JP6993076B2

JP6993076B2 - 皮下組織構造の改善成分のスクリーニング方法

Info

Publication number: JP6993076B2
Application number: JP2015252345A
Authority: JP
Inventors: 綾坂田; まゆみ宍戸; 靖子原田
Original assignee: Pola Chemical Industries Inc
Current assignee: Pola Orbis Holdings Inc
Priority date: 2015-12-24
Filing date: 2015-12-24
Publication date: 2022-01-13
Anticipated expiration: 2035-12-24
Also published as: JP2017112918A

Description

本発明は、皮下組織構造の改善成分のスクリーニング方法に関する。

加齢で顕著となる皮膚のタルミやシワは、皮膚の弾力性低下がその原因の一つと考えられている。従来、皮膚の弾力性を改善する方法として、例えば、皮膚の弾力性保持に重要な役割を果たすコラーゲンやヒアルロン酸等の細胞外マトリックスの産生を促進又は分解を抑制する技術や（特許文献１）、細胞外マトリックスを産生する真皮線維芽細胞の増殖を促進する技術（特許文献２）が知られている。しかしながら、皮膚直下に存在する皮下組織の構造を改善することでタルミやシワを改善する方法についてはこれまで報告がない。

本発明者らは、皮下組織に存在する皮膚支帯（Ｒｅｔｉｎａｃｕｌａｃｕｔｉｓ）と呼ばれる網目状の線維構造に着目し、顔のタルミとの関連性について検討した結果、皮膚支帯が疎になることにより皮膚深部の弾力性が低下し、タルミが引き起こされる可能性を見出している（非特許文献１）。また、額及び目尻において、深いシワ部位直下の皮下組織では皮膚支帯密度が減少していることが知られている（非特許文献２）。非特許文献１や２の記載から、皮膚支帯の密度を高めることができれば、タルミやシワの改善につながることが推定される。しかしながら、これまでは皮膚支帯の構成成分やその産生細胞、皮膚支帯の密度の変化のメカニズムについては知見がなかったし、皮膚支帯の密度の変化の原因を高める成分の探索も行われていなかった。

特開2006-257101号公報特開2008-105983号公報

Sakata A., et al. :"Breakthrough in improving the skin sagging with focusing on the subcutaneous tissue structure, retinacula cutis", 23rd IFSCC, Zurich (2015) Tsukahara K. et al., Arch Dermatol. (2012), 148, 39-46

本発明は、新規な皮下組織構造の改善成分のスクリーニング方法を提供することを課題とする。本発明は、抗老化に有用な成分、特に、皮膚のタルミ及びシワの改善に有効な成分のスクリーニング方法を提供することを課題とする。また、本発明は、皮膚支帯成分の発現促進剤を提供することも課題とする。

本発明者らは、鋭意研究の結果、皮膚支帯の構成成分、及び当該構成成分を産生する細胞種を特定した。さらに、皮膚支帯を構成する特定の成分が加齢で減少することを見出した。そして、加齢で減少する皮膚支帯成分の発現量を指標とすることで皮下組織構造の改善成分をスクリーニングすることが可能であることを見出し、本発明を完成させた。

前記課題を解決する本発明は、細胞における皮膚支帯成分の発現量を指標として、皮下組織構造の改善成分をスクリーニングすることを特徴とする、スクリーニング方法である。
特に、本発明は、抗老化効果を有する成分、特にタルミ改善成分及びシワ改善成分をスクリーニングするのに有用である。

本発明の好ましい形態では、前記細胞は、線維芽細胞及び腱細胞から選ばれる少なくとも１種である。

本発明の好ましい形態では、前記細胞は、皮膚支帯に存在する細胞である。

本発明の好ましい形態では、前記皮膚支帯成分として、加齢で減少する、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、アネキシンＡ２（ＡｎｎｅｘｉｎＡ２）、バイグリカン（Ｂｉｇｌｙｃａｎ）、ビンキュリン（Ｖｉｎｃｕｌｉｎ）及びミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ４、ＭＦＡＰ４）から選ばれる少なくとも１種を選択する。
これらの何れかの皮膚支帯成分の発現量を指標とすることで、効率よく皮下組織構造の改善成分をスクリーニングすることが可能となる。

本発明によれば、皮膚支帯を密にするという、新たな作用機序に基づく皮下組織構造の改善に有効な成分を探索することができる。

＜１＞スクリーニング方法
本発明のスクリーニング方法は、細胞における皮膚支帯成分の発現量を指標として、皮下組織構造の改善成分をスクリーニングすることを特徴とする。ここで、スクリーニングとは、皮下組織構造の改善成分又はその候補を探索することを含む。

皮下組織構造の改善成分としては、抗老化効果を有する成分、特にシワ改善、タルミ改善、ハリの低下防止、肌の弾力性の低下防止効果を有する成分を挙げることができる。ここで、タルミとは、皮膚および皮下組織の弾力性の低下によって生ずる肌の変形をさす。

本発明のスクリーニング方法において用いる細胞としては、線維芽細胞及び腱細胞から選ばれる少なくとも１種が好ましい。本発明者らは、皮膚支帯中に細胞が存在していることを見出し、これらの細胞が線維芽細胞及び腱細胞の両者を含むことを見出している。そのため、これらの少なくとも１種の細胞を用いることが、皮膚支帯成分の発現量の測定に効率的である。また、これらの両者を用いることも好ましい。

皮膚支帯成分としては、以下から選ばれる少なくとも１種が挙げられる。
ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、アネキシンＡ２（ＡｎｎｅｘｉｎＡ２）、バイグリカン（Ｂｉｇｌｙｃａｎ）、ビンキュリン（Ｖｉｎｃｕｌｉｎ）、ミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ４、ＭＦＡＰ４）、６型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅ６）、１型コラーゲン（Ｃｏｌｌａｇｅｎｔｙｐｅ１）、アネキシンＡ５（ＡｎｎｅｘｉｎＡ５）、デコリン（Ｄｅｃｏｒｉｎ）、ルミカン（Ｌｕｍｉｃａｎ）、プロラルギン（Ｐｒｏｌａｒｇｉｎ）。
中でも、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、アネキシンＡ２（ＡｎｎｅｘｉｎＡ２）、バイグリカン（Ｂｉｇｌｙｃａｎ）、ビンキュリン（Ｖｉｎｃｕｌｉｎ）、及びミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ４、ＭＦＡＰ４）、は、加齢に伴い減少する成分であることから、これらの成分から選ばれる少なくとも１種の発現量を指標とすることが、皮下組織構造の改善成分のスクリーニングの観点から好ましい。

本発明のスクリーニング方法は、細胞の培養系に被験物質を添加し、細胞における皮膚支帯成分の発現量を測定することを含む。具体的には、被験物質を添加して培養した細胞における皮膚支帯成分の発現量が、被験物質を添加しないで培養した細胞における皮膚支帯成分の発現量と比較して統計的に有意に大きい場合に、前記被験物質は皮下組織構造の改善成分の候補として判定することが可能である。具体的には、被験物質を添加しないで培養した細胞における皮膚支帯成分の発現量の１倍より大きい場合に、皮下組織構造の改善成分の候補として選択することが可能である。

皮膚支帯成分の発現量は、ｍＲＮＡ測定、免疫組織学化学的解析等の常法により測定することができる。
例えば、前記皮膚支帯成分をコードする遺伝子の発現量は、当該遺伝子の配列に特異的に結合する配列を有するＤＮＡ断片をプライマーとして用いてＰＣＲを行い、定量的な検出を行う。なお、前記皮膚支帯成分をコードする遺伝子配列は、公開されているので、当業者は適宜プライマーを設計することが可能である。
また、前記各皮膚支帯成分の抗体についても市販品が存在するので、これを用いて、細胞における発現量を測定することができる。

本発明のスクリーニング方法が対象とする被験物質は、純物質、動植物由来の抽出物、又はそれらの混合物等のいずれであってもよい。
動植物由来の抽出物は、動物又は植物由来の抽出物自体のみならず、抽出物の画分、精製した画分、抽出物乃至は画分、精製物の溶媒除去物の総称を意味するものとし、植物由来の抽出物は、自生若しくは生育された植物、漢方生薬原料等として販売されるものを用いた抽出物、市販されている抽出物等が挙げられる。
抽出操作は、植物部位の全草を用いるほか、植物体、地上部、根茎部、木幹部、葉部、茎部、花穂、花蕾等の部位を使用することできるが、予めこれらを粉砕あるいは細切して抽出効率を向上させることが好ましい。抽出溶媒としては、水、エタノール、イソプロピルアルコール、ブタノールなどのアルコール類、１，３－ブタンジオール、ポリプロピレングリコールなどの多価アルコール類、アセトン、メチルエチルケトンなどのケトン類、ジエチルエーテル、テトラヒドロフランなどのエーテル類等の極性溶媒から選択される１種乃至は２種以上が好適なものとして例示することができる。具体的な抽出方法としては、例えば、植物体等の抽出に用いる部位乃至はその乾燥物１質量に対して、溶媒を１～３０質量部加え、室温であれば数日間、沸点付近の温度であれば数時間浸漬し、室温まで冷却し後、所望により不溶物及び／又は溶媒除去し、カラムクロマトグラフィー等で分画精製する方法が挙げられる。

＜２＞皮膚支帯成分の発現促進剤
本発明の皮膚支帯成分の発現促進剤は、本発明のスクリーニング法によって探索された成分のうち、医薬部外品、化粧料及び食品に使用することが可能な成分からなる。具体例としては、以下の植物抽出物を例示できる。
ニンジンエキス、シソエキス、ドクダミエキス、センブリエキス、イザヨイバラエキス、オウレンエキス、キウイエキス、アロエエキス、クワエキス、ダマスクバラ花水
複数のタンパク質の発現促進作用が確認された成分を含有させる態様、また、異なるタンパク質の発現促進作用を有する２種以上の成分を組み合わせて含有させる態様も好ましく挙げられる。

本発明の皮膚支帯成分の発現促進剤は、製剤化に用いられる任意の成分と適宜組み合わせて、外用剤又は経口剤の形態とすることが好ましい。外用剤としては、例えば、化粧料、医薬部外品、皮膚外用医薬等の形態が挙げられる。また、それらの剤形は特に制限されない。中でも、皮膚支帯成分の発現を促進させるという用途との関係から、継続的に使用可能な化粧料の形態が好ましく、中でも、化粧水、美容液、乳液、クリーム、ジェル、サンケア品等の形態が好ましい。
また、経口剤としては、錠剤、顆粒剤、ドリンク剤等の剤形を有するサプリメントの形態が好ましい。

外用剤における皮膚支帯成分の発現促進剤の含有量（抽出物の場合は乾燥質量）は、通常、０．００００１質量％以上、好ましくは０．０００１質量％以上、より好ましくは０．００１質量％以上であり、通常８０質量％以下、好ましくは３０質量％以下、より好ましくは１０質量％以下である。上記範囲とすることで、好適にシワ改善、タルミ改善、ハリの低下防止、肌の弾力性の低下防止効果を奏する。
また、皮膚支帯成分の発現促進剤の種類は、１種類のみでなく２種類以上であってもよい。

また、経口剤の場合には、剤形に応じて、１回あたりの摂取量が抽出物の乾燥質量として、通常、０．１ｍｇ以上、好ましくは１ｍｇ以上、より好ましくは１０ｍｇ以上であり、通常２０００ｍｇ以下、好ましくは１０００ｍｇ以下、より好ましくは５００ｍｇ以下である。

皮膚支帯は、皮膚の形状維持において重要な役割を果たしている。また、皮膚支帯の疎密は、年齢および皮膚のタルミ程度と相関関係を有することを本発明者らは見出している。
従って、本発明の皮膚支帯成分の発現促進剤は、皮下組織構造の改善剤として使用することができる。
特に、本発明の皮膚支帯成分の発現促進剤は、抗老化剤として有用であり、特にシワ改善、タルミ改善、ハリの低下防止、肌の弾力性の低下防止剤としての使用が好ましく、より好ましくは皮膚のタルミ改善剤として使用することが有用である。

皮膚支帯成分の発現促進剤を化粧料に用いる場合、通常化粧料に使用される成分を広く配合することが可能であり、また、その剤形や用途についても、何ら限定されない。以下、化粧料に適用される場合、化粧料中に含有させることができる他の成分について説明する。

化粧料においては、前述したスクリーニング方法により有効成分として探索された皮膚支帯成分の発現促進剤に加え、美白成分、他のシワ改善成分、抗炎症成分等を配合することができる。
美白成分としては、一般的に化粧料に用いられているものであれば特に限定はない。例えば、４－ｎ－ブチルレゾルシノール、アスコルビン酸グルコシド、３－О－エチルアスコルビン酸、トラネキサム酸、アルブチン、１－トリフェニルメチルピペリジン、１－トリフェニルメチルピロリジン、２－（トリフェニルメチルオキシ）エタノール、２－（トリフェニルメチルアミノ）エタノール、２－（トリフェニルメチルオキシ）エチルアミン、トリフェニルメチルアミン、トリフェニルメタノール、トリフェニルメタン及びアミノジフェニルメタン、Ｎ－（ｏ－トルオイル）システイン酸、Ｎ－（ｍ－トルオイル）システイン酸、Ｎ－（p－トルイル）システイン酸、Ｎ－（p－メトキシベンゾイル）システイン酸等が挙げられる。更にその他の美白成分として、Ｎ－ベンゾイル－セリン、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－エチルベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－メトキシベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－フルオロベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－トリフルオロメチルベンゾイル）セリン、Ｎ－（２－ナフトイル）セリン、Ｎ－（４－フェニルベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）セリンメチルエステル、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）セリンエチルエステル、Ｎ－（２－ナフトイル）セリンメチルエステル、Ｎ－ベンゾイル－Ｏ－メチルセリン、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）－Ｏ－メチルセリン、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）－Ｏ－アセチルセリン、Ｎ－（２－ナフトイル）－Ｏ－メチルセリン等があげられる。
これらの美白成分は、既に市販されているものもあれば、合成により入手することもできる。例えば、３－О－エチルアスコルビン酸は、特開平８－１３４０５５号公報に記載の公知の方法で合成することが出来る。市販品（日本精化製「ＶＣエチル」）もあるので、これらを入手して使用することが可能である。１－トリフェニルメチルピペリジン、１－トリフェニルメチルピロリジン、２－（トリフェニルメチルオキシ）エタノール、２－（トリフェニルメチルアミノ）エタノール、２－（トリフェニルメチルオキシ）エチルアミン、トリフェニルメチルアミン、トリフェニルメタノール、トリフェニルメタン、アミノジフェニルメタンは特許文献ＷＯ２０１０―０７４０５２号パンフレットに、Ｎ－（ｏ－トルオイル）システイン酸、Ｎ－（ｍ－トルオイル）システイン酸、Ｎ－（ｐ－トルイル）システイン酸、Ｎ－（ｐ－メトキシベンゾイル）システイン酸、Ｎ－（４－フェニルベンゾイル）システイン酸、Ｎ－（ｐ－トルオイル）ホモシステイン酸、はＷＯ２０１１－０５８７３０号パンフレットに、Ｎ－ベンゾイル－セリン、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－エチルベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－メトキシベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－フルオロベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－トリフルオロメチルベンゾイル）セリン、Ｎ－（２－ナフトイル）セリン、Ｎ－（４－フェニルベンゾイル）セリン、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）セリンメチルエステル、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）セリンエチルエステル、Ｎ－（２－ナフトイル）セリンメチルエステル、Ｎ－ベンゾイル－Ｏ－メチルセリン、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）－Ｏ－メチルセリン、Ｎ－（ｐ－メチルベンゾイル）－Ｏ－アセチルセリン、Ｎ－（２－ナフトイル）－Ｏ－メチルセリン等はＷＯ２０１１／０７４６４３号パンフレットに、それぞれその合成方法が公開されているので、該開示に従い合成することができる。
化粧料における美白成分の含有量は、通常０．０００１～３０質量％であり、０．００１～１０質量％が好ましく、０．０１～５質量％がより好ましい（抽出物の場合は乾燥質量）。

シワ改善成分としては、一般的に化粧料に用いられているものであれば特に限定はない。ただし、皮膚支帯の発現促進とは異なるメカニズムでシワ改善効果を有する成分を用いることが、各成分の作用効果を存分に生かす観点から好ましい。例えば、ビタミンＡ又はその誘導体としてレチノール、レチナール、レチノイン酸、トレチノイン、イソトレチノイン、レチノイン酸トコフェロール、パルミチン酸レチノール、酢酸レチノールが挙げられる。また、ウルソール酸ベンジルエステル、ウルソール酸リン酸エステル、ベツリン酸ベンジルエステル、ベンジル酸リン酸エステルが挙げられる。化粧料における皮膚支帯の発現促進剤の他のシワ改善成分の含有量は、通常０．０００１～３０質量％であり、０．００１～１０質量％が好ましく、０．０１～５質量％がより好ましい（抽出物の場合は乾燥質量）。

抗炎症成分としては、クラリノン、グラブリジン、グリチルリチン酸、グリチルレチン酸、パントテニルアルコール等が挙げられ、好ましくは、グリチルリチン酸及びその塩、グリチルレチン酸アルキル及びその塩、並びに、グリチルレチン酸及びその塩が好ましく挙げられる。
化粧料中における抗炎症成分の含有量は、通常０．０１～３０質量％であり、０．１～１０質量％が好ましく、１～５質量％がより好ましい（抽出物の場合は乾燥質量）。

また、一般的に医薬品、化粧料、食品等に用いられている動植物由来の抽出物を用いることが好ましい。例えば、アケビエキス、アスナロエキス、アスパラガスエキス、アボガドエキス、アマチャエキス、アーモンドエキス、アルニカエキス、アロニアエキス、アンズエキス、イチョウエキス、インドキノエキス、ウイキョウエキス、ウドエキス、エゾウコギエキス、エンメイソウエキス、オウバクエキス、オタネニンジンエキス、オドリコソウエキス、オレンジエキス、カキョクエキス、カッコンエキス、カモミラエキス、カロットエキス、カワラヨモギエキス、カンゾウエキス、キウイエキス、キューカンバーエキス、グアバエキス、クチナシエキス、クマザサエキス、クララエキス、クルミエキス、グレープフルーツエキス、黒米エキス、クロレラエキス、クワエキス、ケイケットウエキス、ゲットウヨウエキス、ゲンチアナエキス、紅茶エキス、コメエキス、コメ発酵エキス、コメヌカ発酵エキス、コメ胚芽油、コケモモエキス、サルビアエキス、サボンソウエキス、ササエキス、サンシャエキス、サンショウエキス、シイタケエキス、ジオウエキス、シコンエキス、シソエキス、シナノキエキス、シモツケソウエキス、ショウキョウエキス、ショウブ根エキス、スギナエキス、ステビアエキス、ステビア発酵物、セイヨウサンザシエキス、セイヨウニワトコエキス、セイヨウノコギリソウエキス、セイヨウハッカエキス、セージエキス、ゼニアオイエキス、センキュウエキス、センブリエキス、ソウハクヒエキス、ダイオウエキス、ダイズエキス、タイソウエキス、タイムエキス、タンポポエキス、茶エキス、チョウジエキス、チンピエキス、甜茶エキス、トウガラシエキス、トウキエキス、トウキンセンカエキス、トウニンエキス、トマトエキス、納豆エキス、ニンジンエキス、ニンニクエキス、ノバラエキス、ハイビスカスエキス、バクモンドウエキス、ハスエキス、パセリエキス、バーチエキス、ハマメリスエキス、ヒキオコシエキス、ヒノキエキス、ビワエキス、フキタンポポエキス、フキノトウエキス、ブクリョウエキス、ブドウエキス、ブドウ種子エキス、ヘチマエキス、ペパーミントエキス、ボダイジュエキス、マツエキス、ミズバショウエキス、メリッサエキス、モズクエキス、モモエキス、ヤグルマギクエキス、ユーカリエキス、ユズエキス、ユリエキス、ヨクイニンエキス、ヨモギエキス、ラベンダーエキス、緑茶エキス、リンゴエキス、ルイボス茶エキス、レイシエキス、レタスエキス、レモンエキス、レンギョウエキス、レンゲソウエキス、ローズエキス、ローズマリーエキス、ローマカミツレエキス、ローヤルゼリーエキス、ワレモコウエキス等のエキスが好ましいものとして挙げられる。
化粧料中における前記任意の動植物由来抽出物の含有量（乾燥質量）は、通常０．０１～３０質量％であり、０．１～１０質量％が好ましく、０．３～３質量％がより好ましい。
食品中における前記任意の動植物抽出物の含有量（乾燥質量）は、通常０．０１～８０質量％であり、０．１～５０質量％が好ましく、１～３０質量％がより好ましい。

また、化粧料には、前述した有効成分以外に通常化粧料で使用される任意成分としては、ポリエチレングリコール、グリセリン、１，３－ブチレングリコール、エリスリトール、ソルビトール、キシリトール、マルチトール、プロピレングリコール、ジプロピレングリコール、ジグリセリン、イソプレングリコール、１，２－ペンタンジオール、２，４－ヘキシレングリコール、１，２－ヘキサンジオール、１，２－オクタンジオール等のポリオール、脂肪酸セッケン（ラウリン酸ナトリウム、パルミチン酸ナトリウム等）、ラウリル硫酸カリウム、アルキル硫酸トリエタノールアミンエーテル等のアニオン界面活性剤類、塩化ステアリルトリメチルアンモニウム、塩化ベンザルコニウム、ラウリルアミンオキサイド等のカチオン界面活性剤類、イミダゾリン系両性界面活性剤（２－ココイル－２－イミダゾリニウムヒドロキサイド－１－カルボキシエチロキシ２ナトリウム塩等）、ベタイン系界面活性剤（アルキルベタイン、アミドベタイン、スルホベタイン等）、アシルメチルタウリン等の両性界面活性剤類、ソルビタン脂肪酸エステル類（ソルビタンモノステアレート、セスキオレイン酸ソルビタン等）、グリセリン脂肪酸類（モノステアリン酸グリセリン等）、プロピレングリコール脂肪酸エステル類（モノステアリン酸プロピレングリコール等）、硬化ヒマシ油誘導体、グリセリンアルキルエーテル、ＰＯＥソルビタン脂肪酸エステル類（ＰＯＥソルビタンモノオレエート、モノステアリン酸ポリオキエチレンソルビタン等）、ＰＯＥソルビット脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－ソルビットモノラウレート等）、ＰＯＥグリセリン脂肪酸エステル類（ＰＯＥ－グリセリンモノイソステアレート等）、ＰＯＥ脂肪酸エステル類（ポリエチレングリコールモノオレート、ＰＯＥジステアレート等）、ＰＯＥアルキルエーテル類（ＰＯＥ２－オクチルドデシルエーテル等）、ＰＯＥアルキルフェニルエーテル類（ＰＯＥノニルフェニルエーテル等）、プルロニック型類、ＰＯＥ・ＰＯＰアルキルエーテル類（ＰＯＥ・ＰＯＰ２－デシルテトラデシルエーテル等）、テトロニック類、ＰＯＥヒマシ油・硬化ヒマシ油誘導体（ＰＯＥヒマシ油、ＰＯＥ硬化ヒマシ油等）、ショ糖脂肪酸エステル、アルキルグルコシド等の非イオン界面活性剤類、ピロリドンカルボン酸ナトリウム、乳酸、乳酸ナトリウム等の保湿成分類、表面処理されていても良い、マイカ、タルク、カオリン、合成雲母、炭酸カルシウム、炭酸マグネシウム、無水ケイ酸（シリカ）、酸化アルミニウム、硫酸バリウム等の粉体類、表面処理されていても良い、酸化コバルト、群青、紺青、酸化亜鉛の無機顔料類、表面処理されていても良い、酸化鉄二酸化チタン焼結体等の複合顔料、表面処理されていても良い、雲母チタン、魚燐箔、オキシ塩化ビスマス等のパール剤類、レーキ化されていても良い赤色２０２号、赤色２２８号、赤色２２６号、黄色４号、青色４０４号、黄色５号、赤色５０５号、赤色２３０号、赤色２２３号、橙色２０１号、赤色２１３号、黄色２０４号、黄色２０３号、青色１号、緑色２０１号、紫色２０１号、赤色２０４号等の有機色素類、ポリエチレン末、ポリメタクリル酸メチル、ナイロン粉末、オルガノポリシロキサンエラストマー等の有機粉体類、エタノール、イソプロパノール等の低級アルコール類、ビタミンＡ又はその誘導体、ビタミンＢ_６塩酸塩，ビタミンＢ_６トリパルミテート，ビタミンＢ_６ジオクタノエート，ビタミンＢ_２又はその誘導体，ビタミンＢ_１２，ビタミンＢ_１５又はその誘導体等のビタミンＢ類、α－トコフェロール，β－トコフェロール，γ－トコフェロール，ビタミンＥアセテート等のビタミンＥ類、ビタミンＤ類、ビタミンＨ、パントテン酸、パンテチン、ピロロキノリンキノン等のビタミン類が挙げられる。

＜試験例１＞真皮由来線維芽細胞を用いたスクリーニング
ヒト正常真皮線維芽細胞を、１０％ＦＢＳ／ＤＥＭＥ培地で２４穴プレートに２．０×１０⁴個／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％、ＣＯ₂環境下で２４時間培養した。
播種２４時間後、被験物質として、種々の植物抽出エキスを添加した（最終濃度０．５質量％）。
２４時間後、培地を除きＰＢＳで洗浄し、ＦａｓｔＬａｎｅＣｅｌｌＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｍＲＮＡを回収し、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）でｃＤＮＡを合成した。
ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＰｒｉｍｅｒＡｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて定量的ＲＴ－ＰＣＲを行い、加齢で減少する皮膚支帯構成タンパク質であるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、アネキシンＡ２（ＡｎｎｅｘｉｎＡ２）、バイグリカン（Ｂｉｇｌｙｃａｎ）、ビンキュリン（Ｖｉｎｃｕｌｉｎ）、ミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ４、ＭＦＡＰ４）をコードする遺伝子のｍＲＮＡ量を測定した。
前述のｍＲＮＡ発現量は、β－ａｃｔｉｎを内在性コントロールとして比較ＣＴ法により算出し、被験物質非添加のヒト正常真皮線維芽細胞における目的のｍＲＮＡ発現量を「１」とした場合の相対値として結果を表１に示した。

表１より、キウイエキスを添加することによって、Ｂｉｇｌｙｃａｎ遺伝子の発現が促進されることが明らかとなった。また、アロエエキス、クワエキスをそれぞれ添加することによって、Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ４（ＭＦＡＰ４）遺伝子の発現が促進されることが明らかとなった。また、ダマスクバラ花水を添加することによって、Ｖｉｎｃｕｌｉｎ遺伝子の発現が促進されることが明らかとなった。以上の抽出物は、皮下組織構造の改善成分の候補物質と判定することができる。

＜試験例２＞腱細胞を用いたスクリーニング
ヒト腱由来腱細胞を、専用培地でコラーゲンＩコート２４穴プレートに２．０×１０⁴個／ウェルとなるように播種し、３７℃、５％、ＣＯ₂環境下で２４時間培養した。
播種２４時間後、被験物質として、種々の植物抽出エキスを添加した（最終濃度０．５質量％）。
２４時間後、培地を除きＰＢＳで洗浄し、ＦａｓｔＬａｎｅＣｅｌｌＲＴ－ＰＣＲＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いてｍＲＮＡを回収し、ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＫｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）でｃＤＮＡを合成した。
ＱｕａｎｔｉＴｅｃｔＰｒｉｍｅｒＡｓｓａｙ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて定量的ＲＴ－ＰＣＲを行い、加齢で減少する皮膚支帯構成タンパク質であるミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、アネキシンＡ２（ＡｎｎｅｘｉｎＡ２）、バイグリカン（Ｂｉｇｌｙｃａｎ）、ビンキュリン（Ｖｉｎｃｕｌｉｎ）、ミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ４、ＭＦＡＰ４）をコードする遺伝子のｍＲＮＡ量を測定した。
前述のｍＲＮＡ発現量は、β－ａｃｔｉｎを内在性コントロールとして比較ＣＴ法により算出し、被験物質非添加のヒト腱由来細胞における目的のｍＲＮＡ発現量を「１」とした場合の相対値として、結果を表２に示した。

表２より、ニンジンエキス、シソエキスをそれぞれ添加することによって、Ｂｉｇｌｙｃａｎ遺伝子の発現が促進されることが明らかとなった。また、ドクダミエキスを添加することによって、Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ４（ＭＦＡＰ４）遺伝子の発現が促進されることが明らかとなった。また、センブリエキス、イザヨイバラエキスをそれぞれ添加することによって、Ｖｉｎｃｕｌｉｎ遺伝子の発現が促進されることが明らかとなった。また、オウレンエキスを添加することによって、Ｍｉｍｅｃａｎ遺伝子の発現が促進されることが明らかとなった。以上の抽出物は、皮下組織構造の改善成分の候補物質と判定することができる。

本発明は、化粧料やサプリメントの処方設計に応用できる。

Claims

腱細胞における皮膚支帯成分の発現量を指標として、皮下組織構造の改善成分の候補物質をスクリーニングすることを特徴とする、スクリーニング方法。
前記皮膚支帯成分が、ミメカン（Ｍｉｍｅｃａｎ）、アネキシンＡ２（ＡｎｎｅｘｉｎＡ２）、バイグリカン（Ｂｉｇｌｙｃａｎ）、ビンキュリン（Ｖｉｎｃｕｌｉｎ）及びミクロフィブリル結合タンパク質４（Ｍｉｃｒｏｆｉｂｒｉｌｌａｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ４、ＭＦＡＰ４）から選ばれる少なくとも１種であることを特徴とする、請求項１に記載のスクリーニング方法。
前記皮下組織構造の改善成分が、抗老化効果を有する成分であることを特徴とする、請求項１又は２に記載のスクリーニング方法。
前記抗老化効果が、シワ改善、タルミ改善、ハリの低下防止、肌の弾力性の低下防止からなる群から選択される1種以上の効果であることを特徴とする、請求項３に記載のスクリーニング方法。