JP7007367B2 - 微生物の存在を判定し、前記微生物を同定するための方法、システム、及びコンピュータプログラム製品 - Google Patents

Description

本発明は、ペトリ皿中の生物学的サンプルであって微生物を含む生物学的サンプルを分析するための微生物学的分析の分野に関し、より具体的には、ペトリ皿中の細菌などの微生物の存在を判定し、前記微生物を同定するための方法、システム及びコンピュータプログラムに関する。

微生物学の分野では、特定の細菌の存在を判定し前記細菌を同定するために、例えば微生物、細胞抽出物又は細胞内抽出物を含む生物学的サンプルの増殖について分析が実施されることはよく知られている。而して、対応する疾患を診断することができる。

従来技術には、細菌を同定する幾つかの解決策が存在している。解決策は、記述子と呼ばれる基準を使用する教師あり学習アルゴリズムを含む方法に基づいている。記述子は細菌の色、形態及び構造に関連する。

そのような方法はまた孤立した細菌コロニーの位置を決定するためのステップを伴って作動する。その位置は、半自動化された形でユーザーによって、又は自動化された形で特定のセグメンテーションアルゴリズムを適用することによって、提供されうる。しかし、位置を提供するこれらの方法は双方とも不正確であり、位置の誤った決定につながる幾つかのエラーを発生させる。

米国特許出願公開第２０１５／００８７０１７号は、細菌コロニーの自動分類のための方法を開示している。その方法は、ペトリ皿内の細菌コロニーの分類ステップに基づいており、前記分類ステップは、各細菌コロニーの色、形状及び輪郭などの基準に基づいている。

しかしながら、そのような自動化方法は、ペトリ皿の内容物の分析には適用されない。実際、ペトリ皿中の細菌コロニー周辺の環境もまた前記細菌コロニーに関連する特定の生物学的現象とそれらの培地との相互作用を特定するためには分析されなければならない。そのような生化学的反応は、様々な微生物を識別し、診断仮説を作り又はそれを棄却することを可能にするために生物学者によって使用される。

例えば、血液寒天培地を含むペトリ皿中の微生物の増殖を分析することに関して、従来技術の方法は、特定の微生物を特徴付けるために寒天培地中の血液細胞が分解されるレベルを決定する溶血現象の性質を特定するためのステップを含む。溶血現象は、寒天の血液細胞を破壊することができるタンパク質を産生する所定の微生物の能力に関連している。溶血現象には、次のようにアルファ、ベータ、ガンマと命名された３タイプがある：
－ アルファ溶血現象は、血液寒天上で増殖する細菌コロニーを囲む緑がかった変色を生じさせる。この種の溶血現象は、血液寒天の赤血球のヘモグロビンの部分的分解を表す。
－ ベータ溶血現象は、細菌コロニーの近くにある赤血球のヘモグロビンの全分解を表す。
－ ガンマ溶血現象は細菌コロニーの周辺領域に如何なる分解もないことに対応する。

他の状況では、細菌と培地との間の相互作用は、特定の色の出現のようなコロニーを囲む目に見えるアーティファクトを生み出す。これらの色の変化は、培地と細菌によって産生される代謝産物との間の化学反応によるものであり、前記化学反応は微生物自体の性質に応じて正又は負の反応として解釈されうる。今日、溶血現象の性質又はコロニー周辺の色の変化を決定するためにペトリ皿の内容物を見なければならないユーザーによってそのようなステップが提供される。しかしながら、そのようなヒューマン分析は誤りを招く可能性がある。加えて、分析されるべきペトリ皿の数が増加している状況では、前記同定ステップは時間のかかるプロセスである。

よって、ペトリ皿中の生物学的エレメントの自動同定を効率的な形で可能にするためには従来技術の方法を改良する必要がある。

本発明の一態様によれば、微生物の一又は複数のコロニーと培地とを含むペトリ皿中の少なくとも一種の特定された微生物（例えば少なくとも一種の特定された細菌）の存在を判定するための方法であって、前記培地が、微生物の一又は複数のコロニーと、存在する場合前記少なくとも一種の特定された微生物とが適切な増殖条件下で増殖するのを可能にするように適応されている方法において、
－ ペトリ皿の少なくとも一つの初期画像を取得するステップであって、第一の初期画像が一又は複数の可視画素を含み、各画素が画素値と関連付けられているステップ；
－ 少なくとも一つの初期画像に第一の処理を適用することによってペトリ皿の第一の処理済み画像を取得するステップであって、第一の処理済み画像の可視画素が微生物の一又は複数のコロニーに関連する画素のみに関連付けられているステップ；
－ 第一の処理済み画像に第二の処理を適用することによってペトリ皿の複数の第二の処理済み画像を得るステップであって、第二の処理済み画像の可視画素が微生物の一又は複数のコロニーと微生物の前記一又は複数のコロニーの周辺の周囲ゾーンとに関連付けられた画素のみに関連しているステップ；
－ 少なくとも一つの初期画像と複数の第二の処理済み画像との間の差分を計算することによってペトリ皿の複数の第三の処理済み画像を取得するステップであって、複数の第三の処理済み画像が培地に関連付けられた画素のみに関連する可視画素を含むステップ；
－ 複数の第二の処理済み画像と第一の処理済み画像との間の差分を計算することによってペトリ皿の複数の第四の処理済み画像を取得するステップであって、複数の第四の処理済み画像の可視画素が周囲ゾーンに関連付けられた画素のみに関連しているステップ；
－ 複数の第三の処理済み画像の平均画素値と複数の第四の処理済み画像の平均画素値との間の差分値を、赤緑青（ＲＧＢ）色チャネルの少なくとも各色チャネルについて計算することによって、複数の第三及び第四の処理済み画像に関連付けられた特徴量を決定するステップ；
－ 決定された特徴量を分類することによって、ペトリ皿中の周囲ゾーン内の少なくとも一種の特定された微生物の存在の指標の値を決定するステップ；
－ 指標の値を閾値と比較するステップ；
－ 比較の結果に応じて、ペトリ皿中の周囲ゾーン内の少なくとも一種の特定された微生物の存在を判定するステップ
を含む、方法が提供される。

本出願の文脈において、「平均画素値」という用語は、以下を指す：
－ 画素値の算術平均、又は
－ 画素値の中央値。

本発明の好ましい実施態様によれば、複数の第三の処理済み画像と第四の処理済み画像に関連付けられた特徴量は、複数の第三の処理済み画像の中央画素値と複数の第四の処理済み画像の中央画素値との間の差分値を赤緑青（ＲＧＢ）色チャネルの少なくとも各色チャネルに対して計算することによって決定される。

好ましくは、第一の処理はセグメンテーション処理である。

本発明に係る方法は、微生物のコロニーの周辺の特定のゾーンの自動同定と、溶血現象又はプロテウス感染などの生物学的現象にそれぞれ関連しているベータ溶血性又はプロテウス菌のような細菌の存在の自動判定に基づくペトリ皿の内容物の自動分析を提供する。よって、本方法は、視覚的同定ステップ及び／又は視覚的判定ステップの動作を回避する。

本発明に係る方法は、ペトリ皿中の微生物のコロニーの周辺の特定のゾーンを同定するためのステップを含み、前記特定のゾーンは細菌コロニー又はコロニーの細菌クラスターを含みうる。

本発明の更なる態様によれば、微生物の一又は複数のコロニーと培地とを含むペトリ皿中の少なくとも一種の特定された微生物（例えば少なくとも一種の特定された細菌）の存在を判定するためのシステムであって、前記培地が、微生物の一又は複数のコロニーと、存在する場合前記少なくとも一種の特定された微生物とが適切な増殖条件下で増殖するのを可能にするように適応されており、ペトリ皿の少なくとも一つの初期画像を取得するための撮像システムと、処理システムとを備えるシステムにおいて、前記処理システムが、
－ ペトリ皿の少なくとも一つの初期画像の第一の処理済み画像を取得するための第一の処理ユニットであって、第一の処理済み画像の可視画素が微生物の一又は複数のコロニーに関連付けられた画素のみに関連する第一の処理ユニット；
－ ペトリ皿の第一の処理済み画像の複数の第二の処理済み画像を取得するための第二の処理ユニットであって、第二の処理済み画像の可視画素が微生物の一又は複数のコロニーと微生物の前記一又は複数のコロニーの周辺の周囲ゾーンとに関連付けられた画素のみに関連する第二の処理ユニット；
－ 第二の初期画像と第二の処理済み画像との間の差分を計算することによってペトリ皿の複数の第三の処理済み画像を取得するためと、第二の処理済み画像と第一の処理済み画像との間の差分を計算することによってペトリ皿の複数の第四の処理済み画像を取得するための計算ユニットであって、第三の処理済み画像が培地に関連付けられた画素のみに関連し、第四の処理済み画像の可視画素が周囲ゾーンに関連付けられた画素のみに関連する計算ユニット；
－ 第三の処理済み画像の平均画素値と第四の処理済み画像の平均画素値との間の差分値をＲＧＢ色チャネルの少なくとも各色チャネルに対して計算することによって、複数の第三の処理済み画像と第四の処理済み画像に関連付けられた特徴量を決定するための特徴抽出ユニット；
－ 及びペトリ皿中の周囲ゾーン内の少なくとも一種の特定された微生物の存在の指標の値を決定し、指標の値を閾値と比較し；かつ比較の結果に応じて、ペトリ皿中の周囲ゾーン内の少なくとも一種の特定された微生物の存在を判定するための分析ユニット
を備える、システムが提供される。

先に示されたように、本発明の好ましい実施態様によれば、複数の第三処理済み画像と第四の処理済み画像に関連付けられた特徴量は、複数の第三の処理済み画像の中央画素値と複数の第四の処理済み画像の中央画素値との間の差分値を赤緑青（ＲＧＢ）色チャネルの少なくとも各色チャネルに対して計算することによって決定される。

本発明の更なる態様によれば、実行されると、プログラマブルデータ処理装置に本発明に係る方法のステップを実行させる命令を含むコンピュータプログラム製品が提供される。

以下に、例示としての添付図面について言及する。

本発明の一実施態様に係るシステムの模式図を表す。 発明の一実施態様に係る、円形孔、白背景円、及び黒背景円を備えたホイール形態のコントローラを表す。 本発明の一実施態様に係る、ペトリ皿に照射される異なるタイプの照明ビームを示す撮像システムの模式図である。 本発明の一実施態様に係る、細菌の存在を判定するための方法のフローチャートを示す。 本発明の一実施態様に係る、溶血性細菌の存在を判定するための方法のフローチャートを示す。 本発明の一実施態様に係る、血液寒天と溶血性細菌を含んでいるペトリ皿の原画像を表し、前記原画像はバックライト照明に関係している。 図７ａ、７ｂ及び７ｃは、本発明の一実施態様に係る、中央底部ビューと共に、原画像の赤、緑及び青の色チャネル画像をそれぞれ示す。 本発明の一実施態様に係る、原画像のＧｒｏｗｔｈＭａｓｋと呼ばれる二値画像を示す。 図９ａは、本発明の一実施態様に係る、図６の原画像のＨａｌｏＭａｓｋに関連する画像を示す。図９ｂは、発明の一実施態様に係る、図６の原画像のＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋを示す。 図１０ａ及び１０ｂは、本発明の一実施態様に係る、５０ピクセルの膨張パラメータを有する２００×２００ピクセルの画素パッチのためのＨａｌｏＭａｓｋ及びＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋをそれぞれ示す。 図１１ａは、本発明の一実施態様に係る、１０ピクセルの膨張パラメータを有するＨａｌｏＭａｓｋの画素パッチを示す。図１１ｂは、本発明の一実施態様に係る、１０ピクセルの膨張パラメータを有するＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋの画素パッチを示す。 図１２ａは、本発明の一実施態様に係る、５０ピクセルの膨張パラメータを有するＨａｌｏＭａｓｋの画素パッチを示す。図１２ｂは、本発明の一実施態様に係る、５０ピクセルの膨張パラメータを有するＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋの画素パッチを示す。 図１３ａは、本発明の一実施態様に係る、６０ピクセルの膨張パラメータを有するＨａｌｏＭａｓｋの画素パッチを示す。図１３ｂは、本発明の一実施態様に係る、６０ピクセルの膨張パラメータを有するＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋの画素パッチを示す。 本発明の一実施態様に係る、ベータ溶血性細菌、アルファ溶血性細菌、及びガンマ溶血性細菌を含むペトリ皿中のパッチレベルでの特徴の分布を示す。 本発明の一実施態様に係る、青色チャネル上のＨａｌｏＭａｓｋとＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋとの間の色の差分値に関する画素パッチの分布を示すグラフを表す。 本発明の一実施態様に係る、プロテウス菌の存在を判定するための方法のフローチャートを示す。 図１６ａは、本発明の一実施態様に係る、ＣＰＳ培地とプロテウス菌を含むペトリ皿の原画像を示す。図１６ｂは、本発明の一実施態様に係る、図１６ａの原画像のＢｉｎａｒｙＧｒｏｗｔｈＭａｓｋと呼ばれる二値画像を示す。 図１７ａは、本発明の一実施態様に係る、図１６ａの原画像の有色のＧｒｏｗｔｈＭａｓｋを示す。図１７ｂは、本発明の一実施態様に係る、図１６ａの原画像の有色のＨａｌｏＭａｓｋを示す。図１７ｃは、本発明の一実施態様に係る、図１６ａの原画像の有色のＣｕｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋを示す。 図１８ａは、本発明の一実施態様に係る、７０ピクセルの膨張パラメータを有する、ＣＰＳ培地とクラス４の細菌を含むペトリ皿の底部環状ビューと重ね合わせたＨａｌｏＭａｓｋの輪郭を示す。図１８ｂは、本発明の一実施態様に係る、１０ピクセルの膨張パラメータを有する、ＣＰＳ培地とクラス４の細菌を含むペトリ皿の底部環状ビューと重ね合わせたＨａｌｏＭａｓｋの輪郭を示す。 本発明の一実施態様に係る、プロテウス菌の存在確率の分布を表すグラフを示す。 本発明の一実施態様に係る、プロテウス菌を含む不透明なＣＰＳなどの不透明培地を含むペトリ皿の原画像を示す。 本発明の一実施態様に係る、左側底部環状ビューに関係した図２０のペトリ皿の画像を示す。 本発明の一実施態様に係る、上部環状ビューに関係した図２０のペトリ皿の画像を示す。 本発明の一実施態様に係る、ＣＡＲＴアルゴリズム及びＳＶＭアルゴリズムを用いたプロテウス菌の存在の確率ｐ（Ｈａｌｏ／Ｘ）の分布と、半透明培地を含むペトリ皿に対するプロテウス菌の存在の最終確率の分布とを示すグラフを表す。 本発明の一実施態様に係る、ＣＡＲＴアルゴリズム及びＳＶＭアルゴリズムを用いたプロテウス菌の存在の確率ｐ（Ｈａｌｏ／Ｘ）の分布と、不透明培地を含むペトリ皿に対するプロテウス菌の存在の最終確率の分布とを示すグラフを表す。

以下の説明は、特定の実施例に基づいて、十分に明確かつ完全な形で本発明を開示する。しかしながら、この説明は、保護の範囲を以下に記載される特定の実施態様及び実施例に限定するものとして理解されるべきではない。

以下の説明において、「ペトリ皿」という用語は、ペトリ皿とペトリ皿を覆う蓋とのアセンブリを定義する。ペトリ皿は、ペトリ皿上又は蓋上に示されたセリグラフィを含みうる。

以下の説明において、「画素」という用語は画像中の位置に関連し、「画素値」という用語は前記画像中の画素の対応するキャプチャ強度の検出値を指す。

以下の説明において、「暗画素」という用語は、０の画素値を有する画素に関する。

以下の説明において、「可視画素」という用語は、明画素としても知られる、０以外の値を有する画素に関する。

説明された計算オペレーションは、関連画像の画素値に関連付けられたオペレーションに関する。

以下の説明において、ペトリ皿の表面の表現は、正規直交空間ｘ、ｙ、ｚにおいて行われ、ここでｚは、ｚ＝ｆ（ｘ，ｙ）のように、ｘとｙの関数である。

以下の説明において、ペトリ皿に関連付けられた画素は、ＤｉｓｈＭａｓｋと呼ばれる画像中のゾーンを画定する。

以下の説明において、培地に関連付けられた画素は、ＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋと呼ばれる画像中の培地ゾーンを画定する。

同様に、微生物コロニーの周辺に位置する画素は、ＨａｌｏＭａｓｋと呼ばれる画像中の周囲ゾーン又はハローゾーンを画定する。

以下の説明において、「原画像」という用語は、画像キャプチャ装置を用いて獲得されているペトリ皿の画像に関する。

以下の説明において、「初期画像」という用語はペトリ皿の画像に関し、ここで該初期画像は原画像又は画像キャプチャ装置で獲得された後に撮像システム内で処理されている画像に関しうる。

図１は、本発明に係るシステム１００の一例を示す。システム１００は、サンプル容器バンク１０２、自動画線装置１０４、スマートインキュベータシステム１０６、処理システム１０８及び分析ユニット１１０を備える。

サンプル容器バンク１０２は、その内部で生物学的サンプルを増殖させ、かつ分析することができるサンプル容器を手作業で又は自動的につくる。サンプル容器は典型的にはペトリ皿であるが、他の容器をまた使用してもよい。従って、ここにおけるペトリ皿への言及は、限定的であることを意図していない。

サンプル容器バンク１０２は、適切な培地をペトリ皿に添加し、生物学的サンプルを増殖させることができるようにする。

自動画線装置１０４は、生物学的サンプルをペトリ皿に塗布し、ついで既知の方法で生物学的サンプルを分布させる。例えば、ペトリ皿に、ペトリ皿の半径にほぼ等しい長さの櫛を使用して、サンプルが塗布される。櫛を適用しついで回して、生物学的サンプルをペトリ皿の表面全体に広げる。適当な自動画線装置１０４の一例は、ＰＲＥＶＩ（登録商標）Ｉｓｏｌａの商品名で本願人により市販されている。

生物学的サンプルがペトリ皿中の培地にわたり分布させられたところで、ペトリ皿は、オペレータによって手作業で、又はコンベアベルトもしくは他の自動システムによって、次の処理段階まで、つまりスマートインキュベータシステム１０６まで移送される。

スマートインキュベータシステム１０６は、インキュベータ１１２と撮像システム１１４を備える。ペトリ皿はスマートインキュベータシステム１０６内に導入され、予め決められた時間の間、予め決められた温度でインキュベートされる。これにより、生物学的サンプルが増殖させられ、ペトリ皿内の培地の表面にわたり多数の微生物コロニーがつくり出される。ペトリ皿が要求された通りにインキュベートされた後、ペトリ皿は撮像システム１１４に移送される。撮像システム１１４は、全体としてシステム１００内で生成されたコロニー及び培養物の画像を作成するためのシステムである。撮像システムの詳細は以下に更に説明される。

画像は生物学的サンプルの分析の第一段階に使用される。この段階は、生物学的サンプルのコロニー及び他の様相を同定し、全体システム１００の更なる動作及び機能を支援し容易にすることができる。

ペトリ皿の画像が生成された後、ついでペトリ皿は次の処理段階、つまり処理システム１０８に移送される。これは、コンベアベルトもしくは他の自動システムによって自動的に、又はオペレータによって、実施されうる。

処理システム１０８は、必要とされる生物学的サンプル分析に応じて、様々な異なった形式をとりうる。例えば、特定のコロニーが、更なる分析又は処理のために、画像に基づいて抽出されうる。多くの他の処理をこのときにペトリ皿に対して適用することができる。必要な場合、ペトリ皿は、更なる増殖のためにスマートインキュベータシステム１０６に戻し、及び／又は撮像システム１１４に戻すことができる。

全ての必要な処理と撮像が完了した後、ペトリ皿は分析ユニット１１０に手動又は自動プロセスによって移送されうる。

先に述べたように、スマートインキュベータシステム１０６は撮像システムを備える。撮像システム１１４はベースユニットを備える。ベースユニットは、赤、緑及び青のバックライト照明を発生させるための光学系及び制御回路を備える。ベースユニットは、図２に示された３つの位置をとるホイール形態のコントローラを備えうる。これらの位置は、「無背景」、「白背景」及び「黒背景」である異なった照明に対応する。「無背景」位置はホイールの円形孔１５０に関連する。「白背景」位置はホイールの白背景円１６０に関連する。「黒背景」位置はホイールの黒背景円１７０に関連する。無背景はバックライトに使用される一方、白と黒は、サンプルの性質に応じて、あらゆる他のタイプの照明に対して使用される。

ベースユニットの上方にサンプル保持ユニットがある。サンプル保持ユニットは、摺動して出し入れできるドローア（引き出し）を備え得、またペトリ皿を支持するよう適応された凹所を備える。加えて、サンプル保持ユニットは、４つの赤、緑及び青の水平照明源を備える。４つの照明源は、サンプル凹所の周りに直線的に位置させられ、独立して制御可能である。使用にあたり、ペトリ皿の頂面が４つの水平照明源の頂部に実質的に整列させられる。水平照明源は、ペトリ皿を水平又はほぼ水平なビームで照射することを可能にする。

サンプル凹所の底部は、バックライト照明が使用中の生物学的サンプルを照射できるように光学的に透過性であることに留意されるべきである。サンプル保持ユニットは、４つの水平照明源を動作させるのに必要とされる光学系及び制御器を更に備える。

サンプル保持ユニットは、生物学的サンプルがコンベアベルトによって撮像のための位置に移送される別の配向を備えうる。ドローアは、各々がバックライトを使用できるように透明であるサンプル保持ゾーンを有するコンベアベルトシステムにより置き換えることができる。コンベアベルトシステムは生物学的サンプルを適切な位置に移動させることができ、ついで必要な画像を撮ることができる。ついで、コンベアベルトが次の生物学的サンプルを撮像位置に移動させ、第一の生物学的サンプルを次の処理段階に移動させる。これにより、異なった位置で、かつ生物学的サンプルが移動しているときに、画像を撮ることができる。

更なる代案では、撮像システムは、ペトリ皿をサンプルホルダー内に又はコンベアベルト上に載置できるロボットアームを備えうる。加えて、ロボットアームは、撮像前にペトリ皿の蓋を取外し、その後に蓋を再配置することができる。これは、ペトリ皿を逆さにし、蓋を落下させることによって行うことができる。蓋を外すことにより、生物学的サンプルが所定の照明源によって照射されるときに蓋が反射を生じさせないのを確実にする。

撮像ゾーンに対する出し入れに加えて、サンプル保持ユニットは、通常の位置に対して生物学的サンプルの位置を変化させる機構をまた備えていてもよい。例えば、サンプル保持ユニットは、サンプルを特定のビームに対して特定の角度になるように配向させることができるようにしてもよい。他の動き、例えば、生物学的サンプルの回転を適当な機構によって実施することもできる。その結果、生物学的サンプルと照明源の任意の相対移動を、サンプル保持ユニットにおける生物学的サンプル又は照明源の何れかを移動させることによって実現することができる。変形は無限である。

撮像システム１１４は、サンプル保持ユニットの上方に位置させられる第一の中間ユニットを更に備える。第一の中間ユニットは、直線状に配置された４つの赤、緑、青の照明源を備える。照明源は、使用にあたり、サンプル保持ユニット中のサンプル凹所上に環状照射を生じるように適応され、かつ独立して制御可能である。環状照射は、側方、非側方、又はあらゆる他の適切な配向を含む、任意の適切な方向からサンプルに入射するように調整されうる。

撮像システム１１４はまた第二の中間ユニットを備える。第二の中間ユニットは、直線状に配置した４つの赤、緑、青の照明源を備える。照明源は上向きにされ、ユニットの上方から反射して逆環状照射を生じ、これが使用中にサンプル凹所中のサンプルを照射する。各照明源は独立して制御可能である。

撮像システム１１４のヘッドユニットは第二の中間ユニットの上方に位置させられる。ヘッドユニットは、それぞれ独立して制御可能である白色光照明源を備える。８つの照明源が配置され、使用時に、サンプル凹所上に垂直照明をもたらす。

ヘッドユニットは、サンプル凹所に向けられたカメラ等の画像キャプチャ装置２５４をまた備える。ユニットの何れかの照明源の任意の組合せによる照射をサンプル凹所に向けることができる。画像キャプチャ装置は、ついで、照射されているサンプル凹所中の任意の生物学的サンプルから画像をキャプチャできる。画像の使用と更なる処理は以下に更に詳細に説明される。

ヘッドユニットは、様々な光源を動作させるために使用される制御パッドをまた備えていてもよい。その機能を制御する各ユニットにおける制御回路及び光学系に加えて、全体制御システムがあってもよい。全体制御システムは、コンピューター、ディスプレイユニット、処理モジュール及び画像増強アルゴリズム、画像処理、及び任意な他のプロセス又は技術を備えうる。

全体制御システムは、どの照明源を特定の用途に使用するかを制御するために使用されうる。加えて、全体制御システムは、異なった画像増強技術及び異なった用途に対する画像処理を適用しうる。画像増強技術は、画像の画質を向上させ、又は関連情報を専門家が見れるように可視化する方法及び技術である。以下により詳細に説明するが、例としては、垂直統合又は溶血のための統合のような異なった画像の統合、エッジ照明補正、露光時間補正等がある。画像処理は、決定支援又は自動決定を提供するための画像からの情報の抽出である。これは、必ずしも画像の修正を含むものではなく、より高レベルの情報／解釈を自動的に決定することを含む。以下により詳細に説明するが、例としては、皿の環の検出、マークの検出、増殖（集団、孤立コロニー、スウォーミング）の検出、増殖／非増殖に関する全体的な決定等がある。

全体制御システムを使用して、撮像システムに対する任意の他の機能及び／又は制御動作を実行することができる。これらには、限定されないが、以下のものがある：
－ サンプル凹所内へのサンプルの添加及び取出し；
－ サンプル凹所内へのサンプル位置決めのチェック及び調整；
－ 輝度レベルの制御；
－ 赤、緑、青成分バランスの制御；
－ 露光時間の制御；
－ 照明組合せの制御；
－ システムの検査；
－ システムの較正；及び
－ 使用及び分析目的に基づく任意の他の適切な制御。

撮像システムを形成するユニットの各々は、他のユニットに対して相対移動させることができる。これがなされるとき、生物学的サンプルが全ての照明源によって照射されるのを確実にするために所定の光学的調整が必要な場合がある。

撮像システム１１４の作用を、以下に図３を参照してより詳細に説明する。

図３は、様々な照明源と、これら照明源が撮像システム１１４に位置させられた生物学的サンプルにどのように影響を与えるかを示す撮像システム１１４の概略図である。サンプルは、生物学的サンプルを含むペトリ皿の面と同じ面に位置させられた略水平のビーム３０２，３０４によって照射されうる。略水平のビームは、実際には、参照符号３０２及び３０４で示されたものに加えて、紙面に対して直交する成分を含む。略水平のビーム３０２，３０４は、サンプル保持ユニット中の水平照明源によってつくられる。

サンプルはまたベースユニットによってペトリ皿の下で発生されられ、撮像システム１１４の底部から撮像システム１１４の頂部に向かって垂直方向に発するバックライトビーム３０６によっても照射されうる。

環状ビーム又は底部環状ビーム３０８もまた生物学的サンプル３００を照射することができ、ペトリ皿の上方に位置する第一の中間ユニットによってつくられる。底部環状ビーム３０８は、ペトリ皿に向かって決められた角度で発せられる。ペトリ皿の上方に位置させられた第二の中間ユニットによってつくられる逆環状ビーム又は上部環状ビーム３１０もまたペトリ皿を照射することができる。逆環状ビーム３１０は、ペトリ皿から離れる方向に撮像システム１１４の上部に向かって決められた角度で発せられ、ついでペトリ皿に向かって反射される。

垂直ビーム３１２もまたペトリ皿を照射することができ、ヘッドユニット中の照明源によって生成される。

垂直ビームとバックライト照明は、ペトリ皿中の生物学的サンプルに対して実質的に直交する方向に照射する。従って、これら照明源の各々の光軸は生物学的サンプルに対してまた直交する。略水平の照明、環状照明及び逆環状照明は、ペトリ皿に直交しない。よって、同様に、これらの光源の光軸は生物学的サンプルに非直交である。非直交源は、直交源で達成されるものに対して多様な範囲又は代替的な画像をもたらす。これら非直交源は、それらでつくり出される任意の画像に、付加的で異なった光学的特徴をもたらす。これにより、コロニーのアイソレーションと検出が確実に改善される。

図３に示され、適切なユニットによりつくられる照明源は、任意の好ましいタイプ、例えば、赤、緑及び青（ＲＧＢ）周波数で動作する発光ダイオード（ＬＥＤ）；単純な白色光源；紫外光（ＵＶ）源、又は任意な他の適切な放射源でありうる。照明源は、例えば、６４個の白色ＬＥＤ、８６個の赤色ＬＥＤ、８６個の緑色ＬＥＤ及び８６個の青色ＬＥＤを含む３２２個のＬＥＤを含みうる。任意の位置における光源の数は、ここに示し記載したものとは変えることができる。ＲＧＢ照明は、各位置において各それぞれの周波数で動作する３色ＬＥＤのトリオにして設けられる。異なった照明源に対しては、ＲＧＢ ＬＥＤの異なる組合せが存在しうる。各タイプの照明は、ＬＥＤの特定の配置を有する特定のカードによって提供される。ベースユニットは、それぞれが３個で配置された複数のダイオードを有する２つのカードによってバックライトビーム３０６を生じさせる。ＬＥＤ４０４の各トリオは、赤、緑及び青色ＬＥＤを含む。全体で４５のＬＥＤトリオが各カードに位置させられ、バックライトビーム３０６を生成するのに使用される。各トリオのうち、赤、緑及び青色ＬＥＤを一度に一回点灯し、一つの色の照明を他の色の後につくるようにすることができる。

上述した照明の全ての例では、生物学的サンプルの画像は画像キャプチャ装置２５４によって上方からキャプチャされる。コロニーの増殖及び他の時間に関連する効果を測定するために、画像キャプチャ装置２５４が、予め決められた時間の期間にわたり一連の画像シーケンスのセットを撮り込んでもよいことに留意されたい。加えて、画像キャプチャ装置２５４は、コロニーの増殖進行等が測定されている所定の用途ではビデオカメラであってもよい。ペトリ皿の動きはまた適当なコンベアベルト又はロボットアームによって撮像システム１１４にペトリ皿を出し入れすることによってもたらすこともできる。

画像キャプチャ装置２５４は、異なった照明源から異なったタイプの画像を撮るように適応される。典型的には、特定の用途に対して一連の画像が撮られる。このシーケンスは、特定の照明又は照明の組合せでサンプルを照射するステップと、これに続く、関連照明により、例えば単色、白黒、又はＲＧＢのような特定のタイプの画像を撮るステップとを含む。ついで、次の画像が、異なったタイプの照明又はその組合せで撮られ、全ての必要な画像が撮られるまでこのシーケンスが継続する。画像キャプチャ装置２５４は、適切なタイプの画像を撮るためにシーケンス内で制御される。

先に述べたように、撮像システム１１４における生物学的サンプルは、異なった方向からサンプルに当たる複数の異なった光源から照射されうる。生物学的サンプルが照射された後、生物学的サンプルの画像が上方から撮られる。各照射は、生物学的サンプルの異なった様態を強調する。

バックライト照明は、ペトリ皿のベース上の任意のマーキング、ペトリ皿のエッジ及び蓋の形態を含むペトリ皿の詳細；及び生物学的サンプル中のコロニーの配置及び密度の詳細なビューを示す。この照明は、コロニーをアイソレートし、類似のコロニー（例えば、α及びβ溶血性種）間の相違を判定することができる情報を提供し、一般的にサンプルの内容物のビューを与える。

略水平の照明は、サンプル及びその内容物によって屈折され反射されて、アーティファクトをアイソレートし、排除するのに使用されうる画像を形成する。加えて、この画像は、以下に更に詳細に説明されるように培地による照射の吸収に基づいて補正を行うために使用することができる。また、画像を後で使用し、コロニーによるペトリ皿のカバー率を決定して、コロニー濃度の推定値を提供し、また不透明でない培地上での増殖又は非増殖を判定することができる。

環状照明は、サンプルに向けられ、培地と形成されている任意のコロニーとによって画像キャプチャ装置２５４まで反射され又は屈折される。この照明によって生成される画像の目的は、培地とコロニーの色を識別する能力にある。色を識別する能力は、幾らかの微生物が非常に特有の色彩を有しているため、特定の微生物を同定するための重要なツールとなることがよくある。全体の結果は、生物学者が微生物の特定のタイプ、例えば、色、コロニー様態等について見ようと期待するものに最も近いビューである。これは、培地とコロニー周辺の色彩の微かな変化を識別するのに特に重要である。加えて、環状照明により生成される画像は、発色培地中の細菌コロニーの下側と周辺の色の微かな変化を検出することを可能にする。

側方環状照明は、４つの直線的に位置させられた照明源のうちの一つのみによる照明である。これにより、輪郭と凹凸を識別するのに使用できる陰影を有する画像が得られる。照明源の各々が、照射方向の結果として異なった陰影効果を生じる。

逆環状照明は、ヘッドユニットからサンプル上へ反射される。ついで、サンプルは照射を画像キャプチャ装置２５４まで反射させ又は屈折させる。このようにしてキャプチャされた画像は、サンプル中の異なったコロニーのコントラストの詳細を与える。この画像はまた色情報に寄与しうる。加えて、この画像は、テクスチャ情報；コロニーの様態及び色；スウォーミング限界についての情報及びコロニーの凹凸についての所定の情報、例えば、隆起、形態及び形状を提供しうる。

逆環状照明は、階調変化を可視化できる疑似垂直照明をつくり出す。これはテクスチャと粒度情報を与え、また大きな隆起はないが、不規則表面を有するコロニーを検出するのに有用である。一実施態様では、画像の飽和の可能性に対処するために、逆環状照明を使用して多数の異なった画像を撮り、続いて統合させることができる。

垂直照明源は、生物学的サンプルを上方から照射する。この照射は生物学的サンプル及びコロニーによって反射されて、詳細な輪郭情報を与える画像が得られる。これを使用して、生物学的サンプルの凹凸とコロニーの高さを識別することができる。次に、コロニーの凹凸は非常に特定的であることが多いため、この情報を使用して微生物の特定のタイプを判定することができる。例えば、あるコロニーはドーム形状をしており、他のものはでこぼこで、また他のものは平坦である等々である。

上述のように、照明源と方向の各々を使用して、異なった画像特性を強調し、向上させることができる。記載した実施例は、本発明の範囲から逸脱することなく、異なる照明源と方向からの照射を使用することにより、変更させ又は適応させることができる。

更に、例えば赤外線や紫外線のように、照明の異なった波長を異なった用途に使用することができる。

撮像システム１１４は、照明源の組合せから画像をつくり出して、生物学的サンプルの画像の一つより多くの特徴を強調し向上させうる複合画像を作成することができる。

作成される画像に対して効果を有しうる他の要因は、サンプルを増殖させるために使用される培地のタイプである。多くの異なった培地が存在し、これらには、特に尿サンプルを使用して大腸菌、プロテウス属、及びＫＥＳＣを同定するように適合された培地であるＣＰＳ；及び溶血能を識別するのに有用な血液を含む培地であるＣＯＳが含まれる。

異なった培地、例えばＣＰＳ及びＣＯＳは、性質と色がかなり異なる。その結果、これら培地に加わる照明は異なるタイプの画像をつくり出しうる。而して、異なった照明源と照明源の組合せを異なる培地に使用することができる。

先に述べたように、システム１００は、処理システム１０８と分析ユニット１１０を備える。処理システム１０８は、第一の処理ユニット１１６、第二の処理ユニット１１８、計算ユニット１２０及び特徴抽出ユニット１２２を備える。

第一の処理ユニット１１６は、微生物のコロニーに関連付けられたペトリ皿の内容物と培地に関連付けられたペトリ皿の内容物との間の目に見える分離線を示す二値画像を取得するために、バックライト又は底部環状ビューなどのペトリ皿の原画像に適用され、撮像システム１１４によって提供されるセグメンテーション処理である第一の処理を動作させることができる。よって、第一の処理ユニット１１６は、微生物のコロニーに関連付けられた画素のみに関連する可視画素を含むＧｒｏｗｔｈＭａｓｋと名付けられた二値画像である第一の処理済み画像を提供する。

第一の処理ユニット１１６は、ペトリ皿のエッジに対するペトリ皿の内容物の位置を見つける周知のエッジ検出処理と、画像ノイズを除去するための周知の処理において２つの原画像を統合させる周知の統合処理とを含む追加の処理をまた動作させることができる。

第二の処理ユニット１１８は、Ｄｉｌａｔｅｄ（ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋ）と名付けられた第二の処理済み画像を得るためにＧｒｏｗｔｈＭａｓｋに適用されている膨張演算である第二の処理を動作させることができる。Ｄｉｌａｔｅｄ（ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋ）は、微生物のコロニーに関連付けられた画素とまた微生物のコロニー周辺の周囲ゾーンに関連付けられた画素のみに関連する可視画素を含む。膨張パラメータは、Ｄｉｌａｔｅｄ（ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋ）が周囲ゾーンを包含するように定義される。膨張パラメータは、以下に記載のようにユーザーによって決定される。周囲ゾーンは、同じ画像中の微生物の色と比較したときに別の色を示すゾーンに関連しうる。周囲ゾーンは、微生物の色の変色を示すゾーン、又は同じ画像中の微生物の色と比較したときに新しい色素沈着を示すゾーンにまた関連しうる。

計算ユニット１２０は、２つの画像間の差分計算に関する第三の処理を動作させて結果の画像を取得することができる。よって、計算ユニット１２０は、ペトリ皿の原画像、すなわちＤｉｓｈＭａｓｋとＧｒｏｗｔｈＭａｓｋとの間の差分を計算して、ＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋと名付けられた第三の処理済み画像を提供することができる。ＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋは、培地に関連付けられた画素のみに関連する可視画素を含む。

計算ユニット１２０はまたＤｉｌａｔｅｄ（ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋ）とＧｒｏｗｔｈＭａｓｋとの間の差分計算に関する第四の処理を動作させて、ＨａｌｏＭａｓｋと名付けられた第四の処理済み画像を提供することができる。ＨａｌｏＭａｓｋは周囲ゾーンのみに関連する可視画素を含む。

特徴抽出ユニット１２２は、ＨａｌｏＭａｓｋ及びＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋの特徴量を決定するための特徴抽出処理を動作させることができる。特徴量は、ＨａｌｏＭａｓｋとＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋの画素値に関連する。特徴抽出ユニット１２２は、少なくとも３つの赤緑青（ＲＧＢ）色チャネルについて、第三の処理済み画像の平均画素値と第四の処理済み画像の平均画素値との間の差分を計算する。上述のように、「平均画素値」という用語は、画素値の算術平均又は画素値の中央値を指す。
分析ユニット１１０は、細菌の存在を判定し、前記細菌を同定するために、決定された特徴量に基づいて分析処理を動作させることができる。より具体的には、分析ユニット１１０は、指標の値を、決定された閾値と該指標の値を比較するために決定する。比較の結果に応じて、分析ユニット１１０はペトリ皿内の細菌の存在又は細菌の非存在の何れかを判定する。

本発明によれば、図４に示されるように、本方法は、特定の照明条件に従って、撮像システム１１４を用いてペトリ皿の原画像を取得するためのステップ４００を含む。確かに、照明条件は、同定される細菌の種類によって変わりうる。原画像は、例えば、ペトリ皿のエッジを検出するために処理されてもよい。

次に、本方法は、セグメンテーション処理である第一の処理を原画像に適用することによってＧｒｏｗｔｈＭａｓｋと名付けられた第一の画像を取得する、第一の処理済み画像を取得するためのステップ４０２を含む。ついで、本方法は、膨張処理である第二の処理を第一の処理済み画像に適用してＤｉｌａｔｅｄ（ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋ）と名付けられた第二の画像を取得する、第二の処理済み画像を取得するためのステップ４０４を含む。本方法は、第三の処理を適用してＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋと名付けられた第三の画像を取得する、第三の処理済み画像を取得するための更なるステップ４０６を含む。本方法は第四の処理を適用してＨａｌｏＭａｓｋと名付けられた第四の画像を取得する、第四の処理済み画像を取得するためのステップ４０８をまた含む。本方法は、第三の処理済み画像と第四の処理済み画像に関連付けられた特徴量を決定して、第三の処理済み画像と第四の処理済み画像との間の色差分を決定するためのステップ４１０を更に含む。本方法は、特徴量を分類することによって指標の値を決定するためのステップ４１２をまた含む。ついで、ステップ４１４において、指標の値が閾値と比較される。本方法は、細菌の存在を判定し、かつペトリ皿中の前記細菌を特定された細菌であると同定する最終ステップ４１６を含む。

本発明の第一の実施態様では、本方法は溶血現象を識別するためのベータ溶血性細菌の存在の判定に関する。第一の実施態様の方法は、図５に示される以下のステップを含む。

第一の実施態様では、ＨａｌｏＭａｓｋは、溶血現象の特徴である微生物コロニーの周辺の変色又は退色ゾーンを示すハローゾーンに関する。変色ゾーンは、同じ画像中の微生物の色から生じる。培地は血液寒天である。

第一の実施態様では、本方法は、図７ａ、７ｂ、及び７ｃに示される画像の統合からなる初期画像を取得するためのステップ５００を含む。初期画像は、撮像システム１１４を用いてＲＧＢ色チャネルに対して中央底部環状ビューを使用することによって取得される。実際、溶血現象は、このビューで撮影された画像、特に緑色及び青色チャネルで、あまり目立たない。図７ａは、赤色チャネルに対する原画像を示す。図７ｂは緑色チャンネルに対する原画像を示し、図７ｃは青色チャンネルに対する原画像を示す。

ついで、本方法は、周知のエッジ検出法を用いてペトリ皿のエッジを決定するためのステップ５０２と、周知のガウスフィルタを用いて画像ノイズを除去するためのステップとを含み、ここでσ＝１及びｋ＝５×５である。

ついで、本方法は、各色チャネルを分離するためのステップ５０４と、双方の画像に対して平均画素値を持つ緑色チャネルからの画像と青色チャネルからの画像を統合して平均画像を提供するためのステップ５０６とを含む。確かに、赤色チャンネルから画像を除去すると、ハローゾーンを微生物コロニーと見なすことが回避される。

本方法は、以下のステップを含むセグメンテーション処理を更に含む。セグメンテーション処理は、緑色チャネル画像と青色チャネル画像の統合画像に基づいて、周知の大津法に従ってステップ５０８において閾値を決定することを含む。確かに、大津法は、決定された画像上の位置（ｘ，ｙ）における画素値の平均値を比較するｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｏｔｓｕ）と呼ばれる閾値を提供する。より具体的には、大津法は、明画素値が第一のクラスに関連し、暗画素値が第二のクラスに関連する、クラス内分散及びクラス間分散に関連する比率を最小にする閾値を提供する。本願の状況では、明画素が微生物コロニーに関連し、暗画素が培地に関連する。

ついで、本方法は、次のセグメンテーション式（１）を適用することによって中央底部環状画像をセグメント化するためのステップ５１０を含む：

ここで、

は緑色及び青色チャネルに対する同じ画像上の位置（ｘ，ｙ）にある同じ画素の平均値である。

大津法の適用は二値画像を提供する。

本方法は、図８に示されるＧｒｏｗｔｈＭａｓｋと呼ばれる二値画像を得るために二値画像に対して周知のクロージング演算子に基づくモルフォロジー演算を適用するための任意的なステップ５１２をまた含む。

ついで、第一の実施態様に係る方法は、撮像システム１１４でバックライトビューを使用することによって、図６に示された第二の原画像を取得するための別のステップ５１４を含む。確かに、溶血現象は、このビューで撮影された画像においてより明確であり、培地に関連するゾーンは赤であり、変色ゾーンは、白色もしくは黄色、又は黄色と白色からなる複合色で透明であり、微生物に関連するゾーンは黒色など暗い。

本方法は、ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋに周知の膨張演算を適用するためのステップ５１６を含み、前記膨張演算は、ディスク状部材などの構造化部材に基づいている。膨張演算は、Ｄｉｌａｔｅｄ（ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋ）と呼ばれるＧｒｏｗｔｈＭａｓｋの対応する膨張画像を取得するために、ｍａｔｌａｂ関数ｉｍｄｉｌａｔｅなどの周知の関数と、特定の膨張パラメータｄを用いて演算される。

図９ａに示されるＨａｌｏＭａｓｋと図９ｂに示されるＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋは、以下に示されるようにＤｉｌａｔｅｄ（ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋ）から推定できる。

ここで、ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋに示された微生物のコロニーがＤｉｌａｔｅｄ（ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋ）から除去されてＨａｌｏＭａｓｋが得られる。

ここで、微生物のコロニー及び溶血現象に関連するハローゾーンがＤｉｓｈＭａｓｋから除去されてＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋが得られる。

ＨａｌｏＭａｓｋは微生物コロニーの周辺の色を示す。
ＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋは、培地の元の色、つまり微生物の増殖による影響を受けていない色を示す。

次のステップ５１８において、ＨａｌｏＭａｓｋとＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋがそれぞれ画素パッチに分割される。図１０ａはＨａｌｏＭａｓｋの画素パッチを示し、図１０ｂはＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋの画素パッチを示す。図１０ａ及び図１０ｂにおいて、各画素パッチは２００×２００ピクセルを含み、膨張のサイズは５０ピクセルである。画素パッチのサイズは、関連する中央値を検出するように適応される。

ＨａｌｏＭａｓｋとＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋの分割は、ＨａｌｏＭａｓｋのための２つの隣接する画素パッチとＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋのための２つの隣接する画素パッチの間で５０％のオーバーラップ率で処理される。よって、ハロー画素と培地画素の両方を含む画素パッチの数が最適化される。

加えて、ＨａｌｏＭａｓｋに関連した画素パッチに対して基準が設定される。ハローゾーンが１００未満のピクセルを含む領域を含む画素パッチは、本方法の次のステップには考慮されない。

更なるステップ５２０において、ＨａｌｏＭａｓｋ及びＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋの中央画素値が、各画素パッチに対して、ＲＧＢ色空間の各チャネルに対して、またグレースケール表示に対して演算される。

ＨａｌｏＭａｓｋ及びＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋについての統計的中央画素値の差分の計算は、膨張パラメータｄの増加する値に基づいて数回処理される。

次のステップのために選択されるべき膨張パラメータｄの決定は、次にステップ５２２において処理される。

膨張パラメータｄの決定は、ＨａｌｏＭａｓｋの画素値とＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋの画素値との間の差分値を最大にする膨張パラメータｄの値を決定する次の式に基づく。以下の膨張式（２）が、各ＲＧＢ色チャネル及びグレースケール表示に対して適用される：

膨張パラメータの増加する値は、１０ピクセルから６０ピクセルまでの間隔において、ｄの２つの連続する値に対して１０ピクセルの幅で、選択される。

ステップ５２２は、Ｄｉｌａｔｅｄ（ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋ）と呼ばれる複数の二値画像、従って複数のＨａｌｏＭａｓｋとＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋを提供する。

図１１ａ、１２ａ及び１３ａは、それぞれ、異なる値の膨張パラメータｄを有するＨａｌｏＭａｓｋの一例を示すもので、図１１ａではｄ＝１０ピクセル、図１２ａではｄ＝５０ピクセル、そして図１３ａではｄ＝６０ピクセルである。

図１１ｂ、１２ｂ及び１３ｂは、それぞれ、異なる値の膨張パラメータｄを有するＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋの一例を示すもので、図１１ｂではｄ＝１０ピクセル、図１２ｂではｄ＝５０ピクセル、そして図１３ｂではｄ＝６０ピクセルである。
本願の状況では、決定された膨張パラメータはｄ＝５０ピクセルである。

決定された膨張パラメータに基づいて、ＨａｌｏＭａｓｋとＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋとの間の同じチャネルに対する中央画素値の差分が、ＲＧＢ色チャネルに対する中央値とグレースケール表示の中央値との間の４つの差分値を提供する次の特徴式（３）を適用することによってステップ５２４において演算される：

更なるステップ５２６において、分析ユニット１１０は、以下の期待値式（４）を用いて計算される閾値を設定する決定された規則に従って特徴パッチ値を分類するためのステップを動作させる：

ここで、Ｆｅａｔｕｒｅｓパッチは、青チャネル上のＨａｌｏＭａｓｋとＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋとの間の中央画素値の差分値である。

図１４ａは、ベータ溶血性細菌、アルファ溶血性細菌及びガンマ溶血性細菌にそれぞれ関連するペトリ皿の画像を、青チャネル上のパッチレベルでの特徴量の表示と共に示す。

期待値式に関連する値のセットは、Ｂｅｔａ溶血パッチとＮｏＢｅｔａ溶血パッチの分布を表し、ここで、Ｂｅｔａ溶血パッチは溶血現象を表すハローゾーンを含み、ＮｏＢｅｔａ溶血パッチは溶血現象を表すハローゾーンを含まない。

ステップ５２８において、ＮｏＢｅｔａ溶血パッチの分布が、図１４ｂに示されるように、平均値μ及び標準偏差σに基づくガウス分布と比較される。

図１４ｂ
に示され、以下の３σ規則（５）に基づく閾値は、以下に示されるように正規分布を決定するように設定される：

これは、閾値がμ＋３σに等しいことを意味する。

ステップ５３０において、分析ユニット１１０は、ベータ溶血性細菌の存在又は非存在を判定する。Ｆｅａｔｕｒｅｓパッチ値が高い正の値の場合、これらの値はベータ溶血性細菌の存在を示している。

Ｆｅａｔｕｒｅｓパッチ値が負であるか又は０に近い場合、これらの値は、アルファ溶血性又はガンマ溶血性細菌の存在など、他の現象を示している。

更なる特定の実施態様では、画素パッチの使用は、局所的に、すなわちペトリ皿の画像の特定のゾーンにおける、溶血現象の存在を判定するための方法を提供する。

プロテウス菌の存在の判定に関する本発明の第二の実施態様によれば、本方法は図１５に示される以下のステップを含む。

第二の実施態様では、ＨａｌｏＭａｓｋは、微生物コロニーの周辺の色素沈着ゾーンを示すハローゾーンに関し、色素沈着ゾーンの色は、同じ画像中の微生物の存在によって引き起こされる。培地は、ＣＰＳなどの発色培地に関連する。

第二の実施態様では、本方法は、バックライト無背景ビューと中央底部環状の黒背景ビューを使用することによってペトリ皿の２つの元のビューを取得するためのステップ１５００を含む。中央底部環状の黒背景ビュー画像は、４つの底部環状側方ビュー画像の中央値画像である。

図１６ａは、バックライト無背景ビューを使用することによってペトリ皿の原画像を示している。実際には、図１６ａは、微生物コロニーの存在に関連する暗いゾーンを示し、色素沈着ゾーンは、暗いゾーン周辺の褐色を有するゾーンに関連する。

ついで、本方法は、ペトリ皿のエッジを周知のエッジ検出法で決定するためのステップを含む。

本方法は、書誌参照［１］に開示されている特定のグラフベースの領域セグメンテーション処理を適用するためのステップ１５０２を更に含む。

グラフベースの領域セグメンテーション処理は、培地ゾーンに関連する背景と呼ばれる第一の領域と、ペトリ皿の残りの部分に関連する前景と呼ばれる第二の領域とを含み、またセリグラフィに関連するセリグラフィゾーンを含む画像を提供する。

そのようなセグメンテーション処理は、同じマスク内、すなわち同じ前景領域内で、微生物コロニーのクラスターと微生物の孤立したコロニーの両方をセグメント化する。加えて、グラフベースの領域セグメンテーションは、プロテウスハローの存在を伴う本願の状況におけるように、培地ゾーンの僅かな色の変化に適応される。

セグメンテーション処理は、周知の検出アルゴリズムを用いてセリグラフィゾーンを検出するためのステップをまた含む。

ついで、セグメンテーション処理は、図１６ｂに示されるように、ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋと呼ばれる二値画像を提供する。

本方法は、ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋに膨張演算を適用するための更なるステップ１５０４を含み、前記膨張演算は、ディスク形の部材などの構造化部材に基づいている。膨張演算は、Ｄｉｌａｔｅｄ（ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋ）をつくり出すためにｍａｔｌａｂ関数ｉｍｄｉｌａｔｅのような周知の関数によって演算される。

ＨａｌｏＭａｓｋは、微生物コロニー周辺の色素沈着ゾーンを含みうるゾーンに関連し、前記色素沈着ゾーンがプロテウス菌の存在を表している。ＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋは、培地の元の色、つまり色素沈着ゾーンの影響を受けていない色を示す。

図１７ｂに示されるＨａｌｏＭａｓｋと図１７ｃに示されるＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋは、以下の式（６）及び（７）に示されるように、図１６ａに示される原画像に関連するＤｉｌａｔｅｄ（ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋ）及びＤｉｓｈＭａｓｋから推定することができる：

膨張演算は、膨張パラメータｄの増加する値に基づいて数回適用される。膨張パラメータｄの増加する値は、１０ピクセルから７０ピクセルまでの間隔において、ｄの２つの連続値に対して１０ピクセルの幅で、選択される。ステップ１５０４は、Ｄｉｌａｔｅｄ（ＧｒｏｗｔｈＭａｓｋ）と呼ばれる複数の画像を提供する。

図１８ａは、膨張パラメータｄ＝７０ピクセルのＨａｌｏＭａｓｋの例を示している。
図１８ｂは、膨張パラメータｄ＝１０ピクセルのＨａｌｏＭａｓｋの例を示している。

次のステップにおいて、特徴抽出ユニット１２０が、ＨａｌｏＭａｓｋ及びＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋの特徴を決定する。従って、特徴抽出ユニット１２０は色特徴を抽出する。

本方法は、ＲＧＢ色空間及びＨＳＶ（色相、彩度、明度）空間についての画素値の統計的中央値を演算するためのステップ（図示せず）を含む。ＨＳＶ空間では、０と１が同じ色相値に対応する色相スケールの不連続性を回避するために、値Ｈがベクトル（ｃｏｓＨ，ｓｉｎＨ）で置き換えられる。よって、ＨＳＶ空間は４つのチャネルを含む。

統計的中央値を演算するために、２つの異なる画像が選択される。第一の画像はバックライト無背景ビューに関連し、第二の画像は中央底部環状の黒背景ビューに関連する。中央底部環状の黒背景ビュー画像は、４つの底部側方ビュー画像の中央値画像である。

本方法は、各ＲＧＢ色チャネル及びＨＳＶ空間の各チャネルについて、次の特徴式（８）を演算するためのステップ１５０６を含む：

ＲＧＢ色空間では、２つの異なる画像に７つの膨張演算が適用される３つのＲＧＢ色チャネルがある。従って、上記の式を適用する場合、抽出される合計４２の特徴がある。

ＨＳＶ空間では、７つの膨張演算が２つの異なる画像に適用される４つのチャネルがある。従って、上記の式を適用する場合、抽出される合計５６の特徴がある。

ついで、抽出された特徴の全体の合計は９８である。

ついで、分析ユニット１２０が、従来技術において周知の教師あり学習プロセスに使用される２つの分類アルゴリズムに基づいて分類ステップ１５０８及び１５１０を適用することによって動作する。

第一の分類アルゴリズムは、分類及び回帰ツリー（ＣＡＲＴ）アルゴリズムに関連する。例えば、ｍａｔｌａｂクラス「ＣｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎＴｒｅｅ」がＣＡＲＴアルゴリズムをモデル化するために使用される。第一のアルゴリズムの適用は、ペトリ皿がプロテウス菌を含む可能性を表す第一のスコア値を提供する。

第二の分類アルゴリズムは、サポートベクターマシン（ＳＶＭ）アルゴリズムに関連し、ライブラリー「ｌｉｂＳＶＭ」を使用して作成される。第二のアルゴリズムの適用は、ペトリ皿がプロテウス菌を含む可能性を表す第二のスコア値を提供する。

第一のスコアと第二のスコアは２つの異なる分類アルゴリズムによって提供されるので、第一のスコアと第二のスコアは比較可能な値ではなく、最終スコアを決定するために同じ計算内で組み合わせることはできない。

分類ユニット１２０は、ベイズ定理を適用して事後確率の値、すなわちｐ（Ｈａｌｏ； Ｘ）を取得することによって動作し、ここで、Ｈａｌｏはハローを表すイベントである。

第一の分類アルゴリズムでは、ＸはＣＡＲＴアルゴリズムによって選択された特徴の量を表す。選択された特徴は、９８の既存の特徴のなかでプロテウス菌の存在を判定するための最も識別力のある特徴である特徴に関連する。

第二の分類アルゴリズムでは、Ｘは決定線から最も近い例の距離を表す。最も高い距離Ｘは、ペトリ皿がプロテウス菌を含む可能性を決定するための信頼できる結果を表す。

ハローの存在の確率は、以下の式（９）で計算することができる：

－ ここで、ｐ（Ｘ；Ｈａｌｏ）はペトリ皿がＨａｌｏを含むと仮定するＸを観測する確率であり；
－ ｐ（Ｈａｌｏ）はハローの存在の先験確率であり；
－ そして、ｐ（Ｈａｌｏ；Ｘ）は、値Ｘが与えられた場合のハロー存在の確率である。

ペトリ皿にプロテウス菌が含まれていない場合、ハローが発生する確率は０になると予想される。

しかしながら、ペトリ皿が視覚的なハローを有さず、ハローを有する確率がまた０に等しいプロテウス菌を含む場合がありうる。従って、プロテウス菌の検出を容易にするために、上記の式（９）はそのような状況の考慮を避けるために修正される。以下の式（１０）は、全てのプロテウス菌について可視ハローの存在に関連した仮説を考慮に入れている。

分類ユニット１２０は、ついで、以下の式（１０）を演算する。

－ ここで、ｐ（Ｘ；Ｐｒｏｔｅｕｓ）は、ペトリ皿がプロテウス菌を含むと仮定するＸの確率であり；
－ そして、ｐ（Ｐｒｏｔｅｕｓ）は、プロテウス菌の存在の先験確率である。

確率ｐ（Ｘ；Ｐｒｏｔｅｕｓ）に関連する値の集合は、平均値μ及び標準偏差σを有するガウス分布に基づく値の分布として図１９に表される。

ｐ（Ｐｒｏｔｅｕｓ）は先験確率であり、デフォルトで１／６に設定された調整可能なパラメータである。実際、ＣＰＳ培地は最大６クラスの細菌を含みうる。

ｐ（Ｘ）は、以下の式（１１）により計算される正規化因子の推定値である：
ｐ（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、ｐ（Ｘ；Ｐｒｏｔｅｕｓ）、ｐ（ＮｏＰｒｏｔｅｕｓ）及びＰ（Ｘ；ＮｏＰｒｏｔｅｕｓ）は、教師あり学習プロセスに使用されるデータセットから既知である。

従って、更なるステップ１５１２において、ｐ（Ｈａｌｏ；Ｘ）の第一の値が、第一の分類アルゴリズム、すなわちＣＡＲＴアルゴリズムに関連した第一のスコアを用いて計算される。

更なるステップ１５１４において、ｐ（Ｈａｌｏ；Ｘ）の第二の値が、第二の分類アルゴリズム、すなわちＳＶＭアルゴリズムに関連した第二のスコアを用いて計算される。

従って、ｐ（Ｈａｌｏ；Ｘ）の第一及び第二の値は、今は同じタイプの値、すなわち比較可能な値である第一及び第二の確率に関連する。

更なるステップ１５１６において、ｐ（Ｈａｌｏ；Ｘ）の第一及び第二の値の最小値が取得され、ｐ（Ｈａｌｏ；Ｘ）の第一及び第二の値の間の最も低い最小値が選択される。

ついで、ステップ１５１６において、０％から１００％の間のプロテウス菌の存在の最終確率が取得される。

ユーザーは、ステップ１５１８においてプロテウス菌の存在の確率の値を比較することによって、ステップ１５２０においてペトリ皿中のプロテウス菌の存在の確率を決定するために５０％のような閾値を使用することを決定することができる。

第一の分類アルゴリズムと第二の分類アルゴリズムにそれぞれ基づく２つの確率の使用は、各分類アルゴリズムによって独立して生じるエラーの補正をもたらす。

プロテウス菌の存在の判定に関連する別の実施態様では、培地は不透明ＣＰＳなどの不透明培地でありうる。

図２０は、プロテウス菌を含む不透明ＣＰＳのような不透明培地を含み、バックライトビューに関連したペトリ皿の原画像を示す。

図２１及び図２２は、それぞれ左側底部環状ビュー及び上部環状ビューに関連した図２０のペトリ皿の画像を示す。

本発明の更なる実施態様は、培養培地が不透明培地である、プロテウス菌の検出に関連した上記の方法に関する。

上記方法に関連するステップ１５００及びステップ１５０４から１５２０は同じままである。セグメンテーション処理の適用に関連するステップ１５０２のステップは、不透明培地の存在を考慮に入れるように適応されなければならない。実際、不透明培地の存在下では、セグメンテーション処理は、適応されたグラフベースの領域セグメンテーションアルゴリズムの適用を含み、セリグラフィゾーンの検出及び除去に関連するステップは除去される。

この実施態様では、原画像として使用される画像は、バックライトビューと上部環状ビューに基づいている。前記原画像と前景抽出処理に関連した閾値を組み合わせる方法などの他のパラメータが、不透明培地を用いたプロテウス菌の検出に関連した方法が効率的な形で動作することを可能にするように適合化される。

以下の説明は、ベータ溶血性細菌の検出とプロテウス菌の検出に関する本発明の方法の適用に関する。

ベータ溶血性細菌の検出に関する方法は、単一細菌コロニーとＣＯＳ及びＣＡＮ培地のような血液寒天培地とを含むペトリ皿を含む第一データセットに適用されており、前記ペトリ皿は２４時間インキュベートされている。

第一のデータセットは合計１０４のペトリ皿を含み、グラウンドトゥルースリファレンスによれば、２１のペトリ皿がベータ溶血性細菌を含み、８３のペトリ皿がベータ溶血性細菌を含まない、すなわちベータ溶血性細菌以外の細菌を含む。

下記の表１は、前記第一データセットに本方法を適用した結果を示しており、合計２１のペトリ皿のうち１４のペトリ皿がベータ溶血性細菌を含んでいると同定され、合計８３のペトリ皿のうち８３のペトリ皿がベータ溶血性細菌を含んでいないと同定されている：

表１から、本発明に係る方法を適用する場合、ベータ溶血性細菌を含む７つのペトリ皿が検出されず、同定されていないようである。確かに、対応するペトリ皿内のハローゾーンははっきりと見えず、従って前記ペトリ皿についてのハローゾーンと培地ゾーンとの間の色の違いは溶血性細菌の存在を判定するのに十分なコントラストレベルをもたらさない。

下記の表２は、９５％の信頼区間と指標としてパーセンテージを使用して、表１に示したものと同じ結果を示す。

上記の表２によれば、グローバル精度のパーセンテージは９３％より高い。
ベータ溶血性細菌の検出に関する方法はまた単一細菌コロニーと血液寒天培地、例えばＣＯＳ及びＣＡＮ培地とを含むペトリ皿を含む第二のデータセットにも適用されており、前記ペトリ皿は２４時間インキュベートされている。

第二データセットは合計７０のペトリ皿を含み、グラウンドトゥルースリファレンスによれば、２４のペトリ皿がベータ溶血性細菌を含んでおり、４６のペトリ皿がベータ溶血性細菌を含まない、すなわちベータ溶血性細菌以外の細菌を含む。

下記の表３は、前記第二データセットに対して本方法を適用した結果を示しており、合計２４１のペトリ皿のうち２３のペトリ皿がベータ溶血性細菌を含んでいると同定され、合計４６のペトリ皿のうち４３のペトリ皿がベータ溶血性細菌を含んでいないと同定されている：

表３から、本発明に係る方法を適用する場合、ベータ溶血性細菌を含む一つのペトリ皿は検出されず、同定されていないようである。実際、ペトリ皿には一つの微生物コロニーしか含まれておらず、セグメンテーション処理では正しいＣｕｌｔｕｒｅＭｅｄｉｕｍＭａｓｋと正しいＨａｌｏＭａｓｋを提供しなかった。

表３から、またベータ溶血性細菌の３つの誤った検出が生じたようである。これらの誤った検出は、ガンマ溶血性細菌のコロニー周辺のハローゾーンの存在によって、又はセリグラフィゾーンの存在によって、又はペトリ皿のエッジの存在によって発生しうる。しかしながら、そのような誤検出は、大津法による閾値の決定に関連する方法のステップにおいて読み出されうる。

下記の表４は、９５％の信頼区間で、指標としてパーセンテージを使用することによって表１に示したものと同じ結果を示している：

上記の表４によれば、グローバル精度のパーセンテージは９４％より高い。
表１、２、３及び４に示された結果は、ベータ溶血性細菌の検出のための本発明の方法に対して９５％の高レベルの精度を示している。

プロテウス菌の検出に関する方法は、単一細菌コロニーと２つの異なるクラスの細菌由来の細菌の混合物と半透明の発色培地を含むペトリ皿に関する第一のデータセットに適用され、前記ペトリ皿は２４時間インキュベートされている。

第一のデータセットは、ハローゾーンを有するプロテウス菌とハローゾーンを有しないプロテウス菌を含む。

上述のように、プロテウス菌を検出するための本発明に係る方法は、特徴データをハローゾーンの存在又はハローゾーンの不存在である２つの異なるクラスに特徴データを分離するために２つの教師ありモデルアルゴリズムを使用することによって特徴を分類するステップを含む。各教師ありモデルアルゴリズムに対して同じデータセットが使用される。

結果の分析は、使用された教師ありモデルの混乱レベルを決定する混同行列である以下の表５に基づいている。

現在の状況では、利用可能なグラウンドトゥルースは、プロテウス菌の存在又はプロテウス菌の不存在であるのに対して、本方法は、ハローゾーンの存在又は不存在に関連する予測を提供する。

分類及び回帰ツリーに関する学習モデルを考慮すると、以下の表６に示された結果が得られる：

表６は、精度レベルが、非常に良好なレベルである９９％であることを示している。
感度レベルは、また良好なレベルである７８％である。上記のように、データセットは、ハローゾーンを有さないプロテウス菌を含むペトリ皿を含む。表６に記載のペトリ皿の２２％の目視検査は、前記ペトリ皿の大部分がハローゾーンを有さないプロテウス菌を含んでいることを示している。また、コロニーの境界は、教師ありモデルアルゴリズムによってハローゾーンであると誤って検出されているようである。しかしながら、統計的中央画素値の使用はこの問題を克服する。

ＳＶＭに関する学習モデルを考慮すると、以下の表７に示される結果が得られる：

ハローゾーンを有し、プロテウス菌を含まないペトリ皿のパーセンテージは、分類及び回帰ツリーについて表６において読み出された対応するパーセンテージとは異なる。

不透明な培地を考慮する場合、プロテウス菌の検出に関する結果は、半透明の培地で読み出された結果とかなり類似している。加えて、不透明な培地を含むペトリ皿ではハローゾーンがより目に見えるので、この方法は偽陰性の検出がより少ない、すなわちプロテウス菌がハロなしとして分類される。

開示から：ＣＡＲＴは、同じ特徴が選択され、１０ピクセルに等しい独特の膨張サイズを持つその独特のノードを保持する。

下記の表８は、ＳＶＭアルゴリズムを適用するための混同行列の一例を示す：

プロテウス菌の検出の実施態様に関して上で説明したように、信頼性指標は、２つの教師ありモデルアルゴリズムであるＣＡＲＴ及びＳＶＭによって提供される事後確率を使用することによってベイズ定理で計算されるパーセンテージである。信頼性指標の値は区間［０；１００］に属し、０％はハローゾーンがないことを意味し、１００％はペトリ皿にハローゾーンがあることを意味する。

上記のように、

－ ここで、ｐ（Ｘ；Ｐｒｏｔｅｕｓ）は、マージンまでの距離をＸとしてペトリ皿にプロテウス菌が含まれていると仮定するＸの確率である；
－ そしてｐ（Ｐｒｏｔｅｕｓ）は、プロテウス菌の存在の先験確率である。

図２３は、教師ありモデルアルゴリズムであるＣＡＲＴ及びＳＶＭの両方について得られた確率の分布を示し、両方の状況において半透明培地と共にプロテウス菌を含むペトリ皿とプロテウス菌を含まないペトリ皿についての確率を示す。
円は、表６及び７に示された偽陽性結果の検出を示す。

図２３はまた、教師ありモデルアルゴリズムであるＣＡＲＴ及びＳＶＭの両方に対する最低確率Ｐｔｒｅｅ及びＰｓｖｍのマージ値Ｐｆを表す最終確率の分布を示す。

５０％の閾値は次のように選択される：

以下の表９では、信頼性指標の結果が評価される。

上記の表９は、非常に良好なレベルである９９％より精度レベルが高いことを示している。確かに、２つの教師ありモデルアルゴリズムによって提供された結果のマージは、偽陽性の検出を回避する。

また、感度のレベルは７１％であり、これは、一部のペトリ皿にはハローゾーンを含まないプロテウス菌が含まれているため、また良好なレベルである。

図２４は、教師ありモデルアルゴリズムのＣＡＲＴ及びＳＶＭの両方について得られた確率の分布を示し、両方の状況に対して、プロテウス菌と不透明培地を含むペトリ皿、並びに不透明培地を含みプロテウス菌を含まないペトリ皿の確率を示している。

図２４はまた、教師ありモデルアルゴリズムのＣＡＲＴ及びＳＶＭの両方に対する最低確率Ｐｔｒｅｅ及びＰｓｖｍのマージ値Ｐｆを表す最終確率の分布を示す。

ペトリ皿を１８時間インキュベートした別の状況では、以下の表１１に示す結果が半透明培地について得られている。

不透明培地についての対応する結果を以下の表１２に示す。

上記の表１１及び１２に示されるように、１８時間及び２４時間の期間にわたって得られた結果は、半透明又は不透明な培地を含むペトリ皿について安定している。

書誌参照
[1] Pedro F. Felzenszwalb, Daniel P. Huttenlocher,「効率的なグラフベースの画像セグメンテーション」; International Journal of Computer Vision, 2004年9月、第59巻、第2号、167-181頁

Claims (17)

1. 微生物の一又は複数のコロニーと培地とを含むペトリ皿中の少なくとも一種の特定された微生物の存在を判定するための方法であって、前記培地が、微生物の一又は複数のコロニーと、存在する場合前記少なくとも一種の特定された微生物とが適切な増殖条件下で増殖するのを可能にするように適応されている方法において、
   － 撮像システムを用いて、ペトリ皿の少なくとも一つの初期画像を取得するステップであって、第一の初期画像が複数の可視画素を含み、各画素が画素値と関連付けられているステップ；
   － 少なくとも一つの初期画像に第一の処理を適用することによってペトリ皿の第一の処理済み画像を取得するステップであって、第一の処理済み画像の可視画素が微生物の一又は複数のコロニーに関連付けられた画素のみに関連しているステップ；
   － 第一の処理済み画像に第二の処理を適用することによってペトリ皿の複数の第二の処理済み画像を取得する ステップであって、第二の処理済み画像の可視画素が微生物の一又は複数のコロニーと微生物の前記一又は複数のコロニーの周辺の周囲ゾーンとに関連付けられた画素のみに関連しているステップ；
   － 少なくとも一つの初期画像と複数の第二の処理済み画像との間の差分を計算することによってペトリ皿の複数の第三の処理済み画像を取得するステップであって、複数の第三の処理済み画像が培地に関連付けられた画素のみに関連する可視画素を含むステップ；
   － 複数の第二の処理済み画像と第一の処理済み画像との間の差分を計算することによってペトリ皿の複数の第四の処理済み画像を取得するステップであって、複数の第四の処理済み画像の可視画素が周囲ゾーンに関連付けられた画素のみに関連しているステップ；
   － 複数の第三の処理済み画像の平均画素値と複数の第四の処理済み画像の平均画素値との間の差分値を、赤緑青（ＲＧＢ）色チャネルの少なくとも各色チャネルについて計算することによって、複数の第三及び第四の処理済み画像に関連付けられた特徴量を決定するステップ；
   － 決定された特徴量を分類することによって、ペトリ皿中の周囲ゾーン内の少なくとも一種の特定された微生物の存在の指標の値を決定するステップ；
   － 指標の値を閾値と比較するステップ；
   － 比較の結果に応じて、ペトリ皿中の周囲ゾーン内の少なくとも一種の特定された微生物の存在を判定するステップ
   を含む、方法。
2. 第一の処理がセグメンテーション処理である、請求項１に記載の方法。
3. セグメンテーション処理が、閾値の決定と、画素値と前記閾値の比較とを含む、請求項２に記載の方法。
4. 前記セグメンテーション処理が、グラフベースの領域セグメンテーション処理である、請求項２に記載の方法。
5. 第二の処理が、複数の定義された値を有する膨張基準に関連付けられた膨張処理である、請求項１に記載の方法。
6. 特徴量を決定するステップが、複数の第三の処理済み画像と第四の処理済み画像を画素パッチに分割することを含む、請求項１に記載の方法。
7. 各画素パッチについて、前記第三の処理済み画像と第四の処理済み画像の画素値間の画素値の最大差分を計算することを更に含む、請求項６に記載の方法。
8. 特徴量を決定するステップが、グレースケール画像に対して画素値の最大差分を計算することを含む、請求項７に記載の方法。
9. 特徴量を決定するステップが、複数の第一の処理済み画像の中央画素値とＨＳＶ空間に対する複数の第一の処理済み画像の中央画素値とを計算することを含む、請求項１に記載の方法。
10. 特徴量を分類するステップが、特徴量の分布をガウス分布と比較することを含む、請求項１に記載の方法。
11. 特徴量を分類するステップが、分類及び回帰ツリーアルゴリズムとサポートベクトルアルゴリズムを適用して、対応する第一及び第二スコアを提供することを含む、請求項１に記載の方法。
12. 特徴量を分類するステップが、ベイズ定理を第一及び第二スコアに適用することを更に含む、請求項１１に記載の方法。
13. 指標の値を閾値と比較するステップが、ガウス分布の平均と標準偏差σに基づいて閾値を決定することを含む、請求項１に記載の方法。
14. 少なくとも特定された微生物の存在を判定するステップが、ベータ溶血性細菌である細菌の存在を判定することを含む、請求項１、２、３、５、６、７、８、１０又は１３の何れか一項に記載の方法。
15. 少なくとも特定された微生物の存在を判定するステップが、プロテウス菌である細菌の存在を判定することを含む、請求項１、４、９、１１又は１２の何れか一項に記載の方法。
16. 微生物の一又は複数のコロニーと培地とを含むペトリ皿中の少なくとも一種の特定された微生物の存在を判定するためのシステムであって、前記培地が、微生物の一又は複数のコロニーと、存在する場合前記少なくとも一種の特定された微生物とが適切な増殖条件下で増殖するのを可能にするように適応されており、ペトリ皿の少なくとも一つの初期画像を取得するための撮像システムと、処理システム（１０８）とを備えるシステム（１００）において、前記処理システム（１０８）が、
    － ペトリ皿の少なくとも一つの初期画像の第一の処理済み画像を取得するための第一の処理ユニットであって、第一の処理済み画像の可視画素が微生物の一又は複数のコロニーに関連付けられた画素のみに関連する第一の処理ユニット（１１６）；
    － ペトリ皿の第一の処理済み画像の複数の第二の処理済み画像を取得するための第二の処理ユニットであって、第二の処理済み画像の可視画素が微生物の一又は複数のコロニーと微生物の前記一又は複数のコロニーの周辺の周囲ゾーンとに関連付けられた画素のみに関連する第二の処理ユニット（１１８）；
    － 別の初期画像と第二の処理済み画像との間の差分を計算することによってペトリ皿の複数の第三の処理済み画像を取得するためと、第二の処理済み画像と第一の処理済み画像との間の差分を計算することによってペトリ皿の複数の第四の処理済み画像を取得するための計算ユニットであって、第三の処理済み画像の可視画素が培地に関連付けられた画素のみに関連し、第四の処理済み画像の可視画素が周囲ゾーンに関連付けられた画素のみに関連する計算ユニット（１２０）；
    － 第三の処理済み画像の平均画素値と第四の処理済み画像の平均画素値との間の差分値をＲＧＢ色チャネルの少なくとも各色チャネルに対して計算することによって、複数の第三の処理済み画像と第四の処理済み画像に関連付けられた特徴量を決定するための特徴抽出ユニット（１２２）；
    － 及びペトリ皿中の周囲ゾーン内の少なくとも一種の特定された微生物の存在の指標の値を決定し、指標の値を閾値と比較し；かつ比較の結果に応じて、ペトリ皿中の周囲ゾーン内の少なくとも一種の特定された微生物の存在を判定するための分析ユニット（１１０）
    を備える、システム（１００）。
17. プログラマブルデータ処理装置に請求項１から１５の何れか一項に記載の方法のステップを実行させるためのコンピュータプログラム。
    

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