JP6850736B2 - ムコ多糖症治療用のアデノ随伴ウイルスベクター - Google Patents

Description

本発明は、所定のタンパク質の発現に有用なベクター、および遺伝子治療におけるその利用に関する。本発明はまた、ムコ多糖症（ＭＰＳ）の治療、とりわけムコ多糖症ＩＩ型またはハンター症候群の治療に役立つ、ベクターおよび核酸配列に関する。

リソソームは、５０種類を超える加水分解酵素を含んでいる、動物細胞の細胞質に見られる細胞内小器官である。上記加水分解酵素は、使い古した細胞の構成要素の再利用中、または、ウイルスおよび細菌の貪食後に、生体分子を破壊する。上記細胞内小器官は、プロテアーゼ、ヌクレアーゼ、グリコシダーゼ、リパーゼ、ホスホリパーゼ、ホスファターゼおよびスルファターゼを含む、いくつかの種類の加水分解酵素を含んでいる。すべての酵素は、酸性の加水分解酵素である。

リソソーム蓄積症（ＬＳＤ）は、１種類以上のリソソーム酵素に影響を及ぼす遺伝的欠陥によって引き起こされる。これらの遺伝病は、一般的に、リソソーム中に存在する特定の酵素活性における欠陥に起因する。より少ない程度ではあるが、これらの疾患は、リソソームの生合成に関係しているタンパク質における欠陥が原因であることもある。

ＬＳＤは、個人としては珍しい。しかし群としては、これらの障害は、一般集団において比較的多くみられる。ＬＳＤの総罹患率は、生児出生の約５０００人に１人である（Meikle P, et al., JAMA 1999;281:249-254を参照）。しかし、一般集団の中でもいくつかの集団は、特に高い発生率でＬＳＤに罹患する。例えば、中部および東ヨーロッパのユダヤ系（アシュケナージ）の個人の子孫において、ゴーシュ病およびテイ＝サックス病の罹患率は、それぞれ、出生児の６００人に１人、および出生児の３９００人に１人である。

ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）（ハンター症候群の名でも知られ、チャールズ・ハンター博士によって最初に記述された）は、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）遺伝子によってコードされ、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ヘパラン硫酸（ＨＳ）およびデルマタン硫酸（ＤＳ）のリソソームによる段階的な分解に関連している、ＩＤＳ酵素の活性の欠陥または欠如によって引き起こされる慢性、進行性、多臓器的な（multisystemic）ＬＳＤであり、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）ヘパラン硫酸（ＨＳ）およびデルマタン硫酸（ＤＳ）の病的な蓄積をもたらす（Hunter, Proc R Soc Med. 1917;10(Sect Study Dis Child):104-16を参照）。Ｘ染色体に関連した劣性遺伝により、ハンター症候群の患者はほとんどすべて男性であるが、ハンター症候群の女性も数人、文献で報告されている（Mossman et al., Arch Dis Child. 1983;58:911-915, Gullen-Navarro et al., Orphanet J Rare Dis. 2013;25(8):92, Valstar et al., J. Inherit. Metab. Dis. 2008;31(2):240-52を参照）。

ＭＰＳＩＩは、小児期に発症する、中枢神経系（ＣＮＳ）の進行性神経障害として臨床的に特徴づけられる。ハンター症候群の子供は、通常、出生時には正常であるが、２歳になる前に諸症状を発症する（Schwartz et al., Acta Paediatr Suppl. 2007;96:63-70を参照）。臨床経過は、一般に、ゆっくりと進行する認識機能障害で始まり、続いて行動上の諸問題および進行性の知的衰弱が生じる。その後、運動の喪失が生じる。神経の諸症状に加えて、ＭＰＳＩＩの患者には非神経的変化も生じる。当該非神経的変化としては、耳、鼻、喉、胸の反復性の感染、頻繁な下痢や便秘、心不全、粗い顔貌、低身長、進行性の関節硬化および変性、動きやすさに影響する骨格異常、肝腫脹および脾腫が挙げられる（Neufeld and Muenzer, “The Mucopolysaccharidoses” in Scriver C, et al., Eds., “The metabolic and molecular basis of inherited disease”, McGraw-Hill Publishing Co., New York, NY, US, 2001, pp. 3421-3452を参照）。本疾患の臨床的徴候のスペクトルは、患者が有するＩＤＳ活性の残余レベルによってかなり異なる。患者が有するＩＤＳ活性は、ＩＤＳ遺伝子の潜在的な変異によって決まる。現在まで、ＩＤＳ遺伝子の３００を超える変異が記述されている（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/gene.php?gene=IDS）。一般に、ＭＰＳＩＩの２種類の臨床型が記述されてきた。最も重篤な型は、１８ヶ月から４歳のあいだに発症するもので、軽度の型の３倍の発症率であり、粗い顔貌、骨格異常、肝脾腫大症、および精神遅滞に至る神経学的障害によって特徴づけられる（Wraith et al., Eur J Pediatr. 2008;167(3):267-277を参照）。患者は通常、閉塞性気道疾患や心不全のために十代で死亡する（Wraith et al., Eur J Pediatr. 2008;167(3):267-277, Neufeld and Muenzerの上記箇所を参照）。本疾患の、より進行が遅い型は、発症がより遅く、より長く生存し、神経機能障害が最小であるもので、弱毒化表現型（attenuated phenotype）として知られており、ＭＰＳＩＩの患者の一部で報告されてきた（Wraith et al., Eur J Pediatr. 2008;167(3):267-277, Neufeld and Muenzerの上記箇所を参照）。

最近まで、ＭＰＳＩＩ症候群に対する特定の承認された治療法は存在せず、利用可能な唯一の治療は、合併症を予防し管理する広範囲の不特定の薬物を用いた対症的なものであった。過去数年のあいだに、２つの主要な治療の選択肢が利用可能になった。酵素補充療法（ＥＲＴ）および造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）である。どちらの治療法の設計も、正常な細胞はマンノース−６−リン酸（Ｍ６Ｐ）で標識された溶解性リソソーム酵素（例えば、ＩＤＳ）を多量に分泌し、その後、それを他の細胞によって細胞外区画から、細胞膜上のＭ６Ｐ受容体を通して運び、リソソームへと向けることができるという事実に基づいた、クロスコレクション（cross-correction）の可能性に頼るものである（Enns et al., Neurosurg Focus. 2008;24(3-4):E12を参照）。さらに、残存酵素活性の閾値が存在する。この閾値は、一般に非常に低く、その閾値を上回るならば、細胞は基質の流入に対処することができ、対象は本疾患に影響されない。このことは、正常な活性を回復することは、臨床経過を改善する必要条件ではないことを示唆している（Neufeld, Annu Rev Biochem. 1991;60:257-80を参照）。

２００６年にアメリカ食品医薬品局（ＦＤＡ）で、２００７年に欧州医薬品庁（ＥＭＡ）で承認されて以来、組み換えヒトイズロン酸−２−スルファターゼ（イデュルスルファーゼ、 エラプレース（登録商標）、シャイアー製薬）が、ＭＰＳＩＩの患者の治療のために示されてきた。上記治療は、０．５ｍｇ／ｋｇの投与量を週毎に静脈注射によって、平均注射時間１〜３時間で投与するものである（Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010;33(4):589-604を参照）。エラプレース（登録商標）は、基本的に認知機能の衰えがなく疾患が中程度進行したハンター症候群の患者９６名に対して、無作為に、二重盲検法で、偽薬でコントロールした調査を行ったのちに承認された（Muenzer et al., Genet Med. 2006;8(8):465-73, Muenzer et al., Genet Med. 2011;13(2):95-101を参照）。一年間の治療後、エラプレース（登録商標）で処置された患者は、偽薬を与えられた患者に比べ、６分間に歩く距離（６分間歩行試験）で伸びを示した（Muenzer et al., Genet Med. 2011;13(2):95-101を参照）。エラプレース（登録商標）を用いたＥＲＴも、関節可動範囲（ＲＯＭ）を広げること、および、肝臓および脾臓の体積を減らすことが示された（Muenzer et al., Genet Med. 2011;13(2):95-101を参照）。さらに、イデュルスルファーゼに対する中和抗体がない場合は肺機能が改善する証拠がある。抗ＩＤＳ抗体の産生が、長期治療を受けた患者の５０％で報告された（Muenzer et al., Genet Med. 2011;13(2):95-101を参照）。

ＭＰＳＩＩの患者３１名に対するフェーズＩ／ＩＩの調査において、エラプレース（登録商標）の効果を、イデュルスルファーゼのベータアイソフォームに基づく第２の製品（提案された販売名はHunterase（登録商標））の効果と比較した（NCT01301898, http://clinicaltrials.gov）。どちらのタンパク質も、２４週のあいだ、エラプレース（登録商標）は０．５ｍｇ／ｋｇ／週の投与量を、Hunterase（登録商標）は０．５および１．０ｍｇ／ｋｇ／週の投与量を静脈内投与した。Hunterase（登録商標）による治療の結果、尿中のＧＡＧ排泄が減り、６分間歩行試験における成績が改善されたが、いずれの投与量でも肺機能、心臓機能、または関節可動性における治療効果を媒介することはできなかったことがわかった（Sohn et al., Orphanet J Rare Dis. 2013;8:42を参照）。Hunterase（登録商標）注射は全般的に安全で耐容性が良好であったが、蕁麻疹や皮膚発疹のような有害事象がいくつか報告された（Sohn et al., Orphanet J Rare Dis. 2013;8:42を参照）。中心的なＰＩＩＩ調査が最近終了した（http://clinicaltrials.gov, NCT01645189）が、結果はまた入手できない。

エラプレース（登録商標）に対する過敏性のため、製品の投与中は医療サポートを受けられるようにしなければならない。試験中、記述された最も重篤な有害事象はアナフィラキシー反応で、これらは、エラプレース（登録商標）の注射中、または製品投与後２４時間、いつでも見られ得た（Muenzer et al., Genet Med. 2006;8(8):465-73, Muenzer et al., Genet Med. 2011;13(2):95-101を参照）。これらのアナフィラキシー反応は、患者の命を危うくする可能性があり、呼吸困難、低酸素状態、低血圧、蕁麻疹、および／または喉または舌の血管浮腫を含み（http://elaprase.com/）、救急蘇生法または緊急気管切開術のような介入や、吸入ベータアドレナリン作用薬、エピネフリン、または静脈副腎皮質による治療が必要になりうる（Burton et al., Mol Genet Metab. 2011;103(2):113-20を参照）。ＥＲＴの他の短所として、１）小児患者（患者の多くが精神障害を持つ）に１〜３時間の静脈注射を行う困難さ（http://elaprase.com/）や、２）臨床研究においてエラプレース（登録商標）を用いて治療した患者の５０％が、臨床的意義がまだ知られていないイデュルスルファーゼに対して抗体陽性となったが、これは、肺機能試験によって示唆されるように、長期の製品効果を限定する可能性があるという事実（Muenzer et al., Mol Genet Metab. 2007;90(3):329-37, Muenzer et al., Genet Med. 2006;8(8):465-73, Muenzer et al., Genet Med. 2011;13(2):95-101を参照）や、３）在宅治療のコストを含む、治療コストが高いこと（Wyatt et al., Health Technol Asses. 2012，16(39):1-543を参照）が挙げられる。

エラプレース（登録商標）投与の安全性についての懸念またはコストとは関係なく、静脈内投与された組み換えＩＤＳが（少なくとも、現在推奨されている、週に０．５ｍｇ／ｋｇという投与量では）ＣＮＳに到達できないことは、ハンター症候群の患者に見られる重篤な神経変性の治療にＥＲＴを適用する可能性を制限すると思われる。１．２または１０ｍｇのエラプレース（登録商標）／ｋｇをそれぞれ２月齢または７月齢のＭＰＳＩＩマウスに毎週静脈内投与しても、ＩＤＳ脳活性の一部を救えただけだった（Polito et al., Hum Mol Genet. 2010;19(24):4871-85を参照）。さらに、これらの多量の投与量であっても、上記タンパク質の投与から７２時間後には、血液循環中のＩＤＳ活性は治療前のレベルに戻ってしまった（Polito et al., Hum Mol Genet. 2010;19(24):4871-85を参照）。実際、静脈注射によるＥＲＴは、ＭＰＳＩＩのマウスモデルの脳におけるＧＡＧの蓄積を直せなかった（Garcia et al., Mol Genet Metab. 2007;91(2):183-90を参照）。したがって、エラプレース（登録商標）の適応（indication）は、本疾患の非神経的徴候の治療に限られる。

ＥＲＴの静脈内送達に対する代替法は、外因性の酵素をＣＮＳに直接供与することである。２０μｇの組み換えヒトＩＤＳを５月齢のＭＰＳＩＩマウスの側脳室に３週間毎に投与することで、大脳、小脳、および体性器官（例えば、肝臓、心臓、腎臓、精巣）におけるＩＤＳ活性が上昇した（Higuchi et al., Mol Genet Metab. 2012;107(1-2):122-8を参照）。ＩＤＳ活性を回復させることで、短期記憶および自発運動が回復し、小脳、肝臓、および精巣における細胞空胞形成およびリソソームの膨張が減った。しかし、治療効果は部分的なものであり、ＧＡＧ含有量は完全には正常にならず、いくつかの行動の変化は上記治療の効果もなく残ったままだった（Higuchi et al., Mol Genet Metab. 2012;107(1-2):122-8を参照）。イデュルスルファーゼを鞘内薬物送達デバイスによって脳脊髄液（ＣＳＦ）に投与してハンター症候群の患者におけるＣＮＳ異常を直接治療する際の安全性および投与量範囲についての最近の研究により、治療から６ヶ月で、ＣＳＦ ＧＡＧレベルが約８０〜９０％減少することが示された（Muenzer et al., Genet. Med. 2015; doi:10.1038/gim.2015.36 および www.clincialtrials.gov (NCT00920647)を参照）。しかし、上記治療が必要とする、永久鞘内送達デバイスの埋入は、実質的なリスクおよび欠点を伴っており、上記治療そのものが、患者１人当たり、または１年当たりで、非常に高い経済的コストを有している。

全身投与によってＣＮＳに到達する別の方法は、分子的トロイの木馬を用いることである。このアプローチの一例は、インシュリン受容体抗体イズロン酸−２−スルファターゼ融合タンパク質（ＨＩＲＭＡｂ‐ＩＤＳ）であり、これは受容体媒介輸送によって血液脳関門（ＢＢＢ）を越えることができる。ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳをオスのアカゲザルの子供に２６週間、週毎に３、１０、および３０ｍｇ／ｋｇ静脈内投与したところ、ＨＩＲＭＡｂ−ＩＤＳの全注射投与量の１％が脳に取り込まれた（Boado et al., Biotechnol Bioeng. 2014;111(11):2317-25を参照）。この研究は、上記融合タンパク質の安全性も実証した。注射に伴う反応または免疫反応はまったく見られなかったからである。

骨髄由来幹細胞を用いる造血幹細胞移植（ＨＳＣＴ）（骨髄移植、ＢＭＴ）は、他のＭＰＳの患者における、体性異常および神経異常の両方の治療において、効果的であることが証明されている（Peters et al., Blood 1996;87(11):4894-902；Peters and Steward, Bone Marrow Transplant 2003;31(4):229-39およびYamada et al., Bone Marrow Transplant 1998;21(6):629-34を参照）。ＨＳＣＴによる矯正の基礎をなす原理は、ドナーの単球は、毛細血管壁、さらには血管脳関門までも通過することができ、その後、組織マクロファージ（ＣＮＳの場合はミクログリア細胞）へと分化し、欠如している酵素を分泌してさまざまな細胞に送達できるということである（Krivit et al., Cell Transplant. 1995;4(4):385-92を参照）。ＭＰＳＩＩマウスで行われたＢＭＴはさまざまな体性組織（肝臓、脾臓、肺を含む）におけるＧＡＧの蓄積を減少させたが、ＣＮＳにおいてはＧＡＧの蓄積を減少させなかった（Akiyama et al., Mol Genet Metab. 2014;111(2):139-46を参照）。ＢＭＴをＥＲＴ（０．５ｍｇのイデュルスルファーゼ／ｋｇ／週）と組み合わせると、ＭＰＳＩＩマウスの治療後７ヶ月で、心臓、腎臓、および肺におけるＧＡＧレベルに対して追加の効果が観察されたが、ＣＮＳにおけるＧＡＧの蓄積は異常なレベルのままだった（Akiyama et al., Mol Genet Metab. 2014;111(2):139-46を参照）。しかし、ＭＰＳＩＩ患者においては、臨床効果の証拠はあまり強力ではない。１９８２年から１９９１年までのあいだにＢＭＴを受けたハンター症候群の患者１０名の追跡調査を行ったところ、成功の度合いは非常にさまざまだった（Vellodi et al., J Inherit Metab Dis. 1999;22(5):638-48を参照）。それらの患者のうち４名は、ＢＭＴ後１００日に達する前に死亡し、さらに３名が当該方法後７年に達する前に死亡した。ＢＭＴ後７年を超えて生存した３名の患者のうち、１名は臨床的便益がなかった。２人目は血漿中のＩＤＳ活性が最小限の上昇を示した。３人目は、血漿中のＩＤＳ活性がわずかに上昇したものの、ＧＡＧ含有量が正常にならなかった（Vellodi et al., J Inherit Metab Dis. 1999;22(5):638-48を参照）。脳の磁気共鳴映像法（ＭＲＩ）により、穏やかなＭＰＳＩＩ表現型の患者における、ＢＭＴから２年半後の嚢胞性病変の数がわずかに減少していることが示された（Seto et al., Ann Neurol. 2001;50(1):79-92を参照）。しかし、同じ研究が示したデータによると、穏やかな表現型を有する別の患者は、ＭＲＩで検査してもまったく改善を見せなかった（Seto et al., Ann Neurol. 2001;50(1):79-92を参照）。ハンター症候群の患者のあいだで、臨床的結果は非常に多様であるように見える。これはおそらく、遺伝子型、ＨＳＣＴを受けた時点での年齢、ＨＳＣＴを受けた時点での患者の臨床状態（例えば、神経損傷の程度）、ドナーの状態、ドナーのキメラ現象、幹細胞源、および酵素活性のようなさまざまな要因がすべて、長期の結果に影響したためと思われる（Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010;33(4):589-604, Valayannopoulos et al., Rheumatology. 2011;5:v49-59を参照）。

うまくいった場合、ＨＳＣＴは身体レベルである程度の臨床的便益に貢献でき、行動上の問題を減らすことができ、睡眠パターンを改善することができるが、当該治療が認識機能障害を大きく改善できるかどうかはまだ解明されていない（Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010;33(4):589-604, Valayannopoulos et al., Rheumatology. 2011;5:v49-59を参照）。一般には、このアプローチは、死亡率が高く、死亡数が多く、神経認知上の便益が変動するため、ハンター症候群の患者には勧められない（Giugliani et al., Genet Mol Biol. 2010;33(4):589-604を参照）。

ＨＳＣＴの失敗に対する理にかなった説明は、移植細胞における限定されたＩＤＳ発現が、ＣＮＳにおける不十分なＩＤＳクロスコレクションにつながるというものである。ヒトＩＤＳ遺伝子をコードするレンチウィルスベクターを用いて骨髄細胞を形質導入してから、当該骨髄細胞をＭＰＳＩＩマウスに移植した。処置されたＭＰＳＩＩマウスは、移植後１４週目のＴ迷路記憶試験において成績が向上した（Podetz-Pedersen et al., Mol Ther. 2013;21:s1-s285を参照）。

ＭＰＳＩＩに対する現在の治療の選択肢が限られていることを考えると、代替的なアプローチが必要である。ｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療は、ＭＰＳＩＩおよび他の遺伝性疾患を一回で治療する可能性を提供し、生涯にわたる有益な効果をもたらす見通しがある。さまざまな投与ルートと組み合わせたさまざまなウイルスベクターの使用に基づくいくつかの遺伝子治療アプローチが、ＭＰＳＩＩ疾患の動物モデルにおいてテストされてきた。

特に、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターを媒介とする遺伝子の導入が、多くのｉｎ ｖｉｖｏ遺伝子治療の応用のための最適なアプローチとして、急速に浮上している。これは、上記ベクターの、形質導入の効率の高さ、および病原性がないことが理由である。ＡＡＶベクターは、分裂終了細胞を形質導入することができる。いくつかの臨床前試験および臨床試験により、種々の疾患のための治療用導入遺伝子の持続的な発現を効果的に促進するための、ＡＡＶベクターを媒介とする遺伝子の導入の可能性が実証された（Bainbridge et al., N Engl J Med. 2008;358(21):2231-9；Hauswirth et al., Hum Gene Ther. 2008;19(10):979-90；Maguire et al., N Engl J Med. 2008;358(21):2240-8；Niemeyer et al., Blood 2009;113(4):797-806；Rivera et al., Blood 2005;105(4):1424-30；Nathawani et al., N Engl J Med. 2011;365(25):2357-65およびBuchlis et al., Blood 2012;119(13):3038-41を参照）。

ＡＡＶ５−ＣＭＶ−ヒトＩＤＳベクターをＭＰＳＩＩマウスの子（ｐ２）の側頭静脈に全身投与することで、心臓、腎臓、肝臓、肺、筋肉、および脾臓のＩＤＳ活性が上昇し、また、脳のＩＤＳ活性が穏やかに上昇した。これにより、一回のベクター投与後１８ヶ月までに体性組織および尿のＧＡＧ含有量が減少した（Polito et al., Am J Hum Genet. 2009;85(2):296-301を参照）。また、この治療は、神経変性を防ぎ、アストログリオーシスと炎症を直すことにより、ＣＮＳ異常の進行を防いだ。ＡＡＶ注射後１８ヶ月目にオープンフィールド試験でマウスを評価したところ、ＭＰＳＩＩマウスの総運動表現型における治療による改善が実証された（Polito et al., Am J Hum Genet. 2009;85(2):296-301を参照）。

また、肝臓特異型ＴＢＧプロモーターの制御下でヒトＩＤＳ遺伝子をコードする血清型８のＡＡＶを用いてＭＰＳＩＩを治療した。２月齢のＭＰＳＩＩマウスに対してベクターを静脈内投与してから７ヶ月に至るまで、血清、肝臓、脾臓、肺、心臓、腎臓、および筋肉におけるＩＤＳ活性の上昇が観察され、これらの体性組織におけるＧＡＧ蓄積が完全に直された（Cardone et al., Hum Mol Genet. 2006;15(7):1225-36を参照）。しかし、上記ベクターが静脈内投与された場合、ＩＤＳ活性をわずかに上昇させ、脳内のＧＡＧ蓄積を部分的に除くのにも、極めて多い投与量（４×１０^１２ウイルスゲノム／匹）が必要であった（Cardone et al., Hum Mol Genet. 2006;15(7):1225-36を参照）。同様に、ヒトＩＤＳ遺伝子が遍在する伸長因子１−ａ（ＥＦ）プロモーターの制御下にあるＡＡＶ８ベクターを、成体のＭＰＳＩＩマウスに静脈内投与したところ、投与後２４週まで肝臓、心臓、脾臓、および腎臓のＩＤＳ活性が上昇し、これらの器官でのＧＡＧ蓄積が完全に直されることが実証された（Jung et al., Mol Cells. 2010;30(1):13-8を参照）。脳内のＩＤＳ活性は、短期（注射後６週間）で殺処分した動物の群でのみ上昇した。しかし、これはＣＮＳのＧＡＧ含有量を正常にするには不十分であった（Jung et al., Mol Cells. 2010;30(1):13-8を参照）。

上記したアプローチのいずれも、イズロン酸−２−スルファターゼ活性を完全に回復させたり、ＣＮＳおよび体性組織中の細胞質内封入体を完全になくしたり、ＭＰＳＩＩのすべての臨床的徴候を直すことはできなかった。このため、効果および安全性プロファイルが向上したＭＰＳＩＩの新規な治療アプローチが求められている。

本発明は、ムコ多糖症、特にムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）またはハンター症候群の治療用の新規なヌクレオチド配列を提供する。

第１の態様では、本発明は、配列番号１に記載されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列であって、配列番号２と７５％から９０％の同一性を有する、単離されたヌクレオチド配列に関する。特に、本発明の上記第１の態様に係る上記単離されたヌクレオチド配列は、配列番号５および配列番号８から選択される。

第２の態様では、本発明は、配列番号１に記載されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むプラスミドに関する。特に、配列番号２と少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは配列番号２と７５％から９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むプラスミドに関する。

第３の態様では、本発明は、ムコ多糖症ＩＩ型の治療用の新規な組み換えベクターを提供する。上記組み換えベクターは、特に、配列番号１に記載されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルスベクター（ＡＡＶ）である。特に、配列番号２と少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列 、好ましくは配列番号２と７５％から９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むアデノ随伴ウイルスベクターである。好ましい実施形態では、上記アデノ随伴ウイルスベクターは、血清型９のもの（ＡＡＶ９）である。本発明のＡＡＶ９ベクターは、さらに、ＩＤＳの発現を制御するために、コードするヌクレオチド配列に連結しているプロモーターを含んでよい。適切なプロモーターは、ＣＡＧプロモーター（配列番号１４）である。

本発明の別の態様は、本明細書に記載した、前記ヌクレオチド配列または前記プラスミドまたは前記組み換えベクターを治療上効果的な量含む、薬学的組成物に関する。

また、本発明の別の態様は、薬剤として用いられる、特にムコ多糖症ＩＩ型の治療用である、本発明の上記ヌクレオチド配列または本明細書に記載したプラスミドまたは本明細書に記載した組み換えベクターに関する。

本発明はまた、本発明に係る上記プラスミドの製造方法、および、本発明に係る上記組み換えベクターの製造方法に関する。

別の態様では、本発明は、ＩＤＳをコードする上記ヌクレオチド配列を含む単離された細胞に関する。特に、配列番号２と少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列、好ましくは、配列番号２と７５％から９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む、単離された細胞に関する。

ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳおよびＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳの産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳおよびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｈＩＤＳコード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。 ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１およびＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１の産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１およびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１コード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。 ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２およびＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２の産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２およびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２コード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。 ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳおよびＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳの産生。（Ａ）プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳおよびその諸要素の模式図。（Ｂ）ｏｍＩＤＳコード配列を含むアデノ随伴ベクターのゲノムの模式図。 ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、およびｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２の健康なマウスへの流体力学的送達。棒グラフは、ヒトＩＤＳをコードするプラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、およびｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ‐ｖｅｒｓｉｏｎ２を３０μｇ投与してから４８時間後に測定された、（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）活性を表わす。生理食塩水を注射したＷＴマウスのＩＤＳ活性を１００％とした。値は、一群当たり５匹のマウスの平均±標準誤差である。^＊Ｐ＜０．０５。 ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、およびｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２のＭＰＳＩＩマウスへの流体力学的送達。（Ａ、Ｂ）棒グラフは、ヒトＩＤＳをコードするプラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、およびｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２を投与してから１週間後に測定された、（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）活性を表わす。野生型マウスおよび生理食塩水が注射されたＭＰＳＩＩマウスをコントロールとして用いた。ＷＴマウスのＩＤＳ活性を１００％とした。（Ｃ）上記のさまざまなヒトＩＤＳをコードするプラスミドを投与してから１週間後の、肝臓、脾臓、心臓、膀胱、および精巣におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量の定量。値は、一群当たり５匹のマウスの平均±標準誤差である。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、およびＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２のＭＰＳＩＩマウスへの静脈内送達。ＭＰＳＩＩマウスに、野生型ヒトＩＤＳをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ）または最適化ヒトＩＤＳの２つの異なるバージョンをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１およびＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２）を１×１０^１０ｖｇ、静脈注射した。野生型マウスおよび未処置のＭＰＳＩＩマウスをコントロールとして用いた。（Ａ、Ｂ）棒グラフは、（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）活性を表わす。ＷＴマウスのＩＤＳ活性を１００％とした。（Ｃ）上記のさまざまなヒトＩＤＳをコードするベクターを投与した動物の肝臓におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量の定量。値は、一群当たり５匹のマウスの平均±標準誤差である。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１。 ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、およびＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２のＭＰＳＩＩマウスへのＣＳＦ内送達。２月齢のＭＰＳＩＩマウスに、野生型ヒトＩＤＳをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ）または最適化ヒトＩＤＳの２つの異なるバージョンをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１およびＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２）を５×１０^１０ｖｇ、大槽内に注射した。野生型マウス（ＷＴ）、未処置のＭＰＳＩＩマウス（ＭＰＳＩＩ）、および非コード（Ｎｕｌｌ）ＡＡＶ９ベクターを投与したＭＰＳＩＩマウス（ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌ）をコントロールとして用いた。（Ａ）脳のさまざまな部位（セクションＩ〜Ｖ。セクションＩが脳の中で最も吻側の部位を、セクションＶが最も尾側の部位を表わす）における、ベクター送達から１．５ヶ月後に分析したイズロン酸−２−スルファターゼ活性。ＷＴマウスのＩＤＳ活性を１００％とした。（Ｂ）（Ａ）と脳の同じ領域におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量の定量。結果を、一群当たり５匹のマウスの平均±標準誤差として示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、およびＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２のＭＰＳＩＩマウスへのＣＳＦ内送達。２月齢のＭＰＳＩＩマウスに、野生型ヒトＩＤＳをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ）または最適化ヒトＩＤＳの２つの異なるバージョンをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１およびＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２）を５×１０^１０ｖｇ、大槽内に注射した。野生型マウス（ＷＴ）、未処置のＭＰＳＩＩマウス（ＭＰＳＩＩ）、および非コード（Ｎｕｌｌ）ＡＡＶ９ベクターを注入されたＭＰＳＩＩマウス（ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌ）をコントロールとして用いた。（Ａ、Ｂ）処置から１．５ヶ月後に測定した、（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるイズロン酸−２−スルファターゼ活性（ＷＴ活性に対する割合として表わす）。（Ｃ）体性器官におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）含有量の定量。結果を、一群当たり５匹のマウスの平均±標準誤差として示す。^＊Ｐ＜０．０５、^＊＊Ｐ＜０．０１、^＊＊＊Ｐ＜０．００１、^＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１。 最適化マウスイズロン酸−２−スルファターゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ）のＣＳＦ内送達。（Ａ）野生型（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩマウス、および、ＣＳＦ内に大槽内（ＩＣ）注射によってコードしていないコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）またはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳを５×１０^１０ｖｇ投与したＭＰＳＩＩマウスの、脳のさまざまな部位（セクションＩ〜Ｖ）におけるイズロン酸−２−スルファターゼ活性。ＷＴのＩＤＳ活性を１００％とした。ベクター送達の４ヶ月後に分析を行った。（Ｂ）（Ａ）と同じ脳の領域におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量。結果を、一群当たり４〜５匹のマウスの平均±標準誤差として示す。^＊＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．００１、^＊＊＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０００１。 最適化マウスイズロン酸−２−スルファターゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ）のＣＳＦ内送達。（Ａ）野生型（健康な）マウス、および、大槽内にコードしていないコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）を５×１０^１０ｖｇまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳを５×１０^１０ｖｇ投与したＭＰＳＩＩマウスにおいて、リソソームのマーカーであるＬＡＭＰ−２を染色したあと、脳のさまざまな部位において得られた信号強度の定量。ベクター送達の４ヶ月後に分析を行った。（Ｂ）脳抽出物における他のリソソーム酵素の活性。ＩＤＵＡ（イズロニダーゼ、アルファ−Ｌ−）、ＳＧＳＨ（Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ）、ＮＡＧＬＵ（Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ）、ＨＧＳＮＡＴ（ヘパラン−アルファ−グルコサミニド Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）、ＧＡＬＮＳ（ガラクトサミン（Ｎ−アセチル）−６−スルファターゼ）、ＧＵＳＢ（グルクロニダーゼ、ベータ）、ＨＥＸＢ（ヘキソサミニダーゼＢ）。値は、一群当たり４〜５匹のマウスの平均±標準誤差である。^＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０１、^＊＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．００１、^＊＊＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０００１。 最適化マウスイズロン酸−２−スルファターゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ）のＣＳＦ内送達。脳の複数のセクションでリソソームのマーカーであるＬＡＭＰ２を染色したあと、さまざまな部位において得られた信号強度の定量。分析は、野生型（ＷＴ）マウスおよびＭＰＳＩＩ同腹子において、当該ＭＰＳＩＩ同腹子がコードしていないコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）を５×１０^１０ｖｇまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳを５×１０^１０ｖｇ、ＣＳＦ内投与してから８ヶ月後に行った。結果を、一群当たり２〜６匹のマウスの平均±標準誤差として示す。^＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０５、^＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０１。 最適化マウスイズロン酸−２−スルファターゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ）のＣＳＦ内送達。（Ａ、Ｂ）棒グラフは、野生型（健康な）マウス、および、大槽内にコードしていないコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）を５×１０^１０ｖｇまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳを５×１０^１０ｖｇ投与してから４ヶ月後のＭＰＳＩＩマウスの、前頭皮質、頭頂皮質、後頭皮質、上丘、および視床の各部における星状細胞マーカーＧＦＡＰ（Ａ）およびミクログリア細胞マーカーＢＳＩ−Ｂ４（Ｂ）を免疫染色したあとに測定した信号強度を表わす。結果を、一群当たり５匹のマウスの平均±標準誤差として示す。^＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０１、^＊＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．００１、^＊＊＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０００１。 最適化マウスイズロン酸−２−スルファターゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ）のＣＳＦ内送達。（Ａ、Ｂ）棒グラフは、健康な野生型（ＷＴ）マウス、および、コードしていないコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）を５×１０^１０ｖｇまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳを５×１０^１０ｖｇ、ＣＳＦ内投与されたＭＰＳＩＩ同腹子の、脳髄の各部における星状細胞マーカーＧＦＡＰ（Ａ）およびミクログリア細胞マーカーＢＳＩ−Ｂ４（Ｂ）を免疫染色したあとに測定した信号強度を表わす。分析は、ベクター送達から８ヶ月後に行った。結果を、一群当たり２〜６匹のマウスの平均±標準誤差として示す。^＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０５、^＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０１、^＊＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．００１、^＊＊＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０００１。 最適化マウスイズロン酸−２−スルファターゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ）のＣＳＦ内送達。（Ａ、Ｂ）野生型（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩマウス、および、コードしていないコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）を５×１０^１０ｖｇまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳベクターを５×１０^１０ｖｇ、月齢２ヶ月でＣＳＦ内投与され４ヶ月後に分析されたＭＰＳＩＩマウスの、（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるイズロン酸−２−スルファターゼ活性（ＷＴ活性に対する割合として表わす）。（Ｃ）体性器官におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量。結果を、一群当たり４〜５匹のマウスの平均±標準誤差として示す。^＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０１、^＊＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．００１、^＊＊＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０００１。 最適化マウスイズロン酸−２−スルファターゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ）のＣＳＦ内送達。（Ａ、Ｂ）健康な野生型マウス（ＷＴ）、未処置のＭＰＳＩＩマウス（ＭＰＳＩＩ）、および、コードしていないコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）を５×１０^１０ｖｇまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳベクターを５×１０^１０ｖｇ、月齢２ヶ月でＣＳＦ内投与され４ヶ月後に分析されたＭＰＳＩＩマウスの、（Ａ）肺および（Ｂ）心臓におけるイズロン酸−２−スルファターゼ活性（ＷＴ活性に対する割合として表わす）。（Ｃ）ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳをＣＳＦ内投与されたＭＰＳＩＩマウスの肝臓、肺、および心臓におけるベクターゲノムコピー数／二倍体ゲノム（ｖｇ／ｄｇ）の定量。未処置のＭＰＳＩＩマウスから得られた組織をコントロールとして用いた。結果を、（ＡおよびＢ）において、一群当たり４〜５匹のマウスの平均±標準誤差として示す。^＊ＭＰＳＩＩ−ＮｕｌｌのＰ＜０．０５、^＊＊ＭＰＳＩＩ−ＮｕｌｌのＰ＜０．０１、^＊＊＊ＭＰＳＩＩ−ＮｕｌｌのＰ＜０．００１。 最適化マウスイズロン酸−２−スルファターゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ）のＣＳＦ内送達。（Ａ）野生型（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩマウス、および、コントロールのベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）を５×１０^１０ｖｇまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳベクターを５×１０^１０ｖｇ、月齢２ヶ月でＣＳＦ内投与され４ヶ月後に分析されたＭＰＳＩＩマウスの、全体重に対する肝臓の湿重量。（Ｂ）（Ａ）と同じ動物の群から得られた肝臓抽出物中の、他のリソソーム酵素の活性。（Ｃ）（Ａ）と同じ動物の群の血清中の、β‐ヘキソサミニダーゼ（β‐ＨＥＸＯ）活性（ＷＴ活性に対する割合として表わす）。ＩＤＵＡ（イズロニダーゼ、アルファ‐Ｌ‐）、ＳＧＳＨ（Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ）、ＮＡＧＬＵ（Ｎ‐アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ）、ＨＧＳＮＡＴ（ヘパラン‐アルファ‐グルコサミニド Ｎ‐アセチルトランスフェラーゼ）、ＧＡＬＮＳ（ガラクトサミン（Ｎ‐アセチル）−６−スルファターゼ）、ＧＵＳＢ（グルクロニダーゼ、ベータ）、ＨＥＸＢ（ヘキソサミニダーゼＢ）。ＷＴの酵素活性を１００％とした。値は、一群当たり４〜５匹のマウスの平均±標準誤差である。^＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０５、^＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０１、^＊＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．００１、^＊＊＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０００１。 最適化マウスイズロン酸−２−スルファターゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ）のＣＳＦ内送達。実験未使用の野生型（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩマウス、および、コントロールのベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）を５×１０^１０ｖｇまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳベクターを５×１０^１０ｖｇ、月齢２ヶ月でＣＳＦ内投与され４ヶ月後に分析されたＭＰＳＩＩマウスの運動および探索行動の、オープンフィールド試験による評価。（Ａ）中央部滞在時間、（Ｂ）周辺部滞在時間、（Ｃ）中央部侵入回数、（Ｄ）中央部侵入までに要した時間、（Ｅ）総運動量、（Ｆ）区分線横断回数。値は、一群当たり１７〜２２匹のマウスの平均±標準誤差である。^＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０５、^＊＊ＭＰＳＩＩ−Ｎｕｌｌに対してＰ＜０．０１。 最適化マウスイズロン酸−２−スルファターゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ）のＣＳＦ内送達。健康な野生型マウス（ＷＴ）、未処置のＭＰＳＩＩマウス（ＭＰＳＩＩ）、および、コードしていないコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）を５×１０^１０ｖｇまたはＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳベクターを５×１０^１０ｖｇ、ＣＳＦ内投与されたＭＰＳＩＩマウスの生存の、カプラン・マイヤー分析。ＷＴマウスではＮ＝２４、未処置のＭＰＳＩＩマウスではＮ＝２２、Ｎｕｌｌ注射されたＭＰＳＩＩマウスではＮ＝２７、治療ベクターを注射されたマウスではＮ＝９１。 最適化マウスイズロン酸−２−スルファターゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ）の、さまざまな投与量（１．５８×１０^９、５×１０^９、１．５８×１０^１０、および５×１０^１０ｖｇ／匹）でのＣＳＦ内送達。（Ａ）野生型（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩマウス、および、さまざまな投与量のＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳを、２月齢で大槽内（ＩＣ）注射によってＣＳＦ内投与され１．５ヶ月後に分析されたＭＰＳＩＩマウスの、脳のさまざまな部位（セクションＩ〜Ｖ）におけるイズロン酸−２−スルファターゼ活性。ＷＴのＩＤＳ活性を１００％とした。（Ｂ）（Ａ）と同じ脳の部位におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量。結果を、一群当たり５匹のマウスの平均±標準誤差として示す。^＊未処置のＭＰＳＩＩに対してＰ＜０．０５、^＊＊未処置のＭＰＳＩＩに対してＰ＜０．０１、^＊＊＊未処置のＭＰＳＩＩに対してＰ＜０．００１、^＊＊＊＊未処置のＭＰＳＩＩに対してＰ＜０．０００１。 最適化マウスイズロン酸−２−スルファターゼをコードするＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ）の、さまざまな投与量（１．５８×１０^９、５×１０^９、１．５８×１０^１０、および５×１０^１０ｖｇ／匹）でのＣＳＦ内送達。（Ａ、Ｂ）野生型（健康な）マウス、未処置のＭＰＳＩＩマウス、および、さまざまな投与量のＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳベクターを、２月齢でＣＳＦ内投与され１．５ヶ月後に分析されたＭＰＳＩＩマウスの、（Ａ）肝臓および（Ｂ）血清におけるイズロン酸−２−スルファターゼ活性（ＷＴ活性に対する割合として表わす）。ＷＴのＩＤＳ活性を１００％とした。（Ｃ）体性器官におけるグリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量。結果を、一群当たり５匹のマウスの平均±標準誤差として示す。^＊未処置のＭＰＳＩＩに対してＰ＜０．０５、^＊＊未処置のＭＰＳＩＩに対してＰ＜０．０１、^＊＊＊未処置のＭＰＳＩＩに対してＰ＜０．００１、^＊＊＊＊未処置のＭＰＳＩＩに対してＰ＜０．０００１。

〔微生物の寄託〕
プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ（配列番号３）、ｐＡＡＶ‐ＣＡＧ‐ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１（配列番号６）、およびｐＡＡＶ‐ＣＡＧ‐ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２（配列番号９）は、２０１４年１２月１８日、それぞれアクセス番号ＤＳＭ２９８６６、ＤＳＭ２９８６７、およびＤＳＭ２９８６８として、ＤＳＭＺ（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Inhoffenstrasse 7 B, D-38124 Braunschweig, ドイツ連邦共和国）に寄託された。

〔定義〕
用語「ヌクレオチド配列」または「単離されたヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡのいずれかの核酸分子（それぞれ、デオキシリボ核酸またはリボ核酸を含んでいる）を指す。上記核酸は、二本鎖配列であっても、一本鎖配列であっても、または二本もしくは一本鎖配列の両方の一部分が含まれていてもよい。

用語「％の配列同一性」または「％の同一性」は、候補配列が最大の「％の配列同一性」を達成するように調整した後において、参照配列におけるヌクレオチドと同一である上記候補配列のヌクレオチドの割合を指す。上記「％の配列同一性」は、本技術分野において定着している任意の方法またはアルゴリズム（ＡＬＩＧＮ、ＢＬＡＳＴおよびＢＬＡＳＴ２．０アルゴリズムなど）によって決定することができる（Altschul S, et al., Nuc Acids Res. 1977;25:3389-3402およびAltschul S, et al., J Mol Biol. 1990;215:403-410を参照）。

本明細書において、上記「％の配列同一性」または「％の同一性」は、上記参照配列および上記候補配列の調整後に同一であるヌクレオチド数を、上記参照配列の全ヌクレオチド数で除し、その結果を１００倍することにより計算される。

用語「コードする(codify)」または「コードしている(coding)」は、どのようにヌクレオチド配列がポリペプチドまたはタンパク質に翻訳されるかを決定する遺伝子コードを指す。配列中のヌクレオチドの順序は、ポリペプチドまたはタンパク質におけるアミノ酸の順序を決定する。

用語「タンパク質」は、１本以上のアミノ酸鎖またはポリペプチドから構成される高分子を指す。タンパク質は、システイン残基の３−オキソアラニンへの変換、糖鎖形成、または金属の結合のような翻訳後の修飾を受けうる。タンパク質の糖鎖形成とは、種々の炭化水素（アミノ酸鎖に共有結合されている）の付加である。

用語「効果的な量」は、意図された目的を達成するために充分な物質の量を指す。例えば、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）活性を上昇させるために効果的な量のＡＡＶ９ベクターは、グリコサミノグリカンの蓄積を減少させるために充分な量である。疾患または障害を治療するために「治療上効果的な量」の発現ベクターは、上記疾患または障害の徴候および症状を減少または根絶させるために充分な量の、上記発現ベクターである。所与の物質の効果的な量は、上記物質の性質、投与経路、上記物質を与えられる動物の大きさおよび生物種、ならびに上記物質を与える目的などの要因によって異なる。それぞれの個体の症例における効果的な量は、当業者によって、当技術分野において確立された方法に従って、経験的に決定されてよい。

用語「個体」は、哺乳類を指し、好ましくはヒトまたは非ヒト哺乳類を指し、より好ましくはマウス、ラット、その他の齧歯類、ウサギ、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、ウマまたは霊長類を指し、さらに好ましくはヒトを指す。

用語「作動可能に連結されている(operably linked)」は、所定の遺伝子に対するプロモーター配列の機能上の関係および位置を指す（例えば、コード配列の転写に影響を及ぼすならば、プロモーターまたはエンハンサーは、当該コード配列に対して作動可能に連結されている）。一般的に、作動可能に連結されているプロモーターは、所定の配列に隣接している。しかし、エンハンサーは、所定の配列の発現を調節するために、当該所定の配列に隣接している必要はない。

用語「親和性」は、種々のウイルスが、特定の宿主となる生物種または当該生物種における特定の種類の細胞を、優先的に標的とするように進化した状態を指す。

用語「遺伝子治療」は、遺伝的疾患もしくは状態または後天的疾患もしくは状態を、治療または予防するための、細胞に対する所定の遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）の移入を指す。上記所定の遺伝物質は、ｉｎ ｖｉｖｏにおける生産が望まれている産物（例えば、ポリペプチドタンパク質、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）をコードしている。上記所定の遺伝物質は、例えば、酵素、ホルモン、受容体または治療上価値のあるポリペプチドをコードしうる。

用語「組み換えウイルスベクター」または「ウイルスベクター」は、自然に産するウイルスから、所定の遺伝物質（例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡ）を細胞に移入することができ、結果として当該遺伝物質によりコードされている産物（例えば、ポリペプチドタンパク質、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）を標的細胞において産生する遺伝子工学技術を経て、得られた作用物質を指す。

用語「組み換えプラスミド」または「プラスミド」は、小型で、環状で、二本鎖の、自己複製するＤＮＡ分子であって、所定の遺伝物質を細胞に移入することができ、結果として当該遺伝物質によりコードされている産物（例えば、ポリペプチドタンパク質、ペプチドまたは機能性ＲＮＡ）を標的細胞において産生する遺伝子工学技術を経て得られた、ＤＮＡ分子を指す。さらに、用語「組み換えプラスミド」または「プラスミド」はまた、小型で、環状で、二本鎖の、自己複製するＤＮＡ分子であって、組み換えベクターゲノムの担体としてのウイルスベクターを作製する際に使用される遺伝子工学技術を経て得られた、ＤＮＡ分子も指す。

発明の詳細な説明

本発明は、ムコ多糖症、特にムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）またはハンター症候群の治療用の新規なヌクレオチド配列を提供する。

本発明に係るヌクレオチド配列は、配列番号１に記載されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳと称する）タンパク質をコードする。これは、グリコサミノグリカンヘパラン硫酸およびデルマタン硫酸の段階的分解に関係する酵素である。用語「天然ＩＤＳ」または「野生型ＩＤＳ」は、本発明の文脈では、当業者に知られている方法を用いて宿主細胞から得られたまたは産生されたヌクレオチド配列、または各種のＩＤＳのコード配列（ＣＤＳ）を出発材料として用いて化学的に合成されたヌクレオチド配列を指す。好ましくは、「天然ＩＤＳ」または「野生型ＩＤＳ」は、マウスのＣＤＳから化学的に合成されたもの（ｍＩＤＳと称する）またはヒトのＣＤＳから化学的に合成されたもの（ｈＩＤＳと称する）である。より好ましくは、ヌクレオチド配列ｈＩＤＳは、ヒトのＣＤＳから化学的に合成され、配列番号２に対応する。

本発明によれば、改変ヌクレオチド配列（最適化ヌクレオチド配列とも称する）は、所定のタンパク質をより多くの量、産生する媒介をするものであり、これはおそらくｍＲＮＡの効率的な転写またはより安定したｍＲＮＡの転写またはコドンのより効率的な使用によるものだと思われることが、証拠から明らかになっている。本明細書では、これらの配列を「最適化配列」とも称し、マウスのＣＤＳおよびヒトのＣＤＳから得られた場合はそれぞれｏｍＩＤＳおよびｏｈＩＤＳと称する。有利には、本発明に係る最適化配列はコドン最適化配列である。

したがって、本発明の第１の態様は、配列番号１に記載されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質をコードする単離されたヌクレオチド配列であって、配列番号２と７５％から９０％の同一性を有する、単離されたヌクレオチド配列に関する。特に、本発明に係る上記単離されたヌクレオチド配列は、配列番号２と、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８２％、８５％、８７％、または９０％の同一性を有する。好ましい実施形態では、本発明の上記単離されたヌクレオチド配列は、配列番号５に記載のｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１および配列番号８に記載のｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２から選択される。

本発明によれば、上記の単離された配列は、骨格プラスミドのマルチクローニング部位（ＭＣＳ）に挿入されてよい。特に、上記骨格プラスミドは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）のＩＴＲを含むプラスミドである。本明細書ではこれをｐＡＡＶと称する。

本発明の第２の態様は、配列番号１に記載されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号２と少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含むプラスミドを提供する。有利には、本発明に係る上記プラスミドは、配列番号２と７５％から９０％の同一性を有する。特に、本発明に係る上記プラスミドは、配列番号２と、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８２％、８５％、８７％、または９０％の同一性を有する。好ましい実施形態では、本発明の上記プラスミドは、配列番号２に記載のｈＩＤＳ、配列番号５に記載のｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、および配列番号８に記載のｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２から選択されるヌクレオチド配列を含む。

上記の単離された配列に加えて、本発明に係る上記プラスミドは、従来の調節因子も含む。当該調節因子は、上記プラスミドにトランスフェクトされた細胞内で上記ヌクレオチド配列の転写、翻訳、および／または発現を可能にするようなかたちで、当該ヌクレオチド配列に作動可能に連結されてよい。特に、本発明に係る上記プラスミドは、所定のヌクレオチド配列に作動可能に連結されている調節因子としてプロモーターを含む。多数のプロモーター（野生型またはキメラ、構成性または誘発性、遍在性および／または組織特異的）が本技術分野において知られている。有利には、本発明の文脈で用いられる上記プロモーターは、ＣＡＧプロモーターである。これは、サイトメガロウイルス初期エンハンサー要素およびニワトリＢアクチンプロモーターを含む組み合わせを指す。上記ＣＡＧプロモーターはさらに、所定のヌクレオチド配列に由来するｍＲＮＡに安定性を与えるニワトリＢアクチンおよびウサギＢグロブリンイントロンを部分的に含む（Alexopoulou A, et al., BMC Cell Biology 2008; 9(2): 1-11を参照）。本発明のｐＡＡＶプラスミドに含まれるＣＡＧプロモーターは配列番号１４を有する。この特定のＣＡＧプロモーターは、脳および肝臓の全領域において欠損している酵素を長く発現させることができる。その結果、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のリソソームへの蓄積が直され、このようにして、ＭＰＳＩＩに特徴的な神経変異および身体変異が防がれる。

特に有利な実施形態では、本発明に係るプラスミドは、配列番号３に記載された、ｐＡＡＶ‐ＣＡＧ‐ｈＩＤＳプラスミド（アクセッション番号：ＤＳＭ２９８６６）である。

特に有利な別の実施形態では、本発明に係るプラスミドは、配列番号６に記載された、ｐＡＡＶ‐ＣＡＧ‐ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１（アクセッション番号：ＤＳＭ２９８６７）である。

特に有利な別の実施形態では、本発明に係るプラスミドは、配列番号９に記載された、ｐＡＡＶ‐ＣＡＧ‐ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２（アクセッション番号：ＤＳＭ２９８６８）である。

本発明の第３の態様は、ムコ多糖症ＩＩ型の治療用の新規な組み換えベクターに関する。本発明のベクターは、キャプシドタンパク質およびその中に含まれるベクターゲノムであり、所定の遺伝物質を細胞内に運ぶのに用いられることを理解されたい。上記所定の遺伝物質以外に、上記ベクターのゲノムは、さまざまな機能要素を含んでよい。当該さまざまな機能要素としては、転写用の調節因子（例えば、プロモーターまたはオペレーター）、領域同士またはエンハンサー同士を結び付ける転写因子、および翻訳を開始または終了させる調節因子が挙げられる。

本発明に係るベクターはアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）に由来し、所定のヌクレオチド配列を標的の細胞に運ぶのに用いられる。アデノ随伴ウイルスは、広範囲の組織で、分裂後細胞を効率的に形質導入できることが判明している。本発明の文脈では、上記ベクターを用いて、ヒトのイズロン酸−２−スルファターゼをコードする配列（配列番号２のｈＩＤＳ）またはヒトのイズロン酸−２−スルファターゼをコードする配列の最適化バージョン（配列番号５のｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１または配列番号８のｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２）を送達する。アデノ随伴ベクターは、パルボウイルス科のアデノ随伴ウイルスに由来するベクターである。アデノ随伴ウイルスゲノムは、一本鎖デオキシリボ核酸（ｓｓＤＮＡ）から構成されている。当該ウイルスは哺乳類に感染するが、非病原性である（すなわち、疾患を生じさせない）。当該ウイルスは分裂または非分裂細胞に感染し、その親和性は血清型によって変わる。血清型は、ウイルスグループを、そのキャプシド抗原によって分類したものである。アデノ随伴ウイルスの血清型（そのキャプシドタンパク質によって決まる）が、ウイルスの親和性を定め、特定の型の細胞への侵入を可能にする。本発明の文脈では、上記ＡＡＶは血清型１、血清型２、血清型５、血清型７、血清型８、血清型９、または血清型１０を有する。好ましくは、上記ＡＡＶは血清型９のもの（ＡＡＶ９）である。これは、ＡＡＶ９は、ＣＳＦへの一回の投与によって脳および周辺の器官へ遺伝物質を運ぶ能力が最も高いからである。本発明のＡＡＶ９ベクターは、ヒトのアデノ随伴ウイルスの血清型９のウイルスキャプシドおよび改変ゲノムから構成され、ヒトのアデノ随伴ウイルス血清型２の反転末端反復（ＩＴＲ）、ＣＡＧプロモーター、ヒトのイズロン酸−２−スルファターゼ（ｈＩＤＳ）またはその最適化バージョンのコード配列（本発明に係るヌクレオチド配列とも称する）、およびウサギベータグロブリン遺伝子に由来するポリＡを含む。

したがって、この態様では、本発明は、配列番号１に記載されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号２と少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む組み換えＡＡＶに関する。有利には、本発明に係る上記組み換えＡＡＶは、配列番号２と７５％から９０％の同一性を有する。特に、本発明に係る上記組み換えＡＡＶは、配列番号２と、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８２％、８５％、８７％、または９０％の同一性を有する本発明に係るヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、本発明の上記組み換えＡＡＶに含まれる単離されたヌクレオチド配列は、配列番号２に記載のｈＩＤＳ、配列番号５に記載のｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、および配列番号８に記載のｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２から選択される。

この態様の好ましい実施形態では、本発明は、配列番号１に記載されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号２と少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む組み換えＡＡＶ９に関する。好ましくは、本発明の上記組み換えＡＡＶ９は、配列番号２と７５％から９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特に、本発明の上記組み換えＡＡＶ９は、配列番号２と、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８２％、８５％、８７％、または９０％の同一性を有する本発明に係るヌクレオチド配列を含む。好ましい実施形態では、本発明の上記組み換えＡＡＶ９は、配列番号２に記載のｈＩＤＳ、配列番号５に記載のｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、および配列番号８に記載のｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２から選択されるヌクレオチド配列を含む。

驚くべきことに、同じものの中に、ＡＡＶ９キャプシドを、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）と、選択されたプロモーター、特にＣＡＧプロモーターとを随伴させることで、脳の全領域で欠損している酵素を長く発現させることができる。上記ものが大槽内注射によって脳脊髄液（ＣＳＦ）に送達される場合は特にそうである。その結果、グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）のリソソームへの蓄積が治療され、このようにして、ＭＰＳＩＩ疾患に特徴的な神経変異が防がれる。この効果は、ベクターを投与した地点（大槽）から離れている嗅球においてすら観察された。さらに、本発明に係る上記ＡＡＶ９ベクターは、ＣＳＦに送達されると、体循環に到達し、肝臓を形質導入できた。肝細胞が酵素を産生・分泌し、それにより、血清中のイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）活性が上昇して、最終的に、多くの体性組織でリソソーム異常が減少した。これは、本発明に係る上記ベクターが従来のアプローチに対して有する明確な長所を示すものである。従来のアプローチでは、本疾患の臨床徴候を部分的に治療するだけであり、通常は脳または体循環のどちらか一方で効果を発揮するが両方では効果を発揮しないからである。

したがって、本発明は、配列番号１に記載されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列に連結されたＣＡＧプロモーターを含むＡＡＶ９ベクターに関する。

特に、本発明の上記ＡＡＶ９ベクターは、配列番号１に記載されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号２と少なくとも７５％の同一性を有するヌクレオチド配列と連結されているＣＡＧプロモーターを含む。有利には、本発明の上記ＡＡＶ９ベクターは、配列番号１に記載されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号２と７５％から９０％の同一性を有するヌクレオチド配列に連結されているＣＡＧプロモーターを含む。特に、本発明に係る上記組み換えＡＡＶ９ベクターに含まれる上記ヌクレオチド配列は、配列番号２と、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８２％、８５％、８７％、または９０％の同一性を有する。

好ましい実施形態では、本発明の組み換えベクターは、配列番号１４のＣＡＧプロモーターに作動可能に連結されているヌクレオチド配列（配列番号２）を含むＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ（配列番号４）である。

別の好ましい実施形態では、本発明の組み換えベクターは、配列番号１４のＣＡＧプロモーターに作動可能に連結されているヌクレオチド配列（配列番号５）を含むＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１（配列番号７）である。

別の好ましい実施形態では、本発明の組み換えベクターは、配列番号１４のＣＡＧプロモーターに作動可能に連結されているヌクレオチド配列（配列番号８）を含むＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２（配列番号１０）である。

上記のように定められた本発明の組み換えベクターは、やはり上記された対応するプラスミドから、最新技術で知られている方法を用いて、ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクションによって得ることができる。

したがって、本発明はさらに、本発明に係るアデノ随伴ウイルスベクターＡＡＶ、特にＡＡＶ９を製造する方法を提供する。上記方法は、
ｉ）第１のプラスミドと、第２のベクターと、第３のベクターとを提供する工程であって、上記第１のプラスミドは、第１のＡＡＶ末端反復と第２のＡＡＶ末端反復のあいだに挟まれた、所定のタンパク質をコードする配列と、当該所定のタンパク質をコードする配列に作動可能に連結されているＣＡＧプロモーターとを含み、上記第２のベクターは、ＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子とＡＡＶ ｃａｐ遺伝子とを含み、上記第３のベクターは、アデノウイルスヘルパー機能遺伝子を含む、工程と、
ｉｉ）工程ｉ）の上記ベクターでコンピテント細胞を同時トランスフェクトする工程と、
ｉｉｉ）工程ｉｉ）の上記トランスフェクトされた細胞を、ウイルス粒子を産生するのに十分なだけの時間、培養する工程と、
ｉｖ）工程ｉｉｉ）の培養液からベクターを精製する工程と、を含む。

好ましい実施形態では、上記第１のベクターの上記ＡＡＶ第１末端反復と上記ＡＡＶ第２末端反復は、ＡＡＶ血清型２に由来するＩＴＲである。別の好ましい実施形態では、上記第２のベクターのＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子は、ＡＡＶ血清型２に由来する。別の好ましい実施形態では、上記コンピテント細胞はＨＥＫ２９３細胞である。別の好ましい実施形態では、上記第２のベクターのＡＡＶ ｃａｐ遺伝子はＡＡＶ血清型９に由来する。

本発明はまた、本発明に係るプラスミドを調製する方法であって、
ｉ）所定のタンパク質をコードする配列を、出発プラスミドから、消化によって、特にＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩを用いて、切り取る工程と、
ｉｉ）当該所定のタンパク質をコードする配列を、ＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ‐ＣＡＧの２つの制限部位のあいだにクローニングし、それによって、当該所定のタンパク質をコードする配列を含む対応するプラスミドを得る工程と、を含む、方法を提供する。

さらなる態様において、本発明は、上記の単離されたヌクレオチド配列、上記のプラスミド、または上記のＡＡＶベクター、とりわけ上記のＡＡＶ９ベクターを、治療上効果的な量含む薬学的組成物を意図している。

本発明の薬学的組成物は、上記の単離されたヌクレオチド配列、上記のプラスミド、または上記のＡＡＶベクターを、薬学的に許容できる担体において含む。上記組成物はまた、少なくとも一つの補助物質を含んでよい。当該補助物質は、担体、賦形剤、溶剤、希釈剤、またはアジュバントから選択できる。許容できる担体、希釈剤、またはアジュバントは毒性がなく、好ましくは、採用された投与量および濃度では不活性であり、緩衝剤（リン酸塩、クエン酸塩、または他の有機酸など）；酸化防止剤；低分子量ポリペプチド、タンパク質（血清アルブミン、ゼラチン、または免疫グロブリンなど）；親水性ポリマー；アミノ酸；単糖類、二糖類、および他の炭水化物（グルコース、マンノース、またはデキストリンを含む）；キレート剤；糖アルコール（マンニトールまたはソルビトールなど）；体イオンを形成する塩（ナトリウムなど）；および／または非イオン性界面活性剤（ポリエチレン‐ポリオキシプロピレンブロック共重合体（プルロニックＦ６８（登録商標））やポリエチレングリコール（ＰＥＧ））が挙げられる。

好ましい実施形態において、本発明に係る薬学的組成物は、非経口投与に適している。非経口投与の例としては、静脈内注射、皮下注射、大槽内注射および筋肉内注射がある。好ましくは、本発明に係る薬学的組成物は、静脈内投与または大槽内投与に適している。このような非経口投与に適している組成物は、無菌水性溶液または無菌水性分散液、無菌溶液または無菌分散液を即席で調製するための無菌粉末を包含している。有利には、本発明に係る薬学的組成物は、細菌および菌類の汚染作用から守られている。

ヒトおよび動物への投与量は、それぞれの生物種に根拠を持つ要因によって、または年齢、性別、体重、病気の度合などの他の要因によって変えてよい。

本発明のさらなる態様は、上記の単離されたヌクレオチド配列、上記のプラスミド、または上記のＡＡＶベクター、特にＡＡＶ９ベクターの治療上の使用に関する。上記したように、本発明に係る上記の単離されたヌクレオチド配列、上記のプラスミド、または上記のＡＡＶベクター、特にＡＡＶ９ベクターは、欠損しているＩＤＳ酵素の発現を媒介し、それによって、ＧＡＧのリソソームへの蓄積を治療する。これにより、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）のすべての臨床的徴候を治療することができる。この点で、本発明はまた、薬剤として使用される、上記の単離されたヌクレオチド配列、上記のプラスミド、または上記のＡＡＶベクター、特にＡＡＶ９ベクターにも関する。

特に、本発明は、身体内のイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）活性を上昇させるための、上記の単離されたヌクレオチド配列、上記のプラスミド、または上記のＡＡＶベクター、特にＡＡＶ９ベクターに関する。

さらに好ましい態様では、本発明は、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）の治療のための、上記の単離されたヌクレオチド配列、上記のプラスミド、または上記のＡＡＶベクター、特にＡＡＶ９ベクターに関する。

さらなる実施形態では、本発明は、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）の治療に用いられる薬剤の製造のための、上記の単離されたヌクレオチド配列、上記のプラスミド、または上記のＡＡＶベクター、特にＡＡＶ９ベクターに関する。

本発明の他の実施形態は、ムコ多糖症ＩＩ型（ＭＰＳＩＩ）の治療方法であって、上記の単離されたヌクレオチド配列、上記のプラスミド、または上記のＡＡＶベクター、特にＡＡＶ９ベクターを、それらを必要とする対象に投与する工程を含む方法に関する。

本発明はさらに、イズロン酸−２−スルファターゼ（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列を含む単離された細胞を提供する。特に、本発明に係る上記細胞は、配列番号１に記載されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質をコードするヌクレオチド配列であって、配列番号２と少なくとも７５％の同一性、有利には７５％から９０％の同一性を有するヌクレオチド配列を含む。特に、本発明に係る上記単離された細胞に含まれる上記ヌクレオチド配列は、配列番号２と、７５％、７６％、７７％、７８％、７９％、８０％、８２％、８５％、８７％、または９０％の同一性を有する。

好ましい実施形態では、本発明の上記細胞は、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列（配列番号２）を含む。

他の好ましい実施形態では、本発明の上記細胞は、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列（配列番号５）を含む。

他の好ましい実施形態では、本発明の上記細胞は、イズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）（配列番号１）をコードするヌクレオチド配列（配列番号８）を含む。

以下の実施例は、本発明の特定の実施形態の単なる例示であり、決して本発明を制限するように見做すことはできない。

〔一般的な手順〕
［１．組み換えＡＡＶベクター］
本明細書において説明されているＡＡＶベクターは、３重のトランスフェクションによって得た。上記ベクターを作製するために必要な材料は、ＨＥＫ２９３細胞（アデノウイルスＥ１遺伝子を発現している）、アデノウイルス機能を与えるヘルパープラスミド、血清型２のＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子および血清型９（ＡＡＶ９）のｃａｐ遺伝子を与えるプラスミド、そして最後に、ＡＡＶ２ ＩＴＲを有する骨格プラスミドおよび所定のコンストラクトである。

イズロン酸−２−スルファターゼを発現するＡＡＶベクターを産生するため、ヒトまたはマウスのイズロン酸−２−スルファターゼの最適化または非最適化コード配列を、ユビキタスハイブリッドＣＡＧプロモーターの制御下で、ＡＡＶ骨格プラスミド中にてクローニングした。EndoFree Plasmid Megaprep Kit（Qiagen）を用いて、プラスミドの大規模産生を行った。

３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターを産生した（Matsushita T, et al., Gene Ther. 1998;5:938-945およびWright J, et al., Mol. Ther. 2005;12:171-178を参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ）（Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、１）血清型２のＡＡＶのウイルスＩＴＲにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド（上述）；２）ＡＡＶ ｒｅｐ２遺伝子およびＡＡＶ ｃａｐ９遺伝子を有しているプラスミド；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述した最適化プロトコルを用いて、２回の連続する塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso E, et al., Gene Ther. 2010;17:503-510を参照）。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８で透析し、濾過し、ｑＰＣＲで滴定し、使用まで−８０℃にて保存した。

本発明のベクターは、本技術分野において周知である分子生物学技術によって作製された。

［２．動物］
イズロン酸−２−スルファターゼ欠損マウス（ＭＰＳＩＩ）モデルは、Taconic （Germantown, NY 12526 USA, Stock TF1838）から購入した。ＭＰＳＩＩ罹患マウスおよび健康なコントロールマウスは、ヘミ接合のオスおよびヘテロ接合のメスのファウンダーから近親交配により誕生した。テール・クリップサンプルをＰＣＲ分析し、目的の変異を含んでいる配列を増幅して、遺伝子型を決定した。それぞれのセンスプライマーおよびアンチセンスプライマーの配列は、以下の通りであった。フォワードプライマー：5’- TTT TGT GTA CTC CAA CCC CG -3’（配列番号１５）、リバースプライマー：5’- TGT CTC CAT AAC AGC CCA GG -3’ （配列番号１６）、変異型リバースプライマー：5’- GCC CTC ACA TTG CCA AAG GA -3’（配列番号１７）。標準食（Harlan, Tekland）で行動制限を設けずにマウスを飼育し、明暗周期を１２時間に保った（午前９時に点灯）。

［３．ＩＤＳをコードしているプラスミドの、マウスへの流体力学的送達］
ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳプラスミド、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１プラスミドおよびｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２プラスミドの流体力学的送達のために、３月齢のＭＰＳＩＩ動物および野生型動物の尾静脈に注射を行った。上記注射は、５秒未満の間に行われ、総投与量は、上記動物の体重の１０％に相当する体積中に３０μｇのプラスミドであった。この技法により、プラスミドにコードされている導入遺伝子を、主として肝臓において発現させる（Liu et al., Gene Ther. 1990;6(7):1258-66を参照）。コントロールとして、マウスの一群に同量の生理食塩水を注射した。マウスを２つの群に分け、プラスミドの流体力学的注射から４８時間後または１週間後に殺処分した。以下の項目で説明する通りに、臓器を摘出した。

［４．マウスへのベクター投与］
ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳベクターをマウスへＣＳＦ内送達するために、２月齢のＭＰＳＩＩ動物の大槽に、総投与量５×１０^１０ｖｇを注射した。５×１０^１０ｖｇのコードしていないコントロールベクター（ＡＡＶ９−Ｎｕｌｌ）を、同種の動物の一群に注射した。６月齢および１０月齢の時点（すなわちベクターの投与から４ヶ月後および８ヶ月後）で、マウスに麻酔を施し、組織を摘出した。

上記野生型ｈＩＤＳまたは上記ＩＤＳコード配列の上記２つの最適化バージョンのどちらかを含むＡＡＶ９ベクターをマウスへ静脈内送達するために、３．５月齢のＭＰＳＩＩ動物の尾静脈に、総投与量１×１０^１０ｖｇを注射した。ＷＴ動物および未処置のＭＰＳＩＩ動物をコントロールとした。ベクター投与から３週間後、マウスに麻酔を施し、組織を摘出した。

［５．サンプルの収集］
殺処分に際し、動物に深く麻酔を施し、その後、心臓を経由して１２ｍＬのＰＢＳを潅流させて、組織から血液を完全に除去した。全脳および複数の体性組織（肝臓、脾臓、膵臓、腎臓、肺、心臓、骨格筋、精巣、膀胱、腸、および脂肪組織を含む）を収集し、次の組織学的分析のために、液体窒素中で凍結させ−８０℃にて保存するか、ホルマリン中に浸漬した。

［６．イズロン酸−２−スルファターゼ活性およびグリコサミノグリカンの定量］
脳サンプル、肝臓サンプル、肺サンプル、および心臓サンプルを、Ｍｉｌｉ−Ｑ水中で超音波処理した。血清を、未処理で分析した。上述した通りに、４−メチルウンベリフェロン由来の蛍光源基質（Moscerdam Substrates, Oegstgeest, NL）によって、イズロン酸−２−スルファターゼ活性を決定した（Voznyi et al., J Inher Metab Diss 2001;24:675-680を参照）。タンパク質の全量に対して脳、肝臓、肺、および心臓の活性レベルを正規化し、Bradford protein assay（Bio-Rad, Hercules, CA, US）を用いて定量した。血清の活性を、体積に対して正規化した。

グリコサミノグリカン（ＧＡＧ）の定量のために、組織サンプルを計量し、プロテイナーゼＫで消化した。遠心分離および濾過により、抽出物を清澄化した。Blyscan sulfated glycosaminoglycan kit（Biocolor, Carrickfergus, County Antrim, GB）により、コンドロイチン−４−硫酸を標準として用いて、組織抽出物中のＧＡＧレベルを決定した。ＧＡＧのレベルを、組織の含水重量に対して、正規化した。

［７．他のリソソーム酵素の活性］
脳サンプルおよび肝臓サンプルを、５００μｌのＭｉｌｉ−Ｑ水中で超音波処理した。酵素活性は、上澄み中で、４−メチルウンベリフェロン由来の蛍光源基質を用いて決定した。血清を、未処理で分析した。４−メチルウンベリフェリル−α−Ｌ−イズロニド（Glycosynth）とともに、３７℃にて１時間インキュベートしたタンパク質１５μｇにおける、ＩＤＵＡ活性を測定した（Bacter et al., Blood 2002;99(5)1857-9を参照）。上述した通りに、ＳＧＳＨ活性を測定した（Karpova et al., J Inherit Metab Dis. 1996;19(3):278-285, Haurigot et al.の上記箇所を参照）。簡潔に述べると、３０μｇのタンパク質を、第１に、４−ＭＵ−αＧｌｃＮＳとともに１７時間、４７℃でインキュベートした。第２のインキュベーションは、０．２％ＢＳＡ中の１０Ｕ／ｍｌのα−グルコシダーゼ（Sigma-Aldrich）の存在下、２４時間、３７℃で行った。ＮＡＧＬＵ活性のため、３０μｇの組織タンパク質抽出物を、上記したように、４‐メチルウンベリフェリル−α−Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミニド（Moscerdam Substrates）とともに、３時間、３７℃で培養した（Marsh et al., Clin Genet. 1985;27(3):258-62, Ribera et al.の上記箇所を参照）。アセチル補酵素Ａおよび４−メチルウンベリフェリルβ−Ｄ−グルコサミン（ＭＵ−βＧｌｃＮＨ_２、Moscerdam Substrates）とともに１７時間、３７℃で培養したタンパク質抽出物３０μｇから、ＨＧＳＮＡＴ活性を決定した（Voznyi et al., J Inh Metab Dis 1993;16:465-72を参照）。ＧＡＬＮＳ活性を、２段階プロトコルによって評価した。第１の培養は、１０μｇのタンパク質抽出物および４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−ガラクトピラノシド−６−硫酸ナトリウム塩（ＭＵ−βＧａｌ−６Ｓ）を用いて、１７時間、３７℃で行った。第２段階は、Ｐ_ｉ−緩衝液（０．９Ｍ Ｎａ_２ＨＰＯ_４／０．９Ｍ ＮａＨ_２ＰＯ_４緩衝液、ｐＨ４．３＋０．０２％（ｗ／ｖ）Ｎａアジド）およびβ−ガラクトシダーゼ（β−Ｇａｌ−Ａｏ、シグマ）を添加して、混合物を２時間、３７℃で培養して行った（van Diggelen et al., Clin Chim Acta 1990;187:131-40を参照）。４−メチルウンベリフェリル−β−Ｄ−グルクロニド（シグマ）とともに３７℃で１時間インキュベートしたタンパク質抽出物１０μｇからＧＵＳＢ酵素の活性を決定した。０．１μｇのタンパク質抽出物を４−メチルウンベリフェリルＮ−アセチル−β−Ｄ−グルコサミニド（シグマ）とともに１時間、３７℃で培養し、ＨＥＸＢ活性を評価した。ｐＨを上昇させて反応を止めたあと、ＦＬｘ８００蛍光光度計（BioTek Instruments）を用いて、放出された蛍光を測定した。全脳および肝臓活性レベルをタンパク質の総量に対して正規化し、Bradford protein assay（Bio-Rad, Hercules, CA, US）を用いて定量した。

［８．組織学的分析］
組織をホルマリン中で１２〜２４時間固定し、パラフィンに包埋し、切片を作製した。脳におけるＬＡＭＰ２の免疫組織化学的検出のために、クエン酸緩衝液（ｐＨ６）中で、パラフィン切片を熱誘導エピトープ賦活化した。次いで、上記パラフィン切片を、１：５００に希釈したラット抗ＬＡＭＰ２抗体（Ab13524; Abcam, Cambridge, UK）とともに、４℃にて一晩インキュベートした。続いて、上記パラフィン切片を、１：３００に希釈したビオチン化ウサギ抗ラット抗体（Dako, Glostrup, DK）とともにインキュベートした。脳サンプルにおけるＧＦＡＰの免疫染色のために、パラフィン切片を、１：１０００に希釈したウサギ抗ＧＦＡＰ抗体（Ab6673; Abcam, Cambridge, UK）とともに、４℃にて一晩インキュベートした。続いて、上記パラフィン切片を、１：３００に希釈したビオチン化ヤギ抗ウサギ抗体（31820; Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA）とともにインキュベートした。切片を、１：１００に希釈したABC-Peroxidase staining kit（Thermo Scientific, Waltham, MA, US）とともにインキュベートすることにより、ＬＡＭＰ２およびＧＦＡＰの信号を増幅し、色原体として３，３−ジアミノベンジジン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US）を用いて可視化した。

脳サンプルにおけるミクログリア細胞を染色するために、パラフィン切片を、１：１００に希釈したＢＳＩ−Ｂ４レクチン（L5391; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA）とともに、４℃にて一晩インキュベートした。色原体として３，３−ジアミノベンジジン（Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, US）を用いて、ＢＳＩ−Ｂ４の信号を可視化した。光学顕微鏡（Eclipse 90i; Nikon, Tokyo, JP）により、明視野像を得た。

NIS Elements Advanced Research 2.20ソフトウェアを用いて、動物１匹毎の各脳領域の３〜４枚の画像（元の拡大倍率：２０倍）における、ＬＡＭＰ２、ＧＦＡＰおよびＢＳＩ−Ｂ４信号を定量した（すべての動物に対して同じ信号閾値を設定した）。次いで、ポジティブである面積の割合を計算した。すなわち、上記画像中の全組織の面積に対する、ポジティブ信号を有する面積を、ピクセルで計算した。

［９．組織中のベクターゲノムコピー数の定量］
組織をプロテイナーゼＫ（０．２ｍｇ／ｍｌ）中で一晩消化したあと、全ＤＮＡをＭａｓｔｅｒＰｕｒｅＤＮＡ精製キット（Epicenter）で単離した。ＨＢＢ２配列に特異的なプライマーおよびプローブ（ポリＡ切片に含有）を用いた定量ＰＣＲを用いて２０ｎｇの全ＤＮＡ中のベクターゲノムコピー数を定量した。フォワードプライマーは5’-CTT GAG CAT CTG ACT TCT GGC TAA T-3’、リバースプライマーは5’-GAT TTG CCC TCC CAT ATG TCC-3’、プローブは5’-CCG AGT GAG AGA CAC AAA AAA TTC CAA CAC-3’である。ポリＡ配列を含む直線化プラスミドの連続希釈により構成された参照標準曲線を用いて、ｖｇ／サンプルの最終的な値を補間した。

［１０．オープンフィールド試験］
６月齢のマウスの行動を、午前９時から午後１時まで行ったオープンフィールド試験によって分析した。動物を、明るく照らされた部屋（４１×４１×３０ｃｍ）の左下の角に配置した。当該部屋は、マウスの水平方向および垂直方向の動きを検知する光ビーム（SedaCom32; Panlab）の２つの束によって横切られていた。表面を、同心状の３つの正方形へと分割した（中央部（１４×１４ｃｍ）、周辺部（２７×２７ｃｍ）および境界部（４１×４１ｃｍ））。試験の最初の３分間における探索行動および自発運動を、ビデオ追跡システム（Smart Junior, Panlab）を用いて記録した。

［１１．統計分析］
すべての結果を平均±標準誤差として表した。一元配置分散分析を用いて統計比較を行った。ダネットの事後検定を用いてコントロール群と処置群との間の多重比較を行い、チューキーの事後検定を用いてすべての群の間の多重比較を行う。Ｐ＜０．０５の場合、統計的有意であると見なした。生存の分析のためにカプラン・マイヤー曲線を用い、比較のためにログランク検定を用いた。

〔実施例１：ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳの構築〕
ヒトのイズロン酸−２−スルファターゼのＣＤＳを出発材料（ＮＣＢＩの参照配列:ＮＭ＿０００２０２．６）として利用し、本実施例の目的のために化学的に合成した（GenScript Inc）。プラスミドｐＵＣ５７（AmpR）内で、上記ＣＤＳをクローニングした。上記ＣＤＳは、SwaIの制限部位によって挟まれていた。

SwaI−SwaIヒトイズロン酸−２−スルファターゼのＣＤＳ断片を、ｐＵＣ５７プラスミドから切り出し、その後、５’および３’突出部分をＫｌｅｎｏｗ断片（Fermentas）で平滑化してから、ＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧの、ＭｌｕＩの制限部位とＥｃｏＲＩの制限部位との間においてクローニングした。得られたプラスミドを、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ（アクセッション番号：ＤＳＭ２９８６６）と命名した（図１Ａおよび配列番号３を参照）。

ｐＡＡＶ−ＣＡＧプラスミドは、従前産生されてきた。上記ｐＡＡＶ−ＣＡＧプラスミドには、所定のＣＤＳのクローニングのためのマルチクローニングサイトに加え、ＡＡＶ２ゲノムのＩＴＲ、ＣＡＧプロモーター、およびウサギβ−グロビンのポリＡシグナルを含んでいた。上記ＣＡＧプロモーターは、ＣＭＶの初期／中期エンハンサーおよびニワトリβ−アクチンプロモーターから構成された、ハイブリッドプロモーターである。このプロモーターは、あらゆる部位において、強力な発現を促進することができる（Sawicki J et al., Exper Cell Res. 1998;244:367-369, Huang J et al., J Gene Med. 2003;5:900-908, Liu Y et al., Exp Mol Med. 2007; 39(2):170-175を参照）。

〔実施例２：ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１の構築〕
ヒトイズロン酸−２−スルファターゼｃＤＮＡ配列の最適化バージョン（ｏｈＩＤＳ）を含んでいる発現カセットを設計して得た。配列の最適化を実行して、ヒトにおけるイズロン酸−２−スルファターゼタンパク質の産生効率を最大化した。上記最適化は、短いスプライス部位およびＲＮＡ非安定化配列要素の削除（ＲＮＡの安定性を上げるため）、ＲＮＡ安定化配列要素の付加、コドンの最適化およびＧ／Ｃの含有量の適応、種々の変化のうちＲＮＡの安定二次構造の変化の回避によって行った。ヒトイズロン酸−２−スルファターゼのＣＤＳ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００２０２．６）を配列最適化（DNA 2.0 Inc）の出発点として用いた。最適化したＣＤＳを、プラスミドｐＪ２０４：１９１４７６（AmpR）内でクローニングした。上記ＣＤＳは、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位によって、５’および３’がそれぞれ挟まれていた。

ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩ最適化ヒトイズロン酸−２−スルファターゼのＣＤＳ断片をｐＪ２０４：１９１４７６プラスミドから切り出した。続いて、この断片を、上記ＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧのＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩ制限部位の間にてクローニングした。得られたプラスミドは、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１（アクセッション番号：ＤＳＭ２９８６７）と命名した（図２Ａおよび配列番号６を参照）。

〔実施例３：ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２の構築〕
ヒトイズロン酸−２−スルファターゼのＣＤＳ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０００２０２．６）を配列最適化した（GeneScript Inc）。最適化したＣＤＳを、プラスミドｐＵＣ５７（AmpR）内でクローニングした。上記ＣＤＳは、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位によって、５’および３’がそれぞれ挟まれていた。

ｐＵＣ５７−ｏｈＩＤＳプラスミドをＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩで消化して、最適化したイズロン酸−２−スルファターゼＣＤＳを切り取った。続いて、この断片をｐＡＡＶ−ＣＡＧ骨格プラスミドの同じ制限部位のあいだでクローニングして、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２（アクセッション番号：ＤＳＭ２９８６８）を産生した（図３Ａおよび配列番号９を参照）。

〔実施例４：ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳの構築〕
マウスのイズロン酸−２−スルファターゼのＣＤＳ（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１０４９８．３）を配列最適化した（GeneArt; Life Technologies）。最適化したＣＤＳを、プラスミドｐＭＡ−ＲＱ（AmpR）内でクローニングした。上記ＣＤＳは、ＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位によって、５’および３’がそれぞれ挟まれていた。

ＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩ最適化マウスイズロン酸−２−スルファターゼＣＤＳ断片（配列番号１１）をｐＭＡ−ＲＱプラスミドから切り取った。続いて、この断片をＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧのＭｌｕＩおよびＥｃｏＲＩの制限部位のあいだでクローニングした。得られたプラスミドをｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳと命名した（図４Ａおよび配列番号１２を参照）。

〔実施例５：ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＩＤＳの産生〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ（配列番号４）を産生した（Matsushita et al., Gene Ther. 1998;5(7):938-45, Wright et al., Mol Ther. 2005;12(1)171-8を参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ；Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、１）ＡＡＶ２のＩＴＲにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ）；２）ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子を有しているプラスミド（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述の最適化されたプロトコルを用いて、２回の連続した塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso et al., Gene Ther. 2010;17(4):503-10を参照）。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８で透析し、濾過し、ｑＰＣＲで滴定し、使用まで−８０℃にて保存した（図１Ｂを参照）。

〔実施例６：ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１の産生〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１（配列番号７）を産生した（Matsushita et al.およびWright et al.の上記箇所を参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ；Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、１）ＡＡＶ２のＩＴＲにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１）；２）ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子を有しているプラスミド（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述の最適化されたプロトコルを用いて、２回の連続した塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso et al.の上記箇所を参照）。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８で透析し、濾過し、ｑＰＣＲで滴定し、使用まで−８０℃にて保存した（図２Ｂを参照）。

〔実施例７：ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２の産生〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２（配列番号１０）を産生した（Matsushita et al.およびWright et al.の上記箇所を参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ；Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、１）ＡＡＶ２のＩＴＲにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２）；２）ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子を有しているプラスミド（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述の最適化されたプロトコルを用いて、２回の連続した塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso et al.の上記箇所を参照）。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８で透析し、濾過し、ｑＰＣＲで滴定し、使用まで−８０℃にて保存した（図３Ｂを参照）。

〔実施例８：ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳの産生〕
３種類の改変プラスミドを用いて、ヘルパーウイルスを使用せずにＨＥＫ２９３細胞をトランスフェクションすることによって、ベクターＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ（配列番号１３）を産生した（Matsushita et al.およびWright et al.の上記箇所を参照）。１０％ＦＢＳを添加したＤＭＥＭを入れたローラーボトル（ＲＢ；Corning, Corning, NY, US）中で、７０％コンフルエンスにて細胞を培養した。次に、当該細胞を、１）ＡＡＶ２のＩＴＲにより両端を挟まれている発現カセットを有しているプラスミド（ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ）；２）ＡＡＶ２ ｒｅｐ遺伝子およびＡＡＶ９ ｃａｐ遺伝子を有しているプラスミド（ｐＲＥＰ２ＣＡＰ９）；および、３）アデノウイルスヘルパー機能を有しているプラスミド、で同時トランスフェクションした。上述の最適化されたプロトコルを用いて、２回の連続した塩化セシウム勾配により、ベクターを精製した（Ayuso et al.の上記箇所を参照）。ベクターをＰＢＳ＋０．００１％プルロニック（登録商標）Ｆ６８で透析し、濾過し、ｑＰＣＲで滴定し、使用まで−８０℃にて保存した（図４Ｂを参照）。

〔実施例９：ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、およびｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２の健康なマウスへの流体力学的送達〕
総投与量３０μｇのプラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、およびｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２（イズロン酸−２−スルファターゼの発現カセットの異なるバージョンを含んでいる）を、流体力学的尾静脈注射を介して、２月齢のＷＴマウスに対して投与した。この技法は、肝臓に送達されたプラスミドの発現を目的とする（Liu et al., Gene Ther. 1990;6(7):1258-66を参照）。

プラスミドの送達から４８時間後、基底レベルに対するイズロン酸−２−スルファターゼ活性の著しい上昇が、イズロン酸−２−スルファターゼをコードしているプラスミドを投与されたすべての動物の、肝臓および血清において記録された。肝臓と血清の両方において、イズロン酸−２−スルファターゼ遺伝子の最適化バージョンを含む発現カセットで到達した活性レベルは、野生型遺伝子で得られた活性レベルより高かった。さらに、血清では、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２プラスミドを注射された動物が示したイズロン酸−２−スルファターゼ活性レベルは、他の２つのプラスミドについて記録された活性レベルより統計的に高かった（図５Ａおよび５Ｂを参照）。

〔実施例１０：ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、およびｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２のＭＰＳＩＩマウスへの流体力学的送達〕
総投与量３０μｇのプラスミドｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ、ｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、およびｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２（イズロン酸−２−スルファターゼの発現カセットの異なるバージョンを含んでいる）を、流体力学的尾静脈注射を介して、３月齢のＭＰＳＩＩ罹患マウスに投与した。

プラスミドの送達から１週間後、組織を摘出した。３種類のイズロン酸−２−スルファターゼ含有プラスミドはどれも、生理食塩水を注射されたＭＰＳＩＩ動物に比べてイズロン酸−２−スルファターゼ活性の実質的な上昇を媒介した。肝臓では、活性はＷＴレベルの１２００％から２２００％の範囲となり、血清では、ＷＴの２０００％から５７００％の範囲となった。イズロン酸−２−スルファターゼ遺伝子のコドン最適化バージョンを含む発現カセットで到達した活性レベルは、野生型遺伝子を含むプラスミドで媒介された活性レベルより統計的に高かった（図６Ａおよび６Ｂを参照）。

肝臓および血清で記録された高レベルのイズロン酸−２−スルファターゼ活性に呼応して、ＧＡＧ含有量は、すべてのプラスミド構築物で分析されたすべての組織において完全に正常になった（図６Ｃを参照）。

〔実施例１１：ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、およびＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２のＭＰＳＩＩマウスへの静脈内送達〕
ＭＰＳＩＩマウス（３．５月齢）に、野生型ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ配列または最適化ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ配列を含むＡＡＶ９ベクターを１×１０^１０ｖｇ、尾静脈を通して静脈内注射した。月齢が同じＷＴマウスおよび未処置のＭＰＳＩＩマウスそれぞれの一群をコントロールとした。処置から３週間後、動物を殺処分し、血液サンプルおよび肝臓サンプルを回収して分析した。

ＡＡＶ９ベクターを１×１０^１０ｖｇ／匹の投与量で静脈内投与することは、主に肝臓における導入遺伝子発現を目的としている（Wu et al., Mol. Ther. 2006; 14(3):316-27, Inagaki et al., Mol. Ther. 2006; 14(1):45-33を参照）。ベクターの送達から３週間後、肝臓抽出物においてイズロン酸−２−スルファターゼの活性を測定すると、ヒトＩＤＳをコードするベクターのいずれを注射されたＭＰＳＩＩオスにおいても、酵素活性のはっきりした上昇が記録された（図７Ａを参照）。しかし、当該上昇は、最適化ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ配列を含むＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１およびＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２）を注射されたＭＰＳＩＩ動物の場合の方が著しく高かった。野生型の配列を有するベクターを注射された動物において達したイズロン酸−２−スルファターゼ活性のレベルは、健康なＷＴ動物において観察されたレベルの約２倍であった（図７Ａを参照）。最適化ヒトＩＤＳ配列を含むベクターを用いた場合、イズロン酸−２−スルファターゼ活性のレベルは、健康な動物または野生型ＩＤＳ配列を含むベクターで処置されたＭＰＳＩＩ動物において見られたレベルより数倍高かった（図７Ａを参照）。

イズロン酸−２−スルファターゼは分泌可能なリソソーム酵素であり、したがって、肝臓におけるその発現は、酵素循環の原因である（Haurigot et aｌ．の上記箇所を参照）。肝臓抽出物において行われる観察と同様、最適化ヒトＩＤＳ配列を含むＡＡＶ９ベクターで処置されたＭＰＳＩＩ動物の血液循環において達成されたイズロン酸−２−スルファターゼ活性のレベルは、健康な動物または野生型ヒトＩＤＳ配列を含むベクターで処置されたＭＰＳＩＩ動物において見られたレベルより数倍高かった（図７Ｂを参照）。

肝臓および血清で記録された高レベルのイズロン酸−２−スルファターゼ活性に呼応して、ＧＡＧ含有量は、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１およびＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２で処置されたＭＰＳＩＩマウスの肝臓において完全に正常になった。しかし、ＧＡＧレベルは、野生型ＩＤＳコード配列を有する同投与量のＡＡＶ９ベクターで処置された動物の肝臓では、部分的にしか減少しなかった（図７Ｃを参照）。

〔実施例１２：ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｈＩＤＳ、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１、およびＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２のＭＰＳＩＩマウスへの大槽内送達〕
２月齢のＭＰＳＩＩマウスに、野生型ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ配列または最適化ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ配列のいずれかを含む、５×１０^１０ｖｇのＡＡＶ９ベクターを、総量で５μｌ、大槽内注射した。月齢が同じ、ＷＴマウス、未処置のＭＰＳＩＩマウス、および５×１０^１０ｖｇの非コードベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−Ｎｕｌｌ）を注射されたＭＰＳＩＩマウスそれぞれの群をコントロールとした。３．５月齢で、すなわち処置から１．５ヶ月後に、動物を殺処分しサンプルを回収して分析した。

脳抽出物においてイズロン酸−２−スルファターゼの活性を測定すると、ヒトＩＤＳをコードするベクターのいずれを注入されたＭＰＳＩＩオスにおいても、酵素活性のはっきりした上昇が記録された（図８Ａを参照）。しかし、当該上昇は、最適化ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ配列を含むＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１およびＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２）を注射されたＭＰＳＩＩ動物の場合の方が、野生型ＩＤＳ配列を含むベクターで処置されたＭＰＳＩＩ動物よりも数倍高かった（図８Ａを参照）。最適化ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ配列を有するベクターを注入された動物において達したイズロン酸−２−スルファターゼ活性のレベルは、ＷＴのレベルとほとんど同じぐらい高いか、あるいはさらに高かった。脳の最も吻側の部位（セクションＩ）において、最適化ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ配列を含むベクターに由来するＩＤＳ活性は、ＷＴのレベルの倍近かった（図８Ａを参照）。

脳全体でのＩＤＳ活性の上昇に呼応して、本疾患を特徴づける基質の蓄積が、処置されたＭＰＳＩＩマウスの脳において直された。これは、ＧＡＧ含有量の大幅な減少によって示される（図８Ｂを参照）。ＧＡＧレベルの完全な正常化が、分析した領域のうち、セクションＶを除くすべての領域において、すべての構築物について観察された。上記セクションＶでは、野生型ＩＤＳ配列を含むベクターに由来するＩＤＳの発現の効果は見られなかった（図８Ｂを参照）。

ＣＳＦに投与されたＡＡＶ９ベクターは末梢に漏出し、肝臓を形質導入する（Haurigot et al., Clin Invest. 2013;123(8):3254-3271, Ribera et al., Hum Mol Genet. 2014;24(7):2078-2095）。したがって、ヒトＩＤＳをコードするベクターのいずれで処置されたＭＰＳＩＩマウスにおいても、肝臓および血清においてイズロン酸−２−スルファターゼ活性の上昇が記録された（図９Ａおよび９Ｂを参照）。また、当該上昇は、最適化ヒトイズロン酸−２−スルファターゼ配列を含むＡＡＶ９ベクター（ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１およびＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２）を注入されたＭＰＳＩＩ動物の場合の方が、野生型ＩＤＳ配列を含むベクターで処置されたＭＰＳＩＩ動物におけるよりも著しく高かった（図９Ａおよび図９Ｂを参照）。上記治療の効果を、さまざまな体性器官中のＧＡＧ含有量の定量によって評価すると、最適化ヒトＩＤＳをコードするベクターのいずれで処置したＭＰＳＩＩマウスにおいても、すべての組織でＧＡＧレベルの完全な正常化が見られた（図９Ｃを参照）。しかし、野生型ヒトＩＤＳ配列を注入されたＭＰＳＩＩマウスは、肝臓、心臓、肺、および脾臓においてはＧＡＧ含有量が完全に正常になったが、精巣、腎臓、膀胱、および脂肪組織においては部分的な修正に留まった（図９Ｃを参照）。

〔実施例１３：ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳの大槽内送達〕
総投与量が５×１０^１０ベクターゲノムのＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳベクターを、２月齢のＭＰＳＩＩ動物の大槽内に、総量５μｌ注射した。最初に、マウスは６月齢で、すなわちベクター投与から４ヶ月後に、分析された。ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳのＣＳＦ内送達により、分析した脳のすべての領域でイズロン酸−２−スルファターゼ活性が回復し、健康な動物のさまざまな領域において観察されるレベルの平均４０％のレベルに達した（図１０Ａを参照）。ベクター送達から４ヶ月後、処置されたＭＰＳＩＩマウスの脳内において、本疾患に特徴的な基質蓄積は完全に元に戻った。これは、分析された脳のすべての領域でのＧＡＧ含有量の正常化によって示される（図１０Ｂを参照）。同様に、リソソーム区画のサイズも完全に正常化した。これは、リソソームマーカーＬＡＭＰ２の免疫検知用の信号強度の定量によって示される。ＬＡＭＰ２信号は、リソソーム区画のサイズと比例しており、ＬＡＭＰ２信号は、未分解のヘパランおよびデルマタン硫酸の蓄積量に依存する（図１１Ａを参照）。さらに、リソソーム膨張に対する処置の効果は、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ送達から８ヶ月後も安定したままであった。これは、上記治療が長期に渡って効果があることを示す（図１２を参照）。

未分解の基質の蓄積により正常なリソソームのホメオスタシスが中断すると、この突然変異によって直接影響される酵素とは異なる他のリソソーム酵素の活性も変化しうる（Ribera et al., Hum Mol Genet. 2014;doi: 10.1093/hmg/ddu727を参照）。未処置のＭＰＳＩＩマウスまたはコントロール「Ｎｕｌｌ」ベクターで処置されたＭＰＳＩＩマウスの脳内では、ＩＤＵＡ（イズロニダーゼ、アルファ−Ｌ−）、ＳＧＳＨ（Ｎ−スルホグルコサミンスルホヒドラーゼ）、ＮＡＧＬＵ（Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ、アルファ）、ＨＧＳＮＡＴ（ヘパラン−アルファ−グルコサミニド Ｎ−アセチルトランスフェラーゼ）、ＧＡＬＮＳ（ガラクトサミン（Ｎ−アセチル）−６−スルファターゼ）、ＧＵＳＢ（グルクロニダーゼ、ベータ）、ＨＥＸＢ（ヘキソサミニダーゼＢ）の活性が変化したが、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳによる処置により、それらの活性を健康なＷＴ動物で見られるレベルへと戻した。このことは、上記ベクターはリソソームのホメオスタシスを回復させることができたことを示している（図１１Ｂを参照）。

リソソーム異常の修正に呼応して、処置されたＭＰＳＩＩマウスの脳から、炎症のすべての徴候が消えた。処置から４ヶ月後で、星状細胞増加（ＧＦＡＰ）およびミクログリオーシス（ＢＳＩ−Ｂ４）を検知するのに用いた染色の信号強度は、処置されたＭＰＳＩＩマウスおよび健康な動物の脳のさまざまな領域において同じであった。これと反対に、コントロール「Ｎｕｌｌ」ＡＡＶ９ベクターを投与されたＭＰＳＩＩマウスにおいて記録された信号は、神経炎症のこれらの指標がはっきりと増加した（図１３Ａおよび図１３Ｂを参照）。さらに、１０月齢の時点で、すなわち、遺伝子導入から８ヶ月後の時点で、神経炎症に対するＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ処置の有益な影響（ＧＦＡＰおよびＢＳＩ−Ｂ４の双方の染色を通して評価した）は続いていた。これは、神経炎症を長期に渡って根絶したことを示す（図１４Ａおよび１４Ｂを参照）。

ＣＳＦに投与されたＡＡＶ９ベクターは末梢に漏出し、肝臓を形質導入する（Haurigot et al., Clin Invest. 2013;123(8):3254-3271, Ribera et al., Hum Mol Genet. 2014;doi: 10.1093/hmg/ddu727を参照）。したがって、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳで処置されたＭＰＳＩＩマウスの肝臓および血清における遺伝子導入後４ヶ月の時点で、イズロン酸−２−スルファターゼ活性の上昇が記録され、健康な動物で見られるレベルの約１７００％および７００％にそれぞれ達した（図１５Ａおよび１５Ｂを参照）。上記治療の身体的効果を、さまざまな器官中のＧＡＧ含有量の定量によって評価すると、肝臓、心臓、肺、精巣、脾臓、および脂肪組織を含むほとんどの組織において完全な正常化が見られた。例外は腎臓および膀胱で、ＧＡＧの５０％を超える減少が見られた（図１５Ｃを参照）。

処置から４ヶ月後、ＩＤＳ活性も肺において上昇し、心臓において特に高かった（図１６Ａおよび１６Ｂを参照）。これら２つの器官（肺および心臓）は、ベクターゲノムコピー数／二倍体ゲノムの値が非常に低く、ＣＳＦ内にＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳを５×１０^１０ｖｇの投与量送達したあと、これらの器官では効率的な形質導入が行われないことを示す（図１６Ｃを参照）。この発見は、ＩＤＳを血液循環から摂取することによりＩＤＳ欠乏をクロスコレクションできることを示唆した。

ＧＡＧ含有量データに呼応して、２月齢の時点でＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳで処置された６月齢のＭＰＳＩＩマウスの肝臓の重量が正常化した（図１７Ａを参照）。ＭＰＳＩＩマウスのリソソーム異常を正す、ＣＳＦ内ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ処置の能力は、肝臓抽出物中の他のリソソーム酵素の活性を測定することによってさらに実証された。未処置のＭＰＳＩＩマウスまたはコントロール「Ｎｕｌｌ」ベクターで処置されたＭＰＳＩＩマウスでは、ＩＤＵＡ、ＳＧＳＨ、ＮＡＧＬＵ、ＨＧＳＮＡＴ、ＧＡＬＮＳ、ＧＵＳＢ、およびＨＥＸＢがＷＴレベルに比べて大幅に変化した。ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳによる処置は、これらの酵素すべての活性を完全に正常化した（図１７Ｂを参照）。さらに、リソソーム異常の結果、血清ＨＥＸＢ活性も上昇するが、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ処置のあとでは、血清ＨＥＸＢ活性も完全に正常化した（図１７Ｃを参照）。これは、リソソーム機能が全身で直されるという証拠を提供する。

ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳのＣＳＦ内投与が行動に与える影響を、６月齢の時点でオープンフィールド試験によって調べた。オープンフィールド試験は、未知の環境におけるマウスの一般的な運動および探索行動を評価するものである。未処置のＭＰＳＩＩマウスおよびＡＡＶ９ｎｕｌｌ処置ＭＰＳＩＩマウスは、健康なマウスに比べて、中央部および周辺部で費やす時間、中央部および周辺部への侵入回数、およびすばやい運動の総数の点において、探索行動の減少を示した。ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳの大槽内投与は、ＭＰＳＩＩマウスにおける行動欠損を完全に直した（図１８Ａから１８Ｆを参照）。

最後に、ＣＳＦ内ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ処置の治療効果を、未処置のＭＰＳＩＩマウスと処置を受けたＭＰＳＩＩマウスの生存を比較することによって評価した。ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ遺伝子治療は、ＭＰＳＩＩマウスの寿命を大幅に伸ばした（図１９参照）。１７月齢の時点で、未処置またはＡＡＶ９−ＣＡＧ−Ｎｕｌｌ処置を受けたＭＰＳＩＩマウスはすべて死亡していたのに対し、ＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳ処置を受けたＭＰＳＩＩマウスは７６％が生存していた。さらに、２２月齢の時点においても、処置を受けた動物の６５％が依然として生存していた。この月齢の時点で生存していた野生型の動物の割合は７９％であった（図１９を参照）。

〔実施例１４：さまざまな投与量のＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳの大槽内送達：用量反応研究〕
４つの異なる投与量（１．５８×１０^９、５×１０^９、１．５８×１０^１０、および５×１０^１０ｖｇ／匹）のＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｍＩＤＳベクターを、２月齢のＭＰＳＩＩマウスに、大槽内注射によって、総量５μｌ投与した。

ベクター投与後１ヶ月半の時点で、動物を殺処分し、組織を摘出した。イズロン酸−２−スルファターゼ活性を、脳のさまざまな部位（セクションＩ〜Ｖ）で測定した。活性は投与量とともに上昇し、さまざまな領域においてＷＴ活性に対して０．８から５３％の範囲の値を示した（図２０Ａを参照）。同様の用量反応が、ＧＡＧ蓄積に対する上記処置の効果を分析した際にも見られた。しかし、ＧＡＧ蓄積の完全な修正は、１．５８×１０^１０および５×１０^１０ｖｇ／匹という２つの最も高い投与量においてのみ記録された（図２０Ｂを参照）。

肝臓および血清においても、活性は投与量とともに上昇し、肝臓では２０％から４３００％の範囲、血清では０．４％から１１００％の範囲だった。２つの最も低い投与量（１．５８×１０^９および５×１０^９ｖｇ／匹）では、血清中のＩＤＳ活性は検知できなかった（図２１Ａおよび２１Ｂを参照）。末梢組織のＧＡＧ含有量を測定したところ、上記活性データと呼応して、肝臓、心臓、肺、精巣、脾臓、腎臓、膀胱、および脂肪組織においてＧＡＧ含有量が用量反応的に減少するのが示された。２つの最も高い投与量（１．５８×１０^１０および５×１０^１０ｖｇ／匹）では、ほとんどの組織でＧＡＧレベルの完全なまたはほとんど完全な正常化が達成された。例外は、７０％を超える減少が記録された肺および膀胱と、約５０％の減少が観察された腎臓である（図２１Ｃを参照）。

Claims (14)

1. 配列番号１に記載されたイズロン酸−２−スルファターゼ（ＩＤＳ）タンパク質をコードする単離された核酸分子であって、配列番号５および配列番号８から選択される、単離された核酸分子。
2. 請求項１に記載の核酸分子を含む、プラスミド。
3. 配列番号６に記載されたｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１（アクセッション番号：ＤＳＭ２９８６７）である、請求項２に記載のプラスミド。
4. 配列番号９に記載されたｐＡＡＶ−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２（アクセッション番号：ＤＳＭ２９８６８）である、請求項２に記載のプラスミド。
5. 請求項１に記載の核酸分子を含み、血清型９、ＡＡＶ９のアデノ随伴ウイルスベクターである、組み換えベクター。
6. 配列番号１４のＣＡＧプロモーターに連結している核酸分子（配列番号５）を含むＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ１である、請求項５に記載の組み換えベクター。
7. 配列番号１４のＣＡＧプロモーターに連結している核酸分子（配列番号８）を含むＡＡＶ９−ＣＡＧ−ｏｈＩＤＳ−ｖｅｒｓｉｏｎ２である、請求項５に記載の組み換えベクター。
8. 請求項１に記載の核酸分子、または請求項２から４のいずれかに記載のプラスミド、または請求項５から７のいずれかに記載の組み換えベクターを、治療上効果的な量含む、薬学的組成物。
9. 静脈内投与用または大槽内投与用である、請求項８に記載の薬学的組成物。
10. ムコ多糖症ＩＩ型の治療に用いられる薬剤の製造のための、請求項１に記載の核酸分子、請求項２から４のいずれかに記載のプラスミド、または請求項５から７のいずれかに記載の組み換えベクターの使用。
11. イズロン酸−２−スルファターゼ活性の上昇に用いられる薬剤の製造のための、請求項１に記載の核酸分子、請求項２から４のいずれかに記載のプラスミド、または請求項５から７のいずれかに記載の組み換えベクターの使用。
12. 請求項５から７のいずれかに記載のベクターを製造する方法であって、
    ｉ）第１のベクターと、第２のベクターと、第３のベクターとを提供する工程であって、上記第１のベクターは、第１のＡＡＶ末端反復と第２のＡＡＶ末端反復との間に挟まれた、イズロン酸−２−スルファターゼをコードする配列に作動可能に連結されているＣＡＧプロモーターを含み、上記第２のベクターは、血清型９に由来するＡＡＶ ｒｅｐ遺伝子とＡＡＶ ｃａｐ遺伝子とを含み、上記第３のベクターは、アデノウイルスヘルパー機能遺伝子を含む、工程と、
    ｉｉ）工程ｉ）のベクターでコンピテント細胞を同時トランスフェクトする工程と、
    ｉｉｉ）工程ｉｉ）のトランスフェクトされた細胞を培養する工程と、
    ｉｖ）工程ｉｉｉ）の培養液から表現ベクターを精製する工程と、を含む、方法。
13. 請求項２から４のいずれかに記載のプラスミドを調製する方法であって、
    ｉ）イズロン酸−２−スルファターゼタンパク質をコードする配列を、出発プラスミドから、消化によって、特にＭｌｕＩ／ＥｃｏＲＩを用いて、切り取る工程と、
    ｉｉ）イズロン酸−２−スルファターゼタンパク質をコードする配列を、ＡＡＶ骨格プラスミドｐＡＡＶ‐ＣＡＧの２つの制限部位の間にクローニングし、それによって、イズロン酸−２−スルファターゼタンパク質をコードする配列を含む対応するプラスミドを得る工程と、を含む、方法。
14. 請求項１に記載の核酸分子を含む、単離された細胞。

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