JP6846509B2 - オリゴマンヌロン二酸の製造方法 - Google Patents

Description

本発明は、重要な生物活性物質であるオリゴマンヌロン二酸の新規な製造方法に関する。本方法は、出発物質としてＭセグメント中間体を利用し、酸分解と活性な次亜臭素酸酸化工程により目的物質を得るというものである。

オリゴマンヌロン二酸は、その潜在的な医薬的価値により広く注目されている。オリゴマンヌロン二酸は、典型的には、原料のアルギン酸から多段階で製造される。

原料であるアルギン酸の多糖分子は、β−１，４−グルコシド結合を介してＤ−マンヌロン酸から形成されるＭセグメント、α−１，４−グルコシド結合を介してＬ−グルロン酸から形成されるＧセグメント、およびこの２つの糖のハイブリダイゼーションにより形成されるＭＧセグメントを含んでいる。それらの構造式を以下に示す。

ＭセグメントおよびＧセグメントは、原料のアルギン酸から単離することができる。典型的な方法は以下の通りである：アルギン酸を予め分解してポリマンヌロン酸とポリグルロン酸の混合多糖を生成させ；次いで、この混合多糖を酸性法により沈殿させてその中のポリグルロン酸を除去し、さらに精製して純度９０％を超えるホモポリマンヌロン酸（以下「Ｍセグメント中間体」と呼ぶ）を得る。例えば、中国特許出願第９８８０６６３７．８号およびＣＮ０２８２３７０７．２号に開示されている方法を参照することができる。

Geng Meiyuらの中国特許出願第２００５８０００９３９６．５号および米国特許 ＵＳ８８３５４０３Ｂ２は、オリゴマンヌロネートの誘導体であるマンヌロン二酸が重要な薬学的価値を有することを開示している。マンヌロン二酸のための反応プロセスは、以下のスキーム（Ｉ）によって説明される。すなわち、オリゴマンヌロン酸の多糖還元末端のマンヌロン酸のＣ１位のアルデヒド基がカルボキシル基に酸化される。

上記の酸化に使用される酸化剤としては、米国特許第８８３５４０３号におけるような、アルカリ硫酸銅溶液、すなわちフェーリング溶液が挙げられる。具体的には、アルカリ条件下で、反応基質であるオリゴマンヌロン酸を硫酸銅溶液に加え、沸騰水浴中で１５分から２時間反応させる。このような方法では、Ｃｕ²⁺イオンがアルデヒド基を酸化するための酸化剤として用いられ、反応中に赤レンガ色の酸化第一銅の沈殿が生成する。この反応は通常、還元糖を同定するために用いられる。

グルコースをグルコン酸に酸化する反応も同様である。これらの反応は３つのタイプに分類することができる。第１のタイプは、生物学的発酵または酵素的酸化によるものであり、例えば中国特許第９６１１９１６９．４号に記載の、Aspergillus niger等による発酵、米国特許第５，９６２，２８６号、第５，０１７，４８５号、および第５，１９０，８６９号に記載の、グルコン酸を生産する微生物発酵、および例えば米国特許第６，９４２，９９７号、第５，８９７，９９５号、および第３，９３５，０７１号に記載のグルコース酸化法が挙げられる。第２のタイプとしては、重金属触媒酸化によるもの：米国特許第５，１３２，４５２号および第４，８４３，１７３号に記載されているような、グルコン酸を製造するためのパラジウム触媒酸化が挙げられる。第３のタイプは化学試薬によるもの：中国特許第２０１１１０３３８４０２９号に記載されているような、グルコン酸を製造するための、過酸化水素によるグルコースの酸化が挙げられる。

しかしながら、上記方法にはいくつかの欠点がある。例えば、長い製造時間や生物学的発酵および酵素触媒のための高いコスト；重金属触媒は失活し易く、重金属の残留物が混入し易い；水酸化銅または過酸化水素の反応に約１００℃の高温が必要、多くの副反応、および低い収率（＜５０％）がある。

発明の要約
本発明者らは、特定の酸化剤を使用することによって、反応収率が大幅に改善され、オリゴマンヌロン二酸を生成する反応速度が速くなり、そして副反応が少なくなることを見出した。この反応は、十分なメタノールまたはエタノールを反応生成物に加えることにより終了し、油状の沈殿物を得ることができる。油状物質は、分液漏斗で単離し乾燥する。単糖類、塩類、および有機酸不純物を除去するために精製が必要な場合は、透析またはカラムクロマトグラフィーによる簡単な操作をさらに行うことができる。

本発明は特に、原料としてのＭセグメント中間体の酸化によるオリゴマンヌロン二酸の製造方法に関する。具体的には、Ｍセグメント中間体を分解してＭセグメントオリゴ糖（本明細書では「オリゴマンヌロン酸」とも呼ばれる）とし、これをさらに、臭素水や活性次亜臭素酸塩などの、次亜臭素酸として機能し得る臭素含有物質を酸化剤として、酸化することにより、オリゴマンヌロン二酸に変換する。

本発明の第１の態様は、オリゴマンヌロン酸を臭素含有酸化剤と接触させる酸化反応工程を含む、オリゴマンヌロン二酸の製造方法を提供する。特に、本発明のための臭素含有酸化剤は、臭素水、液体臭素、次亜臭素酸、次亜臭素酸塩、臭化物イオン源と次亜塩素酸塩との組合せ、および臭素と次亜塩素酸塩との組合せからなる群から選択される。これらの酸化剤は、臭素イオンまたは次亜臭素酸イオンによって機能する。本発明の一実施形態では、次亜臭素酸および／または次亜塩素酸塩として計算される臭素含有酸化剤のモル量は、反応の原料であるオリゴマンヌロン酸の１．０〜２．０倍である。

本発明の別の態様は、還元オリゴ糖または多糖の酸化における、臭素イオンまたは次亜臭素酸イオン（ＢｒＯ⁻）を介して機能する酸化剤の使用に関する。

本発明のオリゴマンヌロン二酸の製造方法は、穏やかな反応条件を使用することができ、副反応がほとんどなく、さらなる精製を必要とせず、９０％を超える、さらには９５％を超える収率を達成することができる。本発明の酸化反応は、反応速度が速く、収率が高く、室温で反応が進行し、自動制御を実施するのが容易な反応プロセスにて、オンライン連続反応装置での製造に適している。選択された酸化剤は、費用効果が高く、取り扱いが容易であり、大規模製造に適している。

図１は、本発明における原料であるＭセグメント中間体の核磁気共鳴分光法（^１Ｈ−ＮＭＲ）を示す。 図２は、臭素水による酸化から得られたオリゴマンヌロン二酸のＳＥＣ−ＨＰＬＣグラフを示す。 図３は、液体臭素による酸化から得られたオリゴマンヌロン二酸のＳＥＣ−ＨＰＬＣグラフを示す。 図４は、ＮａＢｒＯを用いた酸化から得られたオリゴマンヌロン二酸のＳＥＣ−ＨＰＬＣグラフを示す。 図５は、臭化ナトリウムによって触媒された次亜塩素酸ナトリウムの酸化から得られたオリゴマンヌロン二酸のＳＥＣ−ＨＰＬＣグラフを示す。 図６は、臭素−次亜塩素酸ナトリウムによる酸化から得られたオリゴマンヌロン二酸のＳＥＣ−ＨＰＬＣグラフを示す。 図７Ａは、（臭素水−次亜塩素酸ナトリウムによる）酸化前のマンヌロン酸のヘキソース部分のＬＣ−ＭＳグラフを示す。 図７Ｂは、（臭素水−次亜塩素酸ナトリウムによる）酸化後のマンヌロン酸のヘキソース部分のＬＣ−ＭＳグラフを示す。

本明細書で使用される「約」という用語は、その用語で修飾された値の±５％の範囲内に入ること、好ましい実施形態では、その用語で修飾された値の±３％の範囲内に入ること、そして、より好ましい実施形態では、この用語で修飾された値の±１％の範囲内に入ることを意味する。

Ｍセグメント中間体の調製
本発明において使用される原料であるＭセグメント中間体は、先行技術において知られている方法、例えば、中国特許出願第９８８０６６３７．８号およびＣＮ０２８２３７０７．２号に開示されている方法によって調製することができる。これらの方法について簡単に説明すると以下のとおりである：まずアルギン酸を分解してポリマンヌロン酸とポリグルロン酸の混合多糖とし；次いで、この混合多糖を酸性法により沈殿させてその中のポリグルロン酸を除去し、さらに精製して９０％を超える純度のホモポリマンヌロン酸を得る。

本方法によって調製されるＭセグメント中間体は、約１０ＫＤａの分子量を有し、その構造は、図１に示されるように、Ｈ ＮＭＲスペクトル（^１Ｈ−ＮＭＲ）により確認される。特定の実施形態では、Ｈ ＮＭＲスペクトルにおける４．５ｐｐｍの化学シフト値付近に、末端プロトンのシグナルが１つのみあり、これはマンヌロン酸のＣ１位の１Ｈに帰属し、そして、３．５ｐｐｍから３．９ｐｐｍの間には４つの水素シグナルがあり、それらはＣ２−Ｃ５における４つの^１Ｈシグナルに帰属する。このようにして得られたＭセグメント中間体は、次の工程の反応に直接使用することができる。

好ましい実施形態では、本発明に適したＭセグメント中間体は、６０％を超える、好ましくは７０％を超える、より好ましくは８０％を超える純度、および１〜１５ＫＤａ、好ましくは２〜１２ＫＤａ、およびより好ましくは４〜１０ＫＤａの範囲の分子量を有する。

Ｍセグメントオリゴ糖の調製
Ｍセグメント中間体は、酸化すべきＭセグメントオリゴ糖を得るための酸分解の原料として使用される。Ｍセグメント中間体は、水に溶解して１５％（ｗ／ｖ）を超える濃度の濃縮溶液とした後、酸分解に付される。好ましくは、この溶液は、２０％（ｗ／ｖ）を超える、より好ましくは２５％（ｗ／ｖ）を超える濃度を有する。

その後、この溶液のｐＨを酸性、好ましくはpＨ５未満、より好ましくはpＨ４未満、最も好ましくはpＨ３．５未満に調整する。この溶液は、高温高圧下での分解に付され、室温に自然冷却される。

酸分解は、高温高圧条件下で行われる。温度は、９５〜１５０℃、好ましくは１００〜１３０℃、さらに好ましくは１０５〜１２０℃である。圧力は、０．１０〜０．５０ＭＰａ、好ましくは０．１０〜０．２８ＭＰａ、さらに好ましくは０．１５〜０．２０ＭＰａである。

分解後の溶液を濃縮し、蒸発させ、乾燥させて無水の固体を得る。

Ｍセグメントオリゴ糖は、二糖〜十三糖の混合物を含んでなり、ここで、二糖〜十三糖の混合物の重量基準で、二糖〜四糖は約４０〜６０％、好ましくは５０％；五糖〜十糖は約３０〜５０％、好ましくは４０％；十一糖〜十三糖は約５〜１５％、好ましくは約１０％を占める。

活性な次亜臭素酸塩による酸化工程
前の工程で調製された無水Ｍセグメントオリゴ糖を酸化して、本発明のオリゴマンヌロン二酸を製造する。この工程で使用される酸化剤は臭素含有酸化剤である。具体的には、この臭素含有酸化剤は、臭素水、液体臭素、次亜臭素酸、次亜臭素酸塩、臭化物イオン源と次亜塩素酸塩との組合せ、および臭素と次亜塩素酸塩との組合せからなる群から選択される。次亜臭素酸塩または次亜臭素酸イオンは安定ではないので、本発明の方法で使用される次亜臭素酸塩は、反応系において、in situで生成させることができ、または反応溶液に添加する前にその場で調製することができる。

本発明の一実施形態では、酸化剤として臭素水または液体臭素が使用される。臭素水は市販品として供給業者から入手可能である。一般に市販されている臭素水は３％の濃度である。

本発明の一実施形態では、酸化剤として次亜臭素酸塩が使用される。次亜臭素酸塩は、次亜臭素酸ナトリウムおよび／または次亜臭素酸カリウムであり得る。次亜臭素酸塩は、液体臭素およびアルカリを反応媒体に加えることによって、in situで調製される。例えば、液体臭素とＮａＯＨまたはＫＯＨとの混合物から調製される。

一例として次亜臭素酸ナトリウムを取り上げると、このようにして行われる酸化反応の化学式は以下の通りである。

本発明の別の実施形態では、次亜臭素酸塩は、金属臭化物と次亜塩素酸ナトリウムまたは次亜塩素酸カリウムとの反応の進行によってin situで調製することができる。反応の間に反応溶液は褪色し、その後徐々に赤褐色となり、Ｂｒ_２の生成を示す。反応の進行とともに色は薄くなる。一例として次亜塩素酸ナトリウムを取り上げると、このようにして行われる酸化反応の化学式は以下の通りである。

あるいは、別の実施形態では、次亜臭素酸塩は、臭素水と次亜塩素酸ナトリウムまたは次亜塩素酸カリウムとを反応させることによって、in situで調製することができる。一例として次亜塩素酸ナトリウムを取り上げると、反応は以下の通りである。

この実施形態では、添加された臭素によって、原料であるオリゴマンヌロン酸の一部が酸化されて臭化物イオンを生じ；この臭化物イオンが、次亜塩素酸ナトリウムを触媒し、反応が完了するまで未反応の原料が連続的に反応する。

本発明の酸化工程は、pＨ６〜１０、好ましくはpＨ６．５〜９．６、より好ましくはpＨ７．５〜９．５で行われる。本発明の酸化工程は、好ましくは０〜７０℃、より好ましくは１０〜４５℃の温度で行われる。

このようにして製造されたオリゴマンヌロン二酸は精製してもよい。例えば、沈殿させるため、エタノールまたはメタノールなどのアルコールを使用することができる。次いで、沈殿物を再溶解し、２回目のアルコール沈殿に付す。油状の沈殿物は、分液漏斗で単離する。この油状の沈殿物を乾燥して所望のオリゴマンヌロン二酸を得る。生成物中に残留する単糖類、有機酸不純物、および無機塩をさらに除去するためにさらに精製が必要な場合は、膜透析またはカラムクロマトグラフィーを行ってもよい。これらの操作は、当業者に知られている。以下に記載する実施例でそれらの実施形態のいくつかを説明する。

本発明の別の態様は、還元オリゴ糖または多糖の酸化において臭素イオンまたは次亜臭素酸イオン（ＢｒＯ⁻）によって機能する酸化剤の使用を提供し、ここで酸化剤は、臭素水、液体臭素、in situで次亜臭素酸塩を生じる混合物、次亜塩素酸塩と金属臭化物の組み合わせ、および臭素−次亜塩素酸ナトリウムの組み合わせからなる群から選択される。

一実施形態において、還元オリゴ糖または多糖の還元末端にある糖環（saccharide ring）のＣ１位のアルデヒド基またはヘミアセタールは、カルボキシル基に酸化されて、対応する糖酸または糖二酸を生じる。一実施形態では、還元オリゴ糖または多糖は、ポリマンヌロン酸およびポリグルロン酸からなる群から選択され、好ましくはポリマンヌロン酸である。

本発明の利点は、以下の非限定的な実施例においてさらに説明される。但し、実施例において用いられる特定の材料やその量ならびに他の実験条件によって本発明は限定されないということは理解されるであろう。特記しない限り、本発明における部、比率、百分率などは、重量基準である。

実施例１
工程１）：Ｍセグメントオリゴ糖の調製
１５００ｇのＭセグメント中間体を秤量し、蒸留水で溶解して７５００ｍＬの溶液とした。この溶液を、濃塩酸でｐＨ３．５に調整し、いくつかに分け、オートクレーブに入れて１１０℃で３．５時間加熱し、冷却して取り出し、ロータリーエバポレーターで濃縮し、真空オーブン中６０℃にて乾燥し、１５１５ｇのＭセグメントオリゴ糖を得た。
このＭセグメントオリゴ糖をＨＰＬＣ−ＭＳにより定性分析した。ＨＰＬＣ条件：クロマトグラフィーカラム、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ １２５ ＳＥＣ １．７μｍ、４．６×３００ｍｍ；移動相：２０％メタノール−水に溶解した５０ｍＭ ＮＨ_４Ａｃ、流速０．１ｍＬ／分；試料濃度：１ｍｇ／ｍＬ；注入量：８μｌ；カラムインキュベーター温度：３０℃；検出器：ＤＡＤ検出器、２１０ｎｍ。ＭＳ条件：Agilent 6540 QTOF；イオン源：ＥＳＩ；フラグメンテーション電圧：１２０Ｖ；アニオンモード。
酸分解によって得られたＭセグメントオリゴ糖生成物は全てオリゴマンヌロン酸であり、これらは主に二糖〜十三糖であった。二糖〜十三糖までのＭＳ解析を、以下の表１の左半分に示す。

工程２）：オリゴマンヌロン二酸の調製
１００ｇの上記無水Ｍセグメントオリゴ糖を５Ｌのガラスビーカーに入れ、１Ｌの蒸留水で溶解し、１Ｌの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄を加え、濃塩酸でｐＨ８．０に調整した。３．３Ｌの市販の３％臭素水を攪拌しながら室温（２０℃）で１０分以内にゆっくり加えた。反応が完了するまで混合物を２時間連続的に撹拌した。
反応後の溶液を、４Ｌの９５％エタノールを入れたプラスチック製のバケツに注ぎ、穏やかに攪拌した後１時間静置した。静置して層ができたら、上澄み液を除去し、下層に適量の９５％エタノールを加えて脱水した。下層の黄褐色の油状物を集め、真空オーブン（６０℃）中、１２時間減圧乾燥して、１２５ｇのオリゴマンヌロン二酸である乾燥した酸化生成物を得た。この乾燥したオリゴマンヌロン二酸を少量取り、正確に秤量して５．０ｇとし、これに水を加えて溶解させて１０％溶液を調製した。この溶液を、分画分子量１０００Ｄａの透析バッグを用いた透析によって脱塩し、単糖も除去した。脱塩後にこれを濃縮、乾燥し、秤量すると３．８ｇであった。酸化反応の原料である１００ｇのＭセグメントオリゴ糖から計算すると、脱塩乾燥後のオリゴマンヌロン二酸の収率は９５．０％であった。
脱塩乾燥後の上記の生成物を、ＨＰＬＣ−ＭＳにより定性分析した。ＨＰＬＣ条件：クロマトグラフィーカラム、Ｗａｔｅｒｓ ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＢＥＨ １２５ ＳＥＣ １．７μｍ、４．６×３００ｍｍ；移動相：２０％メタノール−水に溶解した５０ｍＭ ＮＨ_４Ａｃ、流速０．１ｍＬ／分；試料濃度：１ｍｇ／ｍＬ；注入量：８μｌ；カラムインキュベーター温度：３０℃；検出器：ＤＡＤ検出器、２１０ｎｍ。ＭＳ条件：Agilent 6540 QTOF；イオン源：ＥＳＩ；フラグメンテーション電圧：１２０Ｖ；アニオンモード。酸化反応の完全性は９５％以上であり、さらなる副反応は起こらなかった。脱塩操作により、大部分の単糖および少量の二糖が除去された。酸化生成物であるオリゴマンヌロン二酸の二糖〜十三糖までのＭＳ解析を、以下の表１の右半分に示す。

実施例２
実施例１で調製した１００ｇのＭセグメントオリゴ糖を５リットルのガラスビーカーに入れ、１リットルの蒸留水で溶解し、１リットルの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄を添加し、濃塩酸でｐＨ６．５に調整し、水浴中で４０℃に加熱し、攪拌した。１．７Ｌの市販の３％臭素水を１０分以内にゆっくり加えた。３時間連続して撹拌した後、２倍量の９５％エタノールを添加することにより反応を停止させ、生成物を沈殿させた。沈殿物を適量の水で溶解し、アルコール沈殿操作を１回繰り返した。最後に、沈殿物を真空オーブン中で乾燥して、９６ｇの褐色レンガ色の固体を約９６％の収率で得た。実施例１と同じ実験条件で、固体物質の組成をＨＰＬＣ−ＭＳにより分析した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を図２Ａに示す。

実施例３
実施例１で調製した１００ｇのＭセグメントオリゴ糖を５Ｌのガラスビーカーに入れ、１Ｌの蒸留水で溶解し、１Ｌの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄を加え、濃塩酸でｐＨ９．５に調整し、適量の氷を加えることにより水浴中で１０℃に冷却し、撹拌した。４．７Ｌの市販の３％臭素水を１０分以内にゆっくり加えた。１時間連続して撹拌した後、２倍量の９５％エタノールを添加することにより反応を停止させ、生成物を沈殿させた。沈殿物を適量の水で溶解し、アルコール沈殿操作を１回繰り返した。最後に、沈殿物を真空オーブン中で乾燥させて９４ｇの褐色レンガ色の固体を約９４％の収率で得た。実施例１と同じ実験条件で、固体物質の組成をＨＰＬＣ−ＭＳにより分析した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣ分析結果を図２Ｂに示す。

実施例４
実施例１で調製した１００ｇのＭセグメントオリゴ糖を５００ｍＬの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液に溶解し、塩酸でｐＨ８．０に調整し、氷水浴中で攪拌して冷却し、１００ｇ（約３５ｍＬ）の液体臭素（商業的に入手可能、含有量＞９９％）をゆっくり加えた。液体臭素を滴加しながら、適量の６Ｍ ＮａＯＨを補充した。反応溶液のｐＨをｐＨ試験紙で試験して７〜９の間になるようにコントロールした。液体臭素の滴加が完了した後、氷水浴を取り外した。室温（２３℃）で１．５時間撹拌した後、２倍量の９５％エタノールを加えて反応を停止させ、生成物を沈殿させた。沈殿物を適量の水で溶解し、アルコール沈殿操作を１回繰り返した。最後に、沈殿物を真空オーブン中で乾燥させて、９７ｇの褐色レンガ色の固体を約９７％の収率で得た。実施例１と同じ実験条件で、固体物質の組成をＨＰＬＣ−ＭＳにより分析した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を図３Ａに示す。

実施例５
実施例１で調製した１００ｇのＭセグメントオリゴ糖を５００ｍＬの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液に溶解し、塩酸でｐＨ６．５に調整し、氷水浴中で撹拌して冷却し、６０ｇ（約２０ｍＬ）の液体臭素（商業的に入手可能、含有量＞９９％）をゆっくり加えた。液体臭素を滴加しながら、適量の６Ｍ ＮａＯＨを補充した。反応溶液のｐＨをｐＨ試験紙で試験して７〜９の間になるようにコントロールした。液体臭素の滴加が完了した後、氷水浴を取り外した。水浴中で４０℃に加熱し、３時間攪拌した後、２倍量の９５％エタノールを添加することにより反応を停止させ、生成物を沈殿させた。沈殿物を適量の水で溶解し、アルコール沈殿操作を１回繰り返した。最後に、沈殿物を真空オーブン中で乾燥させて９４ｇの褐色レンガ色の固体を約９４％の収率で得た。実施例１と同じ実験条件で、固体物質の組成をＨＰＬＣ−ＭＳにより分析した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を図３Ｂに示す。

実施例６
実施例１で調製した１００ｇのＭセグメントオリゴ糖を５００ｍＬの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液に溶解し、塩酸でｐＨ９．５に調整し、氷水浴中で撹拌して冷却し、１５０ｇ（約５０ｍＬ）の液体臭素（市販、含有量＞９９％）をゆっくり加えた。液体臭素を滴加しながら、適量の６Ｍ ＮａＯＨを補充した。反応溶液のｐＨをｐＨ試験紙で試験して７〜９の間になるようにコントロールした。液体臭素の滴加が完了した後、氷水浴を取り外した。氷が溶けた後に温度が１０℃になるよう適量の氷を水浴に添加し、必要であれば適宜氷を補充して温度を１０℃にコントロールした。１時間撹拌した後、２倍量の９５％エタノールを添加することにより反応を停止させ、生成物を沈殿させた。沈殿物を適量の水で溶解し、アルコール沈殿操作を１回繰り返した。最後に、沈殿物を真空オーブン中で乾燥して、９３ｇの褐色レンガ色の固体を約９３％の収率で得た。実施例１と同じ実験条件で、固体物質の組成をＨＰＬＣ−ＭＳによって分析した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を図３Ｃに示す。

実施例７
実施例１で調製した１００ｇのＭセグメントオリゴ糖を５００ｍＬの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液に溶解し、塩酸でｐＨ８．０に調整してＭセグメントオリゴ糖溶液を得た。１００ｍＬの６Ｍ ＮａＯＨ溶液を調製し、氷水浴中で冷却した。液体臭素も氷水浴中で予め冷却した。反応時に、ＮａＯＨ溶液を液体臭素と反応させて次亜臭素酸ナトリウムを生成させ、次いで次亜臭素酸ナトリウムをＭセグメントオリゴ糖と反応させた。
次亜臭素酸ナトリウムは安定ではないので、使用直前に調製する必要があった。このようにしてオンライン連続反応装置を適用した：反応装置は、冷却器を備えた混合反応器Ａと、混合反応器Ｂとを含み、それぞれ容積５０ｍＬおよび１００ｍＬであり、予め蒸留水で満たした；−１０℃の冷却液を反応器Ａの冷却管に通しながら、ＮａＯＨ溶液と液体臭素とを別々に、手動で、プラスチックシリンジにてそれぞれ５ｍＬ／分および１ｍＬ／分の一定速度で、連続的に送り込んだ；ＮａＯＨ溶液と液体臭素を混合反応器Ａ中で一定時間反応させた後、得られたＮａＢｒＯを反応器Ａから排出して反応器Ｂに導入し、室温で反応器Ｂにポンプ輸送（流速１０ｍＬ／分）したＭセグメントオリゴ糖溶液と反応させた。生成物のオリゴマンヌロン二酸は１６ｍＬ／分の速度で混合反応器Ｂから排出した。排出液を８００ｍＬの９５％エタノールを含むビーカーに回収した。
反応終了後、ビーカー内の下層にある黄褐色の油状沈殿物を回収し、適量の水で溶解した後、再度アルコール沈殿操作を行い、真空オーブン中で減圧乾燥（６０℃、１２時間）した後に約９０％の収率で９０ｇの褐色の固体を得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析のために少量の乾燥生成物を取った。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を図４Ａに示す。

実施例８
実施例１で調製した１００ｇのＭセグメントオリゴ糖を５００ｍＬの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液に溶解し、塩酸でｐＨ６．５に調整した。１００ｍＬの６Ｍ ＮａＯＨ溶液を調製し、氷水浴中で冷却した。液体臭素も氷水浴中で予め冷却した。反応を実施するため、ＮａＯＨ溶液を液体臭素と反応させて次亜臭素酸ナトリウムを生成させ、これを次いでＭセグメントオリゴ糖と反応させた。
反応装置は実施例７と同じであった。ＮａＯＨ溶液および液体臭素が反応器Ａに入るときの流速は、それぞれ３ｍＬ／分および０．６ｍＬ／分であった；反応器Ｂ中のＭセグメントオリゴ糖溶液の流速は１０ｍＬ／分であった。水浴で温度を４０℃にすることにより反応を制御した。生成物のオリゴマンヌロン二酸は１４ｍＬ／分の速度で混合反応器Ｂから排出した。排出液を８００ｍＬの９５％エタノールを含むビーカーに回収した。反応終了後、ビーカー内の下層にある黄褐色の油状沈殿物を回収し、適量の水で溶解した後、再度アルコール沈殿操作を行った。最後に、沈殿物を真空オーブン中で減圧乾燥し（６０℃、１２時間）、９３ｇの褐色の固体を約９３％の収率で得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析のために少量の乾燥生成物を取った。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を図４Ｂに示す。

実施例９
実施例１で調製した１００ｇのＭセグメントオリゴ糖を５００ｍＬの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液に溶解し、塩酸でｐＨ９．５に調整してＭセグメントオリゴ糖溶液を得た。１００ｍＬの６Ｍ ＮａＯＨ溶液を調製し、氷水浴中で冷却した。液体臭素も氷水浴中で予め冷却した。反応を行うために、まずＮａＯＨ溶液を液体臭素と反応させて次亜臭素酸ナトリウムを生成させ、これを次いでＭセグメントオリゴ糖と反応させた。
反応装置は実施例７と同じであった。ＮａＯＨ溶液および液体臭素が反応器Ａに入るときの流速はそれぞれ７．５ｍＬ／分および１．５ｍＬ／分であった。反応器Ｂ中のＭセグメントオリゴ糖溶液の流速は１０ｍＬ／分であった。反応温度を１０℃に制御した。生成物のオリゴマンヌロン二酸は１９ｍＬ／分の速度で混合反応器Ｂから排出した。排出液を８００ｍＬの９５％エタノールを含むビーカーに回収した。反応終了後、ビーカー内の下層にある黄褐色の油状沈殿物を回収し、適量の水で溶解した後、再度アルコール沈殿操作を行った。最後に、沈殿物を真空オーブン中で減圧乾燥し（６０℃、１２時間）、９４ｇの褐色の固体を約９４％の収率で得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析のために少量の乾燥生成物を取った。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を図４Ｃに示す。

実施例１０
実施例１で調製した１００ｇのＭセグメントオリゴ糖を５００ｍＬの１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液に溶解し、塩酸でｐＨ７．５に調整し、２０ｇの臭化ナトリウムを加えて攪拌しながら溶解し、５０ｍＬの次亜塩素酸ナトリウム（市販、１３％溶液として）を室温（１８℃）で滴加した。反応溶液が褪色した後、徐々に赤褐色となった。反応が一定時間進行した後に色は薄くなった。反応が３時間進行した後、色はオレンジ−黄色になった。
反応溶液を９５％エタノール６００ｍＬの入ったビーカーに注ぎ、均一に混合した後、層ができるまで静置した。下層の液を適量の水で溶解し、２倍量の９５％エタノールを用いて再沈殿した後、真空オーブン中６０℃で１２時間減圧乾燥した。乾燥後、９７ｇの褐色の固体が約９７％の収率で得られた。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析のために少量を取った。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を図５Ａに示す。

実施例１１
実施例１で調製した１００ｇのＭセグメントオリゴ糖を５００ｍＬの１Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４緩衝液に溶解し、塩酸でｐＨ６．５に調整し、２０ｇの臭化ナトリウムを加えて撹拌しながら溶解し、２５ｍＬの次亜塩素酸ナトリウム（市販、１３％溶液として）を４０℃にて滴加した。反応溶液が褪色した後、徐々に赤褐色となった。反応が一定時間進行した後に色は薄くなった。反応が３時間進行した後、色はオレンジ−黄色になった。反応溶液を９５％エタノール６００ｍＬの入ったビーカーに注ぎ、均一に混合した後、層ができるまで静置した。下層の液を適量の水で溶解し、２倍量の９５％エタノールを用いて再沈殿した後、真空オーブン中６０℃で１２時間減圧乾燥した。乾燥後、９０ｇの褐色の固体が約９０％の収率で得られた。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析のために少量を取った。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を図５Ｂに示す。

実施例１２
実施例１で調製した１００ｇのＭセグメントオリゴ糖を５００ｍＬの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液に溶解し、塩酸でｐＨ９．５に調整し、２０ｇの臭化ナトリウムを加えて攪拌しながら溶解し、７５ｍＬの次亜塩素酸ナトリウム（市販の１３％溶液）を４０℃にて滴加した。反応溶液が褪色した後、徐々に赤褐色となった。反応が一定時間進行した後に色が薄くなった。反応が１時間進行した後、色はオレンジ−黄色になった。反応溶液を９５％エタノール６００ｍＬの入ったビーカーに注ぎ、均一に混合した後、層ができるまで静置した。下層の液を適量の水で溶解し、２倍量の９５％エタノールを用いて再沈殿した後、真空オーブン中６０℃で１２時間減圧乾燥した。乾燥後、９６ｇの褐色固体が約９６％の収率で得られた。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析のために少量を取った。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を図５Ｃに示す。

実施例１３
実施例１で調製した１００ｇのＭセグメントオリゴ糖を、塩酸でｐＨ８．５に調整した５００ｍＬの１ＭのＮａ₂ＨＰＯ₄緩衝液に溶解し、室温で攪拌しながら１０ｍＬの液体臭素を滴加した。この後、反応物に３５ｍＬの次亜塩素酸ナトリウム（市販、１３％溶液として）をさらに加えた。反応は１時間進行した。反応終了後、２倍量の９５％エタノールを加えて反応を停止させ、層ができるまで静置した。下層の黄褐色の油状沈殿物を適量の水で溶解した後、再度アルコール沈殿操作を行った。最後に、沈殿物を真空オーブン内で減圧乾燥して、９１ｇの固形物を約９１％の収率で得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析のために少量のサンプルを採取した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を図６Ａに示す。

実施例１４
実施例１で調製した１００ｇのＭセグメントオリゴ糖を５００ｍＬの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液に溶解し、塩酸でｐＨ６．５に調整し、水浴中で４０℃に加熱し、撹拌しながら８ｍＬの液体臭素を滴加した。その後、反応物に次亜塩素酸ナトリウム（市販、濃度１３％）２０ｍLをさらに加えた。反応は３時間進行した。反応過程は実施例１３において式（Ｖ）として示された。添加された臭素は、原料であるオリゴマンヌロン酸の一部を酸化して臭化物イオンを生じた；この臭化物イオンが次亜塩素酸ナトリウムを触媒し、反応が完了するまで未反応の原料が連続的に反応した。反応終了後、２倍量の９５％エタノールを加えて反応を停止させ、層ができるまで静置した。下層の黄褐色の油状沈殿物を適量の水で溶解した後、再度アルコール沈殿操作を行った。最後に、沈殿物を真空オーブン中で減圧乾燥して、９６ｇを約９６％の収率で得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析のために少量のサンプルを採取した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を図６Ｂに示す。

実施例１５
実施例１で調製した１００ｇのＭセグメントオリゴ糖を５００ｍＬの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄緩衝液に溶解し、塩酸でｐＨ９．５に調整し、その間水浴中に氷を加えることにより温度を１０℃に制御し、攪拌しながら１５ｍＬの液体臭素を滴加した。その後、反応物に次亜塩素酸ナトリウム５０ｍＬ（市販、濃度13％）をさらに加えた。反応は０．５時間進行した。反応過程は実施例１３において式（Ｖ）として示された。添加された臭素は原料のオリゴマンヌロン酸の一部を酸化し、臭化物イオンを生じた；この臭化物イオンが次亜塩素酸ナトリウムを触媒し、反応が完了するまで未反応の原料が連続的に反応した。反応終了後、２倍量の９５％エタノールを加えて反応を停止させ、層ができるまで静置した。下層の黄褐色の油状沈殿物を適量の水で溶解した後、再度アルコール沈殿操作を行った。最後に、沈殿物を真空オーブン中で減圧乾燥して、９４ｇの固形物を約９４％の収率で得た。ＨＰＬＣ−ＭＳ分析のために少量のサンプルを採取した。ＳＥＣ−ＨＰＬＣの分析結果を図６Ｃに示す。

実施例１６
実施例１で調製した１０ｇのＭセグメントオリゴ糖を水に溶解して０．１ｇ／ｍＬとし、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ６ゲルクロマトグラフィーカラムを用いて単離し、０．０２Ｍ ＮａＣｌで溶出し、ＵＶ２１０ｎｍで検出し、自動コレクターにより回収した。同じ成分を混合し、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ６ゲルクロマトグラフィーカラムを用いて脱塩し、乾燥して１０個のオリゴ糖成分を得た。それらの一つのオリゴ糖成分をＨｅｘａＭとしてマークした。ＨｅｘａＭをＨＰＬＣ−ＭＳによって分析したところ、ほとんどが六糖のオリゴマンヌロン酸であったが、五糖および七糖が少量存在していたことが示された。詳細については図７Ａを参照。

０．５ｇの上記のＨｅｘａＭを秤量し、５ｍＬの水に溶解し、５０ｍＬの丸底フラスコに移し、５ｍＬの１Ｍ Ｎａ₂ＨＰＯ₄を加え、６Ｍ ＨＣｌでｐＨ７．９に調整し、２０℃の室温に保ち、マグネチックスターラーで撹拌し、市販の３％濃度の臭素水１．０ｍＬを滴加し、３０分間攪拌し、次亜塩素酸ナトリウム（市販の１３％濃度）０．５ｍLを滴加し、１時間攪拌し、９５％エタノール１０ｍＬを加えて反応を停止させ、生成物を沈殿させた。沈殿物を１０ｍＬの水で再溶解し、エタノールを添加することによって再び沈殿させた。上澄み液をピペットで除去し、沈殿物を集め、真空オーブン中６０℃で乾燥して０．４８ｇの固体を得た。実施例１と同じ分析方法によるＨＰＬＣ−ＭＳ分析のために適量の固体を採取した。分析結果は、反応原料中の主成分であるマンヌロン酸六糖がマンヌロン二酸六糖に酸化されたことを示し、反応完結率は＞９８％であった。ＬＣ−ＭＳの分析結果を図７Ｂに示す。

Claims (13)

1. オリゴマンヌロン酸を臭素含有酸化剤と接触させる酸化反応工程を含む、オリゴマンヌロン二酸の製造方法であって、該臭素含有酸化剤が、臭素水、液体臭素、次亜臭素酸、次亜臭素酸塩、臭化物イオン源と次亜塩素酸塩との組合せ、および臭素と次亜塩素酸塩との組合せからなる群から選択され、酸化反応の温度が１０〜４０℃である、製造方法。
2. 次亜臭素酸および／または次亜塩素酸塩に基づいて算出される臭素含有酸化剤のモル量が反応原料であるオリゴマンヌロン酸の１．０〜２．０倍である、請求項１に記載の方法。
3. 酸化反応のｐＨが６．５〜９．５になるように制御される、請求項１または２に記載の方法。
4. 次亜臭素酸または次亜臭素酸塩がin situでの製造により得られる、請求項１に記載の方法。
5. in situでの製造が臭素とアルカリ水溶液との反応によって達成される、請求項４に記載の方法。
6. アルカリ水溶液が、水酸化ナトリウムまたはリン酸ナトリウムまたは炭酸ナトリウムの水溶液などの、アルカリ金属水酸化物またはアルカリ金属リン酸塩またはアルカリ金属炭酸塩の水溶液である、請求項１に記載の方法。
7. 次亜臭素酸塩または次亜塩素酸塩が、ナトリウム塩またはカリウム塩などのアルカリ金属塩である、請求項１に記載の方法。
8. オリゴマンヌロン酸出発物質が、２〜２０個のマンヌロン酸単位を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. オリゴマンヌロン酸出発物質が、２〜１５個、２〜１３個、３〜１２個、４〜１０個、または４〜８個のマンヌロン酸単位を含む、請求項８に記載の方法。
10. 前記オリゴマンヌロン酸が、高い重合度を有するポリマンヌロン酸の分解によって得られる、請求項８または９に記載の方法。
11. 前記分解が酸性条件下での分解である、請求項１０に記載の方法。
12. 前記ポリマンヌロン酸が、１５％（ｗ／ｖ）を超える濃度とポリマンヌロン酸の分解を可能にするために５．０未満に調整されたｐＨを有する濃縮溶液として調製される、請求項１１に記載の方法。
13. 前記ポリマンヌロン酸が２０以上の重合度を有する、請求項１０〜１２のいずれかに記載の方法。

Images