JP6889363B2

JP6889363B2 - 細胞の集合構造体の作製方法および作製装置

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Publication number: JP6889363B2
Application number: JP2016236183A
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Inventors: 健二米田; 一朗越田
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Filing date: 2016-12-05
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Description

本発明は細胞の集合構造体の作製方法および作製装置に関し、詳しくは培養液を収容した培養容器の内部に複数の細胞凝集塊を配置し、上記複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製方法および作製装置に関する。

損傷を受けた生体機能を幹細胞などを用いて復元させる再生医療においては、細胞を高密度に培養した細胞シートが使用されている。この細胞シートは極めて薄いため、何枚かの細胞シートを重ね合わせる積層化培養細胞シートの製造方法が知られている（特許文献１）。
またこのような細胞シートを重ね合わせる積層化培養細胞シートの製造方法において、積層する細胞シートと細胞シートとの間にハイドロゲル粒子を配置して、積層された部分の細胞に酸素や栄養等を行き渡らせ、より確実に細胞シートを製造する方法も知られている（特許文献２）。
一方、予め細胞を略球状に培養した細胞凝集塊（スフェロイド）を相互に接触した状態に並べて浮遊培養を行い、細胞凝集塊同士が融合した５０〜３００μｍの厚みを有するシート状細胞凝集塊の作製方法も知られている（特許文献３）。

特許第４９２１３５３号公報特許第５８６２９１５号公報特許第５５２３８３０号公報

しかしながら、特許文献１、２のように細胞シートを積層化する場合、細胞シートは極めて薄いことから、取り扱いが難しく自動化することが困難であり、また特許文献３のように細胞凝集塊を浮遊培養してシート状細胞凝集塊を得ようとした場合、整列させた細胞凝集塊に粗密が生じて細胞凝集塊同士が不規則に融合するため、得られるシート状細胞凝集塊の形状が定まらず、厚さも不均一になるという問題があった。
このような問題に鑑み、本発明は所要の形状および寸法を得ることが可能で、かつ機能性を付加することが可能であり、また自動化に対応した細胞の集合構造体の作製方法および作製装置を提供するものである。

すなわち請求項１の発明にかかる細胞の集合構造体の作製方法は、培養液を収容した培養容器の内部に複数の細胞凝集塊を配置し、上記複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製方法において、
上記培養容器の内部に立設された複数のピンとピンとの間に形成される保持部に細胞凝集塊を挟持または収容させる供給工程と、上記保持部に保持された細胞凝集塊を培養して上記集合構造体を形成する培養工程と、当該培養工程で形成された集合構造体を上記保持部から取り出す離脱工程と、当該離脱工程で取り出された集合構造体に開口する上記ピンによる貫通孔に注入物を注入する注入工程とを有することを特徴としている。

また請求項３の発明にかかる細胞の集合構造体の作製装置は、培養液を収容した培養容器の内部に複数の細胞凝集塊を配置し、上記複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製装置において、
上記培養容器の内部に設けられ複数のピンを立設させた培養保持具と、上記培養保持具のピンとピンとの間に形成される複数の保持部に細胞凝集塊を挟持または収容させる供給手段と、上記培養保持具に保持された細胞凝集塊が培養されて形成された集合構造体を上記培養保持具の上記保持部から取り出す離脱手段と、当該取り出された集合構造体に開口する上記ピンによる貫通孔に注入物を注入する注入手段とを備えることを特徴としている。

上記請求項１および請求項３の発明によれば、上記培養保持具に設けた複数のピンとピンとの間を保持部として、複数の隣接する保持部で細胞凝集塊を保持するため、各細胞凝集塊は当該保持部で培養されることにより相互に融合し、所要の形状および寸法の細胞の集合構造体を作製することができ、これを自動化することができる。
さらに、このようにして培養された細胞の集合構造体には、上記保持部を構成するピンによって貫通孔が形成されるため、当該貫通孔に注入物を注入することで、機能性を付加した細胞の集合構造体を作製することができる。

細胞の集合構造体の製造装置が設けられるアイソレータとインキュベータの正面図細胞の集合構造体の製造装置の構成図収容容器および吸引ノズルについての断面図培養容器の断面図培養容器内に配置された細胞凝集塊についての平面図注入ノズルについての断面図であって、細胞の集合構造体の貫通孔に注入物を注入する注入工程を説明する図第２実施例における第１、第２ピン群を構成するピンの配置を説明する図第２実施例における培養状態を示す図第３実施例における培養状態を示す図第３実施例において培養容器内に配置された細胞凝集塊についての平面図第４実施例における培養状態を示す図ピンの太さと細胞凝集塊の大きさについて説明する図

以下、図示実施例について説明すると、図１〜図６は第１実施例にかかる細胞の集合構造体の作製装置１を説明するものであって、複数の細胞凝集塊２（スフェロイド：図３参照）を培養容器３の内部で配置し、上記細胞凝集塊２が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体としての癒合パッド４（図４参照）を作製するものとなっている。
上記細胞凝集塊２は、例えば特許第４５１７１２５号に開示される方法で作製することができる。すなわち、内面が非接着性の容器に細胞を播種して培養すると、細胞は足場を求めて互いに接着し合うことで凝集して細胞凝集塊２が形成され、これらがさらに融合することで外径寸法が５００μｍ程度の略球状の細胞凝集塊２が形成される。
より効率的には、ウエルプレートの非接着性のウエル（略半球状の収容部）で培養することにより容易に細胞凝集塊２を得ることができる。なお、細胞凝集塊２の作製方法はこれに限らず、旋回している培養液中に細胞懸濁液を入れる旋回培養法、試験管に細胞懸濁液を入れて遠心分離器で沈殿させる方法、あるいはアルギン酸ビーズを用いて培養する方法など公知の様々な方法で作製することができる。
このように、細胞凝集塊２とは、細胞同士が集合し凝集化した１００〜７００μｍ程度の外径寸法を有した略球状の細胞集合体を指し、これらの細胞凝集塊２を平面的または立体的に接触または接近させて配置すると、各細胞凝集塊２の細胞が増殖して隣接する細胞凝集塊２と融合し、平面的または立体的な細胞の集合構造体が得られるようになっている。
本実施例で作製する癒合パッド４は、例えば骨、筋肉、内蔵、血管、皮膚などの組織や、臓器、器官を構成する体細胞やその前駆細胞、幹細胞などから作成され、骨や軟骨の欠損部を埋めたり、臓器や器官の表面に貼り付けて使用するものとなっている。
また上記癒合パッド４は、複数の細胞凝集塊２を平面的に配置して融合させたものとなっており、厚さは用いる細胞凝集塊２の寸法に応じて１００〜７００μｍ程度のものを作製することが可能で、平面的なサイズは整列させる細胞凝集塊２の個数によって調節可能となっている。
このように作製される上記癒合パッド４は、細胞懸濁液を平面的に培養することで細胞単体をシート状に培養して得られる細胞シートとは異なるものである。

本実施例の細胞の集合構造体の作製装置１は、図１に示す内部が無菌状態に維持されたアイソレータ５と、当該アイソレータ５に接続可能に設けられたインキュベータ６との内部に設けられている。また、アイソレータ５には、搬入物を除染するためのパスボックス５ａが設けられている。
図２は上記アイソレータ５の内部に設けられた構成を示し、細胞凝集塊２を収容する収容容器７を支持する収容容器支持部８と、癒合パッド４の培養される培養容器３を支持する培養容器支持部９と、上記細胞凝集塊２を保持する複数の吸引ノズル１０と、上記吸引ノズル１０を上記収容容器７および培養容器３に対して相対的に移動させる吸引ノズル移動手段１１と、培養された癒合パッド４に注入物を注入する注入手段としての注入ノズル１２と、上記注入ノズル１２を上記培養容器３に対して相対的に移動させる注入ノズル移動手段１３とを備えている。
なお、以下の説明において、図２における図示左右方向をＸ方向、前後方向をＹ方向、上下方向をＺ方向とし、図５では図示左右方向をＸ方向、上下方向をＹ方向とする。

上記アイソレータ５は内部が無菌環境に維持され、また無菌エア供給手段によって上方から下方へと向かう無菌エアによる一方向流が形成されるようになっている。
またアイソレータ５の正面には作業者が装着可能なグローブ５ｂが設けられており、各種の作業を行うことが可能となっている。なお、アイソレータ５の内部にロボットや所要の構成を有した移送手段を設けて、これらの作業を自動的に行うようにすることもできる。
次に、上記インキュベータ６は、内部が無菌環境に維持されるとともに、癒合パッド４の培養に適した所定の温度および湿度に維持され、細胞凝集塊２が融合して癒合パッド４へと形成される間、上記インキュベータ６を上記アイソレータ５より分離して、当該アイソレータ５より離れた場所に載置することが可能となっている。
そのため、上記アイソレータ５とインキュベータ６とは接続手段５ｃによって接続されており、例えば特許第４６５６４８５号公報に記載されるような、インキュベータ６とアイソレータ５とを無菌状態を維持したまま接離させる接続手段を使用することができる。

図３は上記収容容器７の断面図を示し、上述したウエルプレートを使用することができる。収容容器７は平面視において縦横に複数の収容凹部７ａを備え、各収容凹部７ａの内部には培養液とともに略球状の細胞凝集塊２が一個ずつ収容されている。
上記収容容器７の収容凹部７ａは、平面視におけるＸ方向およびＹ方向にそれぞれ所定個数ずつ整列しており、本実施例では培養容器３において作製する癒合パッド４を構成する細胞凝集塊２のＸ方向およびＹ方向の個数と同数、すなわちＸ方向に５個、Ｙ方向に５個それぞれ設けられている。

上記収容容器７を支持する収容容器支持部８は、位置決め片８ｂによってその上面で上記収容容器７を位置決めするとともに、上記吸引ノズル移動手段１１を構成するＹ方向テーブル８ａによって構成されている。
後述するように、本実施例の吸引ノズル１０はＸ方向に５個設けられ、またＸ方向およびＺ方向にのみ移動可能となっていることから、上記Ｙ方向テーブル８ａが収容容器７をＹ方向に移動させることで、吸引ノズル１０と収容容器７とをＸＹＺの各方向で相対的に移動させることができる。
具体的に説明すると、最初に上記Ｙ方向テーブル８ａが収容容器７の１列目の収容凹部７ａを吸引ノズル１０の下方に位置させて、当該一列目の収容凹部７ａから吸引ノズル１０が細胞凝集塊２を吸着保持すると、Ｙ方向テーブル８ａが１列分だけＹ方向に収容容器７を移動させて、２列目の収容凹部７ａを吸引ノズル１０の下方に位置させるようになっている。

図４に示すように、培養容器３は有底箱状を有しており、内部には所定の深さで培養液が収容されるとともに、底面に設置された底面プレート１４と、当該底面プレート１４に設置された台座１５および当該台座１５に立設された複数のピン１６から構成される培養保持具と、上記ピン１６に沿って上下に移動する支持部材としての支持プレート１７とが設けられている。
上記底面プレート１４は培養容器３の底面と略同形を有しており、底面プレート１４が培養容器３の内部で移動しないように位置決めされている。また上記台座１５は直方体形状を有しており、底面プレート１４の上面に形成された凹部１４ａに嵌合して位置決めされるようになっている。

上記ピン１６は上記台座１５の上面に形成された設置面１５ａにそれぞれＺ方向を向くように規則的に立設されている。
図５は上記台座１５に設けられたピン１６と、当該ピン１６によって保持される細胞凝集塊２についての平面図を示し、本実施例ではＸ方向およびＹ方向にそれぞれ５個の細胞凝集塊２を相互に接触した状態で平面的に整列させるようになっている。
上記ピン１６は、各細胞凝集塊２の周囲に位置するように設けられており、本実施例では４本のピン１６によって細胞凝集塊２を保持する保持部Ｈを構成している。より具体的には、平面視において４本のピン１６が四隅に位置する略正方形の区画を上記保持部Ｈとしている。
本実施例では、上記保持部Ｈを構成する４本のピン１６のうち、各対角位置の２本のピン１６の間隔は、保持する細胞凝集塊２の直径よりも短くなるように配置されている。換言すると、細胞凝集塊２を作製する際に、各対角位置の２本のピン１６の間隔よりも直径が大きくなるようにしている。
このように構成された保持部Ｈに細胞凝集塊２を保持すると、複数のピン１６とピン１６との間で細胞凝集塊２を挟持することができ、図４（ａ）のように細胞凝集塊２を上記ピン１６の先端と根元との間の上下中間部分に位置させることが可能となる。
換言すると、上記保持部Ｈを上記複数のピン１６を立設した設置面１５ａから離隔した位置に設定することができ、当該保持部Ｈに保持された細胞凝集塊２と設置面１５ａとの間に、培養液が流通可能な隙間ｇを形成することができる。
またピン１６の直径にもよるが、各対角位置の２本のピン１６の間隔を細胞凝集塊２の直径よりも短くすることで、各保持部Ｈの細胞凝集塊２同士を相互に接触させた状態で培養することができるようになっている。

上記底面プレート１４には、上記台座１５を挟んで対向した位置に設けられるとともに、Ｚ方向に向けて立設されて上記支持プレート１７を上下に貫通する２本の棒状のガイド部材１８が設けられ、上記支持プレート１７には上記ピン１６が貫通する貫通孔１７ａが穿設されている。
上記構成により、上記支持プレート１７は上記ピン１６およびガイド部材１８に沿ってＺ方向に昇降可能に設けられるとともに、通常は自重により上記台座１５の設置面１５ａに載置されるピン１６の基端側となる下降位置に位置している。
図４（ａ）に示す支持プレート１７が下降位置に位置した際、上記ピン１６の上下中間部分に保持された細胞凝集塊２と上記台座１５の設置面１５ａとの間には、培養液が流通可能な隙間ｇが形成されるようになっている。
一方、図４（ｂ）に示すように、支持プレート１７を上昇させると、支持プレート１７は上記ピン１６とピン１６との間に保持された細胞凝集塊２を下方から支持することができ、上記支持プレート１７がピン１６の先端側となる上昇位置まで位置することで、細胞凝集塊２が培養された癒合パッド４を上記ピン１６の間の保持部Ｈから取り出すことができるようになっている。
上記支持プレート１７の上昇は、グローブ５ｂを装着した作業者によって行える他、ロボット等によって行うことも可能である。その際、図示しないが上記支持プレート１７の上面に上記培養液の液面より上方に突出する把持部材を設けることで、培養液に触れずに支持プレート１７を上昇させることが可能となる。

図２に示すように、培養容器支持部９は上記吸引ノズル移動手段１１を構成するＹ方向テーブル９ａによって構成され、上記収容容器支持部８を構成するＹ方向テーブル８ａと同様、吸引ノズル１０に吸着保持された細胞凝集塊２が上記ピン１６によって構成された保持部Ｈに供給されるたびに、培養容器３ごとピン１６間に設定された保持部Ｈを上記Ｙ方向に一列ずつ移動させるものとなっている。

次に、上記吸引ノズル１０について説明すると、図３に示すように図示しない負圧発生手段に接続された本体部１０ａと、当該本体部１０ａの下端部に設けられた管状の吸着部１０ｂとを備えている。
上記吸着部１０ｂの内径は上記細胞凝集塊２より小径となっており、上記収容容器７の収容凹部７ａにおいて吸着部１０ｂの先端に細胞凝集塊２を吸着保持した際に、細胞凝集塊２が当該吸着部１０ｂの内部に吸い込まれないようになっている。
また培養容器３においては、上記吸着部１０ｂの中心位置をピン１６とピン１６との間に形成した保持部Ｈの略中央に位置させ、かつ細胞凝集塊２を上記ピン１６の上下中間位置に位置した状態で上記負圧発生手段による負圧を解消する。
なお細胞凝集塊２を吸着保持する吸引ノズル１０に代えて、グリッパなどによって細胞凝集塊２を保持する等の構成を有したものを用いて細胞凝集塊２を保持するようにしてもよい。

また上記吸引ノズル１０を移動させる吸引ノズル移動手段１１は、上記収容容器支持部８および培養容器支持部９にかけてＸ方向に設けられたＸ方向レール２１と、当該Ｘ方向レール２１に沿って吸引ノズル１０をＸ方向に移動させるＸ方向移動手段２２と、当該Ｘ方向移動手段２２に設けられてＺ方向に吸引ノズル１０を昇降させるＺ方向移動手段２３と、上記収容容器支持部８および培養容器支持部９における上記Ｙ方向テーブル８ａ、９ａとによって構成されている。なお、吸引ノズル移動手段１１としては、Ｙ方向テーブル８ａ、９ａに代えて、上記Ｘ方向レール２１をＹ方向に移動させる構成を有したものであってもよい。このような構成とすることで、上記吸引ノズル１０や注入ノズル１２、後述するカメラ２５をＸ−Ｙ方向に移動させることができる。

また本実施例の吸引ノズル１０はＸ方向に５個整列して設けられ、これら吸引ノズル１０は間隔変更手段２４によってＸ方向にその間隔が変更されるようになっている。
具体的には、上記吸引ノズル１０が収容容器支持部８の上方に位置した際には、間隔変更手段２４は上記収容容器７におけるＸ方向に整列した収容凹部７ａと同じ間隔に上記吸引ノズル１０の間隔を変更する。
一方、吸引ノズル１０が培養容器支持部９の上方に位置した際には、間隔変更手段２４は上記培養容器３の内部のピン１６とピン１６との間に形成された保持部Ｈにおける、Ｘ方向の間隔と同じ間隔に吸引ノズル１０の間隔を変更する。
なお、吸引ノズル１０についてはＹ方向に複数列設けることも可能であり、また収容容器支持部８の収容凹部７ａの間隔と、上記ピン１６とピン１６との間に形成された保持部Ｈの間隔とが同じ場合には、上記間隔変更手段２４を省略することができる。
また例えば上記保持部Ｈの間隔が狭い場合には、上記吸引ノズル１０によって一つおきの保持部Ｈに細胞凝集塊２を保持させることも可能であり、その場合、最初に奇数番目の保持部Ｈに細胞凝集塊２を保持させ、その後偶数番目の保持部Ｈに細胞凝集塊２を保持させるようにすればよい。
なお、吸引ノズル１０は少なくとも１本備えられていれば良く、また、細胞凝集塊２の供給手段としては、本実施例のように細胞凝集塊２を移載する構成の他、多数の細胞凝集塊２を収容した容器から１個ずつ繰り出すような構成であっても良い。

図６に示すように、上記注入ノズル１２は、図示しない注入物供給手段に接続された本体部１２ａと、当該本体部１２ａの下端部に設けられた管状の注入部１２ｂとを備え、後述するように培養された癒合パッド４に開口する貫通孔４ａに注入物を注入するものとなっている。
上記注入物供給手段からは、注入物として細胞の培養を促進させる栄養成分や、癒合パッド４を患者に移植した後の生着や成長、周辺組織の再生を促す成長因子や増殖因子、血管の新生を促す細胞懸濁液、移植後の生体に作用する薬物等が、液体、ジェル、ゲル、粒子、顆粒等の状態で供給され、これらは上記注入部１２ｂの先端から排出されて上記癒合パッド４の貫通孔４ａに注入されるようになっている。なお、注入は貫通孔４ａの上方で行ってもよいし、注入ノズル１２を貫通孔４ａに挿入して行うこともできる。
このように貫通孔４ａに注入することで、注入物を癒合パッド４の内部に埋め込むことができ、注入物を単に癒合パッド４の表面に滴下する場合に比べて多量の注入物を当該癒合パッド４の内部に浸透させることができる。
そして上記注入物が注入された癒合パッド４については、引き続き培養して上記貫通孔４ａを塞いでもよいし、そのまま回収して移植に用いることもできる。

図２に示すように、注入ノズル１２はＸ方向に４個整列して設けられており、具体的には上記培養容器３の内部でＸ方向に整列したピン１６の間隔と同じ間隔、すなわち癒合パッド４の貫通孔４ａと同じ間隔となるように設けられている。
上記注入ノズル１２を移動させる注入ノズル移動手段１３は、上記吸引ノズル移動手段１１と共通して用いられるＸ方向レール２１と、当該Ｘ方向レール２１に沿って移動する左右移動手段２５と、当該左右移動手段２５に設けられて注入ノズル１２をＺ方向に昇降させる上下移動手段２６と、上記培養容器支持部９における上記Ｙ方向テーブル９ａとによって構成されている。
なお、注入ノズル１２は少なくとも１本備えられていれば良く、また、注入ノズル移動手段１３は、Ｙ方向テーブル９ａを備えず当該注入ノズル１２をＸ方向およびＹ方向に移動させるよう構成することもできる。
また複数の注入ノズル１２を備えて、それらを個別に移動させるよう構成することにより、異なる注入物を注入できるようにすることも可能である。

上記Ｘ方向レール２１には、Ｘ方向に移動する横移動手段２７にカメラ２８が設けられており、当該カメラ２８を培養容器支持部９の上方まで移動させて培養容器３の内部を撮影するようになっている。
上記吸引ノズル１０によって細胞凝集塊２を保持部Ｈに保持させる際には、上記カメラ２８が撮影した画像により、上記全ての保持部Ｈに細胞凝集塊２が保持されているか否かを確認し、必要に応じて細胞凝集塊２の保持されていない保持部Ｈに対して細胞凝集塊２を供給するように指示することができる。
さらに、上記注入ノズル１２によって注入物を癒合パッド４に注入する際には、上記カメラ２８が撮影した画像により、癒合パッド４の貫通孔４ａの位置が認識されるようになっている。
またカメラ２８は、上記吸引ノズル移動手段１１が吸引ノズル１０を培養容器支持部９の上方に位置させる際、ならびに注入ノズル移動手段１３が注入ノズル１２を培養容器支持部９の上方に位置させる際には、これらとの接触を避けるために培養容器支持部９の上方から退避するようになっている。

以下において、上記構成を有する細胞の集合構造体の作製装置１を用いた癒合パッド４の作製方法を説明する。
最初に、上記パスボックス５ａを介して上記細胞凝集塊２が収容された収容容器７や培養容器３を上記アイソレータ５内に搬入したり、培養容器３に所定量の培養液を供給する準備工程を行う。
また培養容器３には上記台座１５および複数のピン１６からなる培養保持具が設置され、また上記支持プレート１７は自重により上記台座１５の設置面１５ａに接触した下降位置に位置している。
さらに準備工程において、アイソレータ５の内部に上記収容容器７や培養容器３を複数搬入すれば、複数の培養容器３を用いて複数の癒合パッド４を連続して作製することが可能となる。

上記準備工程が完了したら、続いて上記吸引ノズル１０により上記収容容器７から上記培養容器３へと細胞凝集塊２を移動させて、培養容器３の上記ピン１６によって設定された保持部Ｈに細胞凝集塊２を供給する供給工程を行う。
上記吸引ノズル移動手段１１が吸引ノズル１０を移動させ、また間隔変更手段２４が吸引ノズル１０の間隔を変更して、上記収容容器支持部８において収容容器７の収容凹部７ａから細胞凝集塊２を吸着保持する。
続いて、吸引ノズル移動手段１１が吸引ノズル１０を培養容器支持部９へと移動させ、また間隔変更手段２４が上記ピン１６とピン１６との間に形成された保持部Ｈの間隔に合わせて吸引ノズル１０の間隔を変更し、吸引ノズル１０を下降させる。
すると、吸引ノズル１０に保持された各細胞凝集塊２は４本のピン１６の間に形成された保持部Ｈに挿入され、細胞凝集塊２の下方に隙間ｇが形成されるよう、上記ピン１６の上下中間位置に細胞凝集塊２が保持される。
このようにして全ての保持部Ｈに細胞凝集塊２が保持されると、その後上記カメラ２８が培養容器支持部９の上方に移動して培養容器３内の細胞凝集塊２を撮影し、細胞凝集塊２が所要の保持部Ｈに配置されているか否かを確認する。

このようにして培養容器３内に細胞凝集塊２が配置されると、ロボットもしくは作業者の手作業により、上記培養容器３はインキュベータ６に移送され、当該培養容器３内の細胞凝集塊２を培養する培養工程が行われる。
まず上記培養容器３をインキュベータ６に移送したら、インキュベータ６を上記アイソレータ５より分離して、アイソレータ５より離隔した位置に載置し、内部を所定の温度、湿度に維持するとともに、所定の炭酸ガスや酸素の濃度を維持する。
培養容器３内において、細胞凝集塊２が培養されると隣接する保持部Ｈの細胞凝集塊２が相互に融合し、これにより細胞凝集塊２が平面的に配置された形状を維持した細胞の集合構造体としての癒合パッド４を得ることができる。
つまり、各細胞凝集塊２は上記ピン１６によって移動が規制されているため、形成される癒合パッド４の寸法を、はじめに細胞凝集塊２を配置した際の大きさと略同一にすることができ、細胞凝集塊２を配置した通りに任意の形状の癒合パッド４を作製することが可能となる。
これは、細胞凝集塊２が接触している上記ピン１６の周囲に密着するように増殖または移動し、隣接する細胞凝集塊２同士の間に形成される間隙を埋めるためであり、ピン１６を介さず細胞凝集塊２を平面的に配置して培養する場合のように、全体的な寸法はほとんど縮むことがない。
またその際、上記細胞凝集塊２の下方には上記隙間ｇが形成されていることから、癒合パッド４と台座１５の設置面１５ａとの間に培養液が供給され、癒合パッド４の裏面側についても効率的に培養することができる。
つまり、細胞凝集塊２を上記設置面１５ａに載置させて癒合パッド４を作製する場合、中央に位置する細胞凝集塊２の下面側には十分に培養液が行き渡らないという問題があったが、細胞凝集塊２を下方に隙間ｇを形成した状態で保持することにより、当該部分に位置する細胞も良好に培養することが可能となった。
なお、培養中に上記支持プレート１７を上下動させるようにすると、培養液の流動が促進されより効果的である。

このようにして上記培養工程において培養液を交換しながら培養を進めると、細胞凝集塊２同士が融合し必要な大きさの癒合パッド４が得られるが、癒合パッド４は保持部Ｈに保持された状態となっており、換言すると癒合パッド４には上記ピン１６が貫通したままとなっている。
そこで、保持部Ｈに保持されている癒合パッド４を保持部Ｈから取り出す離脱工程を行う。具体的には、インキュベータ６をアイソレータ５に接続して培養容器３をアイソレータ５内部の上記培養容器支持部９に載置し、作業者もしくはロボット等によって上記下降位置に位置した支持プレート１７を上昇位置に位置させる。
これにより、癒合パッド４がピン１６に沿って上昇され、図４（ｂ）に示すように、上記支持プレート１７が上方まで持ち上げられ、この状態で上記支持プレート１７をクリップなどの固定具１７ｂで固定するか、または支持プレート１７を静かに下降位置へと移動させて、癒合パッド４を上記ピン１６の先端部によって下方から支持させることにより、癒合パッド４を上記ピン１６の上方に位置させる。

上記離脱工程により癒合パッド４をピン１６の上方に位置させたら、続いて上記注入ノズル１２によって癒合パッド４に開口している、上記ピン１６による貫通孔４ａに注入物を注入する注入工程を行う。
具体的には、最初に上記カメラ２８が培養容器支持部９の上方に移動して培養容器３内の癒合パッド４を撮影し、当該癒合パッド４の貫通孔４ａの位置を認識する。
続いて、上記注入ノズル移動手段１３が培養容器支持部９の上方へと注入ノズル１２を移動させ、さらに上記癒合パッド４の貫通孔４ａの上方へ位置させた後、図６に示すように当該注入ノズル１２の注入部１２ｂを癒合パッド４に接近させる。
この状態で注入ノズル１２の注入部１２ｂから注入物を放出すると、当該注入物は貫通孔４ａの内部に注入される。
このようにして、癒合パッド４の貫通孔４ａに注入物が注入されると、そのまま癒合パッド４を使用するために、培養容器３から取り出して搬出用の容器に移して、アイソレータ５から搬出するようにしてもよいし、培養容器３を再びアイソレータ５からインキュベータ６へと移載して引き続き培養を継続して、上記貫通孔４ａを完全に塞ぐようにしてもよい。

図７、８は第２実施例としての細胞の集合構造体の作製方法を説明する図であり、本実施例で使用する培養容器３において、上記台座１５に固定されるピン１６は、癒合パッド４の中央部を保持する第１ピン群（１６ａ）と、癒合パッド４の外周縁部を保持する黒色で示した第２ピン群（１６ｂ）とから構成されている。
具体的には、図７において、上記第２ピン群を構成するピン１６ｂは、最外周およびこれよりも一列内側に配置された額縁状に配置されている。このため、供給工程において培養容器３に細胞凝集塊２を収容すると、その最外周に配置された細胞凝集塊２は上記第２ピン群のピン１６ｂによって形成された保持部Ｈに保持されるようになっている。
また図８に示すように、上記第１ピン群を構成するピン１６ａは上記第２ピン群を構成するピン１６ｂよりも短くなっており、上記細胞凝集塊２を保持する保持部Ｈの高さは上記第１ピン群のピン１６ａの先端部近傍の高さに設定されている。

上記培養容器３を用いた細胞の集合構造体の作製方法を説明すると、図８（ａ）に示すように、供給工程では上記第１実施例と同様、上記第１、第２ピン群のピン１６ａ、１６ｂによって形成された保持部Ｈに細胞凝集塊２を保持させる。
その後培養工程を行い、細胞凝集塊２がある程度融合して培養途中の癒合パッド４が形成されると、当該培養された癒合パッド４を収容した培養容器３をインキュベータ６からアイソレータ５へと移載する。
そして図８（ｂ）に示すように、下降位置に位置した支持プレート１７を上下動させて、培養された癒合パッド４を第２ピン群のピン１６ｂの先端部近傍の高さまで移動させ、上記第１ピン群のピン１６ａの保持部Ｈから取り出す離脱工程を行う。
これにより、癒合パッド４は上記第２ピン群のピン１６ｂによって支持された状態となり、当該癒合パッド４には第１ピン群のピン１６ａによる貫通孔４ａが開口されている。

この状態において、上記注入ノズル１２により、癒合パッド４の第１ピン群のピン１６ａによる貫通孔４ａに注入物を注入する注入工程を行う。
その後、上記癒合パッド４を再びアイソレータ５からインキュベータ６へと移動させて培養工程を再開し、引き続き培養を行うことで、上記貫通孔４ａが培養された細胞によって埋められることとなる。
その際に、貫通孔４ａの大きさにもよるが、貫通孔４ａが塞がる過程において癒合パッド４が中央部に向けて収縮し、湾曲する場合がある。
これに対し、本実施例では、癒合パッド４の外周縁部を上記第２ピン群のピン１６ｂによって保持しており、癒合パッド４の中央部の収縮が防止され、湾曲のない厚さが均一な癒合パッド４を得ることができる。

上記培養工程が終了し、上記癒合パッド４の中央部に形成された貫通孔４ａが塞がると、上記培養容器３をインキュベータ６からアイソレータ５へと移動させて離脱工程を行う。
具体的には、上記支持プレート１７を再び下降位置から上昇位置まで上昇させて、癒合パッド４を上記第２ピン群の保持部Ｈより取り出す。
このようにして得られた癒合パッド４の外周縁部には、それまで貫通していた上記第２ピン群のピン１６ｂによる貫通孔４ａが形成されているため、必要に応じて癒合パッド４の外周縁部を切断して除去し、中央部のみを回収するようにしてもよいし、さらに注入工程を実行して第１ピン群のピン１６ａによる貫通孔４ａとは異なる注入物を注入するようにしてもよい。
また、第１ピン群のピン１６ａによる貫通孔４ａには注入物を注入をせずに塞いでしまい、第２ピン群のピン１６ｂによる貫通孔４ａに注入するようにすることも可能で、第１ピン群、第２ピン群を選択的に配置して、注入物の注入位置をデザインすることもできる。

図９は第３実施例としての細胞の集合構造体の作製方法を説明する図であり、細胞凝集塊２の直径が保持部Ｈの各対角位置のピン１６の間隔よりも小径であり、当該細胞凝集塊２をピン１６とピン１６との間で保持できない場合に対応するものとなっている。
具体的には、図１０に示すように、作製される癒合パッド４を薄くするために、極力小さな細胞凝集塊２を用いる場合や、作製された細胞凝集塊２の大きさにばらつきがあって、ピン１６とピン１６とでは保持できずに落下してしまう細胞凝集塊２を含んでいる場合が想定される。
そこで本実施例の供給工程では、図９（ａ）に示すように、ピン１６の間を保持部Ｈとして細胞凝集塊２を収容させ、上記台座１５の設置面１５ａ上の下降位置に位置させた支持プレート１７の上面に載置させて、個々の細胞凝集塊２を保持するようになっている。
そして、上記細胞凝集塊２が支持プレート１７に載置された状態のままで、当該培養容器３をインキュベータ６に移送して上記培養工程を開始し、図９（ｂ）に示すように細胞凝集塊２が融合するまで培養を行う。
細胞凝集塊２がある程度融合したら、上記支持プレート１７を上記ピン１６の基端側と先端側との間の中間位置まで上昇させて、上記複数のピン１６を立設した設置面１５ａから離隔した位置を保持部Ｈとして細胞凝集塊２を保持させるようになっている。
そして本実施例においても、所定の大きさの癒合パッド４が得られたら、培養工程から離脱工程および注入工程に移行する。

図１１は第４実施例にかかる細胞の集合構造体の作製方法を説明する図となっており、上記第１〜第３実施例において作製した細胞の集合構造体としての平面的な癒合パッド４に対し、本実施例ではＺ方向に細胞凝集塊２を整列させた立体的な細胞の集合構造体を作製する方法を説明するものである。
ただし、当該立体的な細胞の集合構造体を作製する場合であっても、上記第１実施例で使用した細胞の集合構造体の作製装置１と同様の構成を有した装置を使用することが可能であり、また略同様の工程を用いて作製することができるため、詳細な説明については省略する。
図１１に示す本実施例で使用する培養容器３において、上記ピン１６の長さは所望される立体的な細胞の集合構造体の高さに応じて設定され、４本のピン１６によって形成された保持部Ｈには細胞凝集塊２をＺ方向に複数保持することが可能となっている。
そして上記供給工程では、上記吸引ノズル１０は予め設定された細胞凝集塊２の立体的な配置に基づいて、上記細胞凝集塊２を上記ピン１６によって形成された保持部Ｈに供給する。
具体的には、最初に培養容器支持部９が培養容器３をＹ方向に順次移動させて、最下段に配置すべき細胞凝集塊２を供給し、その後保持部Ｈに保持させた細胞凝集塊２の上部に順次細胞凝集塊２を供給するようにすればよい。
この時も、上記各実施例と同様、最下段に位置する細胞凝集塊２の下方に隙間ｇを形成するようになっており、これにより立体的な細胞の集合構造体の下面への培養液の供給が行われるようにする。また、上記ピン１６に支持された立体的な細胞の集合構造体の側面部分と培養容器３の側面部分との間にも隙間が形成されることから、細胞の集合構造体の側面部分にも培養液の供給が行われるようになっており、培養工程において立体的な集合構造体を形成することができる。
そして本実施例においても、上記離脱工程および上記注入工程を行うことにより、保持部Ｈから取り出した集合構造体の貫通孔に上記注入ノズル１２より注入物を注入することができる。この場合、上記注入ノズル１２を集合構造体の貫通孔に挿入して、当該貫通孔４ａの上下方向の所要の位置に上記注入物を注入するようにしても良い。

なお、上記各実施例において、上記細胞凝集塊２を支持するピン１６の配置としては、複数のピン１６によって細胞凝集塊２を支持することが可能であれば、例えば６本のピン１６で各細胞凝集塊２を囲繞するように配置してもよい。
その場合、上記保持部Ｈは千鳥状に配置されることとなり、またこの配置を用いて上記第４実施例のような立体的な細胞の集合構造体を作製することも可能である。

さらに上記各実施例において、培養容器３に設けられるピン１６の太さや、ピン１６によって形成される保持部Ｈの大きさ、もしくは使用する細胞凝集塊２の直径に応じて、図１２に示すようにさまざまな態様が考えられる。
図１２に示すピン１６の直径は、上記各実施例で示したピン１６の直径よりも大径であり、対角位置の２本のピン１６の間隔よりも細胞凝集塊２の直径が大きい場合であっても、上記保持部Ｈに保持された隣接する細胞凝集塊２同士が接触しない場合を示している。
このような場合であっても、上記培養工程において細胞凝集塊２が培養されて隣接する細胞凝集塊２が融合するため、上述したような癒合パッド４を得ることができ、またピン１６が大径であるため、癒合パッド４に形成される貫通孔４ａも大径となることから、当該貫通孔４ａの内部に注入物を大量に注入することが可能となり、ピン１６の太さによって注入量を規定することも可能である。

上記癒合パッド４に形成された貫通孔４ａに注入物として栄養成分や成長因子、増殖因子または薬物等を注入する場合、これら注入物の作用に応じて、例えば一つおきの貫通孔４ａに注入して、効果を分散させるようにすることもでき、また癒合パッド４における特定の位置に集中する貫通孔４ａにのみ注入物を注入して、癒合パッド４の特定の位置に作用性を持たせることも考えられる。
また、癒合パッド４の所要の部分に血管が形成されるよう、注入物として血管を構成する細胞を含んだ細胞懸濁液を選択的に貫通孔４ａに注入することも可能であり、癒合パッド４の用途に応じて、種類の異なる注入物を、貫通孔４ａの位置を選択して注入することも可能である。

１細胞の集合構造体の作製装置２細胞凝集塊
３培養容器４癒合パッド（細胞の集合構造体）
１０吸引ノズル１２注入ノズル
１６ピン１７支持プレート
Ｈ保持部ｇ隙間

Claims

培養液を収容した培養容器の内部に複数の細胞凝集塊を配置し、上記複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製方法において、
上記培養容器の内部に立設された複数のピンとピンとの間に形成される保持部に細胞凝集塊を挟持または収容させる供給工程と、上記保持部に保持された細胞凝集塊を培養して上記集合構造体を形成する培養工程と、当該培養工程で形成された集合構造体を上記保持部から取り出す離脱工程と、当該離脱工程で取り出された集合構造体に開口する上記ピンによる貫通孔に注入物を注入する注入工程とを有することを特徴とする細胞の集合構造体の作製方法。
上記注入工程の後で、上記集合構造体を引き続き培養することを特徴とする請求項１に記載の細胞の集合構造体の作製方法。
培養液を収容した培養容器の内部に複数の細胞凝集塊を配置し、上記複数の細胞凝集塊が培養されて相互に融合した細胞の集合構造体を作製する細胞の集合構造体の作製装置において、
上記培養容器の内部に設けられ複数のピンを立設させた培養保持具と、上記培養保持具のピンとピンとの間に形成される複数の保持部に細胞凝集塊を挟持または収容させる供給手段と、上記培養保持具に保持された細胞凝集塊が培養されて形成された集合構造体を上記培養保持具の上記保持部から取り出す離脱手段と、当該取り出された集合構造体に開口する上記ピンによる貫通孔に注入物を注入する注入手段とを備えることを特徴とする細胞の集合構造体の作製装置。
上記離脱手段は、上記培養保持具のピンに沿って移動可能な支持部材を備え、当該支持部材は、上記供給手段が保持部に細胞凝集塊を保持させる際はピンの基端側に位置し、細胞凝集塊が融合して形成された集合構造体を保持部から取り出す際にはピンの先端側に位置させることを特徴とする請求項３に記載の細胞の集合構造体の作製装置。