JP6826571B2 - 癌キラー細胞の殺害能を増加させる癌治療用組換えタンパク質及びその用途 - Google Patents

Description

本発明は、癌キラー細胞の殺害能を増加させる治療用組換えタンパク質、または組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞に関する。また、前記組換えタンパク質または組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞を含む薬学的組成物に関する。さらに、組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞の製造方法に関する。

癌免疫治療は、重要な臨床の発展につながり、癌の管理のための新しい方法を提供した。癌免疫治療に対する一つの新しい接近法は、ＰＤ−１（ｐｒｏｇｒａｍｍｅｄ ｄｅａｔｈ−１）または細胞毒性Ｔリンパ球抗原４（ＣＴＬＡ４；ｃｙｔｏｔｏｘｉｃ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ ４）のようなチェックポイントタンパク質を標的とすることによって腫瘍浸透リンパ球（ＴＩＬ；ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ）の再活性化を行うことであるが、反応効率が低いという欠点がある。

他の接近法は、「ｃａｎｃｅｒ ｈｕｎｔｅｒ ｃｅｌｌ」であって、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ；ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を装着したＴまたはナチュラルキラー（ＮＫ）細胞を用いることであるが、これは、免疫攻撃から保護し得る強い免疫抑制性腫瘍微小環境のため固形癌に用いることができないという問題があった。したがって、再活性化されたＴＩＬまたはＣＡＲ−装着されたＴ細胞及びＮＫ細胞の抗腫瘍活性を強化するための新しい戦略を発展させるために多くの研究が行われている。

免疫シナプス（ＩＳ；ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ）は、Ｔ細胞と適切なペプチド／ＭＨＣ複合体を提示する抗原提示細胞（ＡＰＣ；ａｎｔｉｇｅｎ−ｐｒｅｓｅｎｔｉｎｇ ｃｅｌｌ）との間の界面で形成される多重−分子機能性構造である。Ｔ細胞の１次信号であるＴＣＲの刺激は、ＩＳの最外側のｄｉｓｔａｌ−ＳＭＡＣ（ｄ−ＳＭＡＣ）でアクチン重合を起こすものと知られているが、２次信号である補助刺激（ｃｏｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ）信号がない場合には、大規模の十分なアクチン重合反応がｄ−ＳＭＡＣで起こらないため、完全なＴ細胞活性化を引き起こすことが不可能であると知られている（Ｒａｄｖａｎｙｉ，Ｌ．Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １５６，１７８８−１７９８（１９９６），Ｓａｍｓｔａｇ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｌｅｕｋｏｃｙｔｅ ｂｉｏｌｏｇｙ ７３，３０−４８（２００３））。興味深いことに、固形癌（ｓｏｌｉｄ ｔｕｍｏｒ）のような場合には、２次補助刺激が抑制されている微小環境を有しているため、たとえ細胞キラーＴ細胞が腫瘍部位に浸透するとしても腫瘍殺害機能を十分に奏することができないという問題を有している。したがって、免疫シナプスにおいて細胞キラーＴ細胞のアクチンの重合反応を調節することは、腫瘍微小環境で免疫抑制環境を克服し、不十分な２次補助刺激信号を克服できる新しい方法を開いてくれるということを提示した。そこで、本発明者らは、免疫シナプスでアクチン重合の調節を用いることで、チェックポイント遮断を適用する免疫治療、ＣＡＲ−Ｔ及びＮＫ細胞治療の限界を克服しようとした。

このような背景下で、本発明者らは、免疫シナプスでアクチン重合を調節する技術を開発するために鋭意努力した結果、ＴＡＧＬＮ２という２２−ＫＤａの相対的に小さいアクチン結合タンパク質が、Ｔ細胞抗原受容体（ＴＣＲ）の刺激によって免疫シナプスで重合されるアクチンを安定化させることができることを見出し、Ｔ細胞でＴＡＧＬＮ２を過剰発現させるための組換えタンパク質を製造するか、またはこれを細胞で安定的に発現させることができるレトロウイルスベクターを作製し、前記ＴＡＧＬＮ２組換えタンパク質やＴＡＧＬＮ２の遺伝子コードを含んでいるレトロウイルスが導入された細胞キラーＴ細胞が、腫瘍細胞株に対して付着能に優れることを確認し、なお、サイトカイン放出能及び細胞毒性にも優れることを確認し、マウスを用いた生体固形癌モデルにおいて腫瘍の成長を明らかに減らす効果が立証されることを見出し、本発明を完成した。

本発明の一つの目的は、癌キラー細胞に搭載されて癌キラー細胞の殺害能を増加させることができる配列番号１のアミノ酸で構成された、癌治療用組換えタンパク質を提供することである。

本発明の他の目的は、前記組換えタンパク質を含む、組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞を提供することである。

本発明の更に他の目的は、ｉ）癌キラー細胞に搭載されて癌キラー細胞の殺害能を増加させることができる配列番号１のアミノ酸で構成された、癌治療用組換えタンパク質；ｉｉ）前記ｉ）タンパク質にＰＴＤがさらに融合されたものである組換えタンパク質；またはｉｉｉ）前記組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞を含む、癌治療用薬学的組成物を提供することである。

本発明の更に他の目的は、前記組成物を薬学的に有用な量でヒトを除いた癌の疑いのある個体に投与するステップを含む癌治療方法を提供することである。

本発明の更に他の目的は、（ａ）配列番号１のアミノ酸にＰＴＤを融合するステップと；（ｂ）前記（ａ）ステップの融合されたタンパク質を癌キラー細胞に導入するステップとを含む、組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞の製造方法を提供することである。

本発明の更に他の目的は、配列番号１のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含むレトロウイルスで癌キラー細胞に形質導入するステップを含む、組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞の製造方法を提供することである。

上記目的を達成するための本発明の一つの態様は、癌キラー細胞に搭載されて癌キラー細胞の殺害能を増加させることができる配列番号１のアミノ酸で構成された、癌治療用組換えタンパク質を提供することである。

また、前記組換えタンパク質は、ＰＴＤがさらに融合されたものであり得、具体的には、ＰＴＤの融合は、ペプチドリンカーまたは直接融合によるものであってもよい。前記配列番号１のタンパク質、ＰＴＤタンパク質、及びこれをコードする遺伝子の具体的な塩基配列は、ＮＣＢＩのＧｅｎｅＢａｎｋなどの公知のデータベースから得ることができる。

本発明の組換えタンパク質は、Ｔ細胞抗原受容体の刺激によって免疫シナプスで重合されるアクチンを安定化させることができるか、または前記組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞がＩＣＡＭ−１と相互作用して細胞毒性Ｔ細胞と癌細胞との付着性を増加させる活性を有する以上、前記公知の配列だけでなく、８０％以上の相同性を有する配列、具体的には８５％以上、より具体的には９０％以上、さらに具体的には９５％以上の相同性を有する配列もまた本発明の範囲に含まれ得る。

前記用語「癌キラー細胞」は、腫瘍−浸透Ｔリンパ球（ｔｕｍｏｒ−ｉｎｆｉｌｔｒａｔｅｄ Ｔ ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ；ＴＩＬ）、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ；ｃｈｉｍｅｒｉｃ ａｎｔｉｇｅｎ ｒｅｃｅｐｔｏｒ）を装着したＴ細胞及びナチュラルキラー細胞を意味し得るが、これに制限されない。

本発明において、「相同性（ｈｏｍｏｌｏｇｙ）」は、野生型（ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）タンパク質のアミノ酸配列またはこれをコードする塩基配列との類似の程度を表すためのものであって、本発明のアミノ酸配列または塩基配列と前記のようなパーセント以上の同じ配列を有する配列を含む。このような相同性は、２つの配列を目視で比較して決定することもできるが、比較対象となる配列を並列させて相同性の程度を分析する生物情報アルゴリズム（ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃ ａｌｇｏｒｉｔｈｍ）を用いて決定することができる。前記２つのアミノ酸配列間の相同性は百分率で表示することができる。有用な自動化されたアルゴリズムは、Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｐａｃｋａｇｅ（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗ，ＵＳＡ）のＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡのコンピュータソフトウェアモジュールで利用可能である。前記モジュールで自動化されたアラインメントアルゴリズムは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ＆ ＷｕｎｓｃｈとＰｅａｒｓｏｎ ＆ ＬｉｐｍａｎとＳｍｉｔｈ ＆ Ｗａｔｅｒｍａｎ配列アラインメントアルゴリズムを含む。他の有用なアラインメントに対するアルゴリズムと相同性の決定は、ＦＡＳＴＰ、ＢＬＡＳＴ、ＢＬＡＳＴ２、ＰＳＩＢＬＡＳＴ及びＣＬＵＳＴＡＬ Ｗを含むソフトウェアで自動化されている。

一方、本発明において、「特定の配列番号で構成される組換えタンパク質」と記載されているとしても、当該配列番号のアミノ酸配列からなる組換えタンパク質と同一あるいは相応する活性を有する場合であれば、当該配列番号のアミノ酸配列の前後の無意味な配列追加または自然に発生し得る突然変異、あるいはそのサイレント突然変異（ｓｉｌｅｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎ）を除くものではなく、このような配列追加あるいは突然変異を有する場合でも、本発明の範囲内に属することが自明である。

本発明の用語、「ＴＡＧＬＮ２」又は「Ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ−２」は、ヒトにおいてＴＡＧＬＮ２遺伝子によってコードされるタンパク質であって、前記タンパク質の機能は、まだ明確に知られていない。

具体的には、ＴＡＧＬＮ（Ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ）は、２２−ｋＤａのアクチン−結合タンパク質であって、鶏の砂肝の平滑筋で最初に発見され、形質転換−感受性及び迅速なアクチン−ゲル化の特性によって「ｔｒａｎｓｇｅｌｉｎ」と呼ばれている。８０％の相同性を共有する３つのＴＡＧＬＮのうち、ＴＡＧＬＮ２がＴ細胞で優勢に発現され、免疫シナプス（ＩＳ；ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｓｙｎａｐｓｅ）を維持するために膜に近接した部位のＦ−ａｃｔｉｎを安定化させる。また、ＴＡＧＬＮ２の過剰発現は、ＴＣＲの刺激後にＬＦＡ−１の活性化を引き起こし、このようなＴＡＧＬＮ２の生化学的特性により、癌免疫治療に適用されるときに種々の利点を有することができる。

本発明の目的上、ＴＡＧＬＮ２は、「ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ」信号伝達によってＬＦＡ−１を活性化させるので、人為的にＬＦＡ−１のみを活性化する場合に発生し得る、害になり得る目的としていない標的に対する作用を最小化させることができる。また、信号伝達経路の活性は、腫瘍微小環境でＴ細胞の生存延長に重要なＩＬ−２の生産を増加させ、キラーＴ細胞又はＮＫ細胞と腫瘍標的細胞との間の安定した免疫シナプスの形成は、腫瘍に対する細胞毒性を増加させることによって、癌治療に効果的に作用することができる。

本発明では、ＴＡＧＬＮ２は、他の名称でＴｒａｎｓｇｅｌｉｎ−２、ＴＧ２と混用して使用することができ、具体的には、配列番号１のアミノ酸を意味する。前記タンパク質の遺伝的情報は、公知のデータベースから得ることができ、その例として、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋなどがあるが、これに制限されない。

本発明の用語、「ＰＴＤ（Ｐｒｏｔｅｉｎ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｄｏｍａｉｎ）」は、小さなタンパク質ドメインであって、真核細胞内に特定の治療学的巨大分子を伝達するために使用される。本発明においてＰＴＤは、不連続的な形質導入効率、長い製造期間、高コスト及び安全性の問題を有しているウイルス媒介の遺伝子伝達システムの欠点を克服するために使用される。ＰＴＤの遺伝的情報は公知のデータベースから得ることができ、その例として、米国国立生物工学情報センター（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ；ＮＣＢＩ）のＧｅｎＢａｎｋなどがあるが、これに制限されない。本発明では、ＴＡＧＬＮ２を細胞内に伝達するために、特定のＰＴＤ、具体的には配列番号２で構成されたＰＴＤを使用することができるが、これに制限されない。

本発明において前記組換えタンパク質は、Ｔ細胞抗原受容体の刺激によって免疫シナプスで重合されるアクチンを安定化させることができるものであってもよいが、これに制限されない。

また、本発明において、前記組換えタンパク質が癌キラー細胞に搭載された場合、組換えタンパク質が癌キラー細胞に搭載されていない対照群に比べてサイトカインの発現を増加させることができるが、これに制限されない。

本発明の実施例では、ＴＡＧＬＮ２が形質導入されたＴ細胞が癌細胞株に付着された場合、対照群に比べて、サイトカイン放出能に優れ、細胞毒性に優れることを確認した（実施例３及び図３）。前記サイトカインは、ｍＩＬ−２、ｍＩＦＮγ、及びｍＧＺＭＢのうちの１つ以上であってもよいが、これに制限されない。

さらに、マウスを用いてｉｎ ｖｉｖｏ内で腫瘍の成長に対する効果を確認した結果、ＴＡＧＬＮ２が形質導入されたＴ細胞を注入したマウスが、治療していないマウス、及びＴＡＧＬＮ２が形質導入されていないＴ細胞を注入したマウスよりも生存可能性が遥かに優れていることを確認した（図４）。

これらの結果から、本発明者らは、癌キラー細胞に搭載されてキラー細胞の殺害能を増加させることができる配列番号１のアミノ酸で構成された癌治療用組換えタンパク質が、キラー細胞の付着能を増加させ、サイトカイン放出能及び細胞毒性を増加させ、抗癌効果による生存可能性に優れていることを確認することによって、癌キラー細胞に搭載した場合、癌の治療に効果を奏することができることを確認した。また、既存のウイルス媒介の遺伝子伝達システムが有していた不連続的な形質導入効率、長い製造期間、高コスト及び安全性の問題などを克服した癌治療に適用できることを確認した。

本発明の他の態様は、前記組換えタンパク質を含む、組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞を提供することである。

前記癌キラー細胞の組換えタンパク質の搭載は、ｉ）癌キラー細胞に搭載されてキラー細胞の癌殺害能を増加させることができる配列番号１のアミノ酸で構成された癌治療用組換えタンパク質にＰＴＤが融合された組換えタンパク質の形態で導入されるか、またはｉｉ）配列番号１のアミノ酸で構成された癌治療用組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドをレトロウイルスを用いて形質導入してもよいが、これに制限されない。

本発明の更に他の態様は、ｉ）癌キラー細胞に搭載されて癌キラー細胞の殺害能を増加させることができる配列番号１のアミノ酸で構成された癌治療用組換えタンパク質；ｉｉ）配列番号１のアミノ酸で構成された癌治療用組換えタンパク質にＰＴＤがさらに融合された組換えタンパク質；またはｉｉｉ）前記組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞を含む、癌治療用薬学的組成物を提供することである。

本発明の目的上、前記癌治療用薬学的組成物は、Ｔ細胞抗原受容体の刺激によって免疫シナプスで重合されるアクチンを安定化させることによって、癌治療効果を奏することができる。また、癌キラー細胞に搭載された場合、組換えタンパク質が癌キラー細胞に搭載されていない対照群に比べてサイトカインの発現を増加させることによって、癌の治療効果を奏することができる。

本発明において、「癌」とは、身体組織の自律的な過剰成長によって異常に育った腫瘍、または腫瘍を形成する病気を意味し、特に、正常な細胞死滅活性の喪失、不足などによって発病し、したがって、細胞死滅の調節を通じて癌を治療することができる。本発明では、「癌」は、「腫瘍」と混用して使用できる。

具体的には、前記癌は、本発明の組換えタンパク質または前記タンパク質が導入されたＴ細胞によって症状を緩和、軽減、改善又は治療することができる限り、特にこれに制限されない。具体例として、胃癌、結腸癌、乳癌、肺癌、非小細胞性肺癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部癌、頭頸部癌、黒色腫、子宮癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直腸癌、肛門付近癌、卵管癌腫、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣癌、陰門癌、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、リンパ腺癌、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、前立腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、慢性又は急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓骨盤癌、血液癌、脳癌、中枢神経系（ＣＮＳ；ｃｅｎｔｒａｌ ｎｅｒｖｏｕｓ ｓｙｓｔｅｍ）腫瘍、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、または脳下垂体腺腫であってもよく、より具体的には乳癌であってもよいが、これに制限されない。さらに、ＩＣＡＭ−１が発現される癌であってもよいが、これに制限されない。

上述したように、本発明の組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞は、癌細胞に強く付着されて癌細胞の成長の抑制及び死滅を誘導できる効果を有するところ、癌細胞の成長の抑制及び死滅を誘導することによって治療できる癌であれば、特定の癌の種類に制限されず、本願発明の薬学的組成物によって治療することができる。

本発明の実施例では、代表的な例として、乳癌細胞を選択して、本発明の組換えタンパク質または前記組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞による癌細胞の成長の抑制効果及び抗癌効果を確認した。

本発明において、「治療」とは、前記組換えタンパク質または前記組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞を含む組成物の投与により癌の症状が好転又は有利に変化するあらゆる行為を意味する。

本発明の薬学組成物は、単一の製剤としても使用することができ、公認された癌治療効果を有すると知られている薬物をさらに含めて並行して使用することができ、薬剤学的に許容される担体又は賦形剤を用いて製剤化することによって単位用量形態で製造されるか、または多用量容器内に内入させて製造されてもよい。

また、減圧凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅ）して使用するか、または必要に応じて抗酸化剤、緩衝液及び／又は静菌剤などの他の通常の添加剤を添加して使用することができ、希釈剤、分散剤、界面活性剤、結合剤、潤滑剤などを付加的に添加して水溶液、懸濁液、乳濁液などのような注射用剤形、丸薬、カプセル、顆粒または錠剤などに製剤化して使用することができる。

しかし、本発明の目的上、特定の患者に対する具体的な治療的有効量は、達成しようとする反応の種類と程度、場合によって他の製剤が使用されるか否かをはじめとする具体的な組成物、患者の年齢、体重、一般的な健康状態、性別及び食餌、投与時間、投与経路及び組成物の分泌率、治療期間、具体的な組成物と共に又は同時に使用される薬物をはじめとする様々な因子と医薬分野における周知の類似因子に応じて異ならせて適用することが好ましい。

本発明の薬学的組成物は、細胞キラー細胞に搭載して投与しなければならないが、他の治療剤と併用して投与されてもよく、従来の治療剤とは順次又は同時に投与することができる。そして、単一または多重投与されてもよい。前記要素を全て考慮して、副作用を誘発せず、かつ最小限の量で最大の効果を得ることができる量を投与することが重要であり、当業者によって容易に決定され得る。

本発明において「投与」は、ある適切な方法で患者に所定の物質を導入することを意味し、例えば、局所、静脈内、腹腔内、筋肉内、皮下、鼻腔内、または皮内経路による投与を含む任意の効果的かつ便利な方式で投与することができる。

本発明に係る薬学組成物の投与方法は、必ずしも細胞キラー細胞に搭載して免疫細胞治療の経路を介して投与しなければならず、当該技術分野において通常使用する方法に従うことができる。本発明に係る組成物の投与頻度は、特にこれに制限されない。

本発明の更に他の態様は、前記組成物を薬学的に有用な量でヒトを除いた癌の疑いのある個体に投与するステップを含む、癌治療方法を提供する。

本発明において、「個体」とは、癌が発病しているか、または発病する可能性がある、ヒトを含む全ての動物を意味し得る。前記動物は、ヒトだけでなく、これと類似の症状の治療を必要とする牛、馬、羊、豚、ヤギ、ラクダ、カモシカ、犬、猫などの哺乳動物であってもよいが、これに制限されない。

本発明の前記治療方法は、具体的には、癌が発病しているか、または発病する危険のある個体に前記組成物を薬学的に有効な量で投与するステップを含むことができる。

本発明の更に他の態様は、（ａ）配列番号１のアミノ酸にＰＴＤを融合するステップと；（ｂ）前記（ａ）ステップの融合されたタンパク質を癌キラー細胞に導入するステップとを含む、組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞の製造方法を提供することである。

本発明の目的上、Ｔ細胞にさらに容易に、且つさらに速やかに形質導入される組換えタンパク質（ＴＧ２Ｐ）を製造するために、ＴＡＧＬＮ２にＰＴＤを融合させてＴＡＧＬＮ組換えタンパク質（配列番号１）を製造した。

本発明の実施例では、ＰＴＤと融合されたＴＡＧＬＮ２組換えタンパク質（ＴＧ２Ｐ）を製造し（図５ａ）、製造されたＴＧ２ＰがＴ細胞内に容易に内在化され、内在化されたＴＧ２Ｐが少なくとも２４時間安定することを確認した（図５ｂ及び図５ｃ）。ＴＧ２Ｐが形質導入された癌キラー細胞は、腫瘍成長抑制の効能があることを確認した。

これを通じて、ＴＧ２Ｐは細胞毒性Ｔ細胞に容易に形質導入されることを確認し、ＴＡＧＬＮ２にＰＴＤが導入された形態であるＴＧ２Ｐが、Ｔ細胞内でウイルス媒介でＴＡＧＬＮ２を導入した場合とほぼ同様に、癌治療のために広範囲に適用可能性があることが確認できた。

本発明の更に他の態様は、配列番号１のアミノ酸をコードするポリヌクレオチドを含むレトロウイルスで癌キラー細胞に形質導入するステップを含む、組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞の製造方法を提供することである。

本発明の実施例では、ＴＡＧＬＮ２をコードするポリヌクレオチドを含むレトロウイルス形質導入を通じて癌細胞への細胞毒性Ｔ細胞の付着性が増加するかを確認した結果、ＩＣＡＭ−１の発現レベルが増加した癌細胞株とＴ細胞が付着能に優れることを確認した（実施例２）。

本発明の癌治療用組換えタンパク質または組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞は、癌細胞への付着能を増加させて癌細胞の成長を抑制することによって、これを含む薬学組成物は、癌の治療用途に活用することができる。

ＬＦＡ−１と物理的に相互作用するＴＡＧＬＮ２及び増加したＲａｐ１の活性を示す図である。（ａ）Ｔ細胞とＢ細胞との間の界面においてＴＡＧＬＮ２（ＴＧ２）、Ｆ−アクチン、及びＩＣＡＭ−１（ＩＣ１）の位置を測定したものである。ＴＧ２＿ＧＦＰ及びＬｉｆｅＡ＿ｍＲＦＰ（ｒｅｄ）を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、ＩＣ１＿Ｃｙ５（ｗｈｉｔｅ）で３０分間ＳＥＥがロードされた染色されたＲａｊｉ Ｂ細胞と接合された。３次元再構成は、細胞間の接触界面の正面の位置を示す。ＴＧ２及びＬｉｆｅＡまたはＴＧ２及びＩＣ１信号の共局在化（Ｃｏｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ）は、Ｐｅａｒｓｏｎ’ｓ相関係数（Ｒ）で測定した。（ｂ）ＧＦＰ及びＴＧ２＿ＧＦＰを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／２８で５分間刺激した。Ｆ−アクチン含量は、流細胞分析器を使用して定量化した。データは、０分にＧＦＰを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞と比較して相対的な蛍光強度で表現した。（ｃ）ＧＦＰまたはＴＧ２＿ＧＦＰ細胞を発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞と、ＳＥＥがロードされたＲａｊｉ Ｂ細胞との間の接合体の形成を示す。（ｄ）Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、表示された時間の間抗ＣＤ３／２８で刺激した。サンプルは、ＴＳ１／１８（抗−ＬＦＡ−１抗体）で免疫沈殿し、標識されたタンパク質に対する抗体でウエスタンブロットを行った。（ｅ）ＨＥＫ２９３Ｔ細胞は、ＬＦＡ−１及び様々なＴＧ２の突然変異で共同形質転換され、免疫沈殿及びウエスタンブロットを行った。下段の図式はＴＡＧＬＮ２の結実突然変異（Ｍ１、Ｍ２、及びＭ３）を示したものである。（ｆ）Ｒａｐ１の活性を示したものである。ＧＦＰ及びＴＧ２＿ＧＦＰを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞は、抗ＣＤ３／２８抗体で刺激し、ｐｕｌｌ−ｄｏｗｎ分析を行った。ＧＴＰ−結合されたＲａｐ１は、抗−Ｒａｐ１抗体を使用した免疫ブロッティングによって視覚化した。データは、３つの独立した実験を代表する（ｂ−ｆ）。＊Ｐ＜０．０５。（ｇ）図式で示した絵は、Ｔ細胞においてＴＡＧＬＮ２の潜在的なメカニズムを示す。 ＣＤ８^＋Ｔ細胞においてＴＡＧＬＮ２のレトロウイルス形質導入が、ＩＣＡＭ−１陽性癌細胞上への付着能を増加させることを示す図である。（ａ）ＴＡＧＬＮ２及びｅＧＦＰ、またはｅＧＦＰ（ＥＶ）単独のレトロウイルスベクターの構成に対する図式を示す。（ｂ、ｃ）ＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ細胞においてＴＡＧＬＮ２またはＥＶの形質導入効率は、流細胞分析器（ｂ）及びウエスタンブロット（ｃ）によって測定された。（ｄ）Ｂ１６Ｆ１０及びＥ０７７１細胞の表面のＩＣＡＭ−１の発現を示す。癌細胞は、ＦＩＴＣ−同種型対照群ＩｇＧまたはＦＩＴＣ−抗ＩＣＡＭ−１で染色した。２つの細胞株でのＩＣＡＭ−１の発現態様は、流細胞分析器及び共焦点顕微鏡によって測定した。データは、少なくとも３つの独立した実験を代表する（ｂ−ｄ）。＊Ｐ＜０．０５。（ｅ）ＯＶＡペプチドが不在又は存在するＢ１６Ｆ１０またはＥ０７７１細胞と、ＴＡＧＬＮ２がある又はないＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ細胞との間の接合体の形成を、代表的な流細胞分析プロファイルで示す。いくつかの場合、対照群ＩｇＧまたは抗−ＬＦＡ−１遮断抗体が使用された。右側に示されたものは、接合体の平均％である。データは、３つの実験の平均±ＳＤｓを示す。＊Ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＯＴＩ ＥＶ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞 ＴＡＧＬＮ２のレトロウイルス形質導入が、サイトカインの放出を強くし、ＩＣＡＭ−１陽性癌細胞に対するＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞毒性活性を増加させる。（ａ）ＯＶＡペプチドが不在又は存在するＢ１６Ｆ１０またはＥ０７７１細胞と、ＴＡＧＬＮ２がある又はないＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ細胞とを混合した。各条件でｍＧＺＭＢの分泌をＥＬＩＳＡによって評価した。データは、少なくとも３つの独立した実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５。（ｂ）ＯＴＩ ＥＶ−ＣＤ８^＋ＴまたはＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞と共に培養した後、死滅癌細胞の定量化を代表的な流細胞分析プロファイルで示す。ＯＶＡペプチドが不在又は存在するＯＴＩ ＥＶ−ＣＤ８^＋ＴまたはＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＰＫＨ２６−標識された癌細胞と混合した。７−ＡＡＤで染色した後、死滅癌細胞は流細胞分析によって測定した。右側に示されたものは、細胞毒性の平均％である。データは、３つの実験の平均±ＳＤｓを示す。＊Ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＯＴＩ ＥＶ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞。 ＴＡＧＬＮ２のレトロウイルス形質導入が、ｉｎ ｖｉｖｏでＣＤ８^＋Ｔ細胞の抗腫瘍活性を増加させる。（ａ）ＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性を測定するためのＴ細胞の養子転移の実験的デザインを図式したものである。（ｂ）腫瘍の位置に養子転移されたＯＴＩ ＥＶ−ＣＤ８^＋Ｔ及びＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞の浸透の程度を示す。共焦点（上）及び代表的な流細胞分析プロファイル（下、右側）は、腫瘍−浸透したＯＴＩ ＥＶ−ＣＤ８^＋Ｔ及びＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞を示す。フィールド（３００μｍ×３００μｍ）当たりの浸透した細胞の数は棒グラフで表現した（下、左側）。（ｃ、ｄ）ＯＶＡ−Ｅ０７７１腫瘍のＩＨＣ及びＴＵＮＥＬ分析を示す。ＩＨＣは、ｍＩＣＡＭ−１、ｍＣＤ８Ｔ、ｍＫｉ−６７、ｍＩＦＮ、及びｍＧＺＭＢに対する抗体を用いて行った。ＴＵＮＥＬ分析は、腫瘍の位置での腫瘍細胞の死滅を測定するために使用した。矢印は、ＴＵＮＥＬ−陽性細胞を示す。陽性細胞及びＴＵＮＥＬ−陽性細胞の平均％は棒グラフで示す。＊Ｐ＜０．０５。（ｅ）Ｅ０７７１腫瘍に対するＴ細胞免疫治療法の実験的デザインの図式である。ＯＴＩ ＥＶ−ＣＤ８^＋ＴまたはＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、腫瘍接種後、７、１０、及び１３日にマウスの尾の静脈内に注入した。（ｆ、ｇ）統計重量グラフ（ｆ）及び写真（ｇ）を使用して腫瘍の重量及び大きさを示した。（ｈ）ＯＴＩ ＥＶ−ＣＤ８^＋ＴまたはＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞の養子転移後、ＯＶＡ−Ｅ０７７１腫瘍を有しているマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。生存時間は、１０００ｍｍ^３以上の腫瘍の大きさによる死亡または安楽死した日として定義した。＊Ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＯＴＩ ＥＶ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞。 タンパク質伝達ドメインと融合された組換えＴＡＧＬＮ２（ＴＧ２Ｐ）が、ＡＰＣｓに対するＴ細胞の付着及びサイトカインの放出を増加させることを示す図である。（ａ）ＴＧ２Ｐの図式とＴＡＧＬＮ２のＣ−末端、リンカーアミノ酸（ａ．ａ．）、及びＰＴＤのＮ−末端で構成されたアミノ酸配列を示す。（ｂ）ＣＤ３^＋Ｔ細胞におけるＴＧ２Ｐの形質導入効率及び安定性を示す。ＣＤ３^＋Ｔ細胞を、表示された濃度のＴＧ２Ｐと共に５時間培養し、その後、細胞をウエスタンブロット分析した。（ｃ）（ｂ）の細胞を表示された時間の間培養し、ＣＤ３^＋Ｔ細胞におけるＴＧ２Ｐの滞留時間を分析した。（ｄ）接合体の形成を示す。ＴＧ２Ｐ−ＣＤ３^＋Ｔ細胞は、ＳＥＢ−ロードされたＢ細胞と共に３０分間培養され、接合体の％は、流細胞分析器を通じて測定した（左側）。結果は棒グラフで示した。いくつかの場合、対照群ＩｇＧまたは抗−ＬＦＡ−１抗体が使用された。データは、少なくとも３つの独立した実験を代表する（ｂ−ｄ）、＊Ｐ＜０．０５。（ｅ）サイトカイン分析の結果である。分泌されたサイトカイン（ｍＩＬ−２、ｍＩＦＮγ及びｍＧＺＭＢ）はＥＬＩＳＡで測定した。ｍＲＮＡのレベルはｑＲＴ−ＰＣＲで測定した。データは、３つの実験の平均±ＳＤｓを示す。＊Ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＣＤ３^＋Ｔ細胞。 ＣＤ８^＋Ｔ細胞においてＴＧ２Ｐの形質導入が、ＩＣＡＭ−１−陽性癌細胞に反応して付着及びサイトカインの放出を増加させる。（ａ）接合体の形成を示す。ＯＶＡペプチドが不在又は存在するＥ０７７１細胞と、ＯＴＩ ｎｏｎ−ＣＤ８^＋ＴまたはＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞とは共に２時間培養され、接合体の％は流細胞分析器で測定した（左側）。結果は棒グラフで示した（右側）。いくつかの場合、対照群ＩｇＧまたは抗−ＬＦＡ−１抗体が使用された。データは、少なくとも３つの独立した実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５。（ｂ）ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞毒性を示す。（ａ）のように、前記細胞はさらに６時間培養し、その後、Ｅ０７７１細胞の死亡（細胞毒性）はＬＤＨ放出で評価した。（ｃ）サイトカイン分析の結果である。分泌されたサイトカイン（ｍＩＬ−２、ｍＩＦＮγ及びｍＧＺＭＢ）はＥＬＩＳＡで測定した。データは、３つの実験の平均±ＳＤｓを示す。＊Ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＯＴＩ ｎｏｎ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞。 ＴＧ２Ｐの形質導入が、Ｅ０７７１腫瘍モデルにおいてＣＤ８^＋細胞の抗腫瘍活性を強くすることを示す図である。（ａ）腫瘍の位置に養子転移されたＯＴＩ ｎｏｎ−ＣＤ８^＋Ｔ及びＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞の浸透を示す。共焦点（上）及び代表的な流細胞分析プロファイル（下、右側）は、ＯＴＩ ｎｏｎ−ＣＤ８^＋Ｔ及びＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞が浸透した腫瘍を示す。フィールド（３００μｍ×３００μｍ）当たりの浸透した細胞の数は棒グラフで示した（下、左側）。（ｂ、ｃ）ＯＶＡ−Ｅ０７７１腫瘍のＩＨＣ及びＴＵＮＥＬ分析の結果である。ＩＨＣは、ｍＩＣＡＭ−１、ｍＣＤ８Ｔ、ｍＫｉ−６７、ｍＩＦＮγ及びｍＧＺＭＢに対する抗体を使用して行った。ＴＵＮＥＬ分析は、腫瘍の位置での腫瘍細胞の死滅を測定するために使用された。陽性細胞及びＴＵＮＥＬ−陽性細胞の平均％は棒グラフで示した。＊Ｐ＜０．０５。（ｄ、ｅ）腫瘍を分離した；腫瘍の重量及び大きさは、重量グラフ（ｄ）及び写真（ｅ）で示す。（ｆ）ＯＴＩ ｎｏｎ−ＣＤ８^＋ＴまたはＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞の養子転移後、ＯＶＡ−Ｅ０７７１腫瘍を有しているマウスのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存曲線を示す。生存時間は、１０００ｍｍ^３以上と測定される腫瘍による死亡または安楽死した日として定義した。＊Ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＯＴＩ ｎｏｎ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞。 ＣＤ８^＋Ｔ細胞においてＴＧ２Ｐの形質導入が、Ｅ０７７１細胞に対して付着を増加させ、サイトカインの生成を向上させることを示す図である。（ａ）接合体の形成を示す。ＯＶＡペプチドが不在又は存在するＥ０７７１細胞と、ＯＴＩ Ｎｏｎ−ＣＤ８^＋ＴまたはＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞とは共に２時間培養され、接合体の％は流細胞分析器で測定した。対照群ＩｇＧまたは抗−ＬＦＡ−１抗体を使用した。（ｂ）サイトカイン分析の結果である。サイトカイン（ｍＩＬ−２、ｍＩＦＮγ及びｍＧＺＭＢ）のｍＲＮＡのレベルはｑＲＴ−ＰＣＲで測定した。データは、３つの実験の平均±ＳＤｓを示す。＊Ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＯＴＩ ｎｏｎ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞。 ＣＤ８^＋Ｔ細胞においてＴＧ２Ｐの形質導入は、Ｂ１６Ｆ１０細胞に対する付着を増加させず、サイトカインの放出または細胞毒性活性に対する有意な効果を示さないことを確認した図である。（ａ）接合体の形成を示す。ＯＶＡペプチドが不在又は存在するＢ１６Ｆ１０細胞と、ＯＴＩ ｎｏｎ−ＣＤ８^＋ＴまたはＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞とは共に２時間培養され、接合体の％は流細胞分析器で測定した（左側）。結果は棒グラフで示した（右側）。データは、少なくとも３つの独立した実験を代表する。＊Ｐ＜０．０５。（ｂ）ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞の細胞毒性を示す。（ａ）のように、前記細胞はさらに２４時間培養され、Ｂ１６Ｆ１０細胞の死亡（細胞毒性）はＬＤＨ放出で評価した。（ｃ）サイトカイン放出の結果である。分泌されたサイトカイン（ｍＩＬ−２、ｍＩＦＮγ及びｍＧＺＭＢ）はＥＬＩＳＡで測定した。データは、３つの実験の平均±ＳＤｓを示す。＊Ｐ＜０．０５ ｖｅｒｓｕｓ ＯＴＩ ｎｏｎ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞。

以下、実施例を通じて本発明をより詳細に説明する。これらの実施例は、本発明をより具体的に説明するためのもので、本発明の範囲がこれらの実施例に限定されるものではない。

実験例１：試薬及び抗体

ウサギ多クローン性抗−ＴＡＧＬＮ２抗体は、精製された全長のＴＡＧＬＮ２を使用してウサギから生産された（ＡｂＦｒｏｎｔｉｅｒ，Ｓｅｏｕｌ，Ｋｏｒｅａ）。ウサギ多クローン性抗−緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）及びウサギ多クローン性抗−β−アクチン抗体は、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。マウス多クローン性抗−Ｈｉｓ、抗−Ｖｉｎｃｕｌｉｎ、抗−Ｔａｌｉｎ、抗−ＲａｐＬ、抗−ＬＦＡ−１、抗−Ｒａｐ１、ホースラディッシュ過酸化酵素−接合された抗−マウスＩｇＧ、及び抗−ウサギ又はマウスＩｇＧ抗体は、Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｄａｎｖｅｒｓ，ＭＡ，ＵＳＡ）から得た。１４５−２Ｃ１１（マウス抗−ＣＤ３；ＣＲＬ−１９７５）及びＰＶ１（マウス抗−ＣＤ２８；ＨＢ−１２３５２）融合細胞株は、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ；Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＴＳ１／１８（抗−ヒトＬＦＡ−１；ＨＢ−２０３）及びＲ６．５（抗−ヒトＩＣＡＭ−１）融合細胞株は、Ｔ．Ａ．Ｓｐｒｉｎｇｅｒ（Ｈａｒｖａｒｄ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ，Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ，ＵＳＡ）から寄贈された。抗−ヒトＣＤ２８及び抗−マウスＩＣＡＭ−１抗体は、Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ，ＵＳＡ）から得られた。抗−マウスＣＤ８ａ、抗−ウサギＩＦＮ、及び抗−ウサギＧＺＭＢ抗体は、Ａｂｃａｍ（Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）から得た。抗−マウス−ＬＦＡ−１、フルオレセインイソチオシアネート（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ ｉｓｏｔｈｉｏｃｙａｎａｔｅ；ＦＩＴＣ）−接合された抗−マウスＩＣＡＭ−１、及びＦＩＴＣ−ラットＩｇＧ１同種型対照群抗体は、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＣｅｌｌＴｒａｃｋｅｒ ＣＭＦＤＡ−緑、ＣＭＲＡ−オレンジ及びＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬は、インビトロゲン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。ＯＶＡペプチド断片（２５７−２６５）は、インビボゲン（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ；Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）から購入した。Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｅ（ＳＥＥ）及びｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃａｌ ｅｎｔｅｒｏｔｏｘｉｎ Ｂ（ＳＥＢ）はＴｏｘｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｉｎｃ．（Ｓａｒａｓｏｔａ，ＦＬ，ＵＳＡ）から購入した。Ｔｅｔｒａｍｅｔｈｙｌｒｈｏｄａｍｉｎｅ（ＴＲＩＴＣ）−ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ及びｐｏｌｙ−Ｌ−ｌｙｓｉｎｅ（ＰＬＬ）は、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から購入した。ＰＣＲプレミックスは、Ｅｎｚｙｎｏｍｉｃｓ（Ｄａｅｊｅｏｎ，Ｋｏｒｅａ）から購入した。制限酵素は、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．（Ｂｅｖｅｒｌｙ，ＭＡ，ＵＳＡ）から購入した。プラスミドＤＮＡ精製キット及びＷＥＳＴ−ＺＯＬウエスタンブロット感知キットは、ｉＮｔＲＯＮ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（Ｓｅｏｎｇｎａｍ，Ｋｏｒｅａ）から購入した。ＰｒｉｍｅＳＴＡＲ ＨＳ ＤＮＡ重合酵素は、ＴａＫａＲａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．（Ｓｈｉｇａ，Ｊａｐａｎ）から購入した。特に断りがない限り、全ての化学物質はＳｉｇｍａから購入した。

実験例２：細胞

Ｊｕｒｋａｔ Ｔ（ＴＩＢ−１５２）、Ｅ０７７１（ＣＲＬ−２７５５）及びＢ１６Ｆ１０（ＣＲＬ−６４７５；ａｌｌ ｆｒｏｍ ＡＴＣＣ）細胞、及びＰｌａｔｉｎｕｍ−Ｅ（Ｐｌａｔ−Ｅ）レトロウイルス性パッケージング細胞（Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ，ＵＳＡ）は、１０％（ｖ／ｖ）牛胎児血清（ＦＢＳ；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）が添加されたＲＰＭＩ−１６４０またはダルベッコ改変イーグル（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ ｍｏｄｉｆｉｅｄ Ｅａｇｌｅ）培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）で培養した。ＯＶＡを発現する安定したＥ０７７１細胞（ｐＣＬ−ｎｅｏ−ｃＯＶＡ；Ａｄｄｇｅｎｅ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ，ＵＳＡ）は、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００試薬（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）でトランスフェクションさせ、Ｇ４１８（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）で選択して準備した。Ｎａｉｖｅ ＣＤ３^＋Ｔ細胞は、Ｔ−Ｃｅｌｌ濃縮カラム（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を使用して、陰性選択を通じてマウスの脾臓及びリンパ節から精製した。マウスＴ−Ｃｅｌｌブラストを製造するために、ＣＤ３^＋Ｔ細胞は、２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３／２８コーティングされた培養プレートで１００Ｕ／ｍＬのｒＩＬ−２と共に４８時間培養し、追加で１００Ｕ／ｍＬのｒＩＬ−２と共に５日間培養した。マウスの脾臓細胞を分散させた後、ＥａｓｙＳｅｐ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｅａｔｔｌｅ，ＷＡ，ＵＳＡ）を使用してＣＤ８^＋及びＣＤ１９^＋集団を精製した。各集団の精製度は、流細胞分析器を通じて９５％以上であることを確認した。

実験例３：ｃＤＮＡ構成

ＴＡＧＬＮ２を製造するために、全長オープンリーディングフレームを暗号化するＴＡＧＬＮ２クローンをＩｍａＧｅｎｅ（Ｂｅｒｌｉｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）から購入した。ＴＡＧＬＮ２、ＴＡＧＬＮ２ΔＣＲ（Δ１７４−１９９）、ＴＡＧＬＮ２ΔＣＨ（Δ２−１３６）、及びＴＡＧＬＮ２ΔＡＢ（Δ１５３−１６０）遺伝子は、標準ＰＣＲ又はオーバーラッピングＰＣＲを用いて製造し、ｐＥＧＦＰベクター（Ａｄｄｇｅｎｅ）にサブクローンした。

Ｈｉｓ−タグされたＴＧ２Ｐを生産するために、ｐＥＴ−２１ａベクターを発現ベクターとして使用した。前記ベクターは、Ｔ７プロモーターを有し、発現されたタンパク質のＣ末端に６個のＨｉｓ残基を提供する。ＴＡＧＬＮ２の暗号化配列はＰＣＲによって増幅され、生産物はｐＥＴ−２１ａベクター（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ，ＵＳＡ）に統合された。

実験例４：動物

Ｃ５７ＢＬ／６野生型マウス及びＯＴＩ ＴＣＲトランスジェニックマウス（Ｃ５７ＢＬ／６ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ）は、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ，ＭＥ，ＵＳＡ）から購入した。全てのマウスは、特定の無菌状態で収容し、全ての実験的方法及びプロトコルは、光州科学技術院生命科学大学の実験動物運営委員会によって承認され、彼らが承認したガイドラインに従って行った。

実験例５：マウスＴ細胞でレトロウイルスの形質導入

レトロウイルスの形質導入前、Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのマウスＣＤ３^＋Ｔ細胞、またはＯＴＩ ＴＣＲ Ｃ５７ＢＬ／６マウスからのＣＤ８^＋Ｔ細胞は、２μｇ／ｍＬの抗ＣＤ３／２８−コーティングされたプレートで１００Ｕ／ｍＬのｈＩＬ−２と共に４８時間培養した。５×１０^６のレトロウイルスパッケージング細胞（Ｐｌａｔ−Ｅ；Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌａｂｓ）は、１０−ｃｍ^２のディッシュで一晩プレーティングした。レトロウイルス粒子は、レトロウイルスベクター（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ、ＧＦＰ、及びＴＧ２）及びｐＣＬ−ＥｃｏパッケージングベクターにＬｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ２０００（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して形質導入することによって製造した。４８時間後、ウイルス上澄液（１ｍＬ）を採取し、１０^６のマウスＴ細胞と混合した後、２０μｇ／ｍＬのｒｅｔｒｏｎｅｃｔｉｎがコーティングされた１２ウェルプレートで培養した。その後、１００Ｕ／ｍＬのｈＩＬ−２で９０分間、２，０００×ｇ、２５℃で遠心分離した。形質導入されたＴ細胞は、ｈＩＬ−２と共に新鮮な培地で維持し、５日〜８日間拡張した。

実験例６：細胞Ｆ−アクチン含量の測定

細胞は、血清のない培地で１２時間維持し、指定された時間の間、３７℃で抗ＣＤ３／２８と共に培養した。反応は、４％パラホルムアルデヒドを添加して終了させた。固定された細胞は、ＰＢＳで１回洗浄し、１％牛胎児血清及び０．２５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００を含むＰＢＳに５分間再び浮遊させた。透過化（ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ）後に、細胞を洗浄し、ＴＲＩＴＣ−ｐｈａｌｌｏｉｄｉｎ（Ｓｉｇｍａ）で３０分間染色した後、流細胞分析器を用いて分析した。

実験例７：接合分析

Ｔ細胞及び目的細胞（Ｂ細胞、Ｂ１６Ｆ１０、及びＥ０７７１）はそれぞれ、製造社のプロトコル（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）に従ってＣｅｌｌ ＴｒａｃｋｅｒグリーンＣＭＦＤＡ及びオレンジＣＭＲＡで染色した。Ｂ細胞（５×１０^５）は、５μｇ／ｍＬのＳＥＢ又は対照群と共に３０分間培養し、洗浄した後、ＲＰＭＩ１６５０培地で再び浮遊させた。Ｅ０７７１又はＢ１６Ｆ１０細胞（５×１０^５）は、１０μｇ／ｍＬのＯＶＡ２５７−２６４ペプチドと共に３０分間培養し、洗浄した後、ＲＰＭＩ１６４０培地で再び浮遊させた。

接合のために、Ｔ細胞及び目的細胞の同じ体積を混合し、３７℃で培養した。各チューブにおいて緑色、オレンジ色、及び緑色−オレンジ色の相対的な比率は、ＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｓａｎ Ｊｏｓｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用して２色流細胞分析器を用いて測定し、ＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）で分析した。サンプル当たりの測定した数は、少なくとも１０，０００であった。接合されたＴ細胞のパーセントは、二重標識された（ＣＭＦＤＡ−及びＣＭＲＡ陽性）イベントをＣＭＦＤＡ−陽性Ｔ細胞に分けて決定した。

実験例８：共焦点顕微鏡観察

ＴＡＧＬＮ２の位置を調べるために、ＴＧ２＿ＧＦＰを発現するＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞をＬｉｆｅＡ＿ＲＦＰで形質導入し、ＩＣＡＭ−１＿Ｃｙ５で染色された１μｇ／ｍＬのＳＥＥ−ｐｕｌｓｅｄ Ｒａｊｉ Ｂ細胞と共に３０分間培養した。その後、細胞をＰＬＬ−コーティングされたガラス上に置いて、レーザースキャニング共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００；Ｏｌｙｍｐｕｓ，Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）で１００×、ＮＡ１．４０の油浸対物レンズを使用してイメージ化した。

Ｂ１６Ｆ１０及びＥ０７７１細胞においてＩＣＡＭ−１の発現を測定するために、細胞は、１０ｍＭエチレンジアミン四酢酸（ｅｔｈｙｌｅｎｅｄｉａｍｉｎｅｔｅｔｒａａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ）を使用して分離し、抗−ＩＣＡＭ−１−ＦＩＴＣで染色した後、６０×、ＮＡ１．４０の油浸対物レンズを使用して観察した。様々な接合形成の分析のために、サンプルは、前述したように製造し、Ｅ０７７１（５×１０^５）細胞をＣＭＲＡ−オレンジで３０分間染色した後、洗浄し、その後、ガラス−底共焦点ディッシュで２４時間培養した。翌日、ＥＶ−またはＴＧ２Ｐ−処理されたＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ細胞（５×１０^５）は、ＣＭＦＤＡ−グリーンで染色し、癌細胞と共に２時間培養した。付着されていない細胞は、暖かいＰＢＳで洗浄して除去し、４０×、ＮＡ１．４０の油浸対物レンズを使用して観察した。

実験例９：ウエスタンブロット

細胞は、氷で１５分間非常に冷たい溶解緩衝液（１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及びプロテアーゼ抑制剤を含む５０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４）で溶解された。細胞溶解物は、３０分間、１６，０００×ｇで遠心分離し、上澄液は、ＳＤＳサンプルバッファー（１００ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ６．８、４％ＳＤＳ、及び２０％ｇｌｙｃｅｒｏｌ ｗｉｔｈ ｂｒｏｍｏｐｈｅｎｏｌ ｂｌｕｅ）で溶出させ、５分間加熱した。タンパク質は、１０〜１５％ゲル上でＳＤＳ ＰＡＧＥによって分離し、Ｔｒａｎｓ−Ｂｌｏｔ ＳＤ半乾燥輸送細胞（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用してニトロセルロース膜に転移させた。膜は、５％脱脂乳で遮断させ（１時間）、濯いだ後、０．１％Ｔｗｅｅｎ２０（ＴＢＳ−Ｔ）及び０．５％脱脂乳が含まれたＴＢＳで適切な抗体と共に一晩培養した。その後、過量の１次抗体をＴＢＳＴで３回洗浄することによって除去した。その後、膜を０．１μｇ／ｍＬのペルオキシダーゼ−接合された２次抗体（抗−ウサギ又は抗−マウス）と共に１時間培養した。ＴＢＳＴで３回洗浄した後、バンドは、ウエスタンブロット感知試薬を使用して視覚化し、Ｘ線フィルムに露出させた（Ｋｏｄａｋ，Ｒｏｃｈｅｓｔｅｒ，ＮＹ，ＵＳＡ）。

実験例１０：免疫沈降反応（ＩＰ）

細胞溶解物を予め洗浄し、上澄液は、抗体と共に４℃で一晩培養した。次いで、タンパク質Ａ／Ｇアガロースビーズ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）と共に培養した。ビーズは収集し、ＰＢＳで洗浄し、５×ＳＤＳサンプルバッファーに再び浮遊させた。免疫沈降されたタンパク質は、１２％ゲル上でＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離され、前記に記載されたように、ウエスタンブロットによって分析した。

実験例１１：活性Ｒａｐ１に対するＰｕｌｌ−ｄｏｗｎ分析

活性ＧＴＰ−結合されたＲａｐ１のレベルは、製造社の指針（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．，Ｒｏｃｋｆｏｒｄ，ＩＬ，ＵＳＡ）に従ってＥＺ−Ｄｅｔｅｃｔ Ｒｈｏ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎキットを使用して測定した。具体的には、ＧＦＰまたはＴＧ２＿ＧＦＰ細胞を発現するＪｕｒｋａ Ｔ細胞は、３７℃で、定められた時間の間、抗ＣＤ３／２８で刺激し、冷たいＰＢＳで１回洗浄した後、２０ｍＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ７．４、１５０ｍＭのＮａＣｌ、１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、及びプロテアーゼ阻害剤カクテルを含む緩衝液で溶解させた。

サンプルは、氷上で２０分間培養した後、遠心分離（１６，０００×ｇ、３０分、４℃）した。上澄液の同等量は、４℃で、１２時間、ＧＴＰ−Ｒａｐ１に対するＧＳＴ−ＲａｌＧＤＳ−ＲＢＤ／ＧＳＨ−ビーズと共に培養した。ビーズは、溶解バッファーで３回洗浄し、結合されたタンパク質は、煮沸してサンプルバッファーから溶出させた。サンプルは、電気泳動を行い、抗−Ｒａｐ１抗体でウエスタンブロットを行って分析した。

実験例１２：流動血球計算分析

細胞は、２％ＦＢＳを含むＰＢＳに浮遊させ、マウスＩＣＡＭ−１またはアイソタイプ（ｉｓｏｔｙｐｅ）対照群に対する蛍光−接合された抗体で常温で１５分間染色した。その後、細胞はＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて評価し、データはＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。

実験例１３：サイトカイン分泌の測定

ＣＤ３^＋Ｔ細胞またはＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＳＥＢ−ロードされたＢ細胞またはＯＶＡ−ロードされた癌細胞で刺激した。定められた時間の間培養した後、ＥＬＩＳＡを用いて上澄液からｍＩＬ−２、ｍＩＦＮγ及びｍＧＺＭＢの量を測定した。

実験例１４：Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性分析

Ｉｎ ｖｉｔｒｏ細胞毒性Ｔ−細胞の活性分析のために、ＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ細胞を製造し、ＯＶＡが不在又は存在するＥ０７７１またはＢ１６Ｆ１０細胞と共に培養した。６時間又は２４時間後に、細胞−媒介された細胞毒性をＰｉｅｒｃｅ ＬＤＨ細胞毒性分析キット（Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．）を使用して測定し、細胞毒性パーセントは、製造社の指針に従って計算した。

流細胞分析器を用いて細胞毒性を分析するために、ＰＫＨ２６（Ｓｉｇｍａ）は、製造社のキットの指針に従って希釈した。Ｅ０７７１またはＢ１６Ｆ１０細胞は、ＰＢＳで洗浄し、キットの１ｍＬの希釈液Ｃに再び浮遊させた。ＰＫＨ２６は、１ｍＬの希釈液Ｃで４μＭまで希釈した。細胞は、染料と結合され、３分間、チューブを複数回ひっくり返した。チューブに約２ｍＬのＦＢＳを添加し、１分間継続してチューブをひっくり返した。その後、細胞を、４ｍＬのフェノールレッドのない１０％ＦＢＳが含有されたＲＰＭＩ１６４０と共に１５−ｍＬのコニカルチューブに移した後、同じ培地で３回洗浄した。ＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、フェノールレッドのない１０％ＦＢＳが含有されたＲＰＭＩ１６４０で２回洗浄した後、ＰＫＨ２６−標識された癌細胞と共に混合した後、３７℃で４時間培養した。培養後、７−ＡＡＤの５μｇ／ｍＬ溶液の１０μＬを、１０分間、氷上で細胞上澄液に添加した。細胞はＦＡＣＳＣａｎｔｏ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて評価し、データはＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。

実験例１５：異種移植モデル

ＯＶＡ−Ｅ０７７１腫瘍モデルを作るために、８週齢のＣ５７ＢＬ／６雌マウスの第４乳房脂肪塊に、０日に５×１０^５のＯＶＡ−Ｅ０７７１細胞を注入した。マウスは、Ｔ細胞転移の直前に５Ｇｙの全身放射線を照射した。ＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ（１×１０^７の細胞）、ＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ、またはＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、腫瘍接種後、７、１０、１３日に尾静脈に注入した。動物は、腫瘍注入後、２８日に犠牲にした後、腫瘍の重量を測定してイメージ化した。

ＴＧ２−ロードされたＣＤ８^＋Ｔ細胞の生体内活性の分析のために、ＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ（１×１０^７の細胞）、ＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ、またはＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、腫瘍接種後、１４日に尾静脈に注入した。２日後、動物を犠牲にした後、腫瘍組織を抽出した。

免疫蛍光法のために、腫瘍組織を常温で２時間、４％パラホルムアルデヒドで固定し、ＰＢＳで洗浄した後、腫瘍組織が沈むまで３０％スクロースで脱水させた。その後、組織は、Ｔｉｓｓｕｅ−Ｔｅｋ ＯＣＴ（Ｓａｋｕｒａ Ｆｉｎｅｔｅｋ，Ｔｏｒｒａｎｃｅ，ＣＡ，ＵＳＡ）で凍結保護し、１０μｍの凍結された部分は、蛍光マウンティング培地（Ｄａｋｏ，Ｃａｒｐｉｎｔｅｒｉａ，ＣＡ，ＵＳＡ）に載置した。イメージは、４０×、ＮＡ１．４０のレーザースキャニング共焦点顕微鏡（ＦＶ１０００）の油浸対物レンズを使用して得た。

ＣＤ８^＋Ｔ細胞（ＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ（緑色）及びＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ（緑色／赤色）またはＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ（赤色）細胞）が浸透した腫瘍の量を比較するために、腫瘍組織はＰＢＳで均等化させ、細胞をＦＡＣＳＣａｎｔｏ機器（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用いて評価した。データはＦｌｏｗＪｏ ｓｏｆｔｗａｒｅ（Ｔｒｅｅｓｔａｒ）で分析した。

免疫組織化学染色法のために、抽出された腫瘍組織は、４％パラホルムアルデヒドで固定し、パラフィンに包埋した。組織スライス（５μｍ）は、抗−ＩＣＡＭ−１、抗−ＣＤ８Ｔ、抗−Ｋｉ６７、抗−ＧＺＭＢ、及び抗−ＩＮＦ抗体またはＴｄＴ−ＢｉＯＴＩｎ−ｄＵＴＰミックス（１００μｌのＴｄＴ緩衝液［３０ｍＭのＴｒｉｓ、ｐＨ７．２、１４０ｍＭのカコジル酸ナトリウム、１ｍＭの塩化コバルト］、３０ＵのＴｄＴ、及び０．５μＬのＢｉＯＴＩｎ−ｄＵＴＰミックス［Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ，ＵＳＡ］）と共に培養し、製造社の指針に従ってジアミノベンジジン染色（Ｄａｋｏ ａｎｄ Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を行った。ＴＵＮＥＬ分析は、Ｉｎ Ｓｉｔｕ細胞死感知キット、ＡＰ（Ｒｏｃｈｅ，Ｍａｎｎｈｅｉｍ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を使用して行った。顕微鏡イメージは、ＩｍｍｕｎｏＲａｔｉｏ（ｈｔｔｐ：／／ｉｍｔｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ．ｕｔａ．ｆｉ／ｉｍｍｕｎｏｒａｔｉｏ）を使用して分析するか、または病理学者が測定した。

実験例１６：ＴＧ２Ｐの精製

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＢＬ２１（ＤＥ３）細胞においてＴＧ２Ｐの発現は、前述した組換えプラスミドの形質転換に記載した通りに行った。ＴＧ２Ｐの発現は、培養培地に２５℃で一晩にわたり０．５ｍＭのイソプロピルβ−Ｄ−１−チオガラクトピラノシド（ｉｓｏｐｒｏｐｙｌ β−Ｄ−１−ｔｈｉｏｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ）を添加して誘導した後、細胞を収集した。細胞ペレットをＰＢＳに再び浮遊させ、超音波処理した後、遠心分離した。遠心分離後、上澄液のＴＧ２Ｐは、Ｈｉｓ−ｓｅｌｅｃｔｅｄ Ｎｉｃｋｅｌ Ａｆｆｉｎｉｔｙゲル（Ｓｉｇｍａ）上で親和性クロマトグラフィーで精製した。ゲルは、１０体積の緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０及び０．３ＭのＮａＣｌ）で平衡化し、上澄液と共に培養した。ゲルは、５体積の洗浄緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ８．０、０．３ＭのＮａＣｌ、及び１０ｍＭイミダゾール）で洗浄した。ＴＧ２Ｐは、２５０ｍＭまで増加するイミダゾールの濃度から溶出された。溶出されたＴＧ２Ｐは、１０％グリセロールで補充されたＰＤ−１０ Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ−２５（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）を使用して脱塩させ、アリコート（ａｌｉｑｕｏｔ）から分離し、−７０℃でフレッシュ−凍結させた。

実験例１７：逆転写ＰＣＲ（ＲＴ−ＰＣＲ）及びリアルタイム定量的ＲＴ−ＰＣＲ（ｑＲＴ−ＰＣＲ）

総ＲＮＡは、ＴＲＩｚｏｌ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｉｎｃｉｎｎａｔｉ，ＯＨ，ＵＳＡ）を使用して細胞から分離した。ｃＤＮＡは、ＲＴプレミックスを使用して製造した。リアルタイムｑＰＣＲは、ＳＹＢＲｒｅｅｎ ＰＣＲ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，ＣＡ，ＵＳＡ）を使用したＡＢＩ ＰＲＩＳＭ７３００ ＲＴ−ＰＣＲシステムで行い、遺伝子−特定のプライマー（それぞれ順方向及び逆方向の対）は、下記の表１の通りである。

ＧＡＰＤＨに関する標的遺伝子のｍＲＮＡのレベルは、下記の式を通じて正常化した：相対的ｍＲＮＡ発現＝２−（標的遺伝子のΔＣｔ−ＧＡＰＤＨのΔＣ）、ここで、Ｃｔは、閾値の値である。各サンプルにおいて、分析された遺伝子の発現は、ＧＡＰＤＨに対して正常化させ、ＧＡＰＤＨに対する相対的なｍＲＮＡのレベルで記載した。

実験例１８：統計的分析

平均値は、互いに異なる日に行われた少なくとも３つの独立した実験から得られたデータを使用して計算した。有意性テストを行う場合、ｕｎｐａｉｒｅｄ Ｓｔｕｄｅｎｔ ｔテストと偏差テストの単方向分析を使用した。群間の差は、Ｐ値が０．０５未満のときに有意であると見なした。

実施例１：ＴＡＧＬＮ２、Ｆ−アクチン安定剤がＬＦＡ−１の‘ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ’信号伝達を調節する細胞質因子であることを確認

リンパ球でほとんど発現されるＴＡＧＬＮ２（ＴＧ２）は、免疫シナプス（ＩＳ）の末梢アクチン環に集中しており（図１ａ）、増加したＦ−アクチンの含量（図１ｂ）及びＴ−ＡＰＣ接合体形成（図１ｃ）と一致するということが知られていたが（Ｎａ，Ｂ．−Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ２０９，１４３−１６２（２０１５））、本発明では、ＴＡＧＬＮ２が、刺激に関係なく、ＣＨドメインを介してＬＦＡ−１と物理的に関連しており（図１ｄ、及び図１ｅ）、Ｔ細胞のＬＦＡ−１−依存的な付着及び移動の重要な調節剤として機能するＲａｐ１の活性化と一致（図１ｆ）することを見出した。

このような結果は、ＴＡＧＬＮ２は、アクチン動力を調節できるようにする生化学的特性だけでなく、インテグリンＬＦＡ−１の‘ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ’信号伝達を調節する細胞質因子としての役割を果たすことができることを示唆するものである。

図１ｇは、Ｔ細胞においてＴＡＧＬＮ２の作用の潜在的なメカニズムを示すものである。ＴＡＧＬＮ２は、Ｆ−アクチンを安定させるだけでなく、コフィリン（ｃｏｆｉｌｉｎ）−媒介のアクチン重合を遮断して、ＩＳ１７でＦ−アクチン含量の増加及び延長されたＴ細胞の活性化及びＩＬ−２の生産を誘導することを確認した。また、ＴＡＧＬＮ２は、腫瘍微小環境で‘ｏｕｔｓｉｄｅ−ｉｎ’補助刺激信号が弱かったが、Ｔ細胞がＴＣＲを介して１次抗原信号を受け取ったとき、‘ｉｎｓｉｄｅ−ｏｕｔ’インテグリンＬＦＡ−１の機能を調節することを確認した。これは、Ｔ細胞が腫瘍標的細胞に安定的に付着するようにする役割を果たす（図１ｇ）。

このようなＴＡＧＬＮ２の二重調節メカニズムは、Ｔ細胞の活性化を向上させ、ＴＡＧＬＮ２が、細胞治療を通じて癌細胞を殺すことを強化させる能力を有する潜在的な活性物質（ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であることを示唆するものである。すなわち、ＴＡＧＬＮ２は、ＣＡＲ又はＴＣＲ転移遺伝子−導入された細胞毒性Ｔ細胞及びＮＫ細胞を含む癌免疫治療の様々な類型に適用することができる。

実施例２：癌細胞への細胞毒性Ｔ細胞の付着能の確認

ＴＡＧＬＮ２のレトロウイルス形質導入が、ＩＣＡＭ−１−陽性癌細胞に細胞毒性Ｔ細胞の付着を増加させるかを確認するために、野生型ＴＡＧＬＮ２及びｅＧＦＰ遺伝子、またはｅＧＦＰ（ｅｍｐｔｙ ｖｅｃｔｏｒ［ＥＶ］）を単独で含むレトロウイルスのＤＮＡ構造物を作製した（図２ａ）。

具体的には、ＴＡＧＬＮ２またはＥＶを含むレトロウイルスの粒子は、宿主プレートＥ細胞から製造し、流細胞分析器を用いてウイルスの形質導入効率を測定するために、マウス１次ＣＤ８^＋Ｔ細胞で感染させた。効率は、一般的に８０％以上であり（図２ｂ）、ウエスタンブロットを用いて再度確認した（図２ｃ）。

ＡＰＣとＴ細胞の接合を観察したように、ＴＡＧＬＮ２の発現が、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１相互作用を通じた癌細胞へのＣＤ８^＋Ｔ細胞の付着に影響を与えられるかを確認するために、２つの癌細胞株におけるＩＣＡＭ−１の発現レベルを調べた。

その結果、Ｂ１６Ｆ１０黒色腫は、ＩＣＡＭ−１をほとんど発現しなかったが、Ｅ０７７１乳癌細胞は、比較的多い量のＩＣＡＭ−１を発現した（図２ｄ）。

また、接合分析を行うことで、ＴＧ２（ＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞）を過剰発現するＯＴＩ ＴＣＲ＋ＣＤ８^＋Ｔ細胞がＯＶＡ２５７−２６４ペプチド−ロードされた細胞（ＯＶＡ２５７−２６４）と共に培養されたとき、接合体の数が非常に増加したが、ＯＶＡ−ロードされたＢ１６Ｆ１０（ＯＶＡ−Ｂ１６Ｆ１０）細胞と培養したときはそうでないことを確認した（図２ｅ）。また、対照群ＩｇＧではなく抗−ＬＦＡ−１抗体がＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞とＥ０７７１細胞との間の接合体の数を非常に減少させることを確認することによって、前記結論を再度確認した（図２ｅ）。これは、補助刺激ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１相互作用が、細胞毒性Ｔ細胞をＩＣＡＭ−１^＋癌標的細胞に付着するために重要なものであることを示唆するものである。

実施例３：サイトカイン放出及び細胞毒性の有無の確認

ＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞とＥ０７７１細胞との強い接合体の形成が、サイトカイン放出の増加及び細胞毒性に関連があるかを確認しようとした。

具体的には、ｍＧｒａｎｚｙｍｅ Ｂ（ｍＧＺＭＢ）は、ＯＶＡ−Ｅ０７７１細胞と相互作用するＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞集団で有意に増加することを確認し（図３ａ）、これらの細胞は、Ｅ０７７１細胞を有意に溶解させたが、Ｂ１６Ｆ１０細胞は溶解させないことを確認した（図３ｂ）。

これは、ＴＧ２の過剰発現が、アクチン依存性信号伝達経路を上向き調節し、補助刺激ＬＦＡ−１の活性化を促進することによって、腫瘍細胞を効果的に殺すＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の能力に影響を与えたことを示唆するものである。

実施例４：抗腫瘍活性の増加

実施例３において、ＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞がサイトカインの放出を増加させ、高い細胞毒性と共に、標的癌細胞との増加した接合を示すことをｉｎ ｖｉｔｒｏ上で確認したところ、ｉｎ ｖｉｖｏ上でＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞の有効性を調べようとした。

このために、ＯＶＡ−Ｅ０７７１細胞をＣ５７ＢＬ／６雌マウスの乳房脂肪塊に注入した。１４日後に、マウスにＯＴＩ ＥＶ−ＣＤ８^＋Ｔ及び／又はＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞を静脈内に注入した（図４ａ）。２日後に、マウスを犠牲にし、癌組織を除去した。除去された癌組織の凍結切除された部分は、共焦点及びＦＡＣＳ分析によって測定されたように、ＥＶ−ＣＤ８^＋Ｔ及びＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞の両方とも、Ｅ０７７１細胞由来の腫瘍をほぼ同様に標的化することを確認した（図４ｂ）。

腫瘍の位置で種々のタンパク質の発現レベル及び細胞死滅細胞の数を測定するために免疫化学染色を使用し、癌細胞増殖マーカーであるｍＫｉ６７に対して陽性である細胞は減少した反面、インターフェロンガンマ（ｍＩＦＮγ）、ｍＧＺＭＢ、及び末端デオキシヌクレオチド伝達酵素ｄＵＴＰニック末端標識（ＴＵＮＥＬ）染色は、ＯＴＩ ＥＶ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞と比較して、ＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞を注入した腫瘍の位置で有意に増加することを確認した（図４ｃ及び図４ｄ）。

ｉｎ ｖｉｖｏ内で腫瘍の成長に対するＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞の効果を評価するために、ＯＶＡ−Ｅ０７７１細胞をＣ５７ＢＬ／６マウスの乳房の脂肪に注入した。マウスは、ＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ細胞の投与のために、７日後に３つのグループに任意に分けた。ＯＴＩ ＥＶ−ＣＤ８^＋ＴまたはＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、３日間隔で３回静脈内に注入した（図４ｅ）。腫瘍を注入してから２８日後に全ての動物は犠牲にし、腫瘍の重量を測定した。

その結果、ＯＴＩ ＥＶ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞を注入したマウスの平均腫瘍重量は、細胞の注入がない場合の腫瘍の重量よりも軽かった。これは、細胞毒性Ｔ細胞の転移は、効果的に生体内の腫瘍の成長を減少させたことを示唆する。

また、ＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞の静脈内投与は、細胞の転移がない腫瘍またはＯＴＩ ＥＶ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞が転移された腫瘍に比べて、腫瘍の大きさを有意に減少させることを確認した（図４ｆ及び図４ｇ）。腫瘍を注入してから２８日後のＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存研究で、治療していないマウス及び非形質導入Ｔ細胞を受けたマウスが、それぞれ２０日、２７日の平均生存時間を有することを確認した。しかし、ＯＴＩ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞を注入したマウスは、２８日よりも長い７５％の生存可能性を有することを確認した（図４ｈ）。

実施例５：組換えＴＡＧＬＮ２のＴ細胞付着及びサイトカイン放出の確認

ＰＴＤと融合された組換えＴＡＧＬＮ２（ＴＧ２Ｐ）が効果的にＴ細胞内に内在化され、Ｔ細胞付着及びサイトカイン放出を増加させるかを確認しようとした。

ＰＴＤと呼ばれる小さなタンパク質ドメインは、真核細胞内に特定の治療学的巨大分子を伝達するために使用される。不連続的な形質導入効率、長い製造期間、高コスト及び安全性の問題のようなウイルス媒介の遺伝子伝達システムの欠点を克服するために、マウス１次Ｔ細胞にさらに容易に、且つさらに速やかに形質導入される、ＰＴＤと融合されたＴＡＧＬＮ組換えタンパク質（ＴＧ２Ｐ）を製造した（図５ａ）。ＴＧ２Ｐ（０〜１０μＭ）はＴ細胞内に容易に内在化され、内在化されたＴＧ２Ｐは、少なくとも２４時間、内因性のＴＡＧＬＮ２の程度安定することを確認した（図５ｂ及び図５ｃ）。

次に、ＴＧ２Ｐで処理した結果が、抗原−ロードされたＢ細胞に対するＣＤ３^＋Ｔ細胞の観点で、ＴＡＧＬＮ２のウイルスの形質導入と同一の効能を示すかを確認しようとした。

ＴＧ２Ｐで処理したＣＤ３^＋Ｔ細胞（ＴＧ２Ｐ−ＣＤ３^＋Ｔ細胞）は、ＳＥＢ−ロードされたＢ細胞と共に培養されたとき、接合体の数が増加することを確認した。接合体の数は、Ｔ細胞を処理するのに使用されたＴＧ２Ｐの濃度と関連がある（図５ｄ）。ウイルス遺伝子伝達の結果と一致して、ＳＥＢロードされたＢ細胞と共に培養されたＴＧ２Ｐ−ＣＤ３^＋Ｔ細胞の集団でｍＩＬ−２、ｍＩＦＮγ及びｍＧＺＭＢが有意に上向き調節されることを観察した（図５ｅ）。このような結果は、ＣＤ３^＋Ｔ細胞でＰＴＤ−ベースの形質導入は、レトロウイルス−ベースの遺伝子伝達の程度効果的であるということを示すものである。

前記結果に基づいて、ＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ細胞にＴＧ２Ｐを適用してＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞を製造した。ＴＧ２Ｐで処理したものは、ＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ−ＯＶＡ−Ｅ０７７１接合体の数を有意に増加させた（図６ａ及び図８ａ）。また、ＬＦＡ−１を標的とする抗体による付着の強い抑制は、ＬＦＡ−１の活性化を通じてＴＧ２Ｐの効果を調整するということを確認した。

また、ＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ｍＩＬ２、ｍＩＦＮγ、及びｍＧＺＭＢのようなさらに多くのサイトカインを生産し（図６ｃ及び図８ｂ）、Ｅ０７７１細胞に対して強い細胞毒性活性を有することを確認した（図６ｂ）。しかし、ＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、ＩＣＡＭ−１−ＯＶＡ−Ｂ１６Ｆ１０細胞には影響を及ぼさないことを確認した（図９）。これは、ＬＦＡ−１／ＩＣＡＭ−１を介した細胞毒性Ｔ細胞と癌細胞との間の付着性相互作用が重要であることを示唆するものである。

実施例６：組換えＴＡＧＬＮ２（ＴＧ２Ｐ）の抗腫瘍活性の確認

図４ａに示されたように、腫瘍投入後、ＴＧ２Ｐ存在又はＴＧ２Ｐ不在のＣＤ８^＋Ｔ細胞が腫瘍の位置に移動するか否かを評価しようとした。

除去された癌組織の凍結切除された部分は、両ＣＤ８^＋Ｔ細胞ともに類似にＥ０７７１細胞を標的としたことを示す。また、腫瘍の位置で種々のタンパク質の発現レベル及び細胞死滅細胞の数を測定した。その結果、ＯＴＩ ＴＣＲ ＴＧ２−ＣＤ８^＋Ｔ細胞から得られた結果と類似していることを確認した（図７ｂ、図７ｃ、図４ｃ、及び図４ｄ）。

また、ｉｎ ｖｉｖｏで腫瘍の成長に対するＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞の効果を評価しようとした。

ＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞は、細胞の転移がない腫瘍、またはＴＧ２ＰなしにＯＴＩ ＣＤ８^＋Ｔ細胞を処理した場合と比較して、平均腫瘍重量が有意に減少することを確認した。これは、組換えＴＧ２Ｐは、レトロウイルスベースの遺伝子伝達と類似の効果を有することを示唆する（図７ｄ及び図７ｅ）。

Ｋａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ生存研究において、処理していないマウス、及び非形質導入ＯＴＩ Ｔ細胞で処理したマウスは、それぞれ２１日及び２３日の平均生存期間を有することを示した。しかし、ＯＴＩ ＴＧ２Ｐ−ＣＤ８^＋Ｔ細胞が転移されたマウスは、２８日以上の７０％またはそれ以上の生存可能性を有することを確認した（図７ｆ）。

このような結果は、本発明の組換えＴＧ２Ｐが癌細胞への高い付着性を有することによって、腫瘍細胞の成長を効果的に減少させ、生存可能性を高めることを示唆する。

以上の説明から、本発明の属する技術分野における当業者は、本発明が、その技術的思想や必須の特徴を変更せずに他の具体的な形態で実施できるということを理解できるであろう。これと関連して、以上で記述した実施例は、すべての面で例示的なものであり、限定的なものではないと理解しなければならない。本発明の範囲は、前記詳細な説明よりは、後述する特許請求の範囲の意味及び範囲、そしてその等価概念から導かれる全ての変更又は変形された形態が本発明の範囲に含まれるものと解釈しなければならない。

Claims (9)

1. ｉ）癌キラー細胞に搭載されて癌キラー細胞の殺害能を増加させることができる配列番号１のアミノ酸で構成された、癌治療用組換えタンパク質、
   ｉｉ）前記ｉ）アミノ酸のＣ−末端にＰＴＤがさらに融合されたものである組換えタンパク質、
   または
   ｉｉｉ）癌キラー細胞に搭載されて癌キラー細胞の殺害能を増加させることができる配列番号１のアミノ酸のＣ−末端にＰＴＤがさらに融合されたものである組換えタンパク質が搭載された癌キラー細胞を含む、癌治療用薬学的組成物。
2. 前記癌は、肺癌、胃癌、結腸癌、乳癌、骨癌、膵臓癌、皮膚癌、頭部癌、頭頸部癌、黒色腫、子宮癌、卵巣癌、大腸癌、小腸癌、直腸癌、肛門付近癌、卵管癌腫、子宮内膜癌、子宮頸部癌、膣癌、陰門癌、ホジキン病（Ｈｏｄｇｋｉｎ’ｓｄｉｓｅａｓｅ）、食道癌、リンパ腺癌、膀胱癌、胆嚢癌、内分泌腺癌、前立腺癌、副腎癌、軟組織肉腫、尿道癌、陰茎癌、慢性又は急性白血病、リンパ球リンパ腫、腎臓癌、輸尿管癌、腎臓骨盤癌、血液癌、脳癌、中枢神経系（ＣＮＳ；ｃｅｎｔｒａｌｎｅｒｖｏｕｓｓｙｓｔｅｍ）腫瘍、脊髄腫瘍、脳幹神経膠腫、または脳下垂体腺腫である、請求項１に記載の癌治療用薬学的組成物。
3. 請求項１に記載の組成物を薬学的に有用な量でヒトを除いた癌の疑いのある個体に投与するステップを含む、癌治療方法。
4. 前記ｉｉ）のＰＴＤの融合は、ペプチドリンカーまたは直接融合によるものである、請求項１に記載の癌治療用薬学的組成物。
5. 前記組換えタンパク質は、Ｔ細胞抗原受容体の刺激によって免疫シナプスで重合されるアクチンを安定化させることができることを特徴とする、請求項１に記載の癌治療用薬学的組成物。
6. 前記組換えタンパク質が癌キラー細胞に搭載された場合、組換えタンパク質が癌キラー細胞に搭載されていない対照群に比べて、サイトカインの発現を増加させるものである、請求項１に記載の癌治療用薬学的組成物。
7. 前記サイトカインは、ｍＩＬ−２、ｍＩＦＮγ、及びｍＧＺＭＢのうちの１つ以上である、請求項６に記載の癌治療用薬学的組成物。
8. 前記ｉｉｉ）の癌キラー細胞の組換えタンパク質の搭載は、
   A）配列番号１のアミノ酸で構成された組換えタンパク質、または配列番号１のアミノ酸のＣ−末端にＰＴＤが融合された組換えタンパク質をコードするポリヌクレオチドをレトロウイルスによって形質導入するか、または
   B）配列番号１のアミノ酸のＣ−末端にＰＴＤが融合された組換えタンパク質形態で導入されてなるものである、請求項１に記載の癌治療用薬学的組成物。
9. 前記ＰＴＤは配列番号２で構成される、請求項１に記載の癌治療用薬学的組成物。