JP6858563B2 - Ｂｒａｆ変異検出によるｅｇｆｒ阻害剤の効果予測 - Google Patents

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本発明は、がん治療薬の薬効を予測する方法に関する。具体的には本発明は、抗ＥＧＦＲ抗体薬に適さないＢＲＡＦ突然変異の新規な抗ＥＧＦＲ抗体薬治療効果予測マーカーを検出する方法と、その検査キットとに関する。

近年、転移性大腸がん（metastatic colorectal cancer）の治療成績が向上し、フルオロウラシル単独投与では１２ヶ月であった平均余命が約２年にまで延びるまでになった（非特許文献１）。この延命効果は、フルオロウラシルに加えて、ＥＧＦ（上皮成長因子）受容体（ＥＧＦＲ）に特異的なモノクローナル抗体製剤（以下、「抗ＥＧＦＲ抗体薬」という。）をイリノテカン（irinotecan）、オキサリプラチン（oxaliplatin、L−OHP）等とともに併用することにより得られた。前記抗ＥＧＦＲ抗体薬には、セツキシマブ（Cetuximab）、パニツムマブ（Panitumumab）等が知られている。このうちセツキシマブは、ヒトＥＧＦＲに対するマウスモノクローナル抗体２２５を遺伝子工学的にヒト抗体遺伝子に部分置換して得られたキメラ抗体である。パニツムマブは、ヒト抗体遺伝子座の染色体ＤＮＡを導入したトランスジェニックマウスを用いて作成されたモノクローナル抗体である。イリノテカンはトポイソメラーゼＩ阻害活性によりＤＮＡ複製を阻害する。オキサリプラチンは白金製剤でＤＮＡと結合してがん細胞のＤＮＡ複製及び転写を阻害する。前記抗ＥＧＦＲ抗体薬は、フルオロウラシル、イリノテカン、オキサリプラチン等の合成化合物製剤と併用される他、さらに、ベバシズマブ（Bevacizumab）のような血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する抗体製剤と併用される場合がある。前記血管内皮細胞増殖因子（ＶＥＧＦ）に対する抗体製剤は、ＶＥＧＦの働きを阻害するもので、ＶＥＧＦを発現しないがん細胞であっても、血管新生を抑制してがん組織への血液供給を低減することでがんの増殖を阻害することができる。

抗ＥＧＦＲ抗体薬は、ＥＧＦがＥＧＦＲに結合するのを阻害することにより、ＥＧＦＲから下流へのシグナル伝達を阻害して、がん細胞の増殖を抑制しがん組織を縮小する。しかし、がん細胞のＫＲＡＳ、ＢＲＡＦ等の遺伝子に体細胞突然変異が存在するときには、抗ＥＧＦＲ抗体薬は薬効を示さないことが知られている（特許文献１及び２、非特許文献２）。このうちＫＲＡＳについては、ＫＲＡＳタンパク質の１２位、１３位、５９位、６１位、１１７位又は１４６位のアミノ酸残基が置換する体細胞突然変異がＫＲＡＳタンパク質の機能を構成的に活性化させる。ＫＲＡＳタンパク質はＥＧＦＲへのＥＧＦ結合に始まる細胞増殖促進シグナルの伝達経路に属する。そのため、抗ＥＧＦＲ抗体によるＥＧＦＲからのシグナル伝達阻害が突然変異体ＫＲＡＳにより無効にされ、前記シグナル伝達経路の下流に細胞増殖促進シグナルが伝達される。これがＫＲＡＳ突然変異体による抗ＥＧＦＲ抗体薬の薬効阻害の機序である。大腸がん細胞ではＫＲＡＳと同じ遺伝子ファミリーに属するＮＲＡＳも発現する。そのため、ＫＲＡＳは野生型でも、ＮＲＡＳの１２位、１３位、５９位、６１位、１１７位又は１４６位のアミノ酸残基が置換する体細胞突然変異の場合には、抗ＥＧＦＲ抗体薬の薬効が阻害される。そこで本明細書では、ＫＲＡＳ及びＮＲＡＳのいずれにも体細胞突然変異が検出されない腫瘍をＲＡＳ野生型といい、１２位、１３位、５９位、６１位、１１７位又は１４６位のアミノ酸残基が置換する体細胞突然変異がＫＲＡＳ又はＮＲＡＳの少なくともいずれか１つに検出される腫瘍をＲＡＳ変異型という。

抗ＥＧＦＲ抗体薬セツキシマブ（アービタックス（登録商標））の日本で販売される際の添付文書には、効能・効果に関連する使用上の注意として、「ＥＧＦＲ陽性の治癒切除不能な進行・再発の結腸・直腸がんに対する本剤の使用に際してはＫＲＡＳ遺伝子変異の有無を考慮した上で、適応患者の選択を行うこと」と記載されている。また、抗ＥＧＦＲ抗体薬パニツムマブ（ベクティビックス（登録商標））の日本で販売される際の添付文書には、効能・効果として、「ＫＲＡＳ遺伝子野生型の治癒切除不能な進行・再発の結腸・直腸がん」と記載され、効能・効果に関連する使用上の注意として、「ＫＲＡＳ遺伝子変異を示す患者での有効性は確立していない。」と記載されている。欧州では、セツキシマブ及びパニツムマブはＲＡＳが野生型の大腸がんに適用されるように制限されている。

ＲＡＳタンパク質の１２位又は１３位のアミノ酸残基が置換する体細胞突然変異とＢＲＡＦの体細胞突然変異とが共存する大腸がんの症例は非常に少ないことが知られている。そこで大腸がんでは、ＲＡＳ及びＢＲＡＦがＥＧＦＲへのＥＧＦ結合に始まる細胞増殖促進シグナルの同一の伝達経路に属しており、ＲＡＳが野生型であっても、ＢＲＡＦに機能を構成的に活性化させる体細胞突然変異があれば、抗ＥＧＦＲ抗体薬の薬効が阻害される可能性がある。

ＢＲＡＦの機能を構成的に活性化させる体細胞突然変異としては、ＢＲＡＦタンパク質の６００位のバリンがグルタミン酸に置換される突然変異（以下、「Ｖ６００Ｅ」という。）が最もよく知られている。しかし、ＫＲＡＳ又はＮＲＡＳタンパク質の１２位、１３位、５９位、６１位、１１７位、又は１４６位のアミノ酸残基が置換する体細胞突然変異が抗ＥＧＦＲ抗体薬の効果予測マーカーであることが繰り返し確認されているのとは異なり、ＢＲＡＦのＶ６００Ｅ突然変異については、大規模な治験（ＣＲＹＳＴＡＬ試験及びＯＰＵＳ試験）のデータの解析によって、ＢＲＡＦのＶ６００Ｅ突然変異は予後が悪いことを予測するマーカーであることは確認されたが、抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果予測マーカーであることは確認されなかった。しかし、ＢＲＡＦ変異型症例数が少なすぎるため、この結果により予後マーカーや効果予測マーカーとしての可能性を解析するには至らないと結論している（非特許文献３）。

最近のがん組織の飽和的解析の報告（非特許文献３）から、ＢＲＡＦはＫＲＡＳとは異なり、大腸がんではＶ６００Ｅ突然変異以外の突然変異の頻度が比較的高く、Ｖ６００Ｅ突然変異が優占的とはいえないことが明かになっている。ＢＲＡＦの突然変異のうちＤ５９４突然変異は、Ｖ６００Ｅ突然変異に比べると頻度が大幅に低いものの、大腸がんではしばしば見いだされることが知られた突然変異である。５９４位のアスパラギン酸残基はＤＦＧモチーフに含まれ、アスパラギン酸残基のカルボキシル基の酸素原子は、触媒部位でのＭｇ^２＋イオンのキレート化及びＡＴＰ結合の安定化に関与することが知られている。Ｄ５９４突然変異体のうち、Ｄ５９４Ａ又はＤ５９４Ｖ変異型ＢＲＡＦは、自らのキナーゼ活性を失っているにもかかわらず、前記変異型ＲＡＳの存在下でのみ野生型ＣＲＡＦと結合して、ＣＲＡＦのキナーゼ活性を亢進させるとの報告がある（非特許文献５）。一方で、Ｄ５９４Ｇ変異型ＢＲＡＦは、セツキシマブの薬効とは相関しないこととの報告がある（非特許文献６）。よって、Ｄ５９４突然変異が抗ＥＧＦＲ抗体薬等のＥＧＦＲ阻害剤の効果予測マーカーになるかどうかについては置換したアミノ酸残基によって結論が異なる。

欧州特許公報ＥＰ１９１３１５７Ｂ１ 米国特許出願公開公報ＵＳ２０１２／０２６４１２９Ａ１

Moorcraft, S.Y.ら、Ther. Adv. Gastroenterol., 6: 381−395 (2013) Siena,S.ら、J. Natl. Cancer Inst., 101: 1308−1324 (2009) Bokemeyer, C.ら、Eur. J. Cancer, 48: 1466−1475 (2012) Lawrence, M.S.ら、Nature, 505: 495−501 (2014) Heidorn, S. J.ら、Cell, 140: 209−221 (2010) Smith, C. G.ら、Clin. Cancer Res, 19: 4104−4113, (2013)

以上のとおり、Ｖ６００Ｅ及びＤ５９４変異型ＢＲＡＦの結果から、ＢＲＡＦキナーゼ活性の構成的活性化又は失活という酵素活性だけに基づいて、ＢＲＡＦの体細胞突然変異とＥＧＦＲ阻害剤の治療効果との関係を予測することはできない。そこで、ＥＧＦＲ阻害剤抗がん剤への適応性をより的確に判定するためには、Ｖ６００Ｅ突然変異以外の全てのＢＲＡＦ突然変異を考慮した解析を行って、ＥＧＦＲ阻害剤に適さないＢＲＡＦ突然変異の新規な抗ＥＧＦＲ抗体薬治療効果予測マーカーを検出する技術を開発する必要がある。

今回、網羅的遺伝子解析技術を用いた抗ＥＧＦＲモノクローナル抗体薬治療効果予測バイオマーカーの探索研究に関する多施設共同研究（Biomarker Research for Anti−EGFR Monoclonal Antibodies by Comprehensive Cancer Genomics、以下、「ＢＲＥＡＣ試験」という。）では、大腸がんのＢＲＡＦ体細胞突然変異の半数近くがＶ６００Ｅ以外の突然変異体であった。そこで本件発明者らは、抗ＥＧＦＲ抗体薬をはじめとするＥＧＦＲ阻害剤の単独治療か、又はＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤以外の化学療法剤との併用治療かの治療効果を予測するための、ＢＲＡＦ突然変異の新規な効果予測マーカーを検出する技術を開発した。

本発明は、抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果を予測するヒトＢＲＡＦの突然変異を検出する方法を提供する。本発明のヒトＢＲＡＦの体細胞突然変異を検出する方法は、患者生体サンプルを用いて、配列番号１のヒトＢＲＡＦタンパク質のアミノ酸配列において、Ｇ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップを含み、前記遺伝子の突然変異が検出された腫瘍は、前記ＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤による治療に適さない。

本発明のヒトＢＲＡＦの突然変異を検出する方法において、ヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップは、Ｇ４６９Ａ、Ｌ４８５Ｆ、Ｑ５２４Ｌ、Ｌ５２５Ｒ、Ｄ５９４Ｇ及びＶ６００Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップの場合がある。

本発明のヒトＢＲＡＦの突然変異を検出する方法において、前記ＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤は、ＥＧＦＲ阻害剤の場合がある。

本発明のヒトＢＲＡＦの突然変異を検出する方法において、前記ＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤は、抗ＥＧＦＲ抗体薬の場合がある。

本発明のヒトＢＲＡＦの突然変異を検出する方法において、前記ＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤は、該阻害剤以外の化学療法剤、例えば、イリノテカン、ＦＯＬＦＯＸ、又はＦＯＬＦＩＲＩとともに併用される場合がある。

本発明のヒトＢＲＡＦの突然変異を検出する方法において、前記患者の生体サンプルは、腫瘍組織サンプル、体液サンプル、分泌物サンプル及び排泄物サンプルからなる群から選択される少なくとも１つのサンプルの場合がある。

本発明のヒトＢＲＡＦの突然変異を検出する方法において、前記ヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップは、患者の生体サンプルから抽出した核酸の塩基配列のうち、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の前記少なくとも１つのアミノ酸残基の置換をコードするオリゴヌクレオチドの塩基配列を決定することを含む場合がある。

本発明のヒトＢＲＡＦの突然変異を検出する方法において、前記ヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップは、患者の生体サンプルから抽出した核酸のうち、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の前記少なくとも１つのアミノ酸残基の置換をコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅することを含む場合がある。

本発明のヒトＢＲＡＦの突然変異を検出する方法は、（ａ）患者の生体サンプルからＤＮＡを単離するステップと、（ｂ）配列番号２の塩基配列においてＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基をコードする塩基配列を挟むプライマーの対と、前記単離されたＤＮＡとをハイブリダイズさせるステップと、（ｃ）前記単離したＤＮＡとプライマーを用いて、配列番号２の塩基配列においてＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基をコードする塩基配列を有するＢＲＡＦ遺伝子ＤＮＡを増幅させるステップと、（ｄ）前記増幅されたＢＲＡＦ遺伝子ＤＮＡを固相に固定された若しくは液相中でプローブと接触させるステップと、（ｅ）前記増幅されたＢＲＡＦ遺伝子ＤＮＡとハイブリダイズした前記固相に固定された若しくは液相中のプローブを検出するステップとを含む場合がある。

本発明のヒトＢＲＡＦの突然変異を検出する方法において、前記ヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップは、患者の生体サンプルから、ヒトＢＲＡＦタンパク質の前記少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含むペプチドを検出することを含む場合がある。

本発明のヒトＢＲＡＦの突然変異を検出する方法において、前記腫瘍は大腸がんの場合がある。

本発明は、ＥＧＦＲ阻害剤の治療効果を予測するヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するためのキットを提供する。本発明のキットは、配列番号２の塩基配列においてＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異を含む、塩基配列を特異的に検出するためのプライマー又はプローブオリゴヌクレオチドを含む。

本発明のキットは、ＢＲＡＦ遺伝子におけるＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマー、及びリバースプライマーを含み、ＢＲＡＦ遺伝子の突然変異を検出する場合がある。

本発明のキットにおいて、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列においてＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換をコードするオリゴヌクレオチドの塩基配列を決定することにより、配列番号２の塩基配列においてＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異を検出する場合がある。

本発明のキットにおいて、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列においてＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異塩基を含む、塩基配列を有するＲＮＡ及び／又はＤＮＡを鋳型とするポリヌクレオチドを特異的に増幅することにより、配列番号２の塩基配列においてＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異を検出する場合がある。

本発明のキットにおいて、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜４０からなる群から選択される少なくとも１本の配列からなる場合がある。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜４０からなる群から選択される少なくとも１本の配列を含む場合がある。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、１０ないし５０個のヌクレオチド、代替的には、１５ないし４０個、あるいは、１８ないし３０個のヌクレオチドからなる場合がある。

本発明のキットにおいて、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜９のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号１０〜１４のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドの対と、配列番号１５〜１８のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号１９〜２２のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドの対と、配列番号２３〜２６のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号２７〜３０のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドの対と、配列番号３１〜３５のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号３６〜４０のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドの対とからなるプライマーオリゴヌクレオチドの対の少なくとも１対の場合がある。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜４０からなる群から選択される少なくとも１本の配列を含む場合がある。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、１０ないし５０個のヌクレオチド、代替的には、１５ないし４０個、あるいは、１８ないし３０個のヌクレオチドからなる場合がある。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜９のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号１０〜１４のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドの対と、配列番号１５〜１８のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号１９〜２２のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドの対と、配列番号２３〜２６のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号２７〜３０のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドの対と、配列番号３１〜３５のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号３６〜４０のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドの対とからなるプライマーオリゴヌクレオチドの対の少なくとも１対の場合がある。

本発明のキットにおいて、前記プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列において、Ｇ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異塩基を含む、塩基配列を有するＲＮＡ及び／又はＤＮＡと雑種形成することにより、配列番号２の塩基配列においてＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異を検出する場合がある。該プローブオリゴヌクレオチドは、固相に不動化される場合がある。

本発明のキットにおいて、前記プライマー又はプローブオリゴヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列のうち、Ｇ４６９Ａ、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異塩基を含む塩基配列か、その相補配列かを含む場合がある。

本発明のキットにおいて、前記プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号４１〜９８からなる群から選択される少なくとも１本の配列の場合がある。前記プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号４１〜９８からなる群から選択される少なくとも１本の配列を含む場合がある。前記プローブオリゴヌクレオチドは、１０ないし５０個のヌクレオチド、代替的には、１５ないし４０個、あるいは、１８ないし３０個のヌクレオチドからなる場合がある。

本発明のキットにおいて、前記ヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異は、Ｇ４６９Ａ、Ｌ４８５Ｆ、Ｑ５２４Ｌ、Ｌ５２５Ｒ、Ｄ５９４Ｇ及びＶ６００Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異の場合がある。

本発明のキットにおいて、前記プライマーオリゴヌクレオチドは、その５’末端と３’末端との間にリボヌクレアーゼ酵素認識部位を含み、該リボヌクレアーゼ酵素認識部位は、ＲＮＡの連続配列であって、前記アミノ酸残基の置換を起こす突然変異塩基を含み、該リボヌクレアーゼ酵素認識部位は相補的な塩基配列を有するＤＮＡと対合してヘテロ２本鎖を形成するとき、耐熱性ＲＮａｓｅＨにより特異的に切断される場合がある。

本発明のキットにおいて、前記プライマー又はプローブオリゴヌクレオチドは少なくとも前記アミノ酸残基の置換を起こす突然変異塩基に核酸アナログを含む場合がある。核酸アナログには、２’，４’−ＢＮＡ（Bicyclic nucleoside）、ＰＮＡ(Peptide Nucleic Acid)、ＥＮＡ（Ethylene nucleoside acid）又はＬＮＡ（Locked nucleoside acid）を含む場合があるがこれらに限定されない。

本発明のキットは、前記プライマー又はプローブオリゴヌクレオチドに加えて、ｄＮＴＰなどの酵素反応基質と、ＤＮＡポリメラーゼ、リボヌクレアーゼなどの酵素と、酵素反応液、ハイブリダイゼーション緩衝液、洗浄用緩衝液などの溶液又は該溶液調製用固体組成物と、ニトロセルロース膜、ナイロン膜などの核酸不動化用固相と、能書とからなるグループから選択される少なくとも１つを含む場合がある。

本発明は、配列番号１のヒトＢＲＡＦタンパク質のアミノ酸配列において、Ｇ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含む単離ヒトＢＲＡＦの体細胞突然変異タンパク質、又は、Ｇ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含むヒトＢＲＡＦ体細胞突然変異タンパク質の単離ペプチド断片を提供する。

本発明は、本発明の単離ヒトＢＲＡＦの体細胞突然変異タンパク質又はヒトＢＲＡＦ体細胞突然変異タンパク質の単離ペプチド断片に結合するが、野生型ヒトＢＲＡＦタンパク質又はその単離ペプチドとは結合しない抗体又は抗体断片を提供する。

本発明は、本発明の単離ヒトＢＲＡＦの体細胞突然変異タンパク質又はヒトＢＲＡＦ体細胞突然変異タンパク質の単離ペプチド断片を発現する宿主細胞を提供する。本発明の宿主細胞は、発明の単離ヒトＢＲＡＦの体細胞突然変異タンパク質又はヒトＢＲＡＦ体細胞突然変異タンパク質の単離ペプチド断片をコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを含み、該発現ベクターは前記宿主細胞内での遺伝子の発現を可能にする制御領域を含み、該制御領域は前記ポリヌクレオチドと動作可能に連結される。

本発明は、ＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤のヒトＢＲＡＦ体細胞突然変異に対する治療効果を予測する方法を提供する。本発明の治療効果を予測する方法は、本発明の宿主細胞にＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤を曝露するステップと、前記宿主細胞の増殖に与える前記阻害剤の効果を調べるステップとを含み、前記阻害剤の非存在下と比較して前記阻害剤の存在下で前記宿主細胞の増殖が抑制されるとき、前記ヒトＢＲＡＦタンパク質又はその単離ペプチド断片に含まれるアミノ酸残基置換体細胞突然変異に対して前記阻害剤は治療効果があり、あるいは、前記阻害剤の非存在下と比較して前記阻害剤の存在下で前記宿主細胞の増殖が抑制されないとき、前記ヒトＢＲＡＦタンパク質又はその単離ペプチド断片に含まれるアミノ酸残基置換体細胞突然変異に対して前記阻害剤は治療効果がないと予測する。

本発明は、単離ヒトＢＲＡＦタンパク質又はその単離ペプチド断片の発現方法を提供する。本発明の単離ヒトＢＲＡＦタンパク質又はその単離ペプチド断片の発現方法は、本発明の単離ヒトＢＲＡＦタンパク質又はその単離ペプチド断片をコード化するポリヌクレオチドを含む発現ベクターを宿主細胞に導入するステップと、該宿主細胞中で前記単離ヒトＢＲＡＦタンパク質又はその単離ペプチド断片を発現するステップとを含み、前記宿主細胞内での遺伝子の発現を可能にする制御領域が前記発現ベクターに含まれ、該制御領域は前記ポリヌクレオチドと動作可能に連結される。

本発明は、ＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤の治療効果を予測するヒトＢＲＡＦの突然変異タンパク質を検出するための参照タンパク質組成物を提供する。本発明の参照タンパク質組成物は、配列番号１のヒトＢＲＡＦタンパク質のアミノ酸配列において、Ｇ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含む単離ヒトＢＲＡＦタンパク質か、Ｇ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含むヒトＢＲＡＦタンパク質の単離ペプチド断片を含む。

本発明は、配列番号２の塩基配列のうち、Ｇ４６９Ａ、Ｌ４８５Ｆ、Ｑ５２４Ｌ、Ｌ５２５Ｒ、Ｄ５９４Ｇ及びＶ６００Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異塩基を含む変異型ヒトＢＲＡＦｃＤＮＡ塩基配列を含むポリヌクレオチドを提供する。

本発明は、配列番号２の塩基配列のうち、Ｇ４６９Ａ、Ｌ４８５Ｆ、Ｑ５２４Ｌ、Ｌ５２５Ｒ、Ｄ５９４Ｇ及びＶ６００Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの変異を検出するためのプローブオリゴヌクレオチドを提供する。前記プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号４１〜９８からなる群から選択される少なくとも１本の配列を含む場合がある。前記プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号４１〜９８からなる群から選択される少なくとも１本の配列の場合がある。前記プローブオリゴヌクレオチドは、１０ないし５０個のヌクレオチド、代替的には、１５ないし４０個、あるいは、１８ないし３０個のヌクレオチドからなる場合がある。

本発明は、配列番号２の塩基配列のうち、Ｇ４６９Ａ、Ｌ４８５Ｆ、Ｑ５２４Ｌ、Ｌ５２５Ｒ、Ｄ５９４Ｇ及びＶ６００Ｒからなる群から選択される少なくとも１つの変異を検出するためのプライマーオリゴヌクレオチドを提供する。該プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列においてＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異塩基を含む、塩基配列を有するＲＮＡ及び／又はＤＮＡを鋳型とするポリヌクレオチドを特異的に増幅することにより、配列番号２の塩基配列においてＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異を検出する場合がある。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜４０からなる群から選択される少なくとも１本の配列からなる場合がある。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜４０からなる群から選択される少なくとも１本の配列を含む場合がある。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、１０ないし５０個のヌクレオチド、代替的には、１５ないし４０個、あるいは、１８ないし３０個のヌクレオチドからなる場合がある。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜９のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号１０〜１４のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドの対と、配列番号１５〜１８のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号１９〜２２のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドの対と、配列番号２３〜２６のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号２７〜３０のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドの対と、配列番号３１〜３５のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号３６〜４０のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドの対とからなるプライマーオリゴヌクレオチドの対の少なくとも１対の場合がある。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜４０からなる群から選択される少なくとも１本の配列を含む場合がある。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、１０ないし５０個のヌクレオチド、代替的には、１５ないし４０個、あるいは、１８ないし３０個のヌクレオチドからなる場合がある。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号３〜９のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号１０〜１４のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドの対と、配列番号１５〜１８のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号１９〜２２のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドの対と、配列番号２３〜２６のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号２７〜３０のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドの対と、配列番号３１〜３５のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号３６〜４０のいずれか１本の配列を含むプライマーオリゴヌクレオチドの対とからなるプライマーオリゴヌクレオチドの対の少なくとも１対の場合がある。前記プライマーオリゴヌクレオチドは、その５’末端と３’末端との間にリボヌクレアーゼ酵素認識部位を含み、該リボヌクレアーゼ酵素認識部位は、ＲＮＡの連続配列であって、前記アミノ酸残基の置換を起こす突然変異塩基を含み、該リボヌクレアーゼ酵素認識部位は相補的な塩基配列を有するＤＮＡと対合してヘテロ２本鎖を形成するとき、耐熱性ＲＮａｓｅＨにより特異的に切断される場合がある。

本発明は腫瘍の治療方法を提供する。本発明の腫瘍の治療方法は、患者の生体サンプルを用いて、配列番号１のヒトＢＲＡＦタンパク質のアミノ酸配列において、Ｇ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップと、前記ヒトＢＲＡＦの突然変異が検出された患者には、ＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤であってＥＧＦＲ以外のシグナル伝達系阻害剤を含む処方を投与するステップとを含む。該ＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤であってＥＧＦＲ以外のシグナル伝達系阻害剤は、ＢＲＡＦ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤及びＰＩ３Ｋ阻害剤のうち少なくとも１種類の場合がある。前記ＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤であってＥＧＦＲ以外のシグナル伝達系阻害剤は、ＢＲＡＦ阻害剤を少なくとも含む場合がある。前記処方は、前記ＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤であってＥＧＦＲ以外のシグナル伝達系阻害剤単剤治療か、前記ＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤であってＥＧＦＲ以外のシグナル伝達系阻害剤と、フルオロウラシル、イリノテカン、フォリン酸、オキサリプラチン、カペシタビン、ロイコボリン、テガフール・ウラシル、ギメラシル、オテラシルカリウム及びトリフルリジン・チピラシル（ＴＡＳ−１０２）からなる群から選択される少なくとも１つの化学療法剤との組みあわせの場合がある。前記処方は、さらに、ＶＥＧＦ阻害剤、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ベバシズマブ、アフリベルセプト、ラムシルマブ、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４の活性を阻害する抗体、遺伝子組み換えタンパク質又は低分子薬との組みあわせの場合がある。前記処方は、さらに、ＥＧＦＲ阻害剤を含む場合がある。本発明の腫瘍の治療方法において、ヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップは、Ｇ４６９Ａ、Ｌ４８５Ｆ、Ｑ５２４Ｌ、Ｌ５２５Ｒ、Ｄ５９４Ｇ及びＶ６００Ｒからなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異を検出するステップの場合がある。

本発明の腫瘍の治療方法において、前記患者の生体サンプルを用いて、配列番号１のヒトＢＲＡＦタンパク質のアミノ酸配列において、Ｇ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップは、本発明のヒトＢＲＡＦの突然変異を検出する方法により実施される。前記患者の生体サンプルは、腫瘍組織サンプル、血液サンプル、分泌物サンプル、排泄物サンプルの場合がある。本発明の腫瘍の治療方法において、前記ヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップは、患者の生体サンプルから抽出した核酸の塩基配列のうち、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の前記少なくとも１つのアミノ酸残基の置換をコードするオリゴヌクレオチドの塩基配列を決定することを含む場合がある。前記ヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップは、患者の生体サンプルから抽出した核酸の塩基配列のうち、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の前記少なくとも１つのアミノ酸残基の置換をコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅することを含む場合がある。本発明の腫瘍の治療方法において、前記ヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップは、患者の生体サンプルから、ヒトＢＲＡＦタンパク質の前記少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含むペプチドを検出することを含む場合がある。本発明の腫瘍の治療方法において、腫瘍は大腸がんの場合がある。

本明細書において言及される全ての文献はその全体が引用により本明細書に取り込まれる。

無増悪生存期間（ＰＦＳ）のKaplan−Meier曲線。 全生存期間（ＯＳ）のKaplan−Meier曲線。 ＲＡＳ野生型対ＲＡＳ変異型（RAS W/M）のＰＦＳ及びＯＳを比較したKaplan−Meier曲線。 ＲＡＳ野生型かつＢＲＡＦ６００位野生型対ＲＡＳ野生型かつＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異型（RAS/BRAF V600E W/M）のＰＦＳ及びＯＳを比較したKaplan−Meier曲線。 ＲＡＳ野生型かつＢＲＡＦ野生型対ＲＡＳ野生型かつＢＲＡＦ変異型（RAS/BRAF W/M）のＰＦＳ及びＯＳを比較したKaplan−Meier曲線。 空ベクター（ｐＱＣＸＩＰ）と、野生型ヒトＢＲＡＦ（ＷＴ）、既知のＢＲＡＦ突然変異体（Ｖ６００Ｅ）及び本発明のＢＲＡＦ突然変異体（Ｑ５２４Ｌ及びＬ５２５Ｒ）を発現するベクターとをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞の細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分離し、ウェスタンブロッティング法で転写したメンブレンをＦｌａｇ抗体（ＦＬＡＧ）、抗ＥＲＫ抗体および抗リン酸化ＥＲＫ抗体で（ＥＲＫ及びｐＥＲＫ）で検出した結果のウェスタンブロッティング図である。図４の上段では、Ｆｌａｇタグを融合したＢＲＡＦタンパク質のバンド部分を拡大した。図４の中段及び下段では、ＥＲＫタンパク質のバンド部分を拡大した。 図５は、空ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）と、野生型ヒトＢＲＡＦ（ＷＴ）、既知のＢＲＡＦ突然変異体（Ｖ６００Ｅ）及び本発明のＢＲＡＦ突然変異体（Ｑ５２４Ｌ及びＬ５２５Ｒ）を発現するベクターとをトランスフェクションして、異なる濃度（０、０．５及び５．０μｇ／ｍＬ）のセツキシマブを添加した培地で培養したＨＥＫ２９３細胞の細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分離し、ウェスタンブロッティング法で転写したメンブレンをＦｌａｇ抗体（ＦＬＡＧ）、抗ＥＲＫ抗体および抗リン酸化ＥＲＫ抗体で（ＥＲＫ及びｐＥＲＫ）で検出した結果のウェスタンブロッティング図である。図５の上段では、Ｆｌａｇタグを融合したＢＲＡＦタンパク質のバンド部分を拡大した。図５の中段及び下段では、ＥＲＫタンパク質のバンド部分を拡大した。 図６は、空ベクター（ｐＱＣＸＩＰ）と、野生型ヒトＢＲＡＦ（ＷＴ）、既知のＢＲＡＦ突然変異体（Ｖ６００Ｅ）及び本発明のＢＲＡＦ突然変異体（Ｑ５２４Ｌ、Ｌ５２５Ｒ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｖ、Ｌ４８５Ｆ、Ｎ５８１Ｓ、Ｄ５９４Ｎ、Ｄ５９４Ｇ、Ｇ５９６Ｒ及びＶ６００Ｒ）を発現するベクターとをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞の細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分離し、ウェスタンブロッティング法で転写したメンブレンをＦｌａｇ抗体（ＦＬＡＧ）、抗ＥＲＫ抗体および抗リン酸化ＥＲＫ抗体で（ＥＲＫ及びｐＥＲＫ）で検出した結果のウェスタンブロッティング図である。図６の上段では、Ｆｌａｇタグを融合したＢＲＡＦタンパク質のバンド部分を拡大した。図６の中段及び下段では、ＥＲＫタンパク質のバンド部分を拡大した。 図７は、空ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）と、野生型ヒトＢＲＡＦ（ＷＴ）、既知のＢＲＡＦ突然変異体（Ｖ６００Ｅ）及び本発明のＢＲＡＦ突然変異体（Ｇ４６６Ｖ、Ｄ５９４Ｎ、Ｄ５９４Ｇ及びＧ５９６Ｒ）を発現するベクターとをトランスフェクションして、異なる濃度（０及び５．０μｇ／ｍＬ）のセツキシマブを添加した培地で培養したＨＥＫ２９３細胞の細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分離し、ウェスタンブロッティング法で転写したメンブレンをＦｌａｇ抗体（ＦＬＡＧ）、抗ＥＲＫ抗体および抗リン酸化ＥＲＫ抗体で（ＥＲＫ及びｐＥＲＫ）で検出した結果のウェスタンブロッティング図である。図７の上段では、Ｆｌａｇタグを融合したＢＲＡＦタンパク質のバンド部分を拡大した。図７の中段及び下段では、ＥＲＫタンパク質のバンド部分を拡大した。

本明細書に添付する配列表には、配列番号１としてヒト野生型ＢＲＡＦタンパク質のアミノ酸配列、配列番号２としてヒト野生型ＢＲＡＦｃＤＮＡの塩基配列を記載する。本明細書において、タンパク質のアミノ酸残基は、アミノ酸の１文字表記と、タンパク質のアミノ末端からのアミノ酸残基の位置との組合せで表される。例えばＶ６００は、６００位（アミノ末端から６００番目）のアミノ酸残基がバリンであることを表す。タンパク質のアミノ酸置換突然変異は、野生型タンパク質でのアミノ酸の１文字表記と、タンパク質のアミノ末端からのアミノ酸残基の位置と、変異型タンパク質で置換されたアミノ酸の１文字表記との組合せで表される。例えばＶ６００Ｅは、６００位のアミノ酸残基が野生型ではバリンであったのが、グルタミン酸に置換された突然変異を表す。なお、ヒトＢＲＡＦタンパク質の１次構造については、２０００年代前半に翻訳開始位置の特定に誤りが見つかって、アミノ酸残基の位置が１個分カルボキシル末端にシフトした。そのためＶ６００Ｅは古い文献ではＶ５９９Ｅと表記されている点に注意を要する。

本願に添付する配列表に記載の配列番号と、配列の名称と、配列の内容との関係は以下に示すとおりである。

本明細書における腫瘍は、ＢＲＡＦを発現するいずれかのがん、悪性腫瘍、悪性新生物、肉腫又は腫瘍である。本発明の方法又はキットの対象となるがんは、肺がん、胃がん、大腸がん（直腸・結腸がん）又はメラノーマの場合があるが、これらに限られない。

本明細書における治療薬は、ヒトＢＲＡＦの突然変異を検出することにより治療効果を予測することができる全ての治療薬を指し、ＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤、すなわち、ＥＧＦＲ阻害剤、ＭＥＫ阻害剤、ＰＩ３Ｋ阻害剤、ＶＥＧＦ阻害剤、ＢＲＡＦ阻害剤及びこれらのいずれかの組合せが含まれる。ＥＧＦＲ阻害剤には、セツキシマブ（Cetuximab）、パニツムマブ（Panitumumab）を含むがこれらに限られない抗ＥＧＦＲ抗体薬のほか、ゲフィチニブ（Gefitinib）、エルロチニブ（Erlotinib）、ラパチニブ（Lapatinib）、アファチニブ（Afatinib）を含むがこれらに限られないＥＧＦＲのチロシンキナーゼ阻害活性を有する抗体、組換えタンパク質、又は低分子化合物が含まれる。ＭＥＫ（ＭＡＰＫ／ＥＲＫキナーゼ）阻害剤には、トラメチニブ（Trametinib）、セルメチニブ（Selumetinib）、ＭＥＫ１６２を含むがこれらに限られないＭＥＫのキナーゼ阻害活性を有する抗体、組換えタンパク質、又は低分子化合物が含まれる。ＰＩ３Ｋ（ホスホイノシチド３−キナーゼ）阻害剤には、ペリフォシン（Perifosine）、イデラリシブ（Idelalisib）、ＢＹＬ７１９を含むがこれらに限られないホスホイノシチド３−キナーゼ阻害活性を有する抗体、組換えタンパク質、又は低分子化合物が含まれる。ＶＥＧＦ阻害剤には、ベバシズマブ（Bevacizumab）を含むがこれらに限られないＶＥＧＦ阻害活性を有する抗体、組換えタンパク質、又は低分子化合物が含まれる。ＢＲＡＦ阻害剤には、ベムラフェニブ（Vemurafenib）、ダブラフェニブ（Dabrafenib）、エンコラフェニブ（Encorafenib、ＬＧＸ−８１８）を含むがこれらに限られないＢＲＡＦキナーゼ阻害活性を有する抗体、組換えタンパク質、又は低分子化合物が含まれる。また、ＢＲＡＦ阻害剤は、ＢＲＡＦに加えて、ＡＲＡＦ及び／又はＣＲＡＦを阻害してもよい。ＥＧＦＲ阻害剤、及び／又は、ＥＧＦＲ阻害剤以外のＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤と併用される場合がある化学療法剤には、フルオロウラシル、イリノテカン、フォリン酸、オキサリプラチン、カペシタビン、ロイコボリン、テガフール・ウラシル、ギメラシル、オテラシルカリウム及びトリフルリジン・チピラシル（ＴＡＳ−１０２）が含まれるが、これらに限られない。ＥＧＦＲ阻害剤以外のＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤、及び／又は、化学療法剤は、さらに、免疫チェックポイント阻害剤、例えば、ＰＤ−１、ＰＤ−Ｌ１、ＣＴＬＡ−４の活性を阻害する抗体、組換えタンパク質、又は低分子化合物と併用される場合がある。

現在臨床現場では、ＢＲＡＦＶ６００変異により活性化されているメラノーマに対してだけでなく大腸がんに対してもＭＥＫ阻害剤が積極的に投与される場合がある。ＢＲＡＦの下流のＭＥＫを阻害することによって、生存シグナル伝達を止めることが期待されるためである。同様に、５２４、５２５、４８６、５９４位など６００位以外が置換されたＢＲＡＦ変異がんに対しても、ＭＥＫ阻害剤を投与することが有効であると考えられる。また、大腸がんにおいては、ＢＲＡＦ変異がんに対して、ＥＧＦＲ阻害剤及びＢＲＡＦ阻害剤に、ＰＩ３Ｋ阻害剤又はＭＥＫ阻害剤をさらに併用して投与されその安全性と有効性が報告されている（Van Geel,R. et al. Abstract #3514、Bendell, J.C. et al. Abstract #3515、2014 Annual Meeting of the American Society of Clinical Oncology）。大腸がんにおいては、ＥＧＦＲの発現量が多くＥＧＦＲからの生存シグナルがメラノーマと比較してより強いことから、ＰＩ３Ｋ阻害剤又はＭＥＫ阻害剤をＥＧＦＲ阻害剤及びＢＲＡＦ阻害剤とを併用することにより、治療効果があがったと考えられる。本発明が提供するヒトＢＲＡＦの体細胞突然変異を有する腫瘍についても、同様に、ＭＥＫ阻害剤とＥＧＦＲ阻害剤との併用治療が施される場合がある。

本発明において患者の生体サンプルは、腫瘍組織サンプル、体液サンプル、分泌物サンプル及び排泄物サンプルからなる群から選択される少なくとも１つのサンプルの場合がある。腫瘍組織サンプルは、患者から手術又は生検により切除された新鮮ながん組織と、該新鮮ながん組織を凍結保存した標本とを含むが、これらに限られない。またホルムアルデヒドを３７％以上含む水溶液（ホルマリン原液）を精製水で１０倍に希釈した１０％ホルマリン固定液や、リン酸バッファーで１０倍に希釈した１０％リン酸緩衝ホルマリン固定液で固定された標本であってもよい。ホルマリン固定後、常法に従ってパラフィンに包埋される場合がある。簡潔には、ホルマリン固定されたがん組織を５０〜１００％の濃度のエタノール水溶液系列に順次浸漬して脱水し、１００％エタノールに到達すると、次は、エタノールとキシレンとの混合液の系列に順次浸漬して溶媒をキシレンに置換する。その後、パラフィンのキシレン溶液の系列に順次浸漬する。パラフィンのキシレン濃度が下がると、パラフィンが融解する６０℃の恒温槽に移す。最終的に１００％パラフィンを組織に浸透させてから、パラフィンの温度を下げて固化させる方法などがあげられるが、これに限定されない。体液サンプルは、患者から採取された全血、血清、血餅、血沈、血漿、リンパ液、組織液等の体液のサンプルを含むが、これらに限られない。分泌物サンプルは、汗腺、涙腺、乳腺、唾液腺、その他の外分泌腺の分泌物と、胃液、胆汁その他の消化腺の分泌物とを含むが、これらに限られない。排泄物サンプルは、糞尿、鼻汁、喀痰、その他の排泄物を含むが、これらに限られない。

ＢＲＡＦ変異の有無は、ＢＲＡＦをコードするＤＮＡ、ＲＮＡ、及び／又はＢＲＡＦタンパク質における塩基又はアミノ酸置換の有無を確認することにより、変異の有無を確認できる。
本発明における生体組織サンプルからのＤＮＡ又はＲＮＡ抽出には、Ａｂｓｏｌｕｔｅｌｙ ＲＮＡ ＦＦＰＥ ｋｉｔ（アジレント・テクノロジー株式会社）、ＮｕｃｌｅｏＳｐｉｎ（登録商標） ＤＮＡ ＦＦＰＥ ＸＳ（ＭＡＣＨＥＲＥＹ−ＮＡＧＥＬ ＧｍｂＨ、タカラバイオ株式会社）、ＷａｘＦｒｅｅ（商標） Ｐａｒａｆｆｉｎ Ｓａｍｐｌｅ ＤＮＡ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＴｒｉｍＧｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、フナコシ株式会社）、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｅｒ ＰＳ−Ｒａｐｉｄ Ｒｅａｇｅｎｔ（和光純薬工業株式会社）その他の商業的に入手可能なキットを使用して、製造者の指示書に従って操作することによってＤＮＡ解析に供するのに十分な品質のＤＮＡを得ることができる方法があげられるが、これに限定されない。簡潔には、パラフィン包埋薄切標本をキシレン、ｄ−リモネン等の脱パラフィン剤で処理してパラフィンを溶解除去し、該脱パラフィン剤をエタノール等で洗浄した後、プロテイナーゼＫ消化により核酸を可溶化する。代替的には、界面活性剤によりパラフィン包埋薄切標本から直接核酸を可溶化する。その後、フェノール、グアニジンチオシアン酸塩等のタンパク質変性剤でタンパク質を変性させて水相から除去し、水相に残った核酸をシリカ又は樹脂で吸着分離する。生体サンプルからのＲＮＡ抽出には、ＤＮアーゼ（デオキシリボヌクレアーゼ）Ｉ等のＤＮＡ分解酵素処理が施される場合がある。

腫瘍からのタンパク質は、５２４位等を置換されたＢＲＡＦに特異的に結合する抗体を用いた蛍光 in situ ハイブリダイゼーションなどによって、変異の検出をすることができる。

本明細書において、ＢＲＡＦのＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００における変異は、配列番号１の野生型ＢＲＡＦのアミノ酸配列におけるそれぞれの箇所のアミノ酸残基と比較して、異なるアミノ酸に置換されているものを含む。したがって本明細書において、Ｇ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｑ５２４，Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００の用語には、それぞれ、Ｇ４６９Ａ、Ｌ４８５Ｆ、Ｑ５２４Ｌ、Ｌ５２５Ｒ、Ｄ５９４Ｇ及びＶ６００Ｒを含む。本明細書において、アミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異塩基とは、配列番号１の野生型ＢＲＡＦのアミノ酸残基の置換を起こす突然変異体塩基配列のうち、配列番号１の野生型ＢＲＡＦの塩基配列と異なる塩基をいう。あるアミノ酸残基の置換の有無を検出するためには、当該突然変異塩基を含む少なくとも１個、好ましくは２個又は３個分のオリゴヌクレオチドの塩基配列を決定する必要がある。本発明におけるヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異で検出されるアミノ酸残基置換は、好ましくは、Ｇ４６９Ａ、Ｌ４８５Ｆ、Ｑ５２４Ｌ、Ｌ５２５Ｒ、Ｄ５９４Ｇである。

本発明におけるヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異の検出は、Ｇ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択されるアミノ酸残基の置換突然変異があるかどうかを検出することができることを条件として、いかなるやり方で行われてもかまわない。Ｇ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００に加えて、Ａ２９、Ｈ７２、Ｓ１１３、Ｓ１２４、Ｐ１６２、Ｃ１９４、Ｌ２２７、Ｐ２３１、Ｃ２５１、Ｖ２９１、Ｑ３２９、Ｇ４６４、Ｇ４６６、Ｇ４６９、Ｖ４８３、Ｔ５２１、Ｖ５２８、Ｅ５８６、Ｄ５８７、Ｆ５９５、Ｇ５９６、Ｌ５９７、Ｐ６５５、Ｓ６５７、Ｓ６８３、Ｐ６８６、Ｃ６９６、Ｌ６９７、Ｐ７２２、Ｆ７３８及びＣ７４８を含むが、これらに限定されない、既知のヒトＢＲＡＦの置換突然変異があるかどうかを併せて検出できてもかまわない。抽出されたＤＮＡはシークエンス解析の鋳型となるＤＮＡが濃縮される場合がある。ＤＮＡの濃縮には、SureSelect XT AUTO カスタムキャプチャライブラリ(アジレント・テクノロジー株式会社)その他のキットを用いる場合がある。

前記ヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異の検出は、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換をコードするオリゴヌクレオチドの塩基配列の決定か、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換をコードするポリヌクレオチドの特異的増幅か、ヒトＢＲＡＦタンパク質の前記少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含むペプチドの検出かにより行われる場合がある。

本発明における別の態様は、ＢＲＡＦ遺伝子におけるＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００の塩基部位を含むＤＮＡを増幅するように設計されたフォワードプライマー、及びリバースプライマーを含む試薬である。プライマーの長さは、通常 １０ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは１５ｂｐ〜３５ｂｐ、さらに好ましくは１９ｂｐ〜３１ｂｐである。プライマーは、多型部分を含むＢＲＡＦ遺伝子の少なくとも一部を増幅しうるものであれば、特に制限されない。

プローブは、ＢＲＡＦ遺伝子の多型を検出することができるものであれば、特に制限されない。即ち該プローブは、例えば、野生型のＢＲＡＦ遺伝子、あるいはＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００に変異を有するＢＲＡＦ遺伝子と特異的にハイブリダイズするようなプローブである。プローブの長さは、通常１０ｂｐ〜１００ｂｐであり、好ましくは、１５ｂｐ〜３０ｂｐ、さらに好ましくは１８ｂｐ〜２４ｂｐである。特異的なハイブリダイズが可能であれば、ヌクレオチドプローブは、検出するＢＲＡＦ遺伝子を含むＤＮＡ、又は変異を有するＢＲＡＦ遺伝子に対し、完全に相補的である必要はない。

前記ヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異の検出を、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換をコードするオリゴヌクレオチドの塩基配列の決定により行う場合には、サンガー法による従来技術の核酸シーケンシング法の他、以下の実施例で使用されるとおりのイルミナ株式会社のHiSeq1500/2000/2500、MiseqやNextSeq 500、ライフテクノロジーズ社のIon PGM/Proton、ロシュ・ダイアグノスティックス株式会社のゲノムシークエンサーFLX等の次世代シーケンシングシステムが用いられる場合がある。がん組織標本から抽出・精製された鋳型ＤＮＡは、製造者の指示書に従って、各製造者が用意する試薬キットで処理され、配列決定機器に装架される。塩基配列の決定によるヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異の検出は、タンパク質全長の全てのアミノ酸置換突然変異を検出できる利点があるが、特定の体細胞突然変異を起こした細胞ががん組織中に占める割合が少ないと検出できないという検出感度の問題がある。

前記ヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異の検出を、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換をコードするポリヌクレオチドの特異的合成により行う場合には、それぞれのアミノ酸残基の位置ごとにプライマーやプローブ等の検出用オリゴヌクレオチドを用意する必要がある。前記ポリヌクレオチドの特異的合成が生体サンプルから抽出されたＲＮＡを鋳型とする場合には、ＲＮＡ依存ＲＮＡ合成酵素又はＲＮＡ依存ＤＮＡ合成酵素（逆転写酵素）が用いられる。前記ポリヌクレオチドの特異的合成が生体サンプルから抽出されたＤＮＡを鋳型とする場合には、ＤＮＡ依存ＤＮＡ合成酵素、あるいは、ＤＮＡ依存ＲＮＡ合成酵素が用いられる。該検出用オリゴヌクレオチドの配列は、前記置換アミノ酸をコードするオリゴヌクレオチドを含むか、あるいは、該オリゴヌクレオチドを１対のプライマーが挟むように配列番号２の塩基配列から選択される場合がある。

前記ヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異の検出を、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の少なくとも１つのアミノ酸残基の置換をコードするポリヌクレオチドの全部または一部を増幅し、プローブオリゴヌクレオチドによって検出する場合は、該オリゴヌクレオチドを１対のプライマーが挟むように配列番号２の塩基配列から選択される場合がある。

前記検出用オリゴヌクレオチドは、本発明の患者の生体サンプル中のＤＮＡ又はＲＮＡと特異的に雑種形成を起こすことを条件として、いかなる長さであっても、いかなる天然ヌクレオチド又はヌクレオチド類似体を含むものであってもかまわない。前記検出用オリゴヌクレオチドはヌクレオチドが少なくとも１２、１３、１４、１５、１６、１７個又は１８個の長さの場合がある。また、塩基配列の決定により行う場合に比べて検出感度が高い方法で行ってもよい。パイロシーケンシング法、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ、ＢＥＡＭｉｎｇ技術、リアルタイムＰＣＲ、ｒｈＰＣＲ法等が利用可能である。

本明細書において、「検出用オリゴヌクレオチドが、本発明の患者の生体サンプル中のＤＮＡ又はＲＮＡと特異的に雑種形成を起こす」とは、以下の実験系で決定される。本発明の患者の生体サンプル中のＤＮＡ又はＲＮＡを、直接に、あるいは、アガロース電気泳動により分子量に応じて分離したうえで、毛管現象又は電気泳動によりニトロセルロースフィルターその他の固相に不動化する。該固相に不動化された患者の生体サンプル中のＤＮＡ又はＲＮＡと同じモル数の前記検出用オリゴヌクレオチドが不動化された固相を陰性対照とし、前記検出用オリゴヌクレオチドと相補的なヌクレオチド配列のオリゴヌクレオチドを患者の生体サンプル中のＤＮＡ又はＲＮＡと同じモル数で不動化された固相を陽性対照とする。これらの固相をストリンジェントな条件で雑種形成させる。ここで「ストリンジェントな条件」とは、Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｊ．及びＲｕｓｓｅｌｌ、Ｄ．Ｗ．、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ ３ｒｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（２００１）に説明される以下の実験条件で行うことを指す。６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液で前洗浄する。前記検出用オリゴヌクレオチドを放射性同位元素その他の標識物質で標識したプローブと前記固相に不動化されたＤＮＡ、ＲＮＡ又はオリゴヌクレオチドとの間のハイブリダイゼーション反応を６× ＳＳＣ及び０．２％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、終夜行う。その後前記固相を１× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄し、０．２× ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳからなる溶液中で６５°Ｃ、各３０分ずつ２回洗浄する。最後に前記固相に残存するプローブの量を前記標識物質の定量により決定する。「前記検出用オリゴヌクレオチドが、本発明の患者の生体サンプル中のＤＮＡ又はＲＮＡと特異的に雑種形成を起こす」とは、本発明の患者の生体サンプル中のＤＮＡ又はＲＮＡを不動化した固相に残存するプローブの量と陰性対照の固相に残存するプローブの量との差が、前記陽性対照の固相に残存するプローブの量と陰性対照の固相に残存するプローブの量との差の、少なくとも２５％、又は、少なくとも５０％、、又は、少なくとも７５％以上であることを指す。

本明細書において、「抗体」には、いずれかの動物の免疫グロブリンＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＥ、ＩｇＡ及びＩｇＤを含む。「抗体の断片」には、いずれかの動物の免疫グロブリンの抗原結合部分、すなわち、軽鎖及び／又は重鎖の可変領域自体か、軽鎖及び／又は重鎖の可変領域を含むＦａｂ断片及び／又はＦ（ａｂ’）_２断片か、ラクダ科動物の単一ドメイン抗体（ナノボディ）かを含む。「抗体」には、前記抗体の断片を含む融合タンパク質である２重特異的抗体又は多価抗体を含む。

本明細書において、「本発明の単離ヒトＢＲＡＦの体細胞突然変異タンパク質又はその単離ペプチド断片に特異的に結合する」とは、同じ量のヒト野生型ＢＲＡＦタンパク質又は体細胞突然変異タンパク質を不動化した固相をブロッキングし、同一濃度の抗体又は抗体断片と反応させ、さらに該抗体又は抗原断片に対する標識２次抗体と反応させて、ヒト野生型ＢＲＡＦタンパク質又は体細胞突然変異タンパク質を不動化した固相に結合した前記抗体又は抗原断片の量を比較したとき、体細胞突然変異タンパク質を不動化した固相に結合した前記抗体又は抗原断片の量が、ヒト野生型ＢＲＡＦタンパク質又は他の体細胞突然変異タンパク質を不動化した固相に結合した前記抗体又は抗原断片の量より２倍、又は、５倍、又は、１０倍多いことを指す。

Ｌｕｍｉｎｅｘ（登録商標）システムを利用したｘＭＡＰ（登録商標）テクノロジーのような蛍光マイクロビーズを使った多項目同時測定技術が利用可能である。当該技術では、測定試料（ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ：Ｆｏｒｍａｌｉｎ−Ｆｉｘｅｄ Ｐａｒａｆｆｉｎ−Ｅｍｂｅｄｄｅｄ）組織又は新鮮凍結組織）から抽出したゲノムＤＮＡを検体として、ビオチン標識プライマーを含むマスターミックスとＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼによりヒトＢＲＡＦ遺伝子のＧ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００を含む領域をＰＣＲ増幅させる。前記領域に加えて、Ａ２９、Ｈ７２、Ｓ１１３、Ｓ１２４、Ｐ１６２、Ｃ１９４、Ｌ２２７、Ｐ２３１、Ｃ２５１、Ｖ２９１、Ｑ３２９、Ｇ４６４、Ｇ４６６、Ｇ４６９、Ｖ４８３、Ｔ５２１、Ｖ５２８、Ｅ５８６、Ｄ５８７、Ｆ５９５、Ｇ５９６、Ｌ５９７、Ｐ６５５、Ｓ６５７、Ｓ６８３、Ｐ６８６、Ｃ６９６、Ｌ６９７、Ｐ７２２、Ｆ７３８及びＣ７４８を含むが、これらに限定されない、既知のヒトＢＲＡＦのアミノ酸置換突然変異を含む領域をＰＣＲ増幅させる場合もある。ハイブリダイゼーション緩衝液中にてＰＣＲ増幅産物とビーズミックスを反応させ、ビーズミックスに含まれる蛍光ビーズ上のプローブとＰＣＲ増幅産物をハイブリダイズさせる。ビーズミックスには、野生型（ＷＴ）ビーズと前記アミノ酸置換を伴う突然変異塩基を含むオリゴヌクレオチドに対応するプローブを固相した変異型ビーズが含まれる場合がある。また、ＢＲＡＦ遺伝子の突然変異塩基以外の領域と相補的なプローブを対照として用いることもできる。ビーズを洗浄後、リン酸緩衝液中にて蛍光標識タンパク質、例えば、ＳＡ−ＰＥ（フィコエリスリン標識ストレプトアビジン）とビーズ・ＰＣＲ増幅産物複合体を反応させ、ＰＣＲ増幅産物を蛍光標識する。フローサイトメトリーの原理を利用したＬｕｍｉｎｅｘ １００／２００ システムにより、ビーズと前記蛍光標識タンパク質の蛍光を測定し、ヒトＢＲＡＦ遺伝子のアミノ酸置換突然変異を検出する。

本発明のヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異の検出には、配列番号３ないし１１の塩基配列からなるか、あるいは、配列番号３ないし１１の塩基配列を含むプライマーが用いられる場合がある。配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１１、及び、配列番号１０及び１１の塩基配列からなるプライマーの対から選択される少なくとも１対のプライマーか、あるいは、配列番号３及び４、配列番号５及び６、配列番号７及び８、配列番号９及び１１、及び、配列番号１０及び１１の塩基配列を含むプライマーの対から選択される少なくとも１対のプライマーが用いられる場合がある。本発明のヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異の検出には、配列番号１２ないし８４の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１種類の塩基配列からなるプローブか、あるいは、配列番号１２ないし８４の塩基配列からなる群から選択される少なくとも１種類の塩基配列を含むプローブかが用いられる場合がある。

前記ヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異の検出を、ヒトＢＲＡＦタンパク質の前記少なくとも１つのアミノ酸残基の置換を含むペプチドの検出により行う場合には、Ｇ４６９、Ｌ４８５、Ｑ５２４、Ｌ５２５、Ｄ５９４及びＶ６００からなる群から選択される少なくとも１つのアミノ酸残基が置換したヒトＢＲＡＦタンパク質に特異的に結合する抗体が用いられる場合がある。該抗体は、蛍光in situハイブリダイゼーション法、ＨＲＰ重合ポリマー結合２次抗体法その他の高感度な抗体検出法により検出される場合がある。質量分析イメージング技術その他の微量生体サンプルの質量分析により、前記アミノ酸残基が置換したＢＲＡＦタンパク質の断片ペプチドが検出される場合もある。

本発明の腫瘍の治療方法において、前記ヒトＢＲＡＦの突然変異が検出された患者には、ＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤であってＥＧＦＲ以外のシグナル伝達系阻害剤を含む処方を投与するステップでは、ＢＲＡＦ阻害剤エンコラフェニブ（Encorafenib、ＬＧＸ８１８）及びセツキシマブ（Cetuximab）か、ＢＲＡＦ阻害剤エンコラフェニブ（Encorafenib、ＬＧＸ８１８）、セツキシマブ（Cetuximab）及びＰＩ３Ｋ阻害剤ＢＹＬ７１９（ＧＳＫ２１２）か、ＢＲＡＦ阻害剤ダブラフェニブ（Dabrafenib）及びパニツムマブ（Panitumumab）か、ＢＲＡＦ阻害剤ダブラフェニブ（Dabrafenib）、パニツムマブ（Panitumumab）及びＭＥＫ阻害剤トラメチニブ（Trametinib）か、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ（Infusional 5−FU+LV+IRI+OX）か、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ及びベバシズマブ（Bevacizumab）かを含むが、これらに限られない処方を投与する場合がある。具体的な推奨用量は、当業者に周知であり、以下に推奨用量の例を挙げるが、これらに限定されない。ＢＲＡＦ阻害剤エンコラフェニブ（Encorafenib、ＬＧＸ８１８）：２５０ｍｇ。セツキシマブ（Cetuximab）：初回のみ４００ｍｇ／ｍ^２、１２０分以上かけて点滴静注、その後は２５０ｍｇ／ｍ^２、６０分以上かけて点滴静注。ＢＹＬ７１９：２５０ｍｇ／日。ダブラフェニブ（Dabrafenib）：１５０ｍｇ／日。パニツムマブ（Panitumumab）：１回６ｍｇ／ｋｇ（体重）を６０分以上かけて点滴静注。トラメチニブ（Trametinib）：２ｍｇ。ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ：イリノテカン１６５ｍｇ／ｍ^２、オキサリプラチン８５ｍｇ／ｍ^２、オキサリプラチンと同時にＬ−ロイコボリンｍｇ／ｍ^２、５−フルオロウラシル３，２００ｍｇ／ｍ^２、を点滴静注、２週ごとに繰り返す。ベバシズマブ（Bevacizumab）５ｍｇ／ｋｇ。なお個々の患者への実際の用量は、推奨用量に向けて漸増しながら、用量制限毒性により決定される。これらの処方の他、ＦＯＬＦＯＸ、ＣａｐｅＯＸ、ＦＯＬＦＩＲＩ、ＦＬ及び／又はＣａｐｅとベバシズマブ（Bevacizumab）との併用処方や、ＵＦＴ＋ＬＶ、ＩＲＩＳ、ＩＲＩ、ＴＡＳ−１０２等との併用処方を投与する場合もある。

以下に説明する本発明の実施例は例示のみを目的とし、本発明の技術的範囲を限定するものではない。本発明の技術的範囲は特許請求の範囲の記載によってのみ限定される。本発明の趣旨を逸脱しないことを条件として、本発明の変更、例えば、本発明の構成要件の追加、削除及び置換を行うことができる。

１．１ ＢＲＥＡＣ試験の対象患者
網羅的遺伝子解析技術を用いた抗ＥＧＦＲ抗体薬治療効果予測バイオマーカーの探索研究に関する多施設共同研究（Biomarker Research for Anti−EGFR Monoclonal Antibodies by Comprehensive Cancer Genomics、以下、「ＢＲＥＡＣ試験」という。）では、2010年6月から2011年11月に抗EGFR抗体薬を含む治療を受けた大腸がんの症例のうち、以下の適格基準を満たし、以下の除外基準に該当しない１８４例を解析対象とした。本解析の対象は、実地臨床で抗ＥＧＦＲ抗体薬を投与された症例であり、治療が有効であった群から無効であった群を含む連続的な症例である。

ＢＲＥＡＣ試験の適格基準
（１）組織学的に大腸原発の腺がんと確認されている
（２）切除不能・進行再発大腸がんである
（３）ＫＲＡＳ遺伝子型が野生型である又は不明（治療開始後の判明でも可能）
（４）治療開始前４２日以内にベースラインのＣＴ検査を行っている
（５）測定可能な病変を少なくとも１つ以上有する
（６）２０１０年６月から各施設倫理審査委員会承認日までにセツキシマブあるいはパニツムマブを含む治療を受けた
（７）セツキシマブあるいはパニツムマブを含む治療開始後３ヶ月以内に、少なくとも１回以上の画像診断を受けた
（８）フルオロピリミジン不応性又は再投与困難
（９）イリノテカン不応性
（１０）オキサリプラチン不応性又は再投与困難
（１１）年齢２０歳以上
（１２）ＰＳ：０〜２（ECOG performance status score）
（１３）セツキシマブ又はパニツムマブの投与直前の検査で下記のように主要臓器機能が保持されている
（ｉ）白血球数： ２，０００／ｍｍ^３以上１２，０００／ｍｍ^３未満
（ｉｉ）血小板数：≧７５，０００／ｍｍ^３
（ｉｉｉ）ヘモグロビン：≧８．０ｇ／ｄＬ
（ｉｖ）血清総ビリルビン：≦施設正常値上限（ＵＬＮ）の３倍
（ｖ）ＡＳＴ（ＧＯＴ）及びＡＬＴ（ＧＰＴ）：≦施設正常値上限（ＵＬＮ）の３倍（肝転移を有する症例は５倍以下とする）
（ｖｉ）血清クレアチニン：≦施設正常値上限（ＵＬＮ）の２倍
（１４）十分なホルマリン固定パラフィン包埋組織標本（以下、「ＦＦＰＥ標本」という。）があること
（１５）セツキシマブ単独或いはイリノテカンベースの化学療法にセツキシマブを併用した、あるいはパニツムマブ単独或いはイリノテカンベースの化学療法にパニツムマブを併用した、いずれかの治療を受けた患者

ＢＲＥＡＣ試験の除外基準
セツキシマブ又はパニツムマブを含む治療前の検査で下記の除外基準を満たすものを、除外する。
（１）活動性の重複がんを有する
（２）重篤な感染症を合併している
（３）処置が必要な体腔液（胸、腹水及び心嚢水など）を有する
（４）間質性肺炎又はその既往歴及び肺線維症を有する
（５）その他、担当医師が本研究の対象として不適当と判断した症例
（６）試料等を研究に利用することを文書等で拒否している

１．２ ターゲットシーケンス解析
ＢＲＥＡＣ試験に参加する各施設の倫理審査委員会の承認（国立がん研究センター倫理審査委員会の承認番号：2011−137）の下、文書による同意を得た患者の大腸がんのホルマリン固定パラフィン包埋組織から、アジレント・テクノロジー株式会社が提供するプロトコールでＤＮＡを抽出した。抽出されたＤＮＡは、任意の遺伝子領域をハイブリダイズするSureSelect XT AUTO カスタムキャプチャライブラリ(アジレント・テクノロジー株式会社)を用いて、シークエンス解析の鋳型となるＤＮＡが濃縮された。カスタムライブラリにはＢＲＡＦ遺伝子、ＫＲＡＳ遺伝子、ＮＲＡＳ遺伝子のコーディングエクソンすべてが含まれていた。TruSeq PE Cluster Kit v3−cBot−HS（イルミナ株式会社）を用いて、ＤＮＡクラスターが作成された。該ＤＮＡクラスターが、HiSeq1500（イルミナ株式会社）においてTruSeq SBS Kit v3−HS（イルミナ株式会社）を用いる塩基配列決定に供された。

１．３ 統計解析の対象となる患者の臨床背景
最終的に基準を満たし、塩基配列を決定することが可能であった１５０例を対象として、抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果と相関する遺伝子変異を探索した。
１５０例の臨床背景は、男性８７例及び女性６３例、年齢中央値が６３．５歳（２８−８５歳）、performance statuｓが０、１及び２の症例数は、それぞれ、８１、６５及び４例であり、セツキシマブ又はパニツムマブを投与された症例は、それぞれ、１０６又は４４例であった。また、無増悪生存期間（Progression Free Survival、以下、「ＰＦＳ」という。）中央値は４．０ヶ月、全生存期間（Overall Survival、以下、「ＯＳ」という。）中央値は１２．４ヶ月、奏効率（Response Rate、以下、「ＲＲ」という。）は２１％であった。

１．４ ＢＲＡＦ遺伝子変異
ＢＲＡＦ遺伝子は、大腸がんではＶ６００Ｅ変異が主要な変異であることが知られており、本試験においてもＶ６００Ｅ変異は９例（６．０％）から検出された。さらにＶ６００Ｅ以外の変異（Ｇ４６９Ａ（１例）、Ｌ４８５Ｆ（１例）、Ｑ５２４Ｌ（１例）、Ｌ５２５Ｒ（１例）、Ｄ５９４Ｇ（２例）、Ｖ６００Ｒ（１例））が合計７例（４．７％）から検出された。

１．５ ＢＲＡＦ遺伝子変異と抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果
以下、本明細書で示す解析結果は、十分な追跡期間が終了した後の、成熟したＰＦＳ及びＯＳに対するものである。
（ｉ）ＲＡＳ野生型（ＲＡＳ Ｗ）対ＲＡＳ変異型（ＲＡＳ Ｍ、図１、２における薄灰色の実線対破線）」、
（ｉｉ）「ＲＡＳ／ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ野生型（ＲＡＳ／ＢＲＡＦ Ｗ）対ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異型（ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ Ｍ、図１、２における黒の実線対破線）」、及び
（ｉｉｉ）「ＲＡＳ／ＢＲＡＦ野生型（ＲＡＳ／ＢＲＡＦ Ｗ）対ＢＲＡＦのその他の突然変異（Ｇ４６９Ａ、Ｌ４８５Ｆ、Ｑ５２４Ｌ、Ｌ５２５Ｒ、Ｄ５９４Ｇ及びＶ６００Ｒ）とを含むＢＲＡＦ変異型（ＢＲＡＦ Ｏｔｈｅｒ Ｍ、図１、２における濃灰色の実線対破線）」の３通りの分類と有効性エンドポイント（ＰＦＳ、ＯＳ、奏効割合（response rate、以下「ＲＲ」という。）、病勢制御率（disease control rate、以下、「ＤＣＲ」という。）等）の関連について統計学的な検討を行った。

なお、ＲＡＳ野生型（ＲＡＳ Ｗ）とは、ＫＲＡＳ及びＮＲＡＳのいずれにも体細胞突然変異が検出されない腫瘍を意味する。ＲＡＳ変異型（ＲＡＳ Ｍ）とは、１２位、１３位、５９位、６１位、１１７位又は１４６位のアミノ酸残基が置換する体細胞突然変異がＫＲＡＳ又はＮＲＡＳの少なくともいずれか１つに検出される腫瘍を意味する。ＲＡＳ／ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ野生型（ＲＡＳ／ＢＲＡＦ Ｗ）とは、ＲＡＳ野生型かつＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異がない腫瘍を意味する。ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異型（ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ Ｍ）とは、ＲＡＳ野生型かつＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異がある腫瘍を意味する。ＲＡＳ／ＢＲＡＦ野生型（ＲＡＳ／ＢＲＡＦ Ｗ）とは、ＲＡＳ野生型かつＢＲＡＦに体細胞突然変異がない腫瘍を意味する。ＢＲＡＦのその他の突然変異（ＢＲＡＦ Ｏｔｈｅｒ Ｍ）とは、ＲＡＳ野生型かつＢＲＡＦ Ｇ４６９Ａ、Ｌ４８５Ｆ、Ｑ５２４Ｌ、 Ｌ５２５Ｒ、Ｄ５９４Ｇ又はＶ６００Ｒのいずれかに体細胞突然変異がある腫瘍を意味する。

1.5.1 無増悪生存期間（ＰＦＳ）の解析結果
図1にＰＦＳのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を示した。変異型の患者集団のＰＦＳ（破線）及び野生型の患者集団のＰＦＳ（実線）はいずれの分類においても同等であった。従来から抗ＥＧＦＲ抗体薬の無効因子として知られているＲＡＳ変異型の患者集団と同様、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異型と、ＢＲＡＦのその他の変異型との患者集団は、抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果が期待できない可能性が示唆された。

1.5.2 全生存期間（ＯＳ）の解析結果
図2にＯＳのＫａｐｌａｎ−Ｍｅｉｅｒ曲線を示した。変異型の患者集団（破線）においては、ＰＦＳと異なり、ＢＲＡＦのその他の変異型（濃灰色破線）において予後良好の傾向を示した。野生型の患者集団の予後はいずれの分類においても同等であった。特に、ＲＡＳ／ＢＲＡＦ野生型に集団を限定した場合、程度は弱いものの、ＯＳは改善の傾向を示した。

1.5.3 奏効率、病勢制御率、腫瘍縮小率、ＰＦＳ及びＯＳの中央値の解析結果
表２に、固形がんの治療効果判定のためのガイドライン（response evaluation criteria in solid tumours）改訂版（バージョン１．１、Eisenhauer, E.A.ら、Eur J Cancer 45 (2009) 228−247））による治療への反応の定義を示す。

それぞれＢＲＡＦ遺伝子に変異があった患者における変異型と、その患者の最良の反応を表３に示す。

表４に、奏効率（ＲＲ）、病勢制御率（ＤＣＲ）、腫瘍縮小率（％ｓｈｒｉｎｋ）、ＰＦＳ及びＯＳの中央値の解析結果を示す。ここで奏効率（ＲＲ）とは、ある治療に対する反応がＣＲ及びＰＲであった症例の百分率をいう。また病勢制御率（ＤＣＲ）とは、ある治療に対する反応がＣＲ、ＰＲ及びＳＤであった症例の百分率をいう。ＤＣＲにはＳＤ症例（ベースラインから２０％未満の腫瘍増大）が含まれるため、単純に腫瘍が縮小した割合に対する解析も行った。

^*1：腫瘍が増大しなかった症例の割合（全く縮小しなかった症例を含む）
^*2：腫瘍が一度でも縮小した症例の割合（全く縮小しなかった症例を含まない）

表４において、奏効率（ＲＲ）はＢＲＡＦ Ｖ６００ＥとＢＲＡＦその他変異型とも０％であり、抗ＥＧＦＲ抗体薬による完全奏効が確認できなかった。病勢制御率（ＤＣＲ）は、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異型で２２．２％、ＢＲＡＦのその他の変異型で７１．４％であった。腫瘍が増大しなかった症例（腫瘍の大きさが変わらない、つまり全く縮小しなかった症例も含む）を示す「％shrink^*1」の割合は、それぞれＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異型で２２．２％、ＢＲＡＦのその他の変異型で２８．６％であった。腫瘍が一度でも縮小した症例（「％shrink*1」から全く縮小しなかった症例を除外）を示す「％shrink^*2」の割合は、それぞれＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異型で１１．１％、ＢＲＡＦのその他の変異型で２８．６％であった（図３）。以上の結果から、腫瘍縮小という観点で評価した場合においても、ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異型と、ＢＲＡＦのその他の変異型（Ｇ４６９Ａ、Ｌ４８５Ｆ、Ｑ５２４Ｌ、Ｌ５２５Ｒ、Ｄ５９４Ｇ及びＶ６００Ｒ）を含むＢＲＡＦ変異型患者集団の除外が有効性の改善に寄与することが確認された。

1.5.4 各遺伝子変異の有無によるＰＦＳ及びＯＳの解析
図３Ａは、ＲＡＳ野生型対ＲＡＳ変異型（ＲＡＳ Ｗ／Ｍ）のＰＦＳ及びＯＳを比較したKaplan−Meier曲線を示す。ログランク検定のＰ値は、それぞれ、０．０１％未満又は０．０２％であった。図３Ｂは、ＲＡＳ野生型かつＢＲＡＦ６００位野生型対ＲＡＳ変異型又はＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ変異型（ＲＡＳ／ＢＲＡＦ Ｖ６００Ｅ Ｗ／Ｍ）のＰＦＳ及びＯＳを比較したKaplan−Meier曲線を示す。ログランク検定のＰ値は、それぞれ、０．０１％未満又は０．０１％であった。図３Ｃは、ＲＡＳ野生型かつＢＲＡＦ野生型対ＲＡＳ変異型又はＢＲＡＦ変異型（RAS/BRAF W/M）のＰＦＳ及びＯＳを比較したKaplan−Meier曲線を示す。ログランク検定のＰ値は、いずれも０．０１％未満であった。図３Ａ、Ｂ及びＣのいずれにおいても、ログランク検定のＰ値は有意水準５％で統計学的に有意な関連を示した。

1.5.5 各遺伝子変異の有無によるPFS、OSのハザード比
これまでの結果はKaplan−Meier曲線やログランク検定に基づく、単変量的なアプローチによる検討であった。ＰＦＳ又はＯＳに関連する背景因子が両群間で偏る場合、上記で認められた傾向はアーチファクトである可能性（交絡が生じている可能性）がある。そこで、ＰＦＳ及びＯＳについては、以下の表５に記載した背景因子を調整したCoxの比例ハザードモデルを適用し、交絡を調整した場合の、３分類によるハザード比を推定した（表５の第３列「Multivariate Cox」を参照）。いずれにおいても、ハザード比の９５％信頼区間の下限が１を上回っており、変異型の患者集団が予後不良の傾向を示した。

これまでに示した解析結果は、ＢＲＡＦのＶ６００Ｅ変異型と、ＢＲＡＦのその他の変異型（Ｇ４６９Ａ、Ｌ４８５Ｆ、Ｑ５２４Ｌ、Ｌ５２５Ｒ、Ｄ５９４Ｇ及びＶ６００Ｒからなる群から選択される少なくとも１種類）とが、抗ＥＧＦＲ抗体薬治療効果予測マーカーであることを示している。

１．６ ＢＲＡＦ遺伝子変異の機能
Roskoski Jr, R.（Biochemical and Biophysical Research Communications 399: 313−317 (2010)）によれば今回検出されたＢＲＡＦ遺伝子変異は、すべてタンパク質キナーゼドメインに存在する（４５７−７１７位）。Ｖ６００Ｅ変異は活性化変異として知られており、Ｖ６００Ｒ、Ｇ４６９Ａ変異も活性化変異であることが知られている。コドン４６９， ５９４， ６００は、活性に重要なＰ−ｌｏｏｐ（４６４−４６９）やＤＦＧ ｍｏｔｉｆ／ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ ｓｅｇｍｅｎｔ （５９４−６００） に存在しており、立体構造上は近い位置にある。一方、コドン４８５、５２４及び５２５はこれらの領域から外れており、既知のヒトＢＲＡＦタンパク質の構造及び機能についての知識から抗ＥＧＦＲ抗体薬の治療効果との関連は予測できない。

ヒト培養細胞における一過性発現系によるＢＲＡＦ変異タンパク質の機能解析
２．１ ＨＥＫ２９３細胞で発現されたＢＲＡＦ変異タンパク質の細胞増殖促進シグナル伝達系への影響（１）
ＥＧＦがＥＧＦＲに結合して発生する細胞増殖促進シグナルは、ＫＲＡＳおよび／またはＮＲＡＳを介してＢＲＡＦに伝達され、ＢＲＡＦを活性化する。活性化されたＢＲＡＦはＥＲＫ（細胞外シグナル調節キナーゼ、Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ Ｓｉｇｎａｌ−Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｋｉｎａｓｅ）を活性化することでさらに下流に細胞増殖促進シグナルを伝達する。そこで本実験では、ＢＲＥＡＣ試験で検出されたＢＲＡＦ変異タンパク質がヒト細胞において細胞増殖促進シグナルをＢＲＡＦの下流のＥＲＫに伝達できるかどうかをＢＲＡＦ変異タンパク質の一過性発現系で検討した。

２．１．１ 材料及び方法
本実験では以下の試薬が用いられた。
ＯｐｔｉＭＥＭ （Ｇｉｂｃｏ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社 ３１９８５−０６２）
ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ トランスフェクション試薬（プロメガ株式会社、 Ｅ２３１３）
ダルベッコ変法イーグル培地（ＤＭＥＭ、Ｇｉｂｃｏ、ライフテクノロジーズジャパン株式会社 １１８８５−０８４）
プロテアーゼ阻害剤カクテル （シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社、 Ｐ８３４０）
ＢＣＡ タンパク質アッセイキット（Ｐｉｅｒｃｅ、サーモフィッシャーサイエンティフィック株式会社、 ＃２３２２５）
ＳｕｐｅｒＳｅｐ Ａｃｅ （５−２０％） （和光純薬工業株式会社、１９４−１５０２１）
プレシジョン Ｐｌｕｓ プロテイン（商標）２色スタンダード（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社、１６１−０３７４）
トランスブロット（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）ミニ ＰＶＤＦ 転写パック（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社、 ＃１７０−４１５６）
抗ＦＬＡＧマウスモノクローナル抗体（シグマ アルドリッチ ジャパン合同会社、 Ａ８５９２）
抗ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ （ＥＲＫ１／２）ウサギ抗体（ＣＳＴジャパン株式会社、 ＃４６９５）
抗リン酸化ｐ４４／４２ ＭＡＰＫ（ＥＲＫ１／２）ウサギ抗体（ＣＳＴジャパン株式会社、 ＃４３７０）
抗ウサギ抗体ＨＲＰ結合ヤギ抗体（ＣＳＴジャパン株式会社、 ＃７０７４）
抗マウス抗体ＨＲＰ結合ウマ抗体（ＣＳＴジャパン株式会社、 ＃７０７６）
ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬（Ａｍｅｒｓｈａｍ、ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）

本発明のＢＲＡＦ変異タンパク質を発現するためのベクターは、自己不活性化タイプレトロウイルスベクターのｐＱＣＸＩＰ（クロンテック、タカラバイオ株式会社、６３１５１６）で、これは、ＦＬＡＧタグを融合したＢＲＡＦの野生型又は突然変異体遺伝子と、ピューロマイシン耐性遺伝子とをＣＭＶＩＥプロモーターで駆動する。ＢＲＡＦ発現コンストラクトの作成は、製造者の指示書に従って行った。

ヒト胎児腎細胞ＨＥＫ２９３はＪＣＲＢ細胞バンクから入手した。６穴マルチウェルプレートにＨＥＫ２９３細胞を各ウェルあたり５×１０^５個播種した。３７°Ｃ、５％ＣＯ_２、飽和湿度条件下で終夜培養し、表６に列挙した濃度のプラスミドＤＮＡの１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ及び１ｍＭＥＤＴＡバッファー（ＴＥバッファー、ｐＨ８．０）溶液を用意して、トランスフェクション試薬及びＤＮＡの複合体溶液を表７の組成で調製した。前記ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ トランスフェクション試薬の製造者の指示書に従って前記複合体溶液を各ウェルあたり１５０μＬ添加して、６時間培養した。

前記複合体溶液中で６時間の培養後、培地を交換しさらに２４時間培養を行い、その後以下の細胞溶解バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１％ ＮＰ−４０、０．５％ デオキシコール酸ナトリウム、０．５％ ＳＤＳ、１５０ ｍＭ ＮａＣｌ、２ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭ ＮａＦ、１％プロテアーゼ阻害剤カクテル及び１ｍＭ オルトバナジウム酸ナトリウム、ｐＨ６．８）で溶解、Ｐｉｅｒｃｅ ＢＣＡ タンパク質アッセイキットによりタンパク定量を行い、ＳＤＳ−ＰＡＧＥサンプルを調製した。

製造者の指示書に従い、各レーンあたりタンパク質１０μgのサンプルをプレキャストゲルＳｕｐｅｒＳｅｐ Ａｃｅに懸架して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動終了後、トランスブロット（登録商標）Ｔｕｒｂｏ（商標）転写システム（バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社、 ＃１７０４１５０Ｊ１）を使用し、添付のプロトコールに従い、ウェスタンブロッティングを行った。ブロッティング終了後のＰＶＤＦ メンブレンは、５％ スキムミルクを添加したＴＢＳ（ｐＨ７．４）で３０分間ブロッキングした後、５％ ＢＳＡを添加したＴＢＳ（ｐＨ７．４）で１０００倍に希釈した一次抗体と４°Ｃ終夜反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したＴＢＳでメンブレンを３回洗浄後、５％ ＢＳＡを添加したＴＢＳで２０００倍に希釈した２次抗体を室温で１時間反応させた。０．０５％ Ｔｗｅｅｎ−２０を添加したＴＢＳでメンブレンを３回洗浄後、ＥＣＬウェスタンブロッティング検出試薬により検出を行った。検出にはＩｍａｇｅ Ｑｕａｎｔ ＬＡＳ４０００ ｍｉｎｉ（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社）を使用した。

２．１．２ 結果
図４は、空ベクター（ｐＱＣＸＩＰ）と、野生型ヒトＢＲＡＦ（ＷＴ）、既知のＢＲＡＦ突然変異体（Ｖ６００Ｅ）及び本発明のＢＲＡＦ突然変異体（Ｑ５２４Ｌ及びＬ５２５Ｒ）を発現するベクターとをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞の細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分離し、ウェスタンブロッティング法で転写したメンブレンをＦｌａｇ抗体（ＦＬＡＧ）、抗ＥＲＫ抗体および抗リン酸化ＥＲＫ抗体で（ＥＲＫ及びｐＥＲＫ）で検出した結果のウェスタンブロッティング図である。図４の上段では、Ｆｌａｇタグを融合したＢＲＡＦタンパク質のバンド部分を拡大した。図４の中段及び下段では、ＥＲＫタンパク質のバンド部分を拡大した。図４の上段に示すとおり、空ベクター導入細胞を除くＢＲＡＦ導入した細胞のサンプルでは、ＢＲＡＦタンパク質（８０ｋＤａ）に相当するサイズのバンドに抗体が反応した。また図４の下段に示すとおり、空ベクター導入細胞のサンプルと、全てのＢＲＡＦを導入した細胞のサンプルとで、ＥＲＫタンパク質（４４ｋＤａ）に相当するサイズのバンドに抗体が反応した。全てのサンプルでバンドのデンシティがほぼ同じであったことから、トランスフェクション及びＢＲＡＦの発現はＥＲＫタンパク質の発現には影響を与えなかった。しかし図４の中段に示すとおり、ＢＲＡＦ発現細胞のサンプルでは、リン酸化ＥＲＫのバンドのデンシティは図４の上段のＢＲＡＦバンドのデンシティに対応していた。そこで、本実験で細胞に導入されたＢＲＡＦ突然変異体Ｑ５２４Ｌ及びＬ５２５Ｒは、Ｖ６００Ｅと同様に細胞増殖促進シグナルを下流に伝達することができることが明らかになった。

２．２ ＢＲＡＦ変異タンパク質による下流への細胞増殖促進シグナル伝達に対する抗ＥＧＦＲ抗体の影響（１）
前節２．１の実験から、ＢＲＡＦ突然変異体Ｑ５２４Ｌ及びＬ５２５Ｒは細胞増殖促進シグナルを下流に伝達することができることが明かになった。本節では、これらのＢＲＡＦ突然変異体によるＥＲＫの活性化、すなわち、リン酸化が、上流からの細胞増殖促進シグナルに依存するか否かを検証する。そのため、野生型ＥＧＦＲを恒常的に発現するＨＥＫ２９３細胞株（ＨＥＫ２９３ ＥＧＦＲｗｔ）を樹立した。そして、ＨＥＫ２９３ ＥＧＦＲｗｔ細胞株にＢＲＡＦ突然変異体発現ベクターを導入し、ＢＲＡＦを一過的に過剰発現させ、異なる濃度の抗ＥＧＦＲ抗体セツキシマブ存在下でのＥＲＫのリン酸化を検討した。

２．２．１ 材料及び方法
本実験では前節の実験で用いた試薬に加えて、セツキシマブ（アービタックス（登録商標）メルクセローノ株式会社）が用いられた。

野生型ヒトＥＧＦＲを恒常的に発現するＨＥＫ２９３細胞株ＨＥＫ２９３ ＥＧＦＲｗｔは、ネオマイシン耐性遺伝子を有する自己不活性化タイプレトロウイルスベクターのｐＱＣＸＩＮ（クロンテック、タカラバイオ株式会社、６３１５１４）に野生型ＥＧＦＲ遺伝子を導入したうえで、製造者の指示書に従って作成した。
前節２．１と同様に、ＦｕＧＥＮＥ ＨＤ トランスフェクション試薬を用いて、ＨＥＫ２９３ ＥＧＦＲｗｔ細胞株にヒトＢＲＡＦの野生型又は突然変異体のプラスミドＤＮＡをトランスフェクションした。トランスフェクション試薬及びＤＮＡの複合体溶液中での６時間培養後、培地を交換しさらに２０時間培養を行った。その後、異なる濃度（０、０．５及び５．０μｇ／ｍＬ）のセツキシマブを添加した培地に交換して、さらに２時間培養した。その後、前節２．１と同様に、ヒトＢＲＡＦの野生型又は突然変異体のプラスミドＤＮＡを導入した細胞を溶解して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングを行った。

２．２．２ 結果
図５は、空ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）と、野生型ヒトＢＲＡＦ（ＷＴ）、既知のＢＲＡＦ突然変異体（Ｖ６００Ｅ）及び本発明のＢＲＡＦ突然変異体（Ｑ５２４Ｌ及びＬ５２５Ｒ）を発現するベクターとをトランスフェクションして、異なる濃度（０、０．５及び５．０μｇ／ｍＬ）のセツキシマブを添加した培地で培養したＨＥＫ２９３ ＥＧＦＲｗｔ細胞株の細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分離し、ウェスタンブロッティング法で転写したメンブレンをＦｌａｇ抗体（ＦＬＡＧ）、抗ＥＲＫ抗体および抗リン酸化ＥＲＫ抗体で（ＥＲＫ及びｐＥＲＫ）で検出した結果のウェスタンブロッティング図である。図５の上段では、Ｆｌａｇタグを融合したＢＲＡＦタンパク質のバンド部分を拡大した。図５の中段及び下段では、ＥＲＫタンパク質のバンド部分を拡大した。図５の上段に示すとおり、空ベクター導入細胞を除くＢＲＡＦ導入した細胞のサンプルでは、ＢＲＡＦタンパク質（８０ｋＤａ）に相当するサイズのバンドに抗体が反応した。また図５の下段に示すとおり、空ベクター導入細胞及びＢＲＡＦ導入した細胞のサンプルの全てで、ＥＲＫタンパク質（４４ｋＤａ）に相当するサイズのバンドに抗体が反応した。全てのサンプルでバンドのデンシティがほぼ同じであったことから、トランスフェクション、ＢＲＡＦの発現及びセツキシマブの添加はＥＲＫタンパク質の発現には影響を与えなかった。しかし図５の中段に示すとおり、空ベクター及び野生型ＢＲＡＦを導入した細胞のサンプルでは、セツキシマブの濃度が高いほどリン酸化ＥＲＫのバンドのデンシティが下がった。一方、ＢＲＡＦ突然変異体Ｖ６００Ｅ、Ｑ５２４Ｌ及びＬ５２５Ｒを導入した細胞のサンプルでは、セツキシマブの濃度が高くなってもリン酸化ＥＲＫのバンドのデンシティは変化しなかった。そこで、本発明のＢＲＡＦ突然変異体Ｑ５２４Ｌ及びＬ５２５Ｒは、既知のＢＲＡＦ突然変異体Ｖ６００Ｅと同様に、セツキシマブの濃度が高くなってもＥＲＫをリン酸化する活性が下がらないので、上流からの細胞増殖促進シグナルに依存しない活性化型ＢＲＡＦ突然変異体であることが示唆された。

２．３ ＨＥＫ２９３細胞で発現されたＢＲＡＦ変異タンパク質の細胞増殖促進シグナル伝達系への影響（２）
２．１節と同様の実験を、ＢＲＡＦ変異タンパク質Ｑ５２４Ｌ及びＬ５２５Ｒに加えて、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｖ、Ｌ４８５Ｆ、Ｎ５８１Ｓ、Ｄ５９４Ｎ、Ｄ５９４Ｇ、Ｇ５９６Ｒ及びＶ６００Ｒについても行った。

２．３．１ 材料及び方法
表７に列挙した濃度のプラスミドＤＮＡのＴＥバッファー溶液を用意して、トランスフェクション試薬及びＤＮＡの複合体溶液を表９の組成で調製した。２．１節と同様に、ＨＥＫ２９３細胞へのトランスフェクションを行い、プラスミドＤＮＡを導入した細胞を溶解して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングを行った。

２．３．２ 結果
図６は、空ベクター（ｐＱＣＸＩＰ）と、野生型ヒトＢＲＡＦ（ＷＴ）、既知のＢＲＡＦ突然変異体（Ｖ６００Ｅ）及び本発明のＢＲＡＦ突然変異体（Ｑ５２４Ｌ、Ｌ５２５Ｒ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６６Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｖ、Ｌ４８５Ｆ、Ｎ５８１Ｓ、Ｄ５９４Ｎ、Ｄ５９４Ｇ、Ｇ５９６Ｒ及びＶ６００Ｒ）を発現するベクターとをトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞の細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分離し、ウェスタンブロッティング法で転写したメンブレンをＦｌａｇ抗体（ＦＬＡＧ）、抗ＥＲＫ抗体および抗リン酸化ＥＲＫ抗体で（ＥＲＫ及びｐＥＲＫ）で検出した結果のウェスタンブロッティング図である。図６の上段では、Ｆｌａｇタグを融合したＢＲＡＦタンパク質のバンド部分を拡大した。図６の中段及び下段では、ＥＲＫタンパク質のバンド部分を拡大した。図６の中段に示すとおり、野生型ヒトＢＲＡＦ（ＷＴ）、既知のＢＲＡＦ突然変異体（Ｖ６００Ｅ）及び本発明のＢＲＡＦ突然変異体の一部（Ｑ５２４Ｌ、Ｌ５２５Ｒ、Ｇ４６４Ｖ、Ｇ４６９Ａ、Ｇ４６９Ｖ、Ｌ４８５Ｆ、Ｎ５８１Ｓ及びＶ６００Ｒ）のサンプルでは、リン酸化ＥＲＫのバンドのデンシティは空ベクターのサンプルのデンシティより高かった。しかし、本発明のＢＲＡＦ突然変異体の残り（Ｇ４６６Ｖ、Ｄ５９４Ｎ、Ｄ５９４Ｇ及びＧ５９６Ｒ）のサンプルでは、リン酸化ＥＲＫのバンドのデンシティは空ベクターのサンプルのデンシティとほぼ同じであった。そこで本発明のＢＲＡＦ突然変異体のうち、Ｇ４６６Ｖ、Ｄ５９４Ｎ、Ｄ５９４Ｇ及びＧ５９６Ｒは細胞増殖促進シグナルを下流に伝達しない不活性化型ＢＲＡＦ突然変異体であることが示唆された。

２．４ ＢＲＡＦ変異タンパク質による下流への細胞増殖促進シグナル伝達に対する抗ＥＧＦＲ抗体の影響（２）
本節では、前節２．３の実験で不活性化型ＢＲＡＦ突然変異体であることが示唆されたＧ４６６Ｖ、Ｄ５９４Ｎ、Ｄ５９４Ｇ及びＧ５９６Ｒが、上流からの細胞増殖促進シグナルへの依存性を保持しているかどうかを検証する。

２．４．１ 材料及び方法
表７に列挙した濃度のプラスミドＤＮＡのＴＥバッファー溶液を用意して、トランスフェクション試薬及びＤＮＡの複合体溶液を表１０の組成で調製した。２．２節と同様に、ＨＥＫ２９３ ＥＧＦＲｗｔ細胞株へのトランスフェクションを行い、プラスミドＤＮＡを導入した細胞を溶解して、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びウェスタンブロッティングを行った。

２．４．２ 結果
図７は、空ベクター（Ｖｅｃｔｏｒ）と、野生型ヒトＢＲＡＦ（ＷＴ）、既知のＢＲＡＦ突然変異体（Ｖ６００Ｅ）及び本発明のＢＲＡＦ突然変異体（Ｇ４６６Ｖ、Ｄ５９４Ｎ、Ｄ５９４Ｇ及びＧ５９６Ｒ）を発現するベクターとをトランスフェクションして、異なる濃度（０及び５．０μｇ／ｍＬ）のセツキシマブを添加した培地で培養したＨＥＫ２９３細胞の細胞溶解液をＳＤＳ−ＰＡＧＥ法で分離し、ウェスタンブロッティング法で転写したメンブレンをＦｌａｇ抗体（ＦＬＡＧ）、抗ＥＲＫ抗体および抗リン酸化ＥＲＫ抗体で（ＥＲＫ及びｐＥＲＫ）で検出した結果のウェスタンブロッティング図である。図７の上段では、Ｆｌａｇタグを融合したＢＲＡＦタンパク質のバンド部分を拡大した。図７の中段及び下段では、ＥＲＫタンパク質のバンド部分を拡大した。図７の中段に示すとおり、空ベクター、野生型ＢＲＡＦ及び本発明のＢＲＡＦ突然変異体（Ｇ４６６Ｖ、Ｄ５９４Ｎ、Ｄ５９４Ｇ及びＧ５９６Ｒ）を導入した細胞のサンプルでは、セツキシマブの濃度が高いほどリン酸化ＥＲＫのバンドのデンシティが下がった。これに対し、ＢＲＡＦ突然変異体Ｖ６００Ｅを導入した細胞のサンプルでは、セツキシマブの濃度が高くなってもリン酸化ＥＲＫのバンドのデンシティは変化しなかった。そこで、本発明のＢＲＡＦ突然変異体（Ｇ４６６Ｖ、Ｄ５９４Ｎ、Ｄ５９４Ｇ及びＧ５９６Ｒ）は、下流へのシグナル伝達が減弱する不活性化ＢＲＡＦ突然変異体ではあるが、上流からの細胞増殖促進シグナルへの依存性を保持していることが示唆された。

実施例２の結果から、本発明のＢＲＡＦ突然変異体Ｑ５２４Ｌ及びＬ５２５Ｒは、既知のＢＲＡＦ突然変異体Ｖ６００Ｅと同様に、上流からの細胞増殖促進シグナルに依存しない活性化型ＢＲＡＦ突然変異体であることが示唆された。これは、本発明のＢＲＡＦ突然変異体Ｑ５２４Ｌ及びＬ５２５Ｒにはセツキシマブ応答性がないことを意味する。この結果は、実施例１におけるこれらの変異型の患者の抗ＥＧＦＲ抗体薬への最良の反応がＰＤ又はＳＤという結果（表３）と一致する。したがって、ヒトを含め生体内でも同様に、Ｑ５２４Ｌ， Ｌ５２５Ｒのいずれかの変異を有する患者には、セツキシマブをはじめ、ＥＧＦＲ阻害剤による治療の効果は低いことが予想される。

また、本発明のＢＲＡＦ突然変異体Ｇ４６６Ｖ、Ｄ５９４Ｎ、Ｄ５９４Ｇ及びＧ５９６Ｒは、細胞増殖促進シグナルを下流に伝達しない不活性化型ＢＲＡＦ突然変異体ではあるが、上流からの細胞増殖促進シグナルへの依存性を保持していることが示唆された。これは、本発明のＢＲＡＦ突然変異体Ｇ４６６Ｖ、Ｄ５９４Ｎ、Ｄ５９４Ｇ及びＧ５９６Ｒにはセツキシマブ応答性があることを意味する。しかし、Ｄ５９４Ｇの変異型の患者の抗ＥＧＦＲ抗体薬への最良の反応はＳＤという結果（表３）であった。すると、本発明のＢＲＡＦ突然変異体Ｇ４６６Ｖ、Ｄ５９４Ｎ、Ｄ５９４Ｇ及びＧ５９６Ｒにはセツキシマブ応答性があっても、もともとＥＲＫをリン酸化する活性が低いため、セツキシマブ非存在下でもＥＧＦＲからのシグナルはほとんど遮断されている可能性がある。あるいは、培養細胞における一過性の過剰発現系では、不活性型ＢＲＡＦ変異体によるセツキシマブ応答性が認められるものの、生体内の環境では、ＢＲＡＦ以外のＲＡＦファミリー遺伝子の活性化などによりセツキシマブ耐性を獲得する側副経路が存在する可能性がある。そのため、Ｄ５９４Ｇを有する臨床結果で示したように、Ｇ４６６Ｖ、Ｄ５９４Ｎ、Ｄ５９４Ｇ、Ｇ５９６Ｒの変異を有する患者においては、セツキシマブをはじめ、ＥＧＦＲ阻害剤による治療の効果は低いことが予想される。

Claims (16)

1. 患者の大腸がん（直腸・結腸がん）組織サンプルを用いて、配列番号１のヒトＢＲＡＦタンパク質のアミノ酸配列において、Ｑ５２４Ｌ又はＬ５２５Ｒのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップを含み、前記ＢＲＡＦの突然変異が検出された大腸がん（直腸・結腸がん）はＥＧＦＲ阻害剤による治療に適さない、ここで前記ＥＧＦＲ阻害剤はセツキシマブ又はパニツムマブである、ＥＧＦＲ阻害剤の治療効果を予測する方法。
2. 前記ＥＧＦＲ阻害剤は、イリノテカンか、ＦＯＬＦＯＸか、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩか、ＦＯＬＦＩＲＩか、ＦＯＬＦＯＸＩＲＩ及びベバシズマブかとともに併用される、請求項１に記載の方法。
3. 前記ヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップは、患者の大腸がん（直腸・結腸がん）組織サンプルから抽出した核酸の塩基配列のうち、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の前記少なくとも１つのアミノ酸残基の置換をコードするオリゴヌクレオチドの塩基配列を決定することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記ヒトＢＲＡＦの突然変異を検出するステップは、患者の大腸がん（直腸・結腸がん）組織サンプルから抽出した核酸の塩基配列のうち、ヒトＢＲＡＦ遺伝子の前記少なくとも１つのアミノ酸残基の置換をコードするポリヌクレオチドを特異的に増幅することを含む、請求項１又は２に記載の方法。
5. （ａ）患者の大腸がん（直腸・結腸がん）組織サンプルからＤＮＡを単離するステップと、
   （ｂ）配列番号２の塩基配列においてＱ５２４Ｌ又はＬ５２５Ｒのアミノ酸残基をコードする塩基配列を挟むプライマーの対と、前記単離されたＤＮＡとをハイブリダイズさせるステップと、
   （ｃ）前記単離したＤＮＡとプライマーの対とを用いて、配列番号２の塩基配列においてＱ５２４Ｌ又はＬ５２５Ｒのアミノ酸残基をコードする塩基配列を有するＢＲＡＦ遺伝子ＤＮＡを増幅させるステップと、
   （ｄ）前記増幅されたＢＲＡＦ遺伝子ＤＮＡをプローブと接触させるステップと、
   （ｅ）前記増幅されたＢＲＡＦ遺伝子ＤＮＡとハイブリダイズしたプローブを検出するステップとを含む、請求項１又は２に記載の方法。
6. セツキシマブ又はパニツムマブの治療効果を予測するためのキットであって、
   配列番号２の塩基配列においてＱ５２４Ｌ又はＬ５２５Ｒのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異を含む塩基配列を特異的に検出するためのプライマー又はプローブオリゴヌクレオチドを含み、
   前記治療効果は、前記ＢＲＡＦの突然変異が検出された大腸がん（直腸・結腸がん）はセツキシマブ又はパニツムマブによる治療に適さないことである、キット。
7. 前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列において、Ｑ５２４Ｌ又はＬ５２５Ｒのアミノ酸残基の置換をコードするオリゴヌクレオチドの塩基配列を決定することにより、配列番号２の塩基配列においてＱ５２４Ｌ又はＬ５２５Ｒのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異を検出する、請求項６に記載のキット。
8. 前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列において、Ｑ５２４Ｌ又はＬ５２５Ｒのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異塩基を含む、塩基配列を有するＲＮＡ及び／又はＤＮＡを鋳型とするポリヌクレオチドを特異的に増幅することにより、配列番号２の塩基配列においてＱ５２４Ｌ又はＬ５２５Ｒのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異を検出する、請求項６に記載のキット。
9. 前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号２３〜３０からなる群から選択される少なくとも１本の配列からなる、請求項６ないし８のいずれか１項に記載のキット。
10. 前記プライマーオリゴヌクレオチドは、配列番号２３〜２６のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドと配列番号２７〜３０のいずれか１本の配列からなるプライマーオリゴヌクレオチドの対である、請求項９に記載のキット。
11. 前記プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列において、Ｑ５２４Ｌ又はＬ５２５Ｒのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異塩基を含む、塩基配列を有するＲＮＡ及び／又はＤＮＡと雑種形成することにより、配列番号２の塩基配列においてＱ５２４Ｌ又はＬ５２５Ｒのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異を検出する、請求項６に記載のキット。
12. 前記プローブオリゴヌクレオチドは、配列番号６１〜８２からなる群から選択される少なくとも１本の配列のプローブオリゴヌクレオチドである、請求項１１に記載のキット。
13. 前記プライマー又はプローブオリゴヌクレオチドは、配列番号２の塩基配列のうち、Ｑ５２４Ｌ又はＬ５２５Ｒのアミノ酸残基の置換を起こすヒトＢＲＡＦ遺伝子の突然変異塩基を含む塩基配列か、その相補配列かを含む、請求項６ないし８及び１１のいずれか１項に記載のキット。
14. 前記プライマーオリゴヌクレオチドは、その５’末端と３’末端との間にリボヌクレアーゼ酵素認識部位を含み、
    該リボヌクレアーゼ酵素認識部位は、ＲＮＡの連続配列であって、前記アミノ酸残基の置換を起こす突然変異塩基を含み、該リボヌクレアーゼ酵素認識部位は相補的な塩基配列を有するＤＮＡと対合してヘテロ２本鎖を形成するとき、耐熱性ＲＮａｓｅＨにより特異的に切断される、請求項６ないし１３のいずれかに記載のキット。
15. 前記プライマー又はプローブオリゴヌクレオチドは少なくとも前記アミノ酸残基の置換を起こす突然変異塩基に核酸アナログを含む、請求項６ないし１４のいずれか１項に記載のキット。
16. ヒトＢＲＡＦタンパク質を発現する宿主細胞にＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤を曝露するステップと、前記宿主細胞の細胞増殖促進シグナル伝達に与える前記阻害剤の効果を調べるステップとを含み、前記ヒトＢＲＡＦタンパク質は、配列番号１のヒトＢＲＡＦタンパク質のアミノ酸配列において、Ｑ５２４Ｌ又はＬ５２５Ｒのアミノ酸残基の置換を起こす単離ヒトＢＲＡＦの体細胞突然変異タンパク質であり、前記阻害剤の非存在下と比較して前記阻害剤の存在下で前記宿主細胞の細胞増殖促進シグナル伝達が抑制されるとき、前記ヒトＢＲＡＦタンパク質に含まれるアミノ酸残基置換体細胞突然変異が検出された大腸がん（直腸・結腸がん）に対して前記阻害剤は治療効果があり、あるいは、前記阻害剤の非存在下と比較して前記阻害剤の存在下で前記宿主細胞の細胞増殖促進シグナル伝達が抑制されないとき、前記ヒトＢＲＡＦタンパク質に含まれるアミノ酸残基置換体細胞突然変異が検出された大腸がん（直腸・結腸がん）に対して前記阻害剤は治療効果がない、ＢＲＡＦが介在するシグナル伝達系阻害剤のヒトＢＲＡＦ体細胞突然変異が検出された大腸がん（直腸・結腸がん）に対する治療効果を予測する方法。

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