JP6880034B2 - 特異的ｒｎａの安定化のための汎用法 - Google Patents

Description

本発明はインビトロ診断の分野に属し、特に増幅技術による核酸の検出及び定量に属する。

分子診断の分野では、多くの供給源からの核酸の増幅がかなり重要になっている。核酸増幅及び検出の診断適用の例は、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、西ナイル熱ウイルス（ＷＮＶ）などのウイルスの検出あるいはヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）及び／又はＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）の存在についての献血の定期的なスクリーニングである。さらに、前記増幅技術は、マイコバクテリアなどの細菌標的、又は腫瘍マーカーの分析に好適である。

最も著名で広く用いられている増幅技術はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）である。他の増幅反応には、なかでも、リガーゼ連鎖反応、ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応、Ｇａｐ−ＬＣＲ、修復連鎖反応、３ＳＲ、ＮＡＳＢＡ、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写介在性増幅（ＴＭＡ）、及びＱβ増幅が含まれる。ＰＣＲベースの分析のための自動システムは、多くの場合、同じ反応容器内でのＰＣＲプロセス中の生成物増幅のリアルタイム検出を利用する。そのような方法の重要な要件は、レポーター基又は標識を有する修飾オリゴヌクレオチドの使用である。

臨床的核酸診断の分野において、定性的（性能対照）及び／又は定量的（基準として対照を使用する標的核酸の量の測定）目的のために、既知配列を有する対照核酸を用いて各増幅を制御することがたいていは望ましいか又は必須でさえある。特に、原核生物、真核生物ならびにウイルス核酸を含む診断標的の多様性を考慮して、そして異なる種類の核酸、例えばＲＮＡ及びＤＮＡ間の多様性を考慮して、対照核酸は通常、特定の方法で設計される。簡潔に言うと、これらの対照は、プロセスの間にそれらの特性を模倣するために対照としての役割を果たす標的核酸と通常類似している。この状況は、定性的アッセイと定量的アッセイの両方に当てはまる。複数のパラメータが単一又は並列実験で検出される場合、例えばＳｗａｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｃｌｉｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．， ２００４， ４２， ｐｐ． １８６３−１８６８）においてなど、異なる標的核酸と類似する異なる対照が通常用いられる。Ｓｔｏｃｈｅｒ ｅｔ ａｌ．（Ｊ． Ｖｉｒｏｌ． Ｍｅｔｈ．， ２００３， １０８， ｐｐ． １−８）は、複数のウイルス特異的競合的対照が同じＤＮＡ分子上に含まれている対照核酸を開示している。

過去数年間で、診断アッセイ及び特定のｍＲＮＡ種に関するアッセイが特定の核酸配列の検出に基づいて開発されている。これらのアッセイの多くは特定のＲＮＡ種の絶対濃度を測定するために適合されている。これらの絶対的定量化アッセイは、その正確な量があらかじめ確定されているＲＮＡ標準の使用を必要とする。これらのＲＮＡ標準は、通常、インビトロ転写によって合成されるか、又は感染性因子自体である。ＲＮＡを精製し、次いでＯＤ₂₆₀での吸光度、ホスフェート分析、濃色性又は同位体トレーサー分析（Ｃｏｌｌｉｎｓ， １９９５）などのいくつかの異なる方法によって定量化する。

ＲＮＡの固有の熱不安定性及び随所にあるＲＮａｓｅ汚染源のために、関心対象の特定のｍＲＮＡ及び標準として使用するＲＮＡはどちらも、サンプル取得、保存、又は他の下流プロセスの間に望ましくない分解を受け、試験の失敗又は検出感度の低下となることが多い。

ＲＮＡを安定化するための一般的な一方法は、バクテリオファージのコートタンパク質を用いてＲＮＡをカプセル化してシュードウイルス粒子を創出する（そして、米国特許第５６７７１２４号明細書及び米国特許第５９３９２６２号明細書でさらに記載するとおり）、いわゆる「武装化（ａｒｍｏｒｅｄ）ＲＮＡ」法である。ＲＮＡをカプセル化する別の方法は、関心対象のＲＮＡを哺乳動物ウイルスエンベロープ内部のエキソサイトーシスによって生成させる、ＡｃｃｕＰｌｅｘ技術（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍｉｌｆｏｒｄ ＭＡ）を含む。しかしながら、これらのカプセル化粒子によって提供されるＲＮＡ保護は、高温では制限される。明らかに、冷凍が制限され得る分野で開発される産物中のＲＮＡの保存可能期間を延長する新規方法及び組成物が必要とされている。

本発明は、検出の標的又は対照標準のいずれかであり得る特定のＲＮＡ分子の安定化のための方法及び組成物に関する。

一態様において、本発明は、増幅反応で増幅される一本鎖ＲＮＡテンプレートのセグメントの分解を防止又は低減する方法に関し、この方法は、一本鎖ＲＮＡテンプレートを提供するステップと、一本鎖ＲＮＡテンプレートを、増幅される一本鎖ＲＮＡテンプレートのセグメントと完全に又は部分的に相補的である配列を有する１以上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズするステップと、反応条件下で一本鎖ＲＮＡテンプレートのセグメントを逆転写し増幅するステップとを含む。前記反応条件により、１以上のオリゴヌクレオチドが逆転写及び増幅を妨害しない。これにより、１以上のオリゴヌクレオチドは、逆転写及び増幅の間に、プライマー、プローブ又はテンプレートとしての働きをしない。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、増幅の間に使用される伸長温度よりも少なくとも５℃低い融解温度を有する。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドの各オリゴヌクレオチドは、逆転写及び増幅の間に用いられるプライマー及びプローブの融解温度よりも少なくとも５℃低い融解温度を有する。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、逆転写及び増幅の間で用いられるプライマー及びプローブの濃度よりも少なくとも５０倍低い濃度で存在する。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは０．１ｎＭ〜２．０ｎＭである濃度で存在する。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは、増幅される一本鎖ＲＮＡテンプレートのセグメントの４８％超とハイブリダイズする。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは、増幅される一本鎖ＲＮＡテンプレートのセグメントの６０％超、７５％超、又は９０％超とハイブリダイズする。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは、増幅される一本鎖ＲＮＡテンプレートのセグメント全体とハイブリダイズする。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、１１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド又は１１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの長さであるか、又は１１ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの長さである。ある実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ分子のセグメントの９０％超とハイブリダイズし、複数のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは１１〜３０ヌクレオチドの長さである。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、２０℃〜８０℃、又は３０℃〜７０℃、又は４０℃〜７０℃、又は４０℃〜６０℃の範囲の融解温度を有する。さらに別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドの配列は、１以上のオリゴヌクレオチドからの別のオリゴヌクレオチドの配列と重複しない。別の実施形態では、一本鎖ＲＮＡテンプレートはケージ化されている (caged)。ケージ化は、カプセル化、キャプシド形成、トラッピングによって、又はＲＮＡテンプレートが細胞の内部に存在することによって達成することができる。別の実施形態において、一本鎖ＲＮＡテンプレートを単離又は精製するステップを逆転写及び増幅のステップの前に実施する。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１０、１１〜１９、２０〜２７、及び２８〜３５からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの群を含む。

別の態様において、本発明は、増幅反応の間のサンプルにおいて試験されるＲＮＡ配列の存在を検出する方法であって、サンプルを得、核酸標準 (nucleic acid standard)が、一本鎖ＲＮＡ対照配列と、一本鎖ＲＮＡ対照配列のセグメントに完全又は部分的に相補的である配列を有する１以上のオリゴヌクレオチドとを含む被験ＲＮＡ配列の検出及び／又は定量化における標準としての働きをする核酸標準を得、サンプルと核酸標準とを混合し、試験するＲＮＡ配列と一本鎖ＲＮＡ対照配列のセグメントの両方の逆転写及び増幅を実施するための条件を提供し、これらの条件下では、１以上のオリゴヌクレオチドは逆転写及び増幅を妨害せず、そして試験されるＲＮＡ配列及び一本鎖ＲＮＡ対照配列から増幅産物を検出することを含む方法に関する。これにより、１以上のオリゴヌクレオチドは、逆転写及び増幅の間、プライマー、プローブ又はテンプレートとしての役割を果たさない。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、増幅の間、伸長温度よりも少なくとも５℃低い融解温度を有する。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、逆転写及び増幅の間で用いられるプライマー及びプローブの融解温度よりも少なくとも５℃低い融解温度を有する。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、逆転写及び増幅の間で用いられるプライマー及びプローブの濃度よりも少なくとも５０倍低い濃度で存在する。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、０．１ｎＭ〜２．０ｎＭの濃度で存在する。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは一本鎖ＲＮＡ対照配列のセグメントの４８％超とハイブリダイズする。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは、増幅される一本鎖ＲＮＡ対照配列のセグメントの６０％超、７５％超、又は９０％超とハイブリダイズする。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは一本鎖ＲＮＡ対照配列のセグメント全体とハイブリダイズする。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、１１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチド又は１１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの長さであるか、又は１１ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの長さである。ある実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ分子のセグメントの９０％超とハイブリダイズし、複数のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは１１〜３０ヌクレオチドの長さである。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、２０℃〜８０℃、又は３０℃〜７０℃、又は４０℃〜７０℃、又は４０℃〜６０℃の範囲の融解温度を有する。さらに別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドの配列は、１以上のオリゴヌクレオチドからの別のオリゴヌクレオチドの配列と重複しない。一実施形態において、一本鎖ＲＮＡ対照配列はケージ化されている。いくつかの実施形態において、一本鎖ＲＮＡ対照配列は、カプセル化、キャプシド形成、トラッピング、及び細胞の内部に存在すること、からなる群から選択される手段によってケージ化される。別の実施形態において、試験されるＲＮＡ配列及び一本鎖ＲＮＡ対照配列のセグメントの両方を単離又は精製するステップは、逆転写及び増幅を実施するための条件を提供するステップの前に実施する。さらなる実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは、その配列が配列番号１〜１０、１１〜１９、２０〜２７、及び２８〜３５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの群を含む。

別の態様において、本発明は、増幅反応で増幅される試験されるＲＮＡ配列の検出及び／又は定量化で標準としての役割を果たす核酸標準に関し、この核酸標準は、一本鎖ＲＮＡ対照配列と、一本鎖ＲＮＡ対照配列のセグメントと完全に又は部分的に相補的である配列を有し、一本鎖ＲＮＡ対照配列のセグメントの４８％超とハイブリダイズする１以上のオリゴヌクレオチドとを含む。ここで、１以上のオリゴヌクレオチドは増幅反応の間のプライマー、プローブ又はテンプレートとしての役割を果たさない。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、増幅反応の間に使用される伸長温度よりも少なくとも５℃低い融解温度を有する。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、増幅反応の間に使用されるプライマー及びプローブの融解温度よりも少なくとも５℃低い融解温度を有する。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、増幅反応の間で使用されるプライマー及びプローブの濃度よりも少なくとも５０倍低い濃度で存在する。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、０．１ｎＭ〜２．０ｎＭの濃度で存在する。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ対照配列のセグメントの６０％超、７５％超、又は９０％超とハイブリダイズする。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは一本鎖ＲＮＡ対照配列のセグメント全体とハイブリダイズする。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、１１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドもしくは１１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの長さ又は１１ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの長さである。ある実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ分子のセグメントの９０％超とハイブリダイズし、複数のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは１１〜３０ヌクレオチドの長さである。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、２０℃〜８０℃、又は３０℃〜７０℃、又は４０℃〜７０℃、又は４０℃〜６０℃の範囲の融解温度を有する。さらに別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドの配列は、１以上のオリゴヌクレオチドからの別のオリゴヌクレオチドの配列と重複しない。別の実施形態において、一本鎖ＲＮＡ対照配列はケージ化される。ケージ化は、カプセル化、キャプシド形成、トラッピングによるか、又はＲＮＡテンプレートが細胞の内部にあることにより達成することができる。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは、その配列が配列番号１〜１０、１１〜１９、２０〜２７、及び２８〜３５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの群を含む。

別の態様において、本発明は、一本鎖ＲＮＡ分子のセグメントの分解を防止又は低減する方法に関し、当該方法は、一本鎖ＲＮＡ分子を提供するステップと、その配列が一本鎖ＲＮＡ分子のセグメントに対して完全又は部分的に相補的である複数のオリゴヌクレオチドを有する一本鎖ＲＮＡ分子とハイブリダイズするステップを含み、ここで、複数のオリゴヌクレオチドは一本鎖ＲＮＡ分子のセグメントの４８％超とハイブリダイズし、複数のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは１１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さである。一実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ分子のセグメントの６０％超、７５％超、又は９０％超とハイブリダイズする。一実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ分子のセグメント全体とハイブリダイズする。一実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは１１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの長さ又は１１ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの長さである。ある実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは一本鎖ＲＮＡ分子のセグメントの９０％超とハイブリダイズし、ここで、複数のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは１１〜３０ヌクレオチドの長さである。別の実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、２０℃〜８０℃、又は３０℃〜７０℃、又は４０℃〜７０℃、又は４０℃〜６０℃の範囲の融解温度を有する。さらに別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドの配列は、１以上のオリゴヌクレオチドからの別のオリゴヌクレオチドの配列と重複しない。別の実施形態において、一本鎖ＲＮＡ分子はケージ化される。ケージ化は、カプセル化、キャプシド形成、トラッピングによるか、又はＲＮＡ分子が細胞内部に存在することで達成することができる。別の実施形態において、提供するステップ及びハイブリダイズするステップは溶液中で実施される。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは、その配列が配列番号１〜１０、１１〜１９、２０〜２７、及び２８〜３５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの群を含む。

別の態様において、本発明は、逆転写反応又は逆転写及び増幅反応に供される一本鎖ＲＮＡ分子のセグメントの分解を防止又は低減するための１以上のオリゴヌクレオチドの使用に関し、前記１以上のオリゴヌクレオチドの配列は、一本鎖ＲＮＡのセグメントに対して完全又は部分的に相補的である。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、逆転写反応又は逆転写及び増幅反応において用いられる伸長温度よりも少なくとも５℃低い融解温度を有する。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、逆転写反応又は逆転写及び増幅反応の間に使用されるプライマー及びプローブの融解温度よりも少なくとも５℃低い融解温度を有する。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、逆転写反応又は逆転写及び増幅反応の間に使用されるプライマー及びプローブの濃度よりも少なくとも５０倍低い濃度で存在する。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、０．１ｎＭ〜２．０ｎＭの濃度で存在する。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡのセグメントの４８％超とハイブリダイズする。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡのセグメントの６０％超、７５％超、又は９０％超とハイブリダイズする。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡのセグメント全体とハイブリダイズする。一実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、１１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドもしくは１１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの長さ又は１１ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの長さである。ある実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡのセグメントの９０％超とハイブリダイズし、複数のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは１１〜３０ヌクレオチドの長さである。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、２０℃〜８０℃、又は３０℃〜７０℃、又は４０℃〜７０℃、又は４０℃〜６０℃の範囲の融解温度を有する。さらに別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドの配列は、１以上のオリゴヌクレオチドからの別のオリゴヌクレオチドの配列と重複しない。別の実施形態において、一本鎖ＲＮＡはケージ化される。ケージ化は、カプセル化、キャプシド形成、トラッピングによって、又はＲＮＡテンプレートが細胞の内部に存在することで、達成することができる。一実施形態において、ＲＮＡは少なくとも一本鎖ＲＮＡ対照配列である。一実施形態において、ＲＮＡは少なくとも一本鎖ＲＮＡテンプレート配列である。別の実施形態において、ＲＮＡは、少なくとも１つの一本鎖ＲＮＡ対照配列と少なくとも一本鎖ＲＮＡテンプレート配列との混合物である。一実施形態において、一本鎖ＲＮＡのセグメントの分解は、３７℃のインキュベーション温度で少なくとも１８日の期間、防止又は低減される。一実施形態において、一本鎖ＲＮＡのセグメントの分解は、４５℃のインキュベーション温度で少なくとも１８日の期間、防止又は低減される。ある実施形態において、一本鎖ＲＮＡのセグメントの分解は、３７℃又は４５℃のインキュベーション温度で少なくとも４５日の期間、防止又は低減される。ある実施形態において、一本鎖ＲＮＡのセグメントの分解は、３７℃又は４５℃のインキュベーション温度で少なくとも７１日の期間、防止又は低減される。ある実施形態において、一本鎖ＲＮＡのセグメントの分解は、３７℃又は４５℃のインキュベーション温度で少なくとも１２週の期間、防止又は低減される。別の実施形態において、１以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号１〜１０、１１〜１９、２０〜２７、及び２８〜３５からなる群から選択される配列を有するオリゴヌクレオチドの群を含む。

別の態様において、本発明は、一本鎖ＲＮＡ分子のセグメントの分解を防止又は低減する混合物に関し、当該混合物は、その配列が一本鎖ＲＮＡ分子のセグメントに対して完全又は部分的に相補的である一本鎖ＲＮＡ分子及び複数のオリゴヌクレオチドを溶液中に含み、複数のオリゴヌクレオチドは一本鎖ＲＮＡ分子のセグメントの４８％超とハイブリダイズし、複数のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは１１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さである。一実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは、一本鎖ＲＮＡ分子のセグメントの６０％超、７５％超、又は９０％超とハイブリダイズする。一実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは一本鎖ＲＮＡ分子のセグメント全体とハイブリダイズする。一実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは１１ヌクレオチド〜４０ヌクレオチドの長さであるか又は１１ヌクレオチド〜３０ヌクレオチドの長さである。ある実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは一本鎖ＲＮＡ分子のセグメントの９０％超とハイブリダイズし、複数のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは１１〜３０ヌクレオチドの長さである。別の実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは２０℃〜８０℃、又は３０℃〜７０℃、又は４０℃〜７０℃、又は４０℃〜６０℃の範囲の融解温度を有する。さらに別の実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドの配列は、複数のオリゴヌクレオチドからの別のオリゴヌクレオチドの配列と重複する。別の実施形態において、一本鎖ＲＮＡ分子はケージ化される。ケージ化は、カプセル化、キャプシド形成、トラッピングによるか、又はＲＮＡ分子が細胞の内部に存在することで、達成することができる。別の実施形態において、混合物は、逆転写反応又は逆転写及び増幅反応を実施するために適した緩衝液及び塩をさらに含む。別の実施形態において、複数のオリゴヌクレオチドは、その配列が配列番号１〜１０、１１〜１９、２０〜２７、及び２８〜３５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの群を含む。

図１は、安定性実験で使用した相補的オリゴヌクレオチドプールのＵＰＬＣ分析の結果を示す。 図２は、相補的オリゴヌクレオチドの存在下でのＰＥＦ０６６ ＲＮＡ転写物の１８日安定性試験の結果を示す。サンプルを２〜８℃、３７℃、及び４５℃でインキュベートし、そしてＲＴ−ＰＣＲによって増幅し検出し、この場合、増加したサイクル閾値（値）はサンプル分解を示すものであった。 図３は、相補的オリゴヌクレオチドの存在下でのＰＥＦ０７０武装化ＲＮＡ対照の１８日安定性試験の結果を示す。サンプルを２〜８℃、３７℃、及び４５℃でインキュベートし、そしてＲＴ−ＰＣＲによって増幅し検出し、この場合、増加したサイクル閾値（値）はサンプル分解を示すものであった。 図４−１は、相補的オリゴヌクレオチドの不在又は存在下でのＰＥＦ０６６ ＲＮＡ転写物の１２週安定性試験のＲＴ−ＰＣＲ成長曲線を示す。サンプルを４℃、３７℃、及び４５℃でインキュベートし、そしてＲＴ−ＰＣＲによって増幅し検出し、増加したサイクル閾値（値）はサンプル分解を示すものであった。 図４−２は、相補的オリゴヌクレオチドの不在又は存在下でのＰＥＦ０６６ ＲＮＡ転写物の１２週安定性試験のＲＴ−ＰＣＲ成長曲線を示す。サンプルを４℃、３７℃、及び４５℃でインキュベートし、そしてＲＴ−ＰＣＲによって増幅し検出し、増加したサイクル閾値（値）はサンプル分解を示すものであった。 図５−１は、相補的オリゴヌクレオチドの不在又は存在下でのＨＩＶ−２ ＬＴＲ ＲＮＡ転写物の７１日安定性試験のＲＴ−ＰＣＲ成長曲線を示す。サンプルを４℃、３７℃、及び４５℃でインキュベートし、そしてＲＴ−ＰＣＲによって増幅し検出し、増加したサイクル閾値（値）はサンプル分解を示すものであった。 図５−２は、相補的オリゴヌクレオチドの不在又は存在下でのＨＩＶ−２ ＬＴＲ ＲＮＡ転写物の７１日安定性試験のＲＴ−ＰＣＲ成長曲線を示す。サンプルを４℃、３７℃、及び４５℃でインキュベートし、そしてＲＴ−ＰＣＲによって増幅し検出し、増加したサイクル閾値（値）はサンプル分解を示すものであった。 図６は、相補的オリゴヌクレオチドの不在（ＮＯ ＣＯＰＳ）又は存在（１０ｎＭ ＣＯＰＳ）下でのＡｃｃｕｐｌｅｘにおいてカプセル化されたＲＮＡ対照の安定性試験の結果を示す。４℃、３７℃、又は４５℃のいずれかで１日、１５日又は７１日間インキュベートしたサンプルをＲＴ−ＰＣＲによって増幅し検出し、増加したサイクル閾値（Ｃｐ値）はサンプル分解を示すものであった。

定義
「増幅試薬」は、核酸の増幅を可能にする化学的又は生化学的成分である。そのような試薬には、核酸ポリメラーゼ、緩衝液、モノヌクレオチド、例えばヌクレオシド三リン酸、オリゴヌクレオチドが、例えばオリゴヌクレオチドプライマー、塩及びそれらの各溶液、検出プローブ、色素などとして含まれるが、これらに限定されるものではない。

当該技術分野で知られているように、「ヌクレオシド」は塩基−糖の組み合わせである。ヌクレオシドの塩基部分は、通常、複素環塩基である。そのような複素環塩基の最も一般的な２つのクラスはプリン及びピリミジンである。

「ヌクレオチド」は、ヌクレオシドの糖部分と共有結合したホスフェート基をさらに含むヌクレオシドである。ペントフラノシル糖を含むヌクレオシドについて、ホスフェート基は糖の２’−、３’−又は５’−ヒドロキシル部分のいずれかと結合することができる。ヌクレオチドは、さらに一般的には「オリゴマー化合物」と称され得る「オリゴヌクレオチド」、又はさらに一般的には「ポリマー化合物」と称され得る「ポリヌクレオチド」のモノマー単位である。前記の別の一般的表現は、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）及びリボ核酸（ＲＮＡ）である。

「オリゴマー化合物」は、ヌクレオチド単独又は非天然化合物（下記参照）であり得る「モノマー単位」、さらに詳細には修飾ヌクレオチド（又はヌクレオチドアナログ）又は非ヌクレオチド化合物、単独又はその組み合わせからなる化合物である。

「オリゴヌクレオチド」及び「修飾オリゴヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチドアナログ」）はオリゴマー化合物のサブグループである。ここで、「オリゴヌクレオチド」という語は、それらのモノマー単位として複数のヌクレオチドから形成された成分を指す。ホスフェート基は、通常、オリゴヌクレオチドのヌクレオシド間骨格を形成するとされる。ＲＮＡ及びＤＮＡの通常の結合又は骨格は３’から５’のホスホジエステル結合である。オリゴヌクレオチド及び修飾オリゴヌクレオチドは、主に当該技術分野で記載され、当業者に公知のようにして合成することができる。特定の配列のオリゴマー化合物を調製する方法は当該技術分野で公知であり、例えば、適切な配列のクローニング及び制限ならびに直接化学的合成が挙げられる。化学的合成法には、例えば、Ｎａｒａｎｇ Ｓ． Ａ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８ （１９７９） ９０−９８により記載されているホスホジエステル法、Ｂｒｏｗｎ Ｅ． Ｌ．， ｅｔ ａｌ．， Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ６８ （１９７９） １０９−１５１により開示されているホスホジエステル法、Ｂｅａｕｃａｇｅ ｅｔ ａｌ．， Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ Ｌｅｔｔｅｒｓ ２２ （１９８１） １８５９で開示されているホスホルアミダイト法、Ｇａｒｅｇｇ ｅｔ ａｌ．， Ｃｈｅｍ． Ｓｃｒ． ２５ （１９８５） ２８０−２８２で開示されているＨ−ホスホネート法及び米国特許第４４５８０６６号明細書で開示されている固体支持体法が含まれ得る。

前記プロセスにおいて、オリゴヌクレオチドは化学的に修飾することができ、すなわち、プライマー及び／又はプローブは修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含む。プローブ又はプライマーはしたがって修飾オリゴヌクレオチドである。

「修飾ヌクレオチド」（又は「ヌクレオチドアナログ」）は、天然のヌクレオチドとは多少の修飾で異なるが、それでもなお塩基、ペントフラノシル糖、ホスフェート部分、塩基様、ペントフラノシル糖様及びホスフェート様部分又はそれらの組み合わせから構成される。例えば、標識をヌクレオチドの塩基部分に結合させてもよく、それによって修飾ヌクレオチドを得る。ヌクレオチド中の天然の塩基はまた、例えば７−デアザプリンによって置換してもよく、それによっても修飾ヌクレオチドを得る。

オリゴマー化合物の別の特定のサブグループに属する「修飾オリゴヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチドアナログ」）は、１以上ヌクレオチド及び１以上の修飾ヌクレオチドをモノマー単位として保有する。したがって、「修飾オリゴヌクレオチド」（又は「オリゴヌクレオチドアナログ」）という語は、オリゴヌクレオチドと実質的に類似した方法で機能し、交換可能に使用できる構造を指す。合成の観点から、修飾オリゴヌクレオチド（又はオリゴヌクレオチドアナログ）は、例えば、ホスフェート骨格、リボース単位又はヌクレオチド塩基の適切な修飾によるオリゴヌクレオチドの化学的修飾によって作製することができる（Ｕｈｌｍａｎｎ ａｎｄ Ｐｅｙｍａｎ， Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ ９０ （１９９０） ５４３； Ｖｅｒｍａ Ｓ．， ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｆ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７ （１９９８） ９９−１３４）。代表的な修飾としては、ホスホジエステルヌクレオシド間結合の代わりにホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホン酸メチル、ホスホトリエステル又はホスホルアミデートヌクレオシド間結合；天然のプリン及びピリミジン塩基の代わりに、５又は６位に置換基を有するピリミジン塩基を有するデアザプリン又はアザプリン及びデアザピリミジン又はアザピリミジン；７−デアザプリンのように２、６もしくは８位又は７位に改変された置換基を有するプリン塩基；アルキル部分、アルケニル部分、アルキニル部分又はアリール部分、例えばメチル、エチル、プロピル、ブチル、ｔｅｒｔ−ブチル、ペンチル、ヘキシル、ヘプチル、オクチル、ノニル、デシルなどの低級アルキル基、又はフェニル、ベンジル、ナフチルのようなアリール基を有する塩基；例えば、それらの２’位で置換基を有する糖；あるいは炭素環式又は非環式糖アナログが挙げられる。他の修飾は当業者には公知である。そのような修飾オリゴヌクレオチド（又はオリゴヌクレオチドアナログ）は、天然のオリゴヌクレオチドとは機能的に交換可能であるが、構造的には異なるとして最もよく記述される。さらに詳細には、好ましい修飾は、Ｖｅｒｍａ Ｓ．， ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｆ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７ （１９９８） ９９−１３４又は国際公開第０２／１２２６３号で開示されている。加えて、ヌクレオシド単位がヌクレオシド間ホスフェート又は糖ホスフェート結合と代わる基を介して結合する修飾を行うことができる。そのような結合としては、Ｖｅｒｍａ Ｓ．， ａｎｄ Ｅｃｋｓｔｅｉｎ Ｆ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｂｉｏｃｈｅｍ． ６７ （１９９８） ９９−１３４で開示されているものが挙げられる。ホスフェート結合以外を利用してヌクレオシド単位を連結する場合、そのような構造は「オリゴヌクレオシド」としても記載される。

「核酸」ならびに「標的核酸」は、当業者に公知のヌクレオチドのポリマー化合物である。「標的核酸」は、本明細書中では、分析すべきサンプル中の核酸、すなわち決定すべきサンプル中のそれらの存在、非存在及び／又は量を意味するために用いられる。「プライマー」という語は、本明細書では、当業者に公知のとおりに使用され、オリゴマー化合物、主にオリゴヌクレオチドを指すが、テンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成を開始できる修飾オリゴヌクレオチドも指し、すなわち、例えばプライマーの３’末端は遊離３’−ＯＨ基を提供し、これに対してテンプレート依存性ＤＮＡポリメラーゼによってさらなるヌクレオチドを結合させることができ、３’から５’のホスホジエステル結合が確立され、これによりデオキシヌクレオシド三リン酸が用いられ、それによってピロホスフェートが放出される。「プローブ」はまた、天然又は修飾オリゴヌクレオチドも意味する。当該技術分野で知られているように、プローブは分析物又は増幅産物を検出する目的に適う。上記プロセスの場合、プローブを使用して標的核酸の増幅産物（ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｅ）を検出することができる。この目的のために、プローブは通常、標識を有する。

「標識」は、「レポーター基」と呼ばれることが多く、概して、核酸、特にオリゴヌクレオチド又は修飾オリゴヌクレオチド、ならびにそれに結合した任意の核酸をサンプルの残りから識別可能にする基である（標識が結合した核酸は標識された核酸結合化合物、標識されたプローブ又は単にプローブとも称することができる）。典型的な標識は蛍光標識であり、これらは例えばフルオレセイン色素、ローダミン色素、シアニン色素、及びクマリン色素などの蛍光色素である。好ましい蛍光色素はＦＡＭ、ＨＥＸ、ＪＡ２７０、ＣＡＬ６３５、Ｃｏｕｍａｒｉｎ３４３、Ｑｕａｓａｒ７０５、Ｃｙａｎ５００、ＣＹ５．５、ＬＣ−Ｒｅｄ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ７０５である。

任意のプライマー及び／又はプローブは化学的に修飾され得る、すなわち、プライマー及び／又はプローブは修飾ヌクレオチド又は非ヌクレオチド化合物を含む。プローブ又はプライマーはしたがって修飾オリゴヌクレオチドである。

核酸増幅の方法はポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）であり、これは他の文献のなかでも、米国特許第４６８３２０２号明細書、同第４６８３１９５号明細書、同第４８００１５９号明細書、及び同第４９６５１８８号明細書で開示されている。ＰＣＲは、典型的には、選択された核酸テンプレート（例えばＤＮＡ又はＲＮＡ）と結合する２以上のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる。核酸分析に有用なプライマーとしては、標的核酸の核酸配列内で核酸合成の開始点として作用できるオリゴヌクレオチドが挙げられる。プライマーは、従来法による制限消化によって精製することができるか、又は合成で製造することができる。プライマーは増幅での最大効率のために一本鎖であり得るが、プライマーは二本鎖であり得る。二本鎖プライマーをまず変性させ、すなわち処理して鎖を分離する。二本鎖核酸を変性する一方法は加熱による。「熱安定性ポリメラーゼ」は耐熱性のポリメラーゼ酵素である、すなわち、テンプレートに対して相補的であるプライマー伸長産物の形成を触媒する酵素であり、二本鎖テンプレート核酸の変性を行うために必要な時間、高温に付された場合、不可逆的に変性しない。概して、合成は、各プライマーの３’末端で開始され、テンプレート鎖に沿って５’から３’の方向で進行する。熱安定性ポリメラーゼは、例えばＴｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓ、Ｔ．ｒｕｂｅｒ、Ｔ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、Ｔ．ａｑｕａｔｉｃｕｓ、Ｔ．ｌａｃｔｅｕｓ、Ｔ．ｒｕｂｅｎｓ、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ、及びＭｅｔｈａｎｏｔｈｅｒｍｕｓ ｆｅｒｖｉｄｕｓから単離された。それでも、酵素が補充されるならば、熱安定性でないポリメラーゼもＰＣＲアッセイで用いることができる。

テンプレート核酸が二本鎖である場合、ＰＣＲでテンプレートとして使用できる前に２つの鎖を分離する必要がある。鎖分離は、物理的、化学的又は酵素的手段を含む任意の好適な変性法によって達成することができる。核酸鎖を分離する一方法は、大部分が変性されるまで（例えば、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又は９５％超）核酸を加熱することを含む。テンプレート核酸を変性させるために必要な加熱条件は、例えば、緩衝液塩濃度及び変性される核酸の長さ及びヌクレオチド組成に依存するが、典型的には、約９０℃〜約１０５℃の範囲で、温度や核酸長さなどの反応の特徴に応じた時間である。変性は、典型的には、約５秒〜９分間実施される。例えばＺ０５ＤＮＡポリメラーゼのような各ポリメラーゼをそのような高温に過度に長時間さらして機能的酵素の損失の危険を冒すことがないように、短い変性ステップを使用することが好ましい可能性がある。

二本鎖テンプレート核酸が熱によって変性される場合、反応混合物を、各プライマーの標的核酸上のその標的配列へのアニーリングを促進する温度に冷却させる。

アニーリングの温度は、約３５℃〜７０℃、もしくは約４５℃〜約６５℃；又は約５０℃〜約６０℃、もしくは約５５℃〜約５８℃であり得る。アニーリング時間は約１０秒〜約１分（例えば、約２０秒〜約５０秒；約３０秒〜約４０秒）であり得る。これに関連して、各アッセイの包括性を増大させるために、異なるアニーリング温度を使用することが有利であり得る。簡潔に言うと、このことは、比較的低いアニーリング温度で、プライマーはまた、単一のミスマッチを有する標的と結合することもでき、したがって、ある配列の変異体も増幅され得ることを意味する。これは、例えばある生物が、これもまた検出されるべきである既知又は未知の遺伝的変異体を有する場合、望ましい可能性がある。他方、温度が高くなるほど、プライマー結合が標的配列に正確にマッチしない確率は連続して減少するので、比較的高いアニーリング温度は、より高い特異性を提供する利点を有する。両現象から恩恵を受けるために、本発明のいくつかの実施形態において、上記プロセスは異なる温度で、例えば最初低い温度で、その後高い温度でのアニーリングを含む。例えば、第１インキュベーションを５５℃で約５サイクル行う場合、不正確にマッチする標的配列が（前）増幅される可能性がある。これに続いて５８℃で約４５サイクル行って、実験の主要部分全体にわたってより高い特異性を提供することができる。このように、潜在的に重要な遺伝的変異体は失われない一方で、特異性は比較的高いままである。

反応混合物を次いで、ポリメラーゼの活性が促進又は最適化される温度、すなわち、アニーリングされたプライマーから伸長がおこって、分析される核酸に対して相補的である生成物を生成するために充分な温度に調節する。温度は、核酸テンプレートにアニーリングされる各プライマーから伸長産物を合成するために充分でなければならないが、その相補的テンプレートからの伸長産物を変性するほど高くてはならない（例えば、伸長のための温度は、概して、約４０°〜８０℃の範囲（例えば、約５０℃〜約７０℃、約６０℃）である。伸長時間は、約１０秒〜約５分、又は約１５秒〜２分、又は約２０秒〜約１分、又は約２５秒〜約３５秒であり得る。新たに合成された鎖は二本鎖分子を形成し、これを続く反応ステップで使用できる。鎖分離、アニーリング、及び伸長のステップは、所望の量の標的核酸に対応する増幅産物を産生するために必要な回数繰り返すことができる。反応における制限因子は、反応で存在するプライマー、熱安定性酵素、及びヌクレオシド三リン酸の量である。サイクリングステップ（すなわち、変性、アニーリング、及び伸長）を少なくとも１回繰り返すことができる。検出での使用に関して、サイクリングステップ数は、例えば、サンプルの性質に依存する。サンプルが核酸の複雑な混合物である場合、検出に充分な標的配列を増幅するためにより多くのサイクリングステップが必要であろう。概して、サイクリングステップは少なくとも約２０回繰り返すが、４０、６０、又はさらには１００回も繰り返すことができる。

アニーリング及び伸長のステップを同じステップで実施するＰＣＲ（１ステップＰＣＲ）又は、前述のように、別のステップで実施するＰＣＲ（２ステップＰＣＲ）を実施することができる。アニーリング及び伸長を一緒に、したがって同じ物理的及び化学的条件下で、例えば、Ｚ０５ ＤＮＡポリメラーゼなどの酵素を用いて実施することは、各サイクルで追加のステップの時間を節約し、またアニーリングと伸長との間でさらなる温度調節の必要をなくすという利点を有する。したがって、１ステップＰＣＲは各アッセイの全体的な複雑さを低減する。

概して、結果を得るための時間が短縮され、早期診断が可能になるため、増幅全体についての時間は短いほど好ましい。

使用される他の核酸増幅方法は、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ； Ｗｕ Ｄ． Ｙ． ａｎｄ Ｗａｌｌａｃｅ Ｒ． Ｂ．， Ｇｅｎｏｍｉｃｓ ４ （１９８９） ５６０−６９； ａｎｄ Ｂａｒａｎｙ Ｆ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８８ （１９９１）１８９−１９３）；ポリメラーゼリガーゼ連鎖反応（Ｂａｒａｎｙ Ｆ．， ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃ． １ （１９９１） ５−１６）；Ｇａｐ−ＬＣＲ（国際公開第９０／０１０６９号）；修復連鎖反応（欧州特許出願公開第０４３９１８２（Ａ２）号明細書）、３ＳＲ（Ｋｗｏｈ Ｄ．Ｙ． ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６ （１９８９） １１７３−１１７７； Ｇｕａｔｅｌｌｉ Ｊ．Ｃ．， ｅｔ ａｌ．， Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８７ （１９９０） １８７４−１８７８；国際公開第９２／０８８０８号）、及びＮＡＳＢＡ（米国特許第５１３０２３８号明細書）を含む。さらに、鎖置換増幅（ＳＤＡ）、転写介在性増幅（ＴＭＡ）、及びＱｂ増幅（概説については、例えば、Ｗｈｅｌｅｎ Ａ． Ｃ． ａｎｄ Ｐｅｒｓｉｎｇ Ｄ． Ｈ．， Ａｎｎｕ． Ｒｅｖ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５０（１９９６） ３４９−３７３； Ａｂｒａｍｓｏｎ Ｒ． Ｄ． ａｎｄ Ｍｙｅｒｓ Ｔ． Ｗ．， Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ４ （１９９３） ４１−４７を参照のこと）がある。

内部対照核酸（internal control nucleic acid）は、その配列に関連して以下の特性を示し得る：
・５５℃〜９０℃、又は６５℃〜８５℃、又は７０℃〜８０℃、又は約７５℃の融解温度
・最高５００塩基もしくは塩基対、又は５０〜３００塩基もしくは塩基対、又は１００〜２００塩基もしくは塩基対、又は約１８０塩基もしくは塩基対の長さ
・３０％〜７０％、又は４０％〜６０％、又は約５０％のＧＣ含有量。

「配列」は核酸の一次構造である、すなわち、各核酸を構成する単一の核酸塩基の特異的な配列である。「配列」という語は、ＲＮＡ又はＤＮＡなどの特定の種類の核酸を意味するものではなく、両方にあてはまり、また例えばＰＮＡ又は他の同種のものなどの他の種類の核酸にも当てはまると理解されなければならない。核酸塩基が互いに対応する場合、特にウラシル（ＲＮＡ中に存在する）及びチミン（ＤＮＡ中に存在する）の場合、これらの塩基は、関連する技術分野で周知のように、ＲＮＡ配列とＤＮＡ配列との間で等価であるとみなすことができる。

臨床的に関連する核酸は、多くの場合、例えばＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）及び他の同種のもののようなＤＮＡウイルス、又は例えばＣｈｌａｍｙｄｉａ ｔｒａｃｈｏｍａｔｉｓ（ＣＴ）、淋菌（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）（ＮＧ）及び他の同種のもののような細菌由来であり得るＤＮＡである。そのような場合、標的核酸特性を反映するために、ＤＮＡからなる内部対照核酸を使用することが有利であり得る。

他方、臨床診断に関連する多くの核酸は、例えば、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）、Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）、西ナイル熱ウイルス（ＷＮＶ）、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）、日本脳炎ウイルス（ＪＥＶ）、セントルイス脳炎ウイルス（ＳＬＥＶ）及び他の同種のものなどのＲＮＡウイルス由来の核酸のようなリボ核酸である。本発明はそのような核酸に容易に適用することができる。この場合、標的核酸特性を反映するために、ＲＮＡからなる内部対照核酸を使用することが有利であり得る。ＲＮＡ及びＤＮＡの両方が上記プロセスで分析される場合、内部対照核酸は複数の標的が関与するアッセイの最も感受性の高い標的を模倣するので内部対照核酸はＲＮＡであり得、ＲＮＡ標的は通常、より入念に制御されなければならない。

したがって、本発明の一態様は、前記内部対照核酸がＲＮＡである前記方法である。

ＲＮＡはアルカリ性ｐＨ、リボヌクレアーゼ及び他の同種のものの影響のためにＤＮＡよりも分解を受けやすいので、ＲＮＡで作られた内部対照核酸は武装化粒子として提供してもよい。特に武装化ＲＮＡなどの武装化粒子は例えば欧州特許第９１０６４３号明細書で記載されている。簡潔に言うと、化学的に又はヘテロローガスに、例えば大腸菌などの細菌によって産生され得るＲＮＡは、ウイルスコートタンパク質中で少なくとも部分的にカプセル化される。後者は、外部の影響、特にリボヌクレアーゼに対するＲＮＡの耐性を付与する。内部対照ＤＮＡも武装化粒子として提供できることは理解されなければならない。武装化ＲＮＡ及びＤＮＡはどちらも内部対照核酸として有用である。一実施形態において、ＲＮＡ対照核酸は大腸菌においてＭＳ２コートタンパク質で武装化される。さらなる実施形態において、ＤＮＡ対照核酸はラムダファージＧＴ１１を用いて武装化される。

したがって、本発明の態様は、前記内部対照核酸が武装化核酸である、前述の方法である。

典型的には、増幅に基づく核酸診断において、ＲＮＡテンプレートを増幅及び検出の前にＤＮＡに逆転写する。

「逆転写酵素活性を有するポリメラーゼ」は、ＲＮＡテンプレートに基づいてＤＮＡを合成できる核酸ポリメラーゼである。ＲＮＡが一本鎖ｃＤＮＡに逆転写されると、一本鎖又は二本鎖ＤＮＡを複製することも可能である。本発明の実施形態において、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは熱安定性である。

本明細書中で使用する場合、「一本鎖ＲＮＡテンプレートのセグメント」又は「一本鎖ＲＮＡ対照配列のセグメント」という語は、その分解が本発明の方法で用いられる１以上のオリゴヌクレオチドによって防止又は低減されるＲＮＡテンプレート又は配列の部分を指す。いくつかの場合では、セグメントはＲＮＡテンプレート又は配列全体を対象とすることができ、他の場合では、セグメントは増幅され検出されるＲＮＡテンプレート又は配列の部分に及び得る。

一実施形態において、本発明によるプロセスは、前記ＲＮＡテンプレートとハイブリダイズするために前記ＲＮＡテンプレートに対して充分に相補的であるオリゴヌクレオチドプライマー、及び熱安定性ＤＮＡポリメラーゼとともにＲＮＡテンプレートを含むサンプルを、少なくとも４つすべての天然又は修飾デオキシリボヌクレオシド三リン酸の存在下、一実施形態では、ｐＨ及び金属イオン濃度の両方を緩衝する金属イオン緩衝液を含む適切な緩衝液中で、インキュベートすることを含む。このインキュベーションは、前記プライマーが前記ＲＮＡテンプレートとハイブリダイズするため、そして前記ＤＮＡポリメラーゼが前記デオキシリボヌクレオシド三リン酸の重合を触媒して、前記ＲＮＡテンプレートの配列に対して相補的であるｃＤＮＡ配列を形成するために充分な温度で実施する。

本明細書中で使用する場合、「ｃＤＮＡ」という語は、リボ核酸鎖（ＲＮＡ）をテンプレートとして合成された相補的ＤＮＡ分子を指す。ＲＮＡは、例えばｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、又はＲＮＡの別の形態、例えばウイルスＲＮＡであってよい。ｃＤＮＡは、一本鎖、二本鎖であってよいし、又はＲＮＡ／ｃＤＮＡハイブリッドにおいてのように相補的ＲＮＡ分子と水素結合していてもよい。

ＲＮＡテンプレートにアニーリングするために適したプライマーはＰＣＲによる増幅にも好適であり得る。ＰＣＲに関して、逆転写されたｃＤＮＡ鎖に対して相補的である第２プライマーは、伸長産物の合成の開始部位を提供する。

ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡ分子の増幅において、第１伸長反応はＲＮＡテンプレートを使用する逆転写であり、ＤＮＡ鎖が産生される。ＤＮＡテンプレートを使用する第２伸長反応は二本鎖ＤＮＡ分子を産生する。したがって、ＤＮＡポリメラーゼによるＲＮＡテンプレートからの相補的ＤＮＡ鎖の合成は増幅の出発原料を提供する。

熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはカップリングされた１酵素逆転写／増幅反応で使用することができる。「均一」という語は、これに関連して、ＲＮＡ標的の逆転写及び増幅のための２ステップの単一付加反応（ｓｉｎｇｌｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｒｅａｃｔｉｏｎ）を指す。均一とは、逆転写（ＲＴ）ステップ後に、反応容器を開ける必要がないか、又は増幅ステップの前に反応成分を調節する必要がないことを意味する。不均一ＲＴ／ＰＣＲ反応では、逆転写後で増幅の前に、増幅試薬などの反応成分の１以上を、例えば調節、添加、又は希釈し、そのために反応容器を開けなければならないか、又は少なくともその内容物を操作しなければならない。均一実施形態と不均一実施形態のどちらも本発明の範囲に含まれる。

逆転写はＲＴ／ＰＣＲにおいて重要なステップである。例えば、ＲＮＡテンプレートは、各逆転写酵素によるｃＤＮＡ鎖のプライマー結合及び／又は伸長を妨害し得る二次構造を形成する傾向を示すことが当該技術分野では知られている。したがって、ＲＴ反応の比較的高い温度は転写の効率に関して有利である。他方、インキュベーション温度を上昇させることもより高い特異性を意味する、すなわち、ＲＴプライマーは、予想される１つ又は複数の配列に対してミスマッチを示す配列にアニーリングしない。特に複数の異なる標的ＲＮＡの場合では、例えば、流体サンプル中に生物の未知又は稀少な亜系又は亜種が存在する可能性がある場合、単一のミスマッチを有する配列を転写し、その後増幅し、検出することが望ましい可能性がある。

上記の両方の利点、すなわち二次構造及びミスマッチを有するテンプレートの逆転写の低減から恩恵を受けるために、ＲＴインキュベーションは複数の異なる温度で実施することができる。

したがって、本発明の態様は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼの前記インキュベーションが、３０℃〜７５℃、又は４５℃〜７０℃、又は５５℃〜６５℃の異なる温度で実施される上記プロセスである。

逆転写のさらなる重要な態様として、長いＲＴステップは流体サンプル中に存在し得るＤＮＡテンプレートを損傷する可能性がある。流体サンプルがＲＮＡ及びＤＮＡ種の両方を含む場合、ＲＴステップの期間をできる限り短く保つが、同時に、その後の増幅及び任意の増幅産物の検出のために充分なｃＤＮＡ量の合成を保証することが好ましい。

したがって、本発明の態様は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼのインキュベーションの時間が最大で３０分、２０分、１５分、１２．５分、１０分、５分、又は１分である前記プロセスである。

本発明のさらなる態様は、逆転写酵素活性を有し、変異を含むポリメラーゼが、以下からなる群から選択されるプロセスである
ａ）ＣＳ５ＤＮＡポリメラーゼ
ｂ）ＣＳ６ＤＮＡポリメラーゼ
ｃ）Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａのＤＮＡポリメラーゼ
ｄ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ａｑｕａｔｉｃｕｓのＤＮＡポリメラーゼ
ｅ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼ
ｆ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｌａｖｕｓのＤＮＡポリメラーゼ
ｇ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｆｉｌｉｆｏｒｍｉｓのＤＮＡポリメラーゼ
ｈ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．ｓｐｓ１７のＤＮＡポリメラーゼ
ｉ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｓｐ．Ｚ０５のＤＮＡポリメラーゼ
ｊ）Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｎｅａｐｏｌｉｔａｎａのＤＮＡポリメラーゼ
ｋ）Ｔｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ａｆｒｉｃａｎｕｓのＤＮＡポリメラーゼ
ｌ）Ｔｈｅｒｍｕｓ ｃａｌｄｏｐｈｉｌｕｓのＤＮＡポリメラーゼ。

これらの要件に特に適しているのは、より速い伸長速度の点でそれらの逆転写効率を増強するポリメラーゼドメインにおいて変異を有する酵素である。

したがって、本発明の態様は、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼが、各野生型ポリメラーゼと比較して改善された核酸伸長速度及び／又は改善された逆転写酵素活性を付与する変異を含むポリメラーゼである前記プロセスである。

一実施形態において、上記プロセスでは、逆転写酵素活性を有するポリメラーゼは、各野生型ポリメラーゼと比較して改善された逆転写酵素活性を付与する変異を含むポリメラーゼである。

それらを特に有用にする点変異を有するポリメラーゼは、国際公開第２００８／０４６６１２号で開示されている。特に、用いられるポリメラーゼは、ポリメラーゼドメインに少なくとも以下のモチーフを含む変異ＤＮＡポリメラーゼであり得る：

Ｔ−Ｇ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｓ−Ｘｂ７−Ｘｂ８−Ｐ−Ｎ−Ｌ−Ｑ−Ｎ；ここで、Ｘｂ７はＳ又はＴから選択されるアミノ酸であり、Ｘｂ８はＧ、Ｔ、Ｒ、Ｋ、又はＬから選択されるアミノ酸であり、ポリメラーゼは３’−５’エキソヌクレアーゼ活性を含み、そして野生型ＤＮＡポリメラーゼと比較して改善された核酸伸長速度及び／又は改善された逆転写効率を有し、前記野生型ＤＮＡポリメラーゼにおいて、Ｘｂ８はＤ、Ｅ又はＮから選択されるアミノ酸である。

一例は、Ｔｈｅｒｍｕｓ種Ｚ０５由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの変異体（米国特許第５４５５１７０号明細書に記載）であり、前記変形は、各野生型酵素Ｚ０５と比較してポリメラーゼドメインに変異を含む。本発明の方法の実施形態は、５８０位のアミノ酸がＧ、Ｔ、Ｒ、Ｋ及びＬからなる群から選択される変異体Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼである。

熱安定性ポリメラーゼを使用する逆転写について、Ｍｎ２＋は二価カチオンであり得、典型的には塩、例えば、塩化マンガン（ＭｎＣｌ２）、酢酸マンガン（Ｍｎ（ＯＡｃ）２）、硫酸マンガン（ＭｎＳＯ４）として含まれる。ＭｎＣｌ２が５０ｍＭのＴｒｉｃｉｎｅ緩衝液を含む反応中に含まれる場合、例えば、ＭｎＣｌ２は概して０．５〜７．０ｍＭの濃度で存在し、各々２００μＭのｄＧＴＰ、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、及びｄＣＴＰを使用する場合、２．５〜３．５ｍＭが概して存在する。

ＤＮＡ標的核酸を保存しながらＲＮＡ標的核酸をｃＤＮＡに逆転写し、したがってｃＤＮＡ及びＤＮＡの両方をその後の増幅に使用することができることは本発明の範囲内に含まれるので、上記内部対照プロセスは、ＲＮＡを有する生物又はＤＮＡゲノムを有する生物の両方に由来する標的核酸の同時増幅に特に有用である。この利点は、同じ物理的条件下で分析できる異なる生物、特に病原体の範囲を相当増大させる。

「生物」は、本明細書中で使用する場合、あらゆる生きている単細胞又は多細胞生命体を意味する。本明細書では、ウイルスは生物である。

特に適切な最適温度のために、Ｔｔｈポリメラーゼ又は、例えば、前記変異体Ｚ０５ＤＮＡポリメラーゼのような酵素は、標的核酸のその後の増幅ステップを実施するために適している。逆転写及び増幅の両方に同じ酵素を用いることは、流体サンプルをＲＴ及び増幅ステップの間で操作する必要がないので、プロセスの実施の容易性に貢献し、その自動化を促進する。

増幅ステップの標的はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド分子であり得る。標的は一本鎖又は二本鎖核酸であり得る。最も広く用いられるＰＣＲ手順は二本鎖標的を使用するが、これは必須ではない。一本鎖ＤＮＡ標的の最初の増幅サイクルの後、反応混合物は、一本鎖標的と新たに合成された相補鎖とからなる二本鎖ＤＮＡ分子を含む。同様に、ＲＮＡ／ｃＤＮＡ標的の最初の増幅サイクルの後、反応混合物は二本鎖ｃＤＮＡ分子を含む。この時点で、増幅の連続サイクルは前述のように進行する。

好適な核酸検出法は当業者に公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋ Ｊ． ｅｔ ａｌ．， Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ， Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ， Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ， １９８９及びＡｕｓｕｂｅｌ Ｆ． ｅｔ ａｌ．： Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８７， Ｊ． Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， ＮＹ．のような標準的テキストに記載されている。核酸検出ステップを例えば沈殿ステップとして実施する前にさらなる精製ステップがあってもよい。検出方法には、二本鎖ＤＮＡ中にインターカレートし、その蛍光をその後に変化させるエチジウムブロミドなどの特異的色素の結合又はインターカレーティングが含まれ得るが、これらに限定されない。精製された核酸はまた、場合によって制限消化の後に電気泳動法によって分離し、その後可視化することもできる。特定の配列に対するオリゴヌクレオチドハイブリダイゼーションとその後のハイブリッド検出を用いる、プローブに基づくアッセイもある。

増幅した標的核酸は、分析結果を評価するために、増幅反応中又は増幅反応後に検出することができる。特にリアルタイム検出のために、核酸プローブを使用することが有利である。

増幅反応をリアルタイムでモニターすること、すなわち、標的核酸及び／又はそれらのアンプリコンを増幅中に検出することが好ましい可能性がある。

前記方法は、ドナー蛍光部分とアクセプター蛍光部分との間の蛍光共鳴エネルギー移動（ＦＲＥＴ）に基づくものであり得る。代表的なドナー蛍光部分はフルオレセインであり、代表的な対応するアクセプター蛍光部分としては、ＬＣ−Ｒｅｄ６４０、ＬＣ−Ｒｅｄ７０５、Ｃｙ５、及びＣｙ５．５が挙げられる。典型的には、検出は、ドナー蛍光部分によって吸収される波長でサンプルを励起し、そして対応するアクセプター蛍光部分によって放射される波長を可視化及び／又は測定することを含む。本発明によるプロセスにおいて、検出に続いてＦＲＥＴを定量することができる。例えば、検出を各サイクリングステップの後に実施する。例えば、検出をリアルタイムで実施する。市販のリアルタイムＰＣＲ装置（例えば、ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）又はＴａｑＭａｎ（登録商標））を使用することによって、ＰＣＲ増幅及び増幅産物の検出を単一の閉鎖キュベット中で組み合わせることができ、サイクリング時間が劇的に短縮される。検出は増幅と同時に行われるので、リアルタイムＰＣＲ法は増幅産物を操作する必要性を排除し、そして増幅産物間の二次汚染のリスクを減少させる。リアルタイムＰＣＲはターンアラウンド（ｔｕｒｎ−ａｒｏｕｎｄ）時間を大幅に短縮し、臨床検査室において従来のＰＣＲ技術の魅力的な代替策である。

以下の特許出願はＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）技術で用いられるリアルタイムＰＣＲを記載している：国際公開第９７／４６７０７号、国際公開第９７／４６７１４号及び国際公開第９７／４６７１２号。ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（商標）機器は、高品質光学素子を利用した微量蛍光光度計と組み合わせたラピッドサーマルサイクラーである。このラピッドサーモサイクリング技術は薄いガラス製キュベットを反応容器として使用する。反応チャンバーの加熱及び冷却は、熱風と周囲空気を交互に入れ替えることによって制御する。空気の質量が小さく、キュベットの表面積／容積比が高いため、サーマルチャンバー内で非常に迅速な温度交換速度を達成することができる。

ＴａｑＭａｎ（登録商標）技術は、２つの蛍光部分で標識された一本鎖ハイブリダイゼーションプローブを利用する。第１蛍光部分が好適な波長の光で励起されると、吸収されたエネルギーがＦＲＥＴの原理に従って第２の蛍光部分に移される。第２の蛍光部分は、概してクエンチャー分子である。このフォーマットで使用される典型的な蛍光色素は、例えばとりわけ、ＦＡＭ、ＨＥＸ、ＣＹ５、ＪＡ２７０、Ｃｙａｎ及びＣＹ５．５である。ＰＣＲ反応のアニーリングステップの間、標識されたハイブリダイゼーションプローブは標的核酸（すなわち、増幅産物）と結合し、Ｔａｑ又は当業者に公知の好適な別のポリメラーゼ、例えば変異Ｚ０５ポリメラーゼの５’から３’エキソヌクレアーゼ活性によって、その後の伸長期の間に分解される。その結果、励起された蛍光部分及びクエンチャー部分は空間的に互いに隔てられるようになる。その結果、クエンチャーの不在下で第１蛍光部分が励起されると、第１蛍光部分からの蛍光発光を検出することができる。

上述の両検出フォーマットにおいて、放出されたシグナルの強度は、元の標的核酸分子の数と相関させることができる。

ＦＲＥＴの代替として、増幅産物は、蛍光ＤＮＡ結合色素（例えば、ＳＹＢＲＧＲＥＥＮ Ｉ（登録商標）又はＳＹＢＲＧＯＬＤ（登録商標）（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ））などの二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用して検出することができる。二本鎖核酸と相互作用すると、そのような蛍光ＤＮＡ結合色素は好適な波長の光で励起した後に蛍光シグナルを放出する。核酸インターカレーティング色素などの二本鎖ＤＮＡ結合色素も使用することができる。二本鎖ＤＮＡ結合色素を使用する場合、通常、増幅産物の存在を確認するために融解曲線分析を実施する。

本発明のリアルタイムＰＣＲ法を使用して増幅産物の存在を検出するために、ＦＲＥＴとあわせた分子ビーコンも使用できる。分子ビーコン技術は、第１蛍光部分及び第２の蛍光部分で標識したハイブリダイゼーションプローブを使用する。第２の蛍光部分は、概してクエンチャーであり、蛍光標識は典型的にはプローブの各末端に位置する。分子ビーコン技術は、二次構造形成（例えば、ヘアピン）を可能にする配列を有するプローブオリゴヌクレオチドを使用する。プローブ内での二次構造形成の結果、プローブが溶液中にある場合、両蛍光部分は空間的に近接する。増幅産物に対するハイブリダイゼーション後、プローブの二次構造は破壊され、蛍光部分は互いに分離されるようになり、したがって、好適な波長の光で励起した後、第１蛍光部分の発光を検出することができる。

したがって、本発明による方法は、ＦＲＥＴを使用する前記方法であり、前記プローブは二次構造形成を可能にする核酸配列を含み、前記二次構造形成の結果、前記第１蛍光部分と第２の蛍光部分とが空間的に近接する。

効率的なＦＲＥＴは、蛍光部分が局所的に直接近接する場合、及びドナー蛍光部分の発光スペクトルがアクセプター蛍光部分の吸収スペクトルと重複する場合にのみ起こり得る。

したがって、一実施形態において、前記ドナー及びアクセプター蛍光部分は前記プローブ上で互いに５ヌクレオチド以内である。

さらなる実施形態において、前記アクセプター蛍光部分はクエンチャーである。

上述のように、ＴａｑＭａｎ（登録商標）フォーマットでは、ＰＣＲ反応のアニーリングステップの間に、標識されたハイブリダイゼーションプローブは標的核酸（すなわち、増幅産物）と結合し、そしてその後の伸長期の間に、Ｔａｑ又は当業者に公知の別の好適なポリメラーゼ、例えば変異体Ｚ０５ポリメラーゼの５’から３’エキソヌクレアーゼ活性によって分解する。

したがって、一実施形態において、前記プロセスでは、増幅は、５’から３’エキソヌクレアーゼ活性を有するポリメラーゼ酵素を用いる。

前記プロセスの結果として得られるアンプリコンの長さを慎重に選択することがさらに有利である。概して、比較的短いアンプリコンは増幅反応の効率を増大させる。したがって、本発明の一態様は、増幅されたフラグメントが最大４５０塩基、最大３００塩基、最大２００塩基、又は最大１５０塩基を含む前記プロセスである。

本発明で用いられる内部対照核酸は、定量、すなわち標的核酸の量を測定するための基準である傾向にあり、また基準として使用される「定量的標準核酸 (quantitative standard nucleic acid)」としての役割を果たすことができる。この目的のために、１以上の定量的標準核酸は、標的核酸とともにすべての可能なサンプル調製ステップに供する。さらに、定量的標準核酸は、同じ反応混合物内で方法全体にわたって処理される。定量的標準核酸は、標的核酸の存在下又は不在下の両方で、検出可能なシグナルを直接的又は間接的に生成しなければならない。この目的のために、定量的標準核酸の濃度は、感度を妨害しないが検出可能なシグナルも、例えば非常に高い標的濃度で生成するために、慎重に最適化されなければならない。各アッセイの検出限界（ＬＯＤ、下記参照）に関して、「定量的標準核酸」の濃度範囲は２０〜５０００×ＬＯＤ、２０〜１０００×ＬＯＤ、又は２０〜５０００×ＬＯＤである。反応混合物中の定量的標準核酸の最終濃度は得られた定量的測定範囲に依存する。

「検出限界」又は「ＬＯＤ」は、サンプル中の核酸の検出可能な最低量又は最低濃度を意味する。低い「ＬＯＤ」は高い感度に対応し、逆も同様である。「ＬＯＤ」は、通常、特に核酸がウイルス核酸である場合は単位「ｃｐ／ｍｌ」によって表されるか、又はＩＵ／ｍｌとして表される。「Ｃｐ／ｍｌ」は「１ミリリットル当たりのコピー数」を意味し、ここで、「コピー」は各核酸のコピーである。ＩＵ／ｍｌはＷＨＯ標準を意味する「国際単位／ｍｌ」を表す。

ＬＯＤを算出するために広く用いられている方法は「プロビット分析」であり、これは刺激（用量）と素量（全か無）応答との間の関係を分析する方法である。典型的な素量応答実験において、動物の群に異なる用量の薬物を投与する。各用量レベルでの死亡率を記録する。これらのデータを次に、プロビット分析を使用して分析することができる。プロビットモデルは、応答率（％）が累積正規分布としてのログ用量に関連すると仮定する。すなわち、ログ用量を変数として使用して、累積正規分布から死亡率を読み取ることができる。他の確率分布ではなく正規分布を使用することは、可能な用量の上限及び下限で予想される応答率に影響を及ぼすが、中央付近ではほとんど影響を及ぼさない。

プロビット分析を明確な「ヒットレート (hitrate)」として適用することができる。当該技術分野で知られているように、「ヒットレート」は、通常、パーセント［％］で表され、分析物の特定の濃度での陽性結果の百分率を示す。したがって、例えば、ＬＯＤは９５％ヒットレートで決定することができ、これは、ＬＯＤが妥当な結果の９５％が陽性である設定について算出されることを意味する。

一実施形態において、前記プロセスは、１〜１００ｃｐ／ｍｌ又は０．５〜５０ＩＵ／ｍｌ、又は１〜７５ｃｐ／ｍｌ又は０．５〜３０ＩＵ／ｍｌ、又は１〜２５ｃｐ／ｍｌ又は１〜２０ＩＵ／ｍｌのＬＯＤを提供する。

ある特定のウイルスからの可能な標的核酸のいくつかの例に関して、前記プロセスは、以下のＬＯＤを提供する：
・ＨＩＶ：最高６０ｃｐ／ｍｌ、最高５０ｃｐ／ｍｌ、最高４０ｃｐ／ｍｌ、最高３０ｃｐ／ｍｌ、最高２０ｃｐ／ｍｌ、又は最高１５ｃｐ／ｍｌ
・ＨＢＶ：最高１０ＩＵ／ｍｌ、最高７．５ＩＵ／ｍｌ、又は最高５ＩＵ／ｍｌ
・ＨＣＶ：最高１０ＩＵ／ｍｌ、最高７．５ＩＵ／ｍｌ、又は最高５ＩＵ／ｍｌ
・ＷＮＶ Ｉ：最高２０ｃｐ／ｍｌ、最高１５ｃｐ／ｍｌ、又は最高１０ｃｐ／ｍｌ
・ＷＮＶ ＩＩ：最高２０ｃｐ／ｍｌ、最高１５ｃｐ／ｍｌ、最高１０ｃｐ／ｍｌ、又は最高５ｃｐ／ｍｌ
・ＪＥＶ：最高１００ｃｐ／ｍｌ、最高７５ｃｐ／ｍｌ、最高５０ｃｐ／ｍｌ、又は最高３０ｃｐ／ｍｌ
・ＳＬＥＶ：最高１００ｃｐ／ｍｌ、最高７５ｃｐ／ｍｌ、最高５０ｃｐ／ｍｌ、最高２５ｃｐ／ｍｌ、又は最高１０ｃｐ／ｍｌ。

定量的標準核酸としての役割を果たす内部対照核酸に基づくＴａｑＭａｎ（登録商標）フォーマットにおける定量的結果の計算を実施する方法の一例を以下で記載する：力価は、全ＰＣＲ実施からの機器補正された蛍光値の入力データから算出される。標的核酸と定量的標準核酸としての役割を果たす内部対照核酸とを含むサンプルのセットに特定の温度プロフィールを使用するｔｈｅｒｍｏｃｙｃｌｅｒでのＰＣＲを実施する。ＰＣＲプロファイル中の選択された温度及び時間で、サンプルにフィルタリングした光を照射し、フィルタリングした蛍光データを標的核酸及び内部対照核酸の各サンプルについて集める。ＰＣＲ実施が完了した後、蛍光読取値を処理して、１セットの内部対照核酸の色素濃度データと、１セットの標的核酸の色素濃度データを得る。色素濃度データの各セットを同じ方法で処理する。数回の妥当性チェックの後、エルボー値（ＣＴ）を内部対照核酸及び標的核酸について算出する。エルボー値は、標的核酸又は内部対照核酸の蛍光が所定の閾値（蛍光濃度）と交差する点として定義される。力価決定は、標的核酸及び内部対照核酸が同じ効率で増幅され、算出されたエルボー値で等しい量の標的核酸及び内部対照核酸のアンプリコンが増幅され検出されるという仮定に基づく。したがって、（ＣＴＱＳ−ＣＴ標的）はｌｏｇ（標的濃度／ＱＳ濃度）に対して線形である。これに関連して、ＱＳは、定量的標準核酸としての役目を果たす内部対照核酸を意味する。力価Ｔを次に、例えば、以下の等式においてのような多項較正式を使用することによって算出することができる：
Ｔ’＝１０（ａ（ＣＴＱＳ−ＣＴ標的）２＋ｂ（ＣＴＱＳ−ＣＴ標的）＋ｃ）

多項式定数及び定量的標準核酸の濃度は既知であり、したがって、式の唯一の変数は差（ＣＴＱＳ−ＣＴ標的）である。

さらに、内部対照核酸は、「定性的内部対照核酸」としての役割を果たすことができる。「定性的内部対照核酸」は、定性的検出アッセイの試験結果の妥当性を確認するために特に有用である、すなわち、否定的な結果の場合でも、定性的内部対照が検出されなければならず、さもなければ、試験自体が無効とみなされる。しかしながら、定性的設定では、必ずしも肯定的な結果の場合に検出される必要はない。結果として、その濃度は比較的低くなければならない。各アッセイ及びその感度に対して慎重に適応させなければならない。例えば、定性的内部核酸、すなわち第２の対照核酸の濃度範囲は、反応あたり１コピーから反応あたり１０００コピーの範囲を含む。各アッセイの検出限界（ＬＯＤ）に関連して、その濃度は、アッセイのＬＯＤとＬＯＤの２５倍の値との間であるか、又はＬＯＤと１０×ＬＯＤとの間である。あるいは、２×ＬＯＤと１０×ＬＯＤとの間である。あるいは、５×ＬＯＤと１０×ＬＯＤとの間である。あるいは、５×ＬＯＤ又は１０×ＬＯＤである。

本発明の第一の態様は、ヌクレアーゼ及び加水分解耐性核酸標準及び対照の調製及び使用である。内部標準及び正の対照は、試験キットの正しい機能を保証し、試験結果を確認する上で重要な役割を果たす。内部標準は定量化のための手段も提供する。サンプル中の特定のＲＮＡの検出及び定量化はＲＴ−ＰＣＲの出現とともに普及するようになった。ＲＴ−ＰＣＲ研究のための内部標準はＲＮＡ分子でなければならない。なぜなら、それは逆転写及びＰＣＲ増幅ステップの両方を制御するからである。このことは、ＲＮＡが特にＲＮａｓｅ及び熱分解の影響を受けやすいので問題である。サンプルの保存中又は導入後のいずれかでＲＮＡ標準の部分的又は完全分解により、改変された試験結果を得る可能性があった。ＲＮＡ検出スキームの多くが、比較的多量の様々なＲＮａｓｅｓがある血清サンプルのウイルスＲＮＡを検出するために設計されると仮定すると、少なくとも部分的ＲＮＡ分解の可能性はかなり高い。ＲＮＡ診断アッセイの理想的な内部標準は、アッセイフォーマットにおけるＲＮＡと機能的に同等であるが、ヌクレアーゼによる分解又は加水分解による分解に対して耐性である分子である。ＲＮａｓｅｓが活性である環境において酵素による分解からＲＮＡを保護するために３つの一般的な方法、すなわち、（１）透過不可能な構造の内部にＲＮＡをマイクロカプセル化する方法、（２）標準へのヌクレアーゼのアクセスを拒否する分子とＲＮＡを非共有結合させる方法、及び（３）アッセイフォーマットにおいて依然としてＲＮＡと機能的に同等でありながら、もはやヌクレアーゼの基質ではなくなるように、ＲＮＡの構造を化学的に改変する方法を想定することができる。

本発明の標準における核酸は、定量化アッセイで使用することができる。これらの標準は、様々な目的のため、例えば定量的ＲＮＡ標準（特定のＲＮＡ配列の絶対コピー数を決定するため）、特に、血漿、血清、又は脳脊髄液中の、ＨＩＶ−１、ＨＩＶ−２、ＨＣＶ、ＨＴＬＶ−１、ＨＴＬＶ−２、Ｇ型肝炎、エンテロウイルス、デング熱ウイルス、又は狂犬病などのＲＮＡウイルスの数を定量化するために使用することができる。それらはまた、ＲＴ−ＰＣＲアッセイによって細胞又は組織中の特定のｍＲＮＡの発現を定量化するためにも使用できる。標準は内部であっても外部であってもよい。サンプル及び標準が１つとして処理し分析されるように、内部標準を既知濃度のサンプルと混合する。したがって、サンプルごとのアッセイの効率の差を、内部標準によって生じたシグナルを使用して正規化する。外部標準を、サンプルと並行して既知濃度で処理し分析するが、サンプルとは別に処理する。いくつかの異なる濃度の外部標準を同時に処理して、標準曲線を作製し、これを次に使用して、未知のサンプルの値を決定することができる。内部及び外部標準はどちらも定量化のために使用できるが、内部標準の方が概してより正確とみなされる。標準を、試薬のすべてが適切に機能することを示すためにＲＴ−ＰＣＲアッセイに基づくか又はＲＴ−ＰＣＲアッセイにおける診断ＲＮＡである細菌、真菌、又は寄生虫性疾患において、診断で正の対照として作用する定性的標準として使用することができる。これらの標準を使用して、単離手順に供し、それに続いてノザンブロッティングを行った後、保護されたＲＮＡにおいて観察される分解の量を測定することによって、ＲＮＡ単離手順の完全性を測定することができる。それらは、環境トレーサーとして使用して、地下水の流れを追跡するか、又は独自の核酸配列で個々の企業の廃棄物を標識することができ、これで違反企業をたどることができる。

本発明はウイルス定量化に特に有用である。開発中及び／又は市販のプロセスにおいて多くの新規核酸ベースのアッセイが存在する。これらのアッセイは、ヒト血漿又は血清中の病原性ヒトウイルス、例えばＨＩＶ及びＨＣＶを検出する。これらのアッセイは高感度であり、１．０ｍｌの血漿あたり３００ビリオン未満でも検出する。それらの現行のフォーマットにおいて、これらの核酸ベースのアッセイの一部は、それらの定量的標準に裸のＲＮＡを使用する。残念なことに、これらの裸のＲＮＡ標準は夾雑リボヌクレアーゼや熱による加水分解の影響を非常に受けやすく、したがって、アッセイの結果は損なわれる可能性がある。

本発明の一つの第１実施形態は、標準核酸をコードする配列を含むヌクレアーゼ及び加水分解耐性組換え核酸セグメントを含む核酸標準に関する。いくつかの好ましい実施形態において、核酸標準は、標準ＲＮＡをコードする配列を含むリボヌクレアーゼ及び加水分解耐性ＲＮＡセグメントを含むＲＮＡ標準である。本明細書中で用いられる場合、「標準的核酸」及び「標準的ＲＮＡ」とは、それぞれ、用いられる特定のアッセイで標準として適した核酸及びＲＮＡを指す。本発明は、ＲＮＡウイルスを定量化するためのＲＮＡ標準として非常に適したリボヌクレアーゼ及び加水分解耐性組換えＲＮＡを企図するが、組換え体である必要はなく、組織培養からの細胞などの任意の供給源から単離されたＲＮＡのＲＮＡ標準として使用することができる。

本明細書中で、「ヌクレアーゼ耐性」及び「リボヌクレアーゼ耐性」という語は、核酸が同じ配列の裸の非修飾核酸よりもヌクレアーゼに対して多少増加した耐性を示すことを意味する。同様に、「加水分解耐性」という語は、核酸が、同じ配列の裸の非修飾核酸よりも多少増加した自発的温度依存性加水分解に対する耐性を示すことを意味する。

核酸セグメントをヌクレアーゼ耐性にするために用いることができる様々な方法がある。核酸セグメントは、化学的に修飾することができるか、ヌクレアーゼ耐性コーティングでコーティングすることができるか、又はヌクレアーゼ耐性構造中にケージ化することができる。例えば、ＲＮＡ標準は、リボヌクレアーゼに対して耐性である化学的に修飾されたＲＮＡであり得る。組換えＲＮＡセグメントをリボヌクレアーゼ耐性にする別の方法は、組換えＲＮＡセグメントをリボヌクレアーゼ耐性コーティングでコートすることである。そのようなコーティングは、配列依存的又は非依存的方法でＲＮＡに結合し、ＲＮＡをリボヌクレアーゼ耐性にするいかなるものでもあり得る。いくつかの場合で、ＲＮＡ標準は、リボヌクレアーゼ耐性構造中で外部環境からケージ化された組換えＲＮＡである。ＲＮＡは、単に細胞の内部にあることによってケージ化され得る。ケージ化ＲＮＡの他の合成法は、ウイルスタンパク質中のＲＮＡの部分キャプシド形成、ＲＮＡの部分脂質カプセル化、ポリマーマトリックス中のＲＮＡの部分トラッピングなどを含む。

別の方法において、リボヌクレアーゼ又は加水分解耐性構造は、ＲＮＡ標準を部分的にキャプシドで包むウイルスコートタンパク質から構成される。ＲＮＡは、細菌宿主においてインビボで転写され、次いでバクテリオファージタンパク質によってキャプシドで包まれる。ＲＮＡのこの「ケージ化」の結果、リボヌクレアーゼから保護されたＲＮＡ（武装化ＲＮＡ）が得られる。核酸又はＲＮＡをヌクレアーゼ耐性又は加水分解耐性構造中に完全又は実質的にケージ化することができるが、部分的ケージ化が核酸又はＲＮＡをヌクレアーゼもしくはリボヌクレアーゼ又は加水分解耐性にする限りにおいて、部分的にケージ化された核酸及びＲＮＡもまた本発明の範囲に含まれる。したがって、本明細書中で使用する場合、「キャプシド形成」、「カプセル化」、「トラッピングされた」及び同種の語は、これらの語が本明細書中で用いられる場合、結果としての構造がヌクレアーゼ又は加水分解耐性である限りにおいて、キャプシド形成、カプセル化、トラッピングなどが部分的ならびに実質的又は実質的に完全である構造を包含する。

ＲＮＡはまた、リボヌクレアーゼに耐性となるように化学的に修飾することもできる。化学的に修飾されたＲＮＡは、化学的に修飾されたヌクレオチドから構成され得る。これらのヌクレオチドは、リボヌクレアーゼがＲＮＡに作用できないように修飾される。化学的に修飾されたＲＮＡは、ＲＮＡ又はあらかじめ転写されたＲＮＡ転写物の化学的修飾によって調製される。あるいは、化学的に修飾されたＲＮＡは、すでに化学的に修飾されたヌクレオチドから転写又は合成することができる。

ＲＮＡ標準はまた、リボヌクレアーゼ耐性コーティングと非共有結合しているか又はリボヌクレアーゼ耐性コーティングでコートされたＲＮＡも含み得る。配列依存性又は非依存性であり得るそのような結合は、ＲＮＡをリボヌクレアーゼ耐性にする。いくつかの実施形態において、結合した分子はタンパク質から構成される。そのような結合タンパク質の例はＭＳ２／Ｒ１７コートタンパク質、ＨＩＶ−１ヌクレオキャプシドタンパク質、ｇｐ３２、Ｔ４のｒｅｇＡタンパク質、又はバクテリオファージＴ４のｇｐ３２である。他の場合では、非共有結合分子は、小分子から構成される。例えば、ポリアミン、スペルミン及び／又はスペルミジン。リボヌクレアーゼ耐性コーティングはまた核酸から構成され得る。いくつかの好ましい実施形態では、核酸は、組換えＲＮＡとハイブリダイズし、ヌクレアーゼをブロックし、そして逆転写酵素のプライマーとしての役割を果たすことができる。他の場合では、ポリ−Ｌ−リシン及びカチオン性界面活性剤、例えばＣＴＡＢを使用してＲＮＡをコートし保護することができる。

汎用内部対照／定量標準 (generic Internal Control/Quantitation Standard)（ＩＣ／ＱＳ）概念は、全ての診断アッセイで使用される単一対照配列（例えば、１つの配列に由来する１つのＤＮＡと１つのＲＮＡ）を使用することに基づく。歴史的には、内部対照の設計には、プライマーの標的と競合する対照である、競合的増幅が用いられてきた。競合的増幅概念を使用して、各アッセイは、アッセイ標的及び汎用プローブ結合部位と同一であるプライマー結合配列から構成される個々の対照配列を使用した。各新規アッセイについて、標的プライマーは、対照プライマーとしての役割も果たし、したがって、アッセイで追加のプライマーは必要なかった。多重アッセイにおいて、１つだけの内部対照は、標的の１つに対応するプライマー結合部位を有するように構築された。多重アッセイにおいて１つのＩＣを使用することは、明らかに、もはやアッセイにおける他の標的と競合的ではなかった。したがって、完全プロセス対照の目標は部分的にしか満たされなかった。非競合的対照の第２の例は、それ自身のプライマーセットを必要とするサンプル中の細胞に由来する内因性ヒトゲノム内部対照を使用する。汎用ＩＣ／ＱＳの重要な要件は以下のものを含んでいた：すべての調節要件を満たさなければならない。各アッセイにおいて完全プロセス対照（ＦＰＣ）、内部対照（ＩＣ）、及び内部定量標準（ＩＱＳ）としての役割を果たさなければならない。ＦＰＣに関して、サンプル調製を通して１つ又は複数の標的について類似した効率でなければならない。任意の意図する標的とプライマー及びプローブ結合部位を共有してはならないが、類似した効率で増幅／検出しなければならない、すなわち、標的が増幅／検出する場合は増幅／検出できず、標的と同様にＰＣＲ阻害剤に応答しなければならない。汎用ＩＣ／ＱＳは改善されたダイナミックレンジ、ＬＯＤ、及びアッセイ精度をもたらさなければならず、発生時間及び操作上の複雑さを低減しなければならない。

汎用対照の概念は、ＲＮＡ又はＤＮＡのいずれかであり得る共通対照配列からなり、保護される（例えば、武装化ＲＮＡ（ＭＳ２ファージコートタンパク質粒子）又は武装化ＤＮＡ（ラムダファージ粒子）と称する粒子中のように）。可能ならば、汎用対照はすべてのアッセイで使用される新規プライマー及びプローブの１セットを有する。この目的のために、プライマー及びプローブとあわせた汎用内部対照（ＧＩＣ）は、ＮＣＢＩ Ｂｌａｓｔプログラム及びＥＭＢＯＳＳ ｓｈｕｆｆｌｅｓｅｑ（Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｏｐｅｎ Ｓｏｆｔｗａｒｅ Ｓｕｉｔｅ）を使用して独自の配列を生成するために設計することができる。

本発明の基本的概念は、関心対象の特異的ＲＮＡ配列を核酸二本鎖に変換することによってＲＮＡを加水分解又はＲＮａｓｅ分解から保護するという概念である。一実施形態において、この二本鎖はＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド二本鎖である。二本鎖ＤＮＡにおけるホスホジエステル結合の加水分解速度は一本鎖ＤＮＡよりも１０倍遅いことが知られている。また、すべての一般的な夾雑リボヌクレアーゼは一本鎖ＲＮＡ基質を好む。ＲＮＡ／ＤＮＡハイブリッド二本鎖はＲＮａｓｅ Ｈに好ましい基質であるが、このリボヌクレアーゼは一般的な夾雑物ではない。

一本鎖ＲＮＡが容易に加水分解され、低い熱安定性を有することはよく知られている。これは、２’−ヒドロキシルが近接し、この結果、隣接基関与効果とエステル交換、それに続いて最終的に鎖切断がもたらされ得るためである。２’，３’−環状中間体に至る遷移状態には厳密な幾何学的及び立体的要件があることも知られている。２’−ヒドロキシルは、脱離基と一列になって一次的な三角両錐構造をもたらすような正しい位置にそれ自体を配列させることができなければならない。２’−３’環状ホスフェート中間体の形成は、遷移状態の形成が結合の柔軟性のために低いエネルギー要件を有し、利用可能な自由度が多いため、一本鎖ＲＮＡ立体配座に限定されない。ＲＮＡを二本鎖形態にすることによって、求核試薬及び脱離基は拘束され、官能基の自由度は大幅に減少する。本発明の安定化のための相補的オリゴヌクレオチドプール（ＣＯＰＳ）を添加することで、ハイブリダイゼーションが起こり、ＤＮＡ：ＲＮＡハイブリッド二本鎖が形成される。二本鎖構造中に保持される場合、ＲＮＡは硬質であり、もはや柔軟ではない。二本鎖状態では、２’−ヒドロキシル及びホスホジエステル結合（脱離基）は互いに反対の方向に位置しない。遷移状態の形成は、巻き戻し及び多くの水素結合の切断なしには可能ではない。これはエネルギー的に非常に不利であり、したがって許容されない。加えて、硬質の二環式２’，３’−ホスフェート中間体はすでに硬質構造で形成することができない。これによって、ＣＯＰＳ法によってＲＮＡに付与される並外れた熱安定性の説明がつく。

したがって、本発明の重要な特徴は、１以上の逆相補オリゴヌクレオチド配列を保存溶液、試料、又は必要に応じて抽出緩衝液に導入することによって実現することができる。保護される全ＲＮＡ配列は、１以上の逆相補オリゴヌクレオチド配列に対するハイブリダイゼーションによって場合によりカバーされてもよい。相補的オリゴヌクレオチド配列は、当該技術分野で理解されるように、関心対象のＲＮＡ配列に対して完全に相補的である必要はなく、オリゴヌクレオチド（複数可）とＲＮＡとの間のハイブリダイゼーションが依然として適度にストリンジェントな条件で起こり得る限り、ＲＮＡ配列に対して部分的に相補的であり得る。相補的オリゴヌクレオチド配列は、場合によって、互いに隣接するように選択することができる。相補的オリゴヌクレオチド配列の濃度、長さ、及び組成は、下流プロセスステップ（例えばＰＣＲ増幅）が受ける影響又は損傷が最低となるように選択される。例えば、４５℃以上の温度でＲＮＡ配列に対するハイブリダイゼーションを可能にするが、下流サンプル調製プロセスにおいて固相に対する結合を最小限に抑える範囲（例えば、１１〜５０ヌクレオチド又は１１〜３０ヌクレオチドの長さ）内にオリゴヌクレオチド補体の長さを保持することによって、その後のＲＴ−ＰＣＲ反応における有害な干渉は最小限に抑えられる。さらに、オリゴヌクレオチド補体がプライマーよりも充分低い融解温度を有するように設計し、そして逆転写（ＲＴ）ステップの間に充分高いアニーリング温度を維持することによって、プライマーとの競合を最小限に抑えることができる。同様に、オリゴヌクレオチド補体の３’末端をブロックすることによって、その後のＲＴ−ＰＣＲ反応で依然として存在し得る補体はポリメラーゼによって伸長することができない。オリゴヌクレオチド補体の濃度は、ＲＮＡ配列の適切な保護を提供するために充分なモル過剰であるが、下流プロセス（例えば、ＰＣＲ増幅）に害を及ぼさないために充分低い濃度であるように選択することもできる。

相補オリゴヌクレオチド配列の組成物は、関心対象のＲＮＡ配列を有する安定な二本鎖を形成するそれらの能力によってのみ制限される。これらのオリゴヌクレオチドは、したがって、ＤＮＡ、Ｌ−ＤＮＡ、ＲＮＡ、ＬＮＡ、ＰＮＡ、ＢＮＡなど、又はヌクレオチド塩基、糖、もしくはホスホジエステル骨格に関する他の既知変形及び修飾を含み得る。

前記発明は、明確さ及び理解のためにやや詳細に記載してきたが、この開示を読むことで形態及び詳細の様々な変更が可能であることは当業者には明らかであろう。例えば、上記組成物及び方法はすべて様々な組み合わせで使用することができる。

以下の実施例は、現在のところ実施するのに好ましいので、本発明の実施形態を説明するために提示する。実施例は例示的であると理解され、本発明は添付の特許請求の範囲で指定されているものを除いて限定するとみなされない。

以下の実施例は本発明の方法を説明する。

実施例１：相補的オリゴヌクレオチドプールの設計及び調製
コンピュータ設計ツール（ｓｉｌｉｃｏ ｄｅｓｉｇｎ ｔｏｏｌ）を使用してＲＮＡ配列に対して相補的オリゴヌクレオチドを設計した。合計１０のオリゴヌクレオチドを設計して、長さは１４〜２６塩基で変動し、Ｔｍ計算値は４９．９〜５７．９Ｃの範囲であり、関心対象の配列をカバーした。これらの配列を、３’末端でのホスフェート部分でさらに修飾した１０個のオリゴヌクレオチドの配列及び融解温度を表１に示す。

オリゴヌクレオチドを合成し、ＨＰＬＣによって精製し、それぞれ１００マイクロモル濃度の最終濃度に調節した。等体積のこれらの溶液をまとめて、１０マイクロモル濃度の相補的オリゴヌクレオチドプールを得、これを、Ｃ１８逆相カラムならびにトリエチルアンモニウムアセテート及びアセトニトリルの非線形勾配を使用するＵＰＬＣ分析によって特性決定した。結果を図１に示し、１０個のオリゴヌクレオチドすべての存在を確認した。

実施例２：加速安定性試験のためのＲＮＡ及び武装化ＲＮＡサンプルの調製
ＲＮＡ転写物及び武装化ＲＮＡサンプルを、１００ｍＭのＫＣｌを含有するＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中３００コピー／マイクロリットルの濃度で調製した。安定化のための相補的オリゴヌクレオチドプール（ＣＯＰＳ）と称する補体プールをサンプルに０、０．１、１、又は１０ｎＭの最終濃度で添加した。サンプルを２〜８℃、３７℃又は４５℃で１８日間インキュベートした。

実施例３：ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ安定性の測定
５マイクロリットルの各サンプルをＴａｑｍａｎ（登録商標）に基づくＲＴ−ＰＣＲによって増幅した。ＰＣＲ反応混合物を以下の最終濃度で９６ウェルプレート上で調製した：６０ｍＭのＴｒｉｃｉｎｅ（ｐＨ８．３）、１２０ｍＭの酢酸カリウム、３％グリセロール、５．４％ＤＭＳＯ、０．０１５％Ｔｗｅｅｎ２０、各々４００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ、８００μＭのｄＵＴＰ、各々６００ｎＭのプライマー、１００ｎＭのプローブ、標的ＲＮＡ転写物又は武装化ＲＮＡ（１，５００コピー）、９００単位／ｍＬのＺＯ５Ｄ ＤＮＡポリメラーゼ（５｀ヌクレアーゼ活性を有する）、２００単位／ｍＬのＵＮＧ、４４μＭのＥＤＴＡ、及び３．３ｍＭの酢酸マンガン。逆転写、増幅及び分析は、Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ（登録商標）４８０機器（Ｒｏｃｈｅ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｓｙｓｔｅｍｓ， Ｐｌｅａｓａｎｔｏｎ， ＣＡ）を使用して実施した。以下の温度プロフィールを使用した：５０℃で２分、９４℃で５秒、５５℃で２分、６０℃で６分、６５℃で４分、９５℃（１０秒）から５５℃（１５秒）を２サイクルと続いて９１℃（５秒）から６５℃（１５秒）のサイクルを４５回。これらの実験結果を図２及び図３に示す。容易にわかるように、ＣＯＰＳオリゴヌクレオチドを有しないサンプルと比較して以前のＣｔによって示されるように、相補的オリゴヌクレオチドプールの存在下で、ＲＮＡ転写物及び武装化ＲＮＡはどちらもより安定である。

実施例４：ＣＯＰＳによる部分ハイブリダイゼーションを用いたＲＮＡ安定性試験
１つの反応では、配列番号１、３、５、７及び１０に対応するＣＯＰＳのみを添加し（セットＡ）、そして別の反応では、配列番号２、４、６、８及び９に対応するＣＯＰＳのみを添加する（セットＢ）以外は、実施例２においてと同様にして、ＲＮＡ転写物及び武装化ＲＮＡサンプルを調製する。計算により、セットＡがＲＮＡ転写物／武装化ＲＮＡ配列の５２％をカバーし、一方、セットＢはＲＮＡ転写物／ 武装化ＲＮＡ配列の４８％をカバーすることが示される。４５℃で１８日インキュベーションした後、ＣＯＰＳの不在下又はセットＡ ＣＯＰＳもしくはセットＢ ＣＯＰＳの存在下でのＲＮＡ安定性は、実施例３で記載するようなＲＴ−ＰＣＲにより各反応のＣｔ値を決定することによって比較することができる。

実施例５：長期間インキュベーション後のＲＮＡ安定性
武装化ＲＮＡを１５００コピー／マイクロリットルで調製した以外は、実施例２においてと同様にＲＮＡ転写物及び武装化ＲＮＡサンプルを調製した。ＣＯＰＳを次いでサンプルに０、０．１、１又は１０ｎＭの最終濃度で添加し、サンプルを４℃、３７℃又は４５℃で１２週間インキュベーションした。ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ安定性の判定を実施例３に記載したようにして実施した。３７℃及び４５℃でのインキュベーションで非武装化及び武装化ＲＮＡの両方についてＣＯＰＳの存在で安定性は有意に改善された。図４は、非武装化ＲＮＡテンプレートのＲＴ−ＰＣＲ成長曲線の結果を示す。ＣＯＰＳの不在下（一番上のグラフ）で、４５℃でインキュベートしたサンプルは、４℃でインキュベートしたサンプルと比較して、Ｃｔ値の１０周期遅延を示した。対照的に、１０ｎＭのＣＯＰＳの存在下（一番下のグラフ）で、４５℃サンプルは１．４周期遅延しか示さず、このことは、ＲＮＡ安定性において８．６周期、すなわち約４００倍の改善を実証する。武装化ＲＮＡ実験について、７．４周期、すなわち約２００倍の改善が観察された（データは不掲載）。

実施例６：Ａｃｃｕｐｌｅｘ−カプセル化ＲＮＡの安定化
Ａｃｃｕｐｌｅｘ（ＳｅｒａＣａｒｅ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ， Ｍｉｌｆｏｒｄ ＭＡ）は、タンパク質コート及び脂質二重層の両方を含む複製欠損哺乳動物ウイルス様粒子の内部に関心対象のＲＮＡ分子を封入することができる組換え技術である。Ａｃｃｕｐｌｅｘ粒子内部のＲＮＡの安定化についてＣＯＰＳの有用性を試験するために、実施例１で記載する相補的オリゴヌクレオチドを設計し調製するために使用したＲＮＡ対照配列ｐＥＦ０７０をＡｃｃｕｐｌｅｘカプセル化一本鎖ＲＮＡのカスタム調製のためのＳｅｒａＣａｒｅに提供した。ＣＯＰＳを次いでＡｃｃｕｐｌｅｘ−ＲＮＡサンプルに１０ｎＭ濃度で添加し、そしてサンプルを４℃、３７℃又は４５℃で７１日間インキュベートした。ＲＴ−ＰＣＲによるＲＮＡ安定性の判定を実施例３に記載するようにして実施し、試験結果を図６に示す。７１日のインキュベーション後、ＣＯＰＳの不在と存在との間のＣｐ値Δは３７℃について４．３（３０．９〜２６．６）そして４５℃について８．３（３５．３〜２７．０）であり、高温で保存されるＡｃｃｕｐｌｅｘ粒子におけるＲＮＡの分解の低減に際してのＣＯＰＳの有効性を明らかに示す。

実施例７：ＨＩＶ ＲＮＡテンプレートのＣＯＰＳ安定化
ＨＩＶ−１ＧＡＧ、ＨＩＶ−１ＬＴＲ、及びＨＩＶ−２ＬＴＲ領域のセグメントに対応する３つのＲＮＡ配列を、それらの対応するＣＯＰＳの安定化効果を試験するためのＲＮＡテンプレートとして使用した。関心対象の核配列をカバーするために、ＨＩＶ−ＧＡＧについて９、ＨＩＶ−１ＬＴＲについて８、そしてＨＩＶ−２ＬＴＲについて８の合計２５のオリゴヌクレオチドを設計した。２５のオリゴヌクレオチドは、１７〜２６塩基で長さが様々であり、それらの配列を表２に示す。

２つの安定性試験を実施した。最初の試験では、武装化ＲＮＡテンプレートは、１００ｍＭのＫＣｌを含むＴｒｉｓ．ＨＣｌ（ｐＨ７．０）中、１００コピー／マイクロリットルで使用した。配列番号１１〜３５に相当するＣＯＰＳを次いで０又は１０ｎＭの最終濃度でサンプルに添加し、サンプルを４℃、３７℃又は４５℃で１５週間インキュベートした。３つのＲＮＡテンプレートに相当するプライマーを用いるＲＴ−ＰＣＲを、実施例３で記載した条件を用いて実施した。研究結果を表３に示し、これはＣＯＰＳの存在が両ＲＮＡテンプレートを非常に安定化させたことを実証する。

第二の試験では、非武装化ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２ テンプレートを、０又は１０ｎＭ濃度の対応するＣＯＰＳの存在下で３００コピー／マイクロリットルで使用した。サンプルを４℃、３７℃又は４５℃で７１日間インキュベートした。実施例３に記載した条件を使用して、３つのＲＮＡテンプレートに対応するプライマーを用いたＲＴ−ＰＣＲを実施した。この試験の結果を表４に示す。図５はＨＩＶ−２ＬＴＲテンプレートについて作成したＲＴ−ＰＣＲ成長曲線を示す。これらの実験は、ＣＯＰＳが武装化及び非武装化ＲＮＡテンプレートの両方の安定性を大幅に増大させることができることを示す。

Claims (12)

1. 増幅反応で増幅される一本鎖ＲＮＡテンプレートのセグメントの分解を防止又は低減する方法であって、
   ａ）前記一本鎖ＲＮＡテンプレートを提供するステップと、
   ｂ）前記一本鎖ＲＮＡテンプレートの前記セグメントを、増幅される前記一本鎖ＲＮＡテンプレートの前記セグメントと完全に又は部分的に相補的である配列を有する１以上のオリゴヌクレオチドとハイブリダイズさせるステップと、
   ｃ）反応条件下で前記一本鎖ＲＮＡテンプレートの前記セグメントを逆転写し増幅するステップであって、前記反応条件によって、前記１以上のオリゴヌクレオチドは逆転写及び増幅を妨害せず、そして前記反応条件によって、前記１以上のオリゴヌクレオチドからの各々のオリゴヌクレオチドは、１１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さであり、そして増幅中に使用される伸長温度よりも少なくとも５℃低い融解温度を有することによって特徴付けられ、そしてここで前記１以上のオリゴヌクレオチドからの各々のオリゴヌクレオチドの配列は前記１以上のオリゴヌクレオチドからの他のオリゴヌクレオチドの配列とは重複せず、そして前記1以上のオリゴヌクレオチドが逆転写及び増幅中に使用されるプライマー及びプローブの濃度よりも少なくとも５０倍低い濃度で存在することによって特徴づけられる、ステップと
   を含む、前記方法。
2. 前記１以上のオリゴヌクレオチドが、増幅される前記一本鎖ＲＮＡテンプレートの前記セグメントの４８％超とハイブリダイズするか、又は
   前記１以上のオリゴヌクレオチドが、増幅される前記一本鎖ＲＮＡテンプレートの前記セグメント全体とハイブリダイズする、請求項１に記載の方法。
3. 前記一本鎖ＲＮＡテンプレートがケージ化されている、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記一本鎖ＲＮＡテンプレートが、カプセル化、キャプシド形成、トラッピング、及び細胞の内部に存在すること、からなる群から選択される手段によってケージ化されている、請求項３に記載の方法。
5. ステップｂ）とステップｃ）との間に、前記一本鎖ＲＮＡテンプレートを単離又は精製するステップをさらに含む、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 増幅反応の間に核酸サンプル中の試験されるＲＮＡ配列の存在を検出する方法であって、
   ａ）前記核酸サンプルを提供するステップと、
   ｂ）試験されるＲＮＡ配列の検出及び／又は定量化において標準としての役割を果たす核酸標準を提供するステップであって、前記核酸標準が、一本鎖ＲＮＡ対照配列と、その配列が前記一本鎖ＲＮＡ対照配列のセグメントに対して完全又は部分的に相補的である１以上のオリゴヌクレオチドとを含む、ステップと、
   ｃ）前記核酸サンプルと前記核酸標準とを混合するステップと、
   ｄ）前記試験されるＲＮＡ配列と前記一本鎖ＲＮＡ対照配列の前記セグメントの両方の逆転写及び増幅を実施するための条件を提供するステップであって、前記条件下で、前記１以上のオリゴヌクレオチドは逆転写及び増幅を妨害せず、それによって、前記１以上のオリゴヌクレオチドからの各々のオリゴヌクレオチドが、１１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さであり、そして増幅の間で使用される伸長温度よりも少なくとも５℃低い融解温度を有することによって特徴付けられ、そしてここで前記１以上のオリゴヌクレオチドからの各々のオリゴヌクレオチドの配列は前記１以上のオリゴヌクレオチドからの他のオリゴヌクレオチドの配列とは重複せず、そして前記１以上のオリゴヌクレオチドが逆転写及び増幅の間で用いられるプライマー及びプローブの濃度よりも少なくとも５０倍低い濃度で存在することによって特徴づけられるステップと、
   ｅ）前記試験されるＲＮＡ配列からの増幅産物と、前記一本鎖ＲＮＡ対照配列の前記セグメントからの増幅産物を検出するステップと
   を含む、前記方法。
7. 前記１以上のオリゴヌクレオチドが前記一本鎖ＲＮＡ対照配列の前記セグメントの４８％超とハイブリダイズするか、又は
   前記１以上のオリゴヌクレオチドが前記一本鎖ＲＮＡ対照配列の前記セグメント全体とハイブリダイズする、請求項６に記載の方法。
8. 前記一本鎖ＲＮＡ対照配列がケージ化されている、請求項６〜７のいずれか１項に記載の方法。
9. ステップｃ）とステップｄ）との間で、前記一本鎖ＲＮＡ対照配列を単離又は精製するステップをさらに含む、請求項６〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記１以上のオリゴヌクレオチドが、その配列が配列番号１〜１０、１１〜１９、２０〜２７、及び２８〜３５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの群を含む、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 増幅反応で増幅される試験されるＲＮＡ配列の検出及び／又は定量化において標準としての役割を果たす核酸標準であって、
    一本鎖ＲＮＡ対照配列と、
    その配列が、前記一本鎖ＲＮＡ対照配列に対して完全又は部分的に相補的であり、前記一本鎖ＲＮＡ対照配列全体にハイブリダイズする１以上のオリゴヌクレオチドと
    を含み、
    前記１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、前記増幅反応の間に用いられる伸長温度よりも少なくとも５℃低い融解温度を有することによって特徴付けられ、かつ前記１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドは、増幅反応の間で使用されるプライマー及びプローブの濃度よりも少なくとも５０倍低い濃度で存在することによって特徴付けられ、ここで前記１以上のオリゴヌクレオチドからの各オリゴヌクレオチドが１１ヌクレオチド〜５０ヌクレオチドの長さである、核酸標準。
12. 前記１以上のオリゴヌクレオチドが、その配列が配列番号１〜１０、１１〜１９、２０〜２７、及び２８〜３５からなる群から選択されるオリゴヌクレオチドの群を含む、請求項１１に記載の核酸標準。

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