JP6803334B2 - 凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する方法 - Google Patents

Description

本特許出願は、２０１４年１２月０２日に大韓民国特許庁に提出された大韓民国特許出願第１０−２０１４−０１７０６０８号に対して優先権を主張し、前記特許出願の開示事項は、本明細書に参照として取り込まれる。

本発明は、生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する方法またはキットに関する。

まず、タンパク質を構成するポリペプチドは、マルチマーを形成して、機能的なタンパク質をなす場合もあるが、正常的な状態では、モノマーとして存在していて、非正常的な状態（例えば、ミスフォールディングに転換）になると、マルチマーを形成して凝集し、疾病を誘発する場合が多い（非特許文献１〜２）。

例えば、タンパク質の非正常的な凝集またはミスフォールディングに係わる疾患または病気は、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、スポンジフォーム脳疾患（Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ）、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、セルピン欠乏症（Ｓｅｒｐｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、肺気腫（ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、第ＩＩ型糖尿病、一次全身性アミロイドーシス、二次全身性アミロイドーシス、前頭側頭葉性痴呆（Ｆｒｏｎｔｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａｓ）、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー（ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、遺伝性大脳アミロイド血管症（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）及び血透析関連アミロイドーシスを含む。

これらの疾患または疾病の有無や進行程度を測定するにあたって、抗原の量が試料中に非常に少ないか、あるいは抗原の大きさが非常に小さくて、測定し難いか、あるいは体中の抗原の量と試料中の抗原の量が比例していない場合に、例えば、アルツハイマー病に関与するＡβ（アミロイド−ベータ）も、正常人に比べ、非正常人はＡβオリゴマーのレベルが高いと知られているが、血液試料内のＡβオリゴマー量の検出が難しいか、血液試料内に非定型的にＡβオリゴマーが存在する場合、診断が困難な場合がある。

また、測定しようとする抗原が小さすぎるか、量が少なくて、ｓａｎｄｗｉｃｈ ＥＬＩＳＡを介しての疾患の診断が容易でない場合がある。

そこで、本発明者らは、患者と正常人間の診断シグナルの違い（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を極大化した凝集形−形成ポリペプチドの凝集形検出方法の開発の必要性を認識した。

本明細書全体にかけて多数の論文及び特許文献が参照され、その引用が表示されている。引用された論文及び特許文献の開示内容は、その全体が本明細書に参照として取り込まれ、本発明の属する技術分野の水準及び本発明の内容がより明確に説明される。

Ｍａｓｓｉｍｏ Ｓｔｅｆａｎｉ， ｅｔ ａｌ．， Ｊ． Ｍｏｌ． Ｍｅｄ． ８１：６７８−６９９（２００３） Ｒａｄｆｏｒｄ ＳＥ， ｅｔ ａｌ．， Ｃｅｌｌ． ９７：２９１−２９８（１９９９）

本発明者らは、凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する新規な方法を開発するために鋭意研究し、その結果、ポリペプチドの凝集形の形成を抑制する防御システム（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）または疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の違いを利用して、患者と正常人間の診断シグナルの違い（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を極大化した凝集形−形成ポリペプチドの凝集形検出方法を開発した。

したがって、本発明の目的は、生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する方法を提供することにある。

本発明の他の目的は、生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出するためのキットを提供することにある。

本発明の他の目的及び利点は、発明の詳細な説明、請求の範囲及び図面により、さらに明確にされる。

本発明の一様態によると、本発明は、以下の段階を含む、生試料の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する方法を提供する：（ａ）分析対象の生試料に（ｉ）凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型、（ｉｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｄｅｌｅｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ａｇｇｒｅｇａｔｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、または（ｉｉｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型と前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体とをスパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）する段階と、（ｂ）前記段階（ａ）の結果物をインキュベーションして前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を追加的に形成する段階（ここで、前記インキュベーションは、前記スパイクした（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）が前記生試料によってマルチマー化できるほど十分な時間行う）と、（ｃ）前記段階（ｂ）の結果物に、前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合する結合剤にシグナル発生標識が結合された結合剤−標識を接触させる段階と、（ｄ）前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合された結合剤−標識から発生するシグナルを検出する段階。

本発明は、ポリペプチドの凝集形の形成を抑制する防御システム（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）または疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の違いを利用して、患者と正常人間の診断シグナルの違い（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を極大化した凝集形−形成ポリペプチドの凝集形検出方法に関する。

本発明の特徴と利点を要約すると以下のようである：
（ａ）本発明は、生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する方法、またはキットを提供する。
（ｂ）本発明の方法は、生試料中の測定しようとする凝集形−形成ポリペプチドの凝集形（抗原）の量が非常に少ないか、その大きさが非常に小さくて、測定することが難しいか、あるいは人体内凝集形−形成ポリペプチドの凝集形（抗原）の量と生試料中の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形（抗原）の量が比例していない場合に、ポリペプチドの凝集形形成を抑制する防御システム（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）、および／または疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の違いを利用して、患者と正常人間の診断シグナルの違い（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を極大化した。
（ｃ）本発明は、便利で迅速な方式で実施することができて、これは、生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する方法の自動化を可能にする。

図１ａは、ｒｅｃ．Ａβ１−４２スパイクした後、４日間インキュベーション時間によるＡβオリゴマーの変化を示す。 図１ｂは、ｒｅｃ．Ａβ１−４２スパイクした後、６日間インキュベーション時間によるＡβオリゴマーの変化を示す。 図１ｃは、ｒｅｃ．Ａβ１−４２スパイクした後、２日、３日、４日、５日間インキュベーション時間によるＡβオリゴマーの変化を示す。 図１ｄは、ｒｅｃ．Ａβ１−４２スパイクした後、５日間インキュベーション、ｒｅｃ．Ａβ１−４２を添加せずに０日、５日間インキュベーション後、Ａβオリゴマーの変化を示す。 図２ａは、ｒｅｃ．Ａβ９−４２ビオチンをスパイクした後、６日間インキュベーション後、Ａβオリゴマーの変化を示す。 図２ｂは、Ａβとバインディングするｒｅｃ．Ａβ９−４２をスパイクした後、２日、３日、４日間インキュベーション後、Ａβオリゴマーの変化を示す。 図３は、組換えα−シヌクレインをスパイクした後、インキュベーション０日、２日、４日、６日間、経時によるα−シヌクレインオリゴマーの変化を示す。

本明細書において、用語‘凝集形−形成ポリペプチド’は、マルチマー型（オリゴマー型）を形成することができるか、モノマーとの疎水性相互作用による凝集形を形成することができるポリペプチドを意味する。特に、下記構造的変化は、様々な疾患を誘発する。例えば、アルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病、スポンジフォーム脳疾患（Ｓｐｏｎｇｉｆｏｒｍ ｅｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｉｅｓ）、パーキンソン病、ハンチントン病、筋萎縮性側索硬化症（Ａｍｙｏｔｒｏｐｈｉｃ ｌａｔｅｒａｌ ｓｃｌｅｒｏｓｉｓ）、セルピン欠乏症（Ｓｅｒｐｉｎ ｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙ）、肺気腫（ｅｍｐｈｙｓｅｍａ）、肝硬変（ｃｉｒｒｈｏｓｉｓ）、第ＩＩ型糖尿病、一次全身性アミロイドーシス、二次全身性アミロイドーシス、前頭側頭葉性痴呆（Ｆｒｏｎｔｏ−ｔｅｍｐｏｒａｌ ｄｅｍｅｎｔｉａｓ）、老人性全身性アミロイドーシス、家族性アミロイドポリニューロパチー（ｆａｍｉｌｉａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ｐｏｌｙｎｅｕｒｏｐａｔｈｙ）、遺伝性大脳アミロイド血管症（ｈｅｒｅｄｉｔａｒｙ ｃｅｒｅｂｒａｌ ａｍｙｌｏｉｄ ａｎｇｉｏｐａｔｈｙ）及び血透析関連アミロイドーシスを含む。

一般に、前記凝集形−形成ポリペプチドの非凝集形は、正常であり、凝集形は、疾患、特にアルツハイマー病、クロイツフェルト−ヤコブ病またはパーキンソン病のような退行性神経疾患を誘発する。

本発明の一具現例によると、前記スパイクした（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）をマルチマー化させる前記生試料は、前記凝集形−形成ポリペプチドのマルチマー型の係わった疾患を有する人間の生試料であり、より好ましくは、前記生試料によってマルチマー化できるほど十分なインキュベーション時間は、凝集形−形成ポリペプチドのマルチマー型の係わった疾患を有する人間の生試料を利用して発生したシグナルを、正常の人間の生試料を利用して発生したシグナルより１．５〜２０倍大きくするに十分な時間である。

以下、生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出するための本発明の方法を段階的に詳細に説明すると、以下のようである。

（ａ）スパイクする段階
まず、本発明の方法は、分析対象の生試料に、（ｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型（オリゴマー型）、（ｉｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｄｅｌｅｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ａｇｇｒｅｇａｔｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、または（ｉｉｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型（オリゴマー型）と前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体とをスパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）する段階を含む。

本明細書において、用語‘生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）’は、分析しようとする有機体由来の試料を意味する。前記生試料は、生物源の細胞、組織、または生体液、または本発明によって分析できる他のミディアム（ｍｅｄｉｕｍ）を意味し、これは、人間から採取した試料、動物から採取した試料、人間または動物のための食品から採取した試料を含む。好ましくは、分析対象の生試料は、血液、血清、血漿、リンパ、牛乳、尿、便、涙、唾液、精液、脳抽出物（例えば、脳均質液）、脊髄液（ＳＣＦ）、虫垂、脾臓、および扁桃組織抽出物を含む、体内流体試料である。より好ましくは、前記生試料は、血液であり、最も好ましくは、血漿である。

本発明の他の具現例によると、前記凝集形−形成ポリペプチドは、アルツハイマー病に関与するＡβペプチドとｔａｕタンパク質、クロイツフェルト−ヤコブ病及びスポンジフォーム脳疾患に関与するプリオン、パーキンソン病に関与するα−シヌクレイン、一次全身性アミロイドーシスに関与するＩｇ軽鎖、二次全身性アミロイドーシスに関与する血清アミロイドＡ、前頭側頭葉性痴呆に関与するｔａｕタンパク質、老人性全身性アミロイドーシスに関与するトランスサイレチン、家族性アミロイドポリニューロパシーに関与するトランスサイレチン、遺伝性大脳アミロイド血管症に関与するシスタチンＣ、血透析関連アミロイドーシスに関与するβ２−マイクログロブリン、ハンチントン病に関与するハンチンチン、筋萎縮性側索硬化症に関与するスーパーオキシドディスムターゼ、セルピン欠乏症、肺気腫、および肝硬変に関与するセルピン、及び第ＩＩ型糖尿病に関与するアミリンを含む。より好ましくは、前記凝集形−形成ポリペプチドは、アルツハイマー病に関与するＡβペプチドまたはｔａｕタンパク質、またはパーキンソン病に関与するα−シヌクレインであり、最も好ましくは、Ａβペプチドまたはα−シヌクレインである。

本明細書において、用語‘スパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）’は、分析対象の生試料に、凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型（またはマルチマー型）および／または凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体を添加、または添加後混合する過程を意味する。

本明細書において、用語‘マルチマー’は、二つ以上のモノマーが結合して形成されるものであって、これはオリゴマーも含む。

本発明によると、分析対象の生試料に（ｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型をスパイクする場合は、凝集形−形成ポリペプチドの凝集形の形成を抑制する防衛システム（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）の違いを利用して、患者と正常人間の診断シグナルの違い（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を極大化する、すなわち患者の生試料は、防衛システム（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）の程度が低く、凝集形−形成ポリペプチドの凝集形形成が促進されるのに対し、正常人の生試料では、防衛システム（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）の程度が高く、凝集形−形成ポリペプチドの凝集形形成が減少され、診断シグナルの違い（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）が極大化される。

本発明のまた他の具現例によると、前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＡβペプチドまたは配列番号２のアミノ酸配列からなるα−シヌクレインである。

本発明によると、分析対象の生試料に（ｉｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｄｅｌｅｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ａｇｇｒｅｇａｔｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）をスパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）する場合は、疎水性（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ）を有するアミノ酸残基を含む凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体と生試料に存在する凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型（オリゴマー型）との疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の違いを利用して、患者と正常人間の診断シグナルの違い（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を極大化する、すなわち患者の生試料に存在する凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型（オリゴマー型）と凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体は、疎水性相互作用によって凝集形を多量形成するが、正常人の生試料に存在する凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型と凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体は、疎水性相互作用によって凝集形を形成してはいるが、患者の場合よりは少なくて、患者と正常人間の診断シグナルの違い（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）が極大化される。

本明細書において、用語‘凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｄｅｌｅｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ａｇｇｒｅｇａｔｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）’は、凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型（オリゴマー型）と疎水性相互作用によって凝集形が形成できるように、凝集形−形成ポリペプチドのアミノ酸配列から、疎水性アミノ酸残基を多数含むように、アミノ酸残基を欠失させた誘導体である。

凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体は、凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型（オリゴマー型）と疎水性相互作用のために、長さ（分子量）および／または疎水性アミノ酸残基を考慮して選択することができ、好ましくは、前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｄｅｌｅｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ａｇｇｒｅｇａｔｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）は、配列番号１のアミノ酸配列の３７番目アミノ酸残基乃至４２番目アミノ酸残基を含むＡβ_{ｄｅｌｅｔｅ}ペプチドであり、より好ましくは、前記Ａβ_{ｄｅｌｅｔｅ}ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の２９番目アミノ酸残基乃至４２番目アミノ酸残基を含むペプチドであって、さらに好ましくは、前記Ａβ_{ｄｅｌｅｔｅ}ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の１７番目アミノ酸残基乃至４２番目アミノ酸残基を含むペプチドであり、最も好ましくは、前記Ａβ_{ｄｅｌｅｔｅ}ペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列の９番目アミノ酸残基乃至４２番目アミノ酸残基を含むペプチドである。

本発明によると、分析対象の生試料に（ｉｉｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型と前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体をスパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）する場合は、上述の（ｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型及び（ｉｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体をそれぞれスパイクして達成される効果を両方とも利用するために、すなわち、ポリペプチドの凝集形形成を抑制する防御システム（ｃｌｅａｒｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ）及び疎水性相互作用（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ）の違いを利用して、患者と正常人間の診断シグナルの違い（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を極大化する。

本発明の他の具現例によると、前記段階（ａ）の結果物に緩衝液をさらに添加する。より好ましくは、前記緩衝液は、生試料に対して３〜１５倍（ｖ／ｖ）に添加され、さらに好ましくは、５〜１３倍（ｖ／ｖ）に添加されて、よりさらに好ましくは、７〜１１倍（ｖ／ｖ）、最も好ましくは、８〜１０倍（ｖ／ｖ）に添加される。

本発明に用いられる緩衝液は、当業界に公知された様々な緩衝液を利用することができるが、好ましくは、前記緩衝液は、非イオン性界面活性剤含有リン酸塩緩衝液である。

本発明に用いられるリン酸塩緩衝液に含有される非イオン性界面活性剤は、当業界に公知された様々な非イオン性界面活性剤を利用することができて、好ましくは、アルコキシル化アルキルエーテル、アルコキシル化アルキルエステル、アルキルポリグリコシド、ポリグリセリルエステル、ポリソルベート類及びシュガーエステルを含む。より好ましくは、Ｔｗｅｅｎ−２０またはＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００が使用されて、最も好ましくは、Ｔｗｅｅｎ−２０が使用される。

（ｂ）凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を追加的に形成させる段階
本発明の方法は、（ｂ）前記段階（ａ）の結果物をインキュベーションし、前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を追加的に形成させる段階を含む。

本発明の最大の特徴の一つは、生試料中の測定しようとする凝集形−形成ポリペプチドの凝集形（抗原）の量が非常に少ないか、その大きさが非常に小さくて、測定することが難しいか、あるいは人体内凝集形−形成ポリペプチドの凝集形（抗原）の量と生試料中の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形（抗原）の量が比例していない場合に、上述の（ｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型、（ｉｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｄｅｌｅｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ａｇｇｒｅｇａｔｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、または（ｉｉｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型と前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体とを生試料にスパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）して、凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を追加的に形成させることにより、疾病または疾患の有無や進行程度を測定することができるということである。

本発明の他の具現例によると、前記段階（ｂ）の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形の追加的な形成は、前記の段階（ａ）の結果物を温度１〜５０℃でインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）して行い、より好ましくは、温度２５〜５０℃でインキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）して行って、さらに好ましくは、温度２５〜４５℃で行い、よりさらに好ましくは、温度２５〜４０℃で行って、最も好ましくは、温度２５〜３８℃で行う。

本発明において、前記段階（ｂ）のインキュベーションは、前記スパイクした（ｉ）、（ｉｉ）または（ｉｉｉ）が前記生試料によってマルチマー化できるほど十分な時間行って、より好ましくは、前記生試料によってマルチマー化できるほど十分なインキュベーション時間は、凝集形−形成ポリペプチドのマルチマー型が関与した疾患を有する人間の生試料を用いて発生した信号を、正常人の生試料を用いて発生したシグナルより１．５〜２０倍大きくするに十分な時間である。

本発明のまた他の具現例によると、患者の生試料を用いて発生された信号が正常人の生試料を用いて発生された信号よりも１．５〜２０倍大きくするに十分な時間実施するための、前記段階（ｂ）の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形の追加的な形成は、前記段階（ａ）の結果物を１日〜１２日間インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）して実施し、好ましくは３０時間（ｈｒ）〜１０日間実施して、より好ましくは２日〜８日間実施し、さらに好ましくは２日〜６日間実施して、よりさらに好ましくは３日〜６日間実施し、最も好ましくは４日〜６日間実施し、さらに最も好ましくは５日〜６日間に実施する。

本明細書において、用語‘インキュベーション’は、分析対象の生試料を所定の温度で一定期間スタンディングすること（ｋｅｐｔ ｔｏ ｓｔａｎｄ）またはシェイク（ｓｈａｋｉｎｇ）することを意味し、シェイクする場合は、好ましくは、マイルドシェイク（ｍｉｌｄｓｈａｋｉｎｇ）することを意味する。

本発明の最大の特徴の他の一つは、生試料を所定の温度で一定期間スタンディング（つまり、インキュベーション）することにより、生試料に存在するスパイクされた凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型（またはマルチマー型）及び／または前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体と凝集形−形成ポリペプチドとが互いによく凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）されるようにして、患者と正常人間の診断シグナルの違い（ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ）を極大化したことである。

（ｃ）前記段階（ｂ）の結果物に前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合する結合剤−標識の接触
本発明の方法は、（ｃ）前記段階（ｂ）の結果物に、前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合する結合剤にシグナル発生標識が結合された結合剤−標識を接触させる段階を経る。

本発明において、前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合する結合剤は、抗体、ペプチドアプタマー、アドネクチン（ＡｄＮｅｃｔｉｎ）、ａｆｆｉｂｏｄｙ（米国特許第５，８３１，０１２号）、Ａｖｉｍｅｒ（Ｓｉｌｖｅｒｍａｎ、Ｊ．ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３（１２）：１５５６（２００５））、またはＫｕｎｉｔｚ ｄｏｍａｉｎ（Ａｒｎｏｕｘ Ｂ ｅｔ ａｌ．、Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．Ｄ Ｂｉｏｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒ．５８（Ｐｔ７）：１２５２４（２００２））、およびＮｉｘｏｎ、ＡＥ、Ｃｕｒｒｅｎｔ ｏｐｉｎｉｏｎ ｉｎ ｄｒｕｇ ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ＆ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ９（２）：２６１８（２００６））である。

本発明において、前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合する結合剤に結合されるシグナル発生標識は、化合物標識（例えば、ビオチン）、酵素標識（例えば、アルカリンホスファターゼ、ペロキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ）、放射能標識（例えば、Ｉ^１２５、及びＣ^１４）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン）、発光標識、化学発光標識、およびＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動； ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識を含むが、これらに限定されるものではない。

（ｄ）前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合された結合剤 − 標識から発生するシグナルの検出
最後に、本発明の方法は、（ｄ）前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合された結合剤−標識から発生するシグナルを検出する段階を含む。

前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合された結合剤−標識から発生するシグナルの検出は、当業界に公知された様々な方法で実施することができ、例えば、抗原−抗体反応に係わる免疫分析法を利用して実施することができる。

本発明のまた他の具現例によると、前記段階（ｃ）及び（ｃ）は、以下の段階を含む方法で実施される：（ｃ−１）前記凝集形を捕獲（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ）する前記凝集形−形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体に、前記段階（ｂ）の結果物を接触させる段階と、（ｃ−２）前記凝集形−形成ポリペプチド上のエピトープを認識する検出抗体に、前記捕獲された凝集形を接触させる段階と、（ｃ−３）凝集形−検出抗体複合体を検出する段階。

このような検出方法は、二つの形態の抗体、すなわち、捕獲抗体及び検出抗体を利用する。本明細書において、用語、‘捕獲抗体’は、生試料から検出しようとする凝集形−形成ポリペプチドに結合できる抗体を意味する。用語、‘検出抗体’は、前記捕獲抗体によって捕獲された凝集形−形成ポリペプチドに結合できる抗体を意味する。‘抗体’は、抗原に結合できる免疫グロブリンタンパク質を意味する。本明細書に利用された抗体は、検出しようとするエピトープ、抗原または抗原断片に結合できる全体抗体だけでなく、抗体断片（例えば、Ｆ（ａｂ’）２、Ｆａｂ’、Ｆａｂ、Ｆｖ）を含む。

前記検出方法は、凝集形−形成ポリペプチド上のエピトープを特異的に認識する一セットの捕獲抗体と検出抗体を利用するものであって、前記捕獲抗体と検出抗体が特異的に認識する前記エピトープは、互いに同一であるか、オーバーラップされている。

捕獲抗体及び検出抗体に対するエピトープを言及しながら使用される用語、‘オーバーラップ（ｏｖｅｒｌａｐｐｅｄ ｗｉｔｈ）’は、完全にまたは部分的にオーバーラップされたアミノ酸配列を含むエピトープを包括する。たとえば、６Ｅ１０およびＷＯ２抗体に対するエピトープは、ヒトＡβペプチド配列のそれぞれ、アミノ酸３−８及び４−１０からなるアミノ酸配列を有して、６Ｅ１０及びＦＦ５１抗体に対するエピトープは、ヒトＡβペプチド配列のそれぞれ、アミノ酸３−８及び１−４からなるアミノ酸配列を有し、１Ｅ１１及びＷＯ２抗体に対するエピトープは、ヒトＡβペプチド配列のそれぞれ、アミノ酸１−８及び４−１０からなるアミノ酸配列を有して、１Ｅ１１及びＦＦ５１抗体に対するエピトープは、ヒトＡβペプチド配列のそれぞれ、アミノ酸１−８及び１−４からなるアミノ酸配列を有する。これらのエピトープは、完全にオーバーラップされたエピトープと説明することができる。

また、３Ｂ６及び３Ｂ６ ｂｉｏｔｉｎ抗体に対するエピトープは、α−シヌクレインタンパク質配列の１１９−１４０からなる配列である。

本発明の他の具現例によると、ヒトＡβペプチド配列を言及しながら表現する場合、前記エピトープは、アミノ酸１−８、３−８、１−４または４−１０からなるアミノ酸配列を有して、α−シヌクレインタンパク質配列を言及しながら表現する場合、前記エピトープは、アミノ酸１１９−１４０からなるアミノ酸配列を有する。

本発明のまた他の具現例によると、前記捕獲抗体が認識するエピトープは、前記凝集形−形成ポリペプチドで繰り返されない配列であり、前記検出抗体が認識するエピトープは、前記凝集形−形成ポリペプチドで繰り返されない配列である。本発明の検出方法によると、捕獲抗体に結合された凝集形−形成ポリペプチドは、検出抗体とそれ以上結合することができず、これは、検出抗体が認識する追加的なエピトープが存在しないからである。

本発明の他の具現例によると、前記捕獲抗体及び検出抗体は、互いに同一である。すなわち、捕獲抗体及び検出抗体に特異的に結合されるエピトープは、同一であることが好ましい。

本発明のまた他の具現例によると、前記捕獲抗体は、固体基質に結合される。このような形態の公知の物質は、ポリスチレン及びポリプロピレン、ガラス、金属、及びゲルのような炭化水素重合体を含む。前記固体基質は、ディップスティック、マイクロタイタープレート、粒子（例えば、ビーズ）、親和性カラム及びイムノブロット膜（例えば、ポリフッ化ビニリデン膜）の形態でありえる（参照：米国特許第５，１４３，８２５号、第５，３７４，５３０号、第４，９０８，３０５号及び第５，４９８，５５１号）。

本発明の他の具現例によると、前記検出抗体は、検出可能な信号を生成させる標識を有する。前記標識は、化合物標識（例えば、ビオチン）、酵素標識（例えば、アルカリンホスファターゼ、ペロキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ及びβ−グルコシダーゼ）、放射能標識（例えば、Ｉ^１２５、及びＣ^１４）、蛍光標識（例えば、フルオレセイン）、発光標識、化学発光標識、およびＦＲＥＴ（蛍光共鳴エネルギー移動； ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ ｒｅｓｏｎａｎｃｅ ｅｎｅｒｇｙ ｔｒａｎｓｆｅｒ）標識を含むが、これらに限定されるものではない。抗体を標識するための様々なカバーおよび方法は、当業界に公知されている（Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、ｅｄｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．）。

本発明において、凝集形−形成ポリペプチドに結合できる抗体を融合方法（Ｋｏｈｌｅｒ ａｎｄ Ｍｉｌｓｔｅｉｎ、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、６：５１１−５１９（１９７６））、組換えＤＮＡ方法（米国特許第４，８１６，５６号）またはファージ抗体ライブラリー（Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ、Ｎａｔｕｒｅ、３５２：６２４−６２８（１９９１）；およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ、Ｊ． Ｍｏｌ。Ｂｉｏｌ．、２２２：５８、１−５９７（１９９１））のような従来技術にしたがって、免疫原として従来に記載されエピトープを利用して準備することができる。前記抗体の製造のための一般的な方法は、Ｈａｒｌｏｗ、Ｅ． ａｎｄ Ｌａｎｅ、Ｄ．、Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９８８；Ｚｏｌａ、Ｈ．、Ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｉｎｃ．、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、１９８４；及びＣｏｌｉｇａｎ、ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＩＭＭＵＮＯＬＯＧＹ、Ｗｉｌｅｙ／ Ｇｒｅｅｎｅ、ＮＹ、１９９１に記載されている。

モノクローナル抗体の製造のためのハイブリドーマ細胞株の準備は、不滅細胞株（ｉｍｍｏｒｔａｌ ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）と抗体を生産するリンパ球の融合で行われる。前記モノクローナル抗体の製造は、当業界に公知された技術を用いて実施することができる。ポリクローナる抗体は、上述の抗原を適切な動物に注入し、抗体を含む抗血清を収集し、公知の親和性技術により抗体を分離する方法によって製造することができる。

凝集形−検出抗体複合体の検出は、当業界に公知の様々な方法で実施することができる。凝集形−検出抗体複合体の形成は、生試料に凝集形の存在を示す。前記段階は、従来の方法にしたがって、例えば、Ｅｎｚｙｍｅ Ｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ、Ｅ． Ｔ． Ｍａｇｇｉｏ、ｅｄ．、ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ、Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ、Ｆｌｏｒｉｄａ、１９８０、及びＨａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ、ｅｄｓ．Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８８）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙに記載されているように、多様な検出可能な標識／基質対を用いて、定量的にまたは定性的に実施することができる。

前記検出抗体をアルカリンホスファターゼで標識する場合は、ブロモクロロインドイルフォスフェート（ＢＣＩＰ）、ニトロブルーテトラゾリウム（ＮＢＴ）及びＥＣＦを、発色反応のための基質として利用することができる。ホースラディッシュペルオキシダーゼで標識する場合は、基質として、クロロナフトール、アミノエチルカルバゾール、ジアミノベンジジン、Ｄ−ルシフェリン、ルシゲニン（ビス−Ｎ−メチルアクリジニウム硝酸塩）、レゾルフィンベンジルエーテル、ルミノール、アンプレックスレッド試薬（１０−アセチル−３，７−ジヒドロキシフェノキサジン）、ＴＭＢ（３，３，５，５−テトラメチルベンジジン）、ＥＣＬ（ｅｎｈａｎｃｅｄ ｃｈｅｍｉｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｃｅ）及びＡＢＴＳ（２，２−アジン−ジ［３−エチルベンゾチアゾリンスルホネート］）などが用いられる。

このような方法で、凝集形−形成ポリペプチドのマルチマー型が関与した疾患を有する人間の生試料を用いて発生された信号を、正常人の生試料を用いて発生された信号よりも１．５〜２０倍大きくすることができ、より好ましくは１．５〜１０倍、より好ましくは１．６倍〜１０倍大きくすることができる。

本発明の他の態様によると、本発明は、以下を含む生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出するためのキットを提供する：（ｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型、（ｉｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体（ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ ｄｅｌｅｔｅｄ ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｏｆ ａｇｇｒｅｇａｔｅ−ｆｏｒｍｉｎｇ ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）、または（ｉｉｉ）前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型と前記凝集形−形成ポリペプチドの疎水性欠失体。

本発明のキットは、上述の本発明の生試料（ｂｉｏｓａｍｐｌｅ）の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する方法を利用するものであって、その共通する内容は、本明細書の過度なる複雑性を避けるために、その記載を省く。

本発明の他の具現例によると、前記キットは、凝集形−形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体と前記捕獲抗体が認識する前記エピトープを認識する検出抗体とをさらに含む。

以下、実施例を通じて本発明をさらに詳細に説明するが、これら実施例は、本発明をより具体的に説明するためのものであって、本発明の範囲がこれら実施例に限定されないことは、本発明の属する技術分野で通常の知識を有する者にとっては自明なことであろう。

実施例１：実験材料の準備
コーティングバッファー（Ｃａｒｂｏｎａｔｅ−Ｂｉｃａｒｂｏｎａｔｅ Ｂｕｆｆｅｒ）、ＰＢＳＴ、ＴＢＳＴ及びＰＢＳは、Ｓｉｇｍａ社から購入した。Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅは、Ｂｉｏ−ｒａｄ社から購入した。バッファＡは、ＴＢＳＴにＢｌｏｃｋ Ａｃｅを０．４％に希釈して製造した。ブロッキング（ｂｌｏｃｋｉｎｇ）バッファは、Ｄ．Ｗに１％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅが希釈されるように製造した。６Ｅ１０抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入した。３Ｂ６抗体は、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社から購入した。３Ｂ６−ｂｉｏｔｉｎ抗体は、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ社から購入した抗体をＰｅｏｐｌｅｂｉｏ社でビオチン化（ｂｉｏｔｉｎｙｌａｔｉｏｎ）した。ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰは、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社から購入した。ＨＢＲ１は、Ｓｃａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ社から購入した。ＦＦ５１−ＨＲＰは、（株）Ｔｈｅ Ｈ ｌａｂから購入した。組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）Ａβ１−４２は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入した。組換えＡβ９−４２ ｂｉｏｔｉｎは、Ａｎａｓｐｅｃ社から購入した。組換えＡβ９−４２は、Ａｎａｓｐｅｃ社から購入した。組換えα−シヌクレインは、Ｍｉｌｉｐｏｒｅ社から購入した。血漿（ｐｌａｓｍａ）サンプルは、ブンダンソウル大学病院及び中央大学病院から入手した。ＥＣＬ溶液は、Ｒｏｃｋｌａｎｄ社から購入した。プレートは、Ｎｕｎｃ社から購入した。６Ｅ１０及びＦＦ５１抗体に対するエピトープは、ヒトＡβペプチド配列のそれぞれ、アミノ酸３−８と１−４からなるアミノ酸配列を有する。３Ｂ６及び３Ｂ６ ｂｉｏｔｉｎ抗体に対するエピトープは、α−シヌクレインタンパク質配列の１１９−１４０からなる配列である。

実施例２：６Ｅ１０プレートの製造
６Ｅ１０抗体（抗Ａβタンパク質、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）３０μｇをコーティングバッファー（ｓｉｇｍａ）１０ｍｌに希釈して、プレート（Ｎｕｎｃ）に１００μｌを各ウェルに分注した後、４℃の冷蔵庫で一日間反応した。前記プレートをＰＢＳで３回洗浄し、Ｄ．Ｗに１％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅが溶いてあるブロッキングバッファー２４０μｌを分注した後、室温で２時間反応した。前記プレートは、ＰＢＳで３回洗浄し、室温で３０分間乾燥した後、使用した。

実施例３：３Ｂ６プレートの製造
３Ｂ６抗体（抗α−シヌクレインタンパク質、Ｎｏｖｕｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ）２０μｇをコーティングバッファー（ｓｉｇｍａ）１０ｍｌに希釈して、プレート（Ｎｕｎｃ）に１００μｌを各ウェルに分注後、４℃の冷蔵庫で一日間反応した。前記プレートをＰＢＳで３回洗浄し、Ｄ．Ｗに１％Ｂｌｏｃｋ Ａｃｅが溶いてあるブロッキングバッファー２４０μｌを分注した後、室温で２時間反応した。前記プレートは、ＰＢＳで３回洗浄し、室温で３０分間乾燥した後、使用した。

実施例４：対照群の準備
陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）は、組換えＡβ１−４２（ｒｅｃ．Ａβ）（１μｇ／ｍｌ）１０μｌにＰＢＳＴ９９０μｌを添加し、１００μｌを使用した。陽性対照群（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）は、組換えα−シヌクレイン（１ｍｇ／ｍｌ）１０μｌにＰＢＳＴ９９０μｌを添加し、１００μｌを使用した。陰性対照群（ｎｅｇａｔｉｖｅ ｃｏｎｔｒｏｌ）は、ＰＢＳ１００μｌを使用した。

実施例５：サンプルの準備
サンプルは、２サンプルを基準にして準備した。凍結された血漿サンプルを、３７℃ヒートブロック（ｈｅａｔ ｂｌｏｃｋ）に１５分間解かした後、３０秒間ボルテックス（ｖｏｒｔｅｘｉｎｇ）後使用した。ｒｅｃ．Ａβ１−４２ １ｎｇがスパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）されたサンプルは、血漿２０μｌにＨＢＲ１（０．１２３ｍｇ／ｍｌ）８．０８μｌとＰＢＳＴ １８０μｌ、ｒｅｃ．Ａβ１−４２（１ｎｇ／１０μｌ）２０μｌを混合して、全体２２８．０８μｌになるように準備した。ｒｅｃ．Ａβ９−４２ビオチン １ｎｇがスパイクされたサンプルは、血漿２０μｌにＨＢＲ１（０．１２３ｍｇ／ｍｌ）８．０８μｌとＰＢＳＴ １８０μｌ、ｒｅｃ．Ａβ９−４２ビオチン（１ｎｇ／１０μｌ）２０μｌを混合して、全体２２８．０８μｌになるように準備した。ｒｅｃ．Ａβ９−４２ １ｎｇがスパイクされたサンプルは、血漿２０μｌにＨＢＲ１（０．１２３ｍｇ／ｍｌ）８．０８μｌとＰＢＳＴ １８０μｌ、ｒｅｃ．Ａβ９−４２（１ｎｇ／１０μｌ）２０μｌを混合して、全体２２８．０８μｌになるように準備した。組換えα−シヌクレイン１μｇがスパイクされたサンプルは、血漿２０μｌにＨＢＲ１（０．１２３ｍｇ／ｍｌ）８．０８μｌとＰＢＳＴ １８０μｌ、組換えα−シヌクレイン（１μｇ／１０μｌ）２０μｌを混合して、全体２２８．０８μｌになるように準備した。また、組換えペプチドをスパイクしなかったサンプルは、血漿２０μｌにＨＢＲ１（０．１２３ｍｇ／ｍｌ）８．０８μｌとＰＢＳＴ ２００μｌを混合して、全体２２８．０８μｌになるように準備した。

実施例６：インキュベーション（ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ）
前記実施例５でｒｅｃ．Ａβ１−４２を処理して用意したサンプルは、３７℃のインキュベーターで各４日と６日間インキュベーションした。前記実施例５でｒｅｃ．Ａβ１−４２を処理して用意したサンプルは、３７℃インキュベーターで各２日、３日、４日、５日間インキュベーションした。ｒｅｃ．Ａβ１−４２を処理しなかったサンプルは、３７℃インキュベーターで各０日、５日間インキュベーションした。そして、前記実施例５でｒｅｃ．Ａβ９−４２ビオチンを処理して用意したサンプルは、６日間インキュベーションした。前記実施例５でｒｅｃ．Ａβ９−４２を処理して用意したサンプルは、各２日、３日、４日間インキュベーションした。また、前記実施例５で組換えα−シヌクレインを処理して用意したサンプルは、各０日、２日、４日、６日インキュベーションした。

実施例７：ｒｅｃ．Ａβ１−４２を処理した後、４日と６日間インキュベーションしたサンプルから、ＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いてのＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）の検出
６Ｅ１０コーティングプレート（３μｇ／ｍｌ）に、陽性対照群、陰性対照群及びｒｅｃ．Ａβ１−４２を処理して４日と６日間インキュベーションしたサンプルを、それぞれ１００μｌずつ分注した後、室温で１時間反応した。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＦＦ５１−ＨＲＰ抗体を、バッファＡに１／１０００希釈して１００μｌずつ分注した後、室温で１時間反応した。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ溶液を１００μｌ分注した。ＥＣＬと反応したプレートは、ルミノメーター機器（ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）に挿入し、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）シグナルを測定した。その結果は、下記図１ａのようである。

図１ａ及び１ｂは、ｒｅｃ．Ａβ１−４２添加後、インキュベーション時間によって、ＡＤサンプルのシグナルがＮｏｎ ＡＤサンプルのシグナルに比べて増加していることを示している。４日と６日間インキュベーションされた各条件において、ＡＤとＮｏｎ ＡＤ間の差を示す。

図１ａ及び１ｂからみて、Ｎｏｎ ＡＤ患者サンプルと比較時、ＡＤ患者のサンプルにおけるＡβオリゴマーのシグナルが高く出るのは、ＡＤ患者サンプルにおいて、Ａβオリゴマーの形成を抑制させる防御システムが、Ｎｏｎ ＡＤ患者ほど活性化しないからであると判断される。

実施例８：ｒｅｃ．Ａβ１−４２を処理した後、各２日、３日、４日、５日間インキュベーションしたサンプルから、ＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いてのＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）の検出
６Ｅ１０コーティングプレート（３μｇ／ｍｌ）に、陽性対照群、陰性対照群及びｒｅｃ．Ａβ１−４２を処理して各２日、３日、４日、５日間インキュベーションしたサンプルをそれぞれ１００μｌずつ分注した後、２７℃インキュベーターで静置状態で１時間反応した。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＦＦ５１−ＨＲＰ抗体をバッファＡに１０ｎｇ／ｍｌになるように製造後、１００μｌずつ分注した。前記プレートを２７℃インキュベーターで静置状態で１時間反応し、ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ溶液を１００μｌ分注した。ＥＣＬと反応したプレートは、ルミノメーター機器（ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）に挿入し、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）シグナルを測定した。その結果は、下記図１ｃのようである。

図１ｃは、ｒｅｃ．Ａβ１−４２添加後、２日、３日、４日、５日間インキュベーション時間によって、ＡＤサンプルのシグナルがＮｏｎ ＡＤサンプルのシグナルに比べて１．１５倍、１．３４倍、１．６５倍、１．８４倍に増加していることを示している。インキュベーション日数が増えるにつれて、ＡＤとＮｏｎ ＡＤ間に差がますます広がることを示す。

図１ｃからみて、Ｎｏｎ ＡＤ患者サンプルと比較時、ＡＤ患者のサンプルにおけるＡβオリゴマーのシグナルが高く出たのは、ＡＤ患者サンプルにおいて、Ａβオリゴマーの形成を抑制させる防御システムが、Ｎｏｎ ＡＤ患者ほど活性化しないからであると判断される。

実施例９：ｒｅｃ．Ａβ１−４２を処理して５日間、ｒｅｃ．Ａβ１−４２を無処理して０日、５日間インキュベーションしたサンプルから、ＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いてのＡβオリゴマー（ｏｌｉｇｏｍｅｒ）の検出
６Ｅ１０コーティングプレート（３μｇ／ｍｌ）に、陽性対照群、陰性対照群及びｒｅｃ．Ａβ１−４２を処理して５日間、ｒｅｃ．Ａβ１−４２を無処理して各０日、５日間インキュベーションしたサンプルをそれぞれ１００μｌずつ分注した後、２７℃インキュベーターで静置状態で１時間反応した。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＦＦ５１−ＨＲＰ抗体をバッファＡに１０ｎｇ／ｍｌになるように製造後、１００μｌずつ分注した。前記プレートを２７℃インキュベーターで静置状態で１時間反応し、ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ溶液を１００μｌ分注した。ＥＣＬと反応したプレートは、ルミノメーター機器（ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）に挿入し、発光（ｌｕｍｉｎｅｓｃｅｎｔ）シグナルを測定した。その結果は、下記図１ｄのようである。

図１ｄは、ｒｅｃ．Ａβ１−４２添加後５日間インキュベーション、ｒｅｃ．Ａβ１−４２を添加せずに０日、５日間インキュベーションしたサンプルからＡβオリゴマーを測定したデータであって、Ａβ１−４２をスパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）した時とスパイクしなかった時、経時によるＡＤサンプルのシグナルとＮｏｎ ＡＤサンプルのシグナルの増加状態を示したもので、ｒｅｃ．Ａβ１−４２添加後５日間インキュベーションしたサンプルでのみ、ＡＤとＮｏｎ ＡＤ間に差を示す。

図１ｄからみて、ＡＤ患者のサンプルからＡβオリゴマーのシグナルが高く出るのは、ＡＤ患者のサンプルにおいて、Ａβオリゴマーの形成を抑制させる防御システムが、Ｎｏｎ ＡＤ患者ほど活性化しないからであると判断されて、Ａβ１−４２をスパイクしたとき、Ａβオリゴマーの形成を抑制させる防御システムに対する効果を示すと判断される。

実施例１０：ｒｅｃ．Ａβ９−４２ビオチンを処理した後、６日間インキュベーションしたサンプルから、ＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いてのＡβオリゴマーの検出
６Ｅ１０コーティングプレート（３μｇ／ｍｌ）に、陽性対照群、陰性対照群、ｒｅｃ．Ａβ９−４２ビオチンを処理して６日間インキュベーションしたサンプルをそれぞれ１００μｌずつ分注した後、室温で１時間反応した。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＦＦ５１−ＨＲＰ抗体をバッファＡに１／１０００希釈し、１００μｌずつ分注した後、室温で１時間反応した。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ溶液を１００μｌ分注した。ＥＣＬと反応したプレートは、ルミノメーター機器（ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）に挿入し、発光シグナルを測定して、その結果は、下記図２ａにまとめた。

図２ａは、Ａβとバインディングするｒｅｃ．Ａβ９−４２ビオチンをスパイクして、６日間インキュベーションしたとき、ＡＤ患者群のシグナルが正常群のシグナルより高いことを示す。

図２ａからみて、ｒｅｃ．Ａβ９−４２ビオチンがＡβにバインディングして凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を促進し、抗原の量的な部分と大きさ的な部分の変化によって区分がされると判断された。

実施例１１：ｒｅｃ．Ａβ９−４２ビオチンを処理した後、２日、３日、４日間インキュベーションしたサンプルから、ＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いてのＡβオリゴマーの検出
６Ｅ１０コーティングプレート（３μｇ／ｍｌ）に、陽性対照群、陰性対照群、ｒｅｃ．Ａβ９−４２を処理して２日、３日、４日間インキュベーションしたサンプルをそれぞれ１００μｌずつ分注した後、２７℃インキュベーターで静置状態で１時間反応した。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、ＦＦ５１−ＨＲＰ抗体をバッファＡに１０ｎｇ／ｍｌになるようにように製造後、１００μｌずつ分注した。前記プレートを２７℃インキュベーターで静置状態で１時間反応し、ＴＢＳＴで３回洗浄した後、ＥＣＬ溶液を１００μｌ分注した。ＥＣＬと反応したプレートは、ルミノメーター機器（ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）に挿入し、発光シグナルを測定して、その結果は、下記図２ｂにまとめた。

図２ｂは、Ａβとバインディングするｒｅｃ．Ａβ９−４２をスパイクし、２日、３日、４日間インキュベーションしたとき、経時によって、ＡＤ患者群のシグナルが、正常群のシグナルより、１．１倍、１．５２倍、１．８４倍高まることを示す。

図２ｂからみて、ｒｅｃ．Ａβ９−４２ビオチンがＡβにバインディングして凝集（ａｇｇｒｅｇａｔｉｏｎ）を促進し、抗原の量的な部分と大きさ的な部分の変化によって、区別がされると判断された。

実施例１２：組換えα−シヌクレインを処理した後、０日、２日、４日、６日間インキュベーションしたサンプルから、ＭＤＳ（ｍｕｌｔｉｍｅｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ）を用いてのα−シヌクレインオリゴマーの検出
３Ｂ６コーティングプレート（２μｇ／ｍｌ）に、陽性対照群、陰性対照群、組換えα−シヌクレインを処理して０日、２日、４日、６日間インキュベーションしたサンプルを、それぞれ１００μｌずつ分注した後、２７℃インキュベーターで静置状態で１時間反応した。前記プレートをＴＢＳＴで３回洗浄し、３Ｂ６−ｂｉｏｔｉｎ抗体をバッファＡに２μｇ／ｍｌになるように製造した後、１００μｌずつ分注した。前記プレートを２７℃インキュベーターで静置状態で１時間反応し、ＴＢＳＴで３回洗浄した。ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−ＨＲＰをバッファＡに１／５０００倍に希釈し、１００μｌずつ分注した後、前記プレートを２７℃インキュベーターで静置状態で１時間反応し、ＴＢＳＴで３回洗浄した。 ＥＣＬ溶液を１００μｌ分注した。ＥＣＬと反応したプレートは、ルミノメーター機器（ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ）に挿入し、発光シグナルを測定して、その結果は、下記図３にまとめた。

図３は、組換えα−シヌクレインを添加した後、インキュベーション０日、２日、４日、６日間、経時によって、ＰＤサンプルのシグナルとＮｏｎ ＰＤサンプルのシグナルの変化を示したデータであって、０日のとき、Ｎｏｎ ＰＤシグナルに対し、ＰＤサンプルのシグナルｒａｔｉｏが０．９２倍を示していたものが、２日、４日、６日間インキュベーション時、１．３４倍、１．７６倍、１．７８倍に増加していることを示した。

図３からみて、Ｎｏｎ ＰＤ患者のサンプルと比較時、ＰＤ患者のサンプルからα−シヌクレインのシグナルが高く出たのは、ＰＤ患者サンプルにおいて、α−シヌクレインオリゴマーの形成を抑制させる防御システムが、Ｎｏｎ ＰＤ患者ほど活性化しないからであると判断される。

以上、本発明の特定な部分を詳細に記述したが、当業界の通常の知識を有する者にとっては、このような具体的な記述はただ望ましい具現例に過ぎなく、これに本発明の範囲が限定されないことは明らかである。従って、本発明の実質的な範囲は、添付の請求項とその等価物により定義されると言える。

Claims (26)

1. （ａ）分析対象の血液試料に凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型をスパイク（ｓｐｉｋｉｎｇ）する段階と、
   （ｂ）前記段階（ａ）の結果物をインキュベーションして前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を追加的に形成する段階と、
   （ｃ）前記段階（ｂ）の結果物に、前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合する結合剤にシグナル発生標識が結合された結合剤−標識を接触させる段階と、
   （ｄ）前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合された結合剤−標識から発生するシグナルを検出する段階と、
   を含み、
   前記段階（ｂ）のインキュベーションは、前記スパイクした凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型が前記血液試料によってマルチマー化できるほど十分な時間行う、血液試料中の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する方法。
2. 前記スパイクした凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型をマルチマー化させる前記血液試料は、前記凝集形−形成ポリペプチドのマルチマー型の係わった疾患を有する人間の血液試料であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記血液試料によってマルチマー化できるほど十分なインキュベーション時間は、凝集形−形成ポリペプチドのマルチマー型の係わった疾患を有する人間の血液試料を利用して発生したシグナルを、正常の人間の血液試料を利用して発生したシグナルより１．５〜２０倍大きくするのに十分な時間であることを特徴とする、請求項２に記載の方法。
4. 前記血液試料は、血漿であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
5. 前記凝集形−形成ポリペプチドは、Ａβペプチド、ｔａｕタンパク質、プリオン、α−シヌクレイン、Ｉｇ軽鎖、血清アミロイドＡ、トランスサイレチン、シスタチンＣ、β２−マイクログロブリン、ハンチンチン、スーパーオキシドディスムターゼ、セルピン及びアミリンからなる群から選択されたことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
6. 前記凝集形−形成ポリペプチドは、Ａβペプチド、ｔａｕタンパク質またはα−シヌクレインであることを特徴とする、請求項５に記載の方法。
7. 前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＡβペプチドまたは配列番号２のアミノ酸配列からなるα−シヌクレインであることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
8. 前記段階（ａ）の結果物に緩衝液をさらに添加することを特徴とする、請求項１に記載の方法。
9. 前記緩衝液は、血液試料に対して３〜１５倍（ｖ／ｖ）の量で添加されることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
10. 前記緩衝液は、非イオン性界面活性剤含有リン酸塩緩衝液であることを特徴とする、請求項８に記載の方法。
11. 前記段階（ｂ）の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形の追加的な形成は、前記段階（ａ）の結果物を温度１〜５０℃でインキュベーションして行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
12. 前記段階（ｂ）の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形の追加的な形成は、前記段階（ａ）の結果物を１日〜１２日間インキュベーションして行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
13. 前記段階（ｃ）及び（ｄ）は、
    （ｃ−１）前記凝集形を捕獲（ｃａｐｔｕｒｉｎｇ）する前記凝集形−形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体に、前記段階（ｂ）の結果物を接触させる段階と、
    （ｃ−２）前記凝集形−形成ポリペプチド上のエピトープを認識する検出抗体に、前記捕獲された凝集形を接触させる段階と、
    （ｃ−３）凝集形−検出抗体複合体を検出する段階と、
    を含む方法で行うことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
14. 前記検出抗体は、前記段階（ｃ−１）のエピトープと同一なまたはオーバーラップされたエピトープを認識する検出抗体であることを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
15. 前記捕獲抗体は、固体基質に結合されたことを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
16. 前記検出抗体は、検出可能な信号を生成させる標識を有することを特徴とする、請求項１３に記載の方法。
17. 前記検出抗体に結合された標識は、化合物標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識又はＦＲＥＴ標識であることを特徴とする、請求項１６に記載の方法。
18. 血液試料中の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出するためのキットであって、
    凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型またはマルチマー型と、
    前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合する結合剤にシグナル発生標識が結合された結合剤−標識とを含み、
    前記凝集形−形成ポリペプチドのモノマー型は、配列番号１のアミノ酸配列からなるＡβペプチドであり、
    前記凝集形−形成ポリペプチドの凝集形に結合された結合剤−標識から発生するシグナルを検出することにより、血液試料中の凝集形−形成ポリペプチドの凝集形を検出する、キット。
19. 前記血液試料は、血漿であることを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
20. 前記キットは、緩衝液をさらに含むことを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
21. 前記緩衝液は、非イオン性界面活性剤含有リン酸塩緩衝液であることを特徴とする、請求項２０に記載のキット。
22. 前記キットは、凝集形−形成ポリペプチド上のエピトープを認識する捕獲抗体と、前記捕獲抗体が認識する前記エピトープを認識する検出抗体とをさらに含むことを特徴とする、請求項１８に記載のキット。
23. 前記検出抗体は、前記捕獲抗体が認識する前記エピトープと同一なまたはオーバーラップされたエピトープを認識する検出抗体であることを特徴とする、請求項２２に記載のキット。
24. 前記捕獲抗体は、固体基質に結合されたことを特徴とする、請求項２２に記載のキット。
25. 前記検出抗体は、検出可能な信号を生成させる標識を有することを特徴とする、請求項２２に記載のキット。
26. 前記検出抗体に結合された標識は、化合物標識、酵素標識、放射能標識、蛍光標識、発光標識、化学発光標識又はＦＲＥＴ標識であることを特徴とする、請求項２５に記載のキット。