Glu136His; Glu136Ile; Glu136Lys; Glu136Leu; Glu136Met; Glu136Asn; Glu136Pro; Glu136Gln; Glu136Arg; Glu136Ser; Glu136Thr; Glu136Val; Glu136Trp; Glu136Tyr; Pro137Ala; Pro137Cys; Pro137Asp; Pro137Glu; Pro137Phe; Pro137Gly; Pro137His; Pro137Ile; Pro137Lys; Pro137Leu; Pro137Met; Pro137Asn; Pro137Gln; Pro137Arg; Pro137Ser; Pro137Thr; Pro137Val; Pro137Trp; Pro137Tyr; Glu138Ala; Glu138Cys; Glu138Asp; Glu138Phe; Glu138Gly; Glu138His; Glu138Ile; Glu138Lys; Glu138Leu; Glu138Met; Glu138Asn; Glu138Pro; Glu138Gln; Glu138Arg; Glu138Ser; Glu138Thr; Glu138Val; Glu138Trp; Glu138Tyr; Leu139Ala; Leu139Cys; Leu139Asp; Leu139Glu; Leu139Phe; Leu139Gly; Leu139His; Leu139Ile; Leu139Lys; Leu139Met; Leu139Asn; Leu139Pro; Leu139Gln; Leu139Arg; Leu139Ser; Leu139Thr; Leu139Val; Leu139Trp; Leu139Tyr; Asn140Ala; Asn140Cys; Asn140Asp; Asn140Glu; Asn140Phe; Asn140Gly; Asn140His; Asn140Ile; Asn140Lys; Asn140Leu; Asn140Met; Asn140Pro; Asn140Gln; Asn140Arg; Asn140Ser; Asn140Thr; Asn140Val; Asn140Trp; Asn140Tyr; Glu141Ala; Glu141Cys; Glu141Asp; Glu141Phe; Glu141Gly; Glu141His; Glu141Ile; Glu141Lys; Glu141Leu; Glu141Met; Glu141Asn; Glu141Pro; Glu141Gln; Glu141Arg; Glu141Ser; Glu141Thr; Glu141Val; Glu141Trp; Glu141Tyr; Val142Ala; Val142Cys; Val142Asp; Val142Glu; Val142Phe; Val142Gly; Val142His; Val142Ile; Val142Lys; Val142Leu; Val142Met; Val142Asn; Val142Pro; Val142Gln; Val142Arg; Val142Ser; Val142Thr; Val142Trp; Val142Tyr; Asn143Ala; Asn143Cys; Asn143Asp; Asn143Glu; Asn143Phe; Asn143Gly; Asn143His; Asn143Ile; Asn143Lys; Asn143Leu; Asn143Met; Asn143Pro; Asn143Gln; Asn143Arg; Asn143Ser; Asn143Thr; Asn143Val; Asn143Trp; Asn143Tyr; Pro144Ala; Pro144Cys; Pro144Asp; Pro144Glu; Pro144Phe; Pro144Gly; Pro144His; Pro144Ile; Pro144Lys; Pro144Leu; Pro144Met; Pro144Asn; Pro144Gln; Pro144Arg; Pro144Ser; Pro144Thr; Pro144Val; Pro144Trp; Pro144Tyr; Gly145Ala; Gly145Cys; Gly145Asp; Gly145Glu; Gly145Phe; Gly145His; Gly145Ile; Gly145Lys; Gly145Leu; Gly145Met; Gly145Asn; Gly145Pro; Gly145Gln; Gly145Arg; Gly145Ser; Gly145Thr; Gly145Val; Gly145Trp; Gly145Tyr; Glu146Ala; Glu146Cys; Glu146Asp; Glu146Phe; Glu146Gly; Glu146His; Glu146Ile; Glu146Lys; Glu146Leu; Glu146Met; Glu146Asn; Glu146Pro; Glu146Gln; Glu146Arg; Glu146Ser; Glu146Thr; Glu146Val; Glu146Trp; Glu146Tyr; Thr147Ala; Thr147Cys; Thr147Asp; Thr147Glu; Thr147Phe; Thr147Gly; Thr147His; Thr147Ile; Thr147Lys; Thr147Leu; Thr147Met; Thr147Asn; Thr147Pro; Thr147Gln; Thr147Arg; Thr147Ser; Thr147Val; Thr147Trp; Thr147Tyr; Gln148Ala; Gln148Cys; Gln148Asp; Gln148Glu; Gln148Phe; Gln148Gly; Gln148His; Gln148Ile; Gln148Lys; Gln148Leu; Gln148Met; Gln148Asn; Gln148Pro; Gln148Arg; Gln148Ser; Gln148Thr; Gln148Val; Gln148Trp; Gln148Tyr; Asp149Ala; Asp149Cys; Asp149Glu; Asp149Phe; Asp149Gly; Asp149His; Asp149Ile; Asp149Lys; Asp149Leu; Asp149Met; Asp149Asn; Asp149Pro; Asp149Gln; Asp149Arg; Asp149Ser; Asp149Thr; Asp149Val; Asp149Trp; Asp149Tyr; Thr150Ala; Thr150Cys; Thr150Asp; Thr150Glu; Thr150Phe; Thr150Gly; Thr150His; Thr150Ile; Thr150Lys; Thr150Leu; Thr150Met; Thr150Asn; Thr150Pro; Thr150Gln; Thr150Arg; Thr150Ser; Thr150Val; Thr150Trp; Thr150Tyr; Ser151Ala; Ser151Cys; Ser151Asp; Ser151Glu; Ser151Phe; Ser151Gly; Ser151His; Ser151Ile; Ser151Lys; Ser151Leu; Ser151Met; Ser151Asn; Ser151Pro; Ser151Gln; Ser151Arg; Ser151Thr; Ser151Val; Ser151Trp; Ser151Tyr; Thr152Ala; Thr152Cys; Thr152Asp; Thr152Glu; Thr152Phe; Thr152Gly; Thr152His; Thr152Ile; Thr152Lys; Thr152Leu; Thr152Met; Thr152Asn; Thr152Pro; Thr152Gln; Thr152Arg; Thr152Ser; Thr15
2Val; Thr152Trp; Thr152Tyr; Ala153Cys; Ala153Asp; Ala153Glu; Ala153Phe; Ala153Gly; Ala153His; Ala153Ile; Ala153Lys; Ala153Leu; Ala153Met; Ala153Asn; Ala153Pro; Ala153Gln; Ala153Arg; Ala153Ser; Ala153Thr; Ala153Val; Ala153Trp; Ala153Tyr; Arg154Ala; Arg154Cys; Arg154Asp; Arg154Glu; Arg154Phe; Arg154Gly; Arg154His; Arg154Ile; Arg154Lys; Arg154Leu; Arg154Met; Arg154Asn; Arg154Pro; Arg154Gln; Arg154Ser; Arg154Thr; Arg154Val; Arg154Trp; Arg154Tyr; Ala155Cys; Ala155Asp; Ala155Glu; Ala155Phe; Ala155Gly; Ala155His; Ala155Ile; Ala155Lys; Ala155Leu; Ala155Met; Ala155Asn; Ala155Pro; Ala155Gln; Ala155Arg; Ala155Ser; Ala155Thr; Ala155Val; Ala155Trp; Ala155Tyr; Leu156Ala; Leu156Cys; Leu156Asp; Leu156Glu; Leu156Phe; Leu156Gly; Leu156His; Leu156Ile; Leu156Lys; Leu156Met; Leu156Asn; Leu156Pro; Leu156Gln; Leu156Arg; Leu156Ser; Leu156Thr; Leu156Val; Leu156Trp; Leu156Tyr; Val157Ala; Val157Cys; Val157Asp; Val157Glu; Val157Phe; Val157Gly; Val157His; Val157Ile; Val157Lys; Val157Leu; Val157Met; Val157Asn; Val157Pro; Val157Gln; Val157Arg; Val157Ser; Val157Thr; Val157Trp; Val157Tyr; Thr158Ala; Thr158Cys; Thr158Asp; Thr158Glu; Thr158Phe; Thr158Gly; Thr158His; Thr158Ile; Thr158Lys; Thr158Leu; Thr158Met; Thr158Asn; Thr158Pro; Thr158Gln; Thr158Arg; Thr158Ser; Thr158Val; Thr158Trp; Thr158Tyr; Ser159Ala; Ser159Cys; Ser159Asp; Ser159Glu; Ser159Phe; Ser159Gly; Ser159His; Ser159Ile; Ser159Lys; Ser159Leu; Ser159Met; Ser159Asn; Ser159Pro; Ser159Gln; Ser159Arg; Ser159Thr; Ser159Val; Ser159Trp; Ser159Tyr; Leu160Ala; Leu160Cys; Leu160Asp; Leu160Glu; Leu160Phe; Leu160Gly; Leu160His; Leu160Ile; Leu160Lys; Leu160Met; Leu160Asn; Leu160Pro; Leu160Gln; Leu160Arg; Leu160Ser; Leu160Thr; Leu160Val; Leu160Trp; Leu160Tyr; Arg161Ala; Arg161Cys; Arg161Asp; Arg161Glu; Arg161Phe; Arg161Gly; Arg161His; Arg161Ile; Arg161Lys; Arg161Leu; Arg161Met; Arg161Asn; Arg161Pro; Arg161Gln; Arg161Ser; Arg161Thr; Arg161Val; Arg161Trp; Arg161Tyr; Ala162Cys; Ala162Asp; Ala162Glu; Ala162Phe; Ala162Gly; Ala162His; Ala162Ile; Ala162Lys; Ala162Leu; Ala162Met; Ala162Asn; Ala162Pro; Ala162Gln; Ala162Arg; Ala162Ser; Ala162Thr; Ala162Val; Ala162Trp; Ala162Tyr; Phe163Ala; Phe163Cys; Phe163Asp; Phe163Glu; Phe163Gly; Phe163His; Phe163Ile; Phe163Lys; Phe163Leu; Phe163Met; Phe163Asn; Phe163Pro; Phe163Gln; Phe163Arg; Phe163Ser; Phe163Thr; Phe163Val; Phe163Trp; Phe163Tyr; Ala164Cys; Ala164Asp; Ala164Glu; Ala164Phe; Ala164Gly; Ala164His; Ala164Ile; Ala164Lys; Ala164Leu; Ala164Met; Ala164Asn; Ala164Pro; Ala164Gln; Ala164Arg; Ala164Ser; Ala164Thr; Ala164Val; Ala164Trp; Ala164Tyr; Leu165Ala; Leu165Cys; Leu165Asp; Leu165Glu; Leu165Phe; Leu165Gly; Leu165His; Leu165Ile; Leu165Lys; Leu165Met; Leu165Asn; Leu165Pro; Leu165Gln; Leu165Arg; Leu165Ser; Leu165Thr; Leu165Val; Leu165Trp; Leu165Tyr; Glu166Ala; Glu166Cys; Glu166Asp; Glu166Phe; Glu166Gly; Glu166His; Glu166Ile; Glu166Lys; Glu166Leu; Glu166Met; Glu166Asn; Glu166Pro; Glu166Gln; Glu166Arg; Glu166Ser; Glu166Thr; Glu166Val; Glu166Trp; Glu166Tyr; Asp167Ala; Asp167Cys; Asp167Glu; Asp167Phe; Asp167Gly; Asp167His; Asp167Ile; Asp167Lys; Asp167Leu; Asp167Met; Asp167Asn; Asp167Pro; Asp167Gln; Asp167Arg; Asp167Ser; Asp167Thr; Asp167Val; Asp167Trp; Asp167Tyr; Lys168Ala; Lys168Cys; Lys168Asp; Lys168Glu; Lys168Phe; Lys168Gly; Lys168His; Lys168Ile; Lys168Leu; Lys168Met; Lys168Asn; Lys168Pro; Lys168Gln; Lys168Arg; Lys168Ser; Lys168Thr; Lys168Val; Lys168Trp; Lys168Tyr; Leu169Ala; Leu169Cys; Leu169Asp; Leu169Glu; Leu169Phe; Leu169Gly; Leu169His; Leu169Ile; Leu169Lys; Leu169Met; Leu169Asn; Leu169Pro; Leu169Gln; Leu169Arg; Leu169Ser; Leu169Thr; Leu169Val; Leu169Trp; Leu169Tyr; Pro170Ala; Pro170Cys; Pro170Asp; Pro170Glu; Pro170Phe; Pro170Gly; Pro170His; Pro170Ile; Pro170Lys; Pro170Leu; Pro170Met; Pro170Asn; Pro170Gln; Pro170Arg; Pro170Ser; Pro170Thr; Pro170Val; Pro170Trp; Pro170Tyr; Ser171Ala; Ser171Cys; Ser171Asp; Ser171Glu; Ser171Phe; Ser171Gly; Ser171His; Ser171Ile; Ser171Lys; Ser171Leu; Ser171Met; Ser171Asn; Ser171Pro; Ser171Gln; Ser171Arg; Ser171Thr; Ser171Val; Ser171Trp; Ser171Tyr; Glu172Ala; Glu172Cys; Glu172Asp; Glu172Phe; Glu172Gly; Glu172His; Glu172Ile; Glu172Lys; Glu172Leu; Glu172Met; Glu172Asn; Glu172Pro; Glu172Gln; Glu172Arg; Glu172Ser; Glu172Thr; Glu172Val; Glu172Trp; Glu172Tyr; Lys173Ala; Lys173Cys; Lys173Asp; Lys173Glu; Lys173Phe; Lys173Gly; Lys173His; Lys173Ile; Lys173Leu; Lys173Met; Lys173Asn; Lys173Pro; Lys173Gln; Lys173Arg; Lys173Ser; Lys173Thr; Lys173Val; Lys173Trp; Lys173Tyr; Arg174Ala; Arg174Cys; Arg174Asp; Arg174Glu; Arg174Phe; Arg174Gly; Arg174His; Arg174Ile; Arg174Lys; Arg174Leu; Arg174Met; Arg174Asn; Arg174Pro; Arg174Gln; Arg174Ser; Arg174Thr; Arg174Val; Arg174Trp; Arg174Tyr; Glu175Ala; Glu175Cys; Glu175Asp; Glu175Phe; Glu175Gly; Glu175His; Glu175Ile; Glu175Lys; Glu175Leu; Glu175Met; Glu175Asn; Glu175Pro; Glu175Gln; Glu175Arg; Glu175Ser; Glu175Thr; Glu175Val; Glu175Trp; Glu175Tyr; Leu176Ala; Leu176Cys; Leu176Asp; Leu176Glu; Leu176Phe; Leu176Gly; Leu176His; Leu176Ile; Leu176Lys; Leu176Met; Leu176Asn; Leu176Pro; Leu176Gln; Leu176Arg; Leu176Ser; Leu176Thr; Leu176Val; Leu176Trp; Leu176Tyr; Leu177Ala; Leu177Cys; Leu177Asp; Leu177Glu; Leu177Phe; Leu177Gly; Leu177His; Leu177Ile; Leu177Lys; Leu177Met; Leu177Asn; Leu177Pro; Leu177Gln; Leu177Arg; Leu177Ser; Leu177Thr; Leu177Val; Leu177Trp; Leu177Tyr; Ile178Ala; Ile178Cys; Ile178Asp; Ile178Glu; Ile178Phe; Ile178Gly; Ile178His; Ile178Lys; Ile178Leu; Ile178Met; Ile178Asn; Ile178Pro; Ile178Gln; Ile178Arg; Ile178Ser; Ile178Thr; Ile178Val; Ile178Trp; Ile178Tyr; Asp179Ala; Asp179Cys; Asp179Glu; Asp179Phe; Asp179Gly; Asp179His; Asp179Ile; Asp179Lys; Asp179Leu; Asp179Met; Asp179Asn; Asp179Pro; Asp179Gln; Asp179Arg; Asp179Ser; Asp179Thr; Asp179Val; Asp179Trp; Asp179Tyr; Trp180Ala; Trp180Cys; Trp180Asp; Trp180Glu; Trp180Phe; Trp180Gly; Trp180His; Trp180Ile; Trp180Lys; Trp180Leu; Trp180Met; Trp180Asn; Trp180Pro; Trp180Gln; Trp180Arg; Trp180Ser; Trp180Thr; Trp180Val; Trp180Tyr; Met181Ala; Met181Cys; Met181Asp; Met181Glu; Met181Phe; Met181Gly; Met181His; Met181Ile; Met181Lys; Met181Leu; Met181Asn; Met181Pro; Met181Gln; Met181Arg; Met181Ser; Met181Thr; Met181Val; Met181Trp; Met181Tyr; Lys182Ala; Lys182Cys; Lys182Asp; Lys182Glu; Lys182Phe; Lys182Gly; Lys182His; Lys182Ile; Lys182Leu; Lys182Met; Lys182Asn; Lys182Pro; Lys182Gln; Lys182Arg; Lys182Ser; Lys182Thr; Lys182Val; Lys182Trp; Lys182Tyr; Arg183Ala; Arg183Cys; Arg183Asp; Arg183Glu; Arg183Phe; Arg183Gly; Arg183His; Arg183Ile; Arg183Lys; Arg183Leu; Arg183Met; Arg183Asn; Arg183Pro; Arg183Gln; Arg183Ser; Arg183Thr; Arg183Val; Arg183Trp; Arg183Tyr; Asn184Ala; Asn184Cys; Asn184Asp; Asn184Glu; Asn184Phe; Asn184Gly; Asn184His; Asn184Ile; Asn184Lys; Asn184Leu; Asn184Met; Asn184Pro; Asn184Gln; Asn184Arg; Asn184Ser; Asn184Thr; Asn184Val; Asn184Trp; Asn184Tyr; Thr185Ala; Thr185Cys; Thr185Asp; Thr185Glu; Thr185Phe; Thr185Gly; Thr185His; Thr185Ile; Thr185Lys; Thr185Leu; Thr185Met; Thr185Asn; Thr185Pro; Thr185Gln; Thr185Arg; Thr185Ser; Thr185Val; Thr185Trp; Thr185Tyr; Thr186Ala; Thr186Cys; Thr186Asp; Thr186Glu; Thr186Phe; Thr186Gly; Thr186His; Thr186Ile; Thr186Lys; Thr186Leu; Thr186Met; Thr186Asn; Thr186Pro; Thr186Gln; Thr186Arg; Thr186Ser; Thr186Val; Thr186Trp; Thr186Tyr; Gly187Ala; Gly187Cys; Gly187Asp; Gly187Glu; Gly187Phe; Gly187His; Gly187Ile; Gly187Lys; Gly187Leu; Gly187Met; Gly187Asn; Gly187Pro; Gly187Gln; Gly187Arg; Gly187Ser; Gly187Thr; Gly187Val; Gly187Trp; Gly187Tyr; Asp188Ala; Asp188Cys; Asp188Glu; Asp188Phe; Asp188Gly; Asp188His; Asp188Ile; Asp188Lys; Asp188Leu; Asp188Met; Asp188Asn; Asp188Pro; Asp188Gln; Asp188Arg; Asp188Ser; Asp188Thr; Asp188Val; Asp188Trp; Asp188Tyr; Ala189Cys; Ala189Asp; Ala189Glu; Ala189Phe; Ala189Gly; Ala189His; Ala189Ile; Ala189Lys; Ala189Leu; Ala189Met; Ala189Asn; Ala189Pro; Ala189Gln; Ala189Arg; Ala189Ser; Ala189Thr; Ala189Val; Ala189Trp; Ala189Tyr; Leu190Ala; Leu190Cys; Leu190Asp; Leu190Glu; Leu190Phe; Leu190Gly; Leu190His; Leu190Ile; Leu190Lys; Leu190Met; Leu190Asn; Leu190Pro; Leu190Gln; Leu190Arg; Leu190Ser; Leu190Thr; Leu190Val; Leu190Trp; Leu190Tyr; Ile191Ala; Ile191Cys; Ile191Asp; Ile191Glu; Ile191Phe; Ile191Gly; Ile191His; Ile191Lys; Ile191Leu; Ile191Met; Ile191Asn; Ile191Pro; Ile191Gln; Ile191Arg; Ile191Ser; Ile191Thr; Ile191Val; Ile191Trp; Ile191Tyr; Arg192Ala; Arg192Cys; Arg192Asp; Arg192Glu; Arg192Phe; Arg192Gly; Arg192His; Arg192Ile; Arg192Lys; Arg192Leu; Arg192Met; Arg192Asn; Arg192Pro; Arg192Gln; Arg192Ser; Arg192Thr; Arg192Val; Arg192Trp; Arg192Tyr; Ala193Cys; Ala193Asp; Ala193Glu; Ala193Phe; Ala193Gly; Ala193His; Ala193Ile; Ala193Lys; Ala193Leu; Ala193Met; Ala193Asn; Ala193Pro; Ala193Gln; Ala193Arg; Ala193Ser; Ala193Thr; Ala193Val; Ala193Trp; Ala193Tyr; Gly194Ala; Gly194Cys; Gly194Asp; Gly194Glu; Gly194Phe; Gly194His; Gly194Ile; Gly194Lys; Gly194Leu; Gly194Met; Gly194Asn; Gly194Pro; Gly194Gln; Gly194Arg; Gly194Ser; Gly194Thr; Gly194Val; Gly194Trp; Gly194Tyr; Val195Ala; Val195Cys; Val195Asp; Val195Glu; Val195Phe; Val195Gly; Val195His; Val195Ile; Val195Lys; Val195Leu; Val195Met; Val195Asn; Val195Pro; Val195Gln; Val195Arg; Val195Ser; Val195Thr; Val195Trp; Val195Tyr; Pro196Ala; Pro196Cys; Pro196Asp; Pro196Glu; Pro196Phe; Pro196Gly; Pro196His; Pro196Ile; Pro196Lys; Pro196Leu; Pro196Met; Pro196Asn; Pro196Gln; Pro196Arg; Pro196Ser; Pro196Thr; Pro196Val; Pro196Trp; Pro196Tyr; Asp197Ala; Asp197Cys; Asp197Glu; Asp197Phe; Asp197Gly; Asp197His; Asp197Ile; Asp197Lys; Asp197Leu; Asp197Met; Asp197Asn; Asp197Pro; Asp197Gln; Asp197Arg; Asp197Ser; Asp197Thr; Asp197Val; Asp197Trp; Asp197Tyr; Gly198Ala; Gly198Cys; Gly198Asp; Gly198Glu; Gly198Phe; Gly198His; Gly198Ile; Gly198Lys; Gly198Leu; Gly198Met; Gly198Asn; Gly198Pro; Gly198Gln; Gly198Arg; Gly198Ser; Gly198Thr; Gly198Val; Gly198Trp; Gly198Tyr; Trp199Ala; Trp199Cys; Trp199Asp; Trp199Glu; Trp199Phe; Trp199Gly; Trp199His; Trp199Ile; Trp199Lys; Trp199Leu; Trp199Met; Trp199Asn; Trp199Pro; Trp199Gln; Trp199Arg; Trp199Ser; Trp199Thr; Trp199Val; Trp199Tyr; Glu200Ala; Glu200Cys; Glu200Asp; Glu200Phe; Glu200Gly; Glu200His; Glu200Ile; Glu200Lys; Glu200Leu; Glu200Met; Glu200Asn; Glu200Pro; Glu200Gln; Glu200Arg; Glu200Ser; Glu200Thr; Glu200Val; Glu200Trp; Glu200Tyr; Val201Ala; Val201Cys; Val201Asp; Val201Glu; Val201Phe; Val201Gly; Val201His; Val201Ile; Val201Lys; Val201Leu; Val201Met; Val201Asn; Val201Pro; Val201Gln; Val201Arg; Val201Ser; Val20
1Thr; Val201Trp; Val201Tyr; Ala202Cys; Ala202Asp; Ala202Glu; Ala202Phe; Ala202Gly; Ala202His; Ala202Ile; Ala202Lys; Ala202Leu; Ala202Met; Ala202Asn; Ala202Pro; Ala202Gln; Ala202Arg; Ala202Ser; Ala202Thr; Ala202Val; Ala202Trp; Ala202Tyr; Asp203Ala; Asp203Cys; Asp203Glu; Asp203Phe; Asp203Gly; Asp203His; Asp203Ile; Asp203Lys; Asp203Leu; Asp203Met; Asp203Asn; Asp203Pro; Asp203Gln; Asp203Arg; Asp203Ser; Asp203Thr; Asp203Val; Asp203Trp; Asp203Tyr; Lys204Ala; Lys204Cys; Lys204Asp; Lys204Glu; Lys204Phe; Lys204Gly; Lys204His; Lys204Ile; Lys204Leu; Lys204Met; Lys204Asn; Lys204Pro; Lys204Gln; Lys204Arg; Lys204Ser; Lys204Thr; Lys204Val; Lys204Trp; Lys204Tyr; Thr205Ala; Thr205Cys; Thr205Asp; Thr205Glu; Thr205Phe; Thr205Gly; Thr205His; Thr205Ile; Thr205Lys; Thr205Leu; Thr205Met; Thr205Asn; Thr205Pro; Thr205Gln; Thr205Arg; Thr205Ser; Thr205Val; Thr205Trp; Thr205Tyr; Gly206Ala; Gly206Cys; Gly206Asp; Gly206Glu; Gly206Phe; Gly206His; Gly206Ile; Gly206Lys; Gly206Leu; Gly206Met; Gly206Asn; Gly206Pro; Gly206Gln; Gly206Arg; Gly206Ser; Gly206Thr; Gly206Val; Gly206Trp; Gly206Tyr; Ala207Cys; Ala207Asp; Ala207Glu; Ala207Phe; Ala207Gly; Ala207His; Ala207Ile; Ala207Lys; Ala207Leu; Ala207Met; Ala207Asn; Ala207Pro; Ala207Gln; Ala207Arg; Ala207Ser; Ala207Thr; Ala207Val; Ala207Trp; Ala207Tyr; Ala208Cys; Ala208Asp; Ala208Glu; Ala208Phe; Ala208Gly; Ala208His; Ala208Ile; Ala208Lys; Ala208Leu; Ala208Met; Ala208Asn; Ala208Pro; Ala208Gln; Ala208Arg; Ala208Ser; Ala208Thr; Ala208Val; Ala208Trp; Ala208Tyr; Ser209Ala; Ser209Cys; Ser209Asp; Ser209Glu; Ser209Phe; Ser209Gly; Ser209His; Ser209Ile; Ser209Lys; Ser209Leu; Ser209Met; Ser209Asn; Ser209Pro; Ser209Gln; Ser209Arg; Ser209Thr; Ser209Val; Ser209Trp; Ser209Tyr; Tyr210Ala; Tyr210Cys; Tyr210Asp; Tyr210Glu; Tyr210Phe; Tyr210Gly; Tyr210His; Tyr210Ile; Tyr210Lys; Tyr210Leu; Tyr210Met; Tyr210Asn; Tyr210Pro; Tyr210Gln; Tyr210Arg; Tyr210Ser; Tyr210Thr; Tyr210Val; Tyr210Trp; Gly211Ala; Gly211Cys; Gly211Asp; Gly211Glu; Gly211Phe; Gly211His; Gly211Ile; Gly211Lys; Gly211Leu; Gly211Met; Gly211Asn; Gly211Pro; Gly211Gln; Gly211Arg; Gly211Ser; Gly211Thr; Gly211Val; Gly211Trp; Gly211Tyr; Thr212Ala; Thr212Cys; Thr212Asp; Thr212Glu; Thr212Phe; Thr212Gly; Thr212His; Thr212Ile; Thr212Lys; Thr212Leu; Thr212Met; Thr212Asn; Thr212Pro; Thr212Gln; Thr212Arg; Thr212Ser; Thr212Val; Thr212Trp; Thr212Tyr; Arg213Ala; Arg213Cys; Arg213Asp; Arg213Glu; Arg213Phe; Arg213Gly; Arg213His; Arg213Ile; Arg213Lys; Arg213Leu; Arg213Met; Arg213Asn; Arg213Pro; Arg213Gln; Arg213Ser; Arg213Thr; Arg213Val; Arg213Trp; Arg213Tyr; Asn214Ala; Asn214Cys; Asn214Asp; Asn214Glu; Asn214Phe; Asn214Gly; Asn214His; Asn214Ile; Asn214Lys; Asn214Leu; Asn214Met; Asn214Pro; Asn214Gln; Asn214Arg; Asn214Ser; Asn214Thr; Asn214Val; Asn214Trp; Asn214Tyr; Asp215Ala; Asp215Cys; Asp215Glu; Asp215Phe; Asp215Gly; Asp215His; Asp215Ile; Asp215Lys; Asp215Leu; Asp215Met; Asp215Asn; Asp215Pro; Asp215Gln; Asp215Arg; Asp215Ser; Asp215Thr; Asp215Val; Asp215Trp; Asp215Tyr; Ile216Ala; Ile216Cys; Ile216Asp; Ile216Glu; Ile216Phe; Ile216Gly; Ile216His; Ile216Lys; Ile216Leu; Ile216Met; Ile216Asn; Ile216Pro; Ile216Gln; Ile216Arg; Ile216Ser; Ile216Thr; Ile216Val; Ile216Trp; Ile216Tyr; Ala217Cys; Ala217Asp; Ala217Glu; Ala217Phe; Ala217Gly; Ala217His; Ala217Ile; Ala217Lys; Ala217Leu; Ala217Met; Ala217Asn; Ala217Pro; Ala217Gln; Ala217Arg; Ala217Ser; Ala217Thr; Ala217Val; Ala217Trp; Ala217Tyr; Ile218Ala; Ile218Cys; Ile218Asp; Ile218Glu; Ile218Phe; Ile218Gly; Ile218His; Ile218Lys; Ile218Leu; Ile218Met; Ile218Asn; Ile218Pro; Ile218Gln; Ile218Arg; Ile218Ser; Ile218Thr; Ile218Val; Ile218Trp; Ile218Tyr; Ile219Ala; Ile219Cys; Ile219Asp; Ile219Glu; Ile219Phe; Ile219Gly; Ile219His; Ile219Lys; Ile219Leu; Ile219Met; Ile219Asn; Ile219Pro; Ile219Gln; Ile219Arg; Ile219Ser; Ile219Thr; Ile219Val; Ile219Trp; Ile219Tyr; Trp220Ala; Trp220Cys; Trp220Asp; Trp220Glu; Trp220Phe; Trp220Gly; Trp220His; Trp220Ile; Trp220Lys; Trp220Leu; Trp220Met; Trp220Asn; Trp220Pro; Trp220Gln; Trp220Arg; Trp220Ser; Trp220Thr; Trp220Val; Trp220Tyr; Pro221Ala; Pro221Cys; Pro221Asp; Pro221Glu; Pro221Phe; Pro221Gly; Pro221His; Pro221Ile; Pro221Lys; Pro221Leu; Pro221Met; Pro221Asn; Pro221Gln; Pro221Arg; Pro221Ser; Pro221Thr; Pro221Val; Pro221Trp; Pro221Tyr; Pro222Ala; Pro222Cys; Pro222Asp; Pro222Glu; Pro222Phe; Pro222Gly; Pro222His; Pro222Ile; Pro222Lys; Pro222Leu; Pro222Met; Pro222Asn; Pro222Gln; Pro222Arg; Pro222Ser; Pro222Thr; Pro222Val; Pro222Trp; Pro222Tyr; Lys223Ala; Lys223Cys; Lys223Asp; Lys223Glu; Lys223Phe; Lys223Gly; Lys223His; Lys223Ile; Lys223Leu; Lys223Met; Lys223Asn; Lys223Pro; Lys223Gln; Lys223Arg; Lys223Ser; Lys223Thr; Lys223Val; Lys223Trp; Lys223Tyr; Gly224Ala; Gly224Cys; Gly224Asp; Gly224Glu; Gly224Phe; Gly224His; Gly224Ile; Gly224Lys; Gly224Leu; Gly224Met; Gly224Asn; Gly224Pro; Gly224Gln; Gly224Arg; Gly224Ser; Gly224Thr; Gly224Val; Gly224Trp; Gly224Tyr; Asp225Ala; Asp225Cys; Asp225Glu; Asp225Phe; Asp225Gly; Asp225His; Asp225Ile; Asp225Lys; Asp225Leu; Asp225Met; Asp225Asn; Asp225Pro; Asp225Gln; Asp225Arg; Asp225Ser; Asp225Thr; Asp225Val; Asp225Trp; Asp225Tyr; Pro226Ala; Pro226Cys; Pro226Asp; Pro226Glu; Pro226Phe; Pro226Gly; Pro226His; Pro226Ile; Pro226Lys; Pro226Leu; Pro226Met; Pro226Asn; Pro226Gln; Pro226Arg; Pro226Ser; Pro226Thr; Pro226Val; Pro226Trp; Pro226Tyr; Val227Ala; Val227Cys; Val227Asp; Val227Glu; Val227Phe; Val227Gly; Val227His; Val227Ile; Val227Lys; Val227Leu; Val227Met; Val227Asn; Val227Pro; Val227Gln; Val227Arg; Val227Ser; Val227Thr; Val227Trp; Val227Tyr; Val228Ala; Val228Cys; Val228Asp; Val228Glu; Val228Phe; Val228Gly; Val228His; Val228Ile; Val228Lys; Val228Leu; Val228Met; Val228Asn; Val228Pro; Val228Gln; Val228Arg; Val228Ser; Val228Thr; Val228Trp; Val228Tyr; Leu229Ala; Leu229Cys; Leu229Asp; Leu229Glu; Leu229Phe; Leu229Gly; Leu229His; Leu229Ile; Leu229Lys; Leu229Met; Leu229Asn; Leu229Pro; Leu229Gln; Leu229Arg; Leu229Ser; Leu229Thr; Leu229Val; Leu229Trp; Leu229Tyr; Ala230Cys; Ala230Asp; Ala230Glu; Ala230Phe; Ala230Gly; Ala230His; Ala230Ile; Ala230Lys; Ala230Leu; Ala230Met; Ala230Asn; Ala230Pro; Ala230Gln; Ala230Arg; Ala230Ser; Ala230Thr; Ala230Val; Ala230Trp; Ala230Tyr; Val231Ala; Val231Cys; Val231Asp; Val231Glu; Val231Phe; Val231Gly; Val231His; Val231Ile; Val231Lys; Val231Leu; Val231Met; Val231Asn; Val231Pro; Val231Gln; Val231Arg; Val231Ser; Val231Thr; Val231Trp; Val231Tyr; Leu232Ala; Leu232Cys; Leu232Asp; Leu232Glu; Leu232Phe; Leu232Gly; Leu232His; Leu232Ile; Leu232Lys; Leu232Met; Leu232Asn; Leu232Pro; Leu232Gln; Leu232Arg; Leu232Ser; Leu232Thr; Leu232Val; Leu232Trp; Leu232Tyr; Ser233Ala; Ser233Cys; Ser233Asp; Ser233Glu; Ser233Phe; Ser233Gly; Ser233His; Ser233Ile; Ser233Lys; Ser233Leu; Ser233Met; Ser233Asn; Ser233Pro; Ser233Gln; Ser233Arg; Ser233Thr; Ser233Val; Ser233Trp; Ser233Tyr; Ser234Ala; Ser234Cys; Ser234Asp; Ser234Glu; Ser234Phe; Ser234Gly; Ser234His; Ser234Ile; Ser234Lys; Ser234Leu; Ser234Met; Ser234Asn; Ser234Pro; Ser234Gln; Ser234Arg; Ser234Thr; Ser234Val; Ser234Trp; Ser234Tyr; Arg235Ala; Arg235Cys; Arg235Asp; Arg235Glu; Arg235Phe; Arg235Gly; Arg235His; Arg235Ile; Arg235Lys; Arg235Leu; Arg235Met; Arg235Asn; Arg235Pro; Arg235Gln; Arg235Ser; Arg235Thr; Arg235Val; Arg235Trp; Arg235Tyr; Asp236Ala; Asp236Cys; Asp236Glu; Asp236Phe; Asp236Gly; Asp236His; Asp236Ile; Asp236Lys; Asp236Leu; Asp236Met; Asp236Asn; Asp236Pro; Asp236Gln; Asp236Arg; Asp236Ser; Asp236Thr; Asp236Val; Asp236Trp; Asp236Tyr; Lys237Ala; Lys237Cys; Lys237Asp; Lys237Glu; Lys237Phe; Lys237Gly; Lys237His; Lys237Ile; Lys237Leu; Lys237Met; Lys237Asn; Lys237Pro; Lys237Gln; Lys237Arg; Lys237Ser; Lys237Thr; Lys237Val; Lys237Trp; Lys237Tyr; Lys238Ala; Lys238Cys; Lys238Asp; Lys238Glu; Lys238Phe; Lys238Gly; Lys238His; Lys238Ile; Lys238Leu; Lys238Met; Lys238Asn; Lys238Pro; Lys238Gln; Lys238Arg; Lys238Ser; Lys238Thr; Lys238Val; Lys238Trp; Lys238Tyr; Asp239Ala; Asp239Cys; Asp239Glu; Asp239Phe; Asp239Gly; Asp239His; Asp239Ile; Asp239Lys; Asp239Leu; Asp239Met; Asp239Asn; Asp239Pro; Asp239Gln; Asp239Arg; Asp239Ser; Asp239Thr; Asp239Val; Asp239Trp; Asp239Tyr; Ala240Cys; Ala240Asp; Ala240Glu; Ala240Phe; Ala240Gly; Ala240His; Ala240Ile; Ala240Lys; Ala240Leu; Ala240Met; Ala240Asn; Ala240Pro; Ala240Gln; Ala240Arg; Ala240Ser; Ala240Thr; Ala240Val; Ala240Trp; Ala240Tyr; Lys241Ala; Lys241Cys; Lys241Asp; Lys241Glu; Lys241Phe; Lys241Gly; Lys241His; Lys241Ile; Lys241Leu; Lys241Met; Lys241Asn; Lys241Pro; Lys241Gln; Lys241Arg; Lys241Ser; Lys241Thr; Lys241Val; Lys241Trp; Lys241Tyr; Tyr242Ala; Tyr242Cys; Tyr242Asp; Tyr242Glu; Tyr242Phe; Tyr242Gly; Tyr242His; Tyr242Ile; Tyr242Lys; Tyr242Leu; Tyr242Met; Tyr242Asn; Tyr242Pro; Tyr242Gln; Tyr242Arg; Tyr242Ser; Tyr242Thr; Tyr242Val; Tyr242Trp; Asp243Ala; Asp243Cys; Asp243Glu; Asp243Phe; Asp243Gly; Asp243His; Asp243Ile; Asp243Lys; Asp243Leu; Asp243Met; Asp243Asn; Asp243Pro; Asp243Gln; Asp243Arg; Asp243Ser; Asp243Thr; Asp243Val; Asp243Trp; Asp243Tyr; Asp244Ala; Asp244Cys; Asp244Glu; Asp244Phe; Asp244Gly; Asp244His; Asp244Ile; Asp244Lys; Asp244Leu; Asp244Met; Asp244Asn; Asp244Pro; Asp244Gln; Asp244Arg; Asp244Ser; Asp244Thr; Asp244Val; Asp244Trp; Asp244Tyr; Lys245Ala; Lys245Cys; Lys245Asp; Lys245Glu; Lys245Phe; Lys245Gly; Lys245His; Lys245Ile; Lys245Leu; Lys245Met; Lys245Asn; Lys245Pro; Lys245Gln; Lys245Arg; Lys245Ser; Lys245Thr; Lys245Val; Lys245Trp; Lys245Tyr; Leu246Ala; Leu246Cys; Leu246Asp; Leu246Glu; Leu246Phe; Leu246Gly; Leu246His; Leu246Ile; Leu246Lys; Leu246Met; Leu246Asn; Leu246Pro; Leu246Gln; Leu246Arg; Leu246Ser; Leu246Thr; Leu246Val; Leu246Trp; Leu246Tyr; Ile247Ala; Ile247Cys; Ile247Asp; Ile247Glu; Ile247Phe; Ile247Gly; Ile247His; Ile247Lys; Ile247Leu; Ile247Met; Ile247Asn; Ile247Pro; Ile247Gln; Ile247Arg; Ile247Ser; Ile247Thr; Ile247Val; Ile247Trp; Ile247Tyr; Ala248Cys; Ala248Asp; Ala248Glu; Ala248Phe; Ala248Gly; Ala248His; Ala248Ile; Ala248Lys; Ala248Leu; Ala248Met; Ala248Asn; Ala248Pro; Ala248Gln; Ala248Arg; Ala248Ser; Ala248Thr; Ala248Val; Ala248Trp; Ala248Tyr; Glu249Ala; Glu249Cys; Glu249Asp; Glu249Phe; Glu249Gly; Glu249His; Glu249Ile; Glu249Lys; Glu249Leu; Glu249Met; Glu249Asn; Glu249Pro; Glu249Gln; Glu249Arg; Glu249Ser; Glu249Thr; Glu249Val; Glu249Trp; Glu249Tyr; Ala250Cys; Ala250Asp; Ala250Glu; Ala250Phe; Ala250Gly; Ala250His; Ala250Ile; Ala250Lys; Ala250Leu; Ala250Met; Ala250Asn; Ala250Pro; Ala250Gln; Ala250Arg; Ala250Ser; Ala250Thr; Ala25
0Val; Ala250Trp; Ala250Tyr; Thr251Ala; Thr251Cys; Thr251Asp; Thr251Glu; Thr251Phe; Thr251Gly; Thr251His; Thr251Ile; Thr251Lys; Thr251Leu; Thr251Met; Thr251Asn; Thr251Pro; Thr251Gln; Thr251Arg; Thr251Ser; Thr251Val; Thr251Trp; Thr251Tyr; Lys252Ala; Lys252Cys; Lys252Asp; Lys252Glu; Lys252Phe; Lys252Gly; Lys252His; Lys252Ile; Lys252Leu; Lys252Met; Lys252Asn; Lys252Pro; Lys252Gln; Lys252Arg; Lys252Ser; Lys252Thr; Lys252Val; Lys252Trp; Lys252Tyr; Val253Ala; Val253Cys; Val253Asp; Val253Glu; Val253Phe; Val253Gly; Val253His; Val253Ile; Val253Lys; Val253Leu; Val253Met; Val253Asn; Val253Pro; Val253Gln; Val253Arg; Val253Ser; Val253Thr; Val253Trp; Val253Tyr; Val254Ala; Val254Cys; Val254Asp; Val254Glu; Val254Phe; Val254Gly; Val254His; Val254Ile; Val254Lys; Val254Leu; Val254Met; Val254Asn; Val254Pro; Val254Gln; Val254Arg; Val254Ser; Val254Thr; Val254Trp; Val254Tyr; Met255Ala; Met255Cys; Met255Asp; Met255Glu; Met255Phe; Met255Gly; Met255His; Met255Ile; Met255Lys; Met255Leu; Met255Asn; Met255Pro; Met255Gln; Met255Arg; Met255Ser; Met255Thr; Met255Val; Met255Trp; Met255Tyr; Lys256Ala; Lys256Cys; Lys256Asp; Lys256Glu; Lys256Phe; Lys256Gly; Lys256His; Lys256Ile; Lys256Leu; Lys256Met; Lys256Asn; Lys256Pro; Lys256Gln; Lys256Arg; Lys256Ser; Lys256Thr; Lys256Val; Lys256Trp; Lys256Tyr; Ala257Cys; Ala257Asp; Ala257Glu; Ala257Phe; Ala257Gly; Ala257His; Ala257Ile; Ala257Lys; Ala257Leu; Ala257Met; Ala257Asn; Ala257Pro; Ala257Gln; Ala257Arg; Ala257Ser; Ala257Thr; Ala257Val; Ala257Trp; Ala257Tyr; Leu258Ala; Leu258Cys; Leu258Asp; Leu258Glu; Leu258Phe; Leu258Gly; Leu258His; Leu258Ile; Leu258Lys; Leu258Met; Leu258Asn; Leu258Pro; Leu258Gln; Leu258Arg; Leu258Ser; Leu258Thr; Leu258Val; Leu258Trp; Leu258Tyr; Asn259Ala; Asn259Cys; Asn259Asp; Asn259Glu; Asn259Phe; Asn259Gly; Asn259His; Asn259Ile; Asn259Lys; Asn259Leu; Asn259Met; Asn259Pro; Asn259Gln; Asn259Arg; Asn259Ser; Asn259Thr; Asn259Val; Asn259Trp; Asn259Tyr; Met260Ala; Met260Cys; Met260Asp; Met260Glu; Met260Phe; Met260Gly; Met260His; Met260Ile; Met260Lys; Met260Leu; Met260Asn; Met260Pro; Met260Gln; Met260Arg; Met260Ser; Met260Thr; Met260Val; Met260Trp; Met260Tyr; Asn261Ala; Asn261Cys; Asn261Asp; Asn261Glu; Asn261Phe; Asn261Gly; Asn261His; Asn261Ile; Asn261Lys; Asn261Leu; Asn261Met; Asn261Pro; Asn261Gln; Asn261Arg; Asn261Ser; Asn261Thr; Asn261Val; Asn261Trp; Asn261Tyr; Gly262Ala; Gly262Cys; Gly262Asp; Gly262Glu; Gly262Phe; Gly262His; Gly262Ile; Gly262Lys; Gly262Leu; Gly262Met; Gly262Asn; Gly262Pro; Gly262Gln; Gly262Arg; Gly262Ser; Gly262Thr; Gly262Val; Gly262Trp; Gly262Tyr; Lys263Ala; Lys263Cys; Lys263Asp; Lys263Glu; Lys263Phe; Lys263Gly; Lys263His; Lys263Ile; Lys263Leu; Lys263Met; Lys263Asn; Lys263Pro; Lys263Gln; Lys263Arg; Lys263Ser; Lys263Thr; Lys263Val; Lys263Trp; Lys263Tyr; Met 264Ala; Met 264Cys; Met 264Asp; Met 264Glu; Met 264Phe; Met 264Gly; Met 264His; Met 264Ile; Met 264Lys; Met 264Leu; Met 264Asn; Met 264Pro; Met 264Gln; Met 264Arg; Met 264Ser; Met 264Thr; Met 264Val; Met 264Trp; Met 264Tyr; Asn 265Ala; Asn 265Cys; Asn 265Asp; Asn 265Glu; Asn 265Phe; Asn 265Gly; Asn 265His; Asn 265Ile; Asn 265Lys; Asn 265Leu; Asn 265Met; Asn 265Pro; Asn 265Gln; Asn 265Arg; Asn 265Ser; Asn 265Thr; Asn 265Val; Asn 265Trp; Asn 265Tyr; Gly 266Ala; Gly 266Cys; Gly 266Asp; Gly 266Glu; Gly 266Phe; Gly 266His; Gly 266Ile; Gly 266Lys; Gly 266Leu; Gly 266Met; Gly 266Asn; Gly 266Pro; Gly 266Gln; Gly 266Arg; Gly 266Ser; Gly 266Thr; Gly 266Val; Gly 266Trp; Gly 266Tyr; Lys267Ala; Lys267Cys; Lys267Asp; Lys267Glu; Lys267Phe; Lys267Gly; Lys267His; Lys267Ile; Lys267Leu; Lys267Met; Lys267Asn; Lys267Pro; Lys267Gln; Lys267Arg; Lys267Ser; Lys267Thr; Lys267Val; Lys267Trp;及びLys267Tyr。いくつかの実施形態において、配列番号１は、配列の最初の残基の前にＭｅｔ及び／又はＴｈｒを有してよい。これらの残基は、上記と同様に変異させてよい。
これらの変異体の全てにおいて、残基の番号付けは配列番号１に対応する。これらの残基の番号は、任意の従来のバイオインフォマティクス法の使用を介して、例えば、ＢＬＡＳＴ（Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌｓ）又はＦＡＳＴＡ（ＦＡＳＴ−Ａｌｌ）を用いることによって、Ａｍｂｌｅｒ番号（Ａｍｂｌｅｒら、１９９１，Ａ ｓｔａｎｄａｒｄ ｎｕｍｂｅｒｉｎｇ ｓｃｈｅｍｅ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｃｌａｓｓ Ａ β−ｌａｃｔａｍａｓｅｓ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．２７６：２６９−２７２、この内容は参照により本明細書に組み込まれる）に変換されてよい。例えば、残基２４４は、Ａｍｂｌｅｒ２７６に相当する。例えば、以下の変換が使用されてよい：
さらに、パーセント同一性も、これらの従来のバイオインフォマティクス法で評価されてよい。
一態様において、本発明の方法によって生産されるベータラクタマーゼポリペプチドは、配列番号１又は配列番号３と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、又は約６１％、又は約６２％、又は約６３％、又は約６４、又は約６５％、又は約６６％、又は約６７％、又は約６８％、又は約６９％、又は約７０％、又は約７１％、又は約７２％、又は約７３％、又は約７４％、又は約７５％、又は約７６％、又は約７７％、又は約７８％、又は約７９％、又は約８０％、又は約８１％、又は約８２％、又は約８３％、又は約８４％、又は約８５％、又は約８６％、又は約８７％、又は約８８％、又は約８９％、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％）の配列同一性並びに以下のＡｍｂｌｅｒ分類の変異：Ｘが任意の天然アミノ酸であるＦ３３Ｘ、Ｑ１３５Ｘ、Ｇ１５６Ｘ、Ａ２３２Ｘ、Ａ２３７Ｘ、Ａ２３８Ｘ、Ｓ２４０Ｘ、Ｔ２４３Ｘ、Ｒ２４４Ｘ、Ｓ２６６Ｘ、及びＤ２７６Ｘのうちの１以上を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、Ｘは、天然の親水性もしくは疎水性アミノ酸残基又は非古典的アミノ酸である。
別の態様において、本発明の方法によって生産されるベータラクタマーゼポリペプチドは、配列番号１又は配列番号３と少なくとも６０％の配列同一性を有し、以下のＡｍｂｌｅｒ分類の変異：３３位にフェニルアラニン（Ｆ）以外の疎水性残基；１３５位にグルタミン（Ｑ）以外の疎水性残基；１５６位にグリシン（Ｇ）以外の親水性残基；２３２位にアラニン（Ａ）以外の疎水性残基；２３７位にアラニン（Ａ）以外の親水性残基；２３８位にアラニン（Ａ）以外の疎水性もしくは親水性残基；２４０位にセリン（Ｓ）以外の親水性残基；２４３位にトレオニン（Ｔ）以外の疎水性残基；２４４位にアルギニン（Ｒ）以外の疎水性残基；２６６位にセリン（Ｓ）以外の親水性残基；及び２７６位にアスパラギン酸（Ｄ）以外の親水性残基のうちの１以上を有するアミノ酸配列を含む。
全体を通して使用されるように、親水性アミノ酸残基は、アルギニン（Ｒ）及びリジン（Ｋ）から選択される極性で正に荷電した親水性残基、アスパラギン（Ｎ）、グルタミン（Ｑ）、セリン（Ｓ）、スレオニン（Ｔ）、プロリン（Ｐ）、及びシステイン（Ｃ）から選択される極性で電荷が中性の親水性残基、アスパラギン酸（Ｄ）又はグルタミン酸（Ｅ）から選択される極性で負に荷電した親水性残基、又はヒスチジン（Ｈ）を含む芳香族の、極性で正に荷電した親水性残基を含んでよい。全体を通して使用されるように、疎水性アミノ酸残基は、グリシン（Ｇ）、アラニン（Ａ）、ロイシン（Ｌ）、イソロイシン（Ｉ）、メチオニン（Ｍ）、又はバリン（Ｖ）から選択される疎水性脂肪族アミノ酸、又はフェニルアラニン（Ｆ）、トリプトファン（Ｗ）、又はチロシン（Ｙ）から選択される疎水性芳香族アミノ酸を含んでよい。
コドン縮重を考慮することを含み、遺伝コードを参照してベータラクタマーゼの遺伝子配列（例えば、配列番号２及び４）に変異を行ってよい。
いくつかの実施形態において、本発明の方法によって生産されるベータラクタマーゼポリペプチドは、Ａｍｂｌｅｒ分類の位置に以下の変異のうちの１以上を含む：Ｆ３３Ｙ、Ｑ１３５Ｍ、Ｇ１５６Ｒ、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ又はＡ２３８Ｔ、Ｓ２４０Ｐ又はＳ２４０Ｄ、Ｔ２４３Ｉ、Ｒ２４４Ｔ、Ｓ２６６Ｎ、Ｄ２７６Ｎ又はＤ２７６Ｒ又はＤ２７６Ｋ。一実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、Ｑ１３５Ｍを含む。別の実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、Ｇ１５６Ｒ及びＡ２３８Ｔを含む。別の実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、Ｆ３３Ｙ及びＤ２７６Ｎを含む。さらに別の実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、Ｆ３３Ｙ、Ｓ２４０Ｐ、及びＤ２７６Ｎを含む。一実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、Ｆ３３Ｙ、Ａ２３８Ｔ、及びＤ２７６Ｎを含む。別の実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、及びＳ２４０Ｄを含む。さらなる実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、及びＲ２４４Ｔを含む。別の実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、及びＤ２７６Ｒを含む。一実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、及びＤ２７６Ｋを含む。一実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、及びＱ１３５Ｍを含む。一実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、Ａ２３８Ｔを含む。一実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、Ｔ２４３Ｉ、Ｓ２６６Ｎ、及びＤ２７６Ｎを含む。一実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、及びＤ２７６Ｎを含む。
様々な実施形態において、本発明の方法によって生産されるベータラクタマーゼポリペプチドは、以下の変異のうちの１以上を含む：
様々な実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、すぐ上の表に提供される変異体のうちの１以上と少なくとも６０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
例示的な実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、配列番号１又は配列番号３と少なくとも６０％の配列同一性を有しＡｍｂｌｅｒ分類の以下のもの：２７６位にアスパラギン酸（Ｄ）以外の残基を有するアミノ酸配列を含む。
例示的な実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、配列番号１と少なくとも９０％、又は９５％、又は９７％、又は９９％の配列同一性を有しＡｍｂｌｅｒ分類による２７６位に相当する位置にアスパラギン酸（Ｄ）以外の親水性アミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含み、この親水性アミノ酸残基がアスパラギン（Ｎ）でありこのベータラクタマーゼがＡｍｂｌｅｒ分類による２７６位に相当する位置にアスパラギン酸（Ｄ）を有する配列番号１のベータラクタマーゼよりも実質的により効率的にセフトリアキソンを加水分解する。
例示的な実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、配列番号１と少なくとも９０％、又は９５％、又は９７％、又は９９％の配列同一性を有しＡｍｂｌｅｒ分類による２７６位に相当する位置にアスパラギン酸（Ｄ）以外の親水性アミノ酸残基を有するアミノ酸配列を含み、この親水性アミノ酸残基がアルギニン（Ｒ）でありこのベータラクタマーゼがＡｍｂｌｅｒ分類による２７６位に相当する位置にアスパラギン酸（Ｄ）を有する配列番号１のベータラクタマーゼよりも実質的により効率的にセフトリアキソンを加水分解する。
いくつかの実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、配列番号５、すなわち、Ｐ３Ａと少なくとも９０％、又は９５％、又は９７％、又は９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む：
配列番号５
TEMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITYTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVADKTGAASYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK
いくつかの実施形態において、本発明の方法によって生産されるベータラクタマーゼポリペプチドは、配列番号５と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、又は約６１％、又は約６２％、又は約６３％、又は約６４、又は約６５％、又は約６６％、又は約６７％、又は約６８％、又は約６９％、又は約７０％、又は約７１％、又は約７２％、又は約７３％、又は約７４％、又は約７５％、又は約７６％、又は約７７％、又は約７８％、又は約７９％、又は約８０％、又は約８１％、又は約８２％、又は約８３％、又は約８４％、又は約８５％、又は約８６％、又は約８７％、又は約８８％、又は約８９％、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の例示的なポリヌクレオチドは、Ｐ３Ａの完全ヌクレオチド配列である配列番号６である：
配列番号６
atgactgagatgaaagatgattttgcgaagctggaagaacagtttgacgcaaaattgggcattttcgcgttggacacgggtacgaatcgtacggttgcctaccgtccggacgagcgcttcgccttcgcgagcacgatcaaagccctgaccgtcggcgtgctgctccagcaaaagagcatcgaggacctgaaccagcgcattacctacacccgtgatgatctggtgaactataatccgatcaccgagaaacacgttgataccggtatgaccctgaaagaactggcagatgcaagcctgcgctacagcgataacgcggctcagaatctgattctgaagcaaatcggtggtccggagagcttgaagaaagaactgcgtaaaatcggcgatgaagtcactaatccggagcgttttgagccggagctgaacgaagtgaatccgggtgaaacgcaagacacgagcaccgcgcgtgcgcttgtcacctccctgcgcgctttcgcactggaagataagctgccgtcggagaaacgcgagctgctgatcgactggatgaagcgcaatacgaccggcgacgcgctgattcgtgcgggcgttccggacggttgggaagtggctgacaagaccggtgcggcgagctacggcacccgtaacgatatcgcgatcatttggccacctaaaggtgacccggtcgtgctggccgtactgagcagccgtgacaagaaagacgcaaagtatgataacaagctgattgcagaggcgaccaaagttgttatgaaggcactgaacatgaatggtaag
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号６と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、又は約６１％、又は約６２％、又は約６３％、又は約６４、又は約６５％、又は約６６％、又は約６７％、又は約６８％、又は約６９％、又は約７０％、又は約７１％、又は約７２％、又は約７３％、又は約７４％、又は約７５％、又は約７６％、又は約７７％、又は約７８％、又は約７９％、又は約８０％、又は約８１％、又は約８２％、又は約８３％、又は約８４％、又は約８５％、又は約８６％、又は約８７％、又は約８８％、又は約８９％、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％）の配列同一性を有する。
例示的な実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、配列番号１又は配列番号３と少なくとも６０％の配列同一性を有しＡｍｂｌｅｒ分類の以下のもの：２３２位にアラニン（Ａ）以外の疎水性残基；２３７位にアラニン（Ａ）以外の親水性残基；２３８位にアラニン（Ａ）以外の疎水性残基；２４０位にセリン（Ｓ）以外の親水性残基；及び２７６位にアスパラギン酸（Ｄ）以外の親水性残基を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態において、２３２位のアラニン（Ａ）以外の疎水性残基は、グリシン（Ｇ）である。いくつかの実施形態において、２３７位のアラニン（Ａ）以外の親水性残基は、セリン（Ｓ）である。いくつかの実施形態において、２３８位のアラニン（Ａ）以外の疎水性残基は、グリシン（Ｇ）である。いくつかの実施形態において、２４０位のセリン（Ｓ）以外の親水性残基は、アスパラギン酸（Ｄ）である。いくつかの実施形態において、２７６位のアスパラギン酸（Ｄ）以外の親水性残基は、アスパラギン（Ｎ）である。いくつかの実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、及びＤ２７６Ｎのうちの１以上を含む。いくつかの実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、その配列が配列番号７、すなわちＰ４Ａである、Ａ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、及びＤ２７６Ｎの全てを含む。いくつかの実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、配列番号７と少なくとも９０％、又は９５％、又は９７％、又は９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
配列番号７
EMKDDFAKLEEQFDAKLGIFALDTGTNRTVAYRPDERFAFASTIKALTVGVLLQQKSIEDLNQRITTRDDLVNYNPITEKHVDTGMTLKELADASLRYSDNAAQNLILKQIGGPESLKKELRKIGDEVTNPERFEPELNEVNPGETQDTSTARALVTSLRAFALEDKLPSEKRELLIDWMKRNTTGDALIRAGVPDGWEVGDKTGSGDYGTRNDIAIIWPPKGDPVVLAVLSSRDKKDAKYDNKLIAEATKVVMKALNMNGK
いくつかの実施形態において、本発明の方法によって生産されるベータラクタマーゼポリペプチドは、配列番号７と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、又は約６１％、又は約６２％、又は約６３％、又は約６４、又は約６５％、又は約６６％、又は約６７％、又は約６８％、又は約６９％、又は約７０％、又は約７１％、又は約７２％、又は約７３％、又は約７４％、又は約７５％、又は約７６％、又は約７７％、又は約７８％、又は約７９％、又は約８０％、又は約８１％、又は約８２％、又は約８３％、又は約８４％、又は約８５％、又は約８６％、又は約８７％、又は約８８％、又は約８９％、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
配列番号８は、配列番号７から誘導され、シグナル及びＱＡＳＫＴアミノ酸の付加をさらに含む（コード領域に下線が引いてある）：
いくつかの実施形態において、本発明の方法によって生産されるベータラクタマーゼポリペプチドは、配列番号８と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、又は約６１％、又は約６２％、又は約６３％、又は約６４、又は約６５％、又は約６６％、又は約６７％、又は約６８％、又は約６９％、又は約７０％、又は約７１％、又は約７２％、又は約７３％、又は約７４％、又は約７５％、又は約７６％、又は約７７％、又は約７８％、又は約７９％、又は約８０％、又は約８１％、又は約８２％、又は約８３％、又は約８４％、又は約８５％、又は約８６％、又は約８７％、又は約８８％、又は約８９％、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、配列番号８と少なくとも９０％、又は９５％、又は９７％、又は９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
本発明の例示的なポリヌクレオチドは配列番号９であり、それはＡ２３２Ｇ、Ａ２３７Ｓ、Ａ２３８Ｇ、Ｓ２４０Ｄ、及びＤ２７６Ｎ変異体、Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位（ＡＡＧＣＴＴ−太字）並びに追加のＫ及びＴアミノ酸の完全ヌクレオチド配列であるである。いくつかの実施形態において、配列番号９の下線部は省略される。リーダー及び追加のヌクレオチド（Ｈｉｎｄ ＩＩＩ部位並びにＫ及びＴのアミノ酸−アミノ酸配列ＱＡＳＫＴの付加のため）に下線が引いてある。
いくつかの実施形態において、本発明のポリヌクレオチドは、配列番号９（下線部の有無にかかわらず）と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、又は約６１％、又は約６２％、又は約６３％、又は約６４、又は約６５％、又は約６６％、又は約６７％、又は約６８％、又は約６９％、又は約７０％、又は約７１％、又は約７２％、又は約７３％、又は約７４％、又は約７５％、又は約７６％、又は約７７％、又は約７８％、又は約７９％、又は約８０％、又は約８１％、又は約８２％、又は約８３％、又は約８４％、又は約８５％、又は約８６％、又は約８７％、又は約８８％、又は約８９％、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％）の配列同一性を有する。
様々な態様において、ベータラクタマーゼポリペプチドは、配列番号１０（すなわち、Ｐ２Ａ）の配列を有するか、又は配列番号１０の１以上の変異によって誘導される：
ETGTISISQLNKNVWVHTELGYFNGEAVPSNGLVLNTSKGLVLVDSSWDNKLTKELIEMVEKKFQKRVTDVIITHAHADRIGGITALKERGIKAHSTALTAELAKNSGYEEPLGDLQTITSLKFGNTKVETFYPGKGHTEDNIVVWLPQYQILAGGCLVKSAEAKDLGNVADAYVNEWSTSIENVLKRYGNINSVVPGHGEVGDKGLLLHTLDLLK
いくつかの実施形態において、本発明の方法によって生産されるベータラクタマーゼポリペプチドは、配列番号１０と少なくとも約６０％（例えば、約６０％、又は約６１％、又は約６２％、又は約６３％、又は約６４、又は約６５％、又は約６６％、又は約６７％、又は約６８％、又は約６９％、又は約７０％、又は約７１％、又は約７２％、又は約７３％、又は約７４％、又は約７５％、又は約７６％、又は約７７％、又は約７８％、又は約７９％、又は約８０％、又は約８１％、又は約８２％、又は約８３％、又は約８４％、又は約８５％、又は約８６％、又は約８７％、又は約８８％、又は約８９％、又は約９０％、又は約９１％、又は約９２％、又は約９３％、又は約９４％、又は約９５％、又は約９６％、又は約９７％、又は約９８％、又は約９９％）の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態において、ベータラクタマーゼ及び／又は医薬組成物は、配列番号１０と少なくとも９０％、又は９５％、又は９７％、又は９９％、又は１００％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。
Ｐ１Ａ、Ｐ２Ａ、Ｐ３Ａ、及びＰ４Ａを含むベータラクタマーゼの追加配列並びにその誘導体は、例えば、ＷＯ ２０１１／１４８０４１及びＰＣＴ／ＵＳ２０１５／０２６４５７に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、例えば、かかるポリヌクレオチドを含むベクターを含み、ベータラクタマーゼポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを提供する。かかるポリヌクレオチドは、本発明のベータラクタマーゼをコードする配列に加えて、１以上の発現調節エレメントをさらに含んでよい。例えば、ポリヌクレオチドは、発現調節エレメントとして、１以上のプロモーター又は転写エンハンサー、リボソーム結合部位、転写終結シグナル、及びポリアデニル化シグナルを含んでよい。一実施形態において、ポリヌクレオチドは、細胞質でベータラクタマーゼの発現を指示する発現調節エレメントを含む。
ポリヌクレオチドは、発現用大腸菌細胞などの適切な宿主細胞を形質転換するのに利用される、適切なベクター内に挿入されてよい。ベクターは、例えば、プラスミドクローニングベクターを含む、宿主細胞間でＤＮＡを移動させることができる任意の自己複製ＤＮＡ分子であってよい。いくつかの実施形態において、治療薬をコードするインサートが転写され得る限り、ベクターは、エピソームのままかであるか染色体に組み込まれ得る。ベクターは、標準的な組換えＤＮＡ技術によって構築できる。ベクターは、原核細胞又は真核細胞内での複製及び発現に使用される、例えば、プラスミド、ファージ、コスミド、ファージミド、ウイルス、又は当技術分野で公知の任意の他の種（例えば、アデノウイルス；レトロウイルス；レンチウイルス；ｓｃＡＡＶ；ｐＧＥＸベクター；ｐＥＴベクター；及びｐＨＴベクター）であり得る。使用され得る例示的なベクターは、例えば、ｐＡＶＥ０１１ベクターを含む。ｐＡＶＥ０１１ベクターの調製は、ＥＰ特許第０５０２６３７号、ＥＰ特許第２３８６６４２号、及び米国特許第６，５３７，７７９号に記載されており、これらの全内容は参照により本明細書に組み込まれる。プロモーター及びプロモーター上へのＲＮＡポリメラーゼの結合を制御する他の配列などの、多種多様な転写シグナルを含む、当技術分野で公知の多種多様な構成要素（発現調節エレメントなど）が、かかるベクター内に含まれてよいことは、当業者なら理解するだろう。ベクターが発現される大腸菌細胞内で効果的であると知られる任意のプロモーターを用いて治療薬の発現を惹起できる。一実施形態において、プロモーターは、細胞質内でのベータラクタマーゼポリペプチドの発現を指示するのに有効である。適切なプロモーターは、誘導性又は構成的であり得る。適切なプロモーターの例として、例えば、ｐＥＴシステム（ＩＮＶＩＴＲＯＧＥＮ）、ｌａｃ プロモーター、ｔａｃ、ｔｒｃ、Ｔ７、Ｔ７Ａ３プロモーター、ＰｈｏＡ、ラムダファージｐＲ、ラムダｐＬプロモーター（例えば、Ｊ Ｉｎｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ（２０１２）３９：３８３−３９９；Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ ２００１,１２：１９５を参照されたく、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）、バチルス・アミロリケファシエンス由来のＰｓｐａｃ、ＰｇｒｏＥＳ、Ｐｇｓｉ、Ｐｌｕｘ及びａｍｙＱプロモーター並びに／又はａｍｙＱシグナルペプチド（非限定的な例として、Ｇｅｎ Ｂａｎｋ ＩＤ番号Ｊ０１５４２．１、これらの内容は参照により本明細書に組み込まれる）が挙げられる。プロモーターは誘導性であり得る（例えばＩＰＴＧ、代謝物、温度による）。一実施形態において、ベータラクタマーゼポリペプチドの細胞質発現は、ＩＰＴＧ誘導性ＬａｃＩプロモーターによって駆動される。一実施形態において、ベータラクタマーゼポリペプチドの細胞質発現は、細菌培養物へのＩＰＴＧの添加によって誘導される。
様々な実施形態において、形質転換された大腸菌細胞を、ベータラクタマーゼポリペプチドの細胞質発現を引き起こすのに十分な条件下で、しばらくの間増殖させる。培養中の大腸菌細胞の増殖及び繁殖を支持する任意の種類の培地が、本発明の方法を実施するのに有用である。培養物の増殖後に、大腸菌細胞を、典型的には、浸透圧ショック、超音波処理又は他の標準的な手段を用いて溶解させ、発現したベータラクタマーゼポリペプチドを可溶性画分から分離する。この目的のために、透析、ゲル濾過、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動、又はステップの組み合わせなどの任意のタンパク質精製法を利用してよい。
様々な実施形態において、本発明の方法によって生産されるベータラクタマーゼは、それらを治療的使用を含む、様々な使用に望ましいものにする機能的特徴を保有する。ベータラクタマーゼを特徴付ける方法（例えば、Ｏ’Ｃａｌｌａｇｈａｎら、Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ．Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ，１：２８３−２８８；Ｖｉｓｗａｎａｔｈａら、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍｏｌ Ｍｅｄ．２００８；１４２：２３９−６０の様々な方法によって説明されるようなニトロセフィンアッセイ）は、当技術分野で公知である。
一実施形態において、本発明の方法によって生産されるベータラクタマーゼは、ペニシリン類及びセファロスポリン類のうちの１以上を加水分解する。全体を通して使用されるように、ペニシリン類には、例えば、アモキシシリン（例えば、ＮＯＶＡＭＯＸ、ＡＭＯＸＩＬ）；アンピシリン（例えば、プリンシパン）；アズロシリン；カルベニシリン（例えば、ジオサイリン）；クロキサシリン（例えば、テゴペン）；ジクロキサシリン（例えば、ダイナペン）；フルクロキサシリン（例えば、フロキサペン）；メズロシリン（例えば、メズリン）；メチシリン（例えば、スタフシリン）；ナフシリン（例えば、ユニペン（ＵＮＩＰＥＮ））；オキサシリン（例えば、プロスタフリン）；ペニシリンＧ（例えば、ペンチド（ＰＥＮＴＩＤＳ）又はファイザーペン）；ペニシリンＶ（例えば、ＶＥＥＴＩＤＳ（ＰＥＮ−ＶＥＥ−Ｋ））；ピペラシリン（例えば、ピプラシル（ＰＩＰＲＡＣＩＬ））；テモシリン（例えば、ネガバン）；及びチカルシリン（例えば、チカール（ＴＩＣＡＲ））が含まれる。全体を通して使用されるように、セファロスポリン類には、例えば、第１世代のセファロスポリン（例えば、セファドロキシル（例えば、デュリセフ（ＤＵＲＩＣＥＦ））；セファゾリン（例えば、アンセフ（ＡＮＣＥＦ）；セフトロザン、セファロチン（Ｃｅｆａｌｏｔｉｎ）／セファロチン（Ｃｅｆａｌｏｔｈｉｎ）（例えば、ケフリン（ＫＥＦＬＩＮ））；セファレキシン（例えば、ケフレックス））；第２世代のセファロスポリン（例えば、セファクロール（例えば、ディスタクロール）；セファマンドール（例えば、マンドール）；セフォキシチン（例えば、メフォキシン）；セフプロジル（例えば、セフジル）；セフロキシム（例えば、セフチン、ジンナット））；第３世代のセファロスポリン（例えば、セフィキシム（例えば、スプラックス）；セフジニール（例えば、オムニセフ、セフディール（ＣＥＦＤＩＥＬ））；セフジトレン（例えば、スペクトラセフ）；セフォペラゾン（例えば、セフォビド）；セフォタキシム（例えば、クラフォラン）；セフポドキシム（例えば、バンチン）；セフタジジム（例えば、フォルタツ（ＦＯＲＴＡＺ））；セフチブテン（例えば、セダックス）；セフチゾキシム（例えば、セフィゾックス）；及びセフトリアキソン（例えば、ロセフィン））；第４世代のセファロスポリン（例えば、セフェピム（例えば、マキシピム））；又は第５世代のセファロスポリン（例えば、セフタロリンフォサミル（例えば、テフラロ）；セフトビプロール（例えば、ゼフテラ）が含まれる。具体的な実施形態において、セファロスポリン類には、例えば、セフォペラゾン、セフトリアキソン又はセファゾリンが含まれる。具体的な実施形態において、本発明のベータラクタマーゼは、配列番号１と比較して、セファロスポリン類に対して触媒効率が向上している。
様々な実施形態において、ベータラクタマーゼは、所望の酵素動態特性を保有する。例えば、いくつかの実施形態において、ベータラクタマーゼは、少なくとも１種類のセファロスポリンについて、例えば、約５００μＭ未満、又は約１００μＭ、又は約１０μＭ、又は約１μＭ、又は約０.１μＭ（１００ｎＭ）、又は約０.０１μＭ（１０ｎＭ）、又は約１ｎＭ未満のＫＭを含む低いＫＭを保有する。例えば、いくつかの実施形態において、ベータラクタマーゼは、少なくとも１種類のペニシリンについて、例えば、約５００μＭ未満、又は約１００μＭ、又は約１０μＭ、又は約１μＭ、又は約０.１μＭ（１００ｎＭ）、又は約０.０１μＭ（１０ｎＭ）、又は約１ｎＭ未満のＫＭを含む低いＫＭを保有する。様々な実施形態において、本発明のベータラクタマーゼは、少なくとも１種類のセファロスポリンについて、例えば、約１００ｓ−１を超える、又は約１０００ｓ−１、又は約１００００ｓ−１、又は約１０００００ｓ−１、又は約１００００００ｓ−１を超えるＶｍａｘを含む高いＶｍａｘを保有する。様々な実施形態において、本発明のベータラクタマーゼは、少なくとも１種類のペニシリンについて、例えば、約１００ｓ−１を超える、又は約１０００ｓ−１、又は約１００００ｓ−１、又は約１０００００ｓ−１、又は約１００００００ｓ−１を超えるＶｍａｘを含む高いＶｍａｘを保有する。様々な実施形態において、本発明のベータラクタマーゼは、少なくとも１種類のセファロスポリンについて、約１０６Ｍ−１ ｓ−１を超える触媒効率を保有する。様々な実施形態において、本発明のベータラクタマーゼは、少なくとも１種類のペニシリンについて、約１０６Ｍ−１ ｓ−１を超える触媒効率を保有する。様々な実施形態において、本発明のベータラクタマーゼは、セファロスポリン類及びペニシリン類のいずれか一方又は両方の少なくとも１種類について所望の酵素動態特性を保有する。
様々な実施形態において、本発明のベータラクタマーゼは、ＧＩ管、例えば、口、食道、胃、十二指腸、小腸、十二指腸、空腸、回腸、大腸、結腸横行、結腸下垂体、結腸上行結腸、結腸Ｓ状結腸、盲腸、及び直腸のうちの１以上において安定であり、かつ／又は活性がある。具体的な実施形態において、ベータラクタマーゼは、必要に応じて結腸横行、結腸下垂体、結腸上行結腸、結腸Ｓ状結腸及び盲腸のうちの１以上から選択される、大腸で安定である。具体的な実施形態において、ベータラクタマーゼは、必要に応じて十二指腸、空腸、及び回腸のうちの１以上から選択される、小腸で安定である。いくつかの実施形態において、ベータラクタマーゼは、例えば小腸を含む、ＧＩ管内のプロテアーゼに耐性を示す。いくつかの実施形態において、ベータラクタマーゼは、約６．０〜約７．５のｐＨで、例えば、約６．０、又は約６．１、又は約６．２、又は約６．３、又は約６．４、又は約６．５、又は約６．６、又は約６．７、又は約６．８、又は約６．９、又は７．０、又は約７．１、又は約７．２、又は約７．３、又は約７．４、又は約７．５のｐＨで実質的に活性がある（例えば、本明細書に記載の配合物を介することを含む）。様々な実施形態において、本発明のベータラクタマーゼは、必要に応じてアビバクタム、タゾバクタム、スルバクタム、及びクラブラン酸から選択される、１以上のベータラクタマーゼ阻害剤に耐性を示す。いくつかの実施形態において、安定とは、治療効果について十分に長い半減期を有し十分な活性を維持する酵素を指す。
本発明を、以下の非限定的な実施例によってさらに説明する。
実施例
実施例１：バチルス株におけるベータラクタマーゼの生産
Ｐ１Ａタンパク質を、約１０，０００リットルの流加発酵で、枯草菌ＲＳ３１０生産株によって生産した。枯草菌ＲＳ３１０株は、無芽胞性で、トリプトファン栄養要求性であり、培養液中にＰ１Ａタンパク質を分泌した。具体的には、Ｐ１Ａタンパク質の細胞培養は、振盪フラスコ内での２つの接種材料（１％）拡張段階（ＷＣＢバイアル→１００ｍＬ→２×１２００ｍＬ）に続く種子発酵段階（２２０Ｌ、２．５％）を含んだ。主な流加発酵は、約１０，０００Ｌの作業量で行った。初期量が９，０００Ｌの増殖培地を用いて、主発酵をバッチ発酵として開始した。増殖培地中のグルコースのほとんどが消費された約９時間後に、グルコース及びリン酸塩を含有する供給溶液（約１５００〜２０００Ｌ）の供給を開始した。供給段階中にグルコースを適切なレベル（０．５〜５ｍｇ／ｍＬ）で保つために、予め定義した供給プロファイルを用い、これはグルコース測定に基づいて工程中に調節してよい。Ｐ１Ａタンパク質を構成的に生産し、培養液中に細胞外分泌させた。
発酵中に、グルコース濃度、ｐＨ（７±０．２）、溶存酸素レベル（１０〜２０％）、温度（３７±１℃）及び泡レベルを含む重要な動作パラメータを監視し、調節した。攪拌速度を調節し、穏やかな混合で開始して最大１３８〜１４５ｒｐｍまで増加させた。容器内への気流を０．５〜１ｖｖｍに調節した。発酵の進行を、Ｐ１Ａ含量（酵素活性測定）及び細胞密度測定（ＯＤ６００ｎｍ）によって監視した。主発酵では、典型的には１６〜２２時間後に、Ｐ１Ａ力価が（ＨＰＬＣによって）約１〜１．２ｍｇ／ｍＬに達した。最終細胞密度は、典型的には約ＯＤ５０（ｄ．ｗ.１６〜１７ｇ／Ｌ）であった。培養完了後に、発酵槽の内容物を１１±３℃まで冷却した。
発酵後に、連続遠心分離、続いて精密濾過によりＰ１Ａタンパク質含有培地から細胞を除去した。Ｐ１Ａ含有濾液を限外濾過により濃縮し、Ｐ１Ａ濃縮物をさらにダイアフィルトレートし、調整して、フロースルーモードで使い捨て陰イオン交換フィルターカートリッジに通し、その後、濾液をさらにダイアフィルトレートしてＮａＣｌを除去した。これにより、結晶化、結晶収集、洗浄及び溶解を含む以下の２段階のＰ１Ａタンパク質結晶化のための溶液を調製した。最後に、第２の結晶化ステップ後に、Ｐ１Ａタンパク質結晶を水に懸濁して溶解し、Ｐ１Ａタンパク質溶液の最終濃度を調整した。このタンパク質溶液を濾過して（０．２μｍ）生物汚染度を低下させ、最後に、滅菌プラスチック容器に分注し、凍結させ−７０℃で保存した。
実施例２：Ｐ３Ａ β−ラクタマーゼの発現のための細胞内遺伝子設計
この研究の目的は、β−ラクタマーゼ発現を改善することであった。そのために、ｐＡＶＥｗａｙ（商標）アドバンスタンパク質発現システムを大腸菌内で用いた。Ｐ３Ａを、この研究を通して、β−ラクタマーゼ発現を試験するために用いた。Ｐ３Ａの細胞内発現を指示するための遺伝子配列は、配列番号６である。
Ｐ３Ａ遺伝子を、ｐＡＶＥｗａｙ（商標）細胞間（細胞質）構築物であるｐＡＶＥ０１１中にクローニングし、ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定を用いてこのプラスミドを確認した。設計したＰ３Ａ発現構築物は、Ｎ末端メチオニンが約９５％の確率で除去された比較的均質なＮ末端を提供した。
細胞間発現プラスミドの構築後、この構築物で以下の大腸菌株：ＣＬＤ９７７（Ｗ３１１０大腸菌宿主）及びＣＬＤ９９０（ＢＬ２１大腸菌宿主）を形質転換した。β−ラクタマーゼ細胞内発現株の構築後に、実施例２及び３にそれぞれ詳細に記載する通り、Ｐ３Ａを発現させ、特徴付けた。
さらに、Ｐ３Ａ遺伝子を、ｐＡＶＥｗａｙ（商標）ペリプラズム構築物であるｐＡＶＥ０２９＋遺伝子１又は遺伝子７（遺伝子１及び遺伝子７は異なる分泌リーダーである）中にクローニングした。再び、ＰＣＲ及びＤＮＡ配列決定を用いて、このプラスミドを確認した。
ペリプラズム発現プラスミドの構築後、この構築物で以下の大腸菌株：ＣＬＤ９８１（遺伝子１リーダー、Ｗ３１１０大腸菌宿主）及びＣＬＤ９８２（遺伝子７リーダー、ＢＬ２１大腸菌宿主）を形質転換した。ペリプラズムβ−ラクタマーゼ発現株の構築後に、実施例２及び３にそれぞれ詳細に記載する通り、Ｐ３Ａを発現させ、特徴付けた。
実施例３：Ｐ３Ａβ−ラクタマーゼの発酵
細胞内発現株ＣＬＤ９７７及びＣＬＤ９９０、並びにペリプラズム株ＣＬＤ９８１及びＣＬＤ９８２を用いて、重複して発酵を行った。具体的には、３段階：振盪フラスコ（ＳＦ）播種段階、発酵槽段階、及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析段階で、発酵分析を実行した。ＳＦ播種段階を実行するために、ＲＣＢバイアルを、標準的な培地を入れた２本の振盪フラスコ中に接種し、約１０時間、３７℃、２００ｒｐｍでインキュベートした。次に、これらの試料の純度及びＯＤ６００を決定した（表１にまとめた）。最後に、大腸菌材料をＳＦから発酵容器に移した。
表１．細胞内株ＣＬＤ９７７及びＣＬＤ９９０用の振盪フラスコ播種段階の結果。ＳＦ１及びＳＦ２は、それぞれＣＬＤ９７７及びＣＬＤ９９０用の重複反応に相当する。
標準的なｐＡＶＥｗａｙ（商標）細胞内プロトコールを用いて発酵槽段階を行った。具体的には、ＯＤ６００＝５０±５の時に、０．５ｍＭのＩＰＴＧを用いて培養物を誘導した。誘導後、停止までさらに１２時間発酵を継続した。誘導前及び停止の両方の時点で、試料の純度を確認した。
ＣＬＤ９７７については、発酵制御パラメータステップは以下であった：ｉ）７．３３時間に酸素補給；ｉｉ）供給開始時の９．４６時間にバッチフェーズの終了；ｉｉｉ）ＯＤ６００＝５０．１の時の１０．２７時間に誘導；ｉｖ）停止前に、発酵をさらに１２時間継続した。
図１（ＣＬＤ９７７発酵のマルチ発酵槽コンピュータシステム（ＭＦＣＳ）プロット）に示すように、約２０時間の時点で気流が低下し始め、これは容器内の圧力が原因と思われた。また、図１に示すように、約２１時間であり停止前の１．５時間の時点でｐＯ２が２０％未満に低下した。
ＣＬＤ９９０については、発酵制御パラメータステップは以下であった：ｉ）１０．９５時間に酸素補給；ｉｉ）供給開始時の１２．２７時間にバッチフェーズの終了；ｉｉｉ）ＯＤ６００＝５０．１の時の１３．１４時間に誘導；ｉｖ）停止までさらに１２時間発酵を継続した。
ＣＬＤ９９０発酵のＭＦＣＳプロットを図２に示す。
ＣＬＤ９７７及びＣＬＤ９９０発酵についての酸素摂取量（ＯＵＲ）及び二酸化炭素の発生速度（ＣＥＲ）の出口ガス分析のＭＦＣＳプロットを図３に示す。同様のプロファイルが両株について観察され、観察されたより長いバッチフェーズによる遅れがＣＬＤ９９０に見られた。ＣＬＤ９７７発酵の終了時のプロファイルは、理論に縛られるものではないが、おそらく容器内の気流の低下（出口フィルタのブロック）に関連した。
両株のバイオマスプロファイルは、バッチフェーズの延長によってＣＬＤ９９０株が遅れたが、誘導後１２時間まで類似していた（図４を参照されたい）。この遅れは、理論に縛られるものではないが、より低いＳＦ ＯＤ６００又は初期増殖速度の低下によるものであった可能性がある。
バッチフェーズの終了時及び発酵完了後に、ＣＬＤ９７７及びＣＬＤ９９０についてグラム染色も行った（図５を参照されたい）。結果は、培養の終了時に培養物が純粋かつ均質であったことを示す。
発酵後に、誘導前から発酵終了までに選択したタイムコース試料を、試料を溶解、スピンダウン、及び再懸濁した後にＳＤＳ ＰＡＧＥを用いて分析した（図６〜８を参照されたい）。
ＳＤＳ ＰＡＧＥの結果によって証明される通り、両株でのタンパク質生産レベルは、１０ｇ／Ｌを超えていた（図６及び図７を参照されたい）：ＣＬＤ９７７のＳＤＳ ＰＡＧＥは１２．１〜１４．０ｇ／Ｌを示し、ＣＬＤ９９０のＳＤＳ ＰＡＧＥは１３．２〜１３．７ｇ／Ｌを示した。さらに、ＣＬＤ９７７及びＣＬＤ９９０の（超音波処理後の）総タンパク質生産物は、ほとんど可溶性であった（図８を参照されたい）。β−ラクタマーゼを発現するのに使用した以前のシステム（約０．５〜１ｇ／Ｌの収量）と比較して、大腸菌株でのβ−ラクタマーゼの細胞内発現を利用する本発明の方法は、はるかに優れていることが判明した。ペリプラズムβ−ラクタマーゼ発現を示す先行研究とは対照的に、ペリプラズム領域でβ−ラクタマーゼを発現させる試みは成功せず、生物学的に不活性のβ−ラクタマーゼがもたらされた（実施例３を参照されたい）。
実施例４．ＣＥＮＴＡ法による発酵試料のβ−ラクタマーゼ活性
前述の発酵試料のＰ３Ａβ−ラクタマーゼ活性（実施例２を参照されたい）を、以下に記載のＣＥＮＴＡ法を用いて分析した。本方法の全体を通して、異なる標準物質を用い、以下のように命名する：参照材料（３２ｍｇ／ｍＬ）；標準曲線：１０００倍希釈した参照標準物質（用いた標準物質は、１０００倍ストックから作製した０．６ｍｇ／ｌ、０．８ｍｇ／ｌ、１．０ｍｇ／ｌ、１．５ｍｇ／ｌ、２．０ｍｇ／ｌ及び４．０ｍｇ／ｌ）；対照標準：１ｍｇ／ｌに希釈し、対照として役割を果たす参照標準；１ｍＭ ＣＥＮＴＡストック溶液：５０ｍＭのリン酸二水素ナトリウム５０ｍｌに溶解した２５ｍｇのＣＥＮＴＡラクタマーゼ基質（−２０℃で保存した）；及びＣＥＮＴＡ作業溶液：リン酸二水素ナトリウム２５ｍｌに溶解したＣＥＮＴＡストック溶液３．３４ｍｌ。
ＣＥＮＴＡ法は、β−ラクタマーゼによって容易に加水分解される発色セファロスポリンを使用し、粗抽出物及びクロマトグラフィー画分中の酵素の動態学的研究並びに検出を可能にする（Ｂｅｂｒｏｎｅ，Ｃ．ら、（２００１）Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ，４５（６）１８６８−１８７１）。本方法はまた、ＣＥＮＴＡが市販の薬物であるセファロチンから調製できるので有用である。本研究のために、β−ラクタマーゼ試料の活性を、ＣＥＮＴＡ作業溶液の存在下でＦＦＤＢプレートリーダーを用いて監視した。最初に、β−ラクタマーゼ試料を１ｍｇ／ｌに希釈した（ブラッドフォードアッセイを用いて濃度を決定した）。次いで、各試料５０μＬをこのプレート上に添加し、２０分間、２５℃でインキュベートした。最後に、ＣＥＮＴＡ作業溶液２００μＬを各試料に添加し、この試料を以下のように読み取った：プレートリーダー設定：測定温度＝２５℃；振盪＝遅い；振盪時間＝２秒；測定時間＝６０秒；読み取り回数＝３秒ごと；及び波長＝４０５ｎｍ。
ＣＥＮＴＡの加水分解を、４０５ｎｍでの吸光度変化を連続的に読み取ることによって監視した（排出された発色団の出現）。このアッセイの結果を図９〜１９に示し、表２〜４にまとめた。
ＣＥＮＴＡ実験を３つのアッセイプレートに分けた。アッセイプレート１は、誘導後のＣＬＤ９８１ １２時間、２４時間、４８時間、浸透圧ショック緩衝液１（ＯＳ１）２４時間、及び浸透圧ショック緩衝液２（ＯＳ２）２４時間、並びに誘導後のＣＬＤ９８２ １２時間、２４時間、４８時間、ＯＳ１ ２４時間、及びＯＳ２ ２４時間に相当する。アッセイプレート２は、誘導後のＣＬＤ９８１のＯＳ１ ４８時間及びＯＳ２ ４８時間、並びに誘導後のＣＬＤ９８２のＯＳ１ ４８時間及びＯＳ２ ４８時間に相当する。アッセイプレート３は、誘導後の最後から２番目及び最後の時点の両方（超音波処理）並びに誘導後最後の時点（バグバスター）のＣＬＤ９７７及びＣＬＤ９９０に相当する。ＯＳ１は、２０％スクロースを含有する。ＯＳ１画分の調製後、細胞ペレットを、ＭｇＳＯ４を含有するＯＳ２の調製にまわした。
アッセイプレート１の結果を、図９〜１３及び表２に示す。具体的には、図９は、対照１及び２（対照標準へと組み合わせられる）並びに０．６、０．８、１．０、１．５、２．０、及び４ｍｇ／Ｌの参照標準物質希釈物についての時間（秒）対吸光度の標準曲線を示す。対照１及び２は、重複物として役割を果たす１．０μｇ／ｍＬのプリセット希釈物であった。図１０は、標準濃度（ｍｇ／Ｌ）対エンドポイント吸光度の標準エンドポイント曲線を示す。標準的な吸光度は、時間＝６０秒で測定されたものから時間＝０秒での標準吸光度を差し引いたものであった。具体的には、反応をｔ＝０及び特定の時間間隔の終了時に測定し、ｔ＝０の吸光度値を差し引いてエンドポイント分析を実行した。ベータラクタマーゼの分析については、反応を時間＝６０秒で測定した。吸光度をｔ＝０秒で測定し、それを次いで６０秒の測定値から差し引いた。標準曲線を作成するために、参照標準のいくつかの希釈物を試験した。図１１は、誘導後のＣＬＤ９８１（３／１３Ｃ０３７）１２時間、２４時間、４８時間、及びＯＳ２ ４８時間についての時間（秒）対吸光度の標準曲線を示す。図１２は、ＣＬＤ９８１のＯＳ１試料についての時間（秒）対吸光度の標準エンドポイント曲線を示す。図１３は、誘導後のＣＬＤ９８２（４／１３Ｃ０３８）１２時間、２４時間、４８時間、並びにＯＳ１及びＯＳ２ ４８時間についての時間（秒）対吸光度の標準曲線を示す。表２は、対照１及び２と共に、ＣＬＤ９８１及びＣＬＤ９８２（それぞれ分泌株３７及び３８）についてのアッセイプレート１の活性並びに力価の結果のまとめを示す。
アッセイプレート２の結果を、図１４〜１６及び表３に示す。具体的には、図１４は、対照１及び２（対照標準へと組み合わせられる）並びに０．６、０．８、１．０、１．５、２．０、及び４ｍｇ／Ｌの参照標準物質希釈物についての時間（秒）対吸光度の標準曲線を示す。図１５は、標準濃度（ｍｇ／Ｌ）対エンドポイント吸光度の標準エンドポイント曲線を示す。標準的な吸光度は、時間＝６０秒で測定されたものから時間＝０秒での標準吸光度を差し引いたものであった。図１６は、誘導後のＣＬＤ９８１（３７）及びＣＬＤ９８２（３８）のＯＳ１並びにＯＳ２ ４８時間についての時間（秒）対吸光度の標準曲線を示す。表３は、対照１及び２と共に、ＣＬＤ９８１及びＣＬＤ９８２のＯＳ１並びにＯＳ２についてのアッセイプレート２の活性及び力価の結果のまとめを示す。
アッセイプレート３の結果を、図１７〜１９及び表４に示す。具体的には、図１７は、対照１及び２（対照標準として組み合わせられる）並びに０．６、０．８、１．０、１．５、２．０、及び４ｍｇ／Ｌの参照標準物質希釈物についての時間（秒）対吸光度の標準曲線を示す。図１８は、標準濃度（ｍｇ／Ｌ）対エンドポイント吸光度の標準エンドポイント曲線を示す。標準的な吸光度は、時間＝６０秒で測定されたものから時間＝０秒での標準吸光度を差し引いたものであった。図１９は、誘導後の最後から２番目及び最後の時点の両方（非標識＝超音波処理）並びに誘導後の最後の時点（バグバスター）のＣＬＤ９７７及びＣＬＤ９９０（それぞれ細胞内株３９及び４０）についての時間（秒）対吸光度の標準曲線を示す。表４は、対照１及び２と共に、ＣＬＤ９７７及びＣＬＤ９９０についてのアッセイプレート３の活性並びに力価の結果のまとめを示す。
表２〜４は、具体的には、対照１及び２と比較した、ＣＬＤ９８１、ＣＬＤ９８２、ＣＬＤ９７７、及びＣＬＤ９９０のエンドポイントＯＤ、活性濃度（ｍｇ／Ｌ）、アッセイ希釈、濃度×希釈（ｇ／Ｌ）、全細胞重量（ＷＣＷ（ｇ／Ｌ））、ペリプラズム希釈係数、ｇ／Ｌ Ｐ１Ａ活性ＷＢ力価、推定ｇ／Ｌ Ｐ１Ａ ＷＢ（ＳＤＳ ＰＡＧＥ、ＳＤＳ ＰＡＧＥ Ｐ、及びＳＤＳ ＰＡＧＥ可溶性（該当する場合）による）を示す。
表２．対照１及び２と比較した、異なる時点でのペリプラズム株ＣＬＤ９８１（３７）及びＣＬＤ９８２（３８）のＣＥＮＴＡ法の結果
表３．対照１及び２と比較した、異なる時点でのペリプラズム株ＣＬＤ９８１（３７）及びＣＬＤ９８２（３８）のＣＥＮＴＡ法の結果
表４．対照１及び２と比較した、異なる時点での細胞内株ＣＬＤ９７７（３９）及びＣＬＤ９９０（４０）のＣＥＮＴＡ法の結果
上記に見られるように、細胞内株について、株ＣＬＤ９７７と比較して株ＣＬＤ９９０において若干より高い活性があった。ペリプラズム株については、ＣＬＤ９８１（遺伝子１リーダー）の最高分泌画分は、１．３ｇ／Ｌ（ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる）でＯＳ２画分であり、ＣＬＤ９８２（遺伝子７リーダー）の最高分泌画分は、約１．０ｇ／ＬでＳＮ画分（非プロセス型を含む）であった。最後に、細胞内株については、バグバスター又は超音波処理のいずれかを適用すると、これらの調製物について類似の活性及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果がもたらされることが観察された。
全体として、細胞内活性及びＳＤＳ−ＰＡＧＥの結果は、分泌（ペリプラズム）画分と比較して１０倍超高かった。これは、典型的には、発現タンパク質はペリプラズムから収集されるので、驚くべき結果であった。さらに、細胞内発現は、封入体とは対照的に可溶性画分内でβラクタマーゼを産生した。
実施例５：大規模Ｐ３Ａ（ＳＹＮ−００４）生産
Ｐ３Ａ（ＳＹＮ−００４）のｃＧＭＰ製造を行った。初期の７５０リットルのｃＧＭＰ生産の実行にｐＡＶＥｗａｙ（商標）プラットフォーム（ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｄｉｏｓｙｎｔｈ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、イギリス）を用いた。収量は、５．５キログラムの純度９５％超のＳＹＮ−００４活性医薬成分（ＡＰＩ）原薬であった。ＧＭＰ製造プロセスを十分な評価後に開始し、Ｐ３Ａ（ＳＹＮ−００４）の一貫した生物活性を示す高収量細胞株をもたらした。Ｐ３Ａ（ＳＹＮ−００４）発現力価は、ＳＹＮ−００４の第１世代のものについて以前に用いたバチルスプラットフォーム（枯草菌培養液１リットル当たりおよそ１グラムのＰ１Ａ、実施例１を参照されたい）と比較して、約１５倍超改善された（大腸菌培養液１リットル当たり１４グラムのＰ３Ａ（ＳＹＮ−００４））。単一クロマトグラフィーカラム精製プロセスにより、９５％超の純度レベルで４０〜５０％のＰ３Ａ（ＳＹＮ−００４）原薬が再現的に回収され、これは以前の精製プロセスを上回る別の顕著な製造改善である。
定義
以下の定義は、本明細書に開示する本発明と関連して用いられる。特に定義しない限り、本明細書で用いる全ての技術用語及び科学用語は、本発明が属する当業者が一般的に理解するのと同じ意味を有する。
本明細書で使用される場合、「１つ（ａ）」、「１つ（ａｎ）」、又は「その」は、１又は１より多くを意味し得る。
さらに、参照番号表示と関連して使用される場合、用語「約」は、参照番号表示±その参照番号表示の１０％までを意味する。例えば、言語「約５０」は、４５〜５５の範囲を占める。
医療用途と関連して使用される場合、「有効量」は、関心のある疾患の測定可能な治療、予防又は関心のある疾患の発病率の低下を提供するのに有効な量である。
本明細書で言及されるように、全ての構成比は、特に明記されない限り、全組成物の重量による。本明細書で使用される場合、単語「含む」及びその変形は、リスト中のアイテムの詳述がこの技術の組成物及び方法にも有用であり得る他の類似アイテムを排除しないように限定されないことが意図される。同様に、用語「できる」及び「あってよい」並びにそれらの変形は、一実施形態が特定の要素もしくは特徴を含むことができるか、又は含んでよいという詳述が、それらの要素又は特徴を含まない本技術の他の実施形態を排除しないように限定されないことが意図される。
含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）、含有する、又は有するなどの用語の同義語としてオープンエンド用語「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」は、本発明を記載し、請求するために本明細書で使用されるが、本発明、又はその実施形態は、代替的に「からなる」又は「から実質的になる」などの代替用語を用いて記載されてよい。
本明細書で使用される場合、単語「好ましい」及び「好ましくは」は、特定の状況下で特定の利益をもたらす技術の実施形態を指す。しかし、他の実施形態が、同じ又は他の状況下で好ましい場合もある。さらに、１以上の好ましい実施形態の詳述は、他の実施形態が有用でないことを示すものではなく、本技術の範囲から他の実施形態を排除することを意図しない。
治療効果を達成するのに必要とされる本明細書に記載の組成物の量は、特定の目的の従来手順に従って経験的に決定され得る。一般的に、治療目的の治療薬（例えば、本発明のβラクタマーゼ及び／又は医薬組成物（及び／又は追加の薬剤））の投与では、治療薬は薬理学的有効量で与えられる。「薬理学的有効量」、「薬理学的有効用量」、「治療有効量」、又は「有効量」は、特に障害又は疾患を治療するために、所望の薬理学効果をもたらすのに十分な量又は所望の結果を達成できる量を指す。本明細書で使用される場合、有効量は、例えば、障害もしくは疾患の症状の発症を遅延させる、障害もしくは疾患の症状の経過を変える（例えば、疾患の症状の進行を遅くさせる）、障害もしくは疾患の１以上の症状もしくは徴候を軽減又は排除する、かつ障害もしくは疾患の症状を元に戻すのに十分な量を含む。例えば、ＧＩ管障害（例えば、ＣＤＩ）を患う患者への治療薬の投与は、根底にある状態が根絶又は緩和される場合だけでなく、患者が疾患と関連する症状の重症度又は継続期間における低下を報告する場合に治療上の利点を提供する。治療上の利点は、改善が実現されるか否かにかかわらず、根底にある疾患もしくは障害の進行の停止又は遅延も含む。
有効量、毒性、及び治療有効性は、例えば、ＬＤ５０（集団の約５０％に致命的な用量）及びＥＤ５０（集団の約５０％において治療上有効な用量）を決定するための細胞培養又は実験動物での標準的な医薬手順によって決定できる。投与量は、用いられる剤形及び利用される投与経路に依存して変更できる。毒性と治療効果の間の用量比は、治療指数であり、ＬＤ５０／ＥＤ５０比として表すことができる。いくつかの実施形態において、大きな治療指数を示す組成物及び方法が好ましい。治療有効用量は、例えば、細胞培養アッセイを含むインビトロアッセイから最初に推定できる。また、用量は、細胞培養又は適切な動物モデルで決定されるようなＩＣ５０を含む、循環血漿濃度範囲を達成するために動物モデルにおいて処方できる。血漿における記載の組成物レベルは、例えば、高速液体クロマトグラフィーによって測定できる。任意の特定の投与量の効果は、適切なバイオアッセイによって監視できる。この投与量は、医師が決定し、必要に応じて、観察される治療効果に合わせて調整できる。
特定の実施形態において、効果は、少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約５０％、少なくとも約７０％、又は少なくとも約９０％の定量可能な変化をもたらす。いくつかの実施形態において、効果は、約１０％、約２０％、約３０％、約５０％、約７０％、もしくはさらに約９０％又はそれより大きい定量可能な変化をもたらす。特定の実施形態において、効果は、２倍、又は３倍、又は４倍、又は５倍、又は１０倍の定量可能な変化をもたらす。治療上の利点は、改善が実現されるか否かにかかわらず、根底にある疾患もしくは障害の進行の停止又は遅延、又は毒性の低下も含む。
等価物
本発明をその具体的な実施形態に関連して記載してきたが、本発明はさらなる変更が可能であり、本出願は、一般的に本発明の原理に従い、本発明が属する技術の範囲内の既知の実践もしくは慣例に入り、本明細書に記載の本質的な特徴に適用することができ、添付の特許請求の範囲に従うように本開示からのかかる逸脱を含めて、本発明の任意の変形、使用、又は適応を網羅することが意図されることが理解されるであろう。
当業者なら、日常的な実験をするだけで、本明細書に具体的に記載される具体的な実施形態に対する多数の等価物を認識するか、又は確認することができるであろう。かかる等価物は、以下の特許請求の範囲内に包含されることが意図される。
参照による組み込み
本明細書で参照される全ての特許及び刊行物は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
本明細書で論じられる刊行物は、本出願の出願日前の開示のためにのみ提供される。本発明が先行発明によりかかる刊行物に先行する資格がないことを認めるものとして解釈されるものは何もない。
本明細書で使用される場合、全ての見出しは単なる組織化のためのものであり、いかなる方法でも本開示を限定することを意図するものではない。任意の個々のセクションの内容は、全てのセクションに等しく適用可能であり得る。

Claims (9)

  1. 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのベータラクタマーゼポリペプチドの生産のための方法であって、
    （ａ）前記ベータラクタマーゼポリペプチドをコードする配列を含むベクターで形質転換された宿主大腸菌細胞を提供するステップであって、前記ベクターは、細胞質における前記ベータラクタマーゼポリペプチドの発現を導く、ステップと、
    （ｂ）細胞質における前記ベータラクタマーゼポリペプチドの発現を誘導するために前記大腸菌細胞を培養するステップと、
    （ｃ）前記大腸菌細胞から調製された細胞質可溶性画分から前記ベータラクタマーゼポリペプチドを回収するステップと、
    を含み、
    前記ベータラクタマーゼポリペプチドが、配列番号５と少なくとも９５％の同一性を有するアミノ酸配列を含み、
    前記方法が、培養液１リットル当たり１０グラム超の前記ベータラクタマーゼポリペプチドを産生し、
    細胞質における前記ベータラクタマーゼポリペプチドの発現が、培養液へのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導される、
    方法。
  2. 培養液１リットル当たり１５グラム超の前記ベータラクタマーゼポリペプチドを産生する、請求項１に記載の方法。
  3. 前記大腸菌細胞が、ＢＬ２１（ＤＥ３）又はＷ３１１０から選択される、請求項１または２に記載の方法。
  4. 前記ベータラクタマーゼポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含む、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
  5. 前記ベータラクタマーゼポリペプチドの純度が、少なくとも９５％である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記生産が、パリンドロームＤＮＡループ化を含む発現ベクターの使用を含む、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
  7. 前記生産が、厳しく制御された遺伝子発現に適する発現ベクターの使用を含む、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記生産が、単一クロマトグラフィーカラムステップを含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
  9. 大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）（Ｅ．ｃｏｌｉ）でのベータラクタマーゼポリペプチドの生産のための方法であって、
    （ａ）前記ベータラクタマーゼポリペプチドをコードする配列を含むベクターで形質転換された宿主大腸菌細胞を提供するステップであって、前記ベクターは、細胞質における前記ベータラクタマーゼポリペプチドの発現を導く、ステップと、
    （ｂ）細胞質における前記ベータラクタマーゼポリペプチドの発現を誘導するために前記大腸菌細胞を培養するステップと、
    （ｃ）前記大腸菌細胞から調製された可溶性画分から前記ベータラクタマーゼポリペプチドを回収するステップと、
    を含み、
    前記ベータラクタマーゼポリペプチドが、配列番号５のアミノ酸配列を含み、
    前記方法が、培養液１リットル当たり１５グラム超の前記ベータラクタマーゼポリペプチドを産生し、
    細胞質における前記ベータラクタマーゼポリペプチドの発現が、培養液へのイソプロピルチオガラクトシド（ＩＰＴＧ）の添加によって誘導される、
    方法。
JP2017507851A 2014-08-28 2015-08-27 大腸菌ベースでのベータラクタマーゼ生産 Active JP6803328B2 (ja)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201462043360P 2014-08-28 2014-08-28
US62/043,360 2014-08-28
PCT/US2015/047187 WO2016033327A1 (en) 2014-08-28 2015-08-27 E. coli-based production of beta-lactamase

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2017529833A JP2017529833A (ja) 2017-10-12
JP2017529833A5 JP2017529833A5 (ja) 2018-10-04
JP6803328B2 true JP6803328B2 (ja) 2021-01-06

Family

ID=55400575

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2017507851A Active JP6803328B2 (ja) 2014-08-28 2015-08-27 大腸菌ベースでのベータラクタマーゼ生産

Country Status (7)

Country Link
US (3) US11034966B2 (ja)
EP (1) EP3186379B1 (ja)
JP (1) JP6803328B2 (ja)
CN (1) CN106574273B (ja)
AU (1) AU2015308897B2 (ja)
CA (1) CA2958755C (ja)
WO (1) WO2016033327A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112877307B (zh) * 2021-01-27 2023-10-31 洛阳华荣生物技术有限公司 一种氨基酸脱氢酶突变体及其应用

Family Cites Families (37)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL89987C (ja) 1954-05-29
US2941995A (en) 1957-08-02 1960-06-21 Beecham Res Lab Recovery of solid 6-aminopenicillanic acid
US2982696A (en) 1959-05-01 1961-05-02 Schenley Ind Inc Ion-exchange procedures for the purification of penicillinase
US3070511A (en) 1960-02-10 1962-12-25 Lepetit Spa Process for preparing 6-aminopenicillanic acid
US3150059A (en) 1962-12-26 1964-09-22 Lilly Co Eli Penicillin deacylation via actinoplanaceae fermentation
US3239394A (en) 1964-06-15 1966-03-08 Merck & Co Inc Process for producing 7-amino-cephalosporanic acid
US3499909A (en) 1966-05-18 1970-03-10 Koninklijke Gist Spiritus Process for production of 6-aminopenicillanic acid
US3488729A (en) 1966-08-22 1970-01-06 Lilly Co Eli Cephalothin ester
GB1241844A (en) 1968-08-23 1971-08-04 Beecham Group Ltd Penicillins
FI59265C (fi) 1974-08-13 1981-07-10 Beecham Group Ltd Foerfarande foer framstaellning av 6-aminopenicillansyra
GB1463513A (en) 1974-08-13 1977-02-02 Beecham Group Ltd Enzymes
US4962055A (en) 1983-03-08 1990-10-09 Rikagaku Kenkyusho Plasmid, method for construction of the same, microorganisms carrying the plasmid and method for cultivation of the microorganism
US5190874A (en) 1984-12-28 1993-03-02 Rikagaku Kenkyusho Method for producing penicillinase and xylanase
GB2199582A (en) 1987-01-07 1988-07-13 Bayer Ag Analogues of pancreatic secretory trypsin inhibitor
FR2613624B1 (fr) 1987-04-10 1990-11-23 Roussy Inst Gustave Composition pharmaceutique, administrable par voie orale, destinee a reduire les effets des b-lactamines
CA2007083A1 (en) 1989-01-09 1990-07-09 Nobuhiko Katunuma Pharmaceutical use of trypstatin
CS275231B2 (en) 1989-09-29 1992-02-19 Ustav Makormolekularni Chemie Medicine bottle
GB2253852B (en) 1991-02-26 1995-03-22 Ici Plc Vector for expression of heterologous polypeptide comprising inducible selection system
FI920206A0 (fi) 1992-01-17 1992-01-17 Pekka Untamo Heino Medicinsk anvaendning, medicinskt foerfarande och preparat.
CN1190434A (zh) 1995-07-07 1998-08-12 诺沃挪第克公司 用不能形成芽孢的芽孢杆菌生产蛋白质的方法
GB9715660D0 (en) 1997-07-25 1997-10-01 Zeneca Ltd Proteins
PT1124941E (pt) * 1998-10-28 2004-02-27 Genentech Inc Processo para recuperar polipeptidos heterologos a partir de celulas bacterianas
US7585674B2 (en) 2001-05-29 2009-09-08 Kao Corporation Host microorganisms
FI112666B (fi) 2001-11-06 2003-12-31 Ipsat Therapies Oy Itiöimätön Bacillus subtilis, sen valmistus ja käyttö
FR2843302B1 (fr) 2002-08-09 2004-10-22 Centre Nat Rech Scient Forme galenique pour la delivrance colique de principes actifs
EP1564286A1 (en) 2004-02-11 2005-08-17 Université de Liège Hybrid proteins of beta-lactamase class A
KR100484653B1 (ko) * 2004-05-06 2005-04-20 주식회사 대웅 원핵세포에서 활성형의 가용성 단백질을 제조하는 방법 및 이를 위한 폴리시스트론 벡터
ES2429095T3 (es) 2005-05-18 2013-11-13 Da Volterra Aporte colónico de adsorbentes
WO2007011077A1 (en) 2005-07-15 2007-01-25 Korea Advanced Institute Of Science And Technology Method for extracellular production of target proteins by co-expression of ompf and target proteins
GB0602173D0 (en) * 2006-02-03 2006-03-15 Avecia Ltd Expression system
FI119190B (fi) 2006-06-21 2008-08-29 Ipsat Therapies Oy Modifioitu beta-laktamaasi ja menetelmä sen valmistamiseksi
FI119678B (fi) 2006-11-28 2009-02-13 Ipsat Therapies Oy Beta-laktamaasin käyttö
US20100292185A1 (en) * 2009-05-12 2010-11-18 Burns Christopher J Beta-lactamase inhibitors
FI20105572A0 (fi) 2010-05-24 2010-05-24 Prevab R Lcc Muokattu beeta-laktamaasi ja siihen liittyvät menetelmät ja käytöt
US20150361107A1 (en) * 2014-06-11 2015-12-17 VenatoRx Pharmaceuticals, Inc. Orally bioavailable beta-lactamase inhibitors
WO2016057744A1 (en) 2014-10-08 2016-04-14 Synthetic Biologics, Inc. Beta-lactamase formulations and uses thereof
US9767330B2 (en) 2015-07-16 2017-09-19 Empire Technology Development Llc Distance determination between RFID tags

Also Published As

Publication number Publication date
US20210332373A1 (en) 2021-10-28
AU2015308897B2 (en) 2021-03-04
US20180030458A1 (en) 2018-02-01
AU2015308897A1 (en) 2017-02-02
US11542510B2 (en) 2023-01-03
EP3186379A4 (en) 2018-03-07
CA2958755A1 (en) 2016-03-03
US11981899B2 (en) 2024-05-14
US11034966B2 (en) 2021-06-15
US20230279409A1 (en) 2023-09-07
CN106574273B (zh) 2021-07-02
CA2958755C (en) 2023-02-28
CN106574273A (zh) 2017-04-19
WO2016033327A1 (en) 2016-03-03
EP3186379B1 (en) 2020-04-08
JP2017529833A (ja) 2017-10-12
EP3186379A1 (en) 2017-07-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2678124C2 (ru) Бета-лактамазы с улучшенными свойствами для лечения
JP5827681B2 (ja) 改変型β−ラクタマーゼ並びにそれに関する方法及び使用
Premkumar et al. An unusual halotolerant α-type carbonic anhydrase from the alga Dunaliella salina functionally expressed in Escherichia coli
Unzueta et al. Strategies for the production of difficult-to-express full-length eukaryotic proteins using microbial cell factories: production of human alpha-galactosidase A
US11981899B2 (en) E. coli-based production of beta-lactamase
KR20230022169A (ko) 대장균을 이용한 전장 항체를 생산하는 방법
US20210309984A1 (en) ChiA Enzyme
US20250367269A1 (en) Kynurenine aminotransferase and products thereof for the treatment of arthritic diseases
KR101634078B1 (ko) 봉입체 형성 단백질의 제조방법
JP6845258B6 (ja) ベータ−ラクタマーゼ変異体
JP7223015B2 (ja) β－ラクタマーゼ変異体
Rasyidah et al. Cephalosporin C acylase: important role, obstacles, and strategies to optimize expression in E. coli
Ryu et al. Identification, crystallization and preliminary X-ray diffraction analysis of esterase A from Caulobacter crescentus CB15, a family VIII lipolytic enzyme
Amin et al. Expression of Synthetic pac Gene Encoding Penicillin G Acylase (PGA) Enzyme in E. coli BL21 (DE3) and HB101
Lin Genetic engineering of the industrial fungus Acremonium chrysogenum: in vivo one-step bioconversion from cephalosporin C to 7-aminocephalosporanic acid
HK40097585A (zh) 二肽基肽酶和亮氨酸氨基肽酶多肽变体
CN116622684A (zh) 一种增强活性的胆盐水解酶以及制备与方法和应用
Kuroita et al. Functional similarities of a thermostable protein-disulfide oxidoreductase identified in the archaeon Pyrococcus horikoshii to bacterial DsbA enzymes
Novikov et al. The highly efficient expression of the aspartase gene (L-aspartate ammonia-lyase) in Escherichia coli cells
Ferreira Thiol-Disulphide Oxidoreductases: Production, Purification and Structural Analysis of a Cold Adapted DsbA
HK1233513B (en) Beta-lactamases with improved properties for therapy

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20170316

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20180822

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20180822

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20190626

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20190702

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20191001

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A821

Effective date: 20191002

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20200324

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20200624

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20201110

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20201130

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 6803328

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

S533 Written request for registration of change of name

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R313533

R350 Written notification of registration of transfer

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R350

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250

R250 Receipt of annual fees

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250