JP7000314B2 - 免疫療法における使用のためのポリエピトープ構築物 - Google Patents

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Description

本発明は、免疫療法及びワクチン接種の分野に関する。
発明の背景
抗癌効率の良いＴ細胞ベースの免疫療法は、腫瘍特異的抗原を認識するＣＤ８及びＣＤ４の両方の腫瘍反応性Ｔ細胞応答を含まなければならない。ＣＤ８細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）を発現する腫瘍細胞に対して細胞傷害活性を示すため、細胞媒介性免疫応答の主要な役者であると考えられている。しかし、この免疫応答は、ＣＤ４ Ｔヘルパー１（Ｔｈ１）細胞が同時に刺激される場合にだけ効率的である。これらのＣＤ４細胞は、複数の相互作用を通じた助けを提供し、全体的な抗腫瘍応答を調整することにより、腫瘍に対するＣＤ８ Ｔ細胞の誘導及び維持のために決定的である（Shedlock and Shen, 2003）。結果的に、複数のＴＡＡからのＭＨＣクラスＩ及びＩＩエピトープの同定に集中してきた（Cheever MA, et al., 2009）。過去数年の間に、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）が最初の一般的な腫瘍抗原として現れ、癌免疫療法のための普遍的な標的として積極的に研究されている。ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）は、染色体末端でテロメアＤＮＡを合成するテロメラーゼ酵素の触媒サブユニットである。ｈＴＥＲＴは、多様な癌表現型からのヒト腫瘍の８５%超で過剰発現し、正常な体細胞ではほとんど又は全く発現しない（Shay and Bacchetti, 1997）。
ＣＤ８エピトープを主に標的とするｈＴＥＲＴペプチドワクチン製剤での臨床試験では、ｈＴＥＲＴ特異的免疫応答が癌患者において安全に誘発され、短期間の臨床転帰に対して顕著な影響を有することが例証されている（Bernhardt et al., 2006; Bolonaki et al, 2007）。しかし、この治療的アプローチでは、持続的な免疫応答の非存在のため、長期的な臨床的利益を誘導することに失敗した。ＣＤ８エピトープ、特に短いペプチドを標的とすることを目的としたｈＴＥＲＴペプチドワクチンで得られた記憶応答は非常に低く持続的ではなかった。これらの最適以下の結果は、ＣＤ４ Ｔ細胞の低レベル又は非存在により部分的に説明することができる。
感染因子又は腫瘍、特に弱い免疫原性抗原を発現するものに対する効果的な治療用ワクチンについての必要性が依然としてある。
発明の概要
本発明者らは、テロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）の特定のエピトープに制限されたペプチド（長いペプチドさえも）ワクチン接種の欠点を示さないＤＮＡワクチン戦略を開発した。特に、ＤＮＡワクチン接種により、タンパク質産生及び精製のための高価で複雑な手順が回避される。本発明の構築物により、安全であり、より良好な定量的及び定性的免疫応答を誘導しながら、患者のＨＬＡ制限に非依存的にＣＴＬ及びＣＤ４ヘルパーＴ細胞の両方が誘導される。
本発明の主題は、少なくとも２つのテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のＣＤ４エピトープ及び少なくとも１つの腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８エピトープをコードするＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物である。
第１の実施形態によれば、ｉ）前記少なくとも２つのＴＥＲＴのＣＤ４エピトープをコードするＤＮＡ発現ベクター、及びｉｉ）前記少なくとも１つの腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８エピトープをコードする少なくとも１つのＤＮＡ発現ベクターを含むＤＮＡ発現ベクターの混合物を提供する。
別の実施形態によれば、前記少なくとも２つのＴＥＲＴのＣＤ４エピトープ及び前記少なくとも１つの腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８エピトープをコードするＤＮＡ発現ベクターを提供する。
本発明の別の主題は、
ａ．前記少なくとも２つのＴＥＲＴのＣＤ４エピトープをコードする少なくとも１つのＤＮＡ発現ベクターを含む第１の容器、及び
ｂ．前記腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８エピトープをコードする少なくとも１つのＤＮＡ発現ベクターを含む第２の容器を含むキットである。
前記ＤＮＡ発現ベクター、ＤＮＡ発現ベクターの混合物、又はキットは、患者における腫瘍又は感染を処置する際に有用である。
図１：ｐＵＣＰｂａｓｉｃプラスミドマップ 以下の表１は詳細な凡例を示す。
Figure 0007000314000001
図２：ｐＵＣＰ２（４×）プラスミドマップ 以下の表２は詳細な凡例を示す。
Figure 0007000314000002
図３：ｐＤＥ７プラスミドマップ 以下の表３は詳細な凡例を示す。
Figure 0007000314000003
図４：制限マッピングによるＤＮＡ構築物の検証 発現ベクターを制限マッピングにより検証した。それらのパターンは予測される制限マップに対応する。 レーンＭ：１ｋｂラダー（Eurogentec）；レーン１：ｐＵＣＰｂａｓｉｃ（３６９，５３４８bp）；レーン２：ｐＵＣＰ２（４×）（３６３，５３５４bp）；レーン３：ｐＤＥ７（３５４，５３４５bp） 図５：ウエスタンブロッティングにより評価したＨＥＫ２９３Ｔ細胞株におけるインビトロでのＵＣＰｂａｓｉｃ、ＵＣＰ２（４×）及びＤＥ７ポリペプチド／タンパク質の発現 タンパク質発現をＨＥＫ２９３Ｔ細胞におけるトランスフェクションの４８時間後にモニターした。（ａ）直接ウェスタンブロッティングアッセイ：取得の２０秒後に検出されたｐＵＣＰｂａｓｉｃ、ｐＵＣＰ２（４×）、ｐＤＥ７及びｐｃＤＮＡ３．１ポリペプチド／タンパク質；βアクチンをローディング対照として使用した。（ｂ）Ｅ７タンパク質の免疫沈降後でのウェスタンブロッティングアッセイ：ｐＤＥ７及びｐｃＤＮＡ３．１でトランスフェクトした細胞から調製した全細胞抽出物を抗Ｖ５アガロースビーズで免疫沈降させた。Ｅ７タンパク質を取得の４分後に検出した。分子量（ＭＷ）マーカーを示す（kDa）。 図６：ｈＴＥＲＴヘルパーエピトープにより、ＨＰＶ１６ Ｅ７抗原に対するＣＤ８ Ｔ細胞応答が増加する マウスを、０日目及び２１日目に非発癌性Ｅ７抗原をコードするＤＮＡ及び空の対照プラスミド（ｐｃＤＮＡ３．１）、ｐＵＣＰ２（４×）、又はｐＵＣＰｂａｓｉｃで同時免疫した。２回目の免疫化の１０日後（Ｄ３１）、脾臓を収集し、ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮ－γアッセイにより分析した。 脾臓におけるｈＴＥＲＴ及びＥ７ ＨＬＡ－ＤＲ１（ａ、ｂ）並びにＥ７ ＨＬＡ－Ａ２（ｃ）制限ＩＦＮ－γ＋Ｔ細胞の頻度の中央値。５－１３：マウス番号。（ｄ）凝集したＨＬＡ－ＤＲ１及びＨＬＡ－Ａ２ ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮ－γの結果。バーはＩＦＮ－γスポットの範囲の中央値を示す。 黒色水平破線はＥＬＩＳｐｏｔ陽性閾値を示す。ｐ値＜０．０５を有意とみなした（不対ｔ検定）。 Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数検定により決定したｐＵＣＰ２（４×）＋ｐＤＥ７（ｅ）及びｐＵＣＰｂａｓｉｃ＋ｐＤＥ７構築物（ｆ）についてのｈＴＥＲＴ ＨＬＡ－ＤＲ１ Ｔ細胞応答及びＥ７ ＨＬＡ－Ａ２ Ｔ細胞応答の間の相関。ｐ値＜０．０５を有意とみなした。 この実験的試験を同じ条件で反復し、同様の結果を得た。 図７：プール１の４つのｈＴＥＲＴ ＨＬＡ－ＤＲ１ペプチドの存在における２４時間培養後の脾細胞培養上清中でのサイトカイン結合アッセイ（ＣＢＡ）によるＴｈ１、Ｔｈ２、及びＴｈ１７サイトカイン産生の検出。pg/mLでのサイトカイン濃度は、平均値±標準偏差として表した。統計分析：ｐＤＥ７＋ｐｃＤＮＡ３．１対照群に対するマンホイットニーノンパラメトリック検定。ｐ値＜０．０５を有意（＊）とみなした。 図８：ｐＵＣＰｂａｓｉｃ挿入配列を示す。 ＵＣＰｂａｓｉｃポリペプチドをコードする導入遺伝子。５つのＡＡ天然隣接配列を伴う４つのＣＤ４＋ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ；受入番号ＮＭ＿１９８２５３）エピトープ、即ちＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、及びＵＣＰ４を一緒に連結する。Ｃ末端配列の１４個のアミノ酸は、Ｖ５エピトープタグをコードする。第１のラインはヌクレオチド配列である；第２のラインは対応するアミノ酸配列である。注釈を配列の上又は下のいずれかに与える。□：停止コドン。 配列をＳＨＯＷＯＲＦ翻訳プログラム（EMBOSS Explorer）により翻訳した。 １－６ サブクローニング用のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位；１３－３１５ ＵＣＰｂａｓｉｃ－ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、及びＵＣＰ４（太字）；３１６－３５７ Ｖ５エピトープタグ；３５８－３６３の２つの停止コドン；３６４－３６９サブクローニング用のＸｈｏＩ制限部位；ヌクレオチド配列を配列番号２１として示し、対応するアミノ酸配列を配列番号２２として示す。 図９はｐＵＣＰ２（４×）挿入配列を示す。 ｐＵＣＰ２（４×）導入遺伝子配列は、各々の側に５つのＡＡ隣接配列を伴う４回反復ＵＣＰ２優性エピトープＫＳＶＷＳＫＬＱＳＩＧＩＲＱＨ（配列番号２、ＴＥＲＴ ５７８－５９２、受入番号ＮＭ＿１９８２５３）を含む。Ｃ末端配列の１４個のアミノ酸は、Ｖ５エピトープタグをコードする。第１のラインはヌクレオチド配列である；第２のラインは対応するアミノ酸配列である。注釈を配列の上又は下のいずれかに与える。□：停止コドン。 配列をＳＨＯＷＯＲＦ翻訳プログラム（EMBOSS Explorer）により翻訳した。 １－６ サブクローニング用のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位；１３－３１５ ＵＣＰ２（４×）－ＵＣＰ２ユニット（太字）；３１６－３５７ Ｖ５エピトープタグ；３５８～３６３ ２つの停止コドン；３６４－３６９ サブクローニング用のＸｈｏＩ制限部位；ヌクレオチド配列を配列番号２３として示し、対応するアミノ酸配列を配列番号２４として示す。 図１０はｐＤＥ７挿入配列を示す。 ＤＥ７タンパク質をコードする導入遺伝子。４つの変異をヒトパピローマウイルス１６型（受入番号ＥＵ８６９３１７）の野生型Ｅ７遺伝子中に導入した。Ｃ末端配列の１４個のアミノ酸は、Ｖ５エピトープタグをコードする。第１のラインはヌクレオチド配列である；第２のラインは対応するアミノ酸配列である。注釈を配列の上又は下のいずれかに与える。□：停止コドン。変化／変異塩基を太字で強調表示する。 配列をＳＨＯＷＯＲＦ翻訳プログラム（EMBOSS Explorer）により翻訳した。 １－６ サブクローニング用のＨｉｎｄＩＩＩ制限部位；１３－３０６ ＤＥ７；３０７－３４８ Ｖ５エピトープタグ；３４９－３５４ ２つの停止コドン；３５５－３６０ サブクローニング用のＸｈｏＩ制限部位；ヌクレオチド配列を配列番号２５として示し、対応するアミノ酸配列を配列番号２６として示す。
発明の詳細な説明
本発明者らは、免疫原性が不良な抗原に対する持続的な免疫応答を誘導するために、普遍的なブースターとして複数のＴＥＲＴ ＣＤ４無差別性ＴヘルパーエピトープをコードするＤＮＡ構築物を使用することを提案する。
本発明者らは、改善されたＥ７ ＣＤ８ Ｔ細胞応答のための助けを提供することができるか否かを研究するために、４つの異なるＣＤ４エピトープ（ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、及びＵＣＰ４、それぞれ配列番号１～４）及びＵＣＰ２免疫優性無差別エピトープのいずれかをそれぞれ４回反復してコードする２つの合成ＤＮＡ ｈＴＥＲＴ由来ＣＤ４ポリエピトープ構築物ｐＵＣＰｂａｓｉｃ及びｐＵＣＰ２（４×）を設計した。ＨＬＡ－Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスにおけるこれらの２つのＤＮＡ構築物のエレクトロポレーション後での皮内（ＩＤ）投与により、優先的にＴｈ１分極された強いｈＴＥＲＴ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞応答がもたらされた。免疫原性が不良なＥ７抗原をコードするプラスミドＤＮＡを同時注入した場合、Ｅ７特異的なＣＤ８ Ｔ細胞応答の大きさが劇的に増加した。
これらの結果に基づき、本発明者らは、（ｉ）ｈＴＥＲＴ由来の合成ＤＮＡ構築物によりコードされるＣＤ４ Ｔヘルパーエピトープが効率的にプロセッシングされ、ＨＬＡ－Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスモデルにおけるＨＬＡ－ＤＲ１の状況で提示され、（ｉｉ）ｈＴＥＲＴ ＣＤ４ Ｔｈ１分極応答が、多様な不良な免疫原性の癌／オンコウイルス抗原又は抗癌クラスＩポリエピトープに対するＣＴＬ応答を大きく増強することができると結論付けた。
定義
テロメラーゼ複合体は、ＲＮＡ鋳型及び、テロメラーゼ活性の主要な決定因子である「テロメラーゼ逆転写酵素」（ＴＥＲＴ）と命名される逆転写酵素を含むタンパク質成分からなる。野生型ヒトテロメラーゼ（又はｈＴＥＲＴ）が公知である（ＧｅｎｅＢａｎｋ受入番号ＮＭ＿１９８２５３）。
１つ又は複数のアミノ酸残基が生物学的に類似の残基により置換されている場合、又はアミノ酸の８０%以上が同一である場合、又は約９０%以上、好ましくは約９５%以上が類似（機能的に同一）である場合、２つのアミノ酸配列は「相同」、「実質的に相同」、又は「実質的に類似」である。好ましくは、類似配列又は相同配列を、アラインメントにより、例えば、ＧＣＧ（Genetics Computer Group, Program Manual for the GCG Package, Version 7、ウィスコンシン州マディソン）パイルアッププログラム、又は当技術分野において公知のプログラムのいずれか（ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡなど）を使用して同定する。
「置換された」又は「改変された」により、天然に生じるアミノ酸から変化又は改変されたアミノ酸を含む。
本明細書で使用する用語「保存的置換」は、ペプチドの全体的な立体構造及び機能を変化させることなく、アミノ酸残基の、別のアミノ酸残基による置換（類似の特性、例えば極性、水素結合能、酸性、塩基性、形状、疎水性、芳香族などを有するアミノ酸によるアミノ酸の置換を含むが、これに限定しない）を意味する。類似の特性を伴うアミノ酸は、当技術分野において周知である。例えば、アルギニン、ヒスチジン、及びリシンは親水性塩基性アミノ酸であり、互換性がありうる。同様に、疎水性アミノ酸であるイソロイシンは、ロイシン、メチオニン、又はバリンで置換してもよい。互いに置換することができる中性親水性アミノ酸には、アスパラギン、グルタミン、セリン、及びスレオニンが含まれる。
用語「単離されたポリヌクレオチド」は、天然に生じる、環境から除去されたポリヌクレオチドとして定義する。例えば、生きた細菌のゲノム又は遺伝子バンクの一部として存在する天然に生じるＤＮＡ分子は単離されないが、例えば、クローニング事象（増幅）の結果として、細菌ゲノムの残りの部分から分離された同じ分子は単離される。典型的には、単離されたＤＮＡ分子には、それが、天然に生じるゲノムにおいて５’又は３’末端で直に連続するＤＮＡ領域（例、コード領域）は含まれない。そのような単離されたポリヌクレオチドは、ベクター又は組成物の一部であってもよく、そのようなベクター又は組成物は、そのようなポリヌクレオチドの天然環境の一部ではないという点において、依然として単離されたとして定義する。
用語「免疫原性」は、それが参照する組成物又は構築物が投与時に免疫応答を誘導することが可能であることを意味する。被験体における「免疫応答」は、先天的で適応性の免疫応答（抗原に対する体液性免疫応答、細胞性免疫応答、又は体液性及び細胞性免疫応答を含む）の発生を指す。「体液性免疫応答」は、抗体により媒介されるものを指す。「細胞性免疫応答」は、Ｔリンパ球により媒介されるものである。それには、活性化Ｔ細胞、白血球、又はその両方により産生されるサイトカイン、ケモカイン、及び類似分子の産生が含まれる。免疫応答は、標準的なイムノアッセイ及び当技術分野において公知の体液性免疫応答の検出のための中和アッセイを使用して決定することができる。
本発明の文脈において、免疫応答は、好ましくは、細胞傷害性ＣＤ８ Ｔ細胞及び／又はＣＤ４ Ｔ細胞の刺激又は増殖を包含し、イムノアッセイ（例えばＥＬＩｓｐｏｔアッセイ、インビボ細胞毒性アッセイ、又はサイトカイン分泌結合アッセイなど）を使用して決定することができる。
本明細書中で使用するように、用語「処置」又は「治療」又は「免疫療法」は、症状の緩和、寛解及び／又は排除、低下及び／又は安定化（例、より進んだ段階への進行の失敗）、ならびに疾患又はその症状の進行における遅延が含まれる。この用語は、このように、癌患者で観察される効率的な抗腫瘍性免疫応答の達成を含む。
本明細書で使用するように、用語「予防」又は「予防する」は、前駆症状の緩和、寛解及び／又は排除、低下及び／又は安定化（例、より進んだ段階への進行の失敗）、即ち、特定の症状が生じる前に疾患の開始を示しうる任意の変化又は初期症状（又は一連の症状）を指す。
「テロメラーゼを過剰発現する」細胞とは、（例、変異又は感染、特にオンコウイルスによる感染時に）テロメラーゼを発現するのに対し、正常な状態では通常発現しない被験体中の細胞を、又は、正常な状態と比較した場合、（例えば、変異又は感染時に）より高いレベルのテロメラーゼを発現する被験体中の細胞を指す。好ましくは、テロメラーゼを過剰発現する細胞は、少なくとも５%、少なくとも１０%、少なくとも２０%、３０%、４０%、５０%、６０%、７０%、８０%又はそれ以上の発現の増加を示す。
「患者」又は「被験体」は、典型的には、任意の年齢、性別、又は状態の重症度の哺乳動物被験体、好ましくはヒト被験体である。非ヒト哺乳動物（ネコ、イヌ、ウマなどを含む）が包含される。
核酸構築物
本明細書では、患者においてワクチン接種を可能にするように設計された核酸構築物を提供する。
第１の実施形態では、ＤＮＡ発現ベクターの混合物は、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つのテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のＣＤ４エピトープ及び少なくとも１つの腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８エピトープをコードする。したがって、混合物は、少なくとも１つの腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８エピトープをコードする少なくとも１つのＤＮＡ発現ベクターとともに、少なくとも２つのＴＥＲＴ ＣＤ４エピトープ（「ポリエピトープ構築物」とも命名される）をコードする少なくとも１つのＤＮＡ発現ベクターを含みうる。
別の実施形態では、単一のＤＮＡ発現ベクターは、少なくとも２つのＴＥＲＴのＣＤ４エピトープ及び少なくとも１つの腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８エピトープをコードする。
本発明のＤＮＡ構築物は、好ましくは二本鎖ＤＮＡであり、単離された形態である。核酸構築物は天然に生じるゲノム核酸ではなく、特にそれはイントロンを含まない。
ＣＤ４エピトープ
ＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物は、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、さらに好ましくは少なくとも４つのＴＥＲＴのＣＤ４エピトープをコードする。
ＴＥＲＴは、好ましくは、ヒトＴＥＲＴ、又は、処置される被験体がネコもしくはイヌである場合、別の種からのＴＥＲＴ（例えばネコＴＥＲＴもしくはイヌＴＥＲＴなど）である。
しかし、本発明のポリエピトープ構築物のいずれも、全長ＴＥＲＴのコード配列や、国際特許出願ＷＯ２０１５／０６３１１７に記載されている「シャッフル」構築物と一致しない。ＴＥＲＴのＣＤ４エピトープ及び構築物は、テロメラーゼ触媒活性を欠く。本発明の構築物は、ＴＥＲＴのＣＤ４エピトープの７０%未満、さらに好ましくは６０%未満、５０%未満、４０%未満をコードする。
特定の実施形態では、ポリエピトープ構築物は、その配列が少なくとも２つ、好ましくは３つ、さらに好ましくは少なくとも４つの異なるＣＤ４ ＴＥＲＴエピトープを含む１６０未満、好ましくは１２０未満のアミノ酸のポリペプチドをコードし、前記エピトープは、場合により、アミノ酸スペーサーにより分離される。
ＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物は、２～３０のＴＥＲＴのＣＤ４エピトープ、好ましくは２～２０、３～１８、３～１５、３～１２、４～１０、又はさらに好ましくは４～８のＴＥＲＴのＣＤ４エピトープをコードする。
用語「ＴＥＲＴのエピトープ」は、抗原決定基であるＴＥＲＴの任意のアミノ酸フラグメントを指し、即ち、それは、免疫系の細胞により認識され、免疫原性であり、即ち、それは免疫応答を誘発することができる。
用語「ＴＥＲＴのＣＤ４エピトープ」は、ＨＬＡクラスＩＩ分子に結合し、ＣＤ４ Ｔ細胞に提示されることが可能であるＴＥＲＴフラグメントを指す。ＴＥＲＴの最も有用なＣＤ４エピトープを「ＵＣＰ」又は「ユニバーサル癌ペプチド」としても言及し、大部分の腫瘍で発現されることを意味する。本発明の構築物によりコードされるＵＣＰは、広範囲のＨＬＡクラスＩＩ対立遺伝子、特にＨＬＡ－ＤＲ対立遺伝子に、しかし、またＨＬＡ－ＤＱ及びＨＬＡ－ＤＰ対立遺伝子にも結合することができる。このペプチドを「ＨＬＡクラスＩＩペプチド」としても言及する。好ましくは、それは、抗ＴＥＲＴ Ｔ細胞により特異的に認識されることができる。ＴＥＲＴのいくつかの免疫原性エピトープ配列が記載されている。例えば、国際特許出願ＷＯ２０１３／１３５５５３を参照のこと。
本発明の構築物によりコードされるＣＤ４エピトープ配列は、ＴＥＲＴに由来する１５～２０アミノ酸のペプチド配列である。好ましくは、ペプチドは、ＴＥＲＴに由来する１５～１７アミノ酸のペプチドである。
本明細書で定義するペプチドは、腫瘍細胞又は抗原提示細胞の表面上の多数のＨＬＡクラスＩＩ分子との複合体として提示されることが可能であり、それにより大部分の患者において有用である。
このペプチドは、テロメラーゼタンパク質に対するＣＤ４ Ｔｈ細胞応答、好ましくはＴｈ１細胞応答を生成することが可能であり、ＣＤ８ Ｔ細胞の細胞傷害活性に対してヘルパー効果を有する。
４つのＣＤ４エピトープが特に興味深い：ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、及びＵＣＰ４。アミノ酸配列を以下の表に示す。
Figure 0007000314000004
他のＣＤ４エピトープには、１つ又は複数の置換による配列番号１、２、３、又は４に由来する実質的に相同なペプチドが含まれる。好ましくは、置換は保存的であり、及び／又はペプチド免疫原性を改善する。
有利には、ＴＥＲＴの前記ＣＤ４エピトープの少なくとも１つは、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、及びＵＣＰ４からなる群より選択する。
特定の実施形態では、ＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物によりコードされる少なくとも２つのＣＤ４エピトープは、互いに異なる。例えば、ベクター又はベクターの混合物は、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、及びＵＣＰ４を含むポリエピトープ配列をコードしうる。
別の特定の実施形態では、ＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物によりコードされるＴＥＲＴの少なくとも２つのＣＤ４エピトープは同一であり、反復する。
例えば、ＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物は、少なくとも２つ、好ましくは少なくとも３つ、好ましくは少なくとも４つのＵＣＰ２エピトープの反復をコードしうる。
複数のエピトープをコードするポリヌクレオチド単位は、任意の順序で連続して配列することができ、即ち、第１のポリヌクレオチド単位の３’末端は、第２のポリヌクレオチド単位の５’末端に直接連結され（以下同様）、連続エピトープのみで構成されるペプチド配列をコードするポリヌクレオチドがもたらされる。複数のエピトープは、代わりに、１アミノ酸スペーサー又はペプチドスペーサーにより分離することができ、即ち、異なるポリヌクレオチド単位が、１又は複数のアミノ酸をそれぞれコードする１又は複数のコドンにより分離されることを意味する。典型的には、ＣＤ４ ＴＥＲＴエピトープは、約４～６個のＧｌｙアミノ酸により分離することができる。
エピトープが配置される順序は、以下の基準に従って、当業者により決定されうる：一部の順序は、ポリヌクレオチドの転写及び／又は翻訳のいずれかを促進しうる、特に三次立体構造が特性に影響する場合、小胞体（ＥＲ）において結果として得られる発現ポリエピトープの輸送を促進しうる、及びいくつかのエピトープ又は類似体におけるポリエピトープのプロセッシングを促進し、重複エピトープのプロセッシングを回避しうる。
実験のセクションでは、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、及びＵＣＰ４（ｐＵＣＰｂａｓｉｃ）並びにＵＣＰ２を４回反復した［ｐＵＣＰ２（４×）］ポリエピトープをブースターとして用いた本発明を例証する。しかし、インシリコ予測によりｈＴＥＲＴタンパク質配列に沿って同定された他のいくつかのｈＴＥＲＴ ＨＬＡ－ＤＲ（クラスＩＩ）エピトープも、ＣＴＬ応答を増強するための優れた候補である（表５）。
Figure 0007000314000005
本発明によれば、用語「ＴＥＲＴのＣＤ４エピトープ」は、上記配列のいずれかを包含する。
ＣＤ８エピトープ：
本発明のベクターによりコードされるＣＤ８エピトープは、抗原に対するＣＤ８ Ｔ細胞応答を活性化することができるペプチドである。好ましくは、前記ＣＤ８エピトープは、ＣＤ８抗腫瘍応答又はウイルス、細菌、又は寄生虫の抗原に対するＣＤ８応答を活性化することができる。特定の実施形態では、ベクターはＭＨＣクラスＩエピトープを含むウイルス、細菌、又は寄生虫の抗原の全部又は一部をコードする。
前記の腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８エピトープを含むベクターは、このように、好ましくは、全長又は実質的に完全な腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８抗原或いはそのＣＤ８エピトープフラグメントをコードする。最も有利には、本発明は前記ＣＤ８抗原の非発癌性変異体を利用する。ＣＤ８エピトープペプチドの例は、以下の抗原に由来する：チロシナーゼ、アルファフェトプロテイン、癌胎児性抗原（ＣＥＡ）、ＣＡ－１２５、ＭＵＣ－１、上皮腫瘍抗原、黒色腫関連抗原、Ｐ１Ａ、ＭＡＲＴ－１／Ｍｅｌａｎ－Ａ及びｇｐ１００／ｐＭｅｌｌ７ならびにチロシナーゼ関連タンパク質ｐｇ７５及びＭＵＭ－１、ＨＥＲ２／ｎｅｕ、ヒトパピローマウイルスタンパク質Ｅ６及びＥ７、サバイビン、ＧｎＴ－Ｖ、ベータカテニン、ＣＤＫ４、ｐ１５、ＭＡＧＥ１、ＭＡＧＥ３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ、ＰＳＭＡ、ＴＡＲＰ、ＳＴＥＡＰ、ＨＴＬＶ－１ Ｔａｘ及びＷＴ１。
ＣＤ８エピトープペプチドの例として、ｇｐ１００．１５４、ＮＡ１７－Ａ．ｎｔ３８、及びＭｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１．２７、ＣＥＡ．５７１、チロシナーゼ３３６８－Ｎ、ｐ５３．６５、Ｈｅｒ２／ｎｅｕ、３６９－３７７、ｇｐ１００．２０９、ｇｐ１００．２８０、ｇｐ１００．４７６、チロシナーゼ３６８－Ｄ、ＭＡＧＥ－３．２７１、及びＨｅｒ２／ｎｅｕ．６５４、ｇｐ１００．４５７、Ｍｅｌａｎ－Ａ／ＭＡＲＴ－１．３２、ｐ５３．１４９、ｐ５３．２６４、Ｓｕｒ１Ｍ２及びＨＰＶ Ｅ７．８６が含まれるが、これらに限定しない。
特定の実施形態では、前記ＣＤ８エピトープは、ＨＰＶ Ｅ７抗原の非発癌性変異体である。
この抗原はいくつかのクラスＩエピトープを示し、ＨＬＡ ＭＨＣクラスＩＩ決定基に対する高親和性エピトープを欠く。故に、Ｅ７だけを標的とするＤＮＡワクチンアプローチは、常に失望した結果をもたらしている（Chen et al, 2000）。本発明により、この抗原に対する免疫応答が増強され、子宮頸癌を処置する際に特に有用である。
ベクター及び投与
本発明で使用する発現ベクターは、インビトロ及び／又はインビボで（例、適切な宿主細胞、宿主生物、及び／又は発現系において）発現を提供することができる。それらは、典型的には、上で定義したポリヌクレオチド配列、及び宿主細胞又は宿主生物においてタンパク質産物の発現（例、転写及び翻訳）を可能にする調節配列（適切なプロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）を含む。
本発明のベクターは、ベクター、例えば、プラスミド、コスミド、ＹＡＣ、ウイルスベクター、又はトランスポゾンなどの形態でありうる。
好ましいが非限定的な態様では、本発明のベクターは、ｉ）上記の少なくとも１つの核酸；ｉｉ）１つ又は複数の調節エレメント（例えばプロモーター及び場合により適切なターミネーターなど）；並びに、場合により、ｉｉｉ）遺伝子構築物の１つ又は複数のさらなるエレメント（例えば３’又は５’ＵＴＲ配列、リーダー配列、選択マーカー、発現マーカー／レポーター遺伝子、及び／又は形質転換或いは組込み（の効率）を促進、或いは増加しうるエレメントなど）を含む。
特定の実施形態では、本発明で使用するベクターは、分子アジュバント（サイトカイン、ケモカイン、又は共刺激分子）をコードする追加のインサート、ＭＨＣ抗原提示を促す小さなＤＮＡ配列（例、ＩＭＸ３１３）、ＩＭＡＸＩＯ技術（抗原のオリゴマー化）、抗原が特定の細胞区画に入るのを補助する（例、ＬＡＭＰ－１）、或いは免疫応答の刺激又は指向においてアジュバントとして作用しうる補助剤を含みうる。
特定の実施形態では、核酸構築物を制限エンドヌクレアーゼで消化し、プロモーター（例えばＳＶ４０プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター、又はラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）プロモーターなど）を含むプラスミド中にクローニングすることにより遺伝子構築物を調製することができる。
他のベクターには、レトロウイルスベクター、レンチウイルスベクター、アデノウイルスベクター、ワクシニアウイルスベクター、ポックスウイルスベクター、麻疹ウイルスベクター、及びアデノウイルス関連ベクターが含まれる。
特定の実施形態では、以下を含むキットを提供する：
ａ．前記少なくとも２つのＴＥＲＴのＣＤ４エピトープをコードする少なくとも１つのＤＮＡ発現ベクターを含む第１の容器、及び
ｂ．少なくとも１つの腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８エピトープをコードする少なくとも１つのＤＮＡ発現ベクターを含む第２の容器。
キットは、少なくともさらなる腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８エピトープをコードする少なくとも別の１つのＤＮＡ発現ベクターを含む少なくとも１つの追加の容器をさらに提供しうる。そのようなキットは、複数の異なる腫瘍抗原、ウイルス抗原、細菌抗原、又は寄生虫の抗原に対するワクチン接種の状況において特に有用でありうる。そのような抗原は、同一のタンパク質又は異なるタンパク質に由来しうるが、それらは、同じ又は異なるタイプの腫瘍、或いは同じ又は異なるウイルス、細菌、又は寄生虫用の薬剤により発現させてもよい。
前記少なくとも２つのＴＥＲＴのＣＤ４エピトープをコードするＤＮＡ発現ベクター及び少なくとも１つの腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８エピトープをコードするＤＮＡ発現ベクターを、別々の容器中で提供する場合、好ましくは同時に又は実質的に同時に投与する。特定の実施形態では、それらは、近接して局所的に注射する。
特定の実施形態では、容器又は種は、被験体に投与する前に、即座に、又は事前に混合することができる。
前記ベクターを含む組成物を調製することができる。組成物は免疫原性である。それらは、ヒト又は哺乳動物（即ち、非毒性、及び必要な場合、無菌）での投与のための適切な担体又は賦形剤を含むことができる。そのような賦形剤には、医薬溶媒、等張剤、安定化剤、又は任意のアジュバントとしての役割を果たす液体、半固体、又は固体の希釈剤が含まれる。希釈剤は、水、生理食塩水、デキストロース、エタノール、グリセロールなどを含むことができる。等張剤は、とりわけ、塩化ナトリウム、デキストロース、マンニトール、ソルビトール、及びラクトースを含むことができる。安定剤には、とりわけ、アルブミンが含まれる。当技術分野で公知の任意のアジュバントをワクチン組成物（油性アジュバント、例えばフロイント完全アジュバント及びフロイント不完全アジュバントなど、マイコレートアジュバント、細菌リポポリサッカライド（ＬＰＳ）、ペプチドグリカン、プロテオグリカン、水酸化アルミニウム、サポニン、ＤＥＡＥ－デキストラン、中性油（例えばミグリオールなど）、植物油（例えば落花生油など）、Pluronic（登録商標）ポリオールを含む）中で使用してもよい。
ベクター又は組成物は直接投与することができる、又はそれらを投与前にリポソーム中にパッケージングするか、又は金コロイド粒子上にコーティングすることができる。ＤＮＡワクチンをリポソーム中にパッケージングする技術は、例えばMurray, 1991から公知である。同様に、金粒子上にネイキッドＤＮＡをコーティングする技術が、Yang, 1992において教示されており、ウイルスベクターを使用したタンパク質の発現のための技術がAdolph, 1996において見出される。
ワクチン組成物は、好ましくは、皮内、皮下、筋肉内、腫瘍中又は任意のタイプのリンパ器官中に投与され、宿主生物における免疫応答を刺激するのに効果的な量で送達される。種々の技術、例えばエレクトロポレーション（例、Cliniporator, IGEA, BTX, Harvard Apparatusを使用）、無針アプローチ、例えば粒子衝撃（例、PifizerのPMEDデバイス）など、及び高圧送達（例、Biojectorデバイス、Bioject Medical Technologies）、真皮パッチ（例、DermaVir, Genetic Immunity）、微小粒子又はリポソーム中でのＤＮＡワクチンの製剤化（例、脂質化合物Vaxfectin、Vical中での製剤化）を含むが、これらに限定しない。
本発明の好ましい実施形態では、投与は、注射工程（Ｍｉｒ ２００８、Sardesai and Weiner 2011に記載）に加えて、エレクトロポレーション工程（本明細書では用語「エレクトロトランスファー」とも命名する）を含む。最も有利な実施形態では、エレクトロトランスファーのプロトコールは、国際特許出願ＷＯ２０１５／０６３１１２に記載されている通りである。
必要とされる材料の量は、各々の個々の構築物の免疫原性に依存し、先験的に予測することはできないと理解されるが、任意の所与の構築物についての適当な投与量を決定するプロセスは直接的である。具体的には、約５～３０μg、又は好ましくは２０～２５μg、約５００μg～約５ｍｇまで、好ましくは５００～１５００μg、５００～１２００μg、又は５００～１０００μgまでで開始する、増加サイズの一連の投与量を、例えば、対応する種に投与し、結果として得られた免疫応答を、ＩＦＮγＥｌｉｓｐｏｔアッセイ（実験セクションに記載）により細胞性免疫応答を検出することにより、インビボ溶解アッセイを使用してＣＴＬ応答を検出すること、又はサイトカイン放出アッセイを使用してＴｈ（ヘルパーＴ細胞）応答を検出することにより観察することができる。
好ましい実施形態では、ワクチン接種計画は１～３回の注射を含み、好ましくは３～４週間後に反復する。
特定の実施形態では、ワクチン接種スケジュールは、１回又は２回の注射、それに続く、３～４週間後での３～５回の注射の少なくとも１サイクルで構成することができる。
別の実施形態では、開始用量は１～３回の注射、それに続く少なくとも、毎年、又は２年もしくは数年毎の追加免疫用量からなる。
これらは単なる例であり、任意の他のワクチン接種計画が本明細書で包含される。
治療的使用
本明細書に記載するベクター又はベクターの混合物を前記患者に投与することを含む、それを必要とする患者において腫瘍又は感染を処置するための方法を記載する。
本発明で使用するベクターにより、弱免疫原性抗原に対するＣＴＬ応答を有意に増強する高い結合力のＴｈ１分極ＣＤ４ Ｔ細胞が特に誘導される。
上記のベクター又はベクターの混合物は、患者において腫瘍を予防又は処置するための方法において有用である。
患者において腫瘍を予防又は処置するための方法を記載し、この方法には、有効量の前記核酸又は免疫原性組成物を、それを必要とする患者において投与することが含まれる。前記核酸又は免疫原性組成物は、患者において免疫応答を誘導するのに十分な量で投与する。
腫瘍は、細胞、特に良性腫瘍又は悪性腫瘍、特に癌の任意の望ましくない増殖でありうる。
癌は、発生の任意の段階（転移段階を含む）でありうる。癌は慢性又は非慢性（急性）でありうる。
別の実施形態では、本発明はまた、腫瘍を予防する際に有用なワクチンに関する。
特定の実施形態では、腫瘍は固形癌又は癌腫である。例として、黒色腫、脳腫瘍（例えば神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、及び星細胞腫膀胱癌など）、膀胱癌、乳癌、子宮頸癌、結腸癌、肺癌、特に非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、膵臓癌、前立腺癌、頭頸部癌、又は胃癌が含まれる。
別の実施形態では、腫瘍は液性腫瘍、例えば、造血性腫瘍又は白血病、例えば慢性又は急性リンパ球性白血病、慢性又は急性骨髄性白血病、リンパ腫（ホジキン病を含む）、多発性骨髄腫、悪性骨髄腫などを含む。
好ましくは、処置される患者は、従来の治療、最も好ましくは、第一選択の従来の治療を受けてきた、又は受けようとしている。
特定の実施形態では、本発明による処置は、従来の治療（化学療法、放射線療法、又は外科手術を含む）と組み合わせてもよい。アジュバント免疫調節分子、例えばＧＭ－ＣＳＦ又はサイトカイン（ＩＬ－２もしくはＩＬ－１２など）などとの組み合わせも有用でありうる。
別の実施形態では、患者はウイルス、寄生虫、又は細菌に感染しているであろう。ウイルスの例には、パピローマウイルス、単純ヘルペスウイルス、肝炎ウイルス、アデノウイルス、ミクソウイルス（例えばインフルエンザ、パラミクソウイルスなど）、ポックスウイルス（例えばワクシニアなど）、レンチウイルス（例えばＨＩＶなど）が含まれる。
実施例及び図により、その範囲を限定することなく本発明を例証する。
実施例１：ＤＮＡプラスミドの同時送達後でのＨＰＶ１６のＥ７抗原に対する応答の誘導
種々のＤＮＡ構築物によりコードされるユニバーサルｈＴＥＲＴ ＣＤ４エピトープが、エレクトロポレーションと組み合わせた皮内注射によるＤＮＡプラスミドの同時送達後でのＨＰＶ１６のＥ７抗原に対するＣＴＬ応答の誘導においてヘルパー的な役割を果たすことが示された。
ＨＬＡ－Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスを、ＨＰＶ１６ Ｅ７抗原の非発癌性変異体をコードするプラスミドの存在下で、ｈＴＥＲＴ由来のＣＤ４エピトープ（すなわち、ユニバーサル癌ペプチドのＵＣＰ）をコードするＤＮＡ構築物を用いて免疫化した。プラスミドによる２回目の免疫化（追加免疫）の１０日後、ＣＤ４及びＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答の頻度を、ＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔアッセイにより動物の脾臓において評価した。機能的に分極したＴ細胞サブセットを、ＣＢＡアッセイを使用したサイトカイン分泌のそれらの異なるパターンに基づいて同定した。
略語
ＨＬＡ－Ａ２／ＤＲ１：ＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１トランスジェニック、Ｈ２クラスＩ／クラスＩＩ ＫＯマウス、ＣＢＡ：サイトメトリービーズアレイ、ＣＴＬ：細胞傷害性Ｔリンパ球、ＤＮＡ：デオキシリボ核酸、ＥＰ：エレクトロポレーション、ＨＬＡ：ヒト白血球抗原、ＨＰＶ１６：ヒトパピローマウイルス１６型、ｈＴＥＲＴ：ヒトＴＥＲＴ、ＩＤ：皮内、ＩＬ：インターロイキン、ＩＦＮ－γ：インターフェロンγ、ＭＨＣ：主要組織適合性複合体、ＴＡＡ：腫瘍関連抗原、ＴＥＲＴ：テロメラーゼ逆転写酵素、ＴＮＦ－α：腫瘍壊死因子α、ＲＴ：室温、ｗｔ：野生型、ＵＣＰ：ユニバーサル癌ペプチド
材料及び方法
プラスミドＤＮＡベクター
ｐＵＣＰｂａｓｉｃ
ｐＵＣＰｂａｓｉｃは、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）由来クラスＩＩエピトープ、すなわち、ＵＣＰ１、ＵＣＰ２、ＵＣＰ３、及びＵＣＰ４（１０１ＡＡ）をコードする５７１７bpのプラスミド発現ベクターであり、１４ＡＡ Ｖ５タグが連結されており（図１、図８）、約１２．７ｋＤａの分子量のポリペプチドに対応する。ｈＴＥＲＴ挿入配列は、野生型ｈＴＥＲＴ（受入番号ＮＭ＿１９８２５３）にそれぞれ対応するＡＡ ２－２６、ＡＡ ２７－５１、ＡＡ ５２－７６、ＡＡ ７７－１０１の４つのフラグメントで構成される：ＡＡ ３９－６３ ｈＴＥＲＴ、ＡＡ ５７３－５９７ ｈＴＥＲＴ、ＡＡ９１１－９３５ ｈＴＥＲＴ、及びＡＡ１０３６－１０６０ ｈＴＥＲＴ（ＵＣＰ１－４クラスＩＩエピトープ及びそれらの５ＡＡ隣接配列を含む）。これらのフラグメントは、４つの十分に特徴付けられた１５－ｍｅｒ ＣＤ４＋ｈＴＥＲＴエピトープ（ＴＥＲＴ ４４－５８ ＰＡＡＦＲＡＬＶＡＱＣＬＶＣＶ（配列番号１）、ＴＥＲＴ ５７８－５９２ ＫＳＶＷＳＫＬＱＳＩＧＩＲＱＨ（配列番号２）、ＴＥＲＴ ９１６－９３０ ＧＴＡＦＶＱＭＰＡＨＧＬＦＰＷ（配列番号３））、ＴＥＲＴ １０４１－１０５５ ＳＬＣＹＳＩＬＫＡＫＮＡＧＭＳ（配列番号４）、及び２つの９－ｍｅｒ内部ＣＤ８ ＋テロメラーゼエピトープ（Godet et al. 2012；Suso et al. 2011）を含む。
ｐＵＣＰ２（４×）
ｐＵＣＰ２（４×）は、各々の側に５ＡＡ隣接配列を伴うヒトテロメラーゼ逆転写酵素ＣＤ４＋５７８－５９２（ＫＳＶＷＳＫＬＱＳＩＧＩＲＱＨ、（配列番号２）、受入番号ＮＭ＿１９８２５３）エピトープをコードする５７１７bpのプラスミド発現ベクターである。このＵＣＰ２エピトープユニットは、４回反復し、１４Ａ Ｖ５エピトープタグ（図２、図９）と連結しており、約１２．７kDaの分子量のポリペプチドに一緒に対応する。
ｐＤＥ７
ｐＤＥ７は、１４ＡＶ Ｖ５エピトープタグ（図３、図１０）と連結した非発癌性ＨＰＶ１６ Ｅ７変異体（９８ＡＡ）（Wieking et al., 2012）をコードする５７０８bpのプラスミド発現ベクターであり、約１４～１５kDaの分子量のタンパク質に相当する。発癌性ＨＰＶ Ｅ７の送達に関連付けられるリスクを減少させるために、Ｅ７内の４つの公知の発癌領域を変異させた（Munger et al., 2004）。Ｅ７に導入された変異は、ｐＲｂに結合／不活性化し、細胞成長を増強するＭｉ２βと会合するその能力を防止する（Brehm et al., 1999）。
遺伝子合成及びクローニング
重複４０ｍｅｒオリゴヌクレオチドアセンブリプロセス（GeneCust、ルクセンブルク）を通じて遺伝子を合成し、固有の隣接制限部位ＨｉｎｄＩＩＩ／ＸｈｏＩを含んだ。合成遺伝子を、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）発現ベクター（Life Technologies、米国カールスバーグ）のＨｉｎｄＩＩＩとＸｈｏＩ制限部位の間にクローニングした。ｐｃＤＮＡ３．１（＋）は、哺乳類細胞における高レベルの安定な一過性発現のために設計したｐｃＤＮＡ３．０に由来する５．４kbのベクターである。このベクターは、ヒトサイトメガロウイルス前初期（ＣＭＶ－ＩＥ）プロモーター及び終結配列としてのウシ成長ホルモンポリアデニル化（ＢＨＧ－ｐｏｌｙＡ）シグナルを含む。
エンドトキシン不含プラスミドの産生
プラスミドを、ＲＤ Ｂｉｏｔｅｃｈ（フランス、ブザンソン）によるＥ． ｃｏｌｉ ５α細胞（ｆｈｕＡ２Δ（ａｒｇＦ－ｌａｃＺ）Ｕ１６９ ｐｈｏＡ ｇｌｎＶ４４Φ８０Δ（ｌａｃＺ）Ｍ１５ ｇｙｒＡ９６ ｒｅｃＡ１ ｒｅｌＡ１ ｅｎｄＡ１ ｔｈｉ－１ ｈｓｄＲ１７）（Lucigen Corporation、米国ミドルトン、ｒｅｆ．６０６０２－２）中に形質転換し、産生した。エンドトキシン不含のプラスミドを１×滅菌ＰＢＳに４mg/mLで再懸濁した。構築物を制限酵素消化により検証した。
細胞培養及び一過性トランスフェクション
ＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、１０%熱不活性化ウシ胎児血清（ＰＡＡ、フランス、ヴェリジー＝ヴィラクブレー）及び１%ペニシリン／ストレプトマイシン（Life technologies SAS、フランス、サン・トーバン）を添加したダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）中で培養した。
細胞を７５cm2のフラスコ中で、３７℃で、５%ＣＯ２を含む加湿雰囲気中で単層として成長させた。８×１０５個の細胞を６ウェル組織培養プレートに播種し、２４時間にわたりインキュベートした。細胞を、トランスフェクションの日に７０～８０%コンフルエントまで成長させた。
ｐＵＣＰｂａｓｉｃ、ｐＵＣＰ２（４×）、ｐＤＥ７構築物をjetPrimeカチオン性ポリマートランスフェクション試薬（Polyplus-transfection Inc.、フランス、イルキルシュ）を使用して標的細胞にトランスフェクトした。ｐｃＤＮＡ３．１プラスミドをトランスフェクトした細胞を陰性対照として使用した。トランスフェクションの４８時間後、細胞を収集し、発現について分析した。
ウエスタンブロット
ｐＵＣＰｂａｓｉｃ、ｐＵＣＰ２（４×）、ｐＤＥ７、及びｐｃＤＮＡ３．１をトランスフェクトしたＨＥＫ２９３Ｔ細胞を、２０分間にわたり氷上で、プロテアーゼ阻害剤カクテル（Roche Diagnostic、米国インディアナポリス）を添加したＲＩＰＡ緩衝液（Sigma Aldrich SARL、フランス、サン＝カンタン＝ファラヴィエ）中に溶解した。溶解物を、１４，０００rpmで、１５分間にわたる４℃での遠心により清澄化した。上清を収集し、タンパク質濃度を、Ｂｒａｄｆｏｒｄ比色アッセイを使用して測定した。
ｐＤＥ７タンパク質を、抗Ｖ５コンジュゲートアガロースビーズ（Abcam、英国ケンブリッジ）を使用して免疫沈降させた。細胞を、１２５mM ＮａＣｌ、５０mM Ｔｒｉｓ ｐＨ８、２５mM ＥＤＴＡ ｐＨ８、及び０．５%ＮＰ４０を含む細胞溶解緩衝液で１５分間にわたり溶解し、１６００rpmで５分間にわたり遠心し、次に２０μlの抗Ｖ５アガロース（Abcam）を加えた。サンプルを４℃で一晩回転させ、冷細胞溶解緩衝液で３回洗浄した。
全てのタンパク質サンプルを１×サンプル緩衝液（Life technologies SAS、フランス、サン・トーバン）中に再懸濁し、９０℃で５分間にわたり変性させ、Nu-PAGE（登録商標）Novex 4-12%Bis-Trisゲル（Life Technologies）で分離し、iBlot（登録商標）デバイス（Life Technologies）を使用してＰＶＤＦ膜（iBlot（登録商標）トランスファースタック、Life Technologies）上にエレクトロブロッティングした。ProSieve（商標）QuadColor（商標）タンパク質マーカー（Lonza、フランス、ルヴァロワ＝ペレ）を使用して分子量を決定した。膜を約４０kDaで切断し、ＰＢＳ １×、０．０５%Tween（登録商標）２０、３%ミルクでブロッキングした。膜の下部を、１／５０００希釈した抗Ｖ５マウスモノクローナル抗体（Life Technologies）でプローブし、上部を抗βアクチンマウスモノクローナル抗体（Sigma Aldrich SARL、フランス、サン＝カンタン＝ファラヴィエ）でプローブした。膜を次に１／５０００に希釈した抗マウスＨＲＰ結合抗体（GE Healthcare、フランス、ヴェリジー）とインキュベートし、タンパク質を、ECL HRP化学発光基質試薬キットを使用した増強化学発光アッセイにより検出した。膜をChemiDoc XRSシステム（Bio-Rad、フランス、マルヌ＝ラ＝コケット）で可視化し、Image Lab 5.2.1（Bio-Rad）ソフトウェアを使用して分析した。
マウス
トランスジェニックＨＬＡ－Ａ＊０２０１／ＤＲＢ１＊０１０１（ＨＬＡ－Ａ２／ＤＲ１）マウス（１３～１６週齢）は、Institut Pasteur（フランス、パリ）又はＣＤＴＡ－ＴＡＡＭ（フランス、オルレアン）から供給された。これらのマウスは、ヒトＨＬＡ－Ａ＊０２０１α１α２ドメイン及びＨ２－Ｄ分子のマウスα３ドメイン、ヒトβ２－ミクログロブリン、並びにＨＬＡ－ＤＲＢ１＊０１０１分子及びＨＬＡ－ＤＲＡ＊０１０１分子を発現する。それらは、マウスのＨ２－Ｄｂ、Ｈ２－Ｋｂ、及びＩＡｂ遺伝子についてノックアウトされている（Pajot et al., 2004）。
動物は、Institut Pasteurの病原体のいない動物施設に収容した。全ての動物は、良好な動物慣習に厳密に従って取り扱い、地域の動物実験法（指令２０１０／６３／ＵＥ）を遵守した。
免疫化
処置に先立ち、マウスを、個々の動物の体重及び麻酔の持続時間に従って腹腔内経路（ＩＰ）を通じてＰＢＳ（Life technologies SAS、フランス、サン・トーバン）中のキシラジン２%（Rompun, Bayer Sante、フランス、ロス）及びケタミン８%（Imalgen 1000, Merial、フランス、リヨン）の混合溶液で麻酔した。プラスミドを次に、０日目（初回）及び２１日目（追加免疫）に腰部の皮内（ＩＤ）に注射し、エレクトロポレーションした。簡単に説明すると、ＩＤ注射の直後に、皮膚の折り目を注射部位に作り、導電性ゲルで全体を覆い、エレクトロポレーション装置（CLIPIATOR（登録商標）２、ＩＧＥＡ、イタリア、カルピ）の電極プレート間に置いた。異なる電圧の２つのパルスを、以下に記載するように適用した（ＨＶ－ＬＶ）。実験群は、表６にまとめたように定義した。
Figure 0007000314000006
ペプチド
免疫応答分析のために、ＨＬＡ－ＤＲに限定されたｈＴＥＲＴペプチド及びＨＬＡ－Ａ＊０２０１に制限されたＥ７ペプチドは以前に記載されているか、又はオンラインで利用可能なＳＹＦＰＥＩＴＨＩ（ｗｗｗ．ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｄｅ）Rammensee et al, 1999）又はＮｅｔＭＨＣＩＩ ２．２（Nielsen and Lund, 2009）アルゴリズムを使用したインシリコエピトープ予測により決定した。全ての合成ペプチドを、Proimmune（英国オックスフォード）から凍結乾燥（＞９０%純度）で購入した。凍結乾燥ペプチドを滅菌水中に２mg/mLで溶解し、使用に先立ち－８０℃で保存した。ペプチド配列及びＭＨＣ制限の詳細を表７に示す。
Figure 0007000314000007
ＩＦＮ－γＥＬＩＳｐｏｔアッセイ
追加免疫ワクチン接種の１０日後、マウスをＣＯ２麻酔により安楽死させ、脾臓を収取した。脾臓を次に破砕し、脾細胞懸濁液を７０μmのナイロンメッシュ（Cell Strainer、BD Biosciences、フランス、ル・ポン＝ド＝クレ）で濾過し、ficoll（リンパ球分離培地、Eurobio、Les、フランス、レ・ジュリス）で精製し、Cellometer（登録商標）Auto T4 Plusカウンター（Ozyme、フランス、モンティニー＝ル＝ブルトンヌー）で計数した。精製した脾細胞を次に、抗マウスＩＦＮ－γ抗体で被覆したELISpot PVDFマイクロプレート（IFN-γELISpotキット、Diaclone、フランス、ブザンソン）に２×１０５個細胞／ウェルで３通りに加え、５μg/mLのペプチド（表７を参照のこと）、１０μg/mLのＰＭＡ－イオノマイシン（Sigma-Aldrich）で刺激し、又は無血清培地で偽刺激した。ｈＴＥＲＴ及びＥ７抗原特異的ＩＦＮ－ρ分泌細胞の数をスコア化するために、３つの異なるペプチドプールを使用した：ＣＤ４＋ｈＴＥＲＴ（プール１）、ＣＤ４ Ｅ７（プール２）、又はＣＤ８ Ｅ７（プール３）（表７）。１９時間後、スポットを、ビオチンコンジュゲート抗ＩＦＮγ検出抗体、それに続くストレプトアビジン－ＨＲＰ及びＢＣＩＰ／ＮＢＴ基質溶液で明らかにした。スポットをカウントし、ImmunoSpot（登録商標）ELISpotカウンター及びソフトウェア（Cellular Technology Limited、ドイツ、ボン）を使用して分析した。
サイトカイン結合アッセイ（ＣＢＡ）
ワクチン接種したＨＬＡ－Ａ２／ＤＲ１マウス由来の脾細胞（６×１０５個細胞）を、最終濃度５μg/mLのプール１からのＨＬＡ－ＤＲ制限ｈＴＥＲＴ由来ペプチドと３７℃で２４時間にわたり培養した。サイトカイン培養上清を回収し、試験まで－２０℃で凍結させた。マウスＴｈ１／Ｔｈ２／Ｔｈ１７サイトメトリービーズアレイ（ＣＢＡ、BD Biosciences）キットを使用し、ＩＬ－２、ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－４、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１７ａの濃度をそれぞれ定量した。ＣＢＡイムノアッセイを製造者の指示に従って行った。フローサイトメトリーは、FACScan LSRIIフローサイトメーター（BD Biosciences）を使用して実施した。定量結果を、FCAP Array（商標）ソフトウェアバージョン３．０（Becton Dickinson、フランス、ル・ポン＝ド＝クレ）を使用して生成した。
統計分析
２群間の差を、不対ｔ検定又は非パラメトリックマンアンドホイットニーＵ検定により評価した。ピアソンの相関係数検定を使用し、免疫化マウスにおけるｈＴＥＲＴクラスＩＩ応答とＥ７クラスＩ応答の間での相関を評価した。全てのコンピュータ分析を、GraphPad Prism 6（GraphPad Software Inc.、米国カリフォルニア州ラホーヤ）を使用して実施した。ｐ値＜０．０５は統計的に有意であると考えられた。
結果
構築物の特徴付け及び配列分析
ＵＣＰｂａｓｉｃ、ＵＣＰ２（４×）及びＤＥ７タンパク質を発現するＤＮＡ導入遺伝子を合成し、制限酵素消化及び電気泳動により示されるように、ｐｃＤＮＡ３．１（＋）Life Technologies発現ベクター中にクローニングした（図４）。インサート及び接合部を、ＤＮＡインサートに隣接するベクター配列と一致するＴ７（フォワード５’ＡＴＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧ３’（配列番号３６））及び／又はＢＧＨ（リバース５’ＴＡＧＡＡＧＧＣＡＣＡＧＴＣＧＡＧＧ３’（配列番号３７））プライマーを使用して配列決定した（表８を参照のこと）。配列決定の結果により、導入遺伝子が正しく合成され、クローニングされていることが確認された。
Figure 0007000314000008
インビトロでの導入遺伝子発現
ｐＵＣＰｂａｓｉｃ及びｐＵＣＰ２（４×）ポリペプチド並びにｐＤＥ７タンパク質の発現をウエスタンブロットアッセイにより評価した。構築物をＨＥＫ２９３Ｔ細胞株中に一過性にトランスフェクションし、次に４８時間にわたり培養した。ｐＵＣＰｂａｓｉｃ及びｐＵＣＰ２（４×）ポリペプチドは、それぞれ約１２．６及び１２．８kDaの分子量で同定された。２つのさらなるバンドがＵＣＰ２（４×）について観察され（約１１及び９kDa）、これらはタンパク質分解で説明されうる（図５ａ）。未知の理由のため、ＤＥ７タンパク質をウエスタンブロットにより直接的に検出することは困難であった（図５ａ）。抗Ｖ５コンジュゲートアガロースビーズを使用した免疫沈降工程が、この目的を達成するために必要であった（図５ｂ）。ｐＤＥ７タンパク質が約１４．５kDaの予想分子量で検出された。ｐｃＤＮＡ３．１トランスフェクト細胞を陰性対照として使用した。これらの結果により、インビトロ発現パターン及びｐＵＣＰｂａｓｉｃ、ｐＵＣＰ２（４×）、及びｐＤＥ７ＤＮＡ構築物の同一性が立証される。
ｈＴＥＲＴヘルパーエピトープにより、ＨＬＡトランスジェニックマウスでのＥ７特異的免疫応答が増加する
ｐＵＣＰｂａｓｉｃ、ｐＵＣＰ２（４×）及びｐＤＥ７で免疫化したＨＬＡ－Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスにおけるｈＴＥＲＴ ＣＤ４＋及びＥ７ ＣＤ８＋／ＣＤ４＋特異的Ｔ細胞の頻度を決定するために、ＥＬＩＳｐｏｔ ＩＦＮ－γ分析を実施した。
図６ａに示すように、ｐＵＣＰｂａｓｉｃ又はｐＵＣＰ２（４×）による免疫化により、強力なｈＴＥＲＴ ＣＤ４＋特異的細胞性免疫応答が誘導された。予想通り、Ｅ７タンパク質は高親和性クラスＩＩエピトープを提示しないため、Ｅ７ ＣＤ４＋特異的免疫応答は検出されなかった（図６ｂ）。ｐＵＣＰｂａｓｉｃ又はｐＵＣＰ２（４×）とｐＤＥ７の同時免疫により、有意なＥ７ ＣＤ８＋特異的免疫応答が示された（図６ｃ）。ｐＤＥ７＋ｐｃＤＮＡ３．１ ＤＮＡワクチンと比較した場合、ｐＵＣＰｂａｓｉｃ又はｐＵＣＰ２（４×）で同時免疫したｐＤＥ７は、Ｅ７特異的免疫応答を駆動する際に強力であり、ｐＵＣＰｂａｓｉｃ及びｐＵＣＰ２（４×）構築物により、Ｅ７抗原に対するＣＤ８＋細胞性免疫応答の大きさを有意に増加させることができることを示唆する。
ｈＴＥＲＴ ＣＤ４＋クラスＩＩ及びＥ７ ＣＤ８＋クラスＩ特異的免疫応答の強度間での正の相関が、個別に（図６ａ、ｃ、動物識別番号に対応する番号付きポイントを参照のこと）、及び凝集した場合（図６ｄ）の両方で観察された。
このように、増加レベルのＣＤ４ Ｔ細胞応答は、各々の動物のＣＤ８ Ｔ細胞増殖の大きさに正比例した。Ｐｅａｒｓｏｎの相関係数検定を使用したデータ分析では、ＣＤ４ ＋及びＣＤ８＋応答間の相関の強さが非常に高く（Ｒ２＝０．９５）、少なくともｐＵＣＰ２（４×）について統計的に有意である（ｐ＝０．００５）ことが示された（図６ｅ）。この分析は、恐らくは、本試験に含まれる動物の数が少ないために、ｐＵＣＰｂａｓｉｃについての信頼性が低い（Ｒ２＝０．４２、ｐ＝０．３５）（図６ｆ）。
最後に、Ｔｈ１／Ｔｈ２免疫応答の役割を評価するために、ｈＴＥＲＴ特異的ＣＤ４ Ｔ細胞により分泌される異なるサイトカインを調べた。この目的のために、第２の独立した実験からのワクチン接種トランスジェニックマウスの脾細胞を、ｈＴＥＲＴペプチドのプールで２４時間にわたりインビトロで刺激したか、又は刺激しないままにした。上清を回収し、サイトカイン結合アッセイ（ＣＢＡ）でアッセイした。ＩＦＮ－γ、ＴＮＦ－α、ＩＬ－２、及びＴｈ２ ＩＬ－６（しかし、ＩＬ－４、ＩＬ－１０、及びＩＬ－１７ではない）の濃度上昇を、対照マウス（ｐＤＥ７＋ｐｃＤＮＡ３．１及びｐｃＤＮＡ３．１）のものとの比較において、ｐＵＣＰｂａｓｉｃ及びｐＵＣＰ２（４×）でワクチン接種したマウスから回収した脾細胞の培養上清中で検出した（図７）。この結果では、ＵＣＰ免疫化によりインビボでＴｈ１分極化免疫応答が優先的に誘導されたことが示される。
このように、ｐＵＣＰｂａｓｉｃ又はｐＵＣＰ２（４×）でのワクチン接種により特異的Ｔｈ１分極ＣＤ４ Ｔ細胞応答が誘導され、Ｅ７特異的ＣＤ８ Ｔ細胞の増殖をインビボで促すことができる。
結論
結果は、ｈＴＥＲＴ ＣＤ４ポリエピトープＤＮＡ構築物が正しくプロセッシングされ、ＨＬＡクラスＩＩ制限の状況においてＨＬＡ－Ａ２／ＤＲ１トランスジェニックマウスにおいてＣＤ４ Ｔ細胞に提示され、主にＩＦＮ－γ、ＴＮＦα、及びＩＬ－２を産生する効率的なＣＤ４ Ｔｈ１細胞を生成しうることが示された。さらに、ｈＴＥＲＴ ＣＤ４ Ｔｈ１細胞応答は、Ｅ７抗原に対するＣＤ８ Ｔ細胞応答と高度に相関しており、Ｅ７クラスＩ制限エピトープに対するＣＤ８ Ｔ細胞免疫応答及び、このように、Ｅ７抗原ワクチン接種の有効性を強く改善する。
これらの結果により、ＤＮＡ送達アプローチを通じてＣＤ４ Ｔｈ１エピトープによるワクチン製剤を補うことにより、不良な免疫原性の抗原に対する免疫応答の強度及び質を増加させることが可能であることが確認される。
参考文献
Figure 0007000314000009
Figure 0007000314000010

Claims (11)

  1. 少なくとも２つのテロメラーゼ逆転写酵素（ＴＥＲＴ）のＣＤ４エピトープ及び少なくとも１つの腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８エピトープをコードするＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物であって、前記少なくとも２つのＴＥＲＴのＣＤ４エピトープが、同一であり、かつ、反復しており、前記ＴＥＲＴのＣＤ４エピトープの少なくとも１つが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群より選択される、前記ＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物。
  2. 前記ベクター又はベクターの混合物が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４の全てを含むポリエピトープ配列をコードする、請求項１記載のＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物。
  3. 少なくとも２つの、配列番号２のエピトープの反復をコードする、請求項１又は２記載のＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物。
  4. 少なくとも４つの、配列番号２のエピトープの反復をコードする、請求項３記載のＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物。
  5. 前記ＣＤ８エピトープとして、ＭＨＣクラスＩエピトープを含むウイルス、細菌、もしくは寄生虫の抗原の全部又は一部をコードする、請求項１～４のいずれか一項記載のＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物。
  6. 前記ＣＤ８エピトープとして、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ） Ｅ７抗原の非発癌性変異体の全部又は一部をコードする、請求項５記載のＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物。
  7. ａ．前記少なくとも２つのＴＥＲＴのＣＤ４エピトープをコードする少なくとも１つのＤＮＡ発現ベクターを含む第１の容器、ここで、前記少なくとも２つのＴＥＲＴのＣＤ４エピトープが、同一であり、かつ、反復しており、前記ＴＥＲＴのＣＤ４エピトープの少なくとも１つが、配列番号１、配列番号２、配列番号３、及び配列番号４からなる群より選択される、及び
    ｂ．腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８エピトープをコードする少なくとも１つのＤＮＡ発現ベクターを含む第２の容器
    を含むキット。
  8. さらなる異なる腫瘍、ウイルス、細菌、又は寄生虫のＣＤ８エピトープをコードする少なくとも１つのＤＮＡ発現ベクターを含む少なくとも１つの追加の容器をさらに含む、請求項７記載のキット。
  9. 患者における腫瘍又は感染を処置する際での使用のための、請求項１～６のいずれか一項記載のＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物、或いは請求項８記載のキット。
  10. 腫瘍が、癌、例えば慢性リンパ球性白血病、慢性骨髄性白血病、多発性骨髄腫、悪性骨髄腫、ホジキン病、黒色腫、脳腫瘍、神経膠芽細胞腫、神経芽細胞腫、及び星細胞腫など、膀胱、乳房、子宮頸部、結腸、肺、膵臓、前立腺、頭頸部、又は胃の癌腫からなる群より選択される癌である、請求項１～６のいずれか一項記載のＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物、或いは請求項９記載の使用のためのキット。
  11. 皮内注射により投与される、請求項１～６のいずれか一項記載のＤＮＡ発現ベクター又はＤＮＡ発現ベクターの混合物、又は請求項９又は１０記載の使用のためのキット。
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