JP6977863B2

JP6977863B2 - キノン類分析方法とその方法を実施するためのオンラインｓｆｅ−ｓｆｃシステム

Info

Publication number: JP6977863B2
Application number: JP2020502033A
Authority: JP
Inventors: 恵子松本
Original assignee: Shimadzu Corp
Current assignee: Shimadzu Corp
Priority date: 2018-02-26
Filing date: 2018-11-30
Publication date: 2021-12-08
Anticipated expiration: 2038-11-30
Also published as: WO2019163245A1; JPWO2019163245A1

Description

本発明は、キノン類分析方法とその方法を実施するためのオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムに関するものである。

土壌などの試料中における微生物の活動を観察するための手法の１つとしてキノンプロファイリング法がある（特許文献１を参照。）。キノンプロファイリング法は、微生物の呼吸関連物質であるキノン類を試料から抽出してその量を測定することで、試料中に存在する微生物群集の種類や量を把握する手法である。

キノン類の抽出には、一般的に有機溶媒による手動抽出の他に、超臨界流体抽出（ＳＦＥ）システムが利用される。具体的には、試料を封入した抽出容器に超臨界状態の二酸化炭素と適量の有機溶媒からなる移動相溶媒を通液することによって抽出容器内の試料からキノン類を抽出し、試料から抽出されたキノン類を吸着カートリッジに捕捉させる。

試料からキノン類を抽出した後、キノン類を捕捉させた吸着カートリッジをＳＦＥシステムから取り外し、その吸着カートリッジにアセトン溶液を通液することによって吸着カートリッジからキノン類を溶出させる。溶出したキノン類を含有するアセトン溶液を別のシリカゲルカラムに通液し、シリカゲルカラムにキノン類を吸着させる。そして、キノン類を吸着させたシリカゲルカラムに揮発性の高い有機溶媒を通液してキノン類を溶出させて回収した後、回収した液をエバポレータで蒸発させて濃縮し、アセトンで洗浄してキノン類を回収し、回収したキノン類を高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）にて分析することにより定量する。

ＷＯ２００６／１１８１６７Ａ１ＷＯ２０１６／０３１００８Ａ１

上記のように、従来のキノンプロファイリング法では、ＳＦＥシステムにて試料からキノン類を抽出した後、抽出されたキノン類をＨＰＬＣに導入するまでの脱離や濃縮といった処理を手作業で行なう必要があった。

本発明は、キノン類の抽出から分析までを手作業を介することなく高効率に行なえるようにすることを目的とするものである。

本発明に係るキノン類分析方法は、キノン類の抽出から分離分析までをオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムを用いて手作業を介することなく実行するものである。

オンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムは、超臨界流体を用いた試料成分の抽出（ＳＦＥ）と、抽出された成分の超臨界流体クロマトグラフィー分析（ＳＦＣ）とをオンラインで行なうことができるように構成されたシステムであり、例えば特許文献２に開示されている。具体的には、超臨界状態の二酸化炭素とモディファイアからなる移動相溶媒を供給するための移動相供給部、試料が封入され、前記移動相供給部から供給される前記移動相溶媒によって前記試料から成分を抽出するための抽出容器、前記試料から抽出された成分の分離を行なうための分析カラム、及び前記分析カラムで分離された成分を検出するための検出器を有するものであり、前記抽出容器内で試料中に含まれる成分を前記移動相溶媒に抽出した後、前記試料から抽出された成分を含む前記移動相溶媒を前記分析カラムに導いて分離し、前記分析カラムで分離された成分を前記検出器により検出するように構成されたものである。

本発明のキノン類分析方法は、前記抽出容器にキノン類を含む試料を封入する試料封入ステップと、前記試料封入ステップの後で、前記移動相供給部から前記試料からキノン類を含む成分を抽出するための第１の移動相溶媒を前記抽出容器に供給し、前記抽出容器内が前記第１の移動相溶媒で満たされた状態で静置する「静的抽出」を実施した後、前記試料から抽出された成分を含む前記第１の移動相溶媒を前記分析カラムに通液し、前記第１の移動相溶媒に含まれる成分のうち少なくともキノン類を含む成分を前記分析カラムに捕捉させる「動的抽出」を一連の抽出動作として実行する抽出ステップと、前記一連の抽出動作により前記分析カラムに捕捉された成分を前記分析カラムから溶出させるための第２の移動相溶媒を前記移動相供給部から供給して前記分析カラムに通液し、前記分析カラムに捕捉された成分を分離しながら溶出させて前記検出器により検出する分析ステップと、を備えている。

本発明のキノン類分析方法では、前記抽出ステップにおいて「静的抽出」と「動的抽出」からなる前記一連の抽出動作を複数回、好ましくは３回以上繰り返すことが好ましい。そうすれば、キノン類の抽出率が向上し、分析精度を高めることができる。

前記第２の移動相溶媒として、前記モディファイアの濃度が前記第１の移動相溶媒よりも高いものを用いることができる。

前記分析ステップにおいて、前記第２の移動相溶媒の前記モディファイアの濃度を時間とともに上昇させてもよい。

本発明に係るオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムは、上述のキノン類分析方法を全自動で実施する機能を備えるものである。具体的には、当該オンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムの動作制御を行なう制御部が、キノン類を含む試料が封入された前記抽出容器に、前記試料からキノン類を含む成分を抽出するための第１の移動相溶媒を供給して前記抽出容器を前記第１の移動相溶媒で満たして静置した後、前記試料から抽出された成分を含む前記抽出容器内の前記第１の移動相溶媒を前記分析カラムに通液し、前記第１の移動相溶媒中の成分のうち少なくともキノン類を含む成分を前記分析カラムに捕捉させる一連の抽出動作を実行するように構成された抽出部と、前記一連の抽出動作により前記分析カラムに捕捉された成分を前記分析カラムから溶出させるための前記第２の移動相溶媒を前記分析カラムに通液するように構成された分析部と、を備えている。

前記抽出部は、前記一連の抽出動作を複数回繰り返すように構成されていることが好ましい。そうすれば、キノン類の抽出率が向上し、分析精度を高めることができる。

本発明を実現するための前記分析カラムとしては、担体にナフチルエチル基又はピレニルエチル基を結合させた分離媒体が充填されているナフチルエチル基又はピレニルエチル基結合型のカラムが挙げられ、前記モディファイアとしてアセトニトリルが挙げられる。

本発明のキノン類分析方法では、分析者が抽出容器にキノン類を含む試料を封入した後、第１の移動相溶媒で抽出容器を満たした状態で静置しキノン類を含む成分を前記第１の移動相溶媒に抽出する静的抽出、及び前記抽出容器内の前記第１の移動相溶媒を前記分析カラムに通液してキノン類を含む成分を前記分析カラムに捕捉させる動的抽出を一連の抽出動作として実施し、その後、第２の移動相溶媒を前記分析カラムに通液して前記分析カラムに捕捉された成分を分離しながら溶出させて前記検出器により検出するので、試料中のキノン類の抽出から分離分析までを１つのＳＦＥ−ＳＦＣシステム上で完結させることができる。

本発明のオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムでは、上記キノン類分析方法を全自動で実施する機能を有するので、キノン類の抽出から分離分析までの処理を高効率に行なうことができる。

オンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムの一実施例を概略的に示す流路構成図である。同実施例のオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムを用いたキノン類の分析方法を説明するためのフローチャートである。スタンバイ時のオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムの流路構成を示す図である。静的抽出時のオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムの流路構成を示す図である。動的抽出時のオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムの流路構成を示す図である。分析時のオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムの流路構成を示す図である。同実施例のオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムを用いたキノン類の分析方法による分析結果の一例を示すクロマトグラムであり、（Ａ）は浄化前の土壌の分析結果、（Ｂ）は浄化後の土壌の分析結果である。一連の抽出動作の繰り返し回数によるキノン類の抽出効果の検証結果を示すグラフであり、（Ａ）は繰り返し回数が１回の場合、（Ｂ）は繰り返し回数が３回の場合である。

以下、本発明に係るキノン類分析方法及びその方法を実施するためのオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムについて、図面を参照しながら説明する。

図１に、キノン類分析方法の実施に適したオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムの一実施例の概略構成図を示す。

この実施例のオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステム１は、主として、移動相供給部２、ＳＦＥ部４、オートサンプラ６、分析カラム８、背圧制御バルブ（ＢＰＲ）１０，１２、検出器１４、及び制御部２８からなる。

移動相供給部２は、二酸化炭素を送液するための二酸化炭素ポンプ１６と、モディファイアを送液するためのモディファイアポンプ１８を備えている。二酸化炭素の初期状態は液体であるが、ＢＰＲ１０又は１２によって流路内の圧力が制御されることにより、流路中を超臨界状態で流れる。モディファイアとしては、例えばアセトニトリルが挙げられる。

ＳＦＥ部４は、抽出容器２０、流路切替バルブ２２及び２４を備えている。流路切替バルブ２２及び２４はそれぞれ、抽出容器２０の一端及び他端の接続先を切り替えるためのものである。流路切替バルブ２２及び２４の切替えにより、このオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステム１は、スタンバイ状態（図３参照）のほか、静的抽出（図４参照）、動的抽出（図５参照）及び分析（図６参照）のそれぞれの動作を実施するための状態をとることができる。静的抽出（図４参照）、動的抽出（図５参照）及び分析（図６参照）の詳細については後述する。

オートサンプラ６は移動相供給部２からの移動相溶媒が流れる流路上におけるＳＦＥ部４の下流に設けられている。オートサンプラ６は、例えば、標準試料の測定データを取得する際に流路中に標準試料を注入するためのものである。

分析カラム８はオートサンプラ６のさらに下流に設けられている。分析カラム８は、例えば、シリカゲル担体にナフチルエチル基を結合させた分離媒体が充填されたナフチルエチル基結合型のカラムである。分析カラム８はカラムオーブン２６内に収容され、温度調節がなされる。

ＢＰＲ１０はオートサンプラ６と分析カラム８との間の流路から分岐した流路上に設けられており、ＢＰＲ１２は分析カラム８の下流に設けられている。ＢＰＲ１０及び１２はそれぞれ、移動相供給部２によって送液される移動相溶媒中の二酸化炭素を超臨界状態にするために流路内の圧力を所定の圧力に制御するためのものである。

検出器１４はＢＰＲ１２のさらに下流に設けられている。検出器１４は、分析カラム８で分離した成分を検出して定量を行なうためのものであり、例えば質量分析計（ＭＳ）によって実現される。

制御部２８は、このオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステム１の動作制御を行なうためのものである。制御部２８は、例えば、マイクロコンピュータなどの演算素子やその演算素子によって実行されるプログラムを格納した記憶素子が搭載されたコンピュータ回路によって実現される。

制御部２８の機能の一部として抽出部２０及び分析部３２が設けられている。抽出部２０は、抽出容器２０に封入されたキノン類を含む試料からキノン類を含む成分を抽出するための一連の抽出動作を実行するように構成されている。一連の抽出動作とは、静的抽出と動的抽出の２つの処理を含む動作である。

静的抽出とは、システム１の流路構成を図４に示されるような状態にして、抽出容器２０に移動相供給部２から所定の組成をもった第１の移動相溶媒を供給し、抽出容器２０内を第１の移動相溶媒で満たして一定時間（例えば２分）静置する処理である。この静的抽出により、試料中のキノン類を含む成分が第１の移動相溶媒に抽出される。

動的抽出とは静的抽出の後で実施される処理であり、システム１の流路構成を図５に示されるような状態にして、抽出容器２０内の第１の移動相溶媒を分析カラム８に通液し、試料から第１の移動相溶媒に抽出されたキノン類を含む成分を分析カラム８に捕捉させて濃縮する処理である。

上記一連の抽出動作において使用する第１の移動相溶媒は、静的抽出において抽出容器２０内の試料からキノン類を抽出し、かつ動的抽出において分析カラム８からキノン類を溶出させないように調整されたものである。分析カラム８がナフチルエチル基結合型のカラムである場合には、第１の移動相溶媒として、例えば、二酸化炭素とモディファイアとの比率が９：１（アセトニトリル濃度１０％）の組成をもつものを用いることができる。

上記一連の抽出動作を複数回繰り返すことにより、抽出容器２０内の試料からのキノン類の抽出効率が向上する。このため、抽出部３０は、上記一連の抽出動作を所定回数（例えば３回）繰り返すように構成されていることが好ましい。

分析部３２は、上記一連の抽出動作が終了した後で、システム１の流路構成を図６に示されるような状態にして、第１の移動相溶媒とは組成の異なる第２の移動相溶媒を分析カラム８に通液し、分析カラム８に捕捉されたキノン類を他の成分と分離しながら溶出させ、検出器１４に導くように構成されている。

上記分析動作において用いられる第２の移動相溶媒は、分析カラム８からのキノン類の溶出力が第１の移動相溶媒よりも高いものである。第２の移動相溶媒は、モディファイアの濃度を第１の移動相溶媒よりも高くすることによって実現される。なお、第２の移動相溶媒のモディファイア濃度を時間とともに上昇させるようにしてもよい。

このオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステム１において実施されるキノン類分析方法について、図１とともに図２のフローチャートを用いて説明する。

初期状態では、オンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステム１がスタンバイ状態（図３の状態）となっている。この状態で、分析者は抽出容器２０にキノン類を含む土壌などの試料を封入し（ステップＳ１）、分析開始の指示を制御部２８に入力する。分析開始の指示が入力されると、抽出部３０はシステム１の流路構成を図４の状態にして静的抽出を実施した後（ステップＳ２）、システム１の流路構成を図５の状態にして動的抽出を実施する（ステップＳ３）。この一連の抽出動作により、試料中のキノン類を含む成分が分析カラム８に捕捉されて濃縮される。一連の抽出動作の繰返し回数が予め設定されている場合には、抽出部３０は、上記一連の抽出動作を予め設定された回数だけ繰り返す（ステップＳ４）。

その後、分析部３２はシステム１の流路構成を図６の状態にして第２の移動相溶媒を分析カラム８に通液し、キノン類の分離分析を行なう（ステップＳ５）。検出器１４によって得られる検出信号から、試料中に含有されていたキノン類に由来するクロマトグラムが得られ、そのピーク面積を求めることによって試料中に含有されていたキノン類を定量することができる。

図７は、油分解微生物が保有しているキノン類として確認され、キノンプロファイリング法の主要成分であるユビキノン４種（Ｑ−８、Ｑ−９、Ｑ−１０、Ｑ−１０（Ｈ２））とメナキノン２種（Ｍ−７、Ｍ−９）についての上記キノン類分析方法による分析結果を示すクロマトグラムである。なお、（Ａ）は油分の浄化を実施する前の土壌についての分析結果であり、（Ｂ）は油分の浄化を実施して１か月が経過した後の土壌についての分析結果である。この分析では、アセトニトリル濃度が１０％である移動相（第１の移動相溶媒）を用いて静的抽出（２分）と動的抽出（２分）からなる一連の抽出動作を３回繰り返した後、移動相溶媒のアセトニトリル濃度を時間とともに上昇させて分析カラム８からキノン類を溶出させて検出器１４（ＭＳ）による検出を行なった。

図７からわかるように、上記キノン類分析方法によっていずれのキノン類もピーク波形として検出することができている。このことから、キノン類の抽出から分析までの処理を１つの分析カラム８を用いてオンラインで完結させることが可能であることが立証された。

また、土壌中に含まれるキノン類の量は土壌中の油分量に比例することがわかっている。図７の（Ａ）と（Ｂ）を比較すると、油分を浄化して１か月が経過した土壌中のキノン類の量は油分を浄化する前の土壌中のキノン類の量よりも減少しており、分析によってキノン類を正確に検出できていることがわかる。

また、図８は、静的抽出（２分）と動的抽出（２分）からなる一連の抽出動作の繰返し回数によるキノン類（Ｑ−９）の抽出率の検証結果を示すクロマトグラムであり、（Ａ）は繰り返し回数が１回の場合、（Ｂ）は繰り返し回数が３回の場合である。この結果からわかるように、一連の抽出動作を１回だけ実施しても試料からのキノン類の抽出量は僅かであるが、一連の抽出動作を複数回繰り返すことによってキノン類の抽出量が大幅に上昇している。この結果から、キノンプロファイリング法の正確性に影響を与える試料からのキノン類の抽出率を大きく向上させるために、一連の抽出動作を繰り返すことが有効であることが立証された。

１オンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステム
２移動相供給部
４ＳＦＥ部
６オートサンプラ
８分析カラム
１０，１２背圧制御バルブ（ＢＰＲ）
１４検出器
１６二酸化炭素ポンプ
１８モディファイアポンプ
２０抽出容器
２２，２４流路切替バルブ
２６カラムオーブン
２８制御部
３０抽出部
３２分析部

Claims

超臨界状態の二酸化炭素とモディファイアからなる移動相溶媒を供給するための移動相供給部、試料が封入され、前記移動相供給部から供給される前記移動相溶媒によって前記試料から成分を抽出するための抽出容器、前記試料から抽出された成分の分離を行なうための分析カラム、及び前記分析カラムで分離された成分を検出するための検出器を有し、前記抽出容器内で試料中に含まれる成分を前記移動相溶媒に抽出した後、前記試料から抽出された成分を含む前記移動相溶媒を前記分析カラムに導いて分離し、前記分析カラムで分離された成分を前記検出器により検出するように構成されたオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムを用いたキノン類分析方法であって、
前記抽出容器にキノン類を含む試料を封入する試料封入ステップと、
前記試料封入ステップの後で、前記移動相供給部から、前記試料からキノン類を含む成分を抽出しながら前記分析カラムから前記キノン類を含む成分を溶出させないように調整された第１の移動相溶媒を前記抽出容器に供給し、前記抽出容器内が前記第１の移動相溶媒で満たされた状態で静置した後、前記試料から抽出された成分を含む前記第１の移動相溶媒を前記分析カラムに通液し、前記第１の移動相溶媒に含まれる成分のうち少なくともキノン類を含む成分を前記分析カラムに捕捉させる一連の抽出動作を複数回繰り返して実行し、前記分析カラムにおいて前記キノン類を含む成分を濃縮する抽出ステップと、
前記抽出ステップの後で、前記一連の抽出動作により前記分析カラムに捕捉された成分を前記分析カラムから溶出させるための第２の移動相溶媒を前記移動相供給部から供給して前記分析カラムに通液し、前記分析カラムにおいて濃縮された成分を分離しながら溶出させて前記検出器により検出する分析ステップと、を備え、
前記分析カラムとして、担体にナフチルエチル基を結合させた分離媒体が充填されているナフチルエチル基結合型のカラム、または担体にピレニルエチル基を結合させた分離媒体が充填されているピレニルエチル基結合型のカラムを用い、前記モディファイアとしてアセトニトリルを用いる、
キノン類分析方法。
前記抽出ステップにおいて前記一連の抽出動作を３回以上繰り返す、請求項１に記載のキノン類分析方法。
前記第２の移動相溶媒の前記モディファイアの濃度を前記第１の移動相溶媒よりも高くする、請求項１又は２に記載のキノン類分析方法。
前記分析ステップにおいて、前記第２の移動相溶媒の前記モディファイアの濃度を時間とともに上昇させる、請求項３に記載のキノン類分析方法。
超臨界状態の二酸化炭素とモディファイアからなる移動相溶媒を供給するための移動相供給部、試料が封入され、前記移動相供給部から供給される前記移動相溶媒によって前記試料から成分を抽出するための抽出容器、前記試料から抽出された成分の分離を行なうための分析カラム、及び前記分析カラムで分離された成分を検出するための検出器を有し、前記抽出容器内で試料中に含まれる成分を前記移動相溶媒に抽出した後、前記試料から抽出された成分を含む前記移動相溶媒を前記分析カラムに導いて分離し、前記分析カラムで分離された成分を前記検出器により検出するように構成されたオンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムであって、
当該オンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステムの動作制御を行なう制御部は、
キノン類を含む試料が封入された前記抽出容器に、前記試料からキノン類を含む成分を抽出しながら前記分析カラムから前記キノン類を含む成分を溶出させないように調整された第１の移動相溶媒を供給して前記抽出容器を前記第１の移動相溶媒で満たして静置した後、前記試料から抽出された成分を含む前記抽出容器内の前記第１の移動相溶媒を前記分析カラムに通液し、前記第１の移動相溶媒中の成分のうち少なくともキノン類を含む成分を前記分析カラムに捕捉させる一連の抽出動作を複数回繰り返して実行し、前記分析カラムにおいて前記キノン類を含む成分を濃縮するように構成された抽出部と、
前記一連の抽出動作が複数回繰り返して実行された後で、前記分析カラムにおいて濃縮された成分を前記分析カラムから溶出させるための第２の移動相溶媒を前記分析カラムに通液するように構成された分析部と、を備え、
前記分析カラムは、担体にナフチルエチル基を結合させた分離媒体が充填されているナフチルエチル基結合型のカラムまたは担体にピレニルエチル基を結合させた分離媒体が充填されているピレニルエチル基結合型のカラムであり、前記モディファイアはアセトニトリルである、オンラインＳＦＥ−ＳＦＣシステム。