JP6875623B2 - 遺伝性疾患に関わるタンパク質の測定方法及び測定キット - Google Patents
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Description
本発明は、生体試料に含まれる遺伝性疾患に関わるタンパク質の測定方法、及びこれに用いる測定キットに関する。
遺伝性疾患は、遺伝子または染色体の変化が原因となって生じる疾患で、現在１万種類以上が知られている。遺伝子の変化には、欠失変異、重複変異、ミスセンス変異やナンセンス変異が知られており、これらの変異によって正常のタンパク質が発現しないことで、またタンパク質の翻訳が途中で止まることで、タンパク質が本来の機能を失うことにより、疾患の症状を呈する。難治性・希少疾患と呼ばれる疾患のほとんどは遺伝性疾患に分類され、治療が困難で重篤な疾患がその大半である。現在の所、このような遺伝性疾患に対して、タンパク質の発現回復を促すことで治療を施すような治療薬及び治療法の開発が活発に行われている。例えば、ミスセンス変異に対してはアンチセンス薬を用いたエクソンスキップ療法が、また、ナンセンス変異に対してはリードスルー薬を用いたリードスルー療法が開発されている。あるいは、正常遺伝子を導入して発現させる遺伝子療法やｓｉＲＮＡ、デコイ核酸、アプタマー、リボザイムなどの核酸医薬品も開発されている。
遺伝性疾患の一例として、筋ジストロフィーが知られている。筋ジストロフィーは、骨格筋の変性、壊死を主病変とし、臨床的には進行性の筋力低下をみる遺伝性疾患である。筋ジストロフィーの一つであるデュシェンヌ型筋ジストロフィー（Duchenne muscular dystrophy；ＤＭＤ）の原因は、ジストロフィン遺伝子欠失変異に起因する、ジストロフィンタンパク質（以降、単に「ジストロフィン」とも称する。）の発現欠損である。ＤＭＤの治療においても、アンチセンス薬及びリードスルー薬を用いてジストロフィンの発現回復を促す治療法の開発が進められている（例えば、非特許文献１，２参照）。また、遺伝子治療の開発も進められている。これらの治療法は、国内外で積極的に治験が実施されている。これらの治験では、化合物薬投与後あるいは遺伝子導入後の患者組織中のジストロフィンの発現回復が評価される。ジストロフィンの発現回復の確認には、患者の組織から可溶化したジストロフィンに対する定量測定法が利用される。非特許文献１，２に示すように、治験では、定量測定法としてウェスタンブロット法が利用されている。
Lancet. 2011, 378(9791), 595-605.
The New England Journal of Medicine. 2011, 364, 1513-1522.
European Medicines Agency. Guideline on the clinical investigation of medicinal products for the treatment of Duchenne and Becker muscular dystrophy. 2015.
Food and Drug Administration. Duchenne Muscular Dystrophy and Related Dystrophinopathies: Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry. Draft Guidance. 2015.
上記の様なアンチセンス薬もしくはリードスルー薬を用いた治療、または遺伝子療法では、薬理作用機序上、健康人と比較してごくわずかのタンパク質量の回復しか見込めないケースが多い。しかしながら、重篤な遺伝性疾患の患者では、原因となるタンパク質の発現が元来皆無であるために、健康人のタンパク質の発現量の数十分の一の発現量が回復することによっても症状がある程度回復することが見込まれる。あるいは、異常タンパクの蓄積をわずかでも抑制することにより症状の回復・進展抑制が見込まれる。このため、遺伝性疾患の治験において、正常タンパク質の発現回復の確認や、異常タンパク質の蓄積の抑制の確認をするために、微量なタンパク質を測定する方法が求められている。
現状、治験では、タンパク質の測定法としてウェスタンブロット法が用いられることがあるが、この方法は手順が煩雑で、測定結果のばらつきが大きく、精度が優れない課題がある。また、高感度の測定法として、液体クロマトグラフィータンデム質量分析法（Liquid chromatography / Tandem mass spectrometry；ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ法や、化学発光法を用いた検出法などが知られているが、これらの方法は手順が煩雑なためばらつきが大きく精度に欠ける課題がある。
この他のタンパク質の測定法としては、ＥＬＩＳＡが知られている。ＥＬＩＳＡは、市販キットが存在し、手順の煩雑さが比較的少なく、精度に優れた方法である。しかしながら、ＥＬＩＳＡでは、高濃度の界面活性剤及び還元剤の存在下では感度が著しく低下するために、試料の溶液に含まれる界面活性剤及び還元剤の量を極力抑える必要がある。ここで、例えば、ＤＭＤ治療法の治験では、ジストロフィンが膜近傍に位置する疎水性の高いタンパク質のため、生体試料の可溶化に高濃度の界面活性剤・還元剤を用いる。このような疎水性のタンパク質に対する測定には、ＥＬＩＳＡ法は、高濃度の界面活性剤及び還元剤の存在により感度が著しく低下するために適していない。また、ＥＬＩＳＡでは、検出法として用いられる発色法の感度が低いという課題があり、微量なタンパク質の定量が必要となる遺伝性疾患の治験には適した方法ではない。これらの理由から、ＤＭＤ治療法の治験における、ＥＬＩＳＡの使用経験はこれまでに報告されていない。
上述した背景の下、現状のジストロフィンの定量測定法に対して、欧州医薬品庁のドラフトガイドラインでは、頑健性が不足していることが指摘されている（非特許文献３）。また、米国食品医療品局のドラフトガイダンスでも、測定方法の改良が求められている（非特許文献４）。このように、遺伝性疾患に関わるタンパク質の測定方法として、特異性が高く、薬事承認審査に耐え得る感度、真度、及び精度を備える方法が必要とされている。
本発明は、かかる背景技術に鑑みてなされたものである。その目的は、感度、真度、及び精度に優れる、遺伝性疾患に関わるタンパク質の測定方法を提供することにある。
本発明者は、上記課題に対し鋭意検討した結果、遺伝性疾患に関わるタンパク質の測定において、電気化学発光（Electrochemiluminescent；ＥＣＬ）法を利用することにより、感度、真度、及び精度に優れた測定が可能になることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の（１）〜（１６）の具体的態様を提供する。
（１）遺伝子疾患に関わるタンパク質と、前記タンパク質を認識する捕捉抗体とを結合させる抗原結合工程、前記捕捉抗体に結合した前記タンパク質と、前記タンパク質の前記捕捉抗体が認識する領域とは別の領域を認識し且つ発光性金属錯体が標識される検出抗体とを結合させる検出抗体結合工程、及び前記タンパク質に結合し且つ前記発光性金属錯体が標識された前記検出抗体を、電気化学的刺激によって生じる電気化学発光量を測定することによって検出する測定工程を備えることを特徴とする、タンパク質の測定方法。
（１）遺伝子疾患に関わるタンパク質と、前記タンパク質を認識する捕捉抗体とを結合させる抗原結合工程、前記捕捉抗体に結合した前記タンパク質と、前記タンパク質の前記捕捉抗体が認識する領域とは別の領域を認識し且つ発光性金属錯体が標識される検出抗体とを結合させる検出抗体結合工程、及び前記タンパク質に結合し且つ前記発光性金属錯体が標識された前記検出抗体を、電気化学的刺激によって生じる電気化学発光量を測定することによって検出する測定工程を備えることを特徴とする、タンパク質の測定方法。
（２）前記捕捉抗体がモノクローナル抗体であり、前記検出抗体がポリクローナル抗体である、上記（１）に記載のタンパク質の測定方法。
（３）前記捕捉抗体がポリクローナル抗体であり、前記検出抗体がモノクローナル抗体である、上記（１）に記載のタンパク質の測定方法。
（４）前記捕捉抗体が前記タンパク質のＣ末端領域を認識する抗体であり、前記検出抗体が前記タンパク質のＮ末端領域を認識する抗体である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。
（５）前記捕捉抗体が前記タンパク質のＮ末端領域を認識する抗体であり、前記検出抗体が前記タンパク質のＣ末端領域を認識する抗体である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。
（３）前記捕捉抗体がポリクローナル抗体であり、前記検出抗体がモノクローナル抗体である、上記（１）に記載のタンパク質の測定方法。
（４）前記捕捉抗体が前記タンパク質のＣ末端領域を認識する抗体であり、前記検出抗体が前記タンパク質のＮ末端領域を認識する抗体である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。
（５）前記捕捉抗体が前記タンパク質のＮ末端領域を認識する抗体であり、前記検出抗体が前記タンパク質のＣ末端領域を認識する抗体である、上記（１）〜（３）のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。
（６）界面活性剤及び還元剤を含有する可溶化溶液を用いて、生体試料から前記タンパク質を可溶化する可溶化工程、及び前記可溶化工程で得られた可溶化試料溶液を希釈して、前記タンパク質を含む希釈試料溶液を得る希釈工程をさらに備え、前記抗原結合工程では、前記希釈試料溶液に含まれる前記タンパク質と前記捕捉抗体とを結合させる、上記（１）〜（５）のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。
（７）前記可溶化工程において、前記生体試料として、筋肉、脳、血液、もしくは心臓に由来する細胞もしくは組織、または生体の細胞に由来する幹細胞から誘導されるもしくは培養される細胞もしくは組織を用いる、上記（６）に記載のタンパク質の測定方法。
（８）前記可溶化工程で用いる前記可溶化溶液の前記界面活性剤が、陰イオン性界面活性剤を含有する、上記（６）または（７）に記載のタンパク質の測定方法。
（９）前記希釈工程において、非イオン性界面活性剤を含む希釈溶液を用いて前記可溶化試料溶液の希釈を行う、上記（６）〜（８）のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。
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（８）前記可溶化工程で用いる前記可溶化溶液の前記界面活性剤が、陰イオン性界面活性剤を含有する、上記（６）または（７）に記載のタンパク質の測定方法。
（９）前記希釈工程において、非イオン性界面活性剤を含む希釈溶液を用いて前記可溶化試料溶液の希釈を行う、上記（６）〜（８）のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。
（１０）標準品タンパク質の濃度と電気化学発光量との検量線と、前記生体試料に含まれる前記タンパク質における電気化学発光量とに基づいて、前記生体試料に含まれる前記タンパク質の量を算出する算出工程をさらに備える、上記（６）〜（９）のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。
（１１）前記標準品タンパク質として、前記タンパク質の全長またはその一部を用いる、上記（１０）に記載のタンパク質の測定方法。
（１１）前記標準品タンパク質として、前記タンパク質の全長またはその一部を用いる、上記（１０）に記載のタンパク質の測定方法。
（１２）前記発光性金属錯体が、前記発光性金属錯体により標識され且つ前記検出抗体を認識する検出二次抗体により、前記検出抗体に導入される、上記（１）〜（１１）のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。
（１３）前記捕捉抗体を認識する固定化二次抗体を固定化する二次抗体固定化工程、及び前記固定化した固定化二次抗体と、前記捕捉抗体とを結合させることで、前記捕捉抗体を固定化する捕捉抗体結合工程とをさらに備える、上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。
（１４）前記固定化二次抗体が固相に固定化され、前記固相が、プレート、キュベット、チューブ、ビーズ、多孔質体、またはメンブレンである、上記（１３）に記載のタンパク質の測定方法。
（１５）前記タンパク質がジストロフィンタンパク質である上記（１）〜（１４）のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法
（１３）前記捕捉抗体を認識する固定化二次抗体を固定化する二次抗体固定化工程、及び前記固定化した固定化二次抗体と、前記捕捉抗体とを結合させることで、前記捕捉抗体を固定化する捕捉抗体結合工程とをさらに備える、上記（１）〜（１２）のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。
（１４）前記固定化二次抗体が固相に固定化され、前記固相が、プレート、キュベット、チューブ、ビーズ、多孔質体、またはメンブレンである、上記（１３）に記載のタンパク質の測定方法。
（１５）前記タンパク質がジストロフィンタンパク質である上記（１）〜（１４）のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法
また、本発明は、以下の（１６）及び（１７）の具体的態様をも提供する。
（１６）遺伝性疾患に関わるタンパク質を認識する捕捉抗体、及び前記タンパク質の前記捕捉抗体が認識する領域とは別の領域を認識し且つ発光性金属錯体が標識される検出抗体を備えることを特徴とする、ＥＣＬ法用のタンパク質の測定キット。
（１７）前記発光性金属錯体により標識され且つ前記検出抗体を認識する検出二次抗体をさらに備える、上記（１６）に記載のＥＣＬ法用のタンパク質の測定キット。
（１６）遺伝性疾患に関わるタンパク質を認識する捕捉抗体、及び前記タンパク質の前記捕捉抗体が認識する領域とは別の領域を認識し且つ発光性金属錯体が標識される検出抗体を備えることを特徴とする、ＥＣＬ法用のタンパク質の測定キット。
（１７）前記発光性金属錯体により標識され且つ前記検出抗体を認識する検出二次抗体をさらに備える、上記（１６）に記載のＥＣＬ法用のタンパク質の測定キット。
本発明によれば、感度、真度、及び精度に優れる、遺伝性疾患に関わるタンパク質の測定方法を提供することができる。
以下、本発明の実施の形態について詳細に説明するが、以下の実施の形態は、本発明を説明するための例示であり、本発明はこれらに限定されるものではなく、その要旨を逸脱しない範囲内で任意に変更して実施することができる。なお、本明細書において、例えば「１〜１００」との数値範囲の表記は、その上限値「１」及び下限値「１００」の双方を包含するものとする。また、他の数値範囲の表記も同様である。
本実施形態のタンパク質の測定方法（以降、単に「本測定方法」とも称する。）は、タンパク質とこのタンパク質を認識する捕捉抗体とを結合させる抗原結合工程、捕捉抗体に結合したタンパク質と、タンパク質の捕捉抗体が認識する領域とは別の領域を認識し且つ発光性金属錯体が標識される検出抗体とを結合させる検出抗体結合工程、及びタンパク質に結合し且つ発光性金属錯体が標識された検出抗体を、電気化学的刺激によって生じる電気化学発光量を測定することによって検出する測定工程を備える。すなわち、本測定方法は、電気化学発光（Electrochemiluminescence；ＥＣＬ）法を利用して、タンパク質を検出するものである。好ましくは、本測定方法は、生体試料に含まれるタンパク質を検出するものである。
さらに、本測定方法は、界面活性剤及び還元剤を含有する溶液を用いて、生体試料からタンパク質を可溶化する可溶化工程、及び可溶化工程で得られた可溶化溶液を希釈して、タンパク質を含む希釈試料溶液を調製する希釈工程をさらに備えることが好ましい。また、本測定方法は、標準品タンパク質の濃度と化学発光量との検量線を作成する検量線作成工程と、この検量線と生体試料に含まれるタンパク質における電気化学発光量とに基づいて、生体試料に含まれるタンパク質の量を算出する算出工程とをさらに備えることが好ましい。また、本測定方法は、捕捉抗体を認識する固定化二次抗体を固定化する二次抗体固定化工程と、固定化二次抗体と捕捉抗体とを結合させる捕捉抗体結合工程を備えていてもよい。
本測定方法は、感度、真度、及び精度に優れたタンパク質の測定を可能とすることにより、遺伝性疾患に関わるタンパク質の測定に好適に用いられる。遺伝性疾患とは、一つ以上の遺伝子または染色体の異常によって起こる疾患をいう。遺伝性疾患では、遺伝子または染色体の異常に起因して、タンパク質の発現量の低下、または異常なタンパク質の発現が生じることが原因となって、疾患の症状を呈する。本測定方法は、遺伝性疾患の原因に関わるタンパク質について、薬剤又は遺伝子治療による発現回復を行った際に、正常なタンパク質の発現を確認するために特に好適に用いられる。
遺伝性疾患としては、例えば、先天性筋ジストロフィー、マルファン症候群、神経線維腫症、鎌状赤血球症などの常染色体優性遺伝病、異染性白質ジストロフィー、嚢胞性線維症、フェニルケトン尿症、ホモシスチン尿症、メープルシロップ尿症、ガラクトース血症などの常染色体劣性遺伝病、及びデュシェンヌ型筋ジストロフィー、ベッカー型筋ジストロフィー、副腎白質ジストロフィー、血友病などのＸ染色体連鎖遺伝病を含む単一遺伝子疾患；口唇裂、口蓋裂、先天性心疾患などの多因子遺伝疾患；ダウン症候群、４Ｐマイナス症候群、ターナー症候群などの染色体異常、慢性進行性外眼筋麻痺、レーバー病などのミトコンドリア遺伝病；癌などの体細胞遺伝病が挙げられるが、これらに特に限定されない。これらの遺伝性疾患の中でも、本測定方法は、アンチセンス薬またはリードスルー薬、もしくは遺伝子療法によって、正常なタンパク質の発現を回復させることで症状を効果的に改善することができる、単一遺伝子疾患に関わるタンパク質の測定に好適に用いられる。より好ましくは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関わるジストロフィン、またはベッカー型筋ジストロフィーに関わるジストロフィンの測定に用いられ、さらに好ましくは、デュシェンヌ型筋ジストロフィーに関わるジストロフィンの測定に好適に用いられる。
またさらに、本測定方法では高感度であるために、界面活性剤及び還元剤を用いて可溶化したタンパク質を含む試料溶液を希釈した場合であっても測定可能である。このため、本測定方法は、高分子量及び／または疎水性が高いタンパク質の測定に好適に用いることができる。このような高分子量及び／または疎水性が高いタンパク質として、例えば、ジストロフィン、ラミニン、コラーゲン、ジスフェルリン、タイチン、ネブリン、スーパーオキシドジスムダーゼ、チトクロム酸化酵素、アクチンなどが挙げられ、中でも本測定方法は、ジストロフィンの測定に好適に用いられる。
以下の実施形態では、ジストロフィンの測定を行う場合を例に挙げて説明するが、本測定方法の測定対象となる遺伝性疾患に関わるタンパク質はこれに限定されない。また、本測定方法は、測定対象のタンパク質に応じて適宜変更して実施することが可能である。
［試験材料、抗体、及び試薬類について］
本測定方法において測定を行う試験材料は、測定を行う対象となる生体組織に由来する生体試料と、検量線を得るための測定対象となる標準品とに分けられる。まずはこれら試験材料について説明する。次いで、本測定方法に用いる、抗体及び試薬類について説明する。
本測定方法において測定を行う試験材料は、測定を行う対象となる生体組織に由来する生体試料と、検量線を得るための測定対象となる標準品とに分けられる。まずはこれら試験材料について説明する。次いで、本測定方法に用いる、抗体及び試薬類について説明する。
＜生体試料＞
本測定方法に用いられる生体試料は、ジストロフィンを発現する細胞、組織、または検体に由来する生体試料であれば、特に限定せず用いることができる。生体試料として例えば、人間、マウス、ラット、犬等の動物を検体として、これらの検体から採取した生体試料を用いることができる。具体的な生体試料として、これらの検体の筋肉、脳、血液、もしくは心臓に由来する細胞もしくは組織を用いることができるが、これらに特に限定されない。または、上記の筋肉、脳、血液、もしくは心臓に由来する細胞、または検体の皮膚もしくは毛髪などの末梢組織の細胞等の、生体の細胞に由来する幹細胞から誘導されるもしくは培養される細胞もしくは組織であって、ジストロフィンを発現するよう分化誘導されたものを用いることができる。幹細胞とは、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられるが、これらに特に限定されない。生体試料は、後述する可溶化工程によってジストロフィンを可溶化した状態で測定に供される。
本測定方法に用いられる生体試料は、ジストロフィンを発現する細胞、組織、または検体に由来する生体試料であれば、特に限定せず用いることができる。生体試料として例えば、人間、マウス、ラット、犬等の動物を検体として、これらの検体から採取した生体試料を用いることができる。具体的な生体試料として、これらの検体の筋肉、脳、血液、もしくは心臓に由来する細胞もしくは組織を用いることができるが、これらに特に限定されない。または、上記の筋肉、脳、血液、もしくは心臓に由来する細胞、または検体の皮膚もしくは毛髪などの末梢組織の細胞等の、生体の細胞に由来する幹細胞から誘導されるもしくは培養される細胞もしくは組織であって、ジストロフィンを発現するよう分化誘導されたものを用いることができる。幹細胞とは、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、体細胞由来ＥＳ細胞（ｎｔＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）などが挙げられるが、これらに特に限定されない。生体試料は、後述する可溶化工程によってジストロフィンを可溶化した状態で測定に供される。
＜標準品＞
標準品（標準品ジストロフィン）は、検量線作成工程において標準試料として用いられるタンパク質であって、分子量４２７ｋＤａのジストロフィンの全長またはその一部を用いることができる。中でも、標準品ジストロフィンとして用いられるジストロフィンとしては、分子量４２７ｋＤａの全長ジストロフィンをコードする遺伝子（Ｄｐ４２７）のｃＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを、哺乳動物細胞に導入して発現させた、リコンビナント全長ジストロフィン（Recombinant full-length dystrophin；ＲＦＤ）を用いることが好ましい。
標準品（標準品ジストロフィン）は、検量線作成工程において標準試料として用いられるタンパク質であって、分子量４２７ｋＤａのジストロフィンの全長またはその一部を用いることができる。中でも、標準品ジストロフィンとして用いられるジストロフィンとしては、分子量４２７ｋＤａの全長ジストロフィンをコードする遺伝子（Ｄｐ４２７）のｃＤＮＡが組み込まれた発現ベクターを、哺乳動物細胞に導入して発現させた、リコンビナント全長ジストロフィン（Recombinant full-length dystrophin；ＲＦＤ）を用いることが好ましい。
このとき、標準ジストロフィンは、分子量４２７ｋＤａのジストロフィンの全長を含むものであってもよいが、分子量４２７ｋＤａのジストロフィンの一部を含むものであってもよい。この場合、分子量４２７ｋＤａのジストロフィンの一部とは、少なくとも捕捉抗体の認識部位、及び検出抗体の認識部位を含むものであることが好ましい。また、検体に投与されたアンチセンス薬もしくはリードスルー薬、または遺伝子治療によって引き起こされるジストロフィンの発現回復に応じて、この発現回復するジストロフィンの部位と重複するアミノ酸配列を含むものであることが好ましい。
＜捕捉抗体＞
捕捉抗体は、ジストロフィンを特異的に認識して、ジストロフィンとの抗原抗体反応を生じることで、ジストロフィンと結合する抗体である。
捕捉抗体は、ジストロフィンを特異的に認識して、ジストロフィンとの抗原抗体反応を生じることで、ジストロフィンと結合する抗体である。
捕捉抗体のジストロフィン上の認識部位は特に限定されないが、後述する検出抗体とは別の領域を認識して結合することが好ましい。より好ましくは、捕捉抗体と検出抗体とは、ジストロフィンにおける相互に干渉しない二つ以上のエピトープをそれぞれ認識することが好ましい。さらに好ましくは、捕捉抗体と検出抗体とのいずれか一方がジストロフィンのＮ末端領域を認識し、他方がジストロフィンのＣ末端領域を認識することが好ましい。すなわち、捕捉抗体と検出抗体とを用いて、ジストロフィンの二つ以上のエピトープにそれぞれ結合するサンドイッチイムノアッセイを行うことが好ましい。特に好ましくは、捕捉抗体がジストロフィンのＣ末端領域を認識し且つ検出抗体がジストロフィンのＮ末端領域を認識するか、または捕捉抗体がジストロフィンのＮ末端領域を認識し且つ検出抗体が前記ジストロフィンのＣ末端領域を認識することが好ましい。
捕捉抗体または検出抗体がジストロフィンのＣ末端領域を認識することにより、Ｃ末端領域まで合成されたジストロフィンを結合することができる。これによって、Ｃ末端領域を認識する捕捉抗体または検出抗体によれば、リードスルーまたはエキソンスキッピングによって発現が回復したジストロフィンを検出することができる。捕捉抗体または検出抗体がジストロフィンのＮ末端領域を認識することにより、ジストロフィンアイソフォームの内、Ｎ末端領域を含む分子量４２７ｋＤａの全長ジストロフィンに結合することができる。これによって、Ｎ末端領域を認識する捕捉抗体または検出抗体は、全長ジストロフィンの他の、Ｎ末端領域を含まない分子量２６０ｋＤａ、１４０ｋＤａ、１１６ｋＤａ、７１−７５ｋＤａのジストロフィンアイソフォームには結合せずに、全長ジストロフィンを検出することができる。
なお、ジストロフィンのＮ末端領域とは、一例として、全長ジストロフィンの４１０〜４５０番のアミノ酸、またはこのアミノ酸の少なくとも一部を含む領域をいう。ジストロフィンのＣ末端領域とは、一例として、全長ジストロフィンの３６６９〜３６８５番のアミノ酸、またはこのアミノ酸の少なくとも一部を含む領域をいう。
捕捉抗体はジストロフィンに対するモノクローナル抗体であってもよく、またはジストロフィンに対するポリクローナル抗体であってもよい。捕捉抗体が認識するジストロフィンのエピトープと同一または類似するエピトープを有する、ジストロフィン以外の抗原との交叉反応を避けて、ジストロフィンへの特異性を高める観点から、捕捉抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。または、ジストロフィンの複数のエピトープへの結合を可能として、一つのジストロフィンに対して複数の捕捉抗体の結合が生じることによって感度を向上させる観点から、捕捉抗体はポリクローナル抗体であることが好ましい。ジストロフィン検出の特異性と感度とを両立させる観点から、捕捉抗体がモノクローナル抗体であり且つ検出抗体がポリクローナル抗体であるか、または、捕捉抗体がポリクローナル抗体であり且つ検出抗体がモノクローナル抗体であることがより好ましい。
捕捉抗体及び後述する検出抗体のポリクローナル抗体の産生は、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、マウス、ウサギ、ラット、ヤギ、ヒツジ、ニワトリなどの宿主動物に、全長ジストロフィン、ジストロフィン断片、またはジストロフィン断片に相当するペプチドを投与することによって免疫する。そして、免疫した宿主動物から抗血清を採取して、抗体を精製することにより得ることができる。
また、捕捉抗体及び後述する検出抗体のモノクローナル抗体の産生も、公知の手法を用いて行うことができる。例えば、上記モノクローナル抗体の産生に用いた宿主動物に、全長ジストロフィン、ジストロフィン断片、またはジストロフィン断片に相当するペプチドを投与することによって免疫する。免疫後に、免疫した宿主動物から脾臓またはリンパ節を採取して、所望の抗体を産生する細胞を骨髄腫細胞と融合させてハイブリドーマを得る。さらにこのハイブリドーマをクローン化することで、得られたクローンよりモノクローナル抗体を産生することができる。
Ｃ末端領域を認識する捕捉抗体または検出抗体のポリクローナル抗体を得るためには、ジストロフィンのＣ末端領域に相当するペプチドを免疫に用いて抗体を産生することが好ましい。また、Ｃ末端領域を認識する捕捉抗体または検出抗体のモノクローナル抗体を得るためには、ジストロフィンのＣ末端領域に相当するペプチドを免疫に用いて抗体を産生するか、ジストロフィンのＣ末端領域に相当するペプチドを用いて、ハイブリドーマのスクリーニングを行うことが好ましい。同様に、Ｎ末端領域を認識する捕捉抗体または検出抗体のポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を得るためには、ジストロフィンのＮ末端領域に相当するペプチドを免疫に用いて抗体を産生するか、または、ジストロフィンのＮ末端領域に相当するペプチドを用いて、ハイブリドーマのスクリーニングを行うことが好ましい。
捕捉抗体は、捕捉抗体を緩衝液に溶解した捕捉抗体溶液として測定に供されることが好ましい。緩衝液としては、特に限定されず、例えば、トリス塩酸緩衝液、トリスグリシン緩衝液、リン酸緩衝液などを用いることができるが、これらに特に限定されない。緩衝液のｐＨは、ｐＨ６．５〜ｐＨ８．５であることが好ましく、ｐＨ７〜ｐＨ８であることがより好ましい。また、緩衝液は、必要に応じて、タンパク質を安定化するためのキャリアタンパク質、塩、キレート剤を含有してもよい。キャリアタンパク質としては、例えば、牛血清アルブミン（Bovine serum albumin；ＢＳＡ）、馬血清アルブミン、オボアルブミン、キーホールリンペットヘモシアニン等を用いることができるが、これらに特に限定されない。塩としては、例えば、ＮａＣｌ、ＫＣｌ等を用いることができるが、これらに特に限定されない。キレート剤としては、例えば、エチレンジアミン四酢酸（Ethylenediaminetetraacetic acid；ＥＤＴＡ）、グリコールエーテルジアミン四酢酸等を用いることができるが、これらに特に限定されない。塩を含有する緩衝液の具体例としては、例えば、リン酸緩衝生理食塩水（Phosphate buffered saline；ＰＢＳ）、トリス緩衝生理食塩水（Tris-Buffered Saline；ＴＢＳ）が挙げられるが、これらに特に限定されない。
捕捉抗体溶液の濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１０μｇ／ｍｌであることが好ましく、０．１〜５μｇ／ｍｌであることがより好ましく、０．５〜２μｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。捕捉抗体溶液の濃度が上記の範囲内にあることにより、測定の感度を向上させることができる。
捕捉抗体は、固相に固定化されてもよい。捕捉抗体が固相に固定化される場合には、捕捉抗体を固相に対して結合させることによって直接固定化を行ってもよく、後述する固定化二次抗体を固相に固定化して、この固定化二次抗体と捕捉抗体とを結合させることによって、固定化二次抗体を介して固定化を行ってもよい。電気化学発光量の測定の際にバックグラウンドを低減する観点から、固定化二次抗体を介して捕捉抗体の固定化を行うことが好ましい。
捕捉抗体を、固相に対して固定化する場合には、捕捉抗体と固相との共有結合または非共有結合（例えば、疎水性相互作用、イオン結合、水素結合、ファンデルワールス力、双極子間結合）によって結合させることができる。または、アビジンとストレプトアビジンとの結合のように、リガンドとこのリガンドに特異的に結合する物質とを用いて、いずれか一方を捕捉抗体に標識して、他方を固相に標識することで結合させてもよい。
捕捉抗体を、固定化二次抗体を介して固定化する場合には、捕捉抗体と固定化二次抗体との抗原抗体反応によって結合させることができる。この場合、固定化二次抗体が捕捉抗体の定常領域を特異的に認識して結合することが好ましい。
＜検出抗体＞
検出抗体は、ジストロフィンの捕捉抗体が認識する領域とは別の領域を特異的に認識して、ジストロフィンとの抗原抗体反応を生じることで、ジストロフィンと結合する抗体である。検出抗体のジストロフィン上の認識部位は特に限定されないが、捕捉抗体とは別の領域を認識して結合することが好ましい。検出抗体の認識部位と捕捉抗体の認識部位との関係は、上記の捕捉抗体についての説明を行った通りである。
検出抗体は、ジストロフィンの捕捉抗体が認識する領域とは別の領域を特異的に認識して、ジストロフィンとの抗原抗体反応を生じることで、ジストロフィンと結合する抗体である。検出抗体のジストロフィン上の認識部位は特に限定されないが、捕捉抗体とは別の領域を認識して結合することが好ましい。検出抗体の認識部位と捕捉抗体の認識部位との関係は、上記の捕捉抗体についての説明を行った通りである。
検出抗体はジストロフィンに対するモノクローナル抗体であってもよく、またはジストロフィンに対するポリクローナル抗体であってもよい。捕捉抗体と同様に、ジストロフィンへの特異性を高める観点から、検出抗体はモノクローナル抗体であることが好ましい。または、感度を向上させる観点から、検出抗体はポリクローナル抗体であることが好ましい。検出抗体と捕捉抗体におけるモノクローナル抗体とポリクローナル抗体との関係は、上記の捕捉抗体についての説明を行った通りである。
本測定方法では、ジストロフィンに結合した検出抗体を、ＥＣＬ法によって生じる電気化学発光量を測定することによって検出する。ＥＣＬ法による電気化学発光は、ＥＣＬ法に通常用いられる発光性金属錯体を利用することによって行うことができる。この発光性金属錯体は、中心原子としての多価金属と配位子とによって構成される。発光性金属錯体に含まれる多価金属としては、例えば、ルテニウム、オスミウム、レニウム、セリウム、ユーロピウム、テルビウム、イッテルビウム等が挙げられる。また、配位子としては、例えば、ビピリジル、置換ビピリジル、１，１０−フェナントロリン、置換１，１０−フェナントロリン等の芳香族多座配位子が挙げられるが、これらに特に限定されない。これらの発光性金属錯体の中でも、中心原子としてルテニウムを有する、ルテニウム含有化合物（ルテニウム錯体）が好ましく、より好ましくはルテニウムと芳香族多座配位子との金属錯体、例えばビス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体、またはトリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体がより好ましく、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体がさらに好ましい。
検出抗体のＥＣＬ法による検出は、発光性金属錯体が標識された検出抗体の電気化学発光によって行うことができる。検出抗体への発光性金属錯体の導入は、検出抗体に発光性金属錯体を直接標識する、または、検出抗体を認識し且つ前記発光性金属錯体が標識された後述する検出二次抗体を検出抗体に結合させる等によって行うことができる。測定の感度を向上させる点からは、発光性金属錯体を標識した検出二次抗体を検出抗体に結合させ、検出二次抗体を介して検出抗体に標識している発光性金属錯体の電気化学発光によって行うことが好ましい。検出抗体または検出二次抗体への発光性金属錯体の標識は、これに限定されるものではないが、例えば、発光性金属錯体の多座配位子におけるスルホン化誘導体（例えば、Ｍｅｓｏ Ｓｃａｌｅ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ製のＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ（商標）標識）を用いることで行うことができる。
検出抗体は、検出抗体を緩衝液に溶解した検出抗体溶液として測定に供されることが好ましい。緩衝液としては、上記の捕捉抗体溶液の説明において挙げた緩衝液を用いることができる。
検出抗体溶液の濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１０μｇ／ｍｌであることが好ましく、０．１〜５μｇ／ｍｌであることがより好ましく、０．５〜２μｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。検出抗体溶液の濃度が上記の範囲内にあることにより、測定の感度を向上させることができる。
＜固定化二次抗体＞
固定化二次抗体は、捕捉抗体を特異的に認識して、捕捉抗体との抗原抗体反応を生じることで、捕捉抗体と結合する抗体である。また、固定化二次抗体は、固定化されうる。固定化二次抗体を、固相に対して固定化する場合には、上記の捕捉抗体の固相に対する固定化と同様に行うことができる。
固定化二次抗体は、捕捉抗体を特異的に認識して、捕捉抗体との抗原抗体反応を生じることで、捕捉抗体と結合する抗体である。また、固定化二次抗体は、固定化されうる。固定化二次抗体を、固相に対して固定化する場合には、上記の捕捉抗体の固相に対する固定化と同様に行うことができる。
固定化二次抗体の認識部位は、捕捉抗体の定常領域であることが好ましい。また、固定化二次抗体は、捕捉抗体の産生に用いられたホスト動物に対する抗体を用いることが好ましい。固定化二次抗体は、捕捉抗体に対するモノクローナル抗体であってもよく、または捕捉抗体に対するポリクローナル抗体であってもよい。捕捉抗体の複数のエピトープへの結合を可能として、固相に固定化した固定化二次抗体と捕捉抗体との結合を促進して高い感度を得る観点から、固定化二次抗体はポリクローナル抗体であることが好ましい。
固定化二次抗体は、固定化二次抗体を緩衝液に溶解した固定化二次抗体溶液として測定に供されることが好ましい。緩衝液としては、上記の捕捉抗体溶液の説明において挙げた緩衝液を用いることができる。
固定化二次抗体溶液の濃度は、特に限定されないが、０．１〜１００μｇ／ｍｌであることが好ましく、１〜５０μｇ／ｍｌであることがより好ましく、５〜２０μｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。固定化二次抗体溶液の濃度が上記の範囲内にあることにより、測定の感度を向上させることができる。
＜検出二次抗体＞
検出二次抗体は、検出抗体を特異的に認識して、検出抗体との抗原抗体反応を生じることで結合する抗体である。検出二次抗体は、上記の検出抗体において説明した、ＥＣＬ法による検出に用いられる発光性金属錯体によって標識される。これにより、検出二次抗体は、ＥＣＬ法による電気化学発光を生じる。
検出二次抗体は、検出抗体を特異的に認識して、検出抗体との抗原抗体反応を生じることで結合する抗体である。検出二次抗体は、上記の検出抗体において説明した、ＥＣＬ法による検出に用いられる発光性金属錯体によって標識される。これにより、検出二次抗体は、ＥＣＬ法による電気化学発光を生じる。
検出二次抗体は、検出抗体の産生に用いられたホスト動物に対する抗体を用いることが好ましい。検出二次抗体は、検出抗体に対するモノクローナル抗体であってもよく、または検出抗体に対するポリクローナル抗体であってもよい。検出抗体の複数のエピトープへの結合を可能として、一つの検出抗体に対する複数の検出二次抗体の結合により高い感度を得る観点から、検出二次抗体はポリクローナル抗体であることが好ましい。
検出二次抗体は、検出二次抗体を緩衝液に溶解した検出二次抗体溶液として測定に供されることが好ましい。緩衝液としては、上記の捕捉抗体溶液の説明において挙げた緩衝液を用いることができる。
検出二次抗体溶液の濃度は、特に限定されないが、０．０１〜１０μｇ／ｍｌであることが好ましく、０．１〜５μｇ／ｍｌであることがより好ましく、０．５〜２μｇ／ｍｌであることがさらに好ましい。検出二次抗体溶液の濃度が上記の範囲内にあることにより、測定の感度を向上させることができる。
＜固相＞
本測定方法では、上記の通り捕捉抗体を固相に固定化してもよく、この固相にジストロフィンを含む試料溶液を適用することで、固定化された捕捉抗体とジストロフィンとの抗原抗体反応を生じさせてもよい。この場合、試料溶液に含まれるジストロフィンを、捕捉抗体に結合することができるとともに、試料溶液に含まれる捕捉抗体に結合しない成分を分離することができる。よって、生体試料に含まれるジストロフィンの特異的な検出が可能となる。なお、試料溶液を適用するとは、固相に対して試料溶液を分注、注入、または滴下等を行うことにより、試料溶液に含まれるジストロフィンと捕捉抗体とを接触させることをいう。
本測定方法では、上記の通り捕捉抗体を固相に固定化してもよく、この固相にジストロフィンを含む試料溶液を適用することで、固定化された捕捉抗体とジストロフィンとの抗原抗体反応を生じさせてもよい。この場合、試料溶液に含まれるジストロフィンを、捕捉抗体に結合することができるとともに、試料溶液に含まれる捕捉抗体に結合しない成分を分離することができる。よって、生体試料に含まれるジストロフィンの特異的な検出が可能となる。なお、試料溶液を適用するとは、固相に対して試料溶液を分注、注入、または滴下等を行うことにより、試料溶液に含まれるジストロフィンと捕捉抗体とを接触させることをいう。
固相は、特に限定されず、ＥＣＬ法に用いられる、捕捉抗体を固定するための支持体面を有する公知の基材を適宜用いることができる。このような固相としては、例えば、樹脂、ポリマー、ガラス、セラミック、または金属などの物質で形成される、プレート、キュベット、チューブ、ビーズ、多孔質体、またはメンブレンが挙げられるが、これらに特に限定されない。これらの中でも、複数のウェルを備えるプラスチック製のプレートであって、各ウェル中に電気化学発光を生じさせるための一対の電極をそれぞれ有するマルチウェルプレートが好ましい。
＜可溶化溶液＞
可溶化溶液は、生体試料に含まれるジストロフィンの可溶化に用いられる、少なくとも界面活性剤を含有する水溶液である。ジストロフィンは疎水性の巨大分子であって水には溶けにくい性質を有する。また、ジストロフィンは、細胞膜の内側に存在して、細胞骨格のアクチンと結合している。このため、ジストロフィンの測定を行うにあたっては、界面活性剤を含む可溶化溶液を用いることによりジストロフィンの可溶化を行って、可溶化試料溶液を得ることが好ましい。
可溶化溶液は、生体試料に含まれるジストロフィンの可溶化に用いられる、少なくとも界面活性剤を含有する水溶液である。ジストロフィンは疎水性の巨大分子であって水には溶けにくい性質を有する。また、ジストロフィンは、細胞膜の内側に存在して、細胞骨格のアクチンと結合している。このため、ジストロフィンの測定を行うにあたっては、界面活性剤を含む可溶化溶液を用いることによりジストロフィンの可溶化を行って、可溶化試料溶液を得ることが好ましい。
可溶化に用いられる界面活性剤は、特に限定されないが、通常、陽イオン性界面活性剤、陰イオン性界面活性剤、両性界面活性剤、非イオン性界面活性剤などが用いられる。これらの中でも、陰イオン性界面活性剤が好ましく用いられる。陰イオン性界面活性剤の具体例としては、ドデシル硫酸ナトリウム（Sodium dodecyl sulfate；ＳＤＳ）、ドデシル硫酸リチウム、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸ナトリウム等が挙げられるが、これらに特に限定されない。これらの中でも、ＳＤＳが好ましい。
界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、可溶化溶液総量に対して、０．１ｗ／ｖ％〜１０ｗ／ｖ％が好ましく、０．５ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％がより好ましく、１ｗ／ｖ％〜３ｗ／ｖ％がさらに好ましい。界面活性剤の濃度が上記範囲内であることにより、生体試料からジストロフィンを可溶化して測定に十分なジストロフィンを得ることができ、且つ過剰な界面活性剤が測定に与える影響を抑えることができる。
可溶化溶液は、さらに還元剤を含むことが好ましい。可溶化溶液に含有される還元剤は、例えば、２−メルカプトエタノール（2-mercaptoethano；２−ＭＥ）、１，４−ジチオトレイトール、還元型グルタチオン等が挙げられるが、これらに特に限定されない。これらの中でも、２−ＭＥが好ましい。
還元剤の濃度は特に限定されないが、可溶化溶液総量に対して、０．０５ｗ／ｖ％〜５ｗ／ｖ％が好ましく、０．１ｗ／ｖ％〜１ｗ／ｖ％がより好ましく、０．２ｗ／ｖ％〜０．５ｗ／ｖ％がさらに好ましい。還元剤の濃度が上記範囲内であることにより、可溶化したジストロフィンの酸化を防ぎ、ジスルフィド結合の形成によるジストロフィンの凝集を防止することができ、且つ過剰な還元剤が測定に与える影響を抑えることができる。
可溶化溶液は、界面活性剤及び還元剤を含有する緩衝液であることが好ましい。緩衝液としては、上記の捕捉抗体溶液の説明において挙げた緩衝液を用いることができる。
＜希釈溶液＞
希釈溶液は、可溶化試料溶液の希釈に用いられる、少なくとも非イオン性界面活性剤を含有する水溶液である。可溶化試料溶液には界面活性剤が含まれるため、この可溶化試料溶液をそのまま測定に供した場合には、抗原抗体反応に影響を及ぼして、測定の感度を低下させるおそれがある。一方で、単純に可溶化試料溶液を希釈した場合には、界面活性剤の濃度が低下することで、ジストロフィンが凝集する場合がある。このため、ジストロフィンの測定を行うにあたっては、非イオン性界面活性剤を含有する希釈溶液を用いることにより可溶化試料溶液の希釈を行って、希釈試料溶液を得ることが好ましい。非イオン性界面活性剤は界面活性剤の中でもマイルドな性質を有することから、可溶化に用いられた界面活性剤の濃度を下げて測定への影響を抑えるとともに、ジストロフィンの可溶化を維持することができる。
希釈溶液は、可溶化試料溶液の希釈に用いられる、少なくとも非イオン性界面活性剤を含有する水溶液である。可溶化試料溶液には界面活性剤が含まれるため、この可溶化試料溶液をそのまま測定に供した場合には、抗原抗体反応に影響を及ぼして、測定の感度を低下させるおそれがある。一方で、単純に可溶化試料溶液を希釈した場合には、界面活性剤の濃度が低下することで、ジストロフィンが凝集する場合がある。このため、ジストロフィンの測定を行うにあたっては、非イオン性界面活性剤を含有する希釈溶液を用いることにより可溶化試料溶液の希釈を行って、希釈試料溶液を得ることが好ましい。非イオン性界面活性剤は界面活性剤の中でもマイルドな性質を有することから、可溶化に用いられた界面活性剤の濃度を下げて測定への影響を抑えるとともに、ジストロフィンの可溶化を維持することができる。
希釈溶液に含有される非イオン性界面活性剤としては、例えば、Ｎｏｎｉｄｅｔ（登録商標）Ｐ−４０（ＮＰ−４０）、Ｔｒｉｔｏｎ（登録商標）Ｘ−１００、Ｔｗｅｅｎ（登録商標）２０、オクチルβ−グルコシド等が挙げられるが、これらに特に限定されない。これらの中でも、ＮＰ−４０が好ましい。
非イオン性界面活性剤の濃度は、特に限定されないが、希釈溶液総量に対して、０．００５ｗ／ｖ％〜１ｗ／ｖ％が好ましく、０．０１ｗ／ｖ％〜０．１ｗ／ｖ％がより好ましい。非イオン性界面活性剤の濃度が上記範囲内であることにより、可溶化試料溶液に含まれる界面活性剤を希釈して測定への影響を抑えることができ、且つジストロフィンの可溶化を維持することができる。
希釈溶液は、非イオン性界面活性剤を含有する緩衝液であることが好ましい。緩衝液としては、上記の捕捉抗体溶液の説明において挙げた緩衝液を用いることができる。
［測定方法について］
本測定方法は、操作の順序に従って、抗原結合工程、検出抗体結合工程、及び測定工程を備えて構成される。さらに、本測定方法は、可溶化工程、希釈工程、二次抗体固定化工程、ブロッキング工程、捕捉抗体結合工程、検出二次抗体結合工程、検量線作成工程、算出工程を備えることが好ましい。以下に、図１を参照して、これらの工程を順に説明する。なお、本測定方法は、公知のＥＣＬ法による電気化学発光量の測定方法を利用して行うことができる。
本測定方法は、操作の順序に従って、抗原結合工程、検出抗体結合工程、及び測定工程を備えて構成される。さらに、本測定方法は、可溶化工程、希釈工程、二次抗体固定化工程、ブロッキング工程、捕捉抗体結合工程、検出二次抗体結合工程、検量線作成工程、算出工程を備えることが好ましい。以下に、図１を参照して、これらの工程を順に説明する。なお、本測定方法は、公知のＥＣＬ法による電気化学発光量の測定方法を利用して行うことができる。
なお、ここでは、固相に固定化二次抗体を固定化して、この固定化二次抗体に捕捉抗体を結合させる場合を例に挙げて説明する。また、検出二次抗体に標識した発光性金属錯体の電気化学発光を生じさせることによって、電気化学発光量の測定を行う場合を例に挙げて説明する。また、ここでは、捕捉抗体としてジストロフィンのＣ末端領域を認識するモノクローナル抗体を、検出抗体としてジストロフィンのＮ末端領域を認識するポリクローナル抗体を用いる場合を例に挙げて説明する。また、ここでは、固相としてウェルを備えるプレートを用いる場合を例に挙げて説明する。
＜可溶化工程＞
まず、検体から採取した生体試料に対して、可溶化溶液を用いて生体試料の可溶化を行い、ジストロフィンを可溶化した可溶化試料溶液を得る（ステップＳ１１：可溶化工程）。このとき、通常、生体試料に含まれる他のタンパク質と共に、ジストロフィンが可溶化される。生体試料の可溶化の手法は、特に限定されないが、例えば、生体試料に可溶化溶液を加えて冷却しながら、ホモジナイザー、ガラスビーズ、または超音波処理などを用いて細胞を破砕する処理を行い、生体試料の細胞破砕液（ホモジネート）を調製することにより行うことができる。さらに、このホモジネートに遠心分離を行い、上清を回収することで、可溶化試料溶液を得ることが好ましい。
まず、検体から採取した生体試料に対して、可溶化溶液を用いて生体試料の可溶化を行い、ジストロフィンを可溶化した可溶化試料溶液を得る（ステップＳ１１：可溶化工程）。このとき、通常、生体試料に含まれる他のタンパク質と共に、ジストロフィンが可溶化される。生体試料の可溶化の手法は、特に限定されないが、例えば、生体試料に可溶化溶液を加えて冷却しながら、ホモジナイザー、ガラスビーズ、または超音波処理などを用いて細胞を破砕する処理を行い、生体試料の細胞破砕液（ホモジネート）を調製することにより行うことができる。さらに、このホモジネートに遠心分離を行い、上清を回収することで、可溶化試料溶液を得ることが好ましい。
＜希釈工程＞
次に、可溶化試料溶液と希釈溶液とを混合して、可溶化試料溶液の希釈を行い、希釈化試料溶液を得る（ステップＳ１２：希釈工程）。このとき、希釈を行った状態の希釈化試料溶液において、可溶化試料溶液に含まれていた界面活性剤の濃度が、希釈化試料溶液の総量に対して、通常１ｗ／ｖ％以下、好ましくは０．５ｗ／ｖ％以下、より好ましくは０．２ｗ／ｖ％以下となるよう希釈を行うことが好ましい。
次に、可溶化試料溶液と希釈溶液とを混合して、可溶化試料溶液の希釈を行い、希釈化試料溶液を得る（ステップＳ１２：希釈工程）。このとき、希釈を行った状態の希釈化試料溶液において、可溶化試料溶液に含まれていた界面活性剤の濃度が、希釈化試料溶液の総量に対して、通常１ｗ／ｖ％以下、好ましくは０．５ｗ／ｖ％以下、より好ましくは０．２ｗ／ｖ％以下となるよう希釈を行うことが好ましい。
＜二次抗体固定化工程＞
ＥＣＬ法によるジストロフィンの測定に先立って、固定化二次抗体を固相に固定化する（ステップＳ１３：二次抗体固定化工程）。固定化二次抗体の固定化は、固定化二次抗体を含有する固定化二次抗体溶液をウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、固定化二次抗体が固相に接触して結合することで、固相に固定化される。
ＥＣＬ法によるジストロフィンの測定に先立って、固定化二次抗体を固相に固定化する（ステップＳ１３：二次抗体固定化工程）。固定化二次抗体の固定化は、固定化二次抗体を含有する固定化二次抗体溶液をウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、固定化二次抗体が固相に接触して結合することで、固相に固定化される。
＜ブロッキング工程＞
次に、固定化二次抗体を固定化した固相にブロッキングを行う（ステップＳ１４：ブロッキング工程）。ブロッキングは、二次抗体、捕捉抗体、検出抗体、及び検出二次抗体のいずれとも結合しない、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼイン等のブロッキング剤を含む溶液をウェルに加えて静置することにより行う。これにより、ブロッキング剤が固相に接触して吸着することで、固相表面がブロッキングされる。ブロッキングを行うことにより、抗体及びジストロフィンが固相に非特異的に吸着することを防ぐ。
次に、固定化二次抗体を固定化した固相にブロッキングを行う（ステップＳ１４：ブロッキング工程）。ブロッキングは、二次抗体、捕捉抗体、検出抗体、及び検出二次抗体のいずれとも結合しない、ＢＳＡ、スキムミルク、カゼイン等のブロッキング剤を含む溶液をウェルに加えて静置することにより行う。これにより、ブロッキング剤が固相に接触して吸着することで、固相表面がブロッキングされる。ブロッキングを行うことにより、抗体及びジストロフィンが固相に非特異的に吸着することを防ぐ。
＜捕捉抗体結合工程＞
ブロッキングを行った固相に、捕捉抗体を結合させる（ステップＳ１５：捕捉抗体結合工程）。捕捉抗体の結合は、捕捉抗体を含む捕捉抗体溶液をウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、捕捉抗体と固定化二次抗体とが抗原抗体反応を生じて結合することで、捕捉抗体が固相に固定化される。
ブロッキングを行った固相に、捕捉抗体を結合させる（ステップＳ１５：捕捉抗体結合工程）。捕捉抗体の結合は、捕捉抗体を含む捕捉抗体溶液をウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、捕捉抗体と固定化二次抗体とが抗原抗体反応を生じて結合することで、捕捉抗体が固相に固定化される。
＜抗原結合工程＞
続いて、固相に固定化された捕捉抗体に、ジストロフィンを結合させる（ステップＳ１６：抗原結合工程）。ジストロフィンの結合は、ステップＳ１２で得られた希釈化試料溶液を測定試料としてウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、捕捉抗体がジストロフィンのＮ末領域を認識して、抗原抗体反応を生じて結合する。
続いて、固相に固定化された捕捉抗体に、ジストロフィンを結合させる（ステップＳ１６：抗原結合工程）。ジストロフィンの結合は、ステップＳ１２で得られた希釈化試料溶液を測定試料としてウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、捕捉抗体がジストロフィンのＮ末領域を認識して、抗原抗体反応を生じて結合する。
＜検出抗体結合工程＞
さらに、捕捉抗体に結合したジストロフィンに、検出抗体を結合させる（ステップＳ１７：検出抗体結合工程）。検出抗体の結合は、検出抗体を含む検出抗体溶液をウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、検出抗体がジストロフィンのＣ末領域を認識して、抗原抗体反応を生じて結合する。
さらに、捕捉抗体に結合したジストロフィンに、検出抗体を結合させる（ステップＳ１７：検出抗体結合工程）。検出抗体の結合は、検出抗体を含む検出抗体溶液をウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、検出抗体がジストロフィンのＣ末領域を認識して、抗原抗体反応を生じて結合する。
＜検出二次抗体結合工程＞
またさらに、ジストロフィンに結合した検出抗体に、検出二次抗体を結合させる（ステップＳ１８：検出二次抗体結合工程）。検出二次抗体の結合は、検出二次抗体を含む検出二次抗体溶液をウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、検出二次抗体が検出抗体を認識して、抗原抗体反応を生じて結合する。このとき、固相上には、固定化二次抗体、捕捉抗体、ジストロフィン、検出抗体、及び検出二次抗体がこの順で結合した複合体が形成される。
またさらに、ジストロフィンに結合した検出抗体に、検出二次抗体を結合させる（ステップＳ１８：検出二次抗体結合工程）。検出二次抗体の結合は、検出二次抗体を含む検出二次抗体溶液をウェルに加えて、振とうさせつつ一定温度でインキュベーションすることにより行う。これにより、検出二次抗体が検出抗体を認識して、抗原抗体反応を生じて結合する。このとき、固相上には、固定化二次抗体、捕捉抗体、ジストロフィン、検出抗体、及び検出二次抗体がこの順で結合した複合体が形成される。
＜測定工程＞
上記の複合体の形成後、電気化学発光リーダーを用いて、ＥＣＬ法により生じる電気化学発光量を測定する（ステップＳ１９：測定工程）。電気化学発光量の測定は、まず、ＥＣＬ反応における電子供与物質を含む溶液をウェルに加える。さらに、ウェルに備えられた電極を介して、ウェル内の溶液に電圧を印加することによって、検出二次抗体に標識された発光性金属錯体と電子供与物質との酸化還元反応により、発光性金属錯体から電気化学発光が誘導される。この電気化学発光を、電気化学発光リーダーが備える光電子増倍管によって検出することで、電気化学発光量を測定する。電子供与物質としては、例えば、トリプロピルアミン（Tripropylamine；ＴＰＡ）等の第三級アルキルアミンが用いられるが、これに特に限定されない。
上記の複合体の形成後、電気化学発光リーダーを用いて、ＥＣＬ法により生じる電気化学発光量を測定する（ステップＳ１９：測定工程）。電気化学発光量の測定は、まず、ＥＣＬ反応における電子供与物質を含む溶液をウェルに加える。さらに、ウェルに備えられた電極を介して、ウェル内の溶液に電圧を印加することによって、検出二次抗体に標識された発光性金属錯体と電子供与物質との酸化還元反応により、発光性金属錯体から電気化学発光が誘導される。この電気化学発光を、電気化学発光リーダーが備える光電子増倍管によって検出することで、電気化学発光量を測定する。電子供与物質としては、例えば、トリプロピルアミン（Tripropylamine；ＴＰＡ）等の第三級アルキルアミンが用いられるが、これに特に限定されない。
＜検量線作成工程＞
上記の生体試料を用いた生体試料に含まれる前記ジストロフィンにおける電気化学発光量の測定（ステップＳ１３〜Ｓ１９）と同様にして、標準品ジストロフィンを用いて電気化学発光量の測定を行う。このとき、標準品ジストロフィンの濃度が異なる複数の標準試料溶液を調製して、それぞれの電気化学発光量の測定を行うことで、標準品ジストロフィンの濃度と電気化学発光量との検量線を作成する（ステップＳ２０：検量線作成工程）。なお、本明細書において検量線という場合、ジストロフィンの濃度と各濃度における電気化学発光量との関係をプロットして得られるグラフと、ジストロフィンの濃度と各濃度における電気化学発光量との関係から算出される回帰式とを含むものとする。
上記の生体試料を用いた生体試料に含まれる前記ジストロフィンにおける電気化学発光量の測定（ステップＳ１３〜Ｓ１９）と同様にして、標準品ジストロフィンを用いて電気化学発光量の測定を行う。このとき、標準品ジストロフィンの濃度が異なる複数の標準試料溶液を調製して、それぞれの電気化学発光量の測定を行うことで、標準品ジストロフィンの濃度と電気化学発光量との検量線を作成する（ステップＳ２０：検量線作成工程）。なお、本明細書において検量線という場合、ジストロフィンの濃度と各濃度における電気化学発光量との関係をプロットして得られるグラフと、ジストロフィンの濃度と各濃度における電気化学発光量との関係から算出される回帰式とを含むものとする。
＜算出工程＞
さらに、ステップＳ２０で得られた検量線と、ステップＳ１９で得られた生体試料に含まれるジストロフィンにおける電気化学発光量とに基づいて、生体試料に含まれる前記ジストロフィンの量を算出する（ステップＳ２１：算出工程）。
さらに、ステップＳ２０で得られた検量線と、ステップＳ１９で得られた生体試料に含まれるジストロフィンにおける電気化学発光量とに基づいて、生体試料に含まれる前記ジストロフィンの量を算出する（ステップＳ２１：算出工程）。
［測定キットについて］
本実施形態のタンパク質の測定キット（以降、単に「本測定キット」とも称する。）は、上記の本測定方法のために用いられるキットであって、上記測定方法を行うために必要な要素を提供する。すなわち本測定キットは、ＥＣＬ法用のタンパク質の測定キットである。より具体的には、遺伝性疾患に関わるタンパク質の測定キットである。
本実施形態のタンパク質の測定キット（以降、単に「本測定キット」とも称する。）は、上記の本測定方法のために用いられるキットであって、上記測定方法を行うために必要な要素を提供する。すなわち本測定キットは、ＥＣＬ法用のタンパク質の測定キットである。より具体的には、遺伝性疾患に関わるタンパク質の測定キットである。
本測定キットは、少なくとも捕捉抗体、及び検出抗体を備えるものである。また、本測定キットは、検出二次抗体を備えることが好ましい。さらに、本測定キットは、固定化二次抗体を備えていてもよく、可溶化溶液及び希釈溶液を備えていてもよい。また、本測定キットは、ＥＣＬ法により電気化学発光を生じさせるための電子供与物質を備えていてもよく、検量線を作成する際に用いられるＲＦＤを備えていてもよい。またさらに、本測定キットは、固相を備えていてもよく、本測定方法を行う上での使用説明書を備えていてもよい。
本測定キットにおいては、捕捉抗体、検出抗体、検出二次抗体、固定化二次抗体、電子供与物質、及びＲＦＤは、これらの水溶液であることが好ましい。また、これらの水溶液は、緩衝液であることが好ましい。
［作用、効果］
本測定方法は、捕捉抗体に結合したタンパク質と検出抗体とを結合させて、この検出抗体を、電気化学的刺激によって生じる電気化学発光量を測定することによって検出することで、タンパク質の測定を行う。本測定方法によれば、ＥＣＬ法を利用することによって、感度、真度、及び精度に優れるタンパク質の測定方法を提供することができる。また、捕捉抗体、タンパク質、及び検出抗体がこの順序でサンドイッチされた複合体を形成することで、タンパク質に対して特異性の高い測定を行うことができる。これにより、本測定方法は、遺伝性疾患に関わるタンパク質の発現回復の確認を行う際に、微量なタンパク質であっても測定を行うことが可能である。
本測定方法は、捕捉抗体に結合したタンパク質と検出抗体とを結合させて、この検出抗体を、電気化学的刺激によって生じる電気化学発光量を測定することによって検出することで、タンパク質の測定を行う。本測定方法によれば、ＥＣＬ法を利用することによって、感度、真度、及び精度に優れるタンパク質の測定方法を提供することができる。また、捕捉抗体、タンパク質、及び検出抗体がこの順序でサンドイッチされた複合体を形成することで、タンパク質に対して特異性の高い測定を行うことができる。これにより、本測定方法は、遺伝性疾患に関わるタンパク質の発現回復の確認を行う際に、微量なタンパク質であっても測定を行うことが可能である。
従来のタンパク質の測定方法としてＥＬＩＳＡが知られているが、本測定方法によれば、ＥＬＩＳＡの１０〜１００倍程度の感度で測定を行うことができる。ここで、ＥＬＩＳＡなどの免疫アッセイ法においては、高濃度の界面活性剤及び還元剤の存在下では検出感度が低下することがある。例えば市販キットの場合、ＳＤＳの濃度が０．０２％未満、２−ＭＥの濃度が０．５ｍＭ未満であることが要求される。界面活性剤及び還元剤の影響を避けるためには、界面活性剤及び還元剤、並びにタンパク質を含む試料溶液を希釈することが考えられるが、この場合、希釈によりタンパク質の濃度が下がることでシグナル量が低下することから、ＥＬＩＳＡでは測定が困難となる課題があった。一方、本測定方法では高感度であるために、タンパク質を含む試料溶液を希釈した場合であっても測定が可能であり、且つ希釈によって界面活性剤及び還元剤の濃度を低下させて、界面活性剤及び還元剤の影響を受けないようにした状態で、高感度な測定を行うことができる。
本測定方法は、ウェスタンブロット法と比較しても感度に優れた測定方法である。また、ウェスタンブロット法では操作が煩雑であるため、精度が低くなることがあった。一方、本測定方法によれば電気化学的刺激による発光を行うことで操作が簡便となり、これも精度の向上に繋がっている。
また、本測定方法では、捕捉抗体または検出抗体がタンパク質のＣ末端領域を認識する抗体であることにより、捕捉抗体または検出抗体は発現欠損が生じたタンパク質には結合せず、全長タンパク質を認識して結合することができる。これにより、ＤＭＤ患者の組織に由来する生体試料を測定する場合において、アンチセンス薬もしくはリードスルー薬、または遺伝子治療によってエクソンスキップまたはリードスルーが生じた場合に、発現回復したジストロフィンに結合することができる。また、本測定方法では、捕捉抗体または検出抗体がタンパク質のＮ末端領域を認識する抗体であることにより、捕捉抗体または検出抗体はジストロフィンのアイソフォームを検出せずに、４２７ｋＤａのジストロフィンを認識して結合できる。このように、Ｃ末端領域を認識する捕捉抗体とＮ末端領域を認識する検出抗体とを組み合せるか、またはＮ末端領域を認識する捕捉抗体とＣ末端領域を認識する検出抗体とを組み合せることにより、全長タンパク質を検出して測定を行うことができる。このため、本測定方法によれば、アンチセンス薬もしくはリードスルー薬投与後、または遺伝子治療後の検体組織中のタンパク質の発現回復の確認が可能となる。
またさらに、本測定方法では、標準品ジストロフィンとして分子量４２７ｋＤａのジストロフィンの全長またはその一部を用いて検量線を作成し、この検量線に基づいてジストロフィンの量を算出する。全長ジストロフィンを精製した市販の標準品は存在していないため、従来の定量測定法では、生体組織から可溶化した全タンパク質量に対するジストロフィン量の相対的な定量を行うに留まり、絶対定量的な真度が求められない課題があった。これに対して、本測定方法によれば、ジストロフィン量の絶対的な存在量を定量することで、真度を高めることができる。
以下、各種試験結果に基づいて、本発明をさらに詳細に説明するが、なお、以下の実施例に示す材料、試薬、使用量、割合、処理内容、処理手順等は、本発明の趣旨を逸脱しない限り適宜変更することができる。したがって、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［抗体、試薬類、機器及び器具］
＜抗体＞
表１に、実施例及び参照例において使用した抗体を示す。
＜抗体＞
表１に、実施例及び参照例において使用した抗体を示す。
捕捉抗体として用いるNovocastra（登録商標） Lyophilized Mouse Monoclonal Antibody Dystrophin NCL-DYS2（以降、「ｍＡｂ３」と称する。）は、全長ジストロフィンの３６６９〜３６８５番のアミノ酸からなるＣ末端ペプチドを免疫原として産生した、ジストロフィンのＣ末端領域を認識するマウスＩｇＧモノクローナル抗体である。
検出抗体として用いるAnti-Dystrophin antibody ab131315（以降、「ｐＡｂ１」と称する。）は、全長ジストロフィンの４１０〜４５０番のアミノ酸からなるＣ末端ペプチドを免疫原として産生した、ジストロフィンのＮ末端領域を認識するラビットＩｇＧポリクローナル抗体である。
固定化二次抗体として用いるAffiniPure Goat Anti-Mouse IgG、 Fcγ Subclass 1 Specific（以降、「２ｎｄ Ａｂ１」と称する。）は、ヤギ抗マウスＩｇＧサブクラス特異的ポリクローナル抗体である。
検出二次抗体として用いるMSD SULFO-TAG labeled Anti-Rabbit Antibody (Goat)（以降、「ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ Ａｂ」と称する。）は、ヤギ抗ラビットＩｇＧサブクラス特異的ポリクローナル抗体であって、トリス（２，２’−ビピリジル）ルテニウム錯体のスルホン化誘導体による標識がなされている。
＜試薬類、機器及び器具＞
表２に、実施例及び参照例において使用した試薬類を示す。また、表３に、実施例及び参照例において使用した機器及び器具を示す。
表２に、実施例及び参照例において使用した試薬類を示す。また、表３に、実施例及び参照例において使用した機器及び器具を示す。
［試薬の調製例］
＜ＰＢＳの調製例＞
１０×Ｄ−ＰＢＳ（−）１０ｍｌ、及び水９０ｍｌを混合した。これにより、ＰＢＳ（１×）を得た。
＜ＰＢＳの調製例＞
１０×Ｄ−ＰＢＳ（−）１０ｍｌ、及び水９０ｍｌを混合した。これにより、ＰＢＳ（１×）を得た。
＜塩化ナトリウム水溶液の調製例＞
少量の水に塩化ナトリウム５．８ｇを加え溶解し、水で全量を１００ｍｌとした。これにより、１ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム水溶液を得た。
少量の水に塩化ナトリウム５．８ｇを加え溶解し、水で全量を１００ｍｌとした。これにより、１ｍｏｌ／ｌ塩化ナトリウム水溶液を得た。
＜可溶化溶液の調製例＞
１ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）０．２２ｍｌ、２０％ＳＤＳ５ｍｌ、グリセロール ２ｍｌ、及び２−メルカプトエタノールに水を加えて全量を５０ｍｌとした。これにより、可溶化溶液（４．４ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ、２％ ＳＤＳ、４％ グリセロール、０．２５％ ２−ＭＥ）を得た。
１ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）０．２２ｍｌ、２０％ＳＤＳ５ｍｌ、グリセロール ２ｍｌ、及び２−メルカプトエタノールに水を加えて全量を５０ｍｌとした。これにより、可溶化溶液（４．４ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ、２％ ＳＤＳ、４％ グリセロール、０．２５％ ２−ＭＥ）を得た。
＜希釈溶液の調製例＞
１ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌＢｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ８．０）２ｍｌ、１ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム水溶液１５ｍｌ、ＮＰ−４０（１０％ｉｎ Ｈ2Ｏ）０．５ｍｌ、１０％ ＢＳＡ １０ｍｌ、及び０．５ｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ８．０） ０．１ｍｌを混合した。０．１ｍｏｌ／ｌ塩酸を加え、ｐＨ７．５に調整した後に、水で全量１００ｍｌとした。これにより、希釈溶液（２０ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ、１５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、０．０５％ＮＰ−４０、１％ ＢＳＡ、０．５ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を得た。
１ｍｏｌ／ｌ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌＢｕｆｆｅｒ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ８．０）２ｍｌ、１ｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム水溶液１５ｍｌ、ＮＰ−４０（１０％ｉｎ Ｈ2Ｏ）０．５ｍｌ、１０％ ＢＳＡ １０ｍｌ、及び０．５ｍｏｌ／ｌ−ＥＤＴＡ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（ｐＨ８．０） ０．１ｍｌを混合した。０．１ｍｏｌ／ｌ塩酸を加え、ｐＨ７．５に調整した後に、水で全量１００ｍｌとした。これにより、希釈溶液（２０ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ、１５０ｍｍｏｌ／ｌ 塩化ナトリウム、０．０５％ＮＰ−４０、１％ ＢＳＡ、０．５ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ、ｐＨ７．５）を得た。
＜洗浄液の調製例＞
２０× ＴＢＳ−Ｔｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ ２０（以降、「２０×ＴＢＳＴ」と称する。）５０ｍｌ、及び水９５０ｍｌを混合した。これにより、これにより、洗浄液（１×ＴＢＳＴ）を得た。
２０× ＴＢＳ−Ｔｗｉｔｈ Ｔｗｅｅｎ ２０（以降、「２０×ＴＢＳＴ」と称する。）５０ｍｌ、及び水９５０ｍｌを混合した。これにより、これにより、洗浄液（１×ＴＢＳＴ）を得た。
＜ＴＢＳＴ−ＢＳＡ水溶液の調製例＞
１０％ ＢＳＡＤｉｌｕｅｎｔ／Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以降、「１０％ＢＳＡ」と称する。）５０ｍｌ、２０×ＴＢＳＴ ５ｍｌ、及び水４５ｍｌを混合した。これにより、ＴＢＳＴ−ＢＳＡ水溶液（以降、「ＴＢＳＴ−ＢＳＡ」と称する。）を得た。
１０％ ＢＳＡＤｉｌｕｅｎｔ／Ｂｌｏｃｋｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ（以降、「１０％ＢＳＡ」と称する。）５０ｍｌ、２０×ＴＢＳＴ ５ｍｌ、及び水４５ｍｌを混合した。これにより、ＴＢＳＴ−ＢＳＡ水溶液（以降、「ＴＢＳＴ−ＢＳＡ」と称する。）を得た。
＜Ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒの調製例＞
ＭＳＤ Ｒｅａｄｂｕｆｆｅｒ Ｔ（４×）ｗｉｔｈ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ５ｍｌ、及び水１５ｍｌを混合した。これにより、Ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ（１×）を得た。
＜固定化二次抗体溶液＞
２ｎｄ Ａｂ１（１．２ｍｇ／ｍｌ）２１μｌ、及びＰＢＳ ２４９９μｌを混合した。これにより、固定化二次抗体溶液（１０μｇ／ｍｌ）を得た。
＜捕捉抗体溶液＞
ｍＡｂ３（３６μｇ／ｍｌ） ７５μｌ、及びＴＢＳＴ−ＢＳＡ ２６２５μｌを混合した。これにより、捕捉抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を得た。
ＭＳＤ Ｒｅａｄｂｕｆｆｅｒ Ｔ（４×）ｗｉｔｈ ｓｕｒｆａｃｔａｎｔ ５ｍｌ、及び水１５ｍｌを混合した。これにより、Ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒ（１×）を得た。
＜固定化二次抗体溶液＞
２ｎｄ Ａｂ１（１．２ｍｇ／ｍｌ）２１μｌ、及びＰＢＳ ２４９９μｌを混合した。これにより、固定化二次抗体溶液（１０μｇ／ｍｌ）を得た。
＜捕捉抗体溶液＞
ｍＡｂ３（３６μｇ／ｍｌ） ７５μｌ、及びＴＢＳＴ−ＢＳＡ ２６２５μｌを混合した。これにより、捕捉抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を得た。
＜検出抗体溶液の調製例＞
ｐＡｂ１（５００μｇ／ｍｌ） ６μｌ、及びＴＢＳＴ−ＢＳＡ ２９９４μｌを混合した。これにより、検出抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を得た。
ｐＡｂ１（５００μｇ／ｍｌ） ６μｌ、及びＴＢＳＴ−ＢＳＡ ２９９４μｌを混合した。これにより、検出抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を得た。
＜検出二次抗体溶液の調製例＞
ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ Ａｂ（５００μｇ／ｍｌ） ６μｌ、及びＴＢＳＴ−ＢＳＡ ２９９４μｌを混合した。これにより、検出二次抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を得た。
ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧ Ａｂ（５００μｇ／ｍｌ） ６μｌ、及びＴＢＳＴ−ＢＳＡ ２９９４μｌを混合した。これにより、検出二次抗体溶液（１μｇ／ｍｌ）を得た。
［試験材料の調整例］
＜標準品ジストロフィンの調製例（ＲＦＤ））＞
国立研究開発法人産業技術総合研究所より提供されたリコンビナント全長ジストロフィン（ＲＦＤ）溶液（１０ｆｍｏｌ／μｌ）を、希釈溶液で段階的に希釈して、表４に示すように、ＲＦＤ濃度が０．００００１〜０．０４ｆｍｏｌ／μｌの１５段階となるようにして、１５種類の標準試料溶液Ａ１〜Ａ１５を得た。
＜標準品ジストロフィンの調製例（ＲＦＤ））＞
国立研究開発法人産業技術総合研究所より提供されたリコンビナント全長ジストロフィン（ＲＦＤ）溶液（１０ｆｍｏｌ／μｌ）を、希釈溶液で段階的に希釈して、表４に示すように、ＲＦＤ濃度が０．００００１〜０．０４ｆｍｏｌ／μｌの１５段階となるようにして、１５種類の標準試料溶液Ａ１〜Ａ１５を得た。
＜生体試料の調製例（ヒト筋組織ホモジネート）＞
正常人由来筋組織に可溶化溶液１００μｌを加え、ジルコニアビーズ及びビーズ式細胞破砕装置を用いて細胞を破砕してヒト筋組織ホモジネートを調製した。このホモジネートを遠心分離（４℃、１０００００×ｇ、１０分間）して、上清を回収することにより、ジストロフィンを含むタンパク質を可溶化した可溶化試料溶液を得た。この可溶化試料溶液のタンパク質濃度を、タンパク質定量キット（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製、商品名：２ＤＱｕａｎｔ Ｋｉｔ）を用いて測定した。可溶化試料溶液のタンパク質濃度は、６３０μｇ／ｍｌであった。続いて、この可溶化試料溶液を希釈溶液で段階的に希釈して、表５に示すように、タンパク質濃度が０.４〜２８．８μｇ／ｍｌの５段階となるようにして、５種類の希釈試料溶液（生体試料溶液ａ１〜ａ５）を得た。
正常人由来筋組織に可溶化溶液１００μｌを加え、ジルコニアビーズ及びビーズ式細胞破砕装置を用いて細胞を破砕してヒト筋組織ホモジネートを調製した。このホモジネートを遠心分離（４℃、１０００００×ｇ、１０分間）して、上清を回収することにより、ジストロフィンを含むタンパク質を可溶化した可溶化試料溶液を得た。この可溶化試料溶液のタンパク質濃度を、タンパク質定量キット（ＧＥヘルスケア・ジャパン株式会社製、商品名：２ＤＱｕａｎｔ Ｋｉｔ）を用いて測定した。可溶化試料溶液のタンパク質濃度は、６３０μｇ／ｍｌであった。続いて、この可溶化試料溶液を希釈溶液で段階的に希釈して、表５に示すように、タンパク質濃度が０.４〜２８．８μｇ／ｍｌの５段階となるようにして、５種類の希釈試料溶液（生体試料溶液ａ１〜ａ５）を得た。
＜検量線試験試料の調製例＞
ＲＦＤ溶液（１０ｆｍｏｌ／μｌ）を、希釈溶液で段階的に希釈して、表６に示すように、ＲＦＤ濃度が０．００１５０〜０．０１００ｆｍｏｌ／μｌの７段階となるようにして、７種類の標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７を得た。
ＲＦＤ溶液（１０ｆｍｏｌ／μｌ）を、希釈溶液で段階的に希釈して、表６に示すように、ＲＦＤ濃度が０．００１５０〜０．０１００ｆｍｏｌ／μｌの７段階となるようにして、７種類の標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７を得た。
＜再現性確認試料の調製例＞
ＲＦＤ溶液（１０ｆｍｏｌ／μｌ）を、希釈溶液で段階的に希釈して、表７に示すように、ＲＦＤ濃度が０．００１５０〜０．０１００ｆｍｏｌ／μｌの７段階となるようにして、７種類の再現性確認試料溶液Ｃ１〜Ｃ７を得た。
ＲＦＤ溶液（１０ｆｍｏｌ／μｌ）を、希釈溶液で段階的に希釈して、表７に示すように、ＲＦＤ濃度が０．００１５０〜０．０１００ｆｍｏｌ／μｌの７段階となるようにして、７種類の再現性確認試料溶液Ｃ１〜Ｃ７を得た。
＜特異性確認試料の調製例１＞
タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌの小脳ライセートを、希釈溶液で希釈して、タンパク質濃度が０．００６ｆｍｏｌ／μｌの生体試料溶液ｂを得た。
タンパク質濃度が５ｍｇ／ｍｌの小脳ライセートを、希釈溶液で希釈して、タンパク質濃度が０．００６ｆｍｏｌ／μｌの生体試料溶液ｂを得た。
＜特異性確認試料の調製例２＞
タンパク質濃度が１９．５μｇ／ｍｌのＤＭＤ患者筋組織ホモジネートを、希釈溶液で希釈して、タンパク質濃度が０．００６ｆｍｏｌ／μｌの生体試料溶液ｃを得た。
タンパク質濃度が１９．５μｇ／ｍｌのＤＭＤ患者筋組織ホモジネートを、希釈溶液で希釈して、タンパク質濃度が０．００６ｆｍｏｌ／μｌの生体試料溶液ｃを得た。
［実施例１：検量線範囲の確認とジストロフィンの測定］
＜電気化学発光量の測定＞
以下の手順によって、電気化学発光量の測定を行った。なお、測定は標準試料溶液Ａ１〜Ａ１５、及び生体試料溶液ａ１〜ａ５について、それぞれ３点実施して、３点の電気化学発光量（ＥＣＬシグナル）の平均値を、各試料の電気化学発光量の測定値とした。
＜電気化学発光量の測定＞
以下の手順によって、電気化学発光量の測定を行った。なお、測定は標準試料溶液Ａ１〜Ａ１５、及び生体試料溶液ａ１〜ａ５について、それぞれ３点実施して、３点の電気化学発光量（ＥＣＬシグナル）の平均値を、各試料の電気化学発光量の測定値とした。
〔１〕固定化二次抗体溶液を、固相として用いられるMULTI-ARRAY 96-well Bare plate(High Bind) ＥＣＬイムノアッセイ用プレート（以降、単に「プレート」と称する。）の各ウェルに２５μｌずつ加え、恒温振とう培養器（２５℃）を用いて、３０分以上振とうした。これにより、固定化二次抗体溶液２ｎｄＡｂ１が固相に固定化された。
〔２〕プレート内の溶液を除去し、洗浄液をプレートの各ウェルに３００μｌずつ加えて除去する洗浄操作を行った後、充分に水分を取り除くことで、過剰の固定化二次抗体溶液２ｎｄＡｂ１を洗い流した。
〔３〕ＴＢＳＴ−ＢＳＡを、プレートの各ウェルに１５０μｌずつ加え、恒温振とう培養器（２５℃）を用いて、振とうした。
〔４〕プログラム低温恒温器（設定値４℃、保存庫管理温度範囲：２．０〜８．０℃）にて、８時間以上静置した。これにより、プレートがＢＳＡによりブロッキングされた。
〔５〕プレート内の溶液を除去し、充分に水分を取り除いた。
〔４〕プログラム低温恒温器（設定値４℃、保存庫管理温度範囲：２．０〜８．０℃）にて、８時間以上静置した。これにより、プレートがＢＳＡによりブロッキングされた。
〔５〕プレート内の溶液を除去し、充分に水分を取り除いた。
〔６〕捕捉抗体溶液を、プレートの各ウェルに２５μｌずつ加え、恒温振とう培養器（２５℃）を用いて、３０分以上振とうした。これにより、捕捉抗体溶液ｍＡｂ３が固定化二次抗体溶液２ｎｄＡｂ１に結合することで、固相に固定化された。
〔７〕プレート内の溶液を除去し、洗浄液をプレートの各ウェルに３００μｌずつ加えて除去する洗浄操作を行った後、充分に水分を取り除くことで、過剰の捕捉抗体溶液ｍＡｂ３を洗い流した。
〔８〕標準試料溶液Ａ１〜Ａ１５、及び生体試料溶液ａ１〜ａ５を、測定試料としてプレートの各ウェルにそれぞれ２５μｌずつ加え、恒温振とう培養器（２５℃）を用いて、振とうした。これにより、測定試料に含まれるジストロフィンが捕捉抗体溶液ｍＡｂ３に結合された。
〔９〕プレート内の溶液を除去し、洗浄液をプレートの各ウェルに３００μｌずつ加えて除去する洗浄操作を行った後、充分に水分を取り除くことで、過剰のジストロフィン、及び捕捉抗体溶液ｍＡｂ３に結合しない測定試料に含まれる成分を洗い流した。
〔１０〕検出抗体溶液を、プレートの各ウェルに２５μｌずつ加え、恒温振とう培養器（２５℃）を用いて、３０分以上振とうした。これにより、検出抗体ｐＡｂ１がジストロフィンに結合された。
〔１１〕プレート内の溶液を除去し、洗浄液をプレートの各ウェルに３００μｌずつ加えて除去する洗浄操作を行った後、充分に水分を取り除くことで、過剰の検出抗体ｐＡｂ１を洗い流した。
〔１２〕検出二次抗体溶液を、プレートの各ウェルに２５μｌずつ加え、遮光し、恒温振とう培養器（２５℃）を用いて、３０分以上振とうした。これにより、検出二次抗体ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧＡｂが検出抗体ｐＡｂ１に結合された。
〔１３〕プレート内の溶液を除去し、洗浄液をプレートの各ウェルに３００μｌずつ加えて除去する洗浄操作を行った後、充分に水分を取り除くことで、過剰の検出二次抗体溶液ＳＵＬＦＯ−ＴＡＧＡｂを洗い流した。
〔１４〕Ｒｅａｄ ｂｕｆｆｅｒを、プレートの各ウェルに１５０μｌずつ加え、電気化学発光リーダーにて電気化学発光を生じさせて、電気化学発光量（ＥＣＬシグナル）を測定した。標準試料溶液Ａ１〜Ａ１５の測定結果を表４に示す。
＜検量線の作成と評価＞
標準試料溶液Ａ１〜Ａ１５の測定で得られたＥＣＬシグナルの測定値をＹ、ＲＦＤ濃度（ｆｍｏｌ／μｌ）をＸとし、４−パラメーターロジスティックモデル（重み付け：１／Ｙ２）を用いた回帰式を算出することで、検量線（Ａ１〜Ａ１５）を作成した。検量線の作製には、コンピュータシステム（Molecular Devices Inc.製、商品名：SoftMax Pro(Ver. 5.4)）を用いて行った。さらに、この検量線（Ａ１〜Ａ１５）に基づいて、各標準試料溶液の逆算値と、逆算値の真度を算出し、検量線を評価した。評価結果を表４に示す（検量線（Ａ１〜Ａ１５））。真度（％）は、「逆算値／添加濃度×１００」によって算出した。なお、表４において、標準試料溶液Ａ１３の逆算値が算出されなかったのは、逆算値が負の値になるためであると推測される。
標準試料溶液Ａ１〜Ａ１５の測定で得られたＥＣＬシグナルの測定値をＹ、ＲＦＤ濃度（ｆｍｏｌ／μｌ）をＸとし、４−パラメーターロジスティックモデル（重み付け：１／Ｙ２）を用いた回帰式を算出することで、検量線（Ａ１〜Ａ１５）を作成した。検量線の作製には、コンピュータシステム（Molecular Devices Inc.製、商品名：SoftMax Pro(Ver. 5.4)）を用いて行った。さらに、この検量線（Ａ１〜Ａ１５）に基づいて、各標準試料溶液の逆算値と、逆算値の真度を算出し、検量線を評価した。評価結果を表４に示す（検量線（Ａ１〜Ａ１５））。真度（％）は、「逆算値／添加濃度×１００」によって算出した。なお、表４において、標準試料溶液Ａ１３の逆算値が算出されなかったのは、逆算値が負の値になるためであると推測される。
表４に示すように、標準試料溶液Ａ１０〜Ａ１５のＥＣＬシグナルは、ほぼ同等のＥＣＬシグナルを示していた。この結果から、本測定方法によるＲＦＤの検出は、少なくとも０．０００００４ｆｍｏｌ／μｌ（０．００１ｆｍｏｌ）〜０．０４ｆｍｏｌ／μｌ（１ｆｍｏｌ）の範囲において可能であることが分かる。さらに、検量線（Ａ１〜Ａ１５）に対する逆算値の真度が±２５％以内であるＡ９を測定下限と考えると、測定範囲は０．０００１ｆｍｏｌ／μｌ（０．００２５ｆｍｏｌ）〜０．０４ｆｍｏｌ／μｌ（１ｆｍｏｌ）、測定下限は０．０００１ｆｍｏｌ／μｌ（０．００２５ｆｍｏｌ）と判断することができる。
この測定範囲に基づいて、標準試料溶液Ａ１〜Ａ９のＥＣＬシグナルをＹ、ＲＦＤ濃度（ｆｍｏｌ／μｌ）をＸとし、４−パラメーターロジスティックモデル（重み付け：１／Ｙ２）を用いた回帰式を算出することで、検量線（Ａ１〜Ａ９）を作成した。この検量線を図２に示す。なお、図２は、横軸にジストロフィン濃度（ｆｍｏｌ／μｌ）、縦軸にＥＣＬシグナルをとった検量線を示すものである。さらに、この検量線（Ａ１〜Ａ９）に基づいて、各標準試料溶液の逆算値と、逆算値の真度とを算出し、検量線を評価した。評価結果を表４に示す（検量線（Ａ１〜Ａ９））。この結果から、本測定方法は、感度と真度に優れることが分かる。
＜定量値の算出＞
生体試料溶液ａ１〜ａ５を測定して得られたＥＣＬシグナルを、標準試料溶液Ａ１〜Ａ９から算出された回帰式に代入して、ジストロフィンの定量値を算出した。結果を表５に示す。
生体試料溶液ａ１〜ａ５を測定して得られたＥＣＬシグナルを、標準試料溶液Ａ１〜Ａ９から算出された回帰式に代入して、ジストロフィンの定量値を算出した。結果を表５に示す。
表５に示すように、本測定方法により、ヒト筋組織ホモジネート中タンパク質濃度０．４μｇ／ｍｌ（１０ｎｇ）〜１４．４μｇ／ｍｌ（３６０ｎｇ）まで、濃度依存的なジストロフィン濃度の増加が確認することができた。２８．８μｇ／ｍｌ（７２０ｎｇ）において１４．４μｇ／ｍｌ（３６０ｎｇ）のジストロフィン濃度と同等の値となり、ＥＣＬシグナルが飽和している事が確認された。ただし、プロゾンは認められないと考えられた。この結果から、ヒト筋組織ホモジネート中のジストロフィン濃度は、少なくともタンパク質濃度０．４μｇ／ｍｌ（１０ｎｇ）〜１４．４μｇ／ｍｌ（３６０ｎｇ）の範囲で測定が可能であり、検出範囲の下限が低く、感度に優れたジストロフィンの測定方法であることが分かる。なお、既存のウェスタンブロット法によるジストロフィンの測定では、１０００μｇが定量限界であるため、本測定方法によれば、その１００倍の感度が得られることになる。
［実施例２：検量線の評価］
＜電気化学発光量の測定：１回目＞
測定試料として、標準試料溶液Ａ１〜Ａ１５及び生体試料溶液ａ１〜ａ５に代えて、標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７を用いて、それぞれ１点測定を実施する以外は実施例１と同様にして、電気化学発光量の測定を行った。標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７の１点の電気化学発光量を、各試料の測定値とした。この測定値を、検量線（１回目）のデータとして用いた。
＜電気化学発光量の測定：１回目＞
測定試料として、標準試料溶液Ａ１〜Ａ１５及び生体試料溶液ａ１〜ａ５に代えて、標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７を用いて、それぞれ１点測定を実施する以外は実施例１と同様にして、電気化学発光量の測定を行った。標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７の１点の電気化学発光量を、各試料の測定値とした。この測定値を、検量線（１回目）のデータとして用いた。
＜電気化学発光量の測定：２，３回目＞
実施例２の１回目の電気化学発光量の測定と同一の環境（実施者、装置）で、異なる実施日に同一の試料（標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７）の電気化学発光量の測定を２回行い、それぞれについて測定値を得た。この測定値を、検量線（２，３回目）のデータとして用いた。
実施例２の１回目の電気化学発光量の測定と同一の環境（実施者、装置）で、異なる実施日に同一の試料（標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７）の電気化学発光量の測定を２回行い、それぞれについて測定値を得た。この測定値を、検量線（２，３回目）のデータとして用いた。
＜検量線の作成と評価＞
標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７の測定で得られたＥＣＬシグナルの測定値をＹ、ＲＦＤ濃度（ｆｍｏｌ／μｌ）をＸとし、４−パラメーターロジスティックモデル（重み付け：１／Ｙ２）を用いた回帰式を算出することで、１〜３回目の電気化学発光量の測定それぞれについて検量線を作成した。さらに、これらの検量線の相関係数を算出した。また、これらの検量線に基づいて、各標準試料溶液の逆算値と、逆算値の真度を算出し、検量線を評価した。結果を表６に示す（検量線（１〜３回目））。
標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７の測定で得られたＥＣＬシグナルの測定値をＹ、ＲＦＤ濃度（ｆｍｏｌ／μｌ）をＸとし、４−パラメーターロジスティックモデル（重み付け：１／Ｙ２）を用いた回帰式を算出することで、１〜３回目の電気化学発光量の測定それぞれについて検量線を作成した。さらに、これらの検量線の相関係数を算出した。また、これらの検量線に基づいて、各標準試料溶液の逆算値と、逆算値の真度を算出し、検量線を評価した。結果を表６に示す（検量線（１〜３回目））。
表６に示すように、計３回のそれぞれの電気化学発光量の測定において、相関係数は０．９９８９以上、逆算値の真度は、Ｂ１及びＢ７で８７．６〜１１８．５％、その他の標準試料溶液で９１．７〜１１４．４％であった。これらの結果によれば、実施例１において検討した測定範囲内となる、０．０００１５０ｆｍｏｌ／μｌ〜０．０１ｆｍｏｌ／μｌの範囲において、４−パラメーターロジスティックモデル（重み付け：１／Ｙ２）を用いた回帰式を算出することで、良好な検量線が得られることを確認できた。
［実施例３：再現性の評価］
＜電気化学発光量の測定：１回目＞
測定試料として、標準試料溶液Ａ１〜Ａ１５及び生体試料溶液ａ１〜ａ５に代えて、標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７及び再現性確認試料溶液Ｃ１〜Ｃ７を用いて、それぞれ５点測定を実施する以外は実施例１と同様にして、電気化学発光量の測定を行った。５点の電気化学発光量の平均値を、各試料の電気化学発光量の測定値とした。この測定値を、日内再現性のデータ、また日間再現性１回目のデータとして用いた。
＜電気化学発光量の測定：１回目＞
測定試料として、標準試料溶液Ａ１〜Ａ１５及び生体試料溶液ａ１〜ａ５に代えて、標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７及び再現性確認試料溶液Ｃ１〜Ｃ７を用いて、それぞれ５点測定を実施する以外は実施例１と同様にして、電気化学発光量の測定を行った。５点の電気化学発光量の平均値を、各試料の電気化学発光量の測定値とした。この測定値を、日内再現性のデータ、また日間再現性１回目のデータとして用いた。
＜電気化学発光量の測定：２，３回目＞
実施例３の１回目の電気化学発光量の測定と同一の環境（実施者、装置）で、同一の試料（標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７及び再現性確認試料溶液Ｃ１〜Ｃ７）の電気化学発光量の測定を、異なる実施日で２回行い、それぞれについて測定値を得た。この測定値を、日間再現性２回目のデータ、及び日間再現性３回目のデータとして用いた。
実施例３の１回目の電気化学発光量の測定と同一の環境（実施者、装置）で、同一の試料（標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７及び再現性確認試料溶液Ｃ１〜Ｃ７）の電気化学発光量の測定を、異なる実施日で２回行い、それぞれについて測定値を得た。この測定値を、日間再現性２回目のデータ、及び日間再現性３回目のデータとして用いた。
＜検量線の作成と定量値の算出＞
標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７の測定で得られたＥＣＬシグナルの測定値をＹ、ＲＦＤ濃度（ｆｍｏｌ／μｌ）をＸとし、４−パラメーターロジスティックモデル（重み付け：１／Ｙ２）を用いた回帰式を算出することで、１〜３回目の電気化学発光量の測定それぞれについて検量線を作成した。さらに、再現性確認試料溶液Ｃ１〜Ｃ７を測定して得られた１〜３回目のＥＣＬシグナルを、標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７から算出された１〜３回目の各回帰式に代入して、ジストロフィンの定量値を算出した。１〜３回目の電気化学発光量の測定値から算出された結果を表７に示す（再現性１〜３回目）。
標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７の測定で得られたＥＣＬシグナルの測定値をＹ、ＲＦＤ濃度（ｆｍｏｌ／μｌ）をＸとし、４−パラメーターロジスティックモデル（重み付け：１／Ｙ２）を用いた回帰式を算出することで、１〜３回目の電気化学発光量の測定それぞれについて検量線を作成した。さらに、再現性確認試料溶液Ｃ１〜Ｃ７を測定して得られた１〜３回目のＥＣＬシグナルを、標準試料溶液Ｂ１〜Ｂ７から算出された１〜３回目の各回帰式に代入して、ジストロフィンの定量値を算出した。１〜３回目の電気化学発光量の測定値から算出された結果を表７に示す（再現性１〜３回目）。
＜日内再現性の評価＞
１〜３回目の電気化学発光量の測定それぞれについて、再現性確認試料溶液Ｃ１〜Ｃ７の定量値の平均値、精度（ＣＶ）、真度、及びトータルエラーを算出した。なお、精度（％）は、「定量値の標準偏差／定量値の平均値×１００」によって算出した。また、トータルエラー（％）は、「｛（真度−１００．０）の絶対値｝＋ＣＶ」によって算出した。
１〜３回目の電気化学発光量の測定それぞれについて、再現性確認試料溶液Ｃ１〜Ｃ７の定量値の平均値、精度（ＣＶ）、真度、及びトータルエラーを算出した。なお、精度（％）は、「定量値の標準偏差／定量値の平均値×１００」によって算出した。また、トータルエラー（％）は、「｛（真度−１００．０）の絶対値｝＋ＣＶ」によって算出した。
表７に示すように、１回目の日内再現性において、Ｃ１（０．０００１５０ｆｍｏｌ／μｌ）及びＣ７（０．０１００ｆｍｏｌ／μｌ）の精度は１１．３％及び３．０％、真度は１２８．７％及び１００．８％であった。その他の標準試料溶液の精度は２．１〜１２．６％、真度は８９．９〜１１４．９％であった。通常、ウェスタンブロット法では、日内再現性の精度は２．９〜３３．３％であることに鑑みると、本測定方法は、日内再現性の精度に優れたジストロフィンの測定方法であることが分かる。
＜日間再現性の評価＞
表７に示すように、日間再現性（全体）において、Ｃ１（０．０００１５０ｆｍｏｌ／μｌ）及びＣ７（０．０１００ｆｍｏｌ／μｌ）の精度２５．７及び４．３％、真度は１０３．８及び１０１．２％であった。他の標準試料溶液の精度は３．２〜１０．５％、真度は１００．２〜１１２．５％であった。通常、ウェスタンブロット法では、日間再現性の精度が６．３〜２０．４％であることに鑑みると、本測定方法は、日間再現性の精度に優れたジストロフィンの測定法であることが分かる。
上記の実施例１〜３の評価結果を総合的に考慮すると、本測定方法は、感度、真度、及び精度に優れたジストロフィンの測定方法であるといえる。
表７に示すように、日間再現性（全体）において、Ｃ１（０．０００１５０ｆｍｏｌ／μｌ）及びＣ７（０．０１００ｆｍｏｌ／μｌ）の精度２５．７及び４．３％、真度は１０３．８及び１０１．２％であった。他の標準試料溶液の精度は３．２〜１０．５％、真度は１００．２〜１１２．５％であった。通常、ウェスタンブロット法では、日間再現性の精度が６．３〜２０．４％であることに鑑みると、本測定方法は、日間再現性の精度に優れたジストロフィンの測定法であることが分かる。
上記の実施例１〜３の評価結果を総合的に考慮すると、本測定方法は、感度、真度、及び精度に優れたジストロフィンの測定方法であるといえる。
［実施例４、参照例：特異性の評価］
＜電気化学発光量の測定＞
測定試料として、生体試料溶液ａ１〜ａ５に代えて、生体試料溶液ｂ及び生体試料溶液ｃを用いた以外は実施例１と同様にして、電気化学発光量の測定を行った。このとき、測定試料として、生体試料溶液ｂ（小脳ライセート）を用いたものが実施例４にあたり、生体試料溶液ｃ（ＤＭＤ患者筋組織ホモジネート）を用いたものが参照例にあたる。
＜電気化学発光量の測定＞
測定試料として、生体試料溶液ａ１〜ａ５に代えて、生体試料溶液ｂ及び生体試料溶液ｃを用いた以外は実施例１と同様にして、電気化学発光量の測定を行った。このとき、測定試料として、生体試料溶液ｂ（小脳ライセート）を用いたものが実施例４にあたり、生体試料溶液ｃ（ＤＭＤ患者筋組織ホモジネート）を用いたものが参照例にあたる。
＜検量線の作成＞
実施例１と同様にして、標準試料溶液Ａ１〜Ａ９の測定で得られたＥＣＬシグナルから回帰式を算出することで、検量線を作成した。
実施例１と同様にして、標準試料溶液Ａ１〜Ａ９の測定で得られたＥＣＬシグナルから回帰式を算出することで、検量線を作成した。
＜定量値の算出＞
生体試料溶液ｂ及び生体試料溶液ｃを測定して得られたＥＣＬシグナルを、標準試料溶液Ａ１〜Ａ９から算出された回帰式に代入して、ジストロフィンの定量値を算出した。結果を表８に示す。
生体試料溶液ｂ及び生体試料溶液ｃを測定して得られたＥＣＬシグナルを、標準試料溶液Ａ１〜Ａ９から算出された回帰式に代入して、ジストロフィンの定量値を算出した。結果を表８に示す。
表８に示すように、生体試料として小脳ライセートを用いた実施例４の場合にも、小脳に存在するジストロフィンの測定を行うことが可能であった。
一方、生体試料としてのＤＭＤ患者筋組織ホモジネートを用いた参照例では、測定限界未満となりジストロフィンの測定を行うことができなかった。これは、ＤＭＤ患者筋組織に発現するジストロフィンは全長のジストロフィンではなく、Ｃ末端を欠くため、検出抗体ｐＡｂ１による結合ができなかったためであると推測される。
このように、本測定方法によれば、ジストロフィンの測定を特異的に行うことが可能である。
一方、生体試料としてのＤＭＤ患者筋組織ホモジネートを用いた参照例では、測定限界未満となりジストロフィンの測定を行うことができなかった。これは、ＤＭＤ患者筋組織に発現するジストロフィンは全長のジストロフィンではなく、Ｃ末端を欠くため、検出抗体ｐＡｂ１による結合ができなかったためであると推測される。
このように、本測定方法によれば、ジストロフィンの測定を特異的に行うことが可能である。
Claims (15)
- 遺伝性疾患に関わるジストロフィンタンパク質と、前記ジストロフィンタンパク質を認識する捕捉抗体とを結合させる抗原結合工程、
前記捕捉抗体に結合した前記ジストロフィンタンパク質と、前記ジストロフィンタンパク質の前記捕捉抗体が認識する領域とは別の領域を認識し且つ発光性金属錯体が標識される検出抗体とを結合させる検出抗体結合工程、
及び
前記ジストロフィンタンパク質に結合し且つ前記発光性金属錯体が標識された前記検出抗体を、電気化学的刺激によって生じる電気化学発光量を測定することによって検出する測定工程
を備えることを特徴とする、タンパク質の測定方法。 - 前記捕捉抗体がモノクローナル抗体であり、前記検出抗体がポリクローナル抗体である、
請求項１に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記捕捉抗体がポリクローナル抗体であり、前記検出抗体がモノクローナル抗体である、
請求項１に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記捕捉抗体が前記ジストロフィンタンパク質のＣ末端領域を認識する抗体であり、前記検出抗体が前記ジストロフィンタンパク質のＮ末端領域を認識する抗体である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記捕捉抗体が前記ジストロフィンタンパク質のＮ末端領域を認識する抗体であり、前記検出抗体が前記ジストロフィンタンパク質のＣ末端領域を認識する抗体である、
請求項１〜３のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。 - 界面活性剤及び還元剤を含有する可溶化溶液を用いて、生体試料から前記ジストロフィンタンパク質を可溶化する可溶化工程、及び
前記可溶化工程で得られた可溶化試料溶液を希釈して、前記ジストロフィンタンパク質を含む希釈試料溶液を得る希釈工程をさらに備え、
前記抗原結合工程では、前記希釈試料溶液に含まれる前記ジストロフィンタンパク質と前記捕捉抗体とを結合させる、
請求項１〜５のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記可溶化工程において、前記生体試料として、筋肉、脳、血液、もしくは心臓に由来する細胞もしくは組織、または生体の細胞に由来する幹細胞から誘導されるもしくは培養される細胞もしくは組織を用いる、
請求項６に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記可溶化工程で用いる前記可溶化溶液の前記界面活性剤が、陰イオン性界面活性剤を含有する、
請求項６または７に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記希釈工程において、非イオン性界面活性剤を含む希釈溶液を用いて前記可溶化試料溶液の希釈を行う、
請求項６〜８のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。 - 標準品ジストロフィンタンパク質の濃度と電気化学発光量との検量線と、前記生体試料に含まれる前記ジストロフィンタンパク質における電気化学発光量とに基づいて、前記生体試料に含まれる前記ジストロフィンタンパク質の量を算出する算出工程をさらに備える、
請求項６〜９のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記標準品ジストロフィンタンパク質として、前記ジストロフィンタンパク質の全長またはその一部を用いる、
請求項１０に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記発光性金属錯体が、前記発光性金属錯体により標識され且つ前記検出抗体を認識する検出二次抗体により、前記検出抗体に導入される、
請求項１〜１１のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。 - 前記捕捉抗体を認識する固定化二次抗体を固定化する二次抗体固定化工程、及び
前記固定化した固定化二次抗体と、前記捕捉抗体とを結合させることで、前記捕捉抗体を固定化する捕捉抗体結合工程とをさらに備える、
請求項１〜１２のいずれか１項に記載のタンパク質の測定方法。 - 遺伝性疾患に関わるジストロフィンタンパク質を認識する捕捉抗体、及び
前記ジストロフィンタンパク質の前記捕捉抗体が認識する領域とは別の領域を認識し且つ発光性金属錯体が標識される検出抗体
を備えることを特徴とする、ＥＣＬ法用のタンパク質の測定キット。 - 前記発光性金属錯体により標識され且つ前記検出抗体を認識し、前記検出抗体に前記発光性金属錯体を導入する検出二次抗体をさらに備える、
請求項１４に記載のＥＣＬ法用のタンパク質の測定キット。
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