JP6934207B2

JP6934207B2 - 新生児ｈｉｅ治療用組成物

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Publication number: JP6934207B2
Application number: JP2019555409A
Authority: JP
Inventors: シルチャン、ユン; スンパク、ウォン; ユンアン、ソ; キョンソン、トン
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Current assignee: Medinno Inc
Priority date: 2017-01-16
Filing date: 2017-10-31
Publication date: 2021-09-15
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Description

本発明は、トロンビン処理された幹細胞又はこれから由来されたエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を有効成分として含む、新生児低酸素性虚血性脳症（ＨｙｐｏｘｉｃＩｓｃｈｅｍｉｃＥｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ；ＨＩＥ）の予防又は治療用薬学的組成物及びその製造方法に関する。

新生児低酸素性虚血性脳症（ＨｙｐｏｘｉｃＩｓｃｈｅｍｉｃＥｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ；ＨＩＥ）は、全体新生児死亡原因の２３％を占めており、激しい損傷の場合、約５０〜１００％が死亡し、生存患児の中で６５〜７５％で重症の運動／認知障害、けいれんなどが一生持続すると報告されている。ＨＩＥに対する現存する唯一の治療法は、低体温療法であるが、効果が微弱であり、約４４％で死亡及び長期的な神経学的後遺症に苦しめられており、特に重症型（ｓｅｖｅｒｅｔｙｐｅ）では、改善の効果がないのが現状である。したがって、新生児のＨＩＥは、その難治性に起因して効果的かつ明確な治療法の開発が大変重要かつ至急である。

さらに、韓国の低調な出産率の問題は、多様な政府支援政策にもかかわらず、好転がないので、出生した新生児の病気罹患率を低減することが最も効率的かつ確実な未来有効経済人口数を増加させる方法になり得るだろう。したがって、全体新生児死亡原因の相当部分を占め、生存時に深刻な合併症を引き起こす新生児低酸素性虚血性脳症を治療できる次世代高効能治療剤の開発は、低出生率国で切実であり、時期的に至急である。

一方、幹細胞は、その多分化能と共に、組織の再生、治療及び免疫反応に関与する細胞と知られており、このような特性を利用して臍帯血、骨髄などから間葉系幹細胞を分離培養して、多様な疾患、症状に対する治療剤として開発しようとする努力があった。しかし、このような幹細胞自体を利用した治療法は、次のような限界と副作用の問題があった。

第一に、基本的に細胞治療剤は、ＤＮＡｔｒａｎｓｆｅｒによる発癌（ｔｕｍｏｒｏｇｅｎｉｃｉｔｙ）可能性を排除することができず、第二に、幹細胞自らの大きいサイズに起因して血管閉塞（ｖａｓｃｕｌａｒｏｂｓｔｒｕｃｔｉｏｎ）や心筋梗塞を誘発することができ、第三に、臍帯血のような同種細胞を使用して移植時（同種移植）に細胞表面抗原（ｓｕｒｆａｃｅａｎｔｉｇｅｎ）による拒否反応の問題があり、第四に、一般的に細胞治療剤は、製造工程が難しくて、保管運送に制約が多いため、生産コストが高いという限界がある。このように、幹細胞が持っている基本的限界に起因して、副作用を減らしながらも治療効果を増進させるための方案として遺伝子操作を利用した効能改善方法が開発されたことがあるが（韓国特許公開第１０−２０１７−００９９３８２号など）、現在まで明確な代案はないのが現状である。

エクソソームは、多様な細胞から分泌される膜構造の小さい小胞（略３０〜１００ｎｍの直径）であって、電子顕微鏡を通した研究で原形質膜から直接脱離されるものではなく、多胞体（ｍｕｌｔｉｖｅｓｉｃｕｌａｒｂｏｄｉｅｓ，ＭＶＢｓ）と呼ばれる細胞内特定区画から生じ、細胞外に放出、分泌されることが観察された。すなわち、多胞体と原形質膜の融合が起こると、小胞は、細胞外環境に放出されるが、これをエクソソームと言う。このようなエクソソームがどんな分子的機作によって作られるか確実に明らかにされていないが、赤血球細胞だけでなく、Ｂ−リンパ球、Ｔ−リンパ球、樹枝状細胞、血小板、大食細胞などを含む多様な種類の免疫細胞と腫瘍細胞、幹細胞なども生きている状態でエクソソームを生産して分泌すると知られている。

特に、幹細胞に由来するエクソソームは、受容体及びタンパク質だけでなく、核成分を含有していて、細胞間コミュニケーションの役割をすると知られている。また、前記幹細胞に由来するエクソソームは、幹細胞に比べて動物血清を相対的に少なく含有していて、動物血清の感染による症状（ｚｏｏｎｏｓｉｓ）の危険性も排除することができる。このようなエクソソームの特性を考慮すると、エクソソームを利用した細胞治療法は、既存の幹細胞治療法の限界を克服できる新しいパラダイムになると期待される。

これより、本発明者らは、新生児低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）において、従来の幹細胞治療剤が有する制約を克服しながらも治療効能を改善させるために鋭意研究した結果、トロンビン処理された幹細胞／エクソソームが、従来のナイーブ（ｎａｉｖｅ）幹細胞の細胞安定性は維持しながらも、多様な成長因子の分泌を通じて効能が強化されると共に、神経細胞死滅に対する保護効果がナイーブ（ｎａｉｖｅ）幹細胞に比べて顕著に増加するという事実を確認することによって、本発明を完成するに至った。

したがって、本発明の目的は、トロンビンで処理した幹細胞又はこれから由来されたエクソソームを含む、新生児低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の予防又は治療用薬学的組成物を提供することにある。

しかし、本発明が達成しようとする技術的課題は、以上で言及した課題に制限されず、言及されていない他の課題は、下記の記載から当業者に明確に理解され得る。

本発明は、トロンビン処理された幹細胞又はこれから由来されたエクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）を有効成分として含む、新生児低酸素性虚血性脳症（ＨｙｐｏｘｉｃＩｓｃｈｅｍｉｃＥｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ；ＨＩＥ）の予防又は治療用薬学的組成物を提供する。

本発明の一具現例において、前記幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌ）、ヒト組織由来間葉系幹細胞及び多分化能の幹細胞よりなる群から選ばれる幹細胞であることを特徴とする。

本発明の他の具現例において、前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜又は胎盤に由来することを特徴とする。

本発明のさらに他の具現例において、前記新生児低酸素性虚血性脳症の治療は、神経細胞の死滅抑制によるものであることを特徴とする。

本発明のさらに他の具現例において、前記薬学的組成物は、個体の脳室又は血管内に投与されることを特徴とする。

本発明のさらに他の具現例において、前記薬学的組成物は、培養培地、サイトカイン、成長因子及び遺伝子よりなる群から選ばれる補助成分をさらに含むことを特徴とする。

本発明のさらに他の具現例において、前記トロンビン処理された幹細胞又はこれから由来されたエクソソームは、トロンビン未処理群に比べて成長因子、免疫調節因子、抗酸化因子又は再生因子の発現が増加していることを特徴とする。

本発明のさらに他の具現例において、前記成長因子は、ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、又はＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）であることを特徴とする。

また、本発明は、前記組成物を含有する、新生児低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の予防又は治療用薬学製剤を提供する。

本発明の一具現例において、前記製剤は、注射剤形、注入剤形又は噴霧剤形であることを特徴とする。

本発明の他の具現例において、前記製剤は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする。

また、本発明は、（ａ）幹細胞の培養後にトロンビンを処理する段階；（ｂ）前記段階（ａ）の培養液からエクソソームを分離する段階；及び（ｃ）前記段階（ｂ）で分離したエクソソームを有効成分として含有する組成物を製造する段階を含む、前記エクソソーム含有薬学的組成物の製造方法を提供する。

本発明の一具現例において、前記段階（ａ）のトロンビンは、培地内に１〜１０００ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度で含まれることを特徴とする。

本発明の他の具現例において、前記段階（ｃ）のエクソソームは、遠心分離を利用することを特徴とする。

本発明のさらに他の具現例において、前記遠心分離は、５，０００〜５００，０００ｇで１０分間〜５時間行われることを特徴とする。

また、本発明は、トロンビン処理された幹細胞又はこれから由来されたエクソソームを個体に投与する段階を含む、新生児低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の予防又は又は治療方法を提供する。

また、本発明は、トロンビン処理された幹細胞又はこれから由来されたエクソソームの新生児低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の予防又は治療するための使用を提供する。

本発明によれば、トロンビン処理された幹細胞又はこれから由来されたエクソソームが、トロンビン未処理群に比べて成長因子、免疫調節因子、抗酸化因子又は再生因子の発現が増加していると共に、神経細胞死滅抑制効果が向上するところ、少ない量でも新生児低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の治療効果に優れているので、治療剤の生産コストを顕著に低減することができるという長所がある。

本発明のエクソソーム基盤治療剤によれば、無細胞の（ｃｅｌｌ−ｆｒｅｅ）製剤であるから、ＤＮＡが含まれていないため、発癌の危険性が少なく、細胞表面抗原がないため、移植拒否反応の問題がない。また、細胞よりサイズが非常に小さいため、全身投与時に微細血管に閉塞を起こすおそれがなく、細胞でなく、分離物質であって、在庫があってすぐに入手可能な（ｏｆｆｔｈｅｓｈｅｌｆ）製品への薬剤開発が可能てあるので、製造コストを低減することができる。

したがって、本発明によれば、従来、幹細胞治療剤が有する問題を解決しながらも、治療効能を顕著に改善することができるところ、新生児低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の治療に有用に用いられる。

図１は、幹細胞にトロンビン処理時にエクソソームの分泌が活性化する過程をＴＥＭイメージ分析を通じて確認した結果である。

図２は、トロンビン処理された幹細胞由来のエクソソームにおいてエクソソームマーカーであるＣＤ６３及びＣＤ９が正常に発現するかを確認したウェスタンブロット結果である。

図３は、トロンビン処理により幹細胞及びエクソソーム内成長因子（ＢＤＮＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ）、抗炎症サイトカイン（ＩＬ−６）等の発現が増加することを示す免疫分析結果である。

図４は、ｉｎｖｉｔｒｏＨＩＥモデルでトロンビン処理幹細胞に対する神経細胞死滅抑制効果を示すＭＴＴアッセイ結果である。

図５は、ｉｎｖｉｔｒｏＨＩＥモデルでトロンビン処理幹細胞由来のエクソソームに対する神経細胞の死滅抑制効果を示すＭＴＴアッセイ結果である。

図６ａ及び図６ｂは、動物モデルを利用してトロンビン処理幹細胞のＨＩＥの治療活性を確認した結果である。

本発明において「幹細胞」とは、未分化した細胞であって、自己複製能力を有し、二つ以上の互いに異なる種類の細胞に分化する能力を有する細胞を言う。本発明の幹細胞は、自家又は同種由来幹細胞であってもよく、ヒト及び非ヒト哺乳類を含む任意類型の動物由来であってもよく、前記幹細胞が成体に由来したものであってもよく、又は胚芽に由来したものであってもよく、これらに限定されない。

本発明の幹細胞は、胚芽幹細胞又は成体幹細胞を含み、好ましくは成体幹細胞である。前記成体幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌ）、ヒト組織由来間葉系幹細胞、又は多分化能の幹細胞であってもよく、好ましくは間葉系幹細胞であるが、これに限定されない。前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜及び胎盤などに由来する間葉系幹細胞であってもよいが、これらに限定されない。

本発明において「臍帯血」は、胎盤と胎児を連結する臍帯静脈から採取された血液を意味する。臍帯血は、出産時に自然的に発生する副産物であって、数回の手術を必要とする骨髄などの一般間葉組織より極めて採取が容易であり、骨髓移植に比べて臍帯血の保管産業が活性化していて、すでにインフラが構築されているので、供与者を求めることも容易である。これと共に、臍帯血由来細胞は、組織や臓器の移植で拒否反応を起こす最も重要な原因である組織適合抗原ＨＬＡ−ＤＲ（ｃｌａｓｓＩＩ）が発現しない細胞であるから、従来の移植手術時に問題になった拒否反応などの免疫反応を誘発しないか、最小化することができるので、自家由来臍帯血はもちろん、他家由来臍帯血も使用することができる。

本発明において「エクソソーム（ｅｘｏｓｏｍｅ）」とは、多様な細胞から分泌される膜構造の小さい（略３０〜１００ｎｍの直径）小胞を意味し、多胞体と原形質膜の融合が起こって、細胞外環境に放出される小胞を意味する。前記エクソソームは、自然的に分泌されたものであるか、あるいは人工的に分泌されたものを含む。

本発明において「低酸素性虚血性脳症（ＨｙｐｏｘｉｃＩｓｃｈｅｍｉｃＥｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ；ＨＩＥ）」とは、脳に深刻な酸素不足に起因して脳の機能や構造に変化が来た状態を言い、一時的に回復可能なこともあるが、時には回復不能な永久的損傷が生じることもある。

本発明において「ＨＩＥの予防又は治療」とは、ＨＩＥの軽減、緩和及び症状の改善を含み、ＨＩＥにかかる可能性を低減することを含む意味である。

本発明において「トロンビン（ｔｈｒｏｍｂｉｎ）処理された幹細胞」は、非処理幹細胞に比べて細胞生存性（ｃｅｌｌｖｉａｂｉｌｉｔｙ）、酸化機能（ｏｘｉｄａｔｉｖｅｆｕｎｃｔｉｏｎ）など細胞安定性には変化なく、幹細胞の主な作用機序であるパラクリン特性（ｐａｒａｃｒｉｎｅｐｒｏｐｅｒｔｙ）の増加によって幹細胞の機能／効能が強化することができる。ひいては、トロンビン処理によって、幹細胞に由来するエクソソームの治療効能を強化させると共に、エクソソームの分泌量を増加させることができる。

この際、パラクリン（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）としては、成長因子、免疫調節因子、抗酸化因子又は再生因子が増加することができ、特に成長因子は、細胞分裂や生長、分化を促進するタンパク質性の生理活性物質を意味するものであって、ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）等を含むことができる。

本発明の薬学的組成物は、個体に多様な経路で特別な制限なく投与され得、例えば、経口又は非経口方式で投与され得るが、脳室内又は血管内に投与することが好ましい。

本発明の薬学的組成物は、ＨＩＥの治療効果を有する公知の補助成分を１種以上さらに含有することができる。例えば、ＨＩＥの治療に効果的な遺伝子［例えば、抗−炎症性サイトカイン（ａｎｔｉ−ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅ）遺伝子、炎症性サイトカイン（ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙｃｙｔｏｋｉｎｅ）に対するｓｉＲＮＡ又はアンチ−センスプライマー（ａｎｔｉｓｅｎｓｅｐｒｉｍｅｒ）］又はこれを含む発現ベクター、自己分泌（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）又は傍分泌（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）効果を提供するサイトカイン［例えば、インターロイキン（ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ）−１０］、成長因子［例えば、ケラチン形成細胞成長因子（Ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）］、及びこれらの組合せよりなる群から選ばれる補助成分を一つ以上さらに含むことができる。

本発明の薬学的組成物の好ましい投与量は、個体の状態及び体重、病気の程度、薬物形態、投与経路及び期間によって異なり、当業者により適切に選択され得る。前記組成物の投与は、一日に一回投与することもでき、数回に分けて投与することもでき、これに限定されない。

本発明の薬学的組成物は、ＨＩＥの治療のために単独で、又は手術、放射線治療、ホルモン治療、化学治療及び生物学的反応調節剤を使用する方法と併用して使用することができる。

本発明の組成物は、薬学的組成物の製造に通常使用する適切な担体をさらに含むことができる。例えば、注射剤の場合には、保存剤、無痛化剤、可溶化剤又は安定化剤などを、局所投与用製剤の場合には、基剤（ｂａｓｅ）、賦形剤、潤滑剤又は保存剤などをさらに含むことができる。

本発明の組成物は、薬学的分野において通常の方法により個体の身体内投与に適合した単位投与型の製剤で剤形化させて投与することができる。このような目的に適合した剤形としては、非経口投与製剤として注射用アンプルのような注射剤、注入バックのような注入剤、及びエアロゾール製剤のような噴霧剤などが好ましい。前記注射用アンプルは、使用直前に注射液と混合調製することができ、注射液としては、生理食塩水、葡萄糖、リンガー液などを使用することができる。また、注入バックは、塩化ポリビニル又はポリエチレン材質のものを使用することができる。本発明において投与は、任意の適切な方法で個体に所定の本発明の組成物を提供することを意味する。

本発明においてトロンビン処理濃度は、幹細胞／エクソソームの効能を強化させるのに適合した濃度であれば十分であり、特別な制限はないが、培地に１〜１０００ｕｎｉｔ／ｍｌの濃度で含まれることが好ましい。

本発明においてエクソソームを分離する方法には制限がなく、例えば、培養液から、遠心分離、超高速遠心分離、フィルターによる濾過、ゲル濾過クロマトグラフィー、フリー−フロー電気泳動、毛細管電気泳動、ポリマーを利用した分離などの方法及びこれらの組合せを利用して分離することができ、好ましくは、遠心分離／超遠心分離である。この際、遠心分離／超遠心分離は、４℃、５，０００〜５００，０００ｇで１０分間〜５時間の間行うことが好ましい。

本発明において細胞培養に用いられる培地は、糖、アミノ酸、各種栄養物質、血清、成長因子、無機質などの細胞の成長及び増殖などに必須の要素を含む生体外（ｉｎｖｉｔｒｏ）で幹細胞などの細胞の成長及び増殖のための混合物を意味する。本発明において用いられる培地は、ＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ）、ＭＥＭ（ＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＢＭＥ（ＢａｓａｌＭｅｄｉｕｍＥａｇｌｅ）、ＲＰＭＩ１６４０、ＤＭＥＭ／Ｆ−１０（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ−１０）、ＤＭＥＭ／Ｆ−１２（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅ’ｓＭｅｄｉｕｍ：ＮｕｔｒｉｅｎｔＭｉｘｔｕｒｅＦ−１２）、α−ＭＥＭ（α−ＭｉｎｉｍａｌｅｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、Ｇ−ＭＥＭ（Ｇｌａｓｇｏｗ’ｓＭｉｎｉｍａｌＥｓｓｅｎｔｉａｌＭｅｄｉｕｍ）、ＩＭＤＭ（Ｉｓｏｃｏｖｅ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓＭｅｄｉｕｍ）及びＫｎｏｃｋＯｕｔＤＭＥＭなどの商業的に製造された培地又は人為的に合成された培地を含むが、これらに限定されない。

以下、本発明の理解を助けるために実施例を提示する。しかし、下記の実施例は、本発明をより容易に理解するために提供されるものに過ぎず、実施例により本発明の内容が限定されるものではない。

実施例１：幹細胞にトロンビン処理による効能増強誘導
１−１．トロンビンによるエクソソーム分泌誘導
ヒト臍帯血由来間葉系幹細胞（３×１０^５個）を６０ｍｍの培養皿（ｏｒａｎｇｅｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｃａｔ＃４４５０２００）に分注した後、１週間培養した。培養皿に細胞が飽和増殖したことを確認した後、５０ｕｎｉｔ／ｍｌのトロンビン（ＲＥＹＯＮＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ．Ｃｏ．，ＬＴＤ）が希釈されている血清フリー培養培地（ＭＥＭａｌｐｈａｍｅｄｉａ）に交替し、さらに６時間培養して、トロンビン処理された幹細胞を収得した。

以後、トロンビン処理により間葉系幹細胞でエクソソームの分泌が活性化するかを確認するために、エクソソームの分泌過程をＴＥＭ（ＴｒａｎｓｍｉｓｓｉｏｎＥｌｅｃｔｒｏｎｉｃＭｉｃｒｏｓｃｏｐｙ）イメージを通じて確認した。その結果、図１に示されたように、トロンビンによる刺激がエクソソームの分泌を誘導することが分かった。

また、前記培養液を遠心分離チューブに分けて入れ、４℃、１００，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離し、上澄み液を新しいチューブに移して、細胞残余物（ｄｅｂｒｉｓ）を除去した。さらに、前記上澄み液を４℃、１００，０００ｒｐｍで２時間超遠心分離した後、上澄み液をさらに除去して、エクソソームを収得した（最終濃度：１５μｇ／ｍｌ）。

この際、収得した産物がエクソソームであるか否かを確認するために、公知のエクソソームマーカーであるＣＤ６３及びＣＤ９（ＳｙｓｔｅｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，ＭｏｕｎｔａｉｎＶｉｅｗ，ＣＡ，ＵＳＡ）の発現をウェスタンブロットを用いて検証した。その結果、図２に示されたように、トロンビン処理された幹細胞から収得したエクソソームは、正常にＣＤ６３及びＣＤ９を発現していたところ、エキソソームであることを確認した。

１−２．トロンビンによる幹細胞／エクソソーム効能増強
前記実施例１−１で収得した幹細胞及びエクソソームがトロンビン処理により成長因子やＩＬ−６のような抗炎症サイトカインなどの発現が増加したかを確認した。

具体的には、溶解緩衝液（ｌｙｓｉｓｂｕｆｆｅｒ）を利用して膜を溶解した後、細胞／エクソソーム内のタンパク質を分離して、ＢＤＮＦ、ＦＧＦ、ＨＧＦ、ＮＧＦ、ＶＥＧＦ、ＩＬ−６の量をＰｒｏｃａｒｔａｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙｋｉｔ（ａｆｆｙｍａｔｒｉｘ、米国）で測定した。

その結果、図３に示されたように、トロンビン処理によりＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＩＬ−６（Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ−６）の発現が、トロンビン非処理幹細胞又はこれから収得したエクソソーム（対照群；ｎｏｒｍａｌ）に比べて増加したことを確認した。

このような結果は、トロンビン処理により幹細胞又はこれから由来されたエクソソームの細胞再生、血管再生、抗炎症効能が増強されることを意味することである。

実施例２：新生児低酸素虚血性脳病症（ＨＩＥ）のｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌ構築
妊娠後、１８．５日が経過したＳＤラットの下腹部を切開して、子宮から胎児を取り出した後、前脳を用心深く摘出した。摘出された脳組織から大脳皮質の部分だけを用心深く分離した後、ピペットを利用して単一細胞で分離して、神経細胞培養液に入れて培養をする。培養後１０日以後に、「グルコースが添加されていない培地を入れた後、１％低酸素条件（ｏｘｙｇｎｅ，ｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ；ＯＧＤ）」下に６０分間露出させることによって、新生児ＨＩＥのｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌを構築した。

実施例３：トロンビン処理幹細胞に対するｉｎｖｉｔｒｏ神経細胞の死滅抑制効果
前記実施例２で構築した新生児ＨＩＥのｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌに、前記実施例１で収得したトロンビン処理幹細胞を処理した後、ＭＴＴアッセイを通じて神経細胞の生存率を測定した。

その結果、図４に示されたように、正常神経細胞（ＮＣ）に比べてＨＩＥのｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌ（ＯＧＤ）では、酸素／グルコース除去（ｏｘｙｇｅｎ／ｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）の誘発によって神経細胞の死滅が有意に増加した反面、新生児ＨＩＥｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌに「トロンビン処理幹細胞で処理した群（ＯＧＤ＋ＭＳＣ＿ｔｈｒｏｍｂｉｎｐｒｅ）」では、トロンビン非処理幹細胞群（ＯＧＤ＋ｎａｉｖｅＭＳＣ）又は低酸素処理幹細胞群（ＯＧＤ＋ＭＳＣ＿ｈｙｐｏｘｉａｐｒｅ）に比べて神経細胞の死滅が顕著に抑制されることを確認し、これを通じて、本発明のトロンビン処理幹細胞の神経細胞保護効果に最も優れていることを検証した。

実施例４：トロンビン処理幹細胞由来のエクソソームに対するｉｎｖｉｔｒｏ神経細胞の死滅抑制効果
前記実施例２で構築した新生児ＨＩＥのｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌに、前記実施例１で収得したトロンビン処理幹細胞由来のエクソソームを処理した後、ＭＴＴアッセイを通じて神経細胞の生存率を測定した。

その結果、図５に示されたように、正常神経細胞（ＮＣ）に比べてＨＩＥのｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌ（ＯＧＤ）では、酸素／グルコース除去（ｏｘｙｇｅｎ／ｇｌｕｃｏｓｅｄｅｐｒｉｖａｔｉｏｎ）の誘発によって神経細胞の死滅が有意に増加した反面、新生児ＨＩＥｉｎｖｉｔｒｏｍｏｄｅｌに「トロンビン処理幹細胞由来のエクソソームで処理した群（ＯＧＤ＋ＥＶｆｒｏｍＭＳＣ＿ｔｈｒｏｍｂｉｎｐｒｅ）」では、トロンビン非処理幹細胞由来のエクソソームで処理した群（ＯＧＤ＋ＥＶｆｒｏｍｎａｉｖｅＭＳＣ）又は低酸素処理幹細胞由来のエクソソームで処理した群（ＯＧＤ＋ＥＶｆｒｏｍＭＳＣ＿ｈｙｐｏｘｉａｐｒｅ）に比べて神経細胞死滅が顕著に抑制されることを確認した。

これを通じて、本発明のトロンビン処理幹細胞と同様に、これから由来されたエクソソームもやはり神経細胞保護効果に優れていることを検証した。

実施例５：トロンビン処理幹細胞のＨＩＥの治療活性検証（ｉｎｖｉｖｏ）
動物モデルを利用してトロンビン処理幹細胞のＨＩＥの治療活性を確認するために、下記のように実験を進めた。

現在、ＨＩＥ治療として唯一の臨床で適用する姑息的治療は、低体温療法（Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ）である。したがって、動物実験でも、臨床環境と同様に、ＨＩＥ病気後、低体温療法で治療をした後、併用治療（ｃｏｍｂｉｎｅｄｔｒｅａｔｍｅｎｔ）で幹細胞をさらに投与しつつ、病気の好転の有無を確認し、この際、実験のために分類されたグループは、下記の通りである：
（１）ＮＣ：正常対照群
（２）ＨＩＥ＋Ｓ：病気対照群（病気誘導後にｓａｌｉｎｅ処理）
（３）ＨＩＥ＋Ｈ＋ＷＪ：ＨＩＥ誘導後に低体温療法（Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ）治療後、トロンビン非処理幹細胞処理
（４）ＨＩＥ＋Ｈ＋Ｔｈ．ＷＪ：ＨＩＥ誘導後に低体温療法（Ｈｙｐｏｔｈｅｒｍｉａ）治療後、トロンビン処理幹細胞処理

その結果、図６ａ及び図６ｂに示されたように、正常ＮＣ群に比べて病気を誘導したＨＩＥ群は、いずれも、有意に脳の損傷領域が増加することを確認することができた。ＨＩＥ誘発以後、低体温療法を施行し、トロンビン非処理幹細胞で治療した群の場合、損傷領域の好転傾向があるが、有意性が認められない反面、トロンビン処理幹細胞で治療した群の場合、損傷領域の好転傾向がさらに大きく、有意であることを確認することができた。

前述した本発明の説明は、例示のためのものであり、本発明の属する技術分野における通常の知識を有する者は、本発明の技術的思想や必須の特徴を変更することなく、他の具体的な形態で容易に変形が可能であることを理解することができる。したがって、以上で記述した実施例は、すべての面において例示的なものであり、限定的でないものと理解されなければならない。

本発明によるトロンビン処理された幹細胞又はこれから由来されたエクソソームによれば、少ない量でも新生児低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の治療効果に優れていると同時に、従来、幹細胞治療剤が有する問題を解決しながらも、治療効能を顕著に改善することができるところ、新生児低酸素性虚血性脳症（ＨＩＥ）の治療に有用に用いられる。

Claims

トロンビン処理された幹細胞を有効成分として含む、新生児低酸素性虚血性脳症（ＨｙｐｏｘｉｃＩｓｃｈｅｍｉｃＥｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ；ＨＩＥ）の予防又は治療用薬学的組成物。
前記幹細胞は、間葉系幹細胞、ヒト組織由来間葉系間質細胞（ｍｅｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｒｏｍａｌｃｅｌｌ）、ヒト組織由来間葉系幹細胞及び多分化能の幹細胞よりなる群から選ばれる幹細胞であることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
前記間葉系幹細胞は、臍帯、臍帯血、骨髄、脂肪、筋肉、神経、皮膚、羊膜又は胎盤に由来することを特徴とする請求項２に記載の薬学的組成物。
前記新生児低酸素性虚血性脳症の治療は、神経細胞の死滅抑制によることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
前記薬学的組成物は、脳室内又は血管内に投与されることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
前記薬学的組成物は、培養培地、サイトカイン、成長因子及び遺伝子よりなる群から選ばれる補助成分をさらに含むことを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
前記トロンビン処理された幹細胞は、トロンビン未処理群に比べて成長因子、免疫調節因子、抗酸化因子又は再生因子の発現が増加していることを特徴とする請求項１に記載の薬学的組成物。
前記成長因子は、ＢＤＮＦ（ｂｒａｉｎ−ｄｅｒｉｖｅｄｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃｆａｃｔｏｒ）、ＦＧＦ（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＨＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、ＮＧＦ（ｎｅｒｖｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）、又はＶＥＧＦ（ｖａｓｃｕｌａｒｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ）であることを特徴とする請求項７に記載の薬学的組成物。
請求項１に記載の組成物を含有する、新生児低酸素性虚血性脳症（ＨｙｐｏｘｉｃＩｓｃｈｅｍｉｃＥｎｃｅｐｈａｌｏｐａｔｈｙ；ＨＩＥ）の予防又は治療用薬学製剤。
前記製剤は、注射剤形、注入剤形又は噴霧剤形であることを特徴とする請求項９に記載の薬学製剤。
前記製剤は、薬学的に許容可能な担体をさらに含むことを特徴とする請求項９に記載の薬学製剤。