JP6830266B2 - Ｎａｓｈ改善用組成物、ｎａｓｈ改善用食品組成物、ｎａｓｈ改善用飲料組成物、ｎａｓｈから肝硬変への移行予防用組成物及びｎａｓｈから肝細胞癌への移行予防用組成物 - Google Patents

Description

本発明は、ＮＡＳＨ改善用組成物、ＮＡＳＨ改善用食品組成物、ＮＡＳＨ改善用飲料組成物、ＮＡＳＨから肝硬変への移行予防用組成物及びＮＡＳＨから肝細胞癌への移行予防用組成物に関する。

古来きのこ類は、独特の風味や香りを有する食材として汎用されると共に、免疫力の向上、抗菌、体調リズムの調節、老化防止等の生理機能活性化作用等を有するとして、漢方薬又はある種の疾患の民間薬としても用いられてきた。また、きのこに関する薬効成分の研究も進歩してきており、抗菌・抗ウイルス作用、強心作用、血糖降下作用、コレステロール低下作用、抗血栓作用、血圧降下作用を示す成分が見出されている。

本出願人は、新規なきのこであるバシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１（以下、「バシディオマイセテスＸ」という）の抽出組成物（以下、「バシディオマイセテスＸ抽出組成物」という。）について、以前に出願した（特許文献１参照）。バシディオマイセテスＸ抽出組成物は、多量の多糖類（β−Ｄ−グルカン）が含まれており、抗酸化力が高く、ＯＨラジカル消去活性を有しているため、老化防止等の効能が期待できるものである。また、バシディオマイセテスＸ抽出組成物は、免疫調整効果を有しているため、免疫賦活剤等として用いて好適なものである。また、本出願人は、バシディオマイセテスＸ抽出組成物を用いた、アトピー性疾患の改善・予防に対して優れた効果を有するアトピー性疾患組成物についても、以前に出願した（特許文献２参照）。

ところで、近年、世界的な食生活の欧米化にともない、脂肪を多量に含む食事の摂取量増加や、社会変化に由来する運動量の低下、ストレスの増大等が著しく、ヒト体内の脂肪蓄積レベルが危機的な社会問題にまでなっている。過剰に摂取された脂肪は、各組織に蓄積され様々な生活習慣病の主因となる。例えば、脂肪が過剰に蓄えられ、肥大化した内臓器官の脂肪細胞におけるサイトカイン分泌異常は、糖尿病や動脈硬化等、メタボリックシンドロームの大きな原因の一つとなっている。また、脂肪細胞の保持可能な脂肪量を超えると、その内臓器官に炎症が生じ、例えば肝臓の場合は脂肪性肝疾患等を生じる。

また、脂肪性肝疾患の中で、飲酒歴が無い又は飲酒歴が乏しい（女性２０ｇ／日以下、男性３０ｇ／日以下）にもかかわらず、脂肪性肝疾患を発症する例が数多く見出され問題となっている。この疾患は、非アルコール性脂肪性肝疾患（ｎｏｎ−ａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｆａｔｔｙ ｌｉｖｅｒ ｄｉｓｅａｓｅ：ＮＡＦＬＤ）と呼ばれ、通常、単純性脂肪肝(ｓｉｍｐｌｅ ｓｔｅａｔｏｓｉｓ)と、単純性脂肪肝に更に炎症や線維化を伴い予後不良と考えられている非アルコール性脂肪肝炎（Ｎｏｎａｌｃｏｈｏｌｉｃ ｓｔｅａｔｏｈｅｐａｔｉｔｉｓ：ＮＡＳＨ）との２種類に大別されている（非特許文献１参照）。これらのうちＮＡＳＨは、肝硬変及び肝細胞癌に移行する例があることから、その対策は目下の緊急課題として極めて重要な位置づけが与えられている。

ＮＡＳＨの症状は、メタボリック症候群の一つであると考えられているように、合併症として肥満、糖尿病、高脂血症、及び高血圧等の生活習慣病が認められている。人口の２０％〜３０％が脂肪肝であり、約３％がＮＡＳＨを発症していると推察される欧米を始め、肥満者及び生活習慣病患者数の増大に伴い、今後世界的に脂肪肝炎患者が急増することが想定されている。

ＮＡＳＨの臨床病態の主な特徴としては、アラニンアミノトランスフェラーゼ（Ａｌａｎｉｎｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ：ＡＬＴ）優位のトランスアミナーゼ活性の上昇や、ヒアルロン酸濃度等の繊維化マーカーの上昇等が挙げられるが、ＮＡＳＨの診断には、脂肪滴の沈着や炎症細胞浸潤、肝臓の線維化、肝細胞が風船のようにふくらむ風船様肝細胞の形成、といった病理所見を判別する肝生検が必要となるため、その診断は容易ではない。更に、肝硬変まで至った症例（Ｂｕｒｎ ｏｕｔ ＮＡＳＨ）では、脂肪滴そのものが消失してしまうことが一層診断を困難にさせている。

従って、ＮＡＳＨは、他の疾患の除外が診断の助けになっているため早期診断が困難であり、適切な改善を受ける前に肝硬変、肝細胞癌等の致死性の疾患に進展してしまう。現在、ＮＡＳＨと診断された患者の３０％は１０年の経過で肝硬変に進展し、それらの半数が肝不全となっている。

また、明確に有効性が確認された改善薬は未だ存在しないため、食生活の改善や運動療法による減量が、ＮＡＦＬＤ又はＮＡＳＨを改善するための第一選択とされている。並行して、インスリン抵抗性改善薬、ビタミンＥ等の抗酸化剤、肝庇護薬及びアンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬等、ＮＡＳＨの背景にある生活習慣病を標的とした薬剤治療が行われるケースもあるが、有効性よりも寧ろ長期投与による副作用の観点から忌避される傾向にある。それ故、投薬よりも安全性の高い食品又は食経験の豊富な天然物を利用したＮＡＳＨの予防及び治療戦略が模索されている。

国際公開第２００４／０９７００７号 特開２００７−１０９４４９号公報

田中直樹、外１名、「肝臓」、２００２年、第４３巻、第１２号、ｐ．５３９−５４９

しかしながら、特許文献１、特許文献２及び非特許文献１には、バシディオマイセテスＸを、非アルコール性脂肪肝炎（以下、「ＮＡＳＨ」という）の改善、又はＮＡＳＨを予防することが可能な食品組成物や飲料組成物に応用することや、バシディオマイセテスＸがＮＡＳＨから肝硬変及び肝細胞癌への移行を予防することについては記載さておらず、その効果も実証されていない。

本発明は、このような実情に鑑み、安全性が高く、しかも経口摂取しやすいバシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１を適用して、ＮＡＳＨ改善用組成物、ＮＡＳＨ改善用食品組成物、ＮＡＳＨ改善用飲料組成物、ＮＡＳＨから肝硬変への移行予防用組成物及びＮＡＳＨから肝細胞癌への移行予防用組成物を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記課題を解決すべく誠意研究を重ねた結果、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１が、安全性が高く経口摂取しやすい形態に加工することが可能であり、ＮＡＳＨを改善すると共に、ＮＡＳＨから肝硬変及び肝細胞癌への移行を予防する機能を有することを見出し、本発明を完成させるに至った。

上記目的を達成する本発明の第１の態様は、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１乾燥粉末又はその抽出組成物を有効成分とすることを特徴とするＮＡＳＨ改善用組成物にある。

本発明の第２の態様は、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、溶液状及びゲル状から選択される何れかの形態であることを特徴とする第１の態様に記載のＮＡＳＨ改善用組成物にある。

本発明の第３の態様は、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１乾燥粉末又はその抽出組成物を有効成分とすることを特徴とするＮＡＳＨ改善用食品組成物にある。

本発明の第４の態様は、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１乾燥粉末又はその抽出組成物を有効成分とすることを特徴とするＮＡＳＨ改善用飲料組成物にある。

本発明の第５の態様は、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１乾燥粉末又はその抽出組成物を有効成分とし、ＮＡＳＨから肝硬変への移行を予防することを特徴とするＮＡＳＨから肝硬変への移行予防用組成物にある。

本発明の第６の態様は、バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１乾燥粉末又はその抽出組成物を有効成分とし、ＮＡＳＨから肝細胞癌への移行を予防することを特徴とするＮＡＳＨから肝細胞癌への移行予防用組成物にある。

本発明によれば、安全性が高く、しかも経口摂取しやすいバシディオマイセテスＸを適用して、ＮＡＳＨ改善用組成物、ＮＡＳＨ改善用食品組成物、ＮＡＳＨ改善用飲料組成物、ＮＡＳＨから肝硬変への移行予防用組成物及びＮＡＳＨから肝細胞癌への移行予防用組成物を提供することができる。

（ａ）〜（ｅ）は各試験群の血液検査結果を示すグラフであり、（ａ）はＡＬＴ濃度、（ｂ）はＡＳＴ濃度、（ｃ）はＡＰＬ濃度、（ｄ）はＴＣ濃度、（ｅ）はＴＧ濃度をそれぞれ示す。 （ａ）〜（ｃ）は各試験群の各臓器量及び血糖値の測定結果を示すグラフであり、（ａ）は肝重量／体重、（ｂ）は脾臓重量／体重、（ｃ）は血糖値をそれぞれ示す。 （ａ）〜（ｌ）は各試験群の組織観察結果を示す写真であり、（ａ）〜（ｄ）は肝臓像、（ｅ）〜（ｈ）はＨ＆Ｅ染色した肝臓組織像、（ｉ）〜（ｌ）はＭＴ染色した線維化領域像をそれぞれ示す。 （ａ）〜（ｃ）は各試験群におけるウエスタンブロッティングによる各タンパク質の発現量の測定結果を示すグラフであり、（ａ）はＰＰＡＲα／ＧＡＰＤＨ、（ｂ）はＰＰＡＲγ／ＧＡＰＤＨ、（ｃ）はＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ／ＧＡＰＤＨをそれぞれ示す。 （ａ）及び（ｂ）は各試験群におけるウエスタンブロッティングによる各タンパク質の発現量の測定結果を示すグラフであり、（ａ）はＳＩＲＴ１／ＧＡＰＤＨ、（ｂ）はＧｌｕｔ４／ＧＡＰＤＨをそれぞれ示す。 （ａ）〜（ｃ）は各試験群におけるウエスタンブロッティングによる各タンパク質の発現量の測定結果を示すグラフであり、（ａ）はｐ−ＮＦ−κＢ／ＮＦ−κＢ、（ｂ）はＩＬ−１β／ＧＡＰＤＨ、（ｃ）はＩＬ−１０／ＧＡＰＤＨをそれぞれ示す。

本発明の抗ＮＡＳＨ組成物は、バシディオマイセテスＸ乾燥粉末又はその抽出組成物を有効成分として含有する。

ここで、本発明でいうバシディオマイセテスは、担子菌であり、嘴状突起（クランプ）は観察されるが、担子器形成能を有しないという特性を有しており、他の担子菌と区別される。即ち、培養しても、担子器を形成せずに、菌核（菌糸塊）を形成するだけである。かかるバシディオマイセテスは、菌を自然界から探索した結果得たものであり、単離し、バシディオマイセテスＸとして独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ） ＮＩＴＥ特許生物寄託センター（ＮＩＴＥ−ＩＰＯＤ）に寄託した（受託番号：ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１）。

このバシディオマイセテスＸは、分生子を形成しない、即ち、無性世代を有しないものである。例えば、ポテトグルコース寒天培地で培養すると、培養菌糸は、クランプを有し、平滑であるが、分生子を形成せず、子実体を形成しない。コロニー表面の形状色調を観察すると、コロニー内に淡桃色菌糸塊を形成しており、植菌部位から同心円状に生長したコロニー内に複数の菌糸塊を形成した場合、菌糸塊相互は菌糸束により連結される。なお、コロニーの裏面の色調は淡桃色である。また、グルコース・ドライイースト寒天培地で培養すると、培養菌糸はクランプを有し、平滑であるが、分生子を形成せず、子実体を形成しない。コロニー表面の形状色調を観察すると、コロニー内に淡桃〜白色の菌糸塊を形成し、植菌部位を中心とするように厚さ５ｍｍ〜６ｍｍの菌糸塊を形成している。なお、コロニーの裏面の色調は、淡桃〜白色である。

バシディオマイセテスＸの最適生育条件は、例えば、ｐＨ５．０〜６．０で、温度２２℃〜２６℃である。また、生育範囲は、例えば、ｐＨ４．０〜７．５で、温度５℃〜３０℃である。

また、バシディオマイセテスＸは、上述した一般的な培養方法により培養でき、培養方法は特に限定されるものではない。例えば、適当な栄養源を添加して滅菌した寒天培地、おがくず培地、液体培地等に、培養済の菌株或いは種菌を無菌的に植菌し、適温条件下で培養することにより、バシディオマイセテスＸの菌糸塊を得ることができる。なお、バシディオマイセテスＸを培養すると、培養した環境に応じて菌糸塊を形成する。

このようなバシディオマイセテスＸ菌糸塊を、必要に応じて乾燥し、この乾燥物を粉末（バシディオマイセテスＸ乾燥粉末）にすることにより、本発明の抗ＮＡＳＨ組成物となる。或いは、前述の乾燥粉末を、顆粒、錠剤、カプセル、溶液状、ゲル状等にして抗ＮＡＳＨ組成物としてもよい。

また、バシディオマイセテスＸ抽出組成物を、本発明の抗ＮＡＳＨ組成物の有効成分としてもよい。バシディオマイセテスＸ菌糸塊からの抽出方法は特に限定されない。例えば、バシディオマイセテスＸ菌糸塊から細胞内容物を効率よく抽出するには、好適には、必要に応じてバシディオマイセテスＸ菌糸塊を凍結する等して細胞壁に損傷を与えて解凍した後、ミキサー等により破砕し、エキス（バシディオマイセテスＸ抽出組成物）を抽出する。

エキスの抽出溶媒も特に限定されないが、水、低級アルコール等、更には、酸、アルカリ、その他の添加剤を添加した抽出液を用いて常温又は加熱条件下、又は加圧下にて抽出する。一般的には、熱水で煮出して抽出するか、或いは、水又はアルコールやアルカリを添加した水と破砕物を混合した状態で、例えば、１００ＭＰａ〜７００ＭＰａ程度、好ましくは、３００ＭＰａ〜６００ＭＰａ程度加圧して抽出するのがよい。

ここで、抽出方法の一例を説明する。まず、凍結しているバシディオマイセテスＸ菌糸塊を常温解凍し、ミキサーを用いて破砕し、破砕したバシディオマイセテスＸ菌糸塊と抽出溶媒である水との割合を、例えば、１：５程度とし、破砕バシディオマイセテスＸ菌糸塊５０ｇをガラス瓶に入れ、水２５０ｍＬを加えて蓋を締め、これを鍋の底にタオルを敷いた上に水を注ぎ、破砕バシディオマイセテスＸ菌糸塊の入ったガラス瓶を置いて加熱・沸騰させる。沸騰してから９０分間加熱を継続し、冷却後固液分離し、抽出液（バシディオマイセテスＸ抽出組成物）及び残渣（バシディオマイセテスＸ抽出残渣）を得る。抽出液のｐＨは例えば、６．３〜６．５を示す。破砕したバシディオマイセテスＸ菌糸塊は、バシディオマイセテスＸ乾燥粉末に替えてもよく、例えば、この場合、適宜これを水溶媒中で、撹拌しながら４時間〜６時間静置培養し、その後、固液分離し、抽出液及び残渣（バシディオマイセテスＸ抽出残渣）を得ることができる。

このように得た抽出液を、必要に応じて濃縮し、バシディオマイセテスＸ抽出組成物とする。なお、エキスの濃縮方法は特に限定されないが、例えば以下のように行う。

得られた抽出液をビーカーに移し、加熱・蒸発させて濃縮する。このとき、抽出液は淡いベージュ色から褐色を呈するようになり、盛んに発泡をはじめるようになるが、更に蒸発・濃縮を継続し、例えば、ｐＨ４．９、密度１．２５ｇ／ｃｍ^３のタール状となった時点で、濃縮を終了させる。この濃縮エキスは、醤油様の芳香を発する。なお、この時点における、バシディオマイセテスＸ菌糸塊からの濃縮エキスの収率は平均１２％である。このように得た濃縮エキスは冷却するに従い、粘性が非常に高まるため、濃縮終了と同時に保存容器に移す必要がある。また、保存容器に移した濃縮エキスは、そのまま冷却後、冷凍・凍結保存とするのが好ましい。

このバシディオマイセテスＸ抽出組成物を、必要に応じて乾燥し、粉末、顆粒、錠剤、カプセル、溶液状、ゲル状等にしたものが、本発明の抗ＮＡＳＨ組成物である。また、バシディオマイセテスＸ乾燥粉末を、本発明の抗ＮＡＳＨ組成物としてもよい。なお、それらへの抗ＮＡＳＨ組成物の含有割合は、用途に応じて適宜設定すればよく、特に限定されない。

本発明の抗ＮＡＳＨ組成物は、上記の粉末、顆粒、錠剤、カプセル、溶液状、ゲル状等から選択される何れかの形態でＮＡＳＨ予防用食品組成物やＮＡＳＨ予防用飲料組成物とすることができる。そして、必要に応じてこれらに加工を加えることにより、サプリメントや飲料等として提供することができる。なお、ＮＡＳＨ予防用食品組成物及びＮＡＳＨ予防用飲料組成物中のバシディオマイセテスＸ乾燥粉末又はバシディオマイセテスＸ抽出組成物の含有割合は、必要に応じて適宜設定すればよく、特に限定されない。

本発明の抗ＮＡＳＨ組成物は、後述する実施例に示すように、ＮＡＳＨを改善することができ、また、肝硬変予防用組成物及び肝細胞癌予防用組成物は、ＮＡＳＨから肝硬変及び肝細胞癌への移行を予防することができる。このため、本発明の抗ＮＡＳＨ組成物の投与によりＮＡＳＨを改善することができ、また、肝硬変予防用組成物及び肝細胞癌予防用組成物の投与によりＮＡＳＨから肝硬変及び肝細胞癌への移行を予防することができる。

また、本発明の抗ＮＡＳＨ組成物をＮＡＳＨの予防及び治療に用いることができ、また、肝硬変予防用組成物及び肝細胞癌予防用組成物を肝硬変及び肝細胞癌の予防に用いることができる。このようなＮＡＳＨ治療方法、肝硬変予防方法及び肝細胞癌予防方法では、各組成物の摂取方法に特に制限はなく、ＮＡＳＨの程度やＮＡＳＨに由来する諸症状等に合わせて有効量を適宜決定し、内服することができる。本実施形態では、日常生活において手軽に摂取可能であることから、経口摂取させることが好ましい。また、摂取条件としては、例えば、バシディオマイセテスＸ抽出組成物を乾燥して粉末化し、好ましくは２００ｍｇ〜３００ｍｇの錠剤としたものを、１日１回〜３回、好ましくは３回経口摂取するＮＡＳＨ治療方法、肝硬変予防方法及び肝細胞癌予防方法が挙げられる。服用期間は特に限定されないが、長期間とすることが好ましく、例えば、８週間以上が好ましく、特に１６週間以上が好ましい。或いは、バシディオマイセテスＸ乾燥粉末を用いる場合には、例えば、そのまま錠剤にしたものを摂取してもよいし、シロップ等の液体に溶解して摂取してもよい。

以下、本発明を、実施例及びバシディオマイセテスＸ乾燥粉末又はバシディオマイセテスＸ抽出組成物の製造例を参照しながら更に具体的に説明する。なお、製造例１〜４でバシディオマイセテスＸの培養例を、製造例５でバシディオマイセテスＸの乾燥例、製造例６でバシディオマイセテスＸ抽出組成物乾燥粉末の製造例を示す。

（製造例１）
＜菌糸塊からの分離＞
（１）培地の調製
下記表１に示す配合で、ＰＳＡ培地及びＰＤＡ培地を調製し、試験管又は三角フラスコに分注した後、シリコセン（又は綿栓）を施しオートクレーブにより１２１℃２０分高圧蒸気滅菌した。その後、試験管の場合は、滅菌後熱いうちに傾斜させてスラント（斜面）培地とし、三角フラスコの場合は、そのまま静置してプレート（平面）培地とした。

（２）菌糸塊からの分離
大きめのバシディオマイセテスＸ菌糸塊を手で割り、火炎滅菌したメスを冷却させてからバシディオマイセテスＸ断面より切片を切断し、火炎滅菌冷却後のピンセットで、（１）のＰＳＡ培地及びＰＤＡ培地スラントにバシディオマイセテスＸ切片を植菌した。なお操作は、無菌箱又はクリーンベンチ内の、無菌処理済み条件下で行った。

（３）菌糸塊生産のためのＡｇａｒ培地による培養
１ｃｍ角としたジャガイモ２００ｇを、精製水を用いて煮沸後２０分継続、冷却後、固液分離したジャガイモ浸出液、スクロース２０ｇ及びＡｇａｒ１ｇ（０．１％）に蒸留水を全量１Ｌとなるように加えて、Ａｇａｒ培地を調整した。なお、通常Ａｇａｒ培地は１．５〜２．０（培地１Ｌに対し、１５ｇ〜２０ｇ）のＡｇａｒ添加するが、培養後の菌糸塊と、Ａｇａｒ培地の分離を容易にするため、また液体培地ではバシディオマイセテスＸの切片が沈降しやすいため物理的強度を維持する目的で、０．１％添加することとした。この０．１％Ａｇａｒ培地を試験管に各５ｍＬに分注し、シリコセンを施した後オートクレーブにより１２１℃２０分間高圧蒸気滅菌した。その後、無菌処理済みの無菌箱内において、製造例１のスラントにおいて培養中のバシディオマイセテスＸ菌糸塊から切片を切除し、０．１％Ａｇａｒ培地に無菌操作により植菌した。２４℃条件下でインキュベーターにおいて培養させたところ、２４時間〜４８時間後には発菌した。発菌後、２４℃条件下で培養を継続すると、１４日間でＡｇａｒ培地上に菌糸が生育した。

（製造例２）
＜菌糸塊生産のためのおがくず培地による培養＞
（１）種菌の培養
おがくず１Ｌ、脱脂ぬか１５ｇ、ふすま１５ｇ及びサンパール（菌糸活性剤・日本製紙製）５ｇに、水を加えて十分に攪拌し、培地を強く握って水がにじむ程度（湿式含水率７０％程度）として、おがくず培地を調製した。この培地を三角フラスコに入れ、シリコセンを施した後、オートクレーブにより１２１℃４０分高圧蒸気滅菌した。滅菌後２４時間後に、製造例１のスラントにて培養中のバシディオマイセテスＸ菌糸を無菌箱内にて無菌操作によっておがくず培地に植菌した。なお、植菌は滅菌三角刀でスラントの一部を切除するようにし、菌糸にダメージを与えないよう行った。また、植菌の密度は、おがくず培地表面積の２０％〜３０％とした。２４℃条件下で培養したところ３日後（遅くとも５日後）に発菌し、３０日後には三角フラスコおがくず培地に菌糸が充満した。

（２）菌糸塊の発生
（１）と同様にしたおがくず培地を調製し、この培地をポリプロピレン製ビンに入れ、フタをして、オートクレーブにより１２１℃４０分高圧蒸気滅菌した。滅菌後２４時間後、無菌処理済みの無菌箱内において無菌操作により、（１）で培養した種菌をポリプロピレン製ビンのおがくず培地に植菌した。なお、植菌の密度は、おがくず培地表面積がほぼ覆われる程度とした。２４℃条件下で培養したところ、４８時間後に発菌し、６０日後にはポリプロピレン製ビン内のおがくず培地全体に菌糸が充満した。更に４０日〜５０日経過すると、ポリプロピレン製ビン内壁に菌糸が展開し、菌糸束を形成、更に培養を継続すると菌糸塊を形成した。

（製造例３）
＜バシディオマイセテスＸ乾燥粉末の製造＞
菌糸の細胞壁に損傷を与え、細胞内容物が浸出することを容易にするため、製造例２で得られた生鮮バシディオマイセテスＸ菌糸塊を冷凍・凍結させ、凍結しているバシディオマイセテスＸ菌糸塊を常温解凍し、ミキサーを用いて破砕したものを乾燥して粉末に加工した（以下、「バシディオマイセテスＸ乾燥粉末」という）。

（製造例４）
＜バシディオマイセテスＸ抽出組成物乾燥粉末の製造＞
製造例３で得られたバシディオマイセテスＸ乾燥粉末（乾燥重量４ｋｇ）を計りとり、水２０Ｌを加えた後、適宜撹拌しながら４〜６時間静置培養した。その後、吸引濾過により固形物（以下、「バシディオマイセテスＸ抽出残渣」という）を除き、バシディオマイセテスＸ抽出組成物１７．６ｋｇ（固形分：８．０％）を得た。最後に−４０℃で予備凍結の後、凍結乾燥に供した（以下、バシディオマイセテスＸ抽出組成物乾燥粉末という）。

（実施例１）
製造例４で得られたバシディオマイセテスＸ抽出組成物乾燥粉末を水に溶かし、１日の投与量が５００ｍｇ/ｋｇ体重となるように調製したものを被験物とした。

（１）使用動物と投与ＮＡＳＨ治療方法
生後間もないＣ５７ＢＬ／６系雌性マウス各個体を、非アルコール性脂肪性肝炎（以下、「ＮＡＳＨ」という）を発症させていない健常（正常）群（ｎ＝５）（以下、「Ｎｏｒｍａｌ群」という）、軽度のＮＡＳＨを発症させた無治療群（ｎ＝５）（以下、「ＨＦＤ−８Ｗ群」という）、重度のＮＡＳＨを発症させた無治療群（ｎ＝８）（以下、「ＮＡＳＨ群」という）、及び重度のＮＡＳＨを発症させ５％バシディオマイセテスＸ抽出組成物乾燥粉末を投与したＮＡＳＨ改善群（ｎ＝６）（以下、「ＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群」という）群の４群に分けた。

（２）ＮＡＳＨの誘導
健常群のマウスを除いて、生後およそ１週目にマウスあたり２００μｇのストレプトゾトシン（ｓｔｒｅｐｔｏｚｏｔｏｃｉｎ：ＳＴＺ）を皮下注射した。何れの群も通常飼料による生後４週間の予備飼育後、健常食又は高脂肪食（日本クレア社製、日本）を各群、次のように摂餌させた。

Ｎｏｒｍａｌ群は、生後４週目から通常飼料を引き続き、１２週に亘って自由摂取させて飼育を行った。ＨＦＤ−８Ｗ群は、生後４週目に、通常飼料から高脂肪食に変更し、８週に亘って自由摂取させて飼育を行った。ＮＡＳＨ群は、生後４週目に、通常飼料から高脂肪食に変更し、１２週に亘って自由摂取させて飼育を行った。ＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群は、生後４週目に通常飼料から高脂肪食に変更し、１２週に亘って自由摂取させて飼育を行った。ＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群は、バシディオマイセテスＸ抽出組成物乾燥粉末を水に溶解したものを被験物として、生後１２週目から１６週目までの５週間、１日の投与量が５００ｍｇ／ｋｇ体重となるようゾンデにより一日一回、経口投与した。

（３）血液検査
１２週間又は１６週間が経過した後に各試験群に対して一晩絶食をかけて空腹時採血を行い血液検査に供した。これらの結果を図１に示した。図１において、（ａ）〜（ｅ）は各試験群の血液検査結果を示すグラフであり、（ａ）はＡＬＴ濃度、（ｂ）はＡＳＴ濃度、（ｃ）はＡＰＬ濃度、（ｄ）はＴＣ濃度、（ｅ）はＴＧ濃度をそれぞれ示す。

ここで、計測項目であるアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼ（Ａｓｐａｒｔａｔｅ ｔｒａｎｓａｍｉｎａｓｅ：ＡＳＴ）、アラニンアミノトランスフェラーゼ（ＡＬＴ）及びアルカリホスファターゼ（Ａｌｋａｌｉｎｅ Ｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ：ＡＬＰ）は、いずれも肝臓組織中に存在し、細胞が傷害されると細胞外へ漏出するため（逸脱酵素）、これらの成分濃度は肝機能の状態を示す重要な指標となる。他に、総コレステロール（Ｔｏｔａｌ Ｃｈｏｌｅｓｔｅｒｏｌ：ＴＣ)、中性脂肪（Ｔｒｉｇｌｙｃｅｒｉｄｅ：ＴＧ）の計測を行った。

また、図１における各数値は、平均値±標準誤差で表し、統計学的検討には一元配置分散分析法（ｏｎｅ−ｗａｙ ＡＮＯＶＡ， ｆｏｌｌｏｗｅｄ ｂｙ Ｄｕｎｎｅｔｔ’ｓ法）を用い、Ｐ値が０．０５未満を有意とした。なお、後述する各試験（図２及び図４〜図６参照）においても、同様の分析法を用いて統計処理を行った。

図１に示すように、ＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群の肝機能パラメータは、ＮＡＳＨ群と比較してＡＬＴ濃度、ＡＳＴ濃度、ＡＬＰ濃度すべてにおいて有意に減少していた。また、ＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群ではＴＧ濃度及びＴＣ濃度がＮＡＳＨ群よりも低い傾向がみられた。

（４）各臓器量及び血糖値の測定
上記（１）の各試験後に犠死させた後に解剖して各試験群の体重（Ｂｏｄｙ ｗｅｉｇｈｔ：ＢＷ）に対する肝重量（Ｌｉｖｅｒ ｗｅｉｇｈｔ：ＬＷ）及び脾臓重量（Ｓｐｌｅｅｎ ｗｅｉｇｈｔ：Ｓｐ）と血糖値を測定し、その測定結果を図２に示した。図２において、（ａ）〜（ｃ）は各試験群の各臓器量及び血糖値の測定結果を示すグラフであり、（ａ）は肝重量／体重、（ｂ）は脾臓重量／体重、（ｃ）は血糖値をそれぞれ示す。

図２（ａ）に示した通り、ＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群の肝重量／体重（以下、「ＬＷ／ＢＷ」という）は、ＮＡＳＨ群と比較して減少傾向にあることが明らかになった。一方、図２（ｂ）及び（ｃ）に示した通り、ＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群の脾臓重量／体重（以下、「Ｓｐ／ＢＷ」という）及び血糖値は、ＮＡＳＨ群と比較して有意に減少した。これらのことから、バシディオマイセテスＸ抽出組成物乾燥粉末の摂取によりＳｐ／ＢＷ及び血糖値の増大が抑制されることが明らかになり、肝臓重量の減少傾向は肝腫大の改善を示唆し、脾臓重量の正常化は免疫系昂進の改善を示唆する。

（５）組織観察
上記（４）の解剖時に肝臓を採取し、ヘマトキシリン・エオシン染色（以下、「Ｈ＆Ｅ染色」という）及びマッソントリクローム（Ｍａｓｓｏｎ ｔｒｉｃｈｒｏｍｅ）染色（以下、「ＭＴ染色」という）を行って肝臓組織を観察し、その結果を図３に示した。

図３において、（ａ）〜（ｌ）は各試験群の組織観察結果を示す写真であり、（ａ）〜（ｄ）は肝臓像、（ｅ）〜（ｈ）はＨ＆Ｅ染色した肝臓組織像、（ｉ）〜（ｌ）はＭＴ染色した線維化領域像をそれぞれ示す。

各試験群の肝臓像の結果において、図３（ｄ）に示したＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群の肝臓は、図３（ａ）に示したＮｏｒｍａｌ群の肝臓形態と比較的近く、脂肪の沈着や炎症症状、肝細胞が風船のようにふくらむ風船様肝細胞及び肝細胞癌の形成等、ＮＡＳＨ特有の病理所見が抑制された。一方、図３（ｂ）に示したＨＦＤ−８Ｗ群の肝臓では脂肪肝を呈した。また、図３（ｃ）に示したＮＡＳＨ群の肝臓では、特に図中の丸で囲った領域において、風船様肝細胞及び肝細胞癌の形成等、ＮＡＳＨに特有の諸症状を明らかに呈した。

また、図３（ｅ）〜（ｈ）に示した通り、Ｈ＆Ｅ染色像の結果から、ＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群の肝臓は、Ｎｏｒｍａｌ群の肝臓形態と比較的近く、脂肪滴の沈着や炎症細胞の浸潤、風船様肝細胞及び肝細胞癌の形成等、ＮＡＳＨ特有の病理所見が抑制された一方で、ＨＦＤ−８Ｗ群の肝臓は脂肪肝を呈し、また、ＮＡＳＨ群の肝臓は上記のＮＡＳＨ特有の諸症状が顕著に現れた肝臓組織像であった。特に、図３（ｇ）に示したＮＡＳＨ群では脂肪滴がなくなっている箇所が垣間見られ、肝硬変まで至った症例（Ｂｕｒｎ ｏｕｔ ＮＡＳＨ)を彷彿とさせるまで症状が悪化した肝織像となった。なお、Ｈ＆Ｅ染色においては、脂肪は染色されないため、細胞内の白く抜けている部分が脂肪である。

更に、図３（ｉ）〜（ｌ）に示した通り、ＭＴ染色の結果から、ＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群の肝臓は、肝臓の線維化が顕著に抑制され、Ｎｏｒｍａｌ群の肝臓形態に比較的近い状態にまで改善したが、ＨＦＤ−８Ｗ群及びＮＡＳＨ群の肝臓切片上においては不可逆性の線維化を生じていることが観察された。特に、図３（ｋ）に示したＮＡＳＨ群では肝臓の線維化が顕著であった。

これらのことは、図３（ａ）〜（ｌ）に示すように、バシディオマイセテスＸがＮＡＳＨ特有の病理所見である脂肪滴の沈着や炎症細胞浸潤、肝臓の線維化、風船様肝細胞及び肝細胞癌の形成を抑制・改善すること、即ち、ＮＡＳＨから肝硬変及び肝細胞癌への移行を予防する機能を有することを強く示唆する。

（６）ウエスタンブロッティング
上記（２）の解剖時に採取し肝臓組織をポリトロンで処理し、ＢＣＡ（ｂｉｃｉｎｃｈｏｎｉｎｉｃａｃｉｄ）法によりタンパク質の定量を行った。その後、２×ｓａｍｐｌｅ ｂｕｆｆｅｒを加えてウエスタンブロッティングの試料とした。各試料中の総タンパクを１０％ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｌｙｌａｍｉｄｅｇｅｌ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ （ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲルを用いて１５０Ｖ、５０分で電気泳動し、１０Ｖ、６０分でニトロセルロース膜に転写した。転写後、この膜のバンドをＰｏｎｃｅａｎ Ｓで染色し確認した後、ＰＢＳで洗浄し、５％ＢＳＡを用いて１時間ｂｌｏｃｋｉｎｇを行った。

一次抗体として、ペルオキシソーム増殖剤活性化受容体（Ｐｅｒｏｘｉｓｏｍｅ Ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｏｒ−Ａｃｔｉｖａｔｅｄ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ：ＰＰＡＲ）α（１：１０００）、 ＰＰＡＲγ（１：１０００）、シトクロムＣ（Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ：ｃｙｔ ｃ）（１：１０００）、サーチュイン（Ｓｉｒｔｕｉｎ：ＳＩＲＴ）１（１：１０００）、グルコーストランスポーター４（Ｇｌｕｃｏｓｅ ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ ｔｙｐｅ ４：Ｇｌｕｔ４）（１：１０００）、核内因子κＢ（ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ‐ｋａｐｐａ Ｂ：ＮＦ−κＢ）（１：１０００）、活性化ＮＦ−κＢ（Ｐｈｏｓｐｈｏ‐ＮＦκＢ：ｐ−ＮＦ−κＢ）（１：１０００）、インターロイキン−１β（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐１β：ＩＬ−１β）（１：１０００）、（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ‐１β：ＩＬ−１０：ＩＬ−１０）（１：１０００）、及び内部標準であるグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｌｙｃｅｒａｌｄｅｈｙｄｅ−３−ｐｈｏｓｐｈａｔｅ−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ：ＧＡＰＤＨ）（１：８０００）を４℃の冷蔵室で一晩反応させた。

翌日、１×ＴＢＳ・Ｔｗｅｅｎ２０で洗浄した後、適宜、二次抗体としてａｎｔｉ−ｒａｂｂｉｔ（１：１００００）、ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ（１：１００００）、又は、ａｎｔｉ−ｇｏａｔ（１：１００００）を室温で１時間反応させた。イムノスターＬＤを用いてＣ−ＤｉＧｉｔブロットスキャナー（エムエステクノシステムズ社）で、それぞれのタンパク質の発現量を測定した。ｐ−ＮＦ−κＢの発現量は、対応するＮＦ−κＢで除することにより、また、ＰＰＡＲα、ＰＰＡＲγ、Ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ、ＳＩＲＴ１、Ｇｌｕｔ４、ＩＬ−１β、ＩＬ−１０の発現量は、対応するＧＡＰＤＨの発現量で除することにより、それぞれ群間比較し、これらの結果を図４〜図６に示した。

図４において、（ａ）〜（ｃ）は各試験群におけるウエスタンブロッティングによる各タンパク質の発現量の測定結果を示すグラフであり、（ａ）はＰＰＡＲα／ＧＡＰＤＨ、（ｂ）はＰＰＡＲγ／ＧＡＰＤＨ、（ｃ）はＣｙｔｏｃｈｒｏｍｅ Ｃ／ＧＡＰＤＨをそれぞれ示す。図５において、（ａ）及び（ｂ）は各試験群におけるウエスタンブロッティングによる各タンパク質の発現量の測定結果を示すグラフであり、（ａ）はＳＩＲＴ１／ＧＡＰＤＨ、（ｂ）はＧｌｕｔ４／ＧＡＰＤＨをそれぞれ示す。図６において、（ａ）〜（ｃ）は各試験群におけるウエスタンブロッティングによる各タンパク質の発現量の測定結果を示すグラフであり、（ａ）はｐ−ＮＦ−κＢ／ＮＦ−κＢ、（ｂ）はＩＬ−１β／ＧＡＰＤＨ、（ｃ）はＩＬ−１０／ＧＡＰＤＨをそれぞれ示す。

ＰＰＡＲは、ステロイドホルモン受容体スーパーファミリーに属する核内受容体のひとつであり、α、β、γの３型が存在する。ＰＰＡＲαは特に肝臓や心臓、消化管等、脂肪酸酸化の盛んな臓器に多く存在する。肝臓については、ＰＰＡＲの活性化を通じたペルオキシソームの増殖により、極長鎖脂肪酸のβ酸化や胆汁酸合成を始め、肝臓の様々な遺伝子の発現や酵素活性、代謝状態が急速且つ劇的に変化することが知られている。

図４（ａ）に示すように、ＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群におけるＰＰＡＲαの発現量が、ＨＦＤ−８Ｗ群、ＮＡＳＨ群それぞれのものと比較していずれも有意に増大した。このことは、バシディオマイセテスＸの投与により脂肪酸のβ酸化や胆汁酸合成等脂質代謝が昂進していることを示唆する。このことは一方で、図１（ｄ）及び（ｅ）に示した血中脂質（ＴＣ及びＴＧ）の改善傾向に寄与している可能性が示唆される。

また、脂肪細胞の分化に関与する蛋白質の一つであるＰＰＡＲγは、肥満時の肝臓（脂肪肝）においても発現が上昇することが知られている（『田中直樹、外１名、「信州医誌」、２００８年、第５６巻、第６号、ｐ．３４７−３５８』参照。図４（ａ）に示すように、バシディオマイセテスＸの投与により、ＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群におけるＰＰＡＲγの発現量が、ＨＦＤ−８Ｗ群、ＮＡＳＨ群それぞれのものと比較していずれも改善する傾向が見られた。

図５に示すように、ＨＦＤ−８Ｗ群、ＮＡＳＨ群と比較して、ＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群では、ＳＩＲＴ１及びＧｌｕｔ４の発現量が改善傾向にあることが示された。ＳＩＲＴ１及びＧｌｕｔ４の活性化はインスリン抵抗性を改善することが知られていることから、図２（ｃ）に示したＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群における血糖値の改善が、ＳＩＲＴ１及びＧｌｕｔ４の活性化を介したインスリン抵抗性の改善によるものであることが示唆される。

更にまた、未だ議論の余地はあるものの、遺伝子修復系の活性化を介して腫瘍抑制因子として作用する可能性が示唆されている（『大田秀隆、「日本老年医学会雑誌」、２０１０年、第４７巻、第１号、ｐ．１１−１６』参照）。このことは、本発明が、ＮＡＳＨを改善すること、特にＮＡＳＨから肝硬変及び肝細胞癌への移行を予防する機能を有することとの関連を示唆する。

図６（ａ）に示すように、ＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群におけるｐ−ＮＦ−κＢ／ＮＦ−κＢの発現量がＨＦＤ−８Ｗ群と比較して有意に減少した。ＮＦ−κＢが炎症のマスターレギュレーターとして炎症惹起に深く関与することから、その活性化の抑制は、肝臓における炎症状態の改善を示唆する。他方、先に述べたＰＰＡＲαの増大がＮＦ−κＢの活性を競合阻害することにより抗炎症作用を示すことは、本発明によるＮＡＳＨ改善効果がＰＰＡＲαの増大に起因するＮＦ−κＢの活性化抑制を介した抗炎症作用に基づくものとして説明し得る。また、図６（ｂ）及び（ｃ）に示すように、ＮＡＳＨ＋Ｍｕｓｈｒｏｏｍ群におけるＩＬ−１β／ＧＡＰＤＨやＩＬ−１０／ＧＡＰＤＨの発現量がＮｏｒｍａｌ群と比較して減少傾向にあることから、肝臓における炎症状態の改善の可能性を示唆する。

以上より、実施例１で得られたバシディオマイセテスＸ抽出組成物乾燥粉末を経口摂取することにより、主としてＰＰＡＲα、ＮＦ−κＢ、及びＳＩＲＴ１発現量制御を介した（１）肝臓組織修復効果、（２）肝臓組織における脂肪代謝の改善効果、（３）高血糖症状の改善効果、（４）脂肪滴の沈着、炎症細胞の浸潤、風船様肝細胞、及び肝細胞癌抑制作用が明らかとなった。

本発明の抗ＮＡＳＨ組成物は、以上で説明した通り、食生活の改善や運動療法による減量等の過重負荷を避けると共に、ＮＡＳＨ背景にある生活習慣病を標的とした薬剤の長期投与による副作用を懸念することなく、安全性の高い食品又は食経験の豊富な天然物由来の組成物である。これを摂取することにより、ＮＡＳＨの改善が期待できる。また、ＮＡＳＨ予防用食品組成物及びＮＡＳＨ予防用飲料組成物を、例えば日常生活で使用可能なサプリメント等の食品や飲料に含有して長期間経口摂取させるのみという安全かつ簡便なものである。

更に、本発明の抗ＮＡＳＨ組成物や肝硬変予防用組成物及び肝細胞癌予防用組成物の摂取により、主としてＰＰＡＲα、ＮＦ−κＢ、及びＳＩＲＴ１発現量制御を介した（１）肝臓組織修復効果、（２）肝臓組織における脂肪代謝の改善効果、（３）高血糖症状の改善効果、（４）脂肪滴の沈着、炎症細胞の浸潤、風船様肝細胞、及び肝細胞癌等ＮＡＳＨ特有の病理所見の抑制作用に基づき、ＮＡＳＨを改善する作用、特にＮＡＳＨから肝硬変及び肝細胞癌への発症を予防する作用が期待できる。

バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１

Claims (6)

1. バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１乾燥粉末又はその抽出組成物を有効成分とすることを特徴とするＮＡＳＨ改善用組成物。
2. 粉末、顆粒、錠剤、カプセル、溶液状及びゲル状から選択される何れかの形態であることを特徴とする請求項１に記載のＮＡＳＨ改善用組成物。
3. バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１乾燥粉末又はその抽出組成物を有効成分とすることを特徴とするＮＡＳＨ改善用食品組成物。
4. バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１乾燥粉末又はその抽出組成物を有効成分とすることを特徴とするＮＡＳＨ改善用飲料組成物。
5. バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１乾燥粉末又はその抽出組成物を有効成分とし、ＮＡＳＨから肝硬変への移行を予防することを特徴とするＮＡＳＨから肝硬変への移行予防用組成物。
6. バシディオマイセテスＸ（Ｂａｓｉｄｉｏｍｙｃｅｔｅｓ−Ｘ）ＦＥＲＭ ＢＰ−１００１１乾燥粉末又はその抽出組成物を有効成分とし、ＮＡＳＨから肝細胞癌への移行を予防することを特徴とするＮＡＳＨから肝細胞癌への移行予防用組成物。

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