JP6837073B2 - プライマー伸長中のプライマー−プライマー相互作用の排除 - Google Patents

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Description

本発明は、一般的に、核酸ターゲットのｉｎ ｖｉｔｒｏ分析に、そしてより具体的には、プライマー伸長による核酸ターゲット濃縮の改善法に関する。
プライマー二量体および他のプライマー−プライマー相互作用は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸合成反応の望ましくないアーチファクトである。一般的に、交差ハイブリダイゼーションまたは自己ハイブリダイゼーションが可能なプライマー配列を回避するために、プライマー設計ツールを用いる。しかし、プライマー二量体が形成され、そして伸長または複製されるようになるためには、相補性はほとんどまたはまったく必要とされないことが、研究によって示されてきている。Ｂｒｏｗｎｉｅ， Ｊ．ら（１９９７），Ｔｈｅ ｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｒｉｍｅｒ ｄｉｍｅｒｓ ｄｕｒｉｎｇ ＰＣＲ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ２５：３２３５。高濃度のプライマーおよび低濃度のターゲット配列が、プライマー−プライマー・アニーリングおよび伸長に、熱力学的に好ましい条件を生じるという説明が示唆される。
プライマー二量体は、試薬を消費し、そして真のターゲットの増幅と競合する望ましくない副産物を導きうる。したがって、プライマー−プライマー相互作用を排除するかまたは減少させる方法に関する必要性がある。こうした方法は、特に、稀な核酸ターゲットを検出しようとする適用に有益であろう。こうした方法は、特に、臨床診断に、そして新たに出現しつつある液体生検の分野に、またはヒト血漿における多数の稀な核酸ターゲットの検出に有益であろう。
いくつかの態様において、本発明は、プライマー−プライマー相互作用を減少させつつ、プライマー伸長によって核酸鎖を合成する方法であって：ターゲット核酸鎖を、核酸ポリメラーゼ、およびポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みを失速させる少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むプライマーと接触させる工程を含む、前記方法である。プライマーは、ターゲット配列に非相補的なリンカー配列によって分離されている、ターゲット配列に相補的な２つのアームからなる一本鎖オリゴヌクレオチドであることも可能である。ポリメラーゼは、古細菌Ｂファミリーポリメラーゼまたは複製ポリメラーゼであることも可能である。修飾ヌクレオチドは、ウラシル、脱塩基ヌクレオチドまたはピリミジン二量体であることも可能である。
別の態様において、本発明は、プライマー−プライマー相互作用を減少させつつ、試料中のターゲット核酸を増幅する方法であって：試料を、核酸ポリメラーゼ、およびポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みを失速させる少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、ターゲット核酸に相補的な第一のプライマーと接触させて、プライマー伸長産物を生成する、プライマー伸長工程；ならびに試料を、プライマー伸長産物に相補的な第二のプライマーと接触させる、指数関数的増幅工程を含む、前記方法である。プライマー伸長産物を、増幅工程前に二本鎖アダプターに連結することも可能である。アダプターおよび第一のプライマーは普遍的増幅プライマーの結合部位を含むことも可能であり、そして第二のプライマーは普遍的プライマーであることも可能である。プライマーは、ターゲット配列に非相補的なリンカー配列によって分離されている、ターゲット配列に相補的な２つのアームからなる一本鎖オリゴヌクレオチドであることも可能である。指数関数的増幅工程は、修飾ヌクレオチドに耐性であるポリメラーゼを利用することも可能である。いくつかの態様において、方法は、増幅工程の前に精製工程をさらに含み、ここで第一のプライマーおよびテンプレート核酸が、プライマー伸長産物から分離される。いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドはウラシルである。方法は、増幅工程の前にキャリーオーバー防止工程を含むことも可能であり、ここで試料をウラシルＤＮＡグリコシラーゼと接触させる。
別の態様において、本発明は、プライマー二量体形成を減少させつつ、プライマー伸長によって核酸鎖を合成するためのキットであって、核酸ポリメラーゼ、およびターゲット核酸の第一の鎖に相補的であり、そしてポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みを失速させる少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、第一のプライマーを含む、前記キットである。キットは、ターゲット核酸の第二の鎖に相補的な第二のプライマーまたはアダプターをさらに含むことも可能である。プライマーは、ターゲット配列に非相補的なリンカー配列によって分離されている、ターゲット配列に相補的な２つのアームからなる一本鎖オリゴヌクレオチドであることも可能である。
さらに別の態様において、本発明は、プライマー二量体形成を減少させつつ、プライマー伸長によって核酸鎖を合成するための反応混合物であって、核酸ポリメラーゼ、およびターゲット核酸の第一の鎖に相補的であり、そしてポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みを失速させる少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、第一のプライマーを含む、前記反応混合物である。
図１は、伸長不能プライマー二量体アーチファクトを示す、本発明の方法の図である。 図２は、ハイブリダイズし、そして伸長された分子反転プローブ（ＭＩＰ）によって形成されるアーチファクトの形成を示す図である。 図３は、分子反転プローブ（ＭＩＰ）によって形成される伸長不能アーチファクトを示す方法の図である。 図４は、場合による増幅工程を示す本発明の方法の図である。 図５は、分子反転プローブ（ＭＩＰ）を用いることによる、場合による増幅工程を示す本発明の方法の図である。
定義
用語「ポリメラーゼ」は、天然（その天然種から精製される）であってもまたは組換え体（形質転換宿主で産生され、そしてそこから精製される）であってもよい核酸ポリメラーゼを指す。本発明の背景において、ポリメラーゼは、元来のアミノ酸配列、または本発明の方法にしたがって修飾塩基で複製を失速させる能力をポリメラーゼが維持する限り、修飾アミノ酸配列を有することも可能である。
用語「失速させる」および「複製を失速させる」は、ポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みの速度を遅らせるかまたは完全に停止させることを指す。失速したポリメラーゼは基質に結合したままであることも可能であるし、または基質から解離することも可能である。
用語「修飾ヌクレオチド」は、アデノシン、グアノシン、チミジンまたはシトシン以外の塩基を含有するデオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドを指す。修飾ヌクレオチドは脱塩基性である（塩基を持たない）ことも可能である。修飾塩基は、天然に見られる修飾：脱アミド化、メチル化、酸化またはＵＶ誘導連結を含有することも可能である。修飾塩基は、天然に見られない修飾を含有することも可能である。
用語「プローブ」は、特に意図されるターゲット生体分子、例えば、プローブによって結合されるか、捕捉されるかまたはハイブリダイズされる関心対象の核酸配列に選択的に結合可能な任意の分子を意味する。
用語「アダプター」は、別の配列にさらなる特性を移入するように、その配列に付加可能なヌクレオチド配列を意味する。アダプターは一本鎖または二本鎖であることも可能であり、あるいは一本鎖部分および二本鎖部分の両方を有することも可能である。
用語「普遍的プライマー」および「普遍的プライミング部位」は、ターゲット配列にはもともと存在しないプライマーおよびプライミング部位を指す。典型的には、普遍的プライミング部位は、アダプターまたはターゲット特異的プライマー中に存在する。普遍的プライマーは、普遍的プライミング部位に結合し、そしてそこからプライマー伸長を指示することも可能である。
用語「プライマー二量体」は、同じ反応容器中に存在する２つのオリゴヌクレオチドプライマーのアニーリングの産物を指す。プライマー二量体は、２つの同一のプライマーまたは異なる配列を持つ２つのプライマーによって形成されることも可能である。プライマー二量体は、２つのプライマー間の塩基対形成の１またはそれより多い領域を伴うことも可能である。塩基対形成は、ワトソンクリック塩基対形成ならびに二本鎖核酸を安定化させるさらなる水素結合（例えばフーグスティーン対形成、または塩基スタッキング）であることも可能である。プライマー二量体は、アニーリングしたプライマーまたはアニーリングし、そして伸長されたプライマーを含むことも可能である。
用語「複製ポリメラーゼ」は、共通の特性および構造を共有する染色体レプリカーゼを指す。共通の特性には、一本鎖ＤＮＡテンプレートを利用して核酸プライマーを進行性に伸長する能力（デノボ合成ではない）が含まれる。共通の構造には、掌、指および親指ドメインが含まれる。Ｊｏｈａｎｓｓｏｎら（２０１３）， Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ, Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂ Ｐｅｒｓｐｅｃｔ Ｂｉｏｌ． ５（６）：ａ０１２７９９を参照されたい。複製ポリメラーゼには、ヒトおよび酵母ポリメラーゼ・イプシロンおよびポリメラーゼ・デルタ、古細菌Ｐｏｌ Ｂおよび真正細菌Ｐｏｌ ＩＩＩが含まれる。
本発明は、プライマー−プライマー相互作用を減少させつつ、プライマー伸長によって核酸鎖を合成する方法であって：ターゲット核酸鎖を、核酸ポリメラーゼ、およびポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みを失速させる少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含むプライマーと接触させる工程を含む、前記方法を提供する。プライマーは、ターゲット配列に非相補的なリンカー配列によって分離されている、ターゲット配列に相補的な２つのアームからなる一本鎖オリゴヌクレオチドであることも可能である。ポリメラーゼは、古細菌Ｂファミリーポリメラーゼまたは複製ポリメラーゼであることも可能である。修飾ヌクレオチドは、例えば、ウラシル、脱塩基修飾ヌクレオチドまたはピリミジン二量体であることも可能である。
本発明はまた、プライマー−プライマー相互作用を減少させつつ、試料中のターゲット核酸を増幅する方法であって：ａ）試料を、核酸ポリメラーゼ、およびポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みを失速させる少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、ターゲット核酸に相補的な第一のプライマーと接触させて、プライマー伸長産物を生成する、プライマー伸長工程；およびｂ）試料を、プライマー伸長産物に相補的な第二のプライマーと接触させる、指数関数的増幅工程を含む、前記方法も提供する。プライマー伸長産物を、工程ｂ）の前に二本鎖アダプターに連結することも可能である。アダプターおよび第一のプライマーが、普遍的増幅プライマーの結合部位を含み、そして第二のプライマーが普遍的プライマーであることも可能である。プライマーが、ターゲット配列に非相補的なリンカー配列によって分離されている、ターゲット配列に相補的な２つのアームからなる一本鎖オリゴヌクレオチドであることも可能である。指数関数的増幅工程が、修飾ヌクレオチドに耐性であるポリメラーゼを利用することも可能である。工程ｂ）の前に精製を行うことも可能である。修飾ヌクレオチドがウラシルであることも可能である。この工程において、方法は、工程ｂ）の前にキャリーオーバー防止工程をさらに含むことも可能であり、ここで試料をウラシルＤＮＡグリコシラーゼと接触させる。
本発明はまた、プライマー二量体形成を減少させつつ、プライマー伸長によって核酸鎖を合成するためのキットであって、核酸ポリメラーゼ、およびターゲット核酸の第一の鎖に相補的であり、そしてポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みを失速させる少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、第一のプライマーを含む、前記キットも提供する。前記キットは、ターゲット核酸の第二の鎖に相補的な第二のプライマー、および／またはアダプターをさらに含むことも可能である。プライマーは、ターゲット配列に非相補的なリンカー配列によって分離されている、ターゲット配列に相補的な２つのアームからなる一本鎖オリゴヌクレオチドであることも可能である。
本発明は、さらに、プライマー二量体形成を減少させつつ、プライマー伸長によって核酸鎖を合成するための反応混合物であって、核酸ポリメラーゼ、およびターゲット核酸の第一の鎖に相補的であり、そしてポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みを失速させる少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、第一のプライマーを含む、前記反応混合物を提供する。
本発明は、オリゴヌクレオチドプライマーが存在するｉｎ ｖｉｔｒｏ核酸合成反応中に起こるプライマー−プライマー相互作用を減少させ、そして排除する方法を含む。こうしたプライマー−プライマー相互作用はしばしば、オリゴヌクレオチドプライマー間の、部分的に相補的で、そして弱い塩基対形成による。こうした塩基対形成を最小限にするかまたは回避するための経験的なプライマー設計法およびソフトウェアツールが存在する。しかし、これらの方法は、多重反応には限定された適用可能性しか持たない。数ダースまたはさらには数百の異なるオリゴヌクレオチドプライマーが存在する場合、ある程度の交差相補性は、不可能ではないとしても回避が困難である。非常に多重化されたプライマー伸長または指数関数的増幅反応中、プライマー−プライマー相互作用は、一般的にプライマー二量体と称される望ましくない副産物を導きうる。これらの副産物に対する主要な寄与因子は、テンプレートとして別のプライマーを用いるプライマーのポリメラーゼ伸長である。交差相補性およびプライマー−プライマー・アニーリングは、防止することが困難である一方、アニーリングしたプライマー対の伸長を減少させるかまたは排除すると、望ましくない副産物の形成が減少するかまたは排除されるであろう。
１つの態様において、本発明は、プライマー二量体形成を減少させるかまたは排除しつつ、核酸ターゲットを増幅する方法である。該方法は、１またはそれより多いターゲット核酸を含有する試料を、核酸ポリメラーゼ、およびプライマー伸長中に核酸ポリメラーゼの失速を引き起こす修飾塩基を含有する１またはそれより多い伸長プライマーと接触させる工程を含む。核酸ポリメラーゼは、修飾ヌクレオチドが経路に存在する場合、プライマー二量体内でプライマーの伸長中に失速するであろう。ターゲット核酸は、修飾ヌクレオチドを含有するとは予期されず、そしてポリメラーゼはターゲット核酸にアニーリングしたプライマーの伸長中には失速しないであろう（図１）。
特定のポリメラーゼはＤＮＡ損傷部位を反映しうるテンプレート鎖における異常なヌクレオチドと出会った際、複製を失速させる。例えば、ＤＮＡ中のウラシルは、いくつかの古細菌ＢファミリーおよびＤファミリーポリメラーゼ、例えばＰｆｕポリメラーゼを含む、いくつかのポリメラーゼを失速させる。Ｗａｒｄｌｅら（２００７）， Ｕｒａｃｉｌ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ ｉｓ ｌｉｍｉｔｅｄ ｔｏ ｔｈｅ ａｒｃｈａｅａ， ｎｏｔ ｏｃｃｕｒｒｉｎｇ ｗｉｔｈ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ｅｕｋａｒｙａ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．， ３６：７０５を参照されたい。脱塩基部位は原核および真核複製酵素、例えば大腸菌（Ｅ． ｃｏｌｉ）のＰｏｌＩＩＩおよび酵母のポリメラーゼ・デルタを失速させる。Ｇｏｏｄｍａｎ， Ｍ． （２０００），Ｃｏｐｉｎｇ ｗｉｔｈ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ ‘ｔｒａｉｎ ｗｒｅｃｋｓ’ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ｕｓｉｎｇ Ｐｏｌ Ｖ, Ｐｏｌ ＩＩ ａｎｄ ＲｅｃＡ ｐｒｏｔｅｉｎｓ. Ｔｒｅｎｄｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍ． Ｓｃｉ．， ２５：１８９；およびＢｏｉｔｅｕｘら（２００４），Ａｂａｓｉｃ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ＤＮＡ: ｒｅｐａｉｒ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｏｎｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ, ＤＮＡ Ｒｅｐａｉｒ ３：１を参照されたい。ＵＶ光照射によって引き起こされるシクロブタンピリミジン二量体および（６−４）光分解生成物（ＴＴ二量体）もまた、古細菌および真核（哺乳動物を含む）複製ポリメラーゼを失速させることが知られる。Ｇｈｏｓａｌら（２０１３）， ＤＮＡ ｄａｍａｇｅ ｔｏｌｅｒａｎｃｅ: ａ ｄｏｕｂｌｅ-ｅｄｇｅｄ ｓｗｏｒｄ ｇｕａｒｄｉｎｇ ｔｈｅ ｇｅｎｏｍｅ, Ｔｒａｎｓｌ． Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ． ２：１０７； Ｊｏｚｗｉａｋｏｗｓｋｉら（２０１５）， Ａｒｃｈａｅａｌ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｖｅ ｐｒｉｍａｓｅｓ ｃａｎ ｐｅｒｆｏｒｍ ｔｒａｎｓｌｅｓｉｏｎ ＤＮＡ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ， ＰＮＡＳ １１２（７） Ｅ６３３−Ｅ６３８。修飾塩基とともに、ピリミジン二量体は、ホスホラミダイト（ｐｈｏｒｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅ）法を通じて、オリゴヌクレオチドプライマー内に取り込まれることも可能である。Ｙａｍａｍｏｔｏら（２００６）， Ｃｈｅｍｉｃａｌ ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ｏｆ ｏｌｉｇｏｄｅｏｘｙ-ｒｉｂｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ ｔｈｅ Ｄｅｗａｒ ｖａｌｅｎｃｅ ｉｓｏｍｅｒ ｏｆ ｔｈｅ （６-４） ｐｈｏｔｏｐｒｏｄｕｃｔ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ ｉｎ （６-４） ｐｈｏｔｏｌｙａｓｅ ｓｔｕｄｉｅｓ， Ｎｕｃｌ． Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ． ３４：４４０６。本明細書に記載する特定の例に加えて、本発明の説明は、プライマー内に取り込まれることが可能であり、そしてＤＮＡポリメラーゼを失速させることが可能である任意の他の修飾ヌクレオチド（既知であるかまたはこれから合成されるかいずれか）の使用を可能にする。
いくつかの態様において、方法は、１またはそれより多いウラシル、あるいは１またはそれより多い脱塩基部位、あるいは１またはそれより多いピリミジン二量体を含有する伸長プライマー、および古細菌ＢファミリーＤＮＡポリメラーゼ（例えばＰｆｕポリメラーゼ）と、試料を接触させる工程を含む。他の態様において、方法は、１またはそれより多いピリミジン二量体または脱塩基部位を含有する伸長プライマー、および真核または古細菌複製ＤＮＡポリメラーゼまたはその誘導体と、試料を接触させる工程を含む。
いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドを取り込むプライマーは、ターゲット核酸と部分的にまたは正確に相補性である単一領域から大部分なる、短いオリゴヌクレオチドである（図１）。ターゲットに相補的な領域に加えて、プライマーは、場合によって、下流工程のためのさらなる配列、例えば制限部位または普遍的増幅プライマー結合部位に相補的な配列、普遍的配列決定プライマー結合部位またはバーコードを含むことも可能である。
他の態様において、修飾ヌクレオチドを取り込むプライマーは、一本鎖および自己アニーリング二本鎖領域の組み合わせからなる複雑な二次構造を形成するよう設計されたオリゴヌクレオチドである。いくつかの態様において、オリゴヌクレオチドは分子反転プローブ（ＭＩＰ）である（図２）。ＭＩＰ構造は、Ｔｕｒｎｅｒら（２００９）， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｉｃ Ｐａｒｔｉｔｉｏｎｉｎｇ， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｈｕｍ． Ｇｅｎｅｔ．， １０：２６３に記載される。ＭＩＰは、ターゲット配列に非相補的なリンカー配列によって分離されている、ターゲット配列に相補的な２つのアームからなる一本鎖オリゴヌクレオチドである。ターゲット配列にプローブがハイブリダイズした際、プローブの５’および３’端が互いに離れているように、ターゲット配列内のプローブ相補配列は互いに離れている。ギャップは、ハイブリダイズしたプローブの３’端を伸長することによって充填可能である。鎖伸長後、２つの端を連結によってつなぐことも可能である。場合によるエキソヌクレアーゼ消化は、非環状化プローブを除去する。
ＭＩＰオリゴヌクレオチドは、場合によって、完全な環のため、プローブの３’端のアニーリングおよび伸長を可能にする、相補性領域を共有することも可能である。環は連結を経て、そしてエキソヌクレアーゼ処理に耐性になる（図２）。ポリメラーゼを遮断する修飾されたヌクレオチドがプライマー内に取り込まれた場合、プライマー伸長および続く連結が防止される（図３）。
いくつかの態様において、方法は、以前の工程で得たプライマー伸長の産物の増幅をさらに含む。プライマー伸長の産物は、プライマー本体に修飾ヌクレオチドを含有する。相補性の単一の領域を含むプライマーの場合（図１）、方法は、遺伝子特異的上流および下流プライマーを用いた増幅を含むことも可能である。
他の態様において、普遍的増幅プライマーを用いる。普遍的プライマーの結合部位は、最初のプライマー伸長プライマー内に、そしてプライマー伸長産物の３’末端に連結されるアダプター内に導入されることも可能である。一本鎖核酸へのアダプターの連結は当該技術分野に知られ、例えば、米国出願公報第２０１４０１９３８６０号を参照されたい。本質的に、方法は、普遍的連結部位を有する代わりに、一本鎖３’端オーバーハングがランダム配列、例えばランダム六量体配列を有する、アダプター集団を用いる。いくつかの態様において、最初のプライマー伸長プライマーは、普遍的プライマーの１つの結合部位を含み、そしてアダプターは、第二の普遍的プライマーの結合部位を含む（図４）。他の態様において、最初のプライマー伸長プライマーは、２つの普遍的プライマーの結合部位を含有する（図５）。
増幅は、テンプレート中の修飾ヌクレオチドの存在に耐性である、すなわち修飾ヌクレオチドと反対側の塩基を取り込み、そして鎖合成を完了させることが可能である核酸ポリメラーゼを用いて進行することも可能である。例えば、ウラシルをバイパスすることが可能なポリメラーゼには、好熱性細菌由来の熱安定性ポリメラーゼ、例えばサーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーマス・アクアティクス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓ）、サーマス・サーモフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）、サーマス・フラブス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ）、サーマス・フィリフォルミス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓ）、サーマス属種Ｓｐｓ１７、サーマス属種Ｚ０５、サーマス・カルドフィルス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓ）、サーモトガ・ネオポリタナ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅｏｐｏｌｉｔａｎａ）、およびサーモシフォ・アフリカヌス（Ｔｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓ）由来のポリメラーゼが含まれる。
いくつかの態様において、方法は、ターゲット核酸テンプレートおよび未使用のプライマーから、プライマー伸長産物を分離する工程をさらに含む。増幅工程でウラシル耐性ＤＮＡポリメラーゼを用いる場合、ウラシルを含む非伸長プライマー二量体を、反応混合物から除去しなければならない。
修飾ヌクレオチドを取り込んだプライマーが、ターゲット核酸と部分的なまたは正確な相補性を持つ単一領域から大部分なる短いオリゴヌクレオチドである（図１）態様において、プライマー伸長産物は、連結および第二鎖伸長を経ることも可能である。続いて、プライマーを含む一本鎖核酸をサイズによって分離することも可能である。
修飾ヌクレオチドを取り込んだプライマーが、一本鎖および自己アニーリング二本鎖領域の組み合わせからなる複雑な二次構造を形成するように設計されたオリゴヌクレオチド（例えばＭＩＰ、図２）である態様において、プライマー伸長産物は、未結合３’−ＯＨを含まない環状ＤＮＡに変換される。こうした態様において、未使用プローブおよびテンプレートＤＮＡは、エキソヌクレアーゼ消化によって除去可能である。一本鎖エキソヌクレアーゼ（例えばＥｘｏＩ）を用いて、未使用プライマーおよび変性ターゲットＤＮＡまたは試料ＤＮＡを除去することも可能であるし、そして二本鎖エキソヌクレアーゼ（例えばＴ７エキソヌクレアーゼ）を用いて、二本鎖ターゲットＤＮＡを除去することも可能である。エキソヌクレアーゼの混合物を用いて、連結された（環状化された）プローブを除き、試料中のすべての核酸の量を減少させることも可能である。
いくつかの態様において、修飾ヌクレオチドはウラシルである。ＤＮＡの指数関数的増幅をルーチンに行う施設において、ｉｎ ｖｉｔｒｏ合成されるＤＮＡへのウラシルの取り込みを、キャリーオーバー防止のために用いることも可能である。場合によって、以前のＤＮＡ増幅からのウラシル含有ＤＮＡ混入物を、ウラシル−Ｎ−ＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＮＧ）としてもまた知られるウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）によって分解することも可能である。Ｌｏｎｇｏら（１９９０）， Ｕｓｅ ｏｆ ｕｒａｃｉｌ ＤＮＡ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｓｅ ｔｏ ｃｏｎｔｒｏｌ ｃａｒｒｙ-ｏｖｅｒ ｃｏｎｔａｍｉｎａｔｉｏｎ ｉｎ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ ｃｈａｉｎ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ, Ｇｅｎｅ ９３：１２５を参照されたい。この態様において、プライマー伸長工程後に、そして指数関数的増幅工程前に、ＵＤＧ処理を実行する。プライマー伸長工程は、（伸長プライマーを除いて）プライマー伸長産物がいかなるウラシルも取り込まないように、反応混合物中にｄＵＴＰを含まずに実行される。増幅工程において、いくつかの態様は、ウラシル耐性ＤＮＡポリメラーゼおよびｄＵＴＰを利用して、将来のキャリーオーバー防止を可能にするであろう。いくつかの態様において、場合によるＵＤＧ処理は実行されない。ウラシル含有テンプレートは、本発明にしたがって、ウラシルによって遮断されたポリメラーゼが用いられる場合、プライマー伸長を可能にしない。非伸長プライマーを伴う一本鎖キャリーオーバー核酸はヌクレアーゼで消化される。
本発明の方法をより複雑な実験設計の一部として用いることも可能である。いくつかの態様において、プライマー伸長または続く増幅の産物を、ハイスループット一分子配列決定を含めた、核酸配列決定プロトコルに用いる。具体的には、方法は、ライブラリー生成工程の一部であることも可能であり、ここで、多重プライマー伸長（および場合による増幅）は、配列決定すべきターゲット核酸のライブラリーを生成する。ライブラリー中のターゲット核酸を修飾して、分子同定（ユニーク分子ＩＤ（ＭＩＤ））および試料同定（多重試料ＩＤ（ＳＩＤ））のためのバーコードを取り込ませることも可能である。これらのバーコード配列を、一方または両方のプライマー、あるいはアダプター内に取り込むことも可能である。
当該技術分野に知られる任意の方法によって、配列決定を実行することも可能である。特に好都合であるのは、ハイスループット一分子配列決定である。こうした技術の例には、Ｉｌｌｕｍｉｎａ ＨｉＳｅｑプラットホーム（Ｉｌｌｕｍｉｎａ、カリフォルニア州サンディエゴ）、Ｉｏｎ Ｔｏｒｒｅｎｔプラットホーム（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、ニューヨーク州グランドアイランド）、ＳＭＲＴ（登録商標）試薬を利用するＰａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓプラットホーム（Ｐａｃｉｆｉｃ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ、カリフォルニア州メンローパーク）、あるいはＧｅｎｉａ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（カリフォルニア州マウンテンビュー）またはＯｘｆｏｒｄ Ｎａｎｏｐｏｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（英国ケンブリッジ）によって開発されたナノポアに基づく配列決定技術、あるいは合成による配列決定を伴うまたは伴わない、任意の他の現存のまたは将来の一分子配列決定技術が含まれる。いくつかの態様において、配列決定は、ターゲット核酸の一端または両端に連結されたアダプター、あるいは配列決定の前にターゲット核酸をコピーするかまたは増幅するために用いられたプライマーに存在する普遍的プライマー部位を利用する。さらに他の態様において、配列決定のために、遺伝子特異的プライマーを用いる。
本発明の方法で用いる試料は、核酸を含有する、個体（例えばヒト患者）由来の任意の試料、あるいは環境試料または実験室調製物を含む。ポリヌクレオチドを試料から抽出することも可能であるし、または試料を直接、本発明の方法に供することも可能である。出発試料はまた、抽出されたまたは単離された核酸、ＤＮＡまたはＲＮＡであることも可能である。試料は、生物から得られた任意の組織または液体に相当することも可能である。例えば、試料は腫瘍生検あるいは血液または血漿試料であることも可能である。いくつかの態様において、試料は、ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）試料である。試料は、１またはそれより多い供給源、例えば１人またはそれより多い患者由来の核酸を含むことも可能である。いくつかの態様において、組織は病原体に感染しており、そしてしたがって、宿主および病原体の核酸を含有することも可能である。
ＤＮＡ抽出法は、当該技術分野に周知である。Ｊ． Ｓａｍｂｒｏｏｋら， ”Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，” １９８９， 第２版， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ： Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， Ｎ．Ｙ．）を参照されたい。生物学的試料から核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ）を抽出するための多様なキットが商業的に入手可能である（例えば、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（カリフォルニア州パロアルト）、Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（ウィスコンシン州マディソン）； Ｇｅｎｔｒａ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｉｎｃ．（ミネソタ州ミネアポリス）；およびＱｉａｇｅｎ， Ｉｎｃ．（カリフォルニア州バレンシア）、Ａｍｂｉｏｎ， Ｉｎｃ．（テキサス州オースティン）； ＢｉｏＲａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（カリフォルニア州ハーキュルス）；およびその他多数。
いくつかの態様において、本発明の方法で用いる出発試料は、ライブラリー、例えば複数のポリヌクレオチドを含むゲノムライブラリーまたは発現ライブラリーである。他の態様において、本発明のプライマー伸長法を用いて、ライブラリーを生成する。出発材料が生物学的試料であるため、方法は、増幅ライブラリー、または多様な配列に相当するアンプリコンのコレクションを生成する。ライブラリーを貯蔵し、そしてライブラリー中の核酸のさらなる増幅または配列決定のため、複数回用いることも可能である。
いくつかの態様において、本発明は、プライマー二量体を回避するかまたはその数を減少させた、ターゲット核酸のプライマー伸長のためのキットである。キットは、修飾塩基を含有する１またはそれより多いターゲット特異的プライマー、およびテンプレート鎖中の修飾塩基に到達した際に、鎖合成を失速させる核酸ポリメラーゼを含む。いくつかの態様において、ポリメラーゼは古細菌ポリメラーゼである。いくつかの態様において、修飾塩基はウラシルであり、そしてポリメラーゼは古細菌Ｂファミリーポリメラーゼである。他の態様において、修飾ヌクレオチドは脱塩基性であり、そしてポリメラーゼは複製ポリメラーゼである。さらに他の態様において、修飾ヌクレオチドはピリミジン二量体であり、そしてポリメラーゼは複製ポリメラーゼである。いくつかの態様において、キットはさらにアダプターを含む。アダプターは、さらなるｉｎ ｖｉｔｒｏ分析工程に必要な配列、例えば１またはそれより多い分子バーコード、連結部位および普遍的プライマー結合部位を含むことも可能である。キットはまた、核酸合成、増幅、連結、ならびに過剰なプライマーおよびプローブのエキソヌクレアーゼ消化を含む精製のための試薬および酵素も含む。
いくつかの態様において、本発明は、プライマー二量体を回避するかまたはその数を減少させた、ターゲット核酸のプライマー伸長のための反応混合物である。反応混合物は、修飾塩基を含有する１またはそれより多いターゲット特異的プライマー、およびテンプレート鎖中の修飾塩基に到達した際に、鎖合成を失速させる核酸ポリメラーゼを含む。いくつかの態様において、ポリメラーゼは古細菌ポリメラーゼである。いくつかの態様において、修飾塩基はウラシルであり、そしてポリメラーゼは古細菌Ｂファミリーポリメラーゼである。他の態様において、修飾ヌクレオチドは脱塩基性であり、そしてポリメラーゼは複製ポリメラーゼである。さらに他の態様において、修飾ヌクレオチドはピリミジン二量体であり、そしてポリメラーゼは複製ポリメラーゼである。
実施例１（予言的）分子反転プローブ（ＭＩＰ）の交差反応性を減少させたターゲット捕捉
分子反転プローブ（ＭＩＰ）は、次世代配列決定適用において、ターゲット配列を濃縮させるために用いられてきている。用いるプローブプールは、数百そしてさらに数千のターゲットアンプリコンを生成しうる。しかし、数百または数千の他のプローブの背景においてよく働くプローブを設計することは容易ではない。これは、最終ライブラリーにおいて、望ましくない産物を生成する、プローブ間の相互作用が起こりうるためである。この状況は、これらのプローブにおいてユニークな識別子配列を用いた際に悪化する可能性もあり、これはこれらが配列決定を通じた分子同定を可能にするために、プローブ内に操作されるランダム配列であるためである。分子反転プローブ内へのウラシル塩基の取り込みは、２つのプローブが相互作用した際に、ポリメラーゼ伸長をブロッキングすることにより、望ましくない産物の生成を減少させるはずである。
図２に示すように、１つのＭＩＰが別のＭＩＰにハイブリダイズする場合、プライマー伸長が開始し、連結が環を閉じ、そして生じた産物はヌクレアーゼ消化から保護される。本発明にしたがって、ウラシルを含有するＭＩＰを、ＭＩＰに関して推奨される標準的反応条件にしたがって、ターゲット核酸およびポリメラーゼとインキュベーションする。反応混合物をプライマー伸長、連結、および場合によって、続く増幅に供する。直鎖（非環状）核酸をエキソヌクレアーゼで消化する、場合による工程がある。一本鎖および二本鎖エキソヌクレアーゼ（ＥｘｏＩおよびＴ７エキソヌクレアーゼ）の混合物を用いる。図３に示すように、プライマー−プライマー相互作用はハイブリダイゼーションを生じる可能性があるが、ハイブリダイゼーション産物において、プライマー伸長および連結は存在しない。増幅工程中、ハイブリダイゼーション産物は増幅不能である。ウラシル耐性ポリメラーゼで、続く増幅を行う。キャリーオーバー防止が望ましい場合、プライマー伸長工程後、反応混合物をＵＤＧで処理する。続くキャリーオーバー防止が望ましい場合、ｄＵＴＰの存在下で増幅を行う。

Claims (8)

  1. プライマー−プライマー相互作用を減少させつつ、試料中のターゲット核酸を増幅する方法であって：
    ａ.試料を、核酸ポリメラーゼ、およびポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みを失速させる少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、ターゲット核酸に相補的な第一のプライマーと接触させて、プライマー伸長産物を生成する、プライマー伸長工程；
    ｂ.該プライマー伸長産物を二本鎖アダプターに連結する；および
    ｃ.該試料を、プライマー伸長産物に相補的な第二のプライマーと接触させる、指数関数的増幅工程
    を含み、
    該プライマーが、ターゲット配列に非相補的なリンカー配列によって分離されている、ターゲット配列に相補的な２つのアームからなる一本鎖オリゴヌクレオチドである、
    前記方法。
  2. 前記アダプターおよび第一のプライマーが、普遍的増幅プライマーの結合部位を含み、そして前記第二のプライマーが普遍的プライマーである、請求項１の方法。
  3. 前記指数関数的増幅工程が、修飾ヌクレオチドに耐性であるポリメラーゼを利用する、請求項１または２の方法。
  4. 工程ｃの前に精製工程をさらに含み、ここで第一のプライマーおよびテンプレート核酸が、プライマー伸長産物から分離される、請求項１〜３のいずれか１項の方法。
  5. 前記修飾ヌクレオチドがウラシルである、請求項１〜４のいずれか１項の方法。
  6. 工程ｃの前にキャリーオーバー防止工程をさらに含み、ここで試料をウラシルＤＮＡグリコシラーゼと接触させる、請求項５の方法。
  7. 請求項１〜６のいずれか１項の方法にしたがって、試料におけるターゲット核酸を増幅するためのキットであって、
    核酸ポリメラーゼ、
    ポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みを失速させる少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、プライマー伸長産物を生成するための、ターゲット核酸に相補的な第一のプライマー、
    該プライマー伸長産物に連結するための二本鎖アダプター、および
    該プライマー伸長産物に相補的な第二のプライマー、
    を含み、
    該プライマーが、ターゲット配列に非相補的なリンカー配列によって分離されている、ターゲット配列に相補的な２つのアームからなる一本鎖オリゴヌクレオチドである、
    前記キット。
  8. 請求項１〜６のいずれか１項の方法にしたがって、試料におけるターゲット核酸を増幅するための反応混合物であって、
    核酸ポリメラーゼ、および
    ポリメラーゼによるヌクレオチド取り込みを失速させる少なくとも１つの修飾ヌクレオチドを含む、プライマー伸長産物を生成するための、ターゲット核酸に相補的な第一のプライマー、
    を含み、
    該プライマーが、ターゲット配列に非相補的なリンカー配列によって分離されている、ターゲット配列に相補的な２つのアームからなる一本鎖オリゴヌクレオチドである、
    前記反応混合物。
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