JP6837632B2 - 体液試料の単位量当たりのセルフリーｄｎａ量を健康状態の評価のための指標とする方法 - Google Patents

Description

本発明は、体液中のセルフリーＤＮＡ（ｃｆＤＮＡ）量に基づいて、比較的非侵襲的に、がん患者、特に腫瘍切除後のがん患者の健康状態、特に、腫瘍の再発や転移、化学療法の奏功性や副作用等を評価する方法に関する。
本願は、２０１５年７月１７日に日本に出願された特願２０１５−１４３３００号及び２０１６年３月１０日に日本に出願された特願２０１６−０４７５２３号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。

抗がん剤の治療効果予測因子としてシグナル伝達に関与する癌遺伝子上の体細胞変異が注目を集めている。例えば、大腸がん治療における分子標的薬である抗ＥＧＦＲ（上皮成長因子受容体）抗体薬であるセツキシマブやパニツムマブの治療効果予測因子として、ＲＡＳ遺伝子変異が挙げられる。また、肺がん治療におけるゲフィチニブ、エルロチニブ等の低分子化合物の分子標的薬の治療効果予測因子として、ＥＧＦＲの点突然変異や欠損等が挙げられる。また、白血病におけるイマチニブ奏功性予測因子として、ＢＣＲ−ＡＢＬ融合遺伝子や、ＥＧＦＲ陰性肺がん患者におけるＥＭＬ４−ＡＬＫ融合遺伝子等も、実際の臨床現場にて検査が行われている。

分子治療薬の治療効果予測のためには、一般的に、腫瘍組織の体細胞変異が指標となることから、生検により採取された腫瘍組織サンプル中の癌遺伝子の遺伝子型を検査することになる。また、体細胞変異がいつ生じてもおかしくはないため、治療効果予測因子となる体細胞変異は、経時的にモニタリングし、リアルタイムに癌の状態を把握することが望ましい。しかしながら、化学療法を受ける患者の大半は肺や肝臓などの体の深部に腫瘍が存在する。そのため、これらの部位からの生検は患者にとって非常に大きな侵襲であり、経時的に生検を行うことは困難である。

一方で近年、がん患者では健常者に比べて、血中のｃｆ（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）ＤＮＡ量が多く、血中のｃｆＤＮＡ量が腫瘍マーカーとして期待できることが報告されている（例えば、非特許文献１参照。）。また、大腸がんに対する抗ＥＧＦＲ抗体薬の薬剤耐性獲得の有無が、腫瘍組織中のＫＲＡＳ遺伝子の体細胞変異と同様に、血中のｃｆＤＮＡ中のＫＲＡＳ遺伝子の体細胞変異とも相関することも報告されている。すなわち、血中のｃｆＤＮＡ中のＫＲＡＳ遺伝子の体細胞変異を検出することによって腫瘍の状態を把握できることも報告されている（例えば、非特許文献２及び３参照。）。通常の生検では繰り返し生検が難しい場合においても、血液を組織の代理検体とすることにより、体細胞変異のモニタリングが可能になりつつある。

しかし、末梢血中のがん細胞などから遺伝子変異を検出するためには、大量の末梢血を一度に大量に採血する必要が有り、がん患者にとっては肉体的負担が大きい。また、遺伝子変異の検出は通常２週間程度を要し、結果を得るまでに時間がかかることも現場医師の治療判断を遅らせることにも繋がる。このため、より迅速に入手可能な治療効果予測のための情報が求められている。ｃｆＤＮＡは少量の血液からでも簡便に回収できるため、臨床検査における患者の負担軽減、治療判断の迅速化が期待できる。

Schwarzenbach，et al.，Nature Review，2011，vol.11，p.426−437. Misale，et al.，Nature，2012，vol.486(7404)，p.532−536. Diaz，et al.，Nature，2012，vol.486(7404)，p.537−540.

本発明は、がん患者、特に腫瘍切除後のがん患者の健康状態、特に、腫瘍の再発や転移、化学療法の奏功性や副作用等を、組織生検採取よりも低侵襲な方法で採取した体液等のサンプル中のｃｆＤＮＡ量に基づいて評価することを目的とする。

本発明者等は、前記課題を解決すべく鋭意研究した結果、体液中のｃｆＤＮＡ量は、腫瘍切除処理により短期的に上昇するが、その後には低い水準で安定すること、また、腫瘍の再発や転移が生じたり、化学療法による副作用が生じた場合には上昇する傾向を見出し、本発明を完成させた。

本発明の第一態様に係る体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量を健康状態の評価のための指標とする方法は、腫瘍切除後の被検者から採取された体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量を測定し、前記体液試料が、血液、血清、又は血漿であり、測定された前記セルフリーＤＮＡ量を、基準値と比較し、前記被検者の健康状態を評価し、前記基準値が、前記被検者から前記腫瘍切除から４２〜９０日が経過した時点に採取された体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量であり、前記被検者の健康状態を評価する際、前記セルフリーＤＮＡ量が前記基準値よりも高い場合に、前記被検者の腫瘍巣が増大している若しくは新たな転移が生じている、若しくは腫瘍巣が増大する若しくは新たな転移が生じる可能性が高い、又は前記被検者の腫瘍巣は増大しておらず、新たな転移も生じていないが、健康状態が悪化している若しくは悪化する可能性が高い、と評価する。
上記第一態様において、前記体液試料が腫瘍切除後の被検者から経時的に採取された体液試料であり、前記体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量をモニタリングし、前記被検者の健康状態を経時的に評価してもよい。
上記第一態様において、前記被検者の体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量が増加傾向にある場合に、前記被検者の腫瘍巣が増大している若しくは新たな転移が生じている、若しくは腫瘍巣が増大する若しくは新たな転移を生じる可能性が高い、又は前記被検者の腫瘍巣は増大しておらず、新たな転移も生じていないが、健康状態が悪化している若しくは悪化する可能性が高い、と評価してもよい。
上記第一態様において、前記被検者が化学療法を受けており、前記被検者の健康状態を評価する際、前記セルフリーＤＮＡ量が前記基準値よりも高い場合に、前記化学療法による副作用が生じている若しくは生ずる可能性が高いと評価してもよい。
上記第一態様において、前記被検者が化学療法を受けており、前記被検者の健康状態を評価する際、前記セルフリーＤＮＡ量が前記基準値よりも高い場合に、前記化学療法が効果を奏していないと評価してもよい。
上記第一態様において、前記化学療法に使用される化学療法剤が、フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチン、カペシタビン、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、イリノテカン、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブから選択される一種以上であってもよい。
上記第一態様において、前記基準値が、血漿１ｍＬ当たり１０００ｎｇのセルフリーＤＮＡ量であってもよい。
上記第一態様において、体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量の測定を、吸光度法、インターカレート法、リアルタイムＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法、次世代シーケンサー法、又は電気化学的検出方法により行ってもよい。
上記第一態様において、前記腫瘍が、転移性髄芽腫、消化管間質腫瘍、隆起性皮膚線維肉腫、結腸直腸癌、大腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、慢性骨髄増殖性疾患、急性骨髄性白血病、甲状腺癌、すい臓癌、膀胱癌、腎臓癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頚部癌、脳腫瘍、肝細胞癌、血液悪性腫瘍、又はこれらの癌を引き起こす前癌であってもよい。
上記第一態様において、前記被検者の健康状態を評価する際、化学療法の継続若しくは休止、又は使用する化学療法剤の変更を行うか否かの決定のための資料とされてもよい。

本発明の第二態様に係る体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量を抗がん剤に対する長期奏功性の予測のための指標とする方法は、抗がん剤を投与された被検者から経時的に採取された２以上の体液試料について、単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量を測定し、前記被検者の体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量をモニタリングし、得られた前記セルフリーＤＮＡ量を、予め設定された基準値と比較し、前記セルフリーＤＮＡ量が、前記基準値超から前記基準値以下にまで低下した場合、又は全ての体液試料の前記セルフリーＤＮＡ量が前記基準値以下の場合に、前記被検者は前記抗がん剤に対して長期奏功性が得られると予測し、前記セルフリーＤＮＡ量が、前記基準値以下の状態から前記基準値超にまで上昇した場合、又は全ての体液試料の前記セルフリーＤＮＡ量が前記基準値超の場合に、前記被検者は前記抗がん剤に対して長期奏功性が得られないと予測し、前記基準値が、前記被検者から腫瘍切除から４２〜９０日が経過した時点に採取された体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量であり、前記体液試料が、血液、血清、又は血漿である。
上記第二態様において、前記基準値が、血清又は血漿１ｍＬ当たり２０ｎｇのセルフリーＤＮＡ量であってもよい。
上記第二態様において、前記長期奏功性が、少なくとも６ヶ月、腫瘍組織の体積の増大、転移、又は再発が生じないことであってもよい。
上記第二態様において、前記被検者が、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、食道癌、頭頸部癌、子宮癌、及び子宮頸癌からなる群より選択される１種又は２種以上に罹患していてもよい。
上記第二態様において、前記抗がん剤が、ＥＧＦＲ阻害剤及びＶＥＧＦ阻害剤からなる群より選択される１種以上であってもよい。

本発明の上記態様に係る健康状態の評価方法により、腫瘍切除後の被検者の健康状態、特に腫瘍の再発や転移、化学療法の奏功性や副作用等を、生検等の侵襲的で負担の大きい検査を要することなく、比較的非侵襲的に感度よく評価することができる。
また、本発明の上記態様に係る抗がん剤に対する長期奏功性の予測方法により、抗がん剤治療を受けている被検者について、当該抗がん剤の長期奏効性を比較的非侵襲的に予測することができる。

実施例１において、ＦＯＬＦＯＸ化学療法の投与レジメンを示した図である。 実施例１において、ｍＦＯＬＦＯＸ＋パニツムマブの併用療法の投与レジメンを示した図である。 実施例１において、ベバシズマブ併用ＸＥＬＯＸ化学療法の投与レジメンを示した図である。 実施例１において、患者Ａの経時的なｃｆＤＮＡ量の変化を示した図である。 実施例１において、患者Ｂの経時的なｃｆＤＮＡ量の変化を示した図である。 実施例１において、患者Ｃの経時的なｃｆＤＮＡ量の変化を示した図である。 実施例１において、患者Ｄの経時的なｃｆＤＮＡ量の変化を示した図である。 実施例１において、患者Ｅの経時的なｃｆＤＮＡ量の変化を示した図である。 実施例１において、患者Ｆの経時的なｃｆＤＮＡ量の変化を示した図である。 実施例２において、患者Ｇの経時的なｃｆＤＮＡ量の変化を示した図である。 実施例３において、ベバシズマブ併用ＸＥＬＯＸ化学療法の投与レジメンを示した図である。 実施例３において、ケース４のがん患者のＣＴ撮像図である。 実施例３において、ケース５のがん患者のＣＴ撮像図である。

＜健康状態の評価方法＞
本発明の一実施形態に係る健康状態の評価方法は、体液中のｃｆＤＮＡ量を指標として用いて、腫瘍切除後の被検者の健康状態を評価することを特徴とする。具体的には、腫瘍切除後の被検者から採取された体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量を測定する定量工程と、前記定量工程において得られた前記ｃｆＤＮＡ量を、基準値と比較し、前記被検者の健康状態を評価する評価工程と、を有する。

後記実施例で示すように、がん患者の末梢血等の体液中の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量は、腫瘍の悪性度が高いほど多くなる。例えば、体液中の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量は、腫瘍組織の体積が大きくなるほど多くなり、転移が生じると転移前よりも多くなり、再発すると再発前よりも多くなる。このため、体液中の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量を、転移や再発の可能性等を評価するための指標として用いることができる。

また、腫瘍患者が化学療法等の治療を受けている場合、当該治療が適切に奏功している場合には、当該患者において腫瘍の悪性化（腫瘍の増大又は新規転移）は抑制されている。そのため、体液中の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量もさほど増大しない。一方で、当該治療が適切に奏功していない場合には、当該患者において腫瘍の増大等が進行する。その結果、体液中の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量が増大する。すなわち、体液中の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量は、化学療法等の治療の奏功性の評価又は予測のための指標となり得る。

腫瘍患者が比較的重篤な副作用が問題となる化学療法を受けている場合、当該化学療法が奏功しており、腫瘍の増大等が抑制されている場合であっても、副作用により患者の健康状態が悪化すると、末梢血等の体液中の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量は多くなる傾向にある。実際に、化学療法の副作用により肺炎など別の合併症を引き起こしている患者中のＤＮＡ量も増加する傾向にある。このため、体液中の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量は、化学療法等の副作用の有無や副作用の強度の評価又は副作用のリスク予測のための指標にもできる。

このように、腫瘍切除後のがん患者の健康状態、例えば、再発及びその可能性、転移及びその可能性、薬剤奏功状態、副作用の影響等について、体液中の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量に基づいて評価することができる。なお、従来、がん患者の末梢血中のｃｆＤＮＡ量が、健常者に対して増加することは知られていた。しかしながら、この従来の知見と、薬剤奏功状態、転移、再発可能性、副作用状態などとに相関があることは未だ報告されていない。

また、腫瘍切除後のがん患者においては、再発や転移が生じた場合には速やかに検出し適切な治療を施すことが重要である。このため、再発や転移の有無について、定期的に検査が行われる。この際、被検者への侵襲性やコスト等の点から、臨床実務上、ＣＴ（コンピュータ断層撮影）を高頻度に使うことはあまりされておらず、抹消血（血液）中のＣＥＡやＣＡ−１９などのごく一般的な腫瘍マーカーをモニタリングする方法が用いられている（日本の公的保険では、ＣＴは６ヶ月に１回、採血は月１回が認められている）。しかし、これらの腫瘍マーカーは、腫瘍が存在していても異常値を示さないことは稀ではない。また健常者であったり、腫瘍を持つ患者が腫瘍以外の疾患に罹患することによっても、しばしば基準値を超えてしまうことがあり、確度が低いという問題がある。本実施形態に係る健康状態の評価方法では、腫瘍切除後のがん患者を体液中の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量に基づいて評価する。そのため、ＣＥＡやＣＡ−１９等の特定の腫瘍マーカーにのみ基づく場合よりも、比較的高い確度で信頼性の高い評価が期待できる。

また、治療効果を予測する方法としては、例えば、ＥＧＦＲ阻害剤の治療効果予測因子としてＫＲＡＳ遺伝子変異が用いられている。ただし、ＫＲＡＳ遺伝子変異がない患者においてもＥＧＦＲ阻害剤が奏功しないケースも有る。また、術後再発をモニタリングする際には、原発巣がＫＲＡＳ遺伝子変異型だった患者のケースに限定される。これに対して、本実施形態に係る健康状態の評価方法は、患者の遺伝子型にかかわらず薬剤奏功状態を評価することができる。そのため、腫瘍組織中の体細胞変異のステイタスを検出する必要がなく、化学療法剤の治療効果の予測に臨床上非常に有用である。このように、腫瘍組織中のＫＲＡＳなどの癌関連遺伝子のステイタスではなく、血中のＤＮＡ量そのものを指標とし、化学療法が適切に作用しているかどうかを評価することは、本発明者らによってはじめて見出された知見である。特に、ＶＥＧＦ（血管内皮細胞増殖因子）阻害剤の奏功性予測に利用可能な特異的な核酸マーカーは未だない。しかしながら、本実施形態に係る健康状態の評価方法により、ＶＥＧＦ阻害剤の治療効果の予測を行うこともできる。

本実施形態に係る健康状態の評価方法の定量工程において、体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量の測定方法は特に限定されず、ＤＮＡの定量的検出のために使用されている方法の中から適宜選択して用いることができる。当該方法としては、吸光度法、インターカレート法、リアルタイムＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法、次世代シーケンサー法、及び電気化学的検出方法等が挙げられる。これらの方法は常法により行うことができる。

吸光度法やインターカレート法、電気化学的検出方法は、ＤＮＡ測定において最も汎用性が高く簡便な方法である。吸光度測定によりＤＮＡ濃度を測定する場合は、体液試料から精製されたＤＮＡを用いることが好ましい。体液試料からＤＮＡの抽出・精製は、常法により行うことができ、市販されている一般的な抽出キット、精製キットを用いることもできる。また、インターカレート法に用いられる蛍光インターカレーターとしては、例えば、ピコグリーン、サイバーグリーン、エチジウムブロマイド、チアゾールオレンジ、オキサゾールイエロー等が挙げられる。

また、リアルタイムＰＣＲ法やデジタルＰＣＲ法は、ＤＮＡの定量的検出を高感度に行える点で好ましい。また、デジタルＰＣＲと同様の理論により、次世代シーケンサーを用いたｃｆＤＮＡ量の定量も可能である。但し、血清又は血漿中のＤＮＡは断片化がおきていることが既に報告されており、ＰＣＲ産物長が１００〜２００ｂｐ程度、若しくは１００ｂｐ以下になるようにプライマーを設計することが好ましい。

例えば、血液試料中のｃｆＤＮＡ量は、デジタルＰＣＲを用いて検出することによって決定できる。特にバイオラッド社のドロップレットデジタルＰＣＲ（ｄｄＰＣＲ）の技術（Hindson，et.al.，Analytical Chemistry，2011，vol.83（22），pp. 8604−8610）やRainDance Technologies社のデジタルＰＣＲ装置「RainDrop Digital PCR System」を利用することにより、高感度に検出することができる。ドロップレットの数が多ければ多いほど、解析精度が高くなる。充分な検出感度を担保するために、ＰＣＲのマスターミックス中の界面活性剤濃度を規定することが好ましい。例えば、ＤＮＡ伸長酵素等の保存液として用いられるエチレングリコール又はグリセロールは、終濃度で０．１５％以下、又はＴｒｉｔｏｎ−Ｘは、終濃度０．０００３％以下であることが好ましい。当該界面活性剤が前記終濃度以上になると、エマルジョン数が激減し、高感度にＰＣＲ産物を検出することが困難になる。この場合、増幅する遺伝子箇所は、非遺伝子領域と遺伝子領域とのどちらでも任意の選択が可能である。

その他の方法としては、例えば、血液試料中の核酸を鋳型としたリアルタイムＰＣＲ等により、特定の領域のプライマーをセットし、例えば、ＴＣＦ４遺伝子中をコードする領域を含む断片を増幅した後、この増幅産物に対して、ＴＣＦ４の特定の遺伝子型に特異的にハイブリダイズ可能なプローブを接触させて会合体が形成されたか否かを高感度に検出する方法が挙げられる。これらを行い、ｃｆＤＮＡ量を定量することは可能である。

前記プローブは、例えば放射性同位元素（^３Ｈ、^３２Ｐ、^３３Ｐ等）、蛍光剤（ローダミン、フルオレセン等）、又は発色剤で検出可能に標識される。また、当該プローブは、アンチセンスオリゴマー、例えばＰＮＡ、モルホリノ−ホスホロアミデート類、ＬＮＡであってもよい。なお、当該プローブの塩基長さは、約８ヌクレオチドから約１００ヌクレオチド、好ましくは約１０ヌクレオチドから約７５ヌクレオチド、より好ましくは約１５ヌクレオチドから約５０ヌクレオチド、さらに好ましくは約２０ヌクレオチドから約３０ヌクレオチドである。

なお、体液試料中のｃｆＤＮＡ量を測定するために使用される試薬をキット化することにより、本実施形態に係る健康状態の評価方法をより簡便に行うことができる。当該キットには、体液試料中のｃｆＤＮＡ量の測定方法についてのプロトコル、得られたｃｆＤＮＡ量に基づいて健康状態を評価するために使用される基準値や評価方法についての説明等が記載された書面等が含まれていてもよい。

本実施形態に係る健康状態の評価方法の定量工程に供される体液試料としてはｃｆＤＮＡが存在することが期待できる体液であれば特に限定されない。例えば、血液、血清、血漿、尿、唾液、精液、胸部滲出液、脳脊髄液、涙液、痰、粘液、リンパ液、細胞質ゾル、腹水、胸水、羊水、膀胱洗浄液、及び気管支肺胞洗浄液等が挙げられる。本実施形態に供される体液試料としては、血液、血清、又は血漿が好ましく、血清又は血漿がより好ましい。本実施形態においては、原発巣切除等の生検採取処理による試料を必要としなくてもよいため、より低侵襲的に試料採取を行うことができる。

また、本実施形態に係る健康状態の評価方法ではｃｆＤＮＡ量を指標にする。そのため、微量な体細胞変異を検出する方法よりも、必要とする体液試料を少量に抑えることができる。例えば、血漿又は血清では、１ｍＬの試料があれば測定可能である。この点からも、本実施形態に係る健康状態の評価方法は、被検者への負担が小さく、臨床上好適である。

本実施形態に供される体液試料は、腫瘍切除後の被検者から採取されたものであればよく、被検者の腫瘍の種類は特に限定されない。また、原発性腫瘍であってもよく、転移性腫瘍であってもよく、再発性腫瘍であってもよい。さらに、腫瘍が、被検者の体内の複数個所に存在していてもよい。当該腫瘍には、脳、肝臓、腎臓、膀胱、乳房、胃、卵巣、結腸直腸、前立腺、膵臓、乳房、肺、外陰部、甲状腺、結腸直腸、食道、及び肝臓の癌、肉腫、膠芽細胞腫、頭頸部癌、白血病並びにリンパ性悪性疾患が含まれる。より詳細には、神経芽細胞腫、腸癌（例えば、直腸癌、大腸癌、家族性大腸ポリポーシス癌及び遺伝性非ポリポーシス大腸癌）、食道癌、口唇癌、喉頭癌、下咽頭癌、舌癌、唾液腺癌、胃癌、腺癌、甲状腺髄様癌、甲状腺動脈乳頭癌、腎臓癌、腎実質癌、卵巣癌、頸癌、子宮体癌、子宮内膜癌、絨毛癌、膵臓癌、前立腺癌、精巣癌、乳癌、尿管癌、メラノーマ、脳腫瘍（例えば、膠芽細胞腫、星状細胞腫、髄膜腫、髄芽細胞腫及び末梢神経外胚葉性腫瘍）、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、バーキットリンパ腫、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性骨髄性白血病骨（ＡＭＬ）、慢性髄性白血病（ＣＭＬ）、成人Ｔ細胞白血病、肝細胞癌、胆嚢癌、気管支癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、多発性骨髄腫、基底細胞腫、奇形腫、網膜芽細胞腫、脈絡膜メラノーマ、精上皮腫、横紋筋肉腫、頭蓋咽頭腫（ｃｒａｎｉｏｐｈａｒｙｎｇｅｏｍａ）、骨肉腫、軟骨肉腫、筋肉腫、脂肪肉腫、線維肉腫、ユーイング肉腫及び形質細胞腫が含まれ得る。本実施形態に供される体液試料が採取される被検者の切除された腫瘍としては、転移性髄芽腫、消化管間質腫瘍、隆起性皮膚線維肉腫、結腸直腸癌、大腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、慢性骨髄増殖性疾患、急性骨髄性白血病、甲状腺癌、すい臓癌、膀胱癌、腎臓癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頚部癌、脳腫瘍、肝細胞癌、血液悪性腫瘍、又はこれらの癌を引き起こす前癌が好ましく、大腸癌、結腸直腸癌、肺癌、肝細胞癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎臓癌、頭頸部癌、又は子宮頸癌がより好ましい。

評価工程においては、定量工程において得られたｃｆＤＮＡ量を、基準値と比較し、前記被検者の健康状態を評価する。具体的には、被検者の体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量が基準値よりも高い場合に、当該被検者は、腫瘍巣が増大している若しくは新たな転移を生じている、若しくは、腫瘍巣が増大する若しくは新規転移を生じる可能性が高い、又は当該被検者は、腫瘍巣は増大しておらず、新たな転移も生じていないが、健康状態が悪化している若しくは悪化する可能性が高い、と評価する。

前記基準値は、下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかである。
（ｉ）予め設定された閾値。
（ｉｉ）前記被検者から腫瘍切除前に採取された体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量、又は、前記被検者から腫瘍切除後１週間から３ヶ月までの期間に採取された体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量。
（ｉｉｉ）前記被検者から前記体液試料の採取時までに採取された体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量。

前記（ｉ）の閾値は、実験的に設定することができる。例えば、腫瘍の再発や転移が生じていることが他の診断方法により確定しているがん患者群から体液試料を採取する。また、腫瘍の再発や転移が生じていないことが他の診断方法により確定しているがん患者群又は健常者群から体液試料を採取する。両群の体液試料に対して、単位量当たりのｃｆＤＮＡ量を同じ測定条件で測定し、両群の測定値を比較することにより、両群を識別するための閾値を適宜設定することができる。健常者群に代えて、がん以外の疾患に罹患している患者群を用いてもよい。また、腫瘍の再発や転移が生じていることが他の診断方法により確定しているがん患者群に代えて、がんの発症が確認されている腫瘍切除処理前のがん患者群を用いてもよい。

例えば、体液試料が血漿の場合、血漿１ｍＬ当たり５００ｎｇのｃｆＤＮＡが検出された場合は、腫瘍の再発若しくは転移が生じている可能性がある。さらに、ｃｆＤＮＡ値が７５０ｎｇではその可能性がさらに高くなり、更にｃｆＤＮＡ値が１０００ｎｇを超えた場合には、確実性が高まる。このため、血漿１ｍＬ当たり１０００ｎｇのｃｆＤＮＡ値を基準値とすることができる。この場合、腫瘍切除後の被検者の血漿１ｍＬ当たりのｃｆＤＮＡ値が１０００ｎｇを超える場合には、当該被検者は、腫瘍の再発若しくは転移が生じている又はその可能性が高い、と評価される。なお、血漿と血清での基準値はほぼ同等である。

また、腫瘍切除処理により体内における腫瘍組織の存在量が少なくなる一方で、腫瘍切除処理は侵襲性が高く、被検者の身体への負担が大きい。このため、一般的に、体液中のｃｆＤＮＡ量は、腫瘍切除処理直後に短期的に上昇した後、切除処理の影響が薄れると低い値で安定化する。そこで、評価工程で用いる基準値としては、この切除処理の影響から身体が回復した状態であり、かつ腫瘍の再発や転移等がまだ生じていない時期の体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量を用いることができる。切除処理の影響からの回復には少なくとも１週間は必要となる場合が多く、通常は、腫瘍切除後１ヶ月から３ヶ月経過時までの間には、切除処理の影響から身体が回復する。そこで、この期間内に採取された体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量を評価工程で用いる基準値として用いることができる。本実施形態における前記（ｉｉ）の基準値としては、腫瘍切除後１週間から３ヶ月までの間に被検者から採取された体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量を用いることができる。好ましくは腫瘍切除後１ヶ月から３ヶ月までの間、より好ましくは腫瘍切除後４０日から３ヶ月までの間、さらに好ましくは腫瘍切除後４２〜９０日までの間に、被検者から採取された体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量が好ましい。ただし、被検者によっては、腫瘍切除処理前における体液中のｃｆＤＮＡ量のほうが、腫瘍切除処理後であって身体が回復した後の体液中のｃｆＤＮＡ量よりも低い場合もある。この場合には、被検者から腫瘍切除前に採取された体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量を評価工程で用いる基準値として用いることが好ましい（前記（ｉｉ））。

なお、腫瘍切除処理から１ヶ月程度以上経過している時点における被検者のｃｆＤＮＡ量は、手術侵襲の影響によるｃｆＤＮＡ量の増加は終了している。このため、当該期間内における体液中のｃｆＤＮＡ量が減少していない被検者においては、何等かの疾患的作用が起きており、このため、健康状態が悪化していると推定される。つまり、本実施形態に係る健康状態の評価方法において、腫瘍切除処理から１〜３ヶ月以内に被検者から採取された体液試料と、基準値として例えば前記（ｉ）の値とを用いることもできる。この場合、定量された体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量が当該基準値よりも高い場合に、当該被検者は何らかの疾患的作用が生じており、健康状態が悪化している若しくは悪化する可能性が高い、と評価することができる。当該評価により、ＣＴの追加撮像や副作用の所見などがないかの医師の治療選択肢を提供することができる。

評価工程で用いる基準値としては、同一の被検者から以前に採取された体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量を用いることもできる（前記（ｉｉｉ））。当該基準値としては、腫瘍切除後に採取されたものが好ましい。例えば、腫瘍切除処理から３ヶ月経過後に採取された体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量を基準として用いて、当該体液試料の採取後に採取された体液試料の評価を行うことができる。

腫瘍切除後のがん患者の再発や転移の有無等は、できるだけ早く検出することが好ましい。そこで、本実施形態に係る健康状態の評価方法を、被検者から経時的に採取された体液試料に対して行い、被検者の体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量をモニタリングし、当該被検者の健康状態を経時的に評価することが好ましい。被検者の体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量が増加傾向にある場合には、当該被検者は、腫瘍巣が増大している若しくは新規転移を生じている、若しくは腫瘍巣が増大する若しくは新規転移を生じる可能性が高い、又は腫瘍巣は増大しておらず、新規転移も生じていないが、健康状態が悪化している若しくは悪化する可能性が高い、と評価することができる。通常、がん治療においては、腫瘍マーカー検査のための採血が、月に１回程度の頻度で行われている。そこで、腫瘍マーカー検査の血液サンプルの残余分を使用して経時的に本実施形態に係る健康状態の評価方法を行うことも可能である。いわゆる遺伝子検査とは異なり、血清又は血漿中のｃｆＤＮＡ量を定量すればよいため、試料量は少量でよい点からも、本実施形態は臨床的に実施しやすい。

被検者が化学療法を受けている場合、腫瘍の増大又は新規転移は、当該化学療法が奏功していないことを意味する。このため、腫瘍切除後、被検者が化学療法を受けている場合には、定量工程で測定されたｃｆＤＮＡ量が、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの基準値よりも高い場合に、当該化学療法が効果を奏していないと評価することができる。

また、腫瘍の増大又は新規転移が生じていない場合であっても、治療行為等による副作用等によって健康状態が悪化すると、体液中のｃｆＤＮＡ量は増大する。そこで、腫瘍切除後、被検者が化学療法を受けている場合には、定量工程で測定されたｃｆＤＮＡ量が、前記（ｉ）〜（ｉｉｉ）のいずれかの基準値よりも高い場合に、当該化学療法による副作用が生じている若しくは生ずる可能性が高いと評価することができる。

抗がん治療において、化学療法は特に重篤な副作用が問題になる場合が多い。特に、副作用として、重度の皮膚障害や脱毛、（間質性）肺炎、又は腹膜炎などが引き起こされる。その結果、その後の薬剤治療の継続が困難な場合があり、休薬の判断が必要になるケースが多い。医師が休薬のタイミングを計るためにも、副作用の予測や評価は重要であるが、副作用を予測したり、早期に検出するための臨床適用可能なバイオマーカーは、従来知られていなかった。本実施形態に係る健康状態の評価方法は、ｃｆＤＮＡ量を指標として用いることにより、健康状態の悪化を引き起こす副作用のリスク予測や早期検出が可能となる。

例えば、体液試料が血漿であり、血漿１ｍＬ当たり１０００ｎｇのｃｆＤＮＡ値を基準値とした場合、腫瘍切除後で化学療法を受けている被検者の血漿１ｍＬ当たりのｃｆＤＮＡ値が１０００ｎｇを超える場合には、当該被検者は、当該化学療法により副作用が生じている若しくは生ずる可能性が高いと評価することができる。得られた評価は、化学療法の継続若しくは休止、又は使用する化学療法剤の変更を行うか否かの決定のための情報（資料）として有用である。例えば、血漿１ｍＬ当たりのｃｆＤＮＡ量が１０００ｎｇ付近、又はそれを越えて増加傾向にある場合、休薬することによりその後の治療も安定し、抗がん治療をやりやすくなる。このように、本実施形態により得られる評価は、休薬を示唆できる予測指標として臨床上極めて有用である。なお、被検者が過去に化学療法剤を投与されたことがある場合には、前記評価工程で用いられる基準値として、当該化学療法剤が投薬された後６０日間が経過した後に採取された体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量を用いることが好ましい。

本実施形態に係る健康状態の評価方法において、被検者が受ける化学療法で使用され、副作用や奏功状態の評価が行われる化学療法剤は、限定されず、細胞毒性又は細胞分裂阻害性を有する化合物であり得る。具体的には、（ｉ）代謝拮抗剤、例えばフルオロウラシル、カペシタビン、シタラビン、フルダラビン、５−フルオロ−２’−デオキシウリジン、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム（ＴＳ−１）、ゲムシタビン、ヒドロキシウレア、又はメトトレキセート；（ｉｉ）ＤＮＡ断片化剤、例えば、ブレオマイシン；（ｉｉｉ）ＤＮＡ架橋剤、例えば、クロラムブシル、シスプラチン、シクロホスファミド、又はナイトロジェンマスタード；（ｉｖ）インターカレート剤、例えばアドリアマイシン（ドキソルビシン）、又はミトキサントロン；（ｖ）タンパク合成阻害剤、例えば、Ｌ−アスパラギナーゼ、シクロヘキシミド、ピューロマイシン、又はジフテリア毒素；（ｖｉ）トポイソメラーゼＩ毒、例えばカンプトセシン、又はトポテカン；（ｖｉｉ）トポイソメラーゼＩＩ毒、例えばエトポシド（ＶＰ−１６）、又はテニポシド；（ｖｉｉｉ）微小管関連剤、例えばコルセミド、コルヒチン、パクリタキセル（ｐａｃｌｉｔｅｘｅｌ）、ビンブラスチン、又はビンクリスチン；（ｉｘ）キナーゼ阻害剤、例えば、フラボピリドール、スタウロスポリン、ＳＴＩ５７１（ＣＰＧ５７１４８Ｂ）、又はＵＣＮ−０１（７−ヒドロキシスタウロスポリン）；（ｘ）様々な治験薬、例えばチオプラチン（ｔｈｉｏｐｌａｔｉｎ）、ＰＳ−３４１、フェニルブチレート、ＥＴ−１８−ＯＣＨ３、又はファルネシルトランスフェラーゼ阻害剤（Ｌ−７３９７４９、Ｌ−７４４８３２）；ポリフェノール類、例えばケルセチン、レスベラトロール、ピセタノール、エピガロカテキン没食子酸塩、テアフラビン類、フラバノール類、プロシアニジン類、ベツリン酸及びその誘導体；（ｘｉ）ホルモン、例えばグルココルチコイド又はフェンレチニド；（ｘｉｉ）抗ホルモン、例えばタモキシフェン、フィナステライド、又はＬＨＲＨアンタゴニストが含まれる。また、フォリン酸（ロイコボリン）、オキサリプラチン、イリノテカン、ダウナルビシン、タキソテール、及びマイトマイシンＣも含まれる。さらに、セツキシマブ、パニツムマブ、ベバシヅマブ、ゲフィニチブ、エルロチニブ、レゴラフェニブ、クリゾチニブ、スニチニブ、ソラフェニブ、エベロリムス、トラスツズマブ、ラパチニブ、及びリツキシマブ等の分子標的薬剤も含まれる。これらの化学療法剤のうち１種のみを用いてもよく、２種類以上を併用してもよい。本実施形態において副作用や奏功状態が評価される化学療法剤としては、フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチン、カペシタビン、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、イリノテカン、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブから選択される一種以上であることが好ましい。

被検者は、化学療法以外の他の抗腫瘍療法を受けていてもよい。当該他の抗腫瘍療法としては、具体的には、放射線治療等が挙げられる。また、評価の対象となる化学療法剤とは異なる化学療法剤を用いた治療を過去に受けていてもよい。

例えば、腫瘍切除後４０〜９０日経過時に被検者から採取された血漿の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量を基準値とした場合に、被検者から採取された血漿の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量が当該基準値よりも高い場合には、現治療が奏功していない可能性が高い、と評価できる。つまり、癌の再燃、つまり、転移又は再発が生じている可能性が高い、又は現治療により看過できない副作用が生じている可能性が高い、と評価できる。当該評価が得られた場合には、当該被検者にはＣＴ撮像検査などを追加で行うことが好ましい。一方、逐次的に体液試料中のｃｆＤＮＡ量をモニタリングした場合に、ｃｆＤＮＡ量が安定して低い、具体的には１ｍＬ中の血漿あたり１０００ｎｇ以下にある場合、又は術前よりもｃｆＤＮＡ量が低い状態を保持している場合には、現治療で使用されている化学療法剤が奏功している、又は転移や再発のリスクも少なく、当該化学療法剤による何らかの副作用状態にもない可能性が高いと評価できる。

＜抗がん剤に対する長期奏功性の予測方法＞
前述のように、体液中の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量は、抗がん剤等の化学療法の治療の奏効性の評価又は予測のための指標とし得る。つまり、抗がん剤治療を受けた被検者の体液中の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量を指標とすることにより、抗がん剤に対する長期奏功性を予測し得る。なお、「抗がん剤の長期奏効性」とは、抗がん剤を投与された被検者が、少なくとも６ヶ月、腫瘍組織の体積の増大、転移、又は再発が生じないことを意味する。

すなわち、本実施形態に係る抗がん剤に対する長期奏功性の予測方法（以下、「本実施形態に係る予測方法」ということがある。）は、被検者から経時的に採取された２以上の体液試料について、単位量当たりのｃｆＤＮＡ量を測定し、前記被検者の体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量をモニタリングするモニタリング工程と、前記モニタリング工程において得られた前記ｃｆＤＮＡ量を、予め設定された基準値と比較し、前記被検者の抗がん剤に対する長期奏功性が得られるか否かを予測する予測工程と、を有する。

抗がん剤が長期奏効性を示し、腫瘍の悪化が抑制されている状態では、がん患者の体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量は少ない傾向にある。また、抗がん剤が奏効しておらず、腫瘍が悪化する状態では、当該ｃｆＤＮＡ量は多くなる傾向にある。そこで、予測工程においては、被検者の体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量が、前記基準値を超える状態から前記基準値以下にまで低下した場合、又は全ての体液試料のｃｆＤＮＡ量が前記基準値以下の場合に、当該被検者は服用していた抗がん剤に対して長期奏功性が得られると予測する。逆に、被検者の体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量が、前記基準値以下の状態から前記基準値を超える状態まで上昇した場合、又は全ての体液試料のｃｆＤＮＡ量が前記基準値を超える場合に、当該被検者は投与されていた抗がん剤に対して長期奏功性が得られないと予測する。

予測工程において用いられる基準値は、例えば、予め実験的に設定することができる。
例えば、抗がん剤を服用しているがん患者のうち、腫瘍の組織増大、再発、及び転移が生じておらず、当該抗がん剤が奏効していることが他の診断方法により確定しているがん患者群から体液試料を採取する。また、腫瘍の組織増大、再発、又は転移のいずれかが生じており、当該抗がん剤が奏効していないことが他の診断方法により確定しているがん患者群から体液試料を採取する。両群の体液試料に対して、単位量当たりのｃｆＤＮＡ量を同じ測定条件で測定し、両群の測定値を比較することにより、両群を識別するための閾値を適宜設定することができる。

例えば、体液試料が血清の場合、血清１ｍＬ当たり２０ｎｇのｃｆＤＮＡ値を基準値として用いることができる。この場合、被検者の血清１ｍＬ当たりのｃｆＤＮＡ値が２０ｎｇを超える場合には、当該被検者において、服用している抗がん剤では長期奏功性が得られないと予測される。

当該予測工程における予測は、被検者が抗がん剤の継続若しくは休止、又は使用する抗がん剤の変更を行うか否かの決定のための資料とすることができる。たとえば、抗がん剤治療を受けている被検者において、当該抗がん剤の使用を継続するか否かを判断する際に、当該予測工程において当該抗がん剤が長期奏効性ありと予測された場合には、当該抗がん剤の使用を継続すると判断することができる。また、当該抗がん剤が長期奏効性なしと予測された場合には、当該抗がん剤の使用を中止する、又は他の抗がん剤へ変更すると判断することができる。

本実施形態に係る予測方法において、抗がん剤の長期奏効性を予測する対象の被検者は、分子治療薬を含む抗がん剤が投与された患者であればよい。罹患している腫瘍の種類は特に限定されず、体内の複数個所に存在する腫瘍であってもよい。また、原発性腫瘍であってもよく、転移性腫瘍であってもよく、再発性腫瘍であってもよい。当該腫瘍の種類としては、本実施形態に係る健康状態の評価方法の被検者が罹患している腫瘍として例示されたものが挙げられる。本発明に係る予測方法において予測対象の被検者としては、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、食道癌、頭頸部癌、子宮癌、及び子宮頸癌からなる群より選択される１種又は２種以上に罹患している被検者が好ましい。

本実施形態に係る予測方法において、長期奏功性を予測する対象の抗がん剤は、特に限定されるものではなく、本実施形態に係る健康状態の評価方法において、被検者が受ける化学療法で使用され、副作用や奏功状態の評価が行われる化学療法剤と同様のものが挙げられる。
本実施形態に係る予測方法においては、中でも、ＥＧＦＲ阻害剤及びＶＥＧＦ阻害剤からなる群より選択される１種以上の抗がん剤の長期奏功性の予測に好適に用いられる。

本実施形態に係る予測方法において、供される体液試料としては、被検者から採取された血液そのものであってもよい。特に、血清又は血漿が好ましい。血液試料としては、がん治療において腫瘍マーカー検査のために採血された血液サンプルの残余分を用いることができる。ただし、モニタリング工程の途中では、供される体液試料の種類の変更は行わないことが好ましい。

本実施形態に係る予測方法のモニタリング工程における体液試料の単位量当たりのｃｆＤＮＡ量の測定方法としては、本実施形態に係る健康状態の評価方法におけるｃｆＤＮＡ量の測定方法として例示されたものが挙げられる。

以下、実施例を示し、本発明を具体的に説明するが、本発明は下記実施例に限定されるものではない。なお、以下の試験は、日本医科大学付属病院内の倫理審査委員会で承認されており、全ての患者からは本研究を包含するインフォームドコンセントを得て行った。

［実施例１］
既に原発巣は切除されており、新たに転移巣（肝臓）を外科的切除した大腸癌患者６名（Ａ〜Ｆ）について、術前、術後に経時的に採取された血液から調製された血漿に含まれるｃｆＤＮＡ濃度を、市販のキット（製品名：Ｑｕｂｉｔ２．０（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製））を用いて蛍光測定し、ｃｆＤＮＡ濃度を算出した。得られた値から血漿１ｍＬ当たりのｃｆＤＮＡ量を算出した。以下に詳細を説明する。

（臨床サンプル）
既に原発巣は切除されており、新たに転移巣（肝臓）の外科的切除手術の術前又は術後に、再発性大腸癌患者の末梢血６〜９ｍＬを採血した。得られた血液を遠心分離処理（１５００ｒｐｍ、１０分間）した。得られた粗血漿成分をさらに追加で遠心分離処理（１５００ｒｐｍ、１０分間）した。その後、細胞断片を除去した上清部を回収し、これを血漿サンプルとした。

（血漿中のＣＥＡ及びＣＡ−１９−９の測定）
血漿中のＣＡ−１９−９、ＣＥＡを、ＣＬＥＩＡ法（化学発光酵素免疫測定法）により測定した。ＣＡ−１９−９の基準値は、３７Ｕ／ｍＬ以下、ＣＥＡの基準値は５．０ｎｇ／ｍＬ以下とした。

(血漿からのｃｆＤＮＡの単離精製)
血漿からのｃｆＤＮＡの単離精製は、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（キアゲン社製)を用いて行った。本キットに供した血漿サンプルの量は、１ｍＬとした。ＤＮＡの単離精製工程は、キットに付属されているインストラクションに従った。スピンカラムからの最終溶出は、ＴＥ緩衝液５０μＬを用いて行った。

(ｃｆＤＮＡの定量)
ｃｆＤＮＡの定量は、Ｑｕｂｉｔ（登録商標) Ｆｌｕｏｒｏｍｅｔｅｒ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）を用いて行った。測定するサンプルは全て、単離したＤＮＡを所定の反応液で２００倍に希釈して用いた。

本試験における患者情報とｃｆＤＮＡ量等の測定結果とについて表１に示す。また、各患者の経時的なＤＮＡ量について図４〜９に示す。表１中、「術後７ｄ」は、肝切除手術後７日目付近で採血した結果を示す。表１中、「術後１−２ｍ」、「術後３−４ｍ」、「術後６ｍ」、及び「術後９ｍ」は、それぞれ、肝切除手術後１〜２ヶ月経過後付近、肝切除手術後３〜４ヶ月経過後付近、肝切除手術後６ヶ月経過後付近、肝切除手術後９ヶ月経過後付近で採血した結果を示す。

患者Ａ及びＣは、いずれも肝切除手術前に、ＦＯＬＦＯＸ化学療法（フルオロウラシル・フォリン酸・オキサリプラチン）を行っていた。具体的には、４００ｍｇ／ｂｏｄｙのフォリン酸（ロイコボリン）と、８５ｍｇ／ｂｏｄｙのオキサリプラチンとを、２時間かけて点滴静脈内投与した。その後、フルオロウラシル（５−ＦＵ）を、４００ｍｇ／ｂｏｄｙを急速点滴静脈内投与し、さらに２，４００ｍｇ／ｂｏｄｙを４６〜４８時間持続点滴静脈内投与した。投与レジメンを図１に示す。

患者Ｂ及びＦは、いずれも肝切除手術前に、ｍＦＯＬＦＯＸ＋パニツムマブの併用療法を図２に示すレジメンにて行った。パニツムマブ（６ｍｇ／ｋｇ）を６０分間以上かけて点滴静注した。その後、ロイコボリン（４００ｍｇ／ｍ^２）とオキサリプラチン（８５ｍｇ／ｍ^２）とを１２０分間かけて点滴静注した。続けて、５−ＦＵ（４００ｍｇ／ｍ^２）を急速静注し、５−ＦＵ（２，４００ｍｇ／ｍ^２）を４６〜４８時間かけて持続静注した。また、患者Ｂに対しては、肝切除手術後にも、図２と同様のレジメンにてｍＦＯＬＦＯＸ＋パニツムマブの併用療法を行った（表中、「ケモ開始」）。

患者Ｄに対しては、ベバシズマブ併用ＸＥＬＯＸ化学療法（オキサリプラチン・カベシタビン）を行った（表中、「ケモ開始（ＸＥＬＯＸ）」）。レジメンを図３に示す。１日目は、午前中にベバシズマブ（７．５ｍｇ／ｋｇ）を静注し、続けてオキサリプラチン（１３０ｍｇ／ｍ^２）を１２０分間以上かけて静注した。さらに、夕食後にカペシタビン（８５０〜１０００ｍｇ／ｍ^２）経口投与した。２〜１４日目までは、１日２回（朝・夕食後）カペシタビン（８５０〜１０００ｍｇ／ｍ^２／回）経口投与した。１５日目以降、朝食後にのみカペシタビン（８５０〜１０００ｍｇ／ｍ^２）経口投与した。１６〜２１日目を休薬とし、１サイクルとした。

患者Ｅに対しては、化学療法を行わなかった。

患者Ａ、Ｃ、Ｅ、Ｆ（図４、６、８、９）は、予後が良く、抗がん剤治療も奏功していた。それぞれの術後１〜２ヶ月経過後付近のｃｆＤＮＡ量は低く、その後の追跡においても急激な上昇は認められなかった。

全患者に共通していることは、術後１週間程度では、手術による侵襲からｃｆＤＮＡ濃度は高く、少なくとも血漿１ｍＬ中に１０００ｎｇのｃｆＤＮＡが存在していた。このため、この時点のｃｆＤＮＡ量を前後の比較対象とすると判断を誤る可能性が高い。そのため、評価に用いる基準値としては、少なくとも術後１週間以上経過しており、好ましくは３０日間以上、より好ましくは４０日間以上経過した時点で採取した体液試料の測定値であることが好ましいことが確認された。

一方、患者Ｂ（図５）は、術後再発を起こしていた。患者Ｂについては、術後、ＣＴにより肝再発は確認されなかった。しかしながら、術後１〜２ヶ月経過後付近に肺転移が観察され、術後３〜４ヶ月経過後付近では、血漿１ｍＬ当たりのｃｆＤＮＡ量が約８００ｎｇも増加しており、血漿１ｍＬ当たり１０００ｎｇを超過していた。つまり、血漿中のｃｆＤＮＡ量は、肺転移に伴って増加する傾向が認められた。さらに、化学治療を開始してからは減少傾向が観察されており、血漿中のｃｆＤＮＡ量が化学治療の奏功にも応答していることが読み取れた。一方で、ＣＥＡとＣＡ−１９は、一貫して正常値を保持しており、転移に対して全く応答していなかった。この結果から、ＣＥＡやＣＡ−１９といった従来の腫瘍マーカーの検査では検出できない転移であっても、体液中のｃｆＤＮＡ量を指標とすることによって高感度に検出できることが明らかである。

患者Ｄ（図７）では、２０１４年１１月に実施したＣＴでは転移は確認されなかった。しかしながら、その後の２０１５年１月に実施したＰＥＴ−ＣＴでは転移が確認された。患者Ｄでは、転移が確認される前の術後１〜２ヶ月経過後付近から血漿１ｍＬ当たりのｃｆＤＮＡ量が高くなっており、化学治療を開始してからは減少傾向が観察された。つまり、ＣＴ撮像よりも１ヶ月先にｃｆＤＮＡ量の顕著な増加が観察された。ＣＥＡ及びＣＡ−１９は、術前から異常値を示していたものの、術後の数値はほとんど変化せず、一定であり、転移に関しては全く応答していなかった。この結果からも、体液中のｃｆＤＮＡ量の上昇が、腫瘍の転移や再発を予測できることが明らかである。

このように、がん患者のｃｆＤＮＡ量は、リアルタイムの腫瘍状態を反映している可能性があり、少なくともＣＥＡやＣＡ−１９などの腫瘍マーカーよりも、転移への堅調な応答性を確保していることが明らかになった。

［実施例２］
実施例１の患者とは別の患者（患者Ｇ）であって、原発巣（肝臓）を外科的切除した大腸癌患者について、経時的に採血し、血漿１ｍＬ当たりのｃｆＤＮＡ量を測定した。ｃｆＤＮＡ量の測定は実施例１と同様にして行った。患者Ｇに関する臨床情報及び血漿１ｍＬ当たりのｃｆＤＮＡ量（ｎｇ）の変化を図１０に示す。当該患者は、実施例１の患者Ｂと同様に、ｍＦＯＬＦＯＸ＋パニツムマブの併用療法を図２に示すレジメンにて行ったが、副作用により肺炎をおこした。肺炎の重篤度に伴い、ｃｆＤＮＡ量が応答して高くなったが、休薬すると、患者の肺炎は改善し、ｃｆＤＮＡ量も一気に低下した。肺炎が改善した後に再びｍＦＯＬＦＯＸ＋パニツムマブの併用療法を続けたところ、当該併用療法は安定して奏功していた。また、副作用も落ち着いており、血漿中のｃｆＤＮＡ量も低下していた。患者の奏功状態としては、転移があるもののＳＤ（病状安定化）を保持していた。これらの結果から、化学療法の副作用により肺炎など別の合併症を引き起こしている患者の体液中のｃｆＤＮＡ量は増加する傾向にあることが推測可能であることが示された。また、ｃｆＤＮＡ量を追跡することにより医師が休薬のタイミングを計ることも可能であることが示された。

［実施例３］
原発巣を外科的切除後に再発した大腸癌患者８名について、血清中のＤＮＡ量（ｃｆＤＮＡ量）を経時的に測定し、さらに、腫瘍の状態をＣＴにより観察した。これらの患者について、予め、原発巣、転移巣、及び転移巣確認後に採取された血液から調製された血清に含まれるＫＲＡＳについて、ノンシノニマスなアミノ酸置換を伴う突然変異を調べた。

(臨床サンプル)
原発巣の外科的切除手術の術前又は術後に、再発性大腸癌患者の末梢血６〜９ｍＬを採血後、遠心分離処理（３，０００ｒｐｍ、１０分間）を行い、血清成分を得た。また、一部の患者の原発巣、転移巣のホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）切片も実験サンプルとした。

(血清からのセルフリー（ｃｆ）ＤＮＡの単離精製)
血清からのｃｆＤＮＡの単離精製は、ＱＩＡａｍｐ Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｋｉｔ（キアゲン社)を用いて行った。本キットに供した血清サンプルの量は、患者によって異なり、２ｍＬ〜４ｍｌであった。ＤＮＡの単離精製工程は、キットに付属されているインストラクションに従った。スピンカラムからの最終溶出は、ＴＥ緩衝液５０μＬを用いて行った。

（ＦＦＰＥ切片からのＤＮＡの単離精製)
ＦＦＰＥ切片からのＤＮＡ単離精製は、ＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ ＦＦＰＥ Ｔｉｓｓｕｅ Ｋｉｔ（キアゲン社)を用いて行った。１サンプルにつき、１０μｍにスライスされたＦＦＰＥ切片を３枚用いた。ＤＮＡの単離精製工程は、キットに付属されているインストラクションに従った。スピンカラムからの最終溶出は、ＴＥ緩衝液１００μＬを用いて行った。

(ＤＮＡの定量)
ｃｆＤＮＡ及びＦＦＰＥ切片から単離精製したＤＮＡの定量は、Ｑｕａｎｔ−ｉＴ（登録商標）ＰｉｃｏＧｒｅｅｎ（登録商標）ｄｓＤＮＡ Ｒｅａｇｅｎｔ ａｎｄ Ｋｉｔｓ（ｉｎｖｉｔｏｒｏｇｅｎ社）を用いて行った。測定するサンプルは全て、単離したＤＮＡをＴＥ緩衝液で２０倍に希釈して用いた。蛍光測定装置は、ＳＡＦＩＲＡ（ＴＥＣＡＮ社）を用いた。結果を表２に示す。

(ダイレクトシークエンシング)
原発巣や転移巣の手術標本、並びに原発巣の外科的切除手術の術前又は術後に採取された血清中のＫＲＡＳ塩基配列解析は、ダイレクトシークエンシングにて行った。より詳細には、ＫＲＡＳの塩基配列に特異的なプライマーを用い、ビッグダイターミネーター法によるサイクルシークエンシングを常法により行った。結果を表２に示す。

（血清中のＣＡ−１９−９の測定）
血清中のＣＡ−１９−９を、ＣＬＥＩＡ法（化学発光酵素免疫測定法）により測定した。測定結果を表２に示す。

（抗がん剤投与）
ＦＦＰＥ組織中にＫＲＡＳ遺伝子変異が認められなかったケースに関しては、セツキシマブを、ＫＲＡＳ遺伝子変異が観察された患者にはベバシズマブを、それぞれ投与した。
ベバシズマブを投与した場合の投与レジメンを図１１に示す。

具体的には、原発巣がＫＲＡＳ変異型である患者に対して、抗ＶＥＧＦ阻害剤であるベバシズマブとＦＯＬＦＯＸ化学療法（フルオロウラシル・フォリン酸・オキサリプラチン）を行った。ベバシズマブ２週間間隔投与法で行い、５ｍｇ／ｋｇを投与速度０．５ｍｇ／ｋｇ／分（５ｍｇ／ｋｇでは１０分）にて点滴静脈内投与を行った。投与時間は、初回９０分間、忍容性により、２回目６０分間、３回目以降３０分間投与とした。ＦＯＬＦＯＸ化学療法は、４００ｍｇ／ｂｏｄｙのフォリン酸（ロイコボリン）と、１４５又は１４０ｍｇ／ｂｏｄｙのオキサリプラチンとを、２時間かけて点滴静脈内投与した。その後、フルオロウラシル（５−ＦＵ）は、６７５又は６５０ｍｇ／ｂｏｄｙを急速点滴静脈内投与した後、さらに４，１００ｍｇ／ｂｏｄｙを２２時間持続点滴静脈内投与した。

原発巣がＫＲＡＳ野生型である患者に対しては、セツキシマブあるいはマニツムマブとＦＯＬＦＯＸ（フルオロウラシル・フォリン酸・オキサリプラチン）あるいはＦＯＲＦＩＲＩ（フルオロウラシル・フォリン酸・イリノテカン）とによる化学療法を行った。セツキシマブは２週間間隔投与法で、８００ｍｇ／ｂｏｄｙを１時間かけて点滴静脈内投与を行った。ＦＯＬＦＯＸ化学療法は、３５０ｍｇ／ｂｏｄｙのフォリン酸（ロイコボリン）と、１４０ｍｇ／ｂｏｄｙのオキサリプラチンとを、２時間かけて点滴静脈内投与した。その後、フルオロウラシル（５−ＦＵ）を、６５０ｍｇ／ｂｏｄｙを急速点滴静脈内投与し、さらに４，１１０ｍｇ／ｂｏｄｙを２２時間持続点滴静脈内投与した。

（治療効果）
各患者について、大腸のＣＴ撮像結果から、治療効果を、ＰＤ(進展性)、ＰＲ(部分寛解)、ＣＲ(完全寛解)の３段階に分けて評価した。評価結果を表２に示す。表２の備考欄中の「切除」は、腫瘍組織の切除手術を行ったことを意味する。

より詳細には、ケース７の患者は、２０１３年１月３１日からセツキシマブとＦＯＬＦＯＸ化学療法を開始し、２０１５年４月１６日までＰＲであった。つまり、ケース７の患者では、抗がん剤治療は、ｃｆＤＮＡ量の低下が確認された２０１３年８月２９日から約１年８カ月程度、抗がん剤治療開始から約２年もの長期間奏効した。
また、ケース１０の患者は、２０１３年７月１５日にセツキシマブとＦＯＬＦＯＸ化学療法を開始し、２０１５年２月５日までＰＲであった。つまり、ケース１０の患者では、抗がん剤治療は、ｃｆＤＮＡ量の低下が確認された２０１３年１１月２７日から約１年２カ月程度、抗がん剤治療開始から約１年６カ月もの長期間奏効した。
ケース１３の患者は、２０１２年６月１９日にセツキシマブとＦＯＬＦＯＸ化学療法を開始し、少なくとも２０１４年５月１６日までＰＲであったが、２０１４年８月６日に再発が確認された。つまり、ケース１３の患者では、抗がん剤治療は、ｃｆＤＮＡ量の低下が確認された２０１３年８月８日から約９カ月程度、抗がん剤治療開始から約２年もの長期間奏効した。
ケース５の患者は、２０１２年８月２２日から同年９月２日まで、２０１３年２月２０日から同年３月３日まで、及び２０１３年１０月３０日から同年１１月１０日まで、ベバシズマブとＦＯＬＦＯＸ化学療法を行った。当該患者では、２０１２年９月２日の時点でＰＲを確認し、２０１３年１２月２０日までＰＲであることが確認できた。

この結果、治療効果がＰＲ又はＣＲであり、抗がん剤の奏効性が確認されたがん患者（ケース５、７、１０、及び１３）の最終採血日における血清中のｃｆＤＮＡ量の平均値は、９．８ｎｇ／ｍＬであり、標準偏差は、３．４０ｎｇ／ｍＬとばらつきは少なかった。つまり、少なくとも奏功しているケースでは血中のｃｆＤＮＡ量は、非常に少ないことがわかった。一方で、治療効果がＰＤであり、抗がん剤が非奏効であったがん患者（ケース１、４、６、及び８）では、最終採血日における血清中のｃｆＤＮＡ量の平均値は、１００ｎｇ／ｍＬを超えており、ばらつきが大きい結果となった。実際の判断基準としては、奏功しているケースでの平均値＋３σが、非奏功のケースの最小値のＤＮＡ量以下であるため、妥当である。すなわち、判断指標としては、ＥＧＦＲ阻害剤又はＶＥＧＦ阻害剤の治療が奏功している指標として、血清中のｃｆＤＮＡ量の基準値は、２０ｎｇ／ｍＬと設定できた。

また、非奏功であったケース４のがん患者の原発巣切除手術前のｃｆＤＮＡからは、結果的に原発巣と同様のＫＲＡＳ遺伝子変異(Ｇ１２Ａ)が観察された。しかしながら、原発巣切除手術後のｃｆＤＮＡ中からは、Ｇ１２Ａは検出されなかった。しかし、術後、血清ＫＲＡＳからＧ１２Ａが検出され、４ヶ月後に再発し、ベバシズマブとＦＯＬＦＩＲＩとは奏効しなかった。ケース４のがん患者のモニタリングによるｃｆＤＮＡ量は８７．３ｎｇ／ｍＬと比較的高濃度であった。ケース４のがん患者のＣＴ撮像図を図１２に示す。

ケース５のがん患者は、顕著なベバシズマブ＋ＦＯＬＦＯＸ併用療法が長期に奏効した症例であった。当該患者は、腫瘍縮小率（縮小効果）が半年以上、変化しない状態を維持した。腫瘍縮小率はＣＴ画像の腫瘍の直径から算出し、腫瘍が多点的に存在する場合は、それらの直径を合計して算出した。ケース５のがん患者のＣＴ撮像図を図１３に示す。図中、矢印は腫瘍再発部分を示す。当該患者の最終採血日における血清中のｃｆＤＮＡ量は５．７ｎｇ／ｍＬであった。

実施例における再発大腸癌患者におけるＥＧＦＲ阻害剤又はＶＥＧＦ阻害剤を含む治療の奏功性の簡便な予測において、末梢血、特に血清又は血漿中を循環しているＤＮＡ量を定量することは、サンプル量が少なくてすむこと、簡便な検査方法であることに鑑み有用である。また、それらｃｆＤＮＡ量の変動を追跡することにより、治療が適切に働いているかを医師が確認できる。さらに、一般的な腫瘍マーカーである、ＣＡ１９−９等の既存のバイオマーカーと同様に治療が適切に働いているかを精度良く確認できた。

Claims (15)

1. 腫瘍切除後の被検者から採取された体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量を測定し、
   前記体液試料が、血液、血清、又は血漿であり、
   測定された前記セルフリーＤＮＡ量を、基準値と比較し、前記被検者の健康状態を評価し、
   前記基準値が、前記被検者から前記腫瘍切除から４２〜９０日が経過した時点に採取された前記体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量であり、
   前記被検者の健康状態を評価する際、前記セルフリーＤＮＡ量が前記基準値よりも高い場合に、
   前記被検者の腫瘍巣が増大している若しくは新たな転移が生じている、若しくは腫瘍巣が増大する若しくは新たな転移が生じる可能性が高い、又は
   前記被検者の腫瘍巣は増大しておらず、新たな転移も生じていないが、健康状態が悪化している若しくは悪化する可能性が高い、
   と評価する、体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量を健康状態の評価のための指標とする方法。
2. 前記体液試料が腫瘍切除後の被検者から経時的に採取された体液試料であり、前記体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量をモニタリングし、前記被検者の健康状態を経時的に評価する、請求項１に記載の方法。
3. 前記被検者の体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量が増加傾向にある場合に、前記被検者の腫瘍巣が増大している若しくは新たな転移が生じている、若しくは腫瘍巣が増大する若しくは新たな転移を生じる可能性が高い、又は
   前記被検者の腫瘍巣は増大しておらず、新たな転移も生じていないが、健康状態が悪化している若しくは悪化する可能性が高い、
   と評価する、請求項２に記載の方法。
4. 前記被検者が化学療法を受けており、
   前記被検者の健康状態を評価する際、前記セルフリーＤＮＡ量が前記基準値よりも高い場合に、前記化学療法による副作用が生じている若しくは生ずる可能性が高いと評価する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
5. 前記被検者が化学療法を受けており、
   前記被検者の健康状態を評価する際、前記セルフリーＤＮＡ量が前記基準値よりも高い場合に、前記化学療法が効果を奏していないと評価する、請求項１〜３のいずれか一項に記載の評価方法。
6. 前記化学療法に使用される化学療法剤が、フルオロウラシル、ロイコボリン、オキサリプラチン、カペシタビン、テガフール・ギメラシル・オテラシルカリウム、イリノテカン、ベバシズマブ、セツキシマブ、パニツムマブから選択される一種以上である、請求項４又は５に記載の方法。
7. 前記基準値が、血漿１ｍＬ当たり１０００ｎｇのセルフリーＤＮＡ量である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
8. 体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量の測定を、吸光度法、インターカレート法、リアルタイムＰＣＲ法、デジタルＰＣＲ法、次世代シーケンサー法、又は電気化学的検出方法により行う、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 前記腫瘍が、転移性髄芽腫、消化管間質腫瘍、隆起性皮膚線維肉腫、結腸直腸癌、大腸癌、肺癌、非小細胞肺癌、小細胞肺癌、慢性骨髄増殖性疾患、急性骨髄性白血病、甲状腺癌、すい臓癌、膀胱癌、腎臓癌、黒色腫、乳癌、前立腺癌、卵巣癌、子宮頸癌、頭頚部癌、脳腫瘍、肝細胞癌、血液悪性腫瘍、又はこれらの癌を引き起こす前癌である、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法。
10. 前記被検者の健康状態を評価する際、化学療法の継続若しくは休止、又は使用する化学療法剤の変更を行うか否かの決定のための資料とされる、請求項４〜６のいずれか一項に記載の方法。
11. 抗がん剤を投与された被検者から経時的に採取された２以上の体液試料について、単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量を測定し、前記被検者の体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量をモニタリングし、
    得られた前記セルフリーＤＮＡ量を、予め設定された基準値と比較し、
    前記セルフリーＤＮＡ量が、前記基準値超から前記基準値以下にまで低下した場合、又は全ての体液試料の前記セルフリーＤＮＡ量が前記基準値以下の場合に、前記被検者は前記抗がん剤に対して長期奏功性が得られると予測し、
    前記セルフリーＤＮＡ量が、前記基準値以下の状態から前記基準値超にまで上昇した場合、又は全ての体液試料の前記セルフリーＤＮＡ量が前記基準値超の場合に、前記被検者は前記抗がん剤に対して長期奏功性が得られないと予測し、
    前記基準値が、前記被検者から腫瘍切除から４２〜９０日が経過した時点に採取された体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量であり、
    前記体液試料が、血液、血清、又は血漿である、体液試料の単位量当たりのセルフリーＤＮＡ量を抗がん剤に対する長期奏功性の予測のための指標とする方法。
12. 前記基準値が、血清又は血漿１ｍＬ当たり２０ｎｇのセルフリーＤＮＡ量である、請求項１１に記載の方法。
13. 前記長期奏功性が、少なくとも６ヶ月、腫瘍組織の体積の増大、転移、又は再発が生じないことである、請求項１１又は１２に記載の方法。
14. 前記被検者が、大腸癌、結腸癌、直腸癌、肺癌、肝癌、乳癌、卵巣癌、前立腺癌、腎癌、食道癌、頭頸部癌、子宮癌、及び子宮頸癌からなる群より選択される１種又は２種以上に罹患している、請求項１１〜１３のいずれか一項に記載の方法。
15. 前記抗がん剤が、ＥＧＦＲ阻害剤及びＶＥＧＦ阻害剤からなる群より選択される１種以上である、請求項１１〜１４のいずれか一項に記載の方法。