JP7016800B2 - 単一細胞のトランスクリプトーム分析の方法 - Google Patents

Description

本発明は、単一細胞から核酸を捕捉しかつバーコードを付与する方法、複数のコンパートメント（特に複数のマイクロ流体液滴）、および複数のマイクロ流体液滴を調製する方法に関する。

当技術分野では、１種または複数の転写産物から単一細胞中に存在する全トランスクリプトームまでの迅速な単離および配列決定の必要性が長年にわたり依然として満たされていない。この必要性は、抗体医薬の発見、免疫細胞および腫瘍細胞のプロファイリングの分野において特に顕著である。

科学機器の感度の大幅な上昇と、試料調製からデータ分析までの全工程の成長し続ける自動化とにより、単一細胞の網羅的な研究が可能になっている。従来技術では、単一細胞の核酸を捕捉しかつ前記核酸にバーコードを付与するための様々な方法がこれまで説明されている。

しかしながら、前記プロトコルの大部分は、大きい反応体積または複数の時間がかかる工程を依然として必要とする。高体積は、ＲＮＡの逆転写（ＲＴ）に必要な高価な酵素およびヌクレオチドをより多量に必要とするという欠点を有する。

従って、反応体積を減少させ、その一方で信頼できかつ効率的な逆転写を得ることは、当技術分野において重要なニーズである。

従来技術では、様々な著者がこの問題に対処し、反応体積を減少させて処理量を増加させようと試みた。

Ｗｈｉｔｅら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１ Ａｕｇ ２３；１０８（３４）：１３９９９－４００４）は、細胞の捕捉、細胞の溶解、逆転写および定量的ＰＣＲを含む、単一細胞のプロセシングを実行する実行毎に、数百の単一細胞からの遺伝子発現のＲＴ－ｑＰＣＲ測定を実施することが可能なマイクロ流体装置を説明する。しかしながら、より小さい反応体積が試みられ、Ｗｈｉｔｅら（Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ．２０１１ Ａｕｇ ２３；１０８（３４）：１３９９９－４００４）は、３００の並行ＲＴ－ｑＰＣＲを実施し、試験した反応条件では５ｎＬ未満の体積でＲＴが阻害されることを実証した。そのため、研究者らは、１個の細胞当たり６７ｎＬでＲＴ反応を実施し、単一の反応におけるＲＴとｑＰＣＲとの組み合わせにより、大規模なトランスクリプトーム分析および／または不偏性の増幅が回避されるとさらに主張した。

さらに、ＤｅＫｏｓｋｙら（Ｎａｔ Ｍｅｄ．２０１５ Ｊａｎ；２１（１）：８６－９１．）により、単一細胞のｍＲＮＡ捕捉に関して単純な軸対称フローフォーカシングデバイスを使用する方法が説明されている。この方法のＲＴおよびＰＣＲ反応はエマルジョン中で起こる。このプロセスは効率的であることが証明されているが、逐次３段プロセスを実施する必要がある。

同じ方針に沿って、Ｅａｓｔｂｕｒｎら（Ａｎａｌ Ｃｈｅｍ．２０１３ Ａｕｇ ２０；８５（１６）：８０１６－２１）は、小液滴体積ではあるが時間のかかる３～４段のプロセスでＲＴを実施した。Ｅａｓｔｂｕｒｎらは、細胞プロテイナーゼからの少量でのＲＴ阻害にも言及した。この問題を克服するために、Ｅａｓｔｂｕｒｎらは、細胞をプロテイナーゼで処理し、細胞溶解物を希釈し、液滴を分割し、かつＲＴ－ＰＣＲ試薬をピコ注入する。

Ｒｏｔｅｍら（ＰＬｏＳ Ｏｎｅ．２０１５ Ｍａｙ ２２；１０（５）：ｅ０１１６３２８）は、オリゴを液滴集団に封入し、ＲＴ酵素および緩衝液をピコ注入しつつ、細胞を含む液滴に融合させる。この３段プロセスにより、３時間で１００，０００個の細胞の封入を可能にする約１００ｐＬの液滴が生成される。この方法は、単一細胞のｃＤＮＡ標識に依存するが、トランスクリプトーム配列データは、複数の表現型的におよび遺伝子型的に無関係な細胞の集合体に由来する。

Ｍａｃｏｓｋｏら（Ｃｅｌｌ．２０１５ Ｍａｙ ２１；１６１（５）：１２０２－１４）は、溶解試薬およびバーコードが付与されたビーズと共に細胞を封入するために液滴ベースのマイクロ流体を使用して、１ｎＬの液滴でｍＲＮＡを捕捉した。次いで、このビーズを回収し、ビーズ上で捕捉されたｍＲＮＡのｃＤＮＡへの変換をオフチップで実施する。次いで、第３の工程は、ライブラリの調製および増幅に向けられる。

国際特許出願国際公開第２０１５／１６４２１２号パンフレットは、単一細胞の核酸を封入してバーコードを付与する方法に言及する。国際公開第２０１５／１６４２１２号パンフレットは、ｍＲＮＡのＲＴが３ｎＬよりも小さい体積で強く阻害されることを開示する（国際公開第２０１５／１６４２１２号パンフレットの実施例４およびＧｅｏｒｇｉｏ Ｇ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１４ Ｆｅｂ；３２（２）：１５８－６８）。

これとは対照的に、本発明者らは、バーコードが付与されたｃＤＮＡが３ｎＬよりも小さい体積で生成される単一細胞のｍＲＮＡの一段階逆転写の開発に成功した。この方法は、ｃＤＮＡを得るための一段階からなり、処理量の増加（倍数５～１０倍；バーコードが付与されたプライマーと共に１００，０００個の細胞が１時間で封入される）および体積の減少に起因するコストの低減を有する。そのため、本発明者らは、３ｎＬ未満の体積を有するマイクロ反応器中で効率的なｃＤＮＡ合成を引き起こす実験条件を確立した。

非最適化プロトコルを使用した、３つの異なる条件（精製済みＲＮＡ、バルク中で溶解した細胞、および液滴中で溶解した細胞）にわたる３種のヒト遺伝子（ＲＰＳ２９、ＡＴＰ５Ｇ３およびＺＮＦ４８０Ａ）のＣｐ値（即ち、二次導関数最大算出法（２^nd ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅ ｍａｘ ｃａｌｃｕｌａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ）により決定された交点値）を実証するグラフである。 ３つの異なる条件（精製済みＲＮＡ、バルク中で溶解した細胞、および液滴中で溶解した細胞）にわたり逆転写の非最適化プロトコルを使用した（図１Ａに示す遺伝子の）平均効率のパーセンテージを示すグラフである。 非最適化プロトコルを使用して１個の細胞当たりの使用した反応の総体積を変化させる３つの条件で精製済みＲＮＡと比較した場合の（図１Ａで示す遺伝子の）平均効率のパーセンテージを示すグラフである。 ３つの異なる遺伝子（ＲＰＳ２９、ＡＴＰ５Ｇ３およびＺＮＦ４８０Ａ）にわたる液滴ベースの実験での逆転写酵素（ＲＴ）濃度の増加によるＣｐ値の変化を示すグラフである。 ２つの異なる遺伝子（ＲＰＳ２９、ＡＴＰ５Ｇ３）にわたる液滴ベースの実験での効率的なｃＤＮＡ合成への溶解緩衝組成物の影響を示すグラフである。 ＡＴＰ５Ｇ３遺伝子に関するｃＤＮＡ合成の効率におけるＲＴ量（図３Ａ）および溶解条件（図３Ｂ）の変化の影響を再現するグラフである。 逆転写の効率における液滴体積の増加および逆転写（ＲＴ）条件の変化の両方のさらなる影響を示すグラフであり、ＡＴＰ５Ｇ３遺伝子に関するＣｐ値により測定している。この実験では、ＲＴ酵素およびＲＮアーゼ阻害剤の量が増加し、溶解緩衝液が変更された。 精製済みＲＮＡと比較した液滴ベースのアプローチのＲＴ効率のパーセンテージを示すグラフである。このＲＴ効率のパーセンテージは、免疫グロブリン軽鎖可変遺伝子の場合には１００％超であり、免疫グロブリン重鎖可変遺伝子の場合には約３０％である。ＶＨの場合のより低い値は、バーコードが付与された試料へのより低いＰＣＲ効率に起因する可能性がある。 免疫グロブリンの可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）をコードする、バーコードが付与された単一細胞転写物のネステッド（ｎｅｓｔｅｄ）ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の結果を示す一連のゲルである。上部のゲルは、１回目のＰＣＲ反応（左側はＶＨ増幅および右側はＶＬ増幅）であり、中央のゲルは、２回目のＰＣＲ（左側はＶＨ増幅および右側はＶＬ増幅）であり、下部のゲルは、イルミナＮＧＳ Ｐ５／Ｐ７配列の存在および対応する配列決定ライブラリ中の軽鎖および重鎖に関連するバーコードの存在を確認する最終ＰＣＲ配列決定ライブラリ産物のＱＣである。 ＶＨの読み取り数（ｘ軸）およびＶＬの読み取り数（ｙ軸）に従ってプロットされた、同一バーコード（即ち、同一細胞に由来する）を共有する対の抗体配列読み取りを示すグラフである。 各ＶＨ／ＶＬ鎖の読み取り閾値の関数として正確なハイブリドーマＶＨ／ＶＬ対形成率を示すグラフである。 （両方の鎖の）読み取り閾値の関数としてハイブリドーマＶＨ／ＶＬ対の数を示すチャートである。 バーコードが付与された単一細胞ＶＨ／ＶＬのネステッドポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）増幅の結果を示すゲルの対である。 対の配列でのＶＨおよびＶＬの読み取り数を示すグラフである。 （ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の両方の）読み取り閾値の関数としてハイブリドーマＶＨ／ＶＬ対形成の数を示すグラフである。 （ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の両方の）読み取り閾値および液滴体積およびｃＤＮＡ精製法の関数として正確なハイブリドーマＶＨ／ＶＬ対形成の数を示すグラフである。 液滴体積および精製法によって決まる、１本の鎖当たり１０回の読み取りの閾値での回収したハイブリドーマ対の分布を示すグラフである。 （ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の両方の）読み取り閾値の関数として、選択されたＢ細胞からのＶＨ／ＶＬの対形成の数を示すグラフである。 （ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の両方の）読み取り閾値の関数として同定した別々のＣＤＲ３配列の数を示すグラフである。 ＶＨおよびＶＬの読み取りの数に従ってプロットされた、同一バーコード（即ち、同一細胞に由来する）を共有する対の配列読み取りを示すグラフである。 １本の鎖当たり４０回の読み取りの閾値で同定した対の配列における重可変遺伝子の使用を示すグラフである。 １本の鎖当たり４０回の読み取りの閾値で同定した対の配列における軽カッパ可変遺伝子の使用を示すグラフである。 １本の鎖当たり４０回の読み取りの閾値で同定した対の配列におけるガンマＪ－生殖系列遺伝子の使用を示すグラフである。 １本の鎖当たり４０回の読み取りの閾値で同定した対の配列におけるカッパＪ－生殖系列遺伝子の使用を示すグラフである。 様々なプライマー濃度でのマウス免疫グロブリンの可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）の逆転写の捕捉効率を示すグラフである。 図８Ａは、様々なプライマー濃度（１０ｎＭおよび１００ｎＭ）でのマウス免疫グロブリンの可変重鎖（ＶＨ）、および可変軽カッパ鎖（ＶＬｋ）、およびラムダ鎖（ＶＬｌ）の逆転写の捕捉効率を示すグラフである。図８Ｂは、図８Ａで実施した逆転写の試料をロードしたアガロースゲルの写真である。 様々なプライマー濃度（１μＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭ）でのヒトハウスキーピング遺伝子ＲＰＳ２９およびＴＲＡＴ１の逆転写の捕捉効率を示すグラフである。 様々な濃度（３．３μＭまたは１００または３３ｎＭのいずれかでポリｄＴプライマーを使用したヒトハウスキーピング遺伝子ＲＰＳ２９およびＴＲＡＴ１の捕捉効率を示すグラフである。

別途定義しない限り、本開示に関連して使用される科学用語および技術用語は、当業者により一般に理解されている意味を有するものとする。

さらに、文脈により別途必要とされない限り、単数形の用語は複数形を含むものとし、複数形の用語は単数形を含むものとする。

一般に、本明細書で説明される細胞および組織の培養、分子生物学、ならびにタンパク質およびオリゴヌクレオチド化学またはポリヌクレオチド化学、ならびにハイブリダイゼーションに関連して用いられる命名法およびこれらの技術は、当技術分野で公知でありかつ一般に使用されるものである。

組換えＤＮＡ、オリゴヌクレオチド合成および組織培養および形質転換（例えば、エレクトロポレーション、リポフェクション）について標準的技術が使用ｓれる。酵素反応および精製技術は、製造業者の仕様書に従って実施するか、または当技術分野で一般的に達成されているようにもしくは本明細書で説明したように実施する。本開示の実行は、反対のことを具体的に示さない限り、当技術分野の技術内のウイルス学、免疫学、微生物学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術の従来の方法を用い、これらの多くが例示を目的として下記で説明される。そのような技術は文献で十分に説明されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８９）；Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８２）；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ｖｏｌ．Ｉ＆ＩＩ（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｎ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８５）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ（Ｂ．Ｈａｍｅｓ＆Ｓ．Ｈｉｇｇｉｎｓ，ｅｄｓ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８６）；Ｐｅｒｂａｌ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ（１９８４）を参照されたい。

本明細書で説明する分析化学、合成有機化学、ならびに医薬化学および製薬化学に関連して用いられる命名法ならびにそれらの実験室手順および技術は、当技術分野で公知でありかつ一般に使用されるものである。化学合成、化学分析、薬剤の調製、製剤および送達ならびに患者の処置について標準的技術が使用される。

用語「核酸」は、本明細書で使用される場合、少なくとも１個の核酸塩基（例えば、ＤＮＡ中に見出される天然に存在するプリン塩基またはピリミジン塩基（例えば、アデニン「Ａ」、グアニン「Ｇ」、チミン「Ｔ」およびシトシン「Ｃ」）またはＲＮＡ中に見出される天然に存在するプリン塩基またはピリミジン塩基（例えば、Ａ、Ｇ、ウラシル「Ｕ」およびＣ））を含むＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡまたはその誘導体もしくは模倣物の少なくとも１個の分子または鎖を概して指す。用語「核酸」は、用語「オリゴヌクレオチド」を包含する。

「ＲＮＡ」は、本明細書では、機能性ＲＮＡ（例えば、限定されないがｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ）を指す。

当業者に理解されるように、一本鎖の描写は、相補鎖の配列も規定する。そのため、核酸は、描写した一本鎖の相補鎖も包含する。そのため、用語核酸は、相補ＤＮＡを包含する。当業者にも認識されるように、核酸の多くのバリアントを所与の核酸と同じ目的のために使用することができる。そのため、核酸は、実質的に同一の核酸およびその相補体も包含する。当業者にも理解されるように、プライマー等の一本鎖核酸は、ハイブリダイゼーション条件（好ましくはストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で標的配列にハイブリダイズすることができる。そのため、核酸は、ハイブリダイゼーション条件下で標的配列にハイブリダイズするプライマーも包含する。

用語「オリゴヌクレオチド」は、約３～約２００個の核酸塩基の長さの少なくとも１種の分子を指す。

これらの定義は少なくとも１種の一本鎖分子を指すが、いくつかの実施形態では、この少なくとも１種の一本鎖分子に部分的に、実質的にまたは完全に相補的な少なくとも１種の追加の鎖も包含する。従って、いくつかの実施形態では、前記定義は二本鎖分子を指す。

そのため、一実施形態では、核酸は、少なくとも１種の二本鎖分子であって、この分子の鎖を含む特定の配列の１種または複数の相補鎖または「相補体」を含む二本鎖分子を指す。

「遺伝子」は、本明細書で使用される場合、転写調節配列および／もしくは翻訳調節配列、ならびに／またはコード領域、ならびに／または非翻訳配列（例えば、イントロン、５’－非翻訳配列および３’－非翻訳配列）を含むゲノム遺伝子であり得る。遺伝子のコード領域は、アミノ酸配列または機能性ＲＮＡ（例えば、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよびｐｉＲＮＡ）をコードするヌクレオチド配列であり得る。遺伝子は、コード領域（例えば、エクソンおよびｍｉＲＮＡ）であって、任意選択で、このコード領域に連結された５’－非翻訳配列または３’－非翻訳配列を含むコード領域に対応するｍＲＮＡまたはｃＤＮＡでもあり得る。遺伝子は、コード領域および／またはこのコード領域に連結された５’－非翻訳配列もしくは３’－非翻訳配列の全てまたは一部を含む、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成された増幅核酸分子でもあり得る。

用語「ストリンジェントな条件」または「高ストリンジェンシー条件」は、本明細書で使用される場合、規定のレベルの相補性を有する核酸間に結合対を生じさせるのに適しているが、前記規定のレベルよりも下方の相補性を示す核酸間での結合対の形成に適していない条件に対応する。ストリンジェントな条件は、ハイブリダイゼーション条件および洗浄条件の両方の組み合わせでありかつ配列依存性である。この条件は、当業者に既知の方法に従って変更し得る（Ｔｉｊｓｓｅｎ，１９９３，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ－Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｐａｒｔ Ｉ，Ｃｈａｐｔｅｒ ２“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙｓ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）。一般に、高ストリンジェンシー条件は、熱融点（Ｔｍ）と比べて約５℃低いように選択され、好ましくは、完全に塩基対形成された二本鎖のＴｍに近い温度であるように選択される（Ａｎｄｅｒｓｅｎ，Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，１９９９，ｐ．５４）。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野で公知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．，Ｂｒｅｎｔ，Ｒ．，Ｋｉｎｇｓｔｏｎ，Ｒ．Ｅ．，Ｍｏｏｒｅ，Ｄ．Ｄ．，Ｓｅｉｄｍａｎ，Ｊ．Ｇ．，Ｓｍｉｔｈ，Ｊ．Ａ．，Ｓｔｒｕｈｌ，Ｋ．ｅｄｓ．（１９９８）Ｃｕｒｒｅｎｔ ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｖ．Ｂ．Ｃｈａｎｄａ，ｓｅｒｉｅｓ ｅｄ．Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ：Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓで説明されている。

高ストリンジェンシー条件は、概して、約５０℃～約６８℃でハイブリダイズさせることであって、前記温度は、概して、例えば５×ＳＳＣ／５×Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ溶液／１．０％ＳＤＳ中で標的配列とハイブリダイズさせる核酸の最高融解温度Ｔ_Mに対応する、ハイブリダイズさせること、および約６０℃～約６８℃において０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄することを含む。

例えば、本発明に関連して、オリゴヌクレオチドに含まれるプライマー配列は、概して、本明細書において下記で定義される溶解組成物および逆転写組成物をさらに含むコンパートメント（特に液滴）中または複数のコンパートメント（特に複数の液滴）中で約５０℃～約６８℃において相補核酸（例えば、相補的なＲＮＡ配列、ｃＤＮＡ配列またはＤＮＡ配列）とハイブリダイズする。

用語「抗体」は、免疫グロブリン分子および免疫グロブリン分子の免疫学的に活性な部分（即ち、抗原に免疫特異的に結合する抗原結合部位を含む分子）を指す。このように、用語抗体は、抗体分子全体だけでなく抗体断片および抗体のバリアント（例えば、ヒト化抗体等の誘導体）も包含する。特定の従来の抗体では、２本の重鎖がジスルフィド結合により互いに連結され、各重鎖はジスルフィド結合により軽鎖に連結されている。２種の軽鎖、即ちラムダ（λ）およびカッパ（κ）が存在する。抗体分子の機能活性を決定する５種の主要な重鎖クラス（またはアイソタイプ）：ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥが存在する。各鎖は、別々の配列ドメインを含む。軽鎖は、２種のドメイン、即ち可変ドメイン（ＶＬ）および定常ドメイン（ＣＬ）を含む。重鎖は、４種のドメイン、即ち可変ドメイン（ＶＨ）ならびに３種の定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３、まとめてＣＨと称される）を含む。軽鎖の可変領域（ＶＬ）および重鎖の可変領域（ＶＨ）は、両方とも抗原に対する結合認識および特異性を決定する。軽鎖の定常領域ドメイン（ＣＬ）および重鎖の定常領域ドメイン（ＣＨ）は、重要な生物学的特性（例えば、抗体鎖会合、分泌、経胎盤性移動性、補体結合およびＦｃ受容体（ＦｃＲ）への結合）を付与する。Ｆｖ断片は、免疫グロブリンのＦａｂ断片のＮ末端部分であり、１本の軽鎖および１本の重鎖の可変部分からなる。抗体の特異性は、抗体結合部位と抗原決定基との間の構造的相補性に存在する。抗体結合部位は、超可変領域または相補性決定領域（ＣＤＲ）に主に由来する残基で構成されている。場合により、非超可変領域またはフレームワーク領域（ＦＲ）に由来する残基が全体的なドメイン構造に影響を及ぼし、そのため結合部位に影響を及ぼす。相補性決定領域（ＣＤＲ）は、天然免疫グロブリン結合部位の天然Ｆｖ領域の結合親和性および特異性を一緒に規定するアミノ酸配列を指す。免疫グロブリンの軽鎖および重鎖は、それぞれ３種のＣＤＲを有し、それぞれＬ－ＣＤＲ１、Ｌ－ＣＤＲ２、Ｌ－ＣＤＲ３およびＨ－ＣＤＲ１、Ｈ－ＣＤＲ２、Ｈ－ＣＤＲ３と呼ばれる。従って、抗原結合部位は６種のＣＤＲを含み、重鎖および軽鎖のＶ領域の各々からのＣＤＲセットを含む。フレームワーク領域（ＦＲ）は、ＣＤＲ間に挿入されているアミノ酸配列を指し、即ち、Ｋａｂａｔら（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．，１９９１）により定義されているように、単一種において異なる免疫グロブリン間で比較的保存されている免疫グロブリンの軽鎖可変領域および重鎖可変領域の一部を指す。

「抗体断片」は、インタクトな抗体の一部を含み、好ましくは、インタクトな抗体の抗原結合領域または可変領域を含む。抗体断片の例として、Ｆａｂ断片、Ｆａｂ’断片、Ｆ（ａｂ’）₂断片およびＦｖ断片；二重特異性抗体；線状抗体（米国特許第５，６４１，８７０号明細書；Ｚａｐａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．８（１０）：１０５７－１０６２［１９９５］を参照されたい）；一本鎖抗体分子；ならびに抗体断片から形成された多特異的抗体が挙げられる。

用語抗体は、一本鎖抗体（例えば、ラクダ抗体またはナノボディまたはＶ_HH）をさらに示す。

用語「Ｔ細胞レセプター」は、本明細書では、Ｔ細胞（即ちＴリンパ球）の表面上に存在する抗原認識分子を指す。この定義は、当技術分野で既知である用語の理解を明白に含み、例えば、インバリアントなＣＤ３鎖との複合体として細胞膜で発現される高度に可変のアルファ鎖もしくはベータ鎖のジスルフィド結合ヘテロ二量体を含むか、またはこのヘテロ二量体からなるレセプター、あるいはＴ細胞のサブセット上でＣＤ３との複合体として細胞膜で発現される可変のガンマ鎖およびデルタ鎖を含むか、またはこれらの鎖からなるレセプターを含む。

「抗体遺伝子」および「Ｔ細胞レセプター遺伝子」は、Ｔ細胞およびＢ細胞の成熟の初期段階で発生するリンパ球中でのみ起こる、Ｖ（Ｄ）Ｊ組換えと呼ばれる固有の遺伝子組換え機構を経る。この機構は、体細胞組換えをさらに含み、Ｂ細胞およびＴ細胞のそれぞれで見出される抗体／免疫グロブリン（Ｉｇ）およびＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）の多様なレパートリーをもたらす。

単一細胞の核酸を捕捉しかつバーコードを付与する方法
「捕捉する」は、本明細書では、コンパートメント（特に液滴）中または複数のコンパートメント（特に複数の液滴）中で単一細胞の核酸をプライマーにハイブリダイズさせることを指す。

「バーコードを付与する」は、本明細書では、前記バーコードが付与された核酸を、別の遺伝子配列（即ち、別の固有のバーコード配列）が付加されている核酸から区別することを可能にする遺伝子配列（本明細書において下記でさらに定義されるいわゆるバーコード配列）を核酸に付加することを指す。

本発明者らは、単一細胞のｍＲＮＡの一段階逆転写であって、単一細胞が３ｎＬ未満の体積で捕捉され、好ましくはサブナノリットル体積の液滴で捕捉され、バーコードが付与されたｃＤＮＡが、処理量が増加し（倍数５～１０倍；バーコードが付与されたプライマーと共に１００，０００個の細胞が１時間で封入される）かつコストが低減されて生成される、一段階逆転写を開発している。本発明者らは、細胞のサイズおよび形状とは無関係に、３ｎＬ未満の効率的なｃＤＮＡ合成用マイクロ反応器に至る実験条件を確立した。

従って、本発明は、単一細胞の核酸を捕捉しかつバーコードを付与する方法であって、
ａ）複数のコンパートメント内に含まれる複数の細胞を提供することであって、これらのコンパートメントの少なくともいくつかは、単一細胞、逆転写酵素、および少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを含み、この少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、バーコード配列およびプライマー配列を含み、それぞれの異なるプライマー配列は、異なるオリゴヌクレオチドタイプを規定し、これらの複数のコンパートメントのコンパートメントは、これらの複数のコンパートメントの他のコンパートメントに含まれるバーコード配列から識別可能な１つまたは複数のバーコード配列を含む、提供すること、
ｂ）コンパートメント内の細胞の少なくともいくつかを溶解させて、この細胞から核酸を放出させること、
ｃ）放出された核酸の少なくともいくつかをコンパートメントの少なくともいくつかの中の前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること、
ｄ）コンパートメントの少なくともいくつかの中のプライマー配列を使用して、前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた放出された核酸を逆転写すること
を含み、
複数のコンパートメントは、３ｎＬ未満の体積を有し、
好ましくは、マイクロ流体液滴中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１００ｎＭである、方法に言及する。

「コンパートメント」（「容器」とも称される）は、本明細書では、例えばプレート、ウェル、チューブ、チャネル、ナノウェル、ナノドロップ、ナノチューブまたはナノチャネルを指す。

本発明に関連して、好ましい実施形態では、コンパートメントは、液滴であり、より好ましくはマイクロ流体液滴である。

従って、好ましい実施形態では、複数のコンパートメントは、複数の液滴であり、より好ましくは複数のマイクロ流体液滴である。

いくつかの実施形態では、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを、この少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを最初に粒子（a particle）に結合させ、次いでこの粒子をコンパートメントに組み込んだ後、この粒子から放出させることにより、コンパートメントに導入する。

本発明の特定の実施形態では、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを粒子に最初に結合させることにより、１つのタイプのオリゴヌクレオチドのみの各コンパートメントへの導入が容易になる。

上記によれば、一実施形態では、工程ａ）は、前記複数のコンパートメント内に含まれる複数の粒子を提供することをさらに含み、これらのコンパートメントの少なくともいくつかは、１つの粒子（a particle）をさらに含む。

関連する実施形態では、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、前記粒子に結合されている。

従って、好ましい実施形態では、本発明は、単一細胞の核酸を捕捉しかつバーコードを付与する方法であって、
ａ）複数のコンパートメント内に含まれる複数の細胞および複数の粒子を提供することであって、これらのコンパートメントの少なくともいくつかは、単一細胞、逆転写酵素、および少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを含む粒子（a particle）を含み、この少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、任意選択で粒子に結合されており、この少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、バーコード配列およびプライマー配列を含み、それぞれの異なるプライマー配列は、異なるオリゴヌクレオチドタイプを規定し、複数のコンパートメントのコンパートメントは、複数のコンパートメントの他のコンパートメントに含まれるバーコード配列から識別可能な１つまたは複数のバーコード配列を含む、提供すること、
ｂ）コンパートメント内の細胞の少なくともいくつかを溶解させて、この細胞から核酸を放出させること、
ｃ）放出された核酸の少なくともいくつかをコンパートメントの少なくともいくつかの中の前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること、
ｄ）コンパートメントの少なくともいくつかの中のプライマー配列を使用して、前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた放出された核酸を逆転写すること
を含み、
複数のコンパートメントは、３ｎＬ未満の体積を有し、
好ましくは、粒子（a particle）を含むコンパートメント中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１００ｎＭである、方法に言及する。

本発明に関連して、「粒子」は、マイクロ粒子を指す。

一実施形態では、この粒子は、ヒドロゲル粒子、ポリマー粒子または磁性粒子である。

この粒子は、不規則的なまたは規則的な形状を有することができる。例えば、この粒子は、球形、楕円形または立方体であり得る。

一実施形態では、粒子および細胞は、同時にまたは任意の適切な順序で連続してコンパートメントに導入され得、またはコンパートメントに封入され得る。

好ましい一実施形態では、粒子および細胞は、同時にまたは任意の適切な順序で連続して液滴に封入され得る。

本発明に関連して、いくつかの実施形態では、粒子はヒドロゲル粒子である。

「ヒドロゲル粒子」は、例えば「Ａｓｓａｙ ａｎｄ ｏｔｈｅｒ ｒｅａｃｔｉｏｎｓ ｉｎｖｏｌｖｉｎｇ ｄｒｏｐｌｅｔｓ」という名称の国際特許出願国際公開第２００８／１０９１７６号パンフレットで説明されている。ヒドロゲルの例として、アガロース、ポリ（エチレングリコール）ジアクリレートまたはアクリルアミドベースのゲル、例えばビスアクリルアミド、ポリアクリルアミド、ストレプトアビジンアクリルアミド、ポリ－Ｎ－イソプロピルアクリルアミドもしくはポリＮ－イソプロピルポリアクリルアミドまたはこれらの混合物が挙げられるが、これらに限定されない。一実施形態では、このヒドロゲル粒子は、アクリルアミド、ビスアクリルアミドおよびストレプトアビジンアクリルアミドを含む。

例えば、モノマーの水溶液をコンパートメント（例えば、液滴）に分散し、次いで重合させて例えばゲルを形成することができる。別の例は、カルシウムイオンの添加によりゲル化され得るアルギン酸等のヒドロゲルである。場合により、例えばＬｉｎｋらにより２００６年２月２３日に出願され、２００７年１月４日に米国特許出願公開第２００７／０００３４２号明細書として公開された「Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ」という名称の米国特許出願第１１／３６０，８４５号明細書、またはＡｈｎらにより２００７年１月２４日に出願された「Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｄｒｏｐｌｅｔ Ｃｏａｌｅｓｃｅｎｃｅ」という名称の米国特許出願第１１／６９８，２９８号明細書（それぞれは、その全体が参照により本明細書に組み込まれる）で論じられているように、例えば、水相との同時流により、油相を通した同時流により、または２個の異なる液滴の合体により、ゲル化開始剤（アクリルアミドの場合には過硫酸アルミニウムおよびＴＥＭＥＤ、またはアルギン酸塩の場合にはＣａ²⁺）をコンパートメント（例えば、液滴）に添加することができる。

別のセットの実施形態では、この粒子は、１種または複数のポリマーを含むことができ、そのため、本明細書では「ポリマー粒子」と称される。例示的なポリマーとして、ポリスチレン（ＰＳ）、ポリカプロラクトン（ＰＣＬ）、ポリイソプレン（ＰＩＰ）、ポリ（乳酸）、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリアクリロニトリル、ポリイミド、ポリアミド、ならびに／またはこれらのおよび／もしくは他のポリマーの混合物および／もしくはコポリマーが挙げられるが、これらに限定されない。

加えて、いくつかの実施形態では、この粒子は磁性であり得、そのため「磁性粒子」と称され、粒子の磁気操作を可能にすることができる。例えば、この粒子は、鉄または他の磁性材料を含むことができる。この粒子は、この粒子が、付着した他の分子（例えば、タンパク質、核酸または小分子）を有することができるように官能化もされ得る。そのため、本発明のいくつかの実施形態は、例えば核酸、タンパク質、小分子または本明細書で説明したもの等の他の種のライブラリを規定する粒子のセットを対象とする。いくつかの実施形態では、この粒子は蛍光性であり得る。

一実施形態では、この粒子はストレプトアビジンを含む。ストレプトアビジンは、本明細書において上記で定義された粒子の表面に共役され得る。

一実施形態では、ヒドロゲル粒子は、１ｐＬ～１０００ｐＬのサイズを有し、例えば、１ｐＬ～５００ｐＬ、１ｐＬ～４００ｐＬ、１ｐＬ～４００ｐＬ、１ｐＬ～３００ｐＬ、例えば５ｐＬ～３００ｐＬ、５ｐＬ～２５０ｐＬ、５ｐＬ～２００ｐＬ、１０ｐＬ～２５０ｐＬ、１０ｐＬ～２００ｐＬのサイズを有し、好ましくは１０ｐＬ～２００ｐＬのサイズを有する。

当業者に理解されるようにかつセクション「複数のマイクロ流体液滴を調製する方法」でさらに説明されるように、１個のコンパートメント（例えば、液滴）に封入された細胞の数は、確率分布（例えば、ポアソン分布）に従い、例えば、本発明の複数のマイクロ流体液滴を調製する方法で使用される第１の流体中の細胞の濃度、第２の流体中の粒子の濃度、主チャネルおよび副チャネルの配置、第１の流体、第２の流体および担体流体の注入パラメータに左右される。

従って、本発明の方法の工程ａ）では、水性組成物に含まれる複数の細胞を複数のコンパートメントに導入し、具体的には複数のマイクロ流体液滴に封入し、１個のコンパートメントに導入される（具体的には１個の液滴に封入される）細胞の数は、「複数のマイクロ流体液滴を調製する方法」で使用されるパラメータに応じてポアソン分布に従う。このパラメータを、例えば１個または０個の細胞が入ったコンパートメントを得るのに適合させることができ、そのため、コンパートメントがいくつかの細胞を含むことが回避される。

本発明者らが示すように、細胞を導入するためにまたは封入するために（好ましくは封入するために）使用されるパラメータは、単一細胞を含むコンパートメントの少なくともいくつかを得るのに適合させることができる。少なくともいくつかのコンパートメントは、本発明に関連して、本明細書において下記でさらに定義されるように、逆転写酵素および少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドをさらに含む。

従って、一実施形態では、工程ａ）の少なくともいくつかのコンパートメント（好ましくは工程ａ）の液滴）は、１秒当たり１～２０００個のコンパートメントの速度で生成され、例えば１秒当たり１～１０００個のコンパートメント、１秒当たり１～８００個のコンパートメント、１秒当たり１～７００個のコンパートメント、１秒当たり１～６００個のコンパートメント、１秒当たり１～５００個のコンパートメント、１秒当たり１～４００個のコンパートメント、１秒当たり１～３００個のコンパートメント、１秒当たり１～２００個のコンパートメント、１秒当たり１～１００個のコンパートメント、１秒当たり１～８０個のコンパートメント、１秒当たり１～７０個のコンパートメント、１秒当たり１～５０個のコンパートメント、例えば１秒当たり１０～３００個のコンパートメント、１秒当たり５０～３００個のコンパートメント、１秒当たり１００～３００個のコンパートメント、１秒当たり１５０～３００個のコンパートメント、１秒当たり１５０～２５０個のコンパートメント、１秒当たり１７５～２５０個のコンパートメント、典型的には１秒当たり１～１０００個のコンパートメント、好ましくは１秒当たり１７５～２５０個のコンパートメントの速度で生成される。

さらに、当業者に理解されるように、様々なパラメータに基づいて、１個のコンパートメント当たり０個、１個または２個の粒子を含むようにコンパートメントを生成し得、そのため、コンパートメントが３個以上の粒子を含むことが回避される。特定の一実施形態では、１個のコンパートメント当たり０個または１個の粒子を含むようにコンパートメントが生成され、そのため、コンパートメントが複数の粒子を含むことが回避される。

特定の例では、当業者に理解されるように、様々なパラメータ（例えば、粒子濃度および流速等）に基づいて、１個の液滴当たり０個、１個または２個の粒子を含むように液滴を生成し得、そのため、液滴が３個以上の粒子を含むことが回避される。特定の一実施形態では、１個の液滴当たり０個または１個の粒子を含むように液滴が生成され、そのため、液滴が複数の粒子を含むことが回避される。

従って、一実施形態では、粒子は、約２個以下の粒子／コンパートメントでコンパートメントに導入もしくは封入され、好ましくは、さらなる実施形態では、粒子は、約１個以下の粒子／コンパートメントでコンパートメントに導入もしくは封入され、または粒子は、好ましくは１個の粒子／コンパートメントでコンパートメントに導入もしくは封入され、または粒子は、平均して１個の粒子／コンパートメントでコンパートメントに導入もしくは封入される。

一実施形態では、特にコンパートメントとして液滴に言及する場合、粒子は、本明細書において上記で定義された粒子の数で液滴に好ましくは封入される。上記に従って、液滴に言及する場合、工程ａ）で生成される液滴のサイズは、確率分布（例えば、ポアソン分布）に従うことも当業者に理解されるであろう。マイクロ流体液滴であって、この液滴の少なくともいくつかは、特許請求の範囲の通りである、マイクロ流体液滴を生成するために工程ａ）で使用されるパラメータを調節して、特定の体積を有する複数のマイクロ液滴流体を得ることができることがさらに理解されるであろう。

「液滴」は、概して、体積の尺度を指し、本発明に関連して、第２の流体で取り囲まれている第１の流体の分離部分をさらに指す。液滴は、必ずしも球形ではなく、さらに例えば外部環境に応じて他の形状を仮定し得ることに留意されたい。

「複数のコンパートメントは３ｎＬ未満の体積を有する」は、複数のコンパートメント中の各コンパートメントが３ｎＬ未満の体積を有することを意味する。

本発明に関連して、「コンパートメント」または「複数のコンパートメント」（好ましくは「液滴」または「複数の液滴」）は、３ｎＬ未満の体積を有する。一実施形態では、前記複数のマイクロ流体液滴は、２．５ｎＬ未満、２ｎＬ未満、１．５ｎＬ未満、１ｎＬ未満、０．５ｎＬ未満、例えば０．１ｎＬ～３ｎＬ、０．５ｎＬ～３ｎＬ、１ｎＬ～３ｎＬ、典型的には０．１ｎＬ、０．５ｎＬ、１ｎＬ、１．２ｎＬ、１．４ｎＬ、１．６ｎＬ、１．８ｎＬ、２．０ｎＬ、２．２ｎＬ、２．４ｎＬ、２．６ｎＬ、２．８ｎＬ、３ｎＬの体積を有する。

好ましい一実施形態では、複数のコンパートメントは、１ｎＬ以下の体積を有する。

先行技術の開示とは対照的に、本発明者らは、本発明の方法を使用して、単一細胞の全トランスクリプトームを効率的に捕捉しかつバーコードを付与し得ること（実施例１０で実証されている）、あるいは本明細書において上記で定義されたオリゴヌクレオチドの１つのタイプの濃度が１００ｎｍ以上である場合、３ｎＬ未満の体積で遺伝子特異的なトランスクリプトームを特異的に捕捉しかつバーコードを付与し得ることを実証した。

「トランスクリプトーム」は、概して、１個の細胞中または細胞の集団中の全てのメッセンジャーＲＮＡ分子のセットまたは全てのメッセンジャーＲＮＡ分子の一部を指す。従って、「細胞のトランスクリプトーム」または「単一細胞のトランスクリプトーム」は、本明細書では、１個の細胞中の全てのメッセンジャーＲＮＡ分子のセットまたは全てのメッセンジャーＲＮＡ分子の一部を指す。

そのため、当業者に理解されるように、遺伝子特異的なトランスクリプトームは、１種の遺伝子に由来する全てのメッセンジャーＲＮＡ分子のセットを指す。

当業者に知られているように、様々な遺伝子産物（いわゆるアイソフォーム）が１種の遺伝子でコードされ得る。従って、遺伝子特異的なトランスクリプトームは、１種の特定の遺伝子の少なくとも１種の特定のアイソフォームのメッセンジャーＲＮＡ分子（例えば、１種の特定の遺伝子の１種、２種、３種または４種の特定のアイソフォームのメッセンジャーＲＮＡ分子）または１種の特定の遺伝子の全てのアイソフォームのメッセンジャーＲＮＡ分子をさらに指すことができる。

従って、本発明に関連して、一実施形態では、核酸は、ｃＤＮＡまたはＲＮＡであり、好ましくはＲＮＡである。

一実施形態では、ＲＮＡは、ｍＲＮＡ、ｔＲＮＡ、ｒＲＮＡ、触媒ＲＮＡ、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡ、ｌｎｃＲＮＡおよびｐＩＲＮＡからなる群から選択され、好ましくはｍＲＮＡである。

さらなる実施形態では、ｍＲＮＡは、ポリＡ配列（ポリＡテールとも呼ばれる）を含む。

さらに、本発明に関連して、特定の一実施形態では、「放出された核酸の少なくともいくつか」は、少なくとも１個の核酸を指し、好ましくは、少なくとも２個、少なくとも３個、少なくとも４個、少なくとも５個の核酸またはより多くを指す。特定の１つでは、工程ｃ）およびｄ）の核酸は、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個、８個、９個または１０個の核酸を指す。

本発明の方法を使用して、単一細胞の１個の特定の核酸から全ての核酸までを転写することができる。

従って、本発明に関連して、さらなる実施形態では、工程ｃ）およびｄ）の「放出された核酸の少なくともいくつか」は、１～１０００００個の核酸を指し、例えば１～８００００個、１～６００００個、１～４００００個、例えば１個、１０００個、２０００個、４０００個、６０００個、８０００個、１００００個、１２０００個、１４０００個、１６０００個、２００００個、２５０００個、３００００個、４５０００個、５００００個の核酸を指す。従って、一実施形態では、核酸は、本明細書において全ての遺伝子のＲＮＡを指す。

上述したように、本発明者らにより実証されたように、本発明の方法は、遺伝子特異的なトランスクリプトームを捕捉および転写することも指す。

従って、一実施形態では、核酸は、本明細書においてａ）特定の遺伝子のＲＮＡを指す。当業者に理解されるように、前記遺伝子は、目的の任意の遺伝子であり得る。

一実施形態では、前記特定の遺伝子は、抗体重鎖可変遺伝子、抗体重鎖定常遺伝子、抗体軽鎖可変遺伝子、抗体軽鎖定常遺伝子、アルファＴ細胞レセプター遺伝子、ベータＴ細胞レセプター遺伝子、およびデルタＴ細胞レセプター遺伝子、およびガンマＴ細胞レセプター遺伝子からなる群から選択される。

一実施形態では、工程ｃ）およびｄ）で言及される核酸は、遺伝子特異的核酸であり、この遺伝子は、抗体重鎖可変遺伝子、抗体重鎖定常遺伝子、抗体軽鎖可変遺伝子、抗体軽鎖定常遺伝子、アルファＴ細胞レセプター遺伝子、ベータＴ細胞レセプター遺伝子、およびデルタＴ細胞レセプター遺伝子、およびガンマＴ細胞レセプター遺伝子からなるリストから選択され得る。

特定の一実施形態では、工程ｃ）およびｄ）で言及される核酸は、少なくとも２種の遺伝子に特異的な核酸であり、この少なくとも２種の遺伝子は、抗体重鎖可変遺伝子、抗体重鎖定常遺伝子、抗体軽鎖可変遺伝子、抗体軽鎖定常遺伝子、アルファＴ細胞レセプター遺伝子、ベータＴ細胞レセプター遺伝子、およびデルタＴ細胞レセプター遺伝子、およびガンマＴ細胞レセプター遺伝子からなるリストから選択される。

一実施形態では、工程ｃ）およびｄ）で言及される核酸は、遺伝子特異的核酸であり、この遺伝子は、抗体重鎖可変異遺伝子、抗体重鎖定常遺伝子、抗体軽鎖可変遺伝子、抗体軽鎖定常遺伝子、アルファＴ細胞レセプター遺伝子、ベータＴ細胞レセプター遺伝子、およびデルタＴ細胞レセプター遺伝子、およびガンマＴ細胞レセプター遺伝子からなるリストから選択され得、好ましくは、抗体重鎖可変遺伝子、抗体重鎖定常遺伝子、抗体軽鎖可変遺伝子および抗体軽鎖定常遺伝子からなるリストから選択され得る。

さらに特定の実施形態では、工程ｃ）およびｄ）で言及される核酸は、少なくとも３種の遺伝子に特異的な核酸であり、この少なくとも３種の遺伝子は、抗体重鎖可変遺伝子、抗体重鎖定常遺伝子、抗体軽鎖可変遺伝子、抗体軽鎖定常遺伝子、アルファＴ細胞レセプター遺伝子、ベータＴ細胞レセプター遺伝子およびデルタＴ細胞レセプター遺伝子からなるリストから選択され、好ましくは、アルファＴ細胞レセプター遺伝子、ベータＴ細胞レセプター遺伝子、およびデルタＴ細胞レセプター遺伝子、およびガンマＴ細胞レセプター遺伝子からなるリストから選択される。

細胞のトランスクリプトームが捕捉される場合、本明細書において下記でさらに定義されるように、ポリＴプライマー配列等のプライマー配列（前記プライマー配列は全てのｍＲＮＡに特異的である）を有するオリゴヌクレオチドが使用されるが、遺伝子特異的トランスクリプトームが捕捉されてバーコードが付与される場合、本明細書において下記でさらに定義されるように、遺伝子特異的プライマー配列を含むオリゴヌクレオチドが使用されることが当業者に理解されるであろう。

「少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチド」は、本発明に関連して使用される場合、バーコード配列およびプライマー配列を含むオリゴヌクレオチド（本明細書において上記で定義されている）を指し、それぞれの異なるプライマー配列は、異なるオリゴヌクレオチドタイプを規定する。一実施形態では、この少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、５’から３’へとバーコード配列およびプライマー配列を含む。

文言「少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチド」中の「少なくとも１つ」は、少なくとも２つ、少なくとも３つ、少なくとも４つ、少なくとも５つ、少なくとも６つ、少なくとも７つ、少なくとも８つ、少なくとも９つ、少なくとも１０のタイプまたはより多くのオリゴヌクレオチドを指す。１個のコンパートメント中に存在するオリゴヌクレオチドの異なるタイプの数は、捕捉されてバーコードが付与されるＲＮＡの遺伝子の数に左右される。

上述したように、１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、このオリゴヌクレオチドのプライマー配列により、別のタイプのオリゴヌクレオチドと区別される。

全トランスクリプトームは、１つのプライマー配列ポリｄＴプライマーを使用して転写され得る。オリゴヌクレオチドのタイプの数は、捕捉されてバーコードが付与されるトランスクリプトームの特定の遺伝子の数に少なくとも対応することが理解されるであろう。

従って、さらなる一実施形態では、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、１～１００のタイプのオリゴヌクレオチドを指し、１～８０、１～６０、１～４０、１～３０、１～２０、１～１０のタイプのオリゴヌクレオチドを指し、好ましくは１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つのタイプのオリゴヌクレオチドを指す。

従って、一実施形態では、１個のコンパートメントに含まれる粒子に結合された様々なタイプのオリゴヌクレオチドは、同一のバーコード配列を含む。

一実施形態では、コンパートメントが液滴である場合、粒子は前記液滴に封入される。

一実施形態では、１個のコンパートメントに封入された粒子に結合された様々なタイプのオリゴヌクレオチドは、同一のバーコード配列を含む。

本発明の方法で定義されたように、好ましくは、コンパートメント中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１００ｎＭである。

従って、いくつかの実施形態では、コンパートメント中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１００ｎＭであり、好ましくは１００ｎＭ超である。

いくつかの実施形態では、コンパートメント中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１５０ｎＭであり、少なくとも２００ｎＭであり、少なくとも３００ｎＭであり、少なくとも４００ｎＭであり、少なくとも５００ｎＭであり、少なくとも６００ｎＭであり、少なくとも７００ｎＭであり、少なくとも８００ｎＭであり、少なくとも９００ｎＭであり、および少なくとも１μＭであり、例えば１００ｎＭ～５μＭであり、１００ｎＭ～４μＭであり、１００ｎＭ～３μＭであり、１００ｎＭ～２μＭであり、１００ｎＭ～１μＭであり、好ましくは１００ｎＭ～５００ｎＭである。

一例では、プライマー配列は、ポリＴプライマー配列であり、およびオリゴヌクレオチドの濃度は、１００ｎＭ～３３００ｎＭ（３．３μＭに対応する）である。

さらなる例では、プライマー配列は、遺伝子特異的プライマー配列であり、およびオリゴヌクレオチドの濃度は、１００ｎＭまたは１０００ｎＭ（１μＭに対応する）である。

例えば、本発明者らは、１個の細胞当たりのオリゴヌクレオチド密度／プライマー濃度が、コンパート体積に関連して効率的な捕捉およびバーコード添付を可能にする（１個のコンパートメント当たり１個の粒子という仮定である）ことを実証する。

「バーコード配列」または「バーコード」と単に呼ばれるものは、本明細書では、配列により別の核酸配列から区別され得る固有の核酸配列を指し、そのため、核酸配列を一意的に標識することが可能になり、その結果、別のバーコード配列を担持する別の核酸から区別され得る。

一実施形態では、バーコード配列は、例えば核酸が一緒にプールされた後であっても、単一細胞により放出された核酸を他の細胞から放出された核酸から一意的に識別する。

いくつかの実施形態では、バーコード配列を使用して、例えば異なる細胞または他の供給源から生じる数十、数百またはさらに数千の核酸を区別することができる。

一実施形態では、バーコード配列は、任意の適切な長さであり得る。このバーコード配列は、好ましくは、バーコード配列を他のバーコード配列から区別するのに十分な長さである。一実施形態では、バーコード配列は、５個、６個、７個、８個、９個、１０個、１１個、１２個、１３個、１４個、１５個、１６個、１７個、１８個、１９個、２０個、２１個、２２個、２３個、２４個、２５個、３０個、３５個、４０個、４５個、５０個、５５個、６０個、６５個、７０個、７２個、７４個、７６個、７８個、８０個、８５個、９０個またはより多くのヌクレオチドの長さを有し、例えば、５０～８５個、６０～８０個、７０～８０個のヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態では、バーコード配列は、複数のバーコード配列からなり、これらのバーコード配列は異なる。

関連する実施形態では、異なるバーコード配列を潜在的なバーコード配列の「プール」から得ることができる。バーコード配列が複数のバーコード配列からなる場合、これらのバーコード配列を潜在的なバーコード配列の同一のまたは異なるプールから得ることができる。配列のプールを、例えば無作為に、または例えばバーコード配列の読み取りでエラーを検出し得るようにかつ場合により訂正し得るように特定の距離（例えば、ハミング距離）だけ離れることにより配列がエラー検出および／もしくは訂正を可能にするように、任意の適切な技術を使用して選択することができる。このプールは、任意の数の潜在的バーコード配列を有し得、例えば、少なくとも１００個、少なくとも３００個、少なくとも５００個、少なくとも１，０００個、少なくとも３，０００個、少なくとも５，０００個、少なくとも１０，０００個、少なくとも３０，０００個、少なくとも５０，０００個、少なくとも１００，０００個、少なくとも３００，０００個、少なくとも５００，０００個、または少なくとも１，０００，０００個のバーコード配列を有し得る。

１つの「プール」または複数のプールから得られた異なるバーコード配列を連結する方法は当業者に既知であり、リガーゼの使用および／またはアニーリングもしくはプライマー伸長法の使用が挙げられるが、これらに限定されない。

リガーゼの非限定的例としてＤＮＡリガーゼが挙げられ、例えば、ＤＮＡリガーゼＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＩＩ、ＤＮＡリガーゼＩＶ、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡリガーゼまたは同類のものが挙げられる。多くのそのようなリガーゼは、商業的に購入することができる。

一実施形態では、バーコード配列は、二本鎖または一本鎖の核酸である。

「プライマー配列」は、概して、１０～５０個のヌクレオチドの長さの短い一本鎖核酸であり、捕捉されて典型的にはＰＣＲで増幅されるかまたは典型的にはＲＴで逆転写される目的の核酸と完全にまたはほぼ完全に一致するように設計されている。プライマー配列は、このプライマー配列がハイブリダイズする核酸に「特異的」であり、即ち、このプライマー配列は、ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下で好ましくはハイブリダイズし、より好ましくは高ストリンジェンシーハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするか、またはこのプライマー配列がハイブリダイズする核酸（標的配列とも称される）に相補的であるかもしくはほぼ相補的である。

典型的には、プライマー配列は、核酸合成の開始点として機能し、核酸ポリメラーゼ等のポリメラーゼ酵素がプライマー配列を伸長させて相補鎖を複製することを可能にする。プライマー配列は、標的核酸に相補的であり得、かつハイブリダイズし得る。いくつかの実施形態では、プライマー配列は、合成プライマー配列である。いくつかの実施形態では、プライマー配列は、天然には存在しないプライマー配列である。プライマー配列は、概して、１０～５０個のヌクレオチドの長さを有する。例えば、プライマー配列は、１０～４０個、１０～３０個、１０～２０個、２５～５０個、１５～４０個、１５～３０個、２０～５０個、２０～４０個または２０～３０個のヌクレオチドの長さを有することができる。いくつかの実施形態では、プライマー配列は、１８～２４個のヌクレオチドの長さを有する。

一実施形態では、プライマー配列は、本発明に関連して使用されるオリゴヌクレオチドの３’側に位置する（即ち、このプライマーはバーコード配列と比べて３’位置である）。

一実施形態では、プライマー配列は、ポリＴ配列、ランダムＤＮＡ配列および遺伝子特異的配列からなる群から選択される。

「ポリＴ配列」は、本明細書で言及される場合、１０～５０個、１０～４０個、１０～３０個、１０～２０個、２５～５０個、１５～４０個、１５～３０個、２０～５０個、２０～４０個または２０～３０個のチミン「Ｔ」を含む配列である。このポリＴ配列は、ｍＲＮＡ中に存在するポリＡテールとハイブリダイズする。

一部の実施形態では、ランダムＤＮＡ配列は任意の適切な長さであり得、例えば、６～５０個、６～５０個、６～４０個、６～３０個、６～２０個、１０～５０個、１０～４０個、２５～５０個、１５～４０個、１５～３０個、２０～５０個、２０～４０個または２０～３０個のヌクレオチドであり得る。

特定の一実施形態では、プライマー配列は、遺伝子特異的配列であり、およびこの遺伝子は、抗体重鎖可変遺伝子、抗体重鎖定常遺伝子、抗体軽鎖可変遺伝子、抗体軽鎖定常遺伝子、アルファＴ細胞レセプター遺伝子、ベータＴ細胞レセプター遺伝子、デルタＴ細胞レセプター遺伝子からなる群から選択される。

文言「抗体重鎖可変遺伝子」、「抗体重鎖定常遺伝子」、「抗体軽鎖可変遺伝子」および「抗体軽鎖定常遺伝子」中の用語「抗体」は、本明細書において上記で定義された通りである。

文言「アルファＴ細胞レセプター遺伝子」、「ベータＴ細胞レセプター遺伝子」および「デルタＴ細胞レセプター遺伝子」または「ガンマＴ細胞レセプター遺伝子」中の用語「Ｔ細胞レセプター」は、本明細書において上記で定義された通りである。

単語「遺伝子」は、本明細書において上記で定義された通りである。

特定の一実施形態では、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのタイプのオリゴヌクレオチドであり、この２つのタイプのオリゴヌクレオチドでは、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドが抗体重鎖可変遺伝子に特異的なプライマー配列を含み、他の少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドが抗体軽鎖可変遺伝子に特異的なプライマー配列を含む。

別の特定の実施形態では、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、少なくとも２つのタイプのオリゴヌクレオチドであり、この少なくとも２つのタイプのオリゴヌクレオチドでは、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドがアルファＴ細胞レセプター遺伝子、またはベータＴ細胞レセプター遺伝子、またはガンマＴ細胞レセプターに特異的なプライマー配列を含み、他の少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドがデルタＴ細胞レセプター遺伝子に特異的なプライマー配列を含む。

別の特定の実施形態では、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、少なくとも３つのタイプのオリゴヌクレオチドであり、この少なくとも３つのタイプのオリゴヌクレオチドでは、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドがアルファＴ細胞レセプター遺伝子に特異的なプライマー配列を含み、第２のタイプのオリゴヌクレオチドがベータＴ細胞レセプター遺伝子に特異的なプライマー配列を含み、第３のタイプのオリゴヌクレオチドがデルタＴ細胞レセプター遺伝子に特異的なプライマー配列を含む。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドは、プロモーター配列および／またはスペーサー配列をさらに含む。

プロモーター配列の例として、Ｔ７プロモーター、Ｔ３プロモーターまたはＳＰ６プロモーターが挙げられるが、これらに限定されない。

オリゴヌクレオチドを粒子に一時的に結合させることにより多量のオリゴヌクレオチドを有する粒子の生成が可能になることが当業者に理解されるであろう。さらに、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを粒子に最初に結合させることにより、各コンパートメント（特に各液滴）へのオリゴヌクレオチドの導入が容易になり、これらの少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、同一のバーコード配列を有する。

従って、一実施形態では、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、粒子に共有結合または非共有結合されている。

「非共有結合されている」は、本明細書では、例えばストレプトアビジン－ビオチン結合を指す。アビジンビオチン結合またはヒスタグおよびニッケル結合等の他の非共有結合が当業者に既知である。

「共有結合されている」は、本明細書では、例えばアミノ結合またはアクリダイトホスホラミダイト結合を指す。

「ストレプトアビジン」は、概して、細菌ストレプトマイセス・アビジニイ（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ａｖｉｄｉｎｉｉ）から精製された５２．８ｋＤａのタンパク質を指す。ストレプトアビジンホモ四量体は、約１０^-14モル／Ｌのオーダーの解離定数（Ｋｄ）でビオチンに対して非常に高い親和性を有し、ビオチンのストレプトアビジンへの結合は、自然界において既知の最も強力な非共有相互作用の１つである。

好ましい実施形態では、この非共有結合は、ストレプトアビジン－ビオチン結合である。

ストレプトアビジン－ビオチン結合は、当業者に既知である。従って、一実施形態では、本明細書で定義された粒子は、ストレプトアビジンを含む。従って、同一の実施形態では、本明細書で定義された少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、ビオチンを含む。換言すると、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、ビオチンで官能化されている。

少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを粒子に連結するために使用される結合のタイプとは無関係に、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、少なくとも１つのリンカー配列をさらに含むことができる。

従って、さらなる実施形態では、「少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチド」または単に「オリゴヌクレオチド」は、少なくとも１つのリンカー配列をさらに含み、前記リンカー配列は、好ましくは５’末端で含まれている。従って、一実施形態では、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、５’から３’へとリンカー配列、バーコード配列およびプライマー配列を含む。

一実施形態では、「リンカー配列」は、それによりオリゴヌクレオチドが粒子に任意選択的に結合される配列である。

「本明細書において任意選択的に結合される」は、粒子に結合された少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドがコンパートメントまたは複数のコンパートメントに充填されると、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドが放出され得、そのため、このコンパートメントは、粒子と、前記粒子に結合されていない少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドとを含む可能性を指す。

好ましくは、リンカー配列は、開裂可能なリンカー配列であり、例えば、酵素的等の適切な刺激および／または光開裂の適用で開裂され得るリンカー配列である。

「開裂可能なリンカー」として、ＴＥＶ、トリプシン、トロンビン、カテプシンＢ、カテスピンＤ、カテプシンＫ、カスパーゼルマトリックスメタロプロテイナーゼ（ｃａｓｐａｓｅ ｌｕｍａｔｒｉｘ ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ）配列、ホスホジエステル、リン脂質、エステル、－ガラクトース、ジアルキルジアルコキシシラン、シアノエチル基、スルホン、エチレングリコールジスクシネート、２－Ｎ－アシルニトロベンゼンスルホンアミド、ａ－チオフェニルエステル、不飽和ビニルスルフィド、活性化後のスルホンアミド、マロンジアルデヒド（ＭＤＡ）－インドール誘導体、レブリノイルエステル、ヒドラゾン、アシルヒドラゾン、アルキルチオエステル、ジスルフィド架橋、アゾ化合物、２－ニトロベンジル誘導体、フェナシルエステル、８－キノリニルベンゼンスルホネート、クマリン、ホスホトリエステル、ビス－アリールヒドラゾン、ビマン ビ－チオプロピオン酸誘導体、パラメトキシベンジル誘導体、ｔｅｒｔ－ブチルカルバメート類似体、ジアルキルジアルコキシシランまたはジアリールジアルコキシシラン、オルトエステル、アセタール、アコニチル、ヒドラゾン、ｂ－チオプロピオネート、ホスホルアミデート、イミン、トリチル、ビニルエーテル、ポリケタール、アルキル２－（ジフェニルホスフィノ）ベンゾエート誘導体、アリルエステル、８－ヒドロキシキノリンエステル、ピコリン酸エステル、隣接ジオールおよびセレン化合物を挙げることができるが、これらに限定されない（例えば、Ｌｅｒｉｃｈｅ Ｇ，Ｃｈｉｓｈｏｌｍ Ｌ，Ｗａｇｎｅｒ Ａを参照されたい。

開裂可能なリンカーは、当業者に公知であり、化学生物学でさらに説明されており、例えば、Ｌｅｒｉｃｈｅ Ｈ．ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｏｒｇ Ｍｅｄ Ｃｈｅｒｎ．１５；２０（２）：５７１－８２．２０１２）でさらに説明されている。開裂の条件および試薬として、酵素、求核／塩基性試薬、還元剤、光照射、求電子／酸性試薬、有機金属試薬および金属試薬、ならびに酸化剤が挙げられるが、これらに限定されない。

上述したように、一実施形態では、本発明の方法は、粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかを、細胞を溶解させる前または溶解させた後に前記粒子から放出させる工程をさらに含む。

細胞を溶解させた後および前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた放出された核酸を逆転写する前に、または細胞を溶解させた後および前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた放出された核酸を逆転写した後に、オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかを放出させる工程がさらに起こり得る。

オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかを放出させるために選択された時点に応じて、用語「オリゴヌクレオチドの少なくともいくつか」は、例えば、上記で定義されたように、細胞により放出された核酸またはＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖にハイブリダイズされたオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかを指す可能性があることを当業者は理解するであろう。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかを、任意の手段（例えば、酵素、求核／塩基性試薬、還元剤、光照射、求電子／酸性試薬、有機金属試薬および金属試薬、ならびに酸化剤）を使用して放出させることができる。

一実施形態では、オリゴヌクレオチドの少なくともいくつかを、酵素開裂および／または光開裂を使用して放出させることができる。例えば、エンドヌクレアーゼを使用して、リンカー配列または任意の他の配列を開裂してオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかを粒子から放出させることができる。

さらなる実施形態では、オリゴヌクレオチドを放出させることは、ストレプトアビジンビオチン等の結合を破壊することを指す。ストレプトアビジンビオチン結合を破壊する方法は当業者に既知であり、ストレプトアビジンの酵素消化および／またはストレプトアビジンの変性が挙げられる。

一実施形態では、ストレプトアビジンの酵素消化によりオリゴヌクレオチドを放出させる。

本発明に関連して、「細胞」は、生物学で使用される通常の意味が与えられ、例えば、細胞は、生物（例えば、単細胞生物）の機能的に独立した単位として、または全体として生物の原因に対する特定の機能を実行することに特化されている多細胞生物（例えば、植物および哺乳動物）中の副単位として存在し得る自律的な自己複製単位を指す。しかしながら、「細胞」は、有糸分裂刺激が適用される場合、典型的には依然として細胞分裂が可能である静止細胞をさらに指すことができる。

一実施形態では、細胞は、原核細胞または真核細胞を指し、好ましくは真核細胞を指す。

「真核細胞」を原核細胞から区別する決定的な特徴は、遺伝物質を含む膜結合細胞小器官（特に核）を有しかつ核膜で覆われていることである。

本発明に関連して、「真核細胞」は、哺乳動物細胞、植物細胞および真菌細胞からなる群から選択され、好ましくは哺乳動物細胞からなる群から選択される。

「哺乳動物」は、本明細書ではあらゆる哺乳動物を指し、ヒト、飼育動物および家畜、動物園、スポーツまたはペットの動物、例えばイヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、ウサギ等が挙げられる。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

従って、一実施形態では、細胞は、哺乳動物細胞、操作された哺乳動物細胞もしくは細胞株、または哺乳動物の免疫細胞である。

一実施形態では、哺乳動物細胞は免疫細胞である。

一実施形態では、免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはハイブリドーマであり得るが、これらに限定されず、好ましくはＢ細胞であり得る。

一実施形態では、細胞または複数の細胞は、本明細書では、様々なタイプの細胞、または様々な条件に曝露された同一のタイプもしくは起源の細胞を指す。

特定の一実施形態では、細胞は非哺乳動物細胞である。

さらに特定の一実施形態では、非哺乳動物細胞は、酵母細胞、トリ細胞またはサメ細胞である。

本発明の方法の工程ｄ）は、コンパートメントの少なくともいくつかの中のプライマー配列を使用して、前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた放出された核酸を逆転写することを指す。逆転写は、コンパートメントの少なくともいくつかに含まれる逆転写酵素（ＲＴ）を使用して実施される。

本発明に関連して、「逆転写酵素（ＲＴ）」は、逆転写と呼ばれるプロセスにおいてＲＮＡテンプレートから相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成するために使用される酵素である。

一実施形態では、逆転写酵素は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｉ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＶ、Ｍｕｒｉｎｅ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ＲＴ、ＳｍａｒｔＳｃｒｉｂｅ ＲＴまたはＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ ＲＴからなる群から選択される。

一実施形態では、逆転写酵素は、１～５０Ｕ／μｌの濃度であり、好ましくは５～２５Ｕ／μＬであり、例えば１２．５Ｕ／μｌである。

「逆転写」または「ＲＴ反応」は、全細胞ＲＮＡまたはポリ（Ａ）ＲＮＡ、逆転写酵素、プライマー、ｄＮＴＰおよびＲＮアーゼ阻害剤を使用することにより一本鎖ＲＮＡが一本鎖相補ＲＮＡ（ｃＤＮＡ）に逆転写されるプロセスである。逆転写の生成物は、一本鎖ｃＤＮＡであって、この一本鎖ｃＤＮＡのテンプレートＲＮＡにハイブリダイズされた一本鎖ｃＤＮＡを含むＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖であることが当業者に理解されるであろう。さらに理解されるように、前記ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖は、逆転写に使用されるプライマー配列を含むオリゴヌクレオチドにさらに連結されている。

従って、本発明の方法の工程ｄ）で核酸を逆転写した後、コンパートメントまたは複数のコンパートメントは、ｃＤＮＡをさらに含むことが当業者に理解されるであろう。

従って、一実施形態では、コンパートメントの少なくともいくつかは、単一細胞の溶解物からの核酸の逆転写により生成される単一細胞のｃＤＮＡをさらに含む。

一実施形態では、前記ｃＤＮＡは一本鎖相補ＤＮＡを指す。

さらなる実施形態では、前記ｃＤＮＡはＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖に含まれる。

一実施形態では、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖は、逆転写され、かつ少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドのプライマー配列にハイブリダイズされたＲＮＡを指す。

当業者に理解されるように、一実施形態では、ＲＮＡ／ＤＮＡ二本鎖は、工程ｃ）で核酸（好ましくはｍＲＮＡ）がハイブリダイズされ、かつ工程ｄ）で逆転写に使用されたプライマー配列を含むオリゴヌクレオチドに連結されている。

一実施形態では、コンパートメントまたは複数のコンパートメントは、逆転写酵素組成物を含む。

一実施形態では、逆転写酵素組成物は、プロテアーゼ阻害剤、ｄＮＴＰおよび／またはＤＴＴを含み、好ましくはプロテアーゼ阻害剤、ｄＮＴＰおよびＤＴＴを含む。

一実施形態では、ＤＴＴは、１ｍＭ～１０ｍＭの濃度であり、好ましくは５ｍＭの濃度である。

一実施形態では、このプロテアーゼ阻害剤は、複数のプロテアーゼ阻害剤を含む。

一実施形態では、このプロテアーゼ阻害剤は、ロイペプチンヘミ硫酸塩、ペプスタチンＡ、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン塩酸塩、Ｅ－６４およびＰＭＳＦからなるリストから選択される。

例えば、プロテアーゼ阻害剤は、ロイペプチンヘミ硫酸塩、ペプスタチンＡ、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン塩酸塩、Ｅ－６４およびＰＭＳＦの１つまたは複数を含むことができる。

本明細書で使用される場合、用語「ｄＮＴＰ」は、デオキシヌクレオシド三リン酸を指し、例えば、デオキシアデノシン－５’－三リン酸（ｄＡＴＰ、「Ａ」）、デオキシシチジン－５’－三リン酸（ｄＣＴＰ、「Ｃ」）、デオキシグアノシン－５’－三リン酸（ｄＧＴＰ、「Ｇ」）、デオキシチミジン－５’－三リン酸（ｄＴＴＰ、「Ｔ」）、またはデオキシウリジン－５’－三リン酸（ｄＵＴＰ、「Ｕ」）を指す。用語「ｄＮＴＰ」は、Ａ、Ｃ、Ｇ、ＴもしくはＵの塩基対の模倣が可能な改変塩基および塩基類似体または縮重様式での塩基対形成が可能な改変塩基および塩基類似体（例えば、ヌクレオチド類似体と呼ばれる、ＡもしくはＧ、ＣもしくはＴ、ＡもしくはＣ、ＧもしくはＴ、ＧもしくはＣ、またはＡもしくはＴと対形成する塩基）を含むデオキシヌクレオシド三リン酸を指すことも意図されている。本明細書において下記でさらに説明するように、前記ヌクレオチド類似体を例えば精製に使用することができる。

一実施形態では、ｄＮＴＰは、０．０１ｍＭ～１０ｍＭの濃度であり、好ましくは０．１～１ｍＭの濃度であり、より好ましくは０．５ｍＭの濃度である。

一実施形態では、逆転写酵素組成物はＲＮアーゼ阻害剤をさらに含む。

本発明に関連して、コンパートメントまたは複数のコンパートメントは水性組成物を含む。

本発明に関連して、「水性組成物」は、本発明の方法で使用される細胞に概して適合されており、本明細書において下記で定義される緩衝溶液を概して含む。

本発明の方法の工程ｂ）は、コンパートメント内の細胞の少なくともいくつかを溶解させることを指す。

本発明に関連して、前記「細胞溶解」は、酵素的手段、物理的手段および／もしくは化学的手段またはこれらの任意の組み合わせにより達成され得、特に酵素的手段、物理的手段および／または化学的手段により達成され得る。他の細胞破壊方法を使用することもできる。

従って、一実施形態では、酵素的細胞溶解、物理的細胞溶解および／または化学的細胞溶解を使用して、工程ａ）でコンパートメントまたは複数のコンパートメントを溶解させる。

細胞を除去する「酵素的方法」は、当技術分野で十分に確立されている。酵素は一般に市販されており、ほとんどの場合、もともと生物学的起源から単離された。一般に使用される酵素として、リゾチーム、リゾスタフィン、ザイモラーゼ（ｚｙｍｏｌａｓｅ）、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼおよびマンノースが挙げられる。

当業者に既知であるように、「化学的細胞溶解」は、脂質－脂質、脂質－タンパク質およびタンパク質－タンパク質の相互作用を破壊することにより、細胞を取り囲む脂質バリアを破壊する化学物質（例えば、界面活性剤）を使用して達成される。細胞溶解に理想的な界面活性剤は、細胞のタイプおよび供給源に左右される。非イオン性界面活性剤および両イオン性界面活性剤は、より穏やかな界面活性剤である。この目的のために、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘシリーズの非イオン性界面活性剤および３－［（３－コラミドプロピル）ジメチルアミノ］－ｌ－プロパンスルホネート（ＣＨＡＰＳ）、両性イオン界面活性剤が一般に使用される。対照的に、イオン性界面活性剤は強い可溶化剤であり、タンパク質を変性させる傾向があり、それによりタンパク質の活性および機能を破壊する。当技術分野では、細胞を破壊するために、タンパク質に結合して変性させるイオン性界面活性剤であるＳＤＳが広く使用される。

「物理的細胞溶解」は、超音波処理、氷ショックまたはエレクトロポレーションの使用を指す。

一例では、コンパートメント内の細胞を氷で溶解させる。

好ましい一実施形態では、工程ａ）の細胞溶解は、本発明に関連して、コンパートメント（特に液滴）を破壊しない。

上記によれば、一実施形態では、コンパートメントまたは複数のコンパートメントは、溶解組成物を含む。

一実施形態では、この溶解組成物は、リゾチーム、リゾスタフィン、ザイモラーゼ、ムタノリシン、グリカナーゼ、プロテアーゼおよびマンノースからなる群から選択される酵素を含む。

本発明に関連して、好ましい一実施形態では、溶解組成物は、塩化マグネシウム、界面活性剤、緩衝溶液およびＲＮアーゼ阻害剤を含む。

一実施形態では、塩化マグネシウムを１ｍＭ～２０ｍＭの濃度で使用する。

一実施形態では、この界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、ＮＰ－４０、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０およびＴｗｅｅｎ－２０およびＩＧＥＰＡＬ ＣＡ ６３０からなる群から選択される。

一実施形態では、この界面活性剤は、０．１％～１０％の濃度である。

この緩衝溶液の非限定的な例として、トリス－ＨＣｌ、ヘペス－ＫＯＨ、ピペス－ＮａＯＨ、マイレン酸、リン酸、クエン酸、リンゴ酸、ギ酸、乳酸、コハク酸、酢酸、ピバル（トリメチル酢）酸、ピリジン、ピペラジン、ピコリン酸、Ｌ－ヒスチジン、ＭＥＳ、ビス－トリス、ビス－トリスプロパン、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＰＩＰＥＳ、イミダゾール、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＴＥＳ、ＨＥＰＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＴＥＡ（トリエタノールアミン）、Ｎ－エチルモルホリン、ＰＯＰＳＯ、ＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、トリス、トリシン、グリシルグリシン、ビシン、ＴＡＰＳ、モルホリン、Ｎ－メチルジエタノールアミン、ＡＭＰＤ（２－アミノ－２－メチル－１，３－プロパンジオール）、ジエタノールアミン、ＡＭＰＳＯ、ホウ酸、ＣＨＥＳ、グリシン、ＣＡＰＳＯ、エタノールアミン、ＡＭＰ（２－アミノ－２－メチル－１－プロパノール）、ピペラジン、ＣＡＰＳ、１，３－ジアミノプロパン、ＣＡＢＳ、またはピペリジンを挙げることができる（ｗｗｗ．ｒｅａｃｈｄｅｖｉｃｅｓ．ｃｏｍ／Ｐｒｏｔｅｉｎ／ＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＢｕｆｆｅｒｓ．ｈｔｍｌも参照されたい）。ＲＮアーゼ阻害剤の非限定的な例として、ＲＮアーゼＯＵＴ、ＩＮ、ＳｕｐｅｒＩＮ Ｒｎアーゼ、ならびに広範囲のＲＮアーゼ（例えば、Ａ、Ｂ、Ｃ、１およびＴ１）を標的とする阻害剤を挙げることができる。

一例では、この溶解組成物は、概して、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５０ｍＭトリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４である。

本発明の方法の工程ｃ）は、コンパートメントの少なくともいくつかにおいて、放出された核酸の少なくともいくつかを前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせることを指す。

工程ｃ）のハイブリダイゼーションは、本明細書では、オリゴヌクレオチド中に存在するプライマー配列が、放出された核酸の相補的核酸配列にアニールする現象を指し、従って、当業者に既知であるように、使用する温度は、使用するプライマー配列および／またはＲＴ酵素に左右される。

一例では、工程ｃ）およびｄ）を、典型的には例えば５５０ｒｐｍでのコンパートメントの混合中に例えば５５℃で１時間にわたりまたは５０℃で２時間にわたりコンパートメントをインキュベートすることにより実施する。

一実施形態では、工程ｄ）の逆転写により生成されたｃＤＮＡを回収し、典型的にはその後の増幅および配列決定ライブラリの調製にさらに使用する。

従って、一実施形態では、本発明の方法は、コンパートメントの少なくともいくつかにおいて逆転写により生成された単一細胞のｃＤＮＡを回収することを含む。

「回収すること」は、本明細書では、コンパートメントの少なくともいくつかでの逆転写により生成されたｃＤＮＡを前記複数のコンパートメントから単離することを指す。

一実施形態では、回収することは、本明細書では、逆転写により生成されたｃＤＮＡを含むコンパートメントを収集すること、または前記ｃＤＮＡを含む前記コンパートメントに含まれる水性組成物を収集し、この水性溶液に含まれるｃＤＮＡを分離することを指す。

特定の一実施形態では、回収することは、本明細書では、逆転写により生成されたｃＤＮＡを含むマイクロ流体液滴を収集すること、このマイクロ流体液滴を破壊すること、および水性組成物に含まれるｃＤＮＡを前記マイクロ流体液滴の油相から分離することを指す。

核酸（特にｃＤＮＡ）をマイクロ流体液滴から単離する方法は、当業者に既知であり、例えば、マイクロ流体液滴を収集すること、および典型的にはペルフルオロオクタノール（Ｖ／Ｖエマルジョン）を使用してマイクロ流体液滴を破壊することを含む。次いで、前工程で得られたエマルジョンを、水相および油相が分離されるまでインキュベートすることである。一例では、水相を例えば４℃において１００００ｇで１０分にわたり概して遠心分離し、ｃＤＮＡを含む上清を回収する。

一実施形態では、この方法は、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを除去する工程をさらに含み、好ましくは、組み込まれていないオリゴヌクレオチドをコンパートメントの水性組成物から除去する工程をさらに含む。好ましい一実施形態では、組み込まれていないオリゴヌクレオチド組成物をコンパートメントの少なくともいくつかから除去する工程を、本明細書において上記で定義された逆転写により生成されたｃＤＮＡを回収する工程後に行う。

好ましくは、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを除去する工程は、本明細書において下記で定義される増幅工程および／または配列決定工程に先行する。

組み込まれていないオリゴヌクレオチドを除去する工程は、組み込まれていないバーコード配列を除去することを包含することが当業者に理解されるであろう。

一実施形態では、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを除去することは、コンパート面の少なくともいくつかの水性組成物と精製基体とを接触させることであって、この精製基体は、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを除去する、接触させることを含む。一実施形態では、この精製基体は、ビーズまたは粒子を含み、このビーズおよび粒子は、任意選択でカラムを形成する。さらなる例では、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを、例えばアクリルアミドゲルを使用するサイズ選択により除去する。

一実施形態では、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを除去する工程は、コンパートメントの少なくともいくつかの水性組成物とエキソヌクレアーゼとを接触させて、コンパートメントの少なくともいくつかの水性組成物内の組み込まれていないオリゴヌクレオチドを分解することを含む。

この工程の特定の実施形態では、エキソヌクレアーゼは、ｃＤＮＡを含む水性組成物由来の一本鎖核酸配列を分解する。

工程ｄ）で得られたｃＤＮＡは、ＲＮＡ／ＤＮＡ複合体の形態で概して存在し、そのため、前記エキソヌクレアーゼから保護されることが当業者に理解されるであろう。

一実施形態では、このｃＤＮＡは、ｃＤＮＡ配列またはｃＤＮＡ分子の精製を容易にする１種または複数のヌクレオチド類似体（本明細書において上記で定義されている）を含む。

当業者に理解されるように、特定の実施形態では、精製済みｃＤＮＡは、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを含まない。従って、特定の実施形態では、精製済みｃＤＮＡは、組み込まれていないバーコード配列を含まない。

一実施形態では、このｃＤＮＡをＲＮアーゼＡおよび／またはＲＮアーゼＨでさらに処理する。

「ＲＮアーゼＡ」は、Ｃ残基およびＵ残基で一本鎖ＲＮＡを特異的に分解するエンドリボヌクレアーゼである。

一実施形態では、ＲＮアーゼＡは、１０～１０００μｇ／μＬの濃度であり、好ましくは５０～２００μｇ／μＬの濃度であり、例えば１００μｇ／μＬの濃度である。

「ＲＮアーゼＨ」は、加水分解機構によるＲＮＡの開裂を触媒する非配列特異的エンドヌクレアーゼのファミリーである。ＲＮアーゼＨのリボヌクレアーゼ活性によりＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖基質中のＲＮＡの３’－Ｏ－Ｐ結合が開裂され、３’－ヒドロキシル終端生成物および５’－リン酸終端生成物が生成される。

一実施形態では、ＲＮアーゼＨは、１０～１０００μｇ／μＬの濃度であり、好ましくは５０～２００μｇ／μＬの濃度であり、例えば１００μｇ／μＬの濃度である。

一実施形態では、このｃＤＮＡをプロテイナーゼＫでさらに処理する。

「プロテイナーゼＫ」は、広域スペクトルのセリンプロテアーゼであり、疎水性アミノ酸の次にタンパク質を優先的に消化する。

一実施形態では、プロテイナーゼＫは、０．１～５ｍｇ／ｍＬの濃度であり、好ましくは０．１～１ｍｇ／ｍＬの濃度であり、例えば０．８ｍｇ／ｍＬの濃度である。

一実施形態では、本方法は、本発明の方法の工程ｄ）で得られたｃＤＮＡを増幅させる工程をさらに含む。一実施形態では、前記増幅工程を、組み込まれていないオリゴヌクレオチドを除去した後に実施する。一実施形態では、前記増幅工程を、本明細書において下記で定義される配列決定工程前に実施する。

一実施形態では、この増幅させる工程は、多重反応、分離型ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または線形増幅で実施される。

一実施形態では、この線形増幅は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写である。

一実施形態では、工程ｄ）で生成されたｃＤＮＡを、ｑＰＣＲ（例えば、一重ｑＰＣＲ反応および／または多重ｑＰＣＲ反応）を使用して定量する。

さらなる実施形態では、本方法は、工程ｄ）で得られたｃＤＮＡを配列決定する工程をさらに含む。

本発明に関連して、一実施形態では、ｃＤＮＡを配列決定する工程は、本明細書では、ｃＤＮＡを配列決定ライブラリに最初に接触させること、およびそれぞれｃＤＮＡに対応する配列決定ライブラリからの目的の配列を増幅させることを指す。

一実施形態では、ｃＤＮＡを配列決定する工程は、配列決定ライブラリに対して次世代配列決定（ＮＧＳ）プロトコルを実施することを含むことができる。

特定の実施形態では、このＮＧＳプロトコルは、試薬キットの１つのフローセル当たり４ｐＭ～２０ｐＭの量の配列決定ライブラリをロードすることを含む。

一実施形態では、このＮＧＳ配列決定プロトコルは、この量の配列決定ライブラリまたは試薬キットのフローセルに５～６０％ＰｈｉＸを添加する工程をさらに含む。

複数のマイクロ流体液滴
本発明は、複数のコンパートメントであって、これらのコンパートメントの少なくともいくつかは、（ｉ）単一細胞または核酸を含む単一細胞溶解物と、（ｉｉ）少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）逆転写酵素とを含み、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、バーコード配列およびプライマー配列を含み、それぞれの異なるプライマー配列は、異なるオリゴヌクレオチドタイプを規定し、複数のコンパートメントのコンパートメントは、複数のコンパートメントの他のコンパートメントに含まれるバーコード配列から識別可能な１つまたは複数のバーコード配列を含み、
複数のコンパートメントは、３ｎＬ未満の体積を有し、
好ましくは、コンパートメント中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１００ｎＭである、複数のコンパートメントにさらに言及する。

本明細書において上記で説明したように、いくつかの実施形態では、少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを粒子（例えば、ヒドロゲルまたはポリマー粒子または磁性粒子）に最初に結合させることにより、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドをコンパートメントに導入する。

従って、一実施形態では、コンパートメントの少なくともいくつかは、（ｉｖ）粒子をさらに含み、ｉｉ）の少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、ｉＶ）の粒子に好ましくは結合されている。

従って、特定の一実施形態では、本発明は、複数のコンパートメントであって、これらのコンパートメントの少なくともいくつかは、（ｉ）単一細胞または核酸を含む単一細胞溶解物と、（ｉｉ）少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）逆転写酵素と、（ｉｖ）粒子（a particle）とを含み、ｉｉ）の少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、前記粒子（ｉｖ）に任意選択で結合されており、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、バーコード配列およびプライマー配列を含み、それぞれの異なるプライマー配列は、異なるオリゴヌクレオチドタイプを規定し、複数のコンパートメントのコンパートメントは、複数のコンパートメントの他のコンパートメントに含まれるバーコード配列から識別可能な１つまたは複数のバーコード配列を含み、
複数のコンパートメントは、３ｎＬ未満の体積を有し、
好ましくは、コンパートメント中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度は、少なくとも１００ｎＭである、複数のコンパートメントにさらに言及する。

一実施形態では、ｉｉｉ）の少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、ｉｖ）の粒子に非共有結合または共有結合され得る。非共有結合および共有結合は、本明細書において上記で定義された通りである。

特定の一実施形態では、複数のコンパートメントは、１ｎＬ以下の体積を有する。

一実施形態では、コンパートメントの少なくともいくつかは、ｖ）単一細胞溶解物からの核酸の逆転写によって生成された単一細胞のｃＤＮＡをさらに含む。

用語「細胞」、「核酸」、「オリゴヌクレオチド」または「各タイプのオリゴヌクレオチド」、「逆転写酵素」、「バーコード配列」、「プライマー配列」、「コンパートメントの体積」、「各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度」、「粒子」、「結合された」は、本明細書において上記セクション「単一細胞の核酸を捕捉しかつバーコードを付与する方法」で定義された通りである。

前のセクション「単一細胞の核酸を捕捉しかつバーコードを付与する方法」で説明されている特徴は、複数のコンパートメントに関する本説明に完全に適用可能である。

複数のマイクロ流体液滴を調製する方法
本発明は、複数のマイクロ流体液滴を調製する方法であって、
－ 第１の流体源を提供する工程であって、第１の流体は細胞の懸濁液を含む、工程、
－ 第２の流体源を提供する工程であって、第２の流体は、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを含み、この少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、１つのバーコード配列とプライマー配列とを含み、それぞれの異なるプライマー配列は、異なるオリゴヌクレオチドタイプを規定し、複数のマイクロ流体液滴の液滴は、複数のマイクロ流体液滴の他の液滴に含まれるバーコード配列から識別可能な１つまたは複数のバーコード配列を含む、工程、
－ 担体流体を提供する工程であって、この担体流体は、第１の流体および第２の流体と非混和性である、工程、
－ この担体流体をチップの主チャネルに注入する工程、
－ このチップの少なくとも副チャネルに第２の流体および第１の流体を注入することにより、担体流体中に液滴の流れを生じさせる工程であって、この副チャネルは、主チャネル中で開口しており、それぞれの生成された液滴は、第１の流体および第２の流体の混合物を含む、工程
を含み、
第１の流体中の細胞の濃度、第２の流体中のオリゴヌクレオチドの濃度、主チャネルおよび副チャネルの配置、第１の流体、第２の流体および担体流体の注入パラメータは、各液滴が単一細胞のみを含み、かつ３ｎＬ未満の体積を示すように適合されており、好ましくは、各液滴中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度が少なくとも１００ｎＭであるように適合されている、方法にさらに言及する。

一実施形態では、第２の流体は、複数の粒子をさらに含み、各粒子は、この粒子に結合された少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを含み、用語「結合された」は、本明細書において上記で定義された通りである。

同一の実施形態では、第１の流体中の細胞の濃度、第２の流体中の粒子の濃度、各粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの数、主チャネルおよび副チャネルの配置、第１の流体、第２の流体および担体流体の注入パラメータは、各液滴が単一細胞および粒子（a particle）のみを含み、かつ３ｎＬ未満の体積を示すように適合されており、好ましくは、各液滴中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度が少なくとも１００ｎＭであるように適合されている。

一実施形態では、第２の流体は、逆転写酵素をさらに含み、この逆転写酵素は、本明細書において上記で定義された通りである。

一実施形態では、第２の流体は、溶解組成物をさらに含む。

一実施形態では、第２の流体は、本明細書において上記で定義された逆転写組成物をさらに含む。

代替実施形態では、第２の流体は、逆転写組成物を含まず、かつ逆転写酵素を含まず、同一の実施形態では、複数のマイクロ流体液滴を調製する方法は、第３の流体源を提供することであって、第３の流体は逆転写酵素を含む、提供することをさらに含む。

関連する実施形態では、第３の流体は、逆転写酵素組成物をさらに含む。

従って、さらなる実施形態では、本発明は、複数のマイクロ流体液滴を調製する方法であって、
－ 第１の流体源を提供する工程であって、第１の流体は、細胞の懸濁液を含む、工程、
－ 第２の流体源を提供する工程であって、第２の流体は、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを含み、この少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、１つのバーコード配列とプライマー配列とを含み、それぞれの異なるプライマー配列は、異なるオリゴヌクレオチドタイプを規定し、複数のマイクロ流体液滴の液滴は、複数のマイクロ流体液滴の他の液滴に含まれるバーコード配列から識別可能な１つまたは複数のバーコード配列を含む、工程、
－ 第３の流体源を提供する工程であって、第３の流体は、逆転写酵素を含む、工程、
－ 担体流体を提供する工程であって、この担体流体は、第１の流体、第２の流体および第３の流体と非混和性である、工程、
－ この担体流体をチップの主チャネルに注入する工程、
－ このチップの少なくとも副チャネルに第１の流体、第２の流体および第３の流体を注入することにより、担体流体中に液滴の流れを生じさせる工程であって、副チャネルは、主チャネル中で開口しており、それぞれの生成された液滴は、第１の流体、第２の流体および第３の流体の混合物を含む、工程
を含み、
第１の流体中の細胞の濃度、第２の流体中のオリゴヌクレオチドの濃度、主チャネルおよび副チャネルの配置、第１の流体、第２の流体、第３の流体および担体流体の注入パラメータは、各液滴が単一細胞および粒子のみを含み、かつ３ｎＬ未満の体積を示すように適合されており、好ましくは、各液滴中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度が少なくとも１００ｎＭであるように適合されている、方法に言及する。

同一の実施形態では、第２の流体は、複数の粒子をさらに含み得、各粒子は、この粒子に結合された少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを含み、用語「結合された」は、本明細書において上記で定義された通りである。

同一の実施形態では、第１の流体中の細胞の濃度、第２の流体中の粒子の濃度、各粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの数、主チャネルおよび副チャネルの配置、第１の流体、第２の流体および第３の流体および担体流体の注入パラメータは、各液滴が単一細胞および粒子（a particle）のみを含み、かつ３ｎＬ未満の体積を示すように適合されており、好ましくは、各液滴中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度が少なくとも１００ｎＭであるように適合されている。

関連する実施形態では、第２の流体または第３の流体は、溶解組成物をさらに含むことができる。

さらに関連する実施形態では、第３の流体は、逆転写酵素組成物をさらに含む。

さらなる実施形態では、本発明は、複数のマイクロ流体液滴を調製する方法であって、
－ 第１の流体源を提供する工程であって、第１の流体は、細胞の懸濁液を含む、工程、
－ 第２の流体源を提供する工程であって、第２の流体は、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを含み、この少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドは、１つのバーコード配列とプライマー配列とを含み、それぞれの異なるプライマー配列は、異なるオリゴヌクレオチドタイプを規定し、複数のマイクロ流体液滴の液滴は、複数のマイクロ流体液滴の他の液滴に含まれるバーコード配列から識別可能な１つまたは複数のバーコード配列を含む、工程、
－ 第３の流体源を提供する工程であって、第３の流体は、逆転写酵素を含む、工程、
－ 第４の流体源を提供する工程であって、第４の流体は、溶解組成物を含む、工程、
－ 担体流体を提供する工程であって、この担体流体は、第１の流体、第２の流体、第３の流体および第４の流体と非混和性である、工程、
－ この担体流体をチップの主チャネルに注入する工程、
－ このチップの少なくとも副チャネルに第１の流体、第２の流体、第３の流体および第４の流体を注入することにより、担体流体中に液滴の流れを生じさせる工程であって、副チャネルは、主チャネル中で開口しており、それぞれの生成された液滴は、第１の流体、第２の流体、第３の流体および第４の流体の混合物を含む、工程
を含み、
第１の流体中の細胞の濃度、オリゴヌクレオチドの濃度、主チャネルおよび副チャネルの配置、第１の流体、第２の流体、第３の流体、第４の流体および担体流体の注入パラメータは、各液滴が単一細胞および粒子（a particle）のみを含み、かつ３ｎＬ未満の体積を示すように適合されており、好ましくは、各液滴中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度が少なくとも１００ｎＭであるように適合されている、方法に言及する。

関連する実施形態では、第３の流体は、逆転写酵素組成物をさらに含む。

一実施形態では、第２の流体は、複数の粒子をさらに含み、各粒子は、この粒子に結合された少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを含み、用語「結合された」は、本明細書において上記で定義された通りである。

同一の実施形態では、第１の流体中の細胞の濃度、第２の流体中の粒子の濃度、各粒子に結合されたオリゴヌクレオチドの数、主チャネルおよび副チャネルの配置、第１の流体、第２の流体、第３の流体、第４の流体および担体流体の注入パラメータは、各液滴が単一細胞および粒子（a particle）のみを含み、かつ３ｎＬ未満の体積を示すように適合されており、好ましくは、各液滴中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度が少なくとも１００ｎＭであるように適合されている。

本明細書において上記で説明されている方法では、一実施形態において、粒子および細胞を同時にまたは任意の適切な順序で連続して液滴に封入することができる。

「溶解組成物」は、本明細書において上記セクション「単一細胞の核酸を捕捉しかつバーコードを付与する方法」で定義されたのと同じ成分を含む。しかしながら、当業者に理解されるように、第２の流体の溶解組成物中に存在する成分の濃度は、セット方法により得られる複数のマイクロ流体液滴中に存在する成分の濃度と比較して増加するであろう。換言すると、複数のマイクロ流体液滴中に存在する溶解組成物の成分の濃度は、第２の流体中に存在する成分の濃度と比較して減少するであろう。

例えば、第２の流体中に存在する溶解組成物の成分の濃度は、最終マイクロ流体液滴中または複数のマイクロ液体流体中に存在する濃度と比べて３～７倍高く、好ましくは３～５倍高く、例えば４倍高い。

複数のマイクロ液体液滴を調製する方法に関連して、「逆転写酵素組成物」は、本明細書において上記で定義されたのと同じ成分を含む。しかしながら、当業者にさらに理解されるように、第２または第３の流体の逆転写酵素組成物に含まれる成分の濃度は、前記方法により得られる複数のマイクロ液滴流体中に存在する逆転写酵素組成物に含まれる成分の濃度と比較して増加するであろう。

例えば、第２または第３の流体中に存在する逆転写酵素組成物の成分の濃度は、複数のマイクロ流体液滴（本明細書において上記で定義された通りである）中に存在する濃度と比べて２～７倍高く、好ましくは２～５倍高く、例えば２．６倍高い場合がある。

一実施形態では、第１および第２の流体源は、接合の形態で構築されている。

さらなる実施形態では、第１、第２および第３の流体源は、接合の形態で構築されている。

さらなる実施形態では、第１、第２、第３および第４の流体源は、接合の形態で構築されている。

この接合は、例えば、Ｔ接合、Ｙ接合、チャネル内チャネル接合（例えば、同軸配置である、または内部チャネルと、この内部チャネルの少なくとも一部を取り囲む外部チャネルとを含む）、交差（または「Ｘ」）接合、流れ収束接合、または液滴の生成に適した他の接合であり得る。例えば、Ｌｉｎｋらにより２００４年４月９日に出願され、２００４年１０月２８日に国際公開第２００４／０９１７６３号パンフレットとして公開された「Ｆｏｒｍａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ Ｆｌｕｉｄｉｃ Ｓｐｅｃｉｅｓ」という名称の国際特許出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００４／０１０９０３号明細書、またはＳｔｏｎｅらにより２００３年６月３０日に出願され、２００４年１月８日に国際公開第２００４／００２６２７号パンフレットとして公開された「Ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ Ａｐｐａｒａｔｕｓ ｆｏｒ Ｆｌｕｉｄ Ｄｉｓｐｅｒｓｉｏｎ」という名称の国際特許出願第ＰＣＴ／米国特許出願公開第２００３／０２０５４２号明細書を参照されたい。

いくつかの実施形態では、この接合は、実質的に単分散の液滴を生成するように構成され得、かつ配置され得る。

一実施形態では、複数のマイクロ液体流体は、約２個以下の粒子／液滴が存在するように調製され、好ましくは複数のマイクロ流体液滴は、約１個以下の粒子／液滴が存在するように調製され、または１個の粒子／液滴でマイクロ流体液滴を優先的に調製し、または平均して１個の粒子／液滴でマイクロ流体液滴を調製される。

粒子／液滴の量を充填割合と称することもできる。例えば、平均充填割合は、約１個未満の粒子／液滴であり得、約０．９個未満の粒子／液滴であり得、約０．８個未満の粒子／液滴であり得、約０．７個未満の粒子／液滴であり得、約０．６個未満の粒子／液滴であり得、約０．５個未満の粒子／液滴であり得、約０．４個未満の粒子／液滴であり得、約０．３個未満の粒子／液滴であり得、約０．２個未満の粒子／液滴であり得、約０．１個未満の粒子／液滴であり得、約０．０５個未満の粒子／液滴であり得、約０．０３個未満の粒子／液滴であり得、約０．０２個未満の粒子／液滴であり得、または約０．０１個未満の粒子／液滴であり得る。場合により、より低い粒子充填割合を選択して、２個以上の粒子を有する液滴が生成される確率を最小化することができる。そのため、例えば、液滴の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％は、粒子を含まないか、または１個のみの粒子を含む場合がある。

同様に、いくつかの実施形態では、複数のマイクロ液体流体は、平均して各液体が１個未満の細胞を有するように調製される。同一の実施形態では、細胞／液滴の量を充填割合と称することができる。

例えば、平均充填割合は、約１個未満の細胞／液滴であり得、約０．９個未満の細胞／液滴であり得、約０．８個未満の細胞／液滴であり得、約０．７個未満の細胞／液滴であり得、約０．６個未満の細胞／液滴であり得、約０．５個未満の細胞／液滴であり得、約０．４個未満の細胞／液滴であり得、約０．３個未満の細胞／液滴であり得、約０．２個未満の細胞／液滴であり得、約０．１個未満の細胞／液滴であり得、約０．０５個未満の細胞／液滴であり得、約０．０３個未満の細胞／液滴であり得、約０．０２個未満の細胞／液滴であり得、または約０．０１個未満の細胞／液滴であり得る。場合により、より低い細胞充填割合を選択して、２個以上の細胞を有する液滴が生成される確率を最小化することができる。そのため、例えば、液滴の少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％または少なくとも約９９％は、細胞を含まないか、または１個のみの細胞を含む場合がある。加えて、液滴内の粒子充填の平均割合および細胞充填の平均割合は同一であっても異なっていてもよいことに留意すべきである。

場合により、１秒当たり比較的多数の液滴が調製され得、例えば、１秒当たり少なくとも約１０個、１秒当たり少なくとも約３０個、１秒当たり少なくとも約５０個、１秒当たり少なくとも約１００個、１秒当たり少なくとも約３００個、１秒当たり少なくとも約５００個、１秒当たり少なくとも約１，０００個、１秒当たり少なくとも約３，０００個、１秒当たり少なくとも約５，０００個、１秒当たり少なくとも約１０，０００個、１秒当たり少なくとも約３０，０００個、１秒当たり少なくとも約５０，０００個、１秒当たり少なくとも約１００，０００個の液滴等が調製され得る。具体的には、１秒当たり１～２０００個の液滴が調製され得、例えば、１秒当たり１～８００個の液滴、１秒当たり１～７００個の液滴、１秒当たり１～６００個の液滴、１秒当たり１～５００個の液滴、１秒当たり１～４００個の液滴、１秒当たり１～３００個の液滴、１秒当たり１～２００個の液滴、１秒当たり１～１００個の液滴、１秒当たり１～８０個の液滴、１秒当たり１～７０個の液滴、１秒当たり１～５０個の液滴、例えば、１秒当たり１０～３００個のマイクロ流体液滴、１秒当たり５０～３００個の液滴、１秒当たり１００～３００個の液滴、１秒当たり１５０～３００個の液滴、１秒当たり１５０～２５０個の液滴、１秒当たり１７５～２５０個のマイクロ流体液滴、典型的には１秒当たり１～１０００個の液滴、好ましくは１秒当たり１７５～２５０個のマイクロ流体液滴が調製され得る。

場合により、既に論じたように、液滴のいくつかまたは全ては、例えば液滴（例えば、好ましくは本明細書において上記で定義された１つのバーコード配列を含む）の少なくともいくつかの中に存在するオリゴヌクレオチドのタイプに基づいて識別可能であり得る。場合により、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも７０％、少なくとも約である。

複数の液滴の体積は、本明細書において上記セクション「単一細胞の核酸を捕捉しかつバーコードを付与する方法」で定義された通りである。

一実施形態では、本明細書における上記の方法に従って複数のマイクロ流体液滴を調製した後、この方法は、本明細書において上記で定義された単一細胞の核酸を捕捉しかつバーコードを付与する方法の工程ｂ）～ｄ）、および本明細書において上記で定義された単一細胞の核酸を捕捉しかつバーコードを付与する方法の他のさらなる工程をさらに含むことができる。

本発明は、先の出願米国特許出願第６２／２６４，４１４号明細書で説明されている項目にさらに関し、この明細書の内容は参照により本明細書に組み込まれる。

従って、本発明は、少なくとも１個の細胞から少なくとも２種の遺伝子配列を同定する方法であって、
（ａ）少なくとも、第１の細胞と、複数の第１の固有のＤＮＡバーコードに連結された第１の担体と、逆転写酵素とを、第１の細胞が第１の水性組成物内で少なくとも２種のＲＮＡ分子を放出するような条件下、第１の固有のＤＮＡバーコードが少なくとも２種のＲＮＡ分子の各々にハイブリダイズして少なくとも２種のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を形成するような条件下、および第１の固有のＤＮＡバーコードを含む少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物が第１の水性組成物内で生成されるような条件下で封入して第１の水性組成物を形成することであって、第１の水性組成物の体積は、５ナノリットル未満である、形成すること、
（ｂ）組み込まれてないＤＮＡバーコード配列を除去すること、および
（ｃ）少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物の各々を配列決定すること
を含み、
それにより、少なくとも１個の細胞から少なくとも２種の遺伝子配列を同定する、方法にさらに言及する。

さらなる項目によれば、本発明は、少なくとも１個の細胞から少なくとも２種の遺伝子配列を同定する方法であって、
（ａ）少なくとも、第１の細胞と、複数の第１の固有のＤＮＡバーコードに連結された第１の担体とを、第１の細胞が第１の水性組成物内で少なくとも２種のＲＮＡ分子を放出するような条件下、および第１の固有のＤＮＡバーコードが少なくとも２種のＲＮＡ分子の各々にハイブリダイズして少なくとも２種のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を形成するような条件下で封入して第１の水性組成物を形成すること、
（ｂ）第１の水性組成物と逆転写酵素とを、第１の固有のバーコードを含む少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物が第１の水性組成物内で生成されるような条件下で接触させることであって、第１の水性組成物の体積は、５ナノリットル未満である、接触させること、
（ｃ）組み込まれていないＤＮＡバーコード配列を除去すること、および
（ｄ）少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物の各々を配列決定すること
を含み、
それにより、少なくとも１個の細胞から少なくとも２種の遺伝子配列を同定する、方法に言及する。

一項目によれば、本発明の方法の方法は、少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物の各々を配列決定する前に少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物の各々を増幅させる工程をさらに含む。

一項目によれば、この増幅させる工程は、多重反応、分離型ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または線形増幅で実施される。

一項目によれば、この線形増幅は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写である。

さらなる項目によれば、本発明の方法は、少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物の各々を増幅させる前に第１の水性組成物内で第１の担体から少なくとも２種のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の各々を放出させる工程をさらに含む。

別の項目によれば、本発明の方法は、少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物の各々を増幅させた後に第１の水性組成物内で第１の担体から少なくとも２種のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の各々を放出させる工程をさらに含む。

一項目によれば、本発明の方法は、第１の水性組成物と逆転写酵素とを接触させる前に第１の水性組成物内で第１の担体から少なくとも２種のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の各々を放出させる工程をさらに含む。

さらなる項目によれば、第１の水性組成物は、第１の溶解組成物をさらに含む。

さらなる項目によれば、第１の水性組成物は、第１の逆転写酵素組成物をさらに含む。

さらなる項目によれば、第１の細胞は免疫細胞である。

さらなる項目によれば、この免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはハイブリドーマであり、好ましくはＢ細胞である。

別の項目によれば、第１の細胞は哺乳動物細胞である。

別の項目によれば、第１の細胞は非哺乳動物細胞である。

一項目によれば、この非哺乳動物細胞は酵母細胞である。

別の項目によれば、この非哺乳動物細胞はトリ細胞である。

別の項目によれば、この非哺乳動物細胞はサメ細胞である。

さらなる項目によれば、少なくとも２種のＲＮＡ分子は、第１の標的配列を含む第１のＲＮＡ分子と、第２の標的配列を含む第２のＲＮＡ分子とを含む。

特定の項目によれば、第１の細胞は免疫細胞であり、少なくとも２種のＲＮＡ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする配列を含む第１のＲＮＡ分子と、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする配列を含む第２のＲＮＡ分子とを含み、少なくとも２種のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする配列を含む第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする配列を含む第２のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖とを含み、第１の固有のＤＮＡバーコードを含む少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物は、ＶＨおよび第１の固有のＤＮＡバーコード配列をコードする配列を含む第１のｃＤＮＡ転写産物と、軽鎖可変領域（ＶＬ）および第１の固有のＤＮＡバーコード配列をコードする配列を含む第２のｃＤＮＡ転写産物とを含む。

特定の項目によれば、第１の細胞は哺乳動物細胞であり、少なくとも２種のＲＮＡ分子は、Ｔ細胞レセプターα鎖（ＴＣＲ－α）をコードする配列を含む第１のＲＮＡ分子と、Ｔ細胞レセプターβ鎖（ＴＣＲ－β）をコードする配列を含む第２のＲＮＡ分子とを含み、少なくとも２種のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖は、ＴＣＲ－αをコードする配列を含む第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖と、ＴＣＲ－βをコードする配列を含む第２のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖とを含み、第１の固有のＤＮＡバーコードを含む少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物は、ＴＣＲ－αおよび第１の固有のバーコード配列をコードする配列を含む第１のｃＤＮＡ転写産物と、ＴＣＲ－βおよび第１の固有のＤＮＡバーコード配列をコードする配列を含む第２のｃＤＮＡ転写産物とを含む。

一項目によれば、少なくとも２種のＲＮＡ分子は、ポリＡ配列を含む第１のＲＮＡ分子と、ポリＡ配列を含む第２のＲＮＡ分子とを含む。

さらなる項目によれば、第１の固有のＤＮＡバーコード配列は、５’から３’へと第１の固有のバーコード配列（このバーコード配列は一本鎖または二本鎖である）および逆転写用の第１のプライミング配列（このプライミング配列は一本鎖である）を含むＤＮＡ配列を含む。

さらなる項目によれば、第１の固有のＤＮＡバーコード配列は、第１の固有のバーコード配列および第１のプライミング配列に対して５’にリンカー配列をさらに含む。

さらなる項目によれば、この方法は、
（ａ）少なくとも、第２の細胞と、複数の第２の固有のＤＮＡバーコードに連結された第２の担体と、逆転写酵素とを、第２の細胞が第２の水性組成物内で少なくとも２種のＲＮＡ分子を放出するような条件下、第２の固有のＤＮＡバーコードが少なくとも２種のＲＮＡ分子の各々にハイブリダイズして少なくとも２種のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を形成するような条件下、および第２の固有のＤＮＡバーコードを含む少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物が第２の水性組成物内で生成されるような条件下で封入して第２の水性組成物を形成することであって、第２の水性組成物の体積は、５ナノリットル未満である、形成すること、
（ｂ）組み込まれていないＤＮＡバーコード配列を除去すること、および
（ｃ）少なくとも２種のｃＤＮＡ配列の各々を配列決定すること
を含む。

別の項目によれば、この方法は、
（ａ）少なくとも、第２の細胞と、複数の第２の固有のＤＮＡバーコードに連結された第２の担体とを、第２の細胞が第２の水性組成物内で少なくとも２種のＲＮＡ分子を放出するような条件下、および第２の固有のＤＮＡバーコードが少なくとも２種のＲＮＡ分子の各々にハイブリダイズして少なくとも２種のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖を形成するような条件下で封入して第２の水性組成物を形成すること、
（ｂ）第２の水性組成物と逆転写酵素とを、第２の固有のＤＮＡバーコードを含む少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物が第２の水性組成物内で生成されるような条件下で接触させることであって、第２の水性組成物の体積は、５ナノリットル未満である、接触させること、
（ｂ）組み込まれてないＤＮＡバーコード配列を除去すること、および
（ｃ）少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物の各々を配列決定すること
を含む。

一項目によれば、本発明の方法は、少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物の各々を配列決定する前に少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物の各々を増幅させる工程をさらに含む。

一項目によれば、前記増幅させる工程は、多重反応、分離型ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）または線形増幅で実施される。

さらなる項目によれば、この線形増幅は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの転写である。

別の項目によれば、本発明の方法は、少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物の各々を増幅させる前に第２の水性組成物内で第２の担体から少なくとも２種のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の各々を放出させる工程をさらに含む。

別の項目によれば、本発明の方法は、少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物の各々を増幅させた後に第２の水性組成物内で第２の担体から少なくとも２種のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の各々を放出させる工程をさらに含む。

さらなる項目によれば、本発明の方法は、第２の水性組成物と逆転写酵素とを接触させる前に第２の水性組成物内で第２の担体から少なくとも２種のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖の各々を放出させる工程をさらに含む。

一項目によれば、第２の水性組成物は、第２の溶解組成物をさらに含む。

別の項目によれば、第２の水性組成物は、第２の逆転写酵素組成物をさらに含む。

さらなる項目によれば、第２の細胞は免疫細胞である。

さらなる項目によれば、この免疫細胞は、Ｂ細胞、Ｔ細胞またはハイブリドーマであり、好ましくはＢ細胞である。

別の項目によれば、第２の細胞は哺乳動物細胞である。

別の項目によれば、第２の細胞は、本明細書において上記の項目の１つに従って定義された非哺乳動物細胞である。

特定の一項目によれば、第２の細胞は免疫細胞であり、少なくとも２種のＲＮＡ分子は、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする配列を含む第１のＲＮＡ分子と、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする配列を含む第２のＲＮＡ分子とを含み、少なくとも２種のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖は、重鎖可変領域（ＶＨ）をコードする配列を含む第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖と、軽鎖可変領域（ＶＬ）をコードする配列を含む第２のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖とを含み、第２の固有のＤＮＡバーコードを含む少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物は、ＶＨおよび第２の固有のＤＮＡバーコード配列をコードする配列を含む第２のｃＤＮＡ転写産物と、軽鎖可変領域（ＶＬ）および第２の固有のＤＮＡバーコード配列をコードする配列を含む第２のｃＤＮＡ転写産物とを含む。

さらに特定の一項目によれば、第２の細胞は哺乳動物細胞であり、少なくとも２種のＲＮＡ分子は、Ｔ細胞レセプターα鎖（ＴＣＲ－α）をコードする配列を含む第１のＲＮＡ分子と、Ｔ細胞レセプターβ鎖（ＴＣＲ－β）をコードする配列を含む第２のＲＮＡ分子とを含み、少なくとも２種のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖は、ＴＣＲ－αをコードする配列を含む第１のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖と、ＴＣＲ－βをコードする配列を含む第２のＤＮＡ／ＲＮＡ二本鎖とを含み、第１の固有のＤＮＡバーコードを含む少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物は、ＴＣＲ－αおよび第１の固有のバーコード配列をコードする配列を含む第１のｃＤＮＡ転写産物と、ＴＣＲ－βおよび第１の固有のＤＮＡバーコード配列をコードする配列を含む第２のｃＤＮＡ転写産物とを含む。

さらなる一項目によれば、第２の固有のＤＮＡバーコード配列は、５’から３’へと第２の固有のバーコード配列（このバーコード配列は一本鎖または二本鎖である）および逆転写用の第２のプライミング配列（このプライミング配列は一本鎖である）を含むＤＮＡ配列を含む。

一項目によれば、第１の溶解組成物および第２の溶解組成物は同一である。

一項目によれば、第１の固有のバーコード配列および第２の固有のＤＮＡバーコード配列は異なる。

一項目によれば、第１の水性組成物の体積は、約１０～５０００ピコリットル（端点を含む）である。例えば、第１の水性組成物の体積は、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０ナノリットルまたはその間の任意の量であり得る。

特定の一項目によれば、第１の水性組成物の体積は、３ｎＬ未満の体積を有する。より具体的な項目によれば、第１の水性組成物の体積は、２．５ｎＬ未満、２ｎＬ未満、１．５ｎＬ未満、１ｎＬ未満、０．５ｎＬ未満、例えば０．１ｎＬ～３ｎＬ、０．５ｎＬ～３ｎＬ、１ｎＬ～３ｎＬ、典型的には０．１ｎＬ、０．５ｎＬ、１ｎＬ、１．２ｎＬ、１．４ｎＬ、１．６ｎＬ、１．８ｎＬ、２．０ｎＬ、２．２ｎＬ、２．４ｎＬ、２．６ｎＬ、２．８ｎＬ、３ｎＬの体積を有する。

一項目によれば、第２の水性組成物の体積は、約１０～５０００ピコリットル（端点を含む）である。例えば、本開示の第２の水性組成物の体積は、０．０１、０．０５、０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．５、２．０、２．５、３．０、３．５、４．０、４．５、５．０ナノリットルまたはその間の任意の量であり得る。

特定の一項目によれば、第２の水性組成物の体積は、３ｎＬ未満の体積を有する。より具体的な項目によれば、第２の水性組成物の体積は、２．５ｎＬ未満、２ｎＬ未満、１．５ｎＬ未満、１ｎＬ未満、０．５ｎＬ未満、例えば０．１ｎＬ～３ｎＬ、０．５ｎＬ～３ｎＬ、１ｎＬ～３ｎＬ、典型的には０．１ｎＬ、０．５ｎＬ、１ｎＬ、１．２ｎＬ、１．４ｎＬ、１．６ｎＬ、１．８ｎＬ、２．０ｎＬ、２．２ｎＬ、２．４ｎＬ、２．６ｎＬ、２．８ｎＬ、３ｎＬの体積を有する。

一項目によれば、第１の水性組成物中の第１の固有のＤＮＡバーコード配列の濃度は、少なくとも１００ｎＭであり、好ましくは１００ｎＭ超である。

一項目によれば、第２の水性組成物中の第２の固有のＤＮＡバーコード配列の濃度は、少なくとも１００ｎＭであり、好ましくは１００ｎＭ超である。

一項目によれば、第１の溶解組成物および／または第２の溶解組成物は、塩化マグネシウム、界面活性剤、緩衝溶液およびＲＮアーゼ阻害剤を含む。

一項目によれば、塩化マグネシウムは、１ｍＭ～２０ｍＭ（端点を含む）の濃度である。

一項目によれば、この界面活性剤は、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ－１００、Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ４０およびＴｗｅｅｎ－２０からなる群から選択される。

一項目によれば、この界面活性剤は、０．１％～１０％（端点を含む）の濃度である。

一項目によれば、緩衝溶液は、トリス－ＨＣｌ、ヘペス－ＫＯＨおよびピペス－ＮａＯＨからなる群から選択される。

さらなる一項目によれば、このＲＮアーゼ阻害剤は、ＲＮアーゼＯＵＴ、ＩＮおよびＳｕｐｅｒＩＮ ＲＮアーゼからなる群から選択される。

一項目によれば、第１の逆転写酵素組成物および／または第２の逆転写酵素組成物は、プロテアーゼ阻害剤、ｄＮＴＰおよびＤＴＴを含む。

一項目によれば、このプロテアーゼ阻害剤は、複数のプロテアーゼ阻害剤を含む。

一項目によれば、このプロテアーゼ阻害剤は、ロイペプチンヘミ硫酸塩、ペプスタチンＡ、ＡＥＢＳＦ、アプロチニン、ベスタチン塩酸塩、Ｅ－６４およびＰＭＳＦの１つまたは複数を含む。

一項目によれば、逆転写酵素は、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ Ｉ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＩＩ、Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔａｓｅ ＩＶ、Ｍｏｌｏｎｅｙ Ｌｅｕｋｅｍｉａ ＲＴ、ＳｍａｒｔＳｃｒｉｂｅ ＲＴまたはＭｕｌｔｉＳｃｒｉｂｅ ＲＴである。

一項目によれば、組み込まれていないＤＮＡバーコード配列を除去することは、第１の水性組成物と精製基体とを接触させることであって、この精製基体は、組み込まれていないＤＮＡバーコード配列を除去する、接触させることを含む。

別の項目によれば、組み込まれていないＤＮＡバーコード配列を除去することは、第２の水性組成物と精製基体とを接触させることであって、この精製基体は、組み込まれていないＤＮＡバーコード配列を除去する、接触させることを含む。

一項目によれば、この精製基体は、ビーズまたは粒子を含む。

一項目によれば、このビーズまたは粒子は、カラムを形成する。

一項目によれば、少なくとも２種のｃＤＮＡ転写産物の各々を配列決定することは、配列決定ライブラリに対して次世代配列決定（ＮＧＳ）プロトコルを実施することを含む。

一項目によれば、このＮＧＳプロトコルは、試薬キットの１つのフローセル当たり８ｐＭ～１４ｐＭの量の配列決定ライブラリをロードすることを含む。

一項目によれば、このＮＧＳ配列決定プロトコルは、この量の配列決定ライブラリまたは試薬キットのフローセルに１０～２５％ＰｈｉＸを添加する工程をさらに含む。

一項目によれば、本発明の方法は、第１のｃＤＮＡ転写産物の配列および第２のｃＤＮＡ転写産物の配列を発現ベクターに挿入することをさらに含む。

用語「ベクター」は、これらの項目に関連して使用される場合、シャトルベクターおよび発現ベクターを含む。典型的には、このプラスミド構築物は、細菌中でのプラスミドの複製および選択それぞれのために、複製起点（例えば、複製のＣｏｌＥ１起点）および選択可能マーカー（例えば、アンピシリン耐性またはテトラサイクリン耐性）も含む。「発現ベクター」は、細菌中または真核細胞中での本発明の抗体断片等の抗体の発現に必須の制御配列または調節要素を含むベクターを指す。

一項目によれば、本発明の方法は、第１のｃＤＮＡ転写産物および第２のｃＤＮＡ転写産物を配列決定ライブラリに接触させる工程、および第１のｃＤＮＡ転写産物および第２のｃＤＮＡ転写産物それぞれに対応する少なくとも２種の目的の配列を配列決定ライブラリから増幅させる工程をさらに含む。

一項目によれば、本発明の方法は、第１のｃＤＮＡ転写産物に対応する目的の第１の配列および第２のｃＤＮＡ転写産物に対応する目的の配列を発現ベクターに挿入することをさらに含む。

一項目によれば、本発明の方法は、宿主細胞中で発現ベクターを発現させ、それにより組換えポリペプチドを産生することをさらに含む。

一項目によれば、この宿主細胞は哺乳動物細胞である。

一項目によれば、この哺乳動物細胞は、２９３細胞、２９３Ｔ細胞、ＨｅＬａ細胞、ＣＨＯ細胞またはＵ２ＯＳ細胞である。

一項目によれば、第１の水性組成物は液滴である。

一項目によれば、第１の水性組成物は、第１の容器またはこの容器の任意のコンパートメントに含まれている。

一項目によれば、第１の容器またはこの容器の任意のコンパートメントは、プレート、ウェル、チューブ、チャネル、ナノウェル、ナノチューブまたはナノチャネルである。

一項目によれば、第２の水性組成物は液滴である。

一項目によれば、第２の水性組成物は、第２の容器またはこの容器の任意のコンパートメントに含まれている。

一項目によれば、第２の容器またはこの容器の任意のコンパートメントは、プレート、ウェル、チューブ、チャネル、ナノウェル、ナノチューブまたはナノチャネルである。

一項目によれば、第１の容器は、３～５ナノリットル（端点を含む）の最大体積を有する。

一項目によれば、第１の容器および／または第２の容器は、３～５ナノリットル（端点を含む）の最大体積を有する。

一項目によれば、第１の担体は、固体担体または液体担体である。

一項目によれば、この固体担体は、ビーズ、ヒドロゲルビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性粒子または表面である。

一項目によれば、この液体担体は、エマルジョン、溶液、緩衝液、水性溶液、非水性溶液である。

一項目によれば、第２の担体は、固体担体または液体担体である。

一項目によれば、この固体担体は、ビーズ、ヒドロゲルビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性粒子または表面である。

一項目によれば、この液体担体は、エマルジョン、溶液、緩衝液、水性溶液、非水性溶液である。

本出願全体を通して、用語「および／または」は、接続する事例の１つまたは複数が起こり得ることを包含すると解釈されるべき文法上の接続詞である。例えば、語句「配列はエラー検出および／または訂正を可能にする」における文言「エラー検出および／または訂正」は、この配列がエラー検出を可能にし得、かつこの配列がエラー訂正を可能にし得ること、またはこの配列がエラー検出を可能にし得るかもしくはこの配列がエラー訂正を可能にし得ることを示す。

本出願および添付した特許請求の範囲で使用される場合、単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」および「その（ｔｈｅ）」は、内容が別途明確に示さない限り、複数の参照（例えば、言及された複数の対象）を含む。

本出願全体を通して、用語「含む」は、全ての具体的に言及された特徴および任意の追加の特定されていない特徴を包含すると解釈されるべきである。本明細書で使用される場合、用語「含む」の使用は、具体的に言及された特徴以外の特徴が存在しない（即ち「からなる」）実施形態も開示する。

説明全体において、１つのセクションで説明された特徴は、本明細書の他のセクションに完全に適用可能である。例えば、セクション「単一細胞の核酸を捕捉しかつバーコードを付与する方法」で示された「プライマー」に関する説明は、「複数のマイクロ流体液滴」と呼ばれるセクションおよび「複数のマイクロ流体液滴を調製する方法」と呼ばれるセクションに完全に適用可能であり、または例えば、セクション「単一細胞の核酸を捕捉しかつバーコードを付与する方法」で示された「少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチド」に関する説明は、「複数のマイクロ流体液滴」と呼ばれるセクションおよび「複数のマイクロ流体液滴を調製する方法」と呼ばれるセクションに完全に適用可能である。

ここで、下記の実施例を参照して本発明をより詳細に説明する。本明細書で引用されている全ての文献および特許文献は、参照により本明細書に組み込まれる。上記の説明で本発明を詳細に例証しかつ説明しているが、実施例は、実例または代表例であって限定的でないと見なされるべきである。

配列表
配列番号１は、核酸配列
ＣＡＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴ ＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＡＡＧＧＧＴＴＴＣ
からなる、アンチセンスプライマーＴｏｐ＿ＳＢＳ１２－ＡＴＰ５Ｇ３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号２は、核酸配列
ＣＡＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣ ＡＧＡＣＡＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡ’
からなる、アンチセンスプライマーＴｏｐ＿ＳＢＳ１２－ＲＰＳ２９のヌクレオチド配列を示す。

配列番号３は、核酸配列
ＣＡＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＧＡＴ ＣＣＡＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＴＧＣＴ
からなる、アンチセンスプライマーＴｏｐ＿ＳＢＳ１２－ＺＮＦ７８０Ａのヌクレオチド配列を示す。

配列番号４は、核酸配列ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＡＧＧＡからなる、センスプライマーＳＢＳ３－ＡＴＰ５Ｇ３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号５は、核酸配列ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＴＡＣＣＴＣＧＴＴ ＧＣＡＣＴＧＣＴＧＡからなる、センスプライマーＳＢＳ３－ＲＰＳ２９のヌクレオチド配列を示す。

配列番号６は、核酸配列ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＴＴＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡからなる、センスプライマーＳＢＳ３－ＺＮＦ７８０Ａのヌクレオチド配列を示す。

配列番号７は、核酸配列ＣＡＡＣＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＣからなる、マウスＡＴＰ５Ｇ３用のアンチセンスプライマーのヌクレオチド配列を示す。

配列番号８は、下記の核酸配列ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴ ＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＡからなる、マウスＡＴＰ５Ｇ３用のセンスプライマーのヌクレオチド配列を示す。

配列番号９は、核酸配列ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧからなる、ＶＨ用のＲＴプライマーＶＨ＿１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１０は、核酸配列ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＧＣからなる、ＶＨ用のＲＴプライマーＶＨ＿２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１１は、核酸配列ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧからなる、ＶＨ用のＲＴプライマーＶＨ＿３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１２は、核酸配列ＧＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＧからなる、ＶＨ用のＲＴプライマーＶＨ＿４のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１３は、核酸配列ＧＣＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧからなる、ＶＨ用のＲＴプライマーＶＬｋ＿１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１４は、核酸配列ＧＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧからなる、ＶＨ用のＲＴプライマーＶＬｋ＿２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１５は、核酸配列ＧＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＧからなる、ＶＨ用のＲＴプライマーＶＬｋ＿３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１６は、核酸配列ＧＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡからなる、Ｔ７アンチセンスＰＣＲ１プライマーのヌクレオチド配列を示す。

配列番号１７は、核酸配列ＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣからなる、センスプライマーＭｍＬＨ＿ＡＧ１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１８は、核酸配列ＣＡＧＣＴＡＣＡＧＧＴＧＴＣＣＡＣＴＣＣからなる、センスプライマーＭｍＬＨ＿ＡＧ２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１９は、核酸配列ＴＴＴＡＴＣＡＡＧＧＴＧＴＧＣＡＴＴＧＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨ＿ＡＧ３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号２０は、核酸配列ＧＡＡＣＴＧＣＡＧＧＣＧＴＣＣＡＣＴＣＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨ＿ＡＧ４のヌクレオチド配列を示す。

配列番号２１は、核酸配列ＴＡＡＣＴＧＣＡＧＧＴＧＴＴＣＡＣＴＣＣからなる、センスプライマーＭｍＬＨ＿ＡＧ５のヌクレオチド配列を示す。

配列番号２２は、核酸配列ＴＣＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＡＴＣＣからなる、センスプライマーＭｍＬＨ＿ＡＧ６のヌクレオチド配列を示す。

配列番号２３は、核酸配列ＴＴＣＣＡＡＧＣＴＧＴＧＴＣＣＴＧＴＣＣからなる、センスプライマーＭｍＬＨ＿ＡＧ７のヌクレオチド配列を示す。

配列番号２４は、核酸配列ＣＴＴＴＴＡＡＡＧＧＴＡＴＴＣＡＣＴＧＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨ＿ＡＧ８のヌクレオチド配列を示す。

配列番号２５は、核酸配列ＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＧＧＴＣＣＡＧＴＧＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨ＿ＡＧ９のヌクレオチド配列を示す。

配列番号２６は、核酸配列ＴＴＴＴＡＡＡＡＧＧＴＧＴＣＣＡＧＴＧＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨ＿ＡＧ１０のヌクレオチド配列を示す。

配列番号２７は、核酸配列ＴＴＴＴＡＡＡＴＧＧＴＡＴＣＣＡＧＴＧＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨ＿ＡＧ１１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号２８は、核酸配列ＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＴＧＣＣＣＡＡＧＣＡからなる、センスプライマーＭｍＬＨ＿ＡＧ１２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号２９は、核酸配列ＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＴＡＴＣＣＡＡＧＣＡからなる、センスプライマーＭｍＬＨ＿ＡＧ１３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号３０は、核酸配列ＡＴＧＲＡＳＴＴＳＫＧＧＹＴＭＡＲＣＴＫＧＲＴＴＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨａのヌクレオチド配列を示す。

配列番号３１は、核酸配列ＡＴＧＲＡＡＴＧＳＡＳＣＴＧＧＧＴＹＷＴＹＣＴＣＴＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨｂのヌクレオチド配列を示す。

配列番号３２は、核酸配列ＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＧＣＴＣＡＡＴＴＴＡＧＴＴＴＴＣＣＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨｃ１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号３３は、核酸配列ＡＴＧＧＣＴＧＴＣＹＴＲＧＢＧＣＴＧＹＴＣＹＴＣＴＧからなる、センスプライマーＭｍＬＨｃ２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号３４は、核酸配列ＡＴＧＧＶＴＴＧＧＳＴＧＴＧＧＡＭＣＴＴＧＣＹＡＴＴＣＣＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨｃ３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号３５は、核酸配列ＡＴＧＡＡＡＴＧＣＡＧＣＴＧＧＲＴＹＡＴＳＴＴＣＴＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨｄ１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号３６は、核酸配列ＡＴＧＧＲＣＡＧＲＣＴＴＡＣＷＴＹＹＴＣＡＴＴＣＣＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨｄ２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号３７は、核酸配列ＡＴＧＡＴＧＧＴＧＴＴＡＡＧＴＣＴＴＣＴＧＴＡＣＣＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨｄ３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号３８は、核酸配列ＡＴＧＧＧＡＴＧＧＡＧＣＴＲＴＡＴＣＡＴＳＹＴＣＴＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨｅ１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号３９は、核酸配列ＡＴＧＡＡＧＷＴＧＴＧＧＢＴＲＡＡＣＴＧＧＲＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨｅ２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号４０は、核酸配列ＡＴＧＧＲＡＴＧＧＡＳＣＫＫＩＲＴＣＴＴＴＭＴＣＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨｅ３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号４１は、核酸配列ＡＴＧＡＡＣＴＴＹＧＧＧＹＴＳＡＧＭＴＴＧＲＴＴＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨｆ１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号４２は、核酸配列ＡＴＧＴＡＣＴＴＧＧＧＡＣＴＧＡＧＣＴＧＴＧＴＡＴからなる、センスプライマーＭｍＬＨｆ２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号４３は、核酸配列ＡＴＧＡＧＡＧＴＧＣＴＧＡＴＴＣＴＴＴＴＧＴＧからなる、センスプライマーＭｍＬＨｆ３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号４４は、核酸配列ＡＴＧＧＡＴＴＴＴＧＧＧＣＴＧＡＴＴＴＴＴＴＴＴＡＴＴＧからなる、センスプライマーＭｍＬＨｆ４のヌクレオチド配列を示す。

配列番号４５は、核酸配列ＡＴＧＲＡＧＷＣＡＣＡＫＷＣＹＣＡＧＧＴＣＴＴＴからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫａのヌクレオチド配列を示す。

配列番号４６は、核酸配列ＡＴＧＧＡＧＡＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＣＣＴＧＣＴＡＴからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｂのヌクレオチド配列を示す。

配列番号４７は、核酸配列ＡＴＧＧＡＧＷＣＡＧＡＣＡＣＡＣＴＳＣＴＧＹＴＡＴＧＧＧＴからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｃのヌクレオチド配列を示す。

配列番号４８は、核酸配列ＡＴＧＡＧＧＲＣＣＣＣＴＧＣＴＣＡＧＷＴＴＹＴＴＧＧＩＷＴＣＴＴからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｄ１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号４９は、核酸配列ＡＴＧＧＧＣＷＴＣＡＡＧＡＴＧＲＡＧＴＣＡＣＡＫＷＹＹＣＷＧＧからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｄ２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号５０は、核酸配列ＡＴＧＡＧＴＧＴＧＣＹＣＡＣＴＣＡＧＧＴＣＣＴＧＧＳＧＴＴからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｅ１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号５１は、核酸配列ＡＴＧＴＴＧＧＧＡＹＣＧＫＴＴＴＹＡＭＭＣＴＴＴＴＣＡＡＴＴＧからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｅ２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号５２は、核酸配列ＡＴＧＧＡＡＧＣＣＣＣＡＧＣＴＣＡＧＣＴＴＣＴＣＴＴＣＣからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｅ３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号５３は、核酸配列ＡＴＧＡＧＩＭＭＫＴＣＩＭＴＴＣＡＩＴＴＣＹＴＧＧＧからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｆ１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号５４は、核酸配列ＡＴＧＡＫＧＴＨＣＹＣＩＧＣＴＣＡＧＹＴＹＣＴＩＲＧからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｆ２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号５５は、核酸配列ＡＴＧＧＴＲＴＣＣＷＣＡＳＣＴＣＡＧＴＴＣＣＴＴＧからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｆ３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号５６は、核酸配列ＡＴＧＴＡＴＡＴＡＴＧＴＴＴＧＴＴＧＴＣＴＡＴＴＴＣＴからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｆ４のヌクレオチド配列を示す。

配列番号５７は、核酸配列ＡＴＧＡＡＧＴＴＧＣＣＴＧＴＴＡＧＧＣＴＧＴＴＧＧＴＧＣＴからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｇ１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号５８は、核酸配列ＡＴＧＧＡＴＴＴＷＣＡＲＧＴＧＣＡＧＡＴＴＷＴＣＡＧＣＴＴからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｇ２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号５９は、核酸配列ＡＴＧＧＴＹＣＴＹＡＴＶＴＣＣＴＴＧＣＴＧＴＴＣＴＧＧからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｇ３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号６０は、核酸配列ＡＴＧＧＴＹＣＴＹＡＴＶＴＴＲＣＴＧＣＴＧＣＴＡＴＧＧからなる、ＶＬセンスプライマーＭｍＬＫｇ４のヌクレオチド配列を示す。

配列番号６１は、核酸配列ａｔｔｇｃｔｃａｇｇｔｔｃｔｔｔｃｔｃｃからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号６２は、核酸配列ｃａｇｔｃａｔａａｔｇｔｃｃａｇａｇｇａからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号６３は、核酸配列ｃａｇｔｃａｔａａｔｇｔｃｃａｇｇｇｇａからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号６４は、核酸配列ｃａｇｔｃａｔａｃｔａｔｔｃａｇａｇｇａからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿４のヌクレオチド配列を示す。

配列番号６５は、核酸配列ｃａｇｔｃａｔａｇｔｇｔｃｔａａｔｇｇａからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿５のヌクレオチド配列を示す。

配列番号６６は、核酸配列ｃａｇｔｃａｔａｔｔｇａｃｃａａｔｇｇａからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿６のヌクレオチド配列を示す。

配列番号６７は、核酸配列ｃａｇｔｃａｔａｔｔｇｔｃｃａｇｔｇｇａからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿７のヌクレオチド配列を示す。

配列番号６８は、核酸配列ｃｇｇｔａｔｃｔｇｇｔａｃｃｔｇｔｇｇａからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿８のヌクレオチド配列を示す。

配列番号６９は、核酸配列ｃｇａｇｔｃｃａｇｃｃｔｃａａｇｃａｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿９のヌクレオチド配列を示す。

配列番号７０は、核酸配列ｇａａｔｃａｃａｇｇｃａｔａａｔａｔｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿１０のヌクレオチド配列を示す。

配列番号７１は、核酸配列ｇａａｔｃｃｃａｇｇｃａｔｇａｔａｔｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿１１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号７２は、核酸配列ｇｃａｔｇｔｃｔｇｇｔｇｃｃｔｇｔｇｃａからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿１２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号７３は、核酸配列ｇｇａｃｃａｃｇｇｔｃｔｃａｇｃｔｇｔｃからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿１３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号７４は、核酸配列ｇｇａｃｔｔｃａｇｃｃｔｃｃａｇａｔｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿１４のヌクレオチド配列を示す。

配列番号７５は、核酸配列ｇｇａｔａｔｃａｇｇｔｇｃｃｃａｇｔｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿１５のヌクレオチド配列を示す。

配列番号７６は、核酸配列ｇｇａｔｃｃｃｔｇｇａｇｃｃａｃｔｇｇｇからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿１６のヌクレオチド配列を示す。

配列番号７７は、核酸配列ｇｇａｔｃｃｃｔｇｇａｔｃｃａｃｔｇｃａからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿１７のヌクレオチド配列を示す。

配列番号７８は、核酸配列ｇｇａｔｃｔｃｔｇｇａｇｔｃａｇｔｇｇｇからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿１８のヌクレオチド配列を示す。

配列場合７９は、核酸配列ｇｇａｔｔｃａｇｇａａａｃｃａａｃｇｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿１９のヌクレオチド配列を示す。

配列番号８０は、核酸配列ｇｇａｔｔｃｃａｇｃｃｔｃｃａｇａｇｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿２０のヌクレオチド配列を示す。

配列番号８１は、核酸配列ｇｇａｔｔｃｃｔｇｃｔｔｃｃａｇｃａｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿２１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号８２は、核酸配列ｇｇａｔｔｃｇｇｇａａａｃｃａａｃｇｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿２２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号８３は、核酸配列ｇｇａｔｔｔｃａｇｃｃｔｃｃａｃａｇｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿２３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号８４は、核酸配列ｇｇｃｔｃｃａａｇｇｃａｔｇａｇｃｔｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿２４のヌクレオチド配列を示す。

配列番号８５は、核酸配列ｇｇｃｔｔｃａｔｇｇｔｇｃｔｃａｇｔｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿２５のヌクレオチド配列を示す。

配列番号８６は、核酸配列ｇｇｃｔｔａｃａｇａｃｇｃａｇｇａｔｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿２６のヌクレオチド配列を示す。

配列番号８７は、核酸配列ｇｇｃｔｔａｃａｇａｔｇｃｃａｇａｔｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿２７のヌクレオチド配列を示す。

配列番号８８は、核酸配列ｇｇｇｔａｔｃｔｇｇｔａｃｃｔｇｔｇｇｇからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿２８のヌクレオチド配列を示す。

配列番号８９は、核酸配列ｇｇｇｔａｔｃｔｇｇｔｇｃｃｔｇｔｇｃａからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿２９のヌクレオチド配列を示す。

配列番号９０は、核酸配列ｇｇｇｔｔｃｃａｇｇｔｔｃｃａｃｔｇｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿３０のヌクレオチド配列を示す。

配列番号９１は、核酸配列ｇｇｔｔａｔａｔｇｇｔｇｃｔｇａｔｇｇｇからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿３１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号９２は、核酸配列ｇｇｔｔｃｃｃａｇｇｔｇｃｃａｇａｔｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿３２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号９３は、核酸配列ｇｇｔｔｇｔｃｔｇｇｔｇｔｔｇａａｇｇａからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿３３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号９４は、核酸配列ｇｇｔｔｔｃｃａｇｇｔａｔｃａｇａｔｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿３４のヌクレオチド配列を示す。

配列番号９５は、核酸配列ｇｇｔｔｔｃｃａｇｇｔｇｃａａｇａｔｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿３５のヌクレオチド配列を示す。

配列番号９６は、核酸配列ｇｇｔｔｔｇｃａｇｇｔｇｇｔａａａｔｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿３６のヌクレオチド配列を示す。

配列番号９７は、核酸配列ｇｇｔｔｔｔｔａｇｇｔｇｃｃａｇａｔｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿３７のヌクレオチド配列を示す。

配列番号９８は、核酸配列ｇｔｇｔｃａｃａｇｔｇｔｃａａａｇｇｇａからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿３８のヌクレオチド配列を示す。

配列番号９９は、核酸配列ｇｔｇｔｃｔｃｔｇａｔｔｃｔａｇｇｇｃａからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿３９のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１００は、核酸配列ｇｔｇｔｇｔｃｔｇｇｔｇｃｔｃａｔｇｇｇからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿４０のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１０１は、核酸配列ｇｔｔｔｔｃａａｇｇｔａｃｃａｇａｔａｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿４１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１０２は、核酸配列ｇｔｔｔｔｃａａｇｇｔａｃｃａｇａｔｇｔからなる、ＶＬセンスプライマーＬＬ＿ＡＧ＿４２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１０３は、核酸配列
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴインデックスＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ
からなる、イルミナインデックスアンチセンス（Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｉｎｄｅｘ Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ）プライマーのヌクレオチド配列を示し、インデックスは標準イルミナインデックスを表し、この標準イルミナインデックスは６～７塩基長である。

配列番号１０４は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＴＣ
からなる、ＶＨセンスプライマーＶＨｓ１のヌクレオチド配列を示す。

配列場合１０５は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＧＡＧＴＣ
からなる、ＶＨセンスプライマーＶＨｓ２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１０６は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＡＡＧＣＡＧＴＣ
からなる、ＶＨセンスプライマーＶＨｓ３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１０７は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＡＧＧＴＴＡＣＴＣＴＧＡＡＡＧＡＧＴＣ
からなる、ＶＨセンスプライマーＶＨｓ４のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１０８は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＡＴＣＴ
からなる、ＶＨセンスプライマーＶＨｓ５のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１０９は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＧＣＡＧＴＣ
からなる、ＶＨセンスプライマーＶＨｓ６のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１１０は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＡＧＧＴＣＣＡＡＣＴＧＣＡＧＣＡＧＣＣＴ
からなる、ＶＨセンスプライマーＶＨｓ７のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１１１は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＧＴＣ
からなる、ＶＨセンスプライマーＶＨｓ８のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１１２は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＧＧＴＧＡＡＧＣＴＧＧＴＧＧＡＡＴＣ
からなる、ＶＨセンスプライマーＶＨｓ９のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１１３は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＴＧＴＧＡＡＣＴＴＧＧＡＡＧＴＧＴＣ
からなる、ＶＨセンスプライマーＶＨｓ１０のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１１４は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＧＧＴＣＣＡＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＣ
からなる、ＶＨセンスプライマーＶＨｓ１１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１１５は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＧＡＧＧＡＧＴＣ
からなる、ＶＨセンスプライマーＶＨｓ１２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１１６は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＧＣＡＧＧＣＴ
からなる、ＶＬセンスプライマーＶＫｓ１のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１１７は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴＴＧＴＧＡＴＡＡＣＣＣＡＧ
からなる、ＶＬセンスプライマーＶＫｓ２のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１１８は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＣＡＴＴＧＴＧＣＴＧＡＣＣＣＡＡＴＣＴ
からなる、ＶＬセンスプライマーＶＫｓ３のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１１９は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＣＡＴＴＧＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＧＴＣＴ
からなる、ＶＬセンスプライマーＶＫｓ４のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１２０は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴＴＧＴＧＣＴＡＡＣＴＣＡＧＴＣＴ
からなる、ＶＬセンスプライマーＶＫｓ５のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１２１は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＴＡＴＣＣＡＧＡＴＧＡＣＡＣＡＧ ＡＣＴ
からなる、ＶＬセンスプライマーＶＫｓ６のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１２２は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＧＣＴＧＡＣＴＣＡＧＴＣＴ
からなる、ＶＬセンスプライマーＶＫｓ７のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１２３は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＡＡＡＴＴＧＴＴＣＴＣＡＣＣＣＡＧＴＣＴ
からなる、ＶＬセンスプライマーＶＫｓ８のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１２４は、核酸配列
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＧＡＴＧＴＴＴＴＧＡＴＧＡＣＣＣＡＡＡＣＴ
からなる、ＶＬセンスプライマーＶＫｓ９のヌクレオチド配列を示す。

配列番号１２５は、核酸配列ＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣからなる、プライマーＲＴ＿ＶＬｋのヌクレオチド配列を示す。

配列番号１２６は、核酸配列ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴからなる、ＰＣＲ３で使用されるセンスプライマーのヌクレオチド配列を示す。

配列番号１２７は、核酸配列ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ
からなる、ＰＣＲ３で使用されるアンチセンスプライマーのヌクレオチド配列を示す。

配列番号１２８は、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列ＣＡＲＤＷＳＲＳＷＹＬＡＰＮＧＰＤＬＤＹＷを示す。

配列番号１２９は、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列ＣＣＳＹＡＧＧＳＴＬＶＦを示す。

配列番号１３０は、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列ＣＡＲＧＧＫＳＤＤＧＮＦＲＹＦＤＨＷを示す。

配列番号１３１は、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列ＣＱＱＲＳＳＷＰＰＧＷＴＦを示す。

配列番号１３２は、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列ＣＡＫＳＦＧＦＧＧＶＩＶＩＧＧＹＦＬＨＷを示す。

配列番号１３３は、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列ＣＱＱＹＤＮＬＰＬＴＦを示す。

配列番号１３４は、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列ＣＡＲＨＫＴＴＳＧＷＹＳＰＬＤＹＷを示す。

配列番号１３５は、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列ＣＱＱＹＳＧＳＶＷＴＦを示す。

配列番号１３６は、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列ＣＡＲＧＶＫＡＡＧＲＴＰＮＷＦＧＰＷを示す。

配列番号１３７は、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列ＣＱＳＹＤＳＳＬＳＧＨＶＶＦを示す。

配列番号１３８は、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列ＣＡＲＥＶＳＡＤＩＬＴＧＹＹＤＹＷを示す。

配列番号１３９は、ＣＤＲ３のヌクレオチド配列ＣＱＨＹＤＮＬＰＰＴＦを示す。

本開示がより効率的に理解され得るように、下記に実施例を記載する。この実施例は説明を目的とするのみであり、いかなる方法でも本発明を限定すると解釈されるべきではないことを理解すべきである。この実施例全体にわたり、別途注記した場合を除いて、分子クローニング反応および他の標準的な組換えＤＮＡ技術を、市販の試薬を使用してＭａｎｉａｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ－Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）で説明されている方法に従って実行した。

実施例１：バルク対液滴およびＲＴの効率測定
細胞から始まるＲＴ反応の最適化をバルク反応で実施している。この実験は、液滴条件（特に１個の細胞当たりの反応緩衝液の体積、１個の細胞当たりの試薬の量）を模倣する。バルク条件が液滴条件を模倣することを確認するために、バルク中でおよび液滴中でＲＴ反応を並行して実施した。ＲＴ反応の効率を評価するために、この結果を、同一の細胞集団から抽出した精製済みＲＮＡと比較した。

比較はｑＰＣＲデータに基づく。液滴実験のＣｐ値（二次導関数最大算出法により決定された交点値）をバルク実験および精製済みＲＮＡ試料のｃＤＮＡ合成と比較した。混合物（溶解緩衝液４× ５０μＬ；ＲＴ緩衝液５× １７．６μＬ；Ｈ２Ｏ ２２．４μＬ；ポリｄＴオリゴ １００μＭ ２μＬ；プロテアーゼ阻害剤４μＬ；ＤＹ－６４７ １００μＭ ４μＬ）を含む溶解緩衝液と、ＲＴ混合物緩衝液（一本鎖反応緩衝液５× ２２．５μＬ；０．１Ｍ ＤＴＴ １０μＬ；１０ｍＭ各ｄＮＴＰ １０μＬ；ＲＮアーゼ阻害剤２．５μＬ；Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ酵素２．５μＬ；ＤＹ－６４７ １００μＭ溶液２．５μＬ）と、ＰＢＳで予め洗浄し、ペレット化し、かつＤＹ－６４７ １００μＭ溶液１μＬ＋細胞懸濁溶液（Ｐｅｒｃｏｌｌ ３００μＬ；ＮａＣｌ １．５Ｍ ３３．３μＬ；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ１０％ １０μＬ；ヘペス１Ｍ ２５μＬ；血清低ＩｇＧ５％ ５０μＬ；培地ＤＭＥＭ５８１．７μＬ）４９μＬに再懸濁した２００，０００個のヒトＲａｍｏｓ細胞とを同時に流すことにより、液滴ベースの実験を実施した。溶解緩衝液１×は、５０ｍＭ トリスＨＣｌ ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００である。Ｆｌｕｉｇｅｎｔポンプを備えたフィードバックモジュールを使用して、下記の流速が得られることを確実にする（表２）。

１００ｐＬの液滴を生成し（ＣＶは＜５％の幅）、ＨＦＥ－７５００を充填したチューブ中において氷上でエマルジョンを回収した。エマルジョンの製造が終了すると、ＨＦＥ－７５００が入ったシリンジを使用して、リザーバーのより長いチューブに取り付けた。出口に接続された針に油を充填し、このシリンジを塞いで気泡の形成を防止した。チップからチューブを直ちに切断し、プランジャーを緩やかに引き出して、チューブ中に依然として存在するエマルジョンを完全に吸引する。回収チューブ内での気泡を避ける。エマルジョン含有チューブを６０分にわたり５５℃でサーモミキサー中に置いた。ＲＴを１５分にわたり７０℃で不活性化し、次いで４℃で１分間不活性化した。ペルフルオロオクタノール（エマルジョンの体積／体積）を使用してエマルジョンを回収して破壊し、油相および水相が分離するまでインキュベートした。４℃において１０，０００ｇで１０分にわたり水相を遠心分離し、上清を回収する。３７℃で１５分にわたりＲＮアーゼＡ ２．５μＬと共にインキュベートし、３７℃で一晩プロテイナーゼＫ ４μＬと共にインキュベートすることにより、ＲＮＡおよびタンパク質を消化する。

１個の細胞当たり１００ｐＬを模倣する反応体積（２０μＬの最終反応）で、２００，０００個のヒトＲａｍｏｓ細胞（上記のようにＰＢＳで予め洗浄した）または２００，０００個のヒトＲａｍｏｓ細胞から抽出（Ｍａｃｈｅｒｙ Ｎａｇｅｌ抽出キット）したＲＮＡを混合することにより、バルク実験を実施した。この混合物を表３に示す。

混合した細胞およびＲＮＡを氷上で１０分にわたりインキュベートし、次いでＲＴを５５℃で１時間にわたり実施した。ＲＴを１５分にわたり７０℃で不活性化した。ｃＤＮＡを上記のように処理した。

全てのｃＤＮＡを、（０．８×比で）ＲＮＡＣｌｅａｎ ＸＰ Ｂｅｃｋｍａｎを使用して精製し、Ｈ₂Ｏ ２０μＬで溶出させた。ｃＤＮＡを３回希釈し、Ｒａｍｏｓ細胞中において様々なレベルで発現されることが分かっている３組のハウスキーピング遺伝子用のｑＰＣＲ反応（Ｒｏｃｈｅ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ ４８０マスターミックス）のテンプレートとして使用した。純粋なＲＮＡ条件からのＣｐ値と細胞反応からのＣｐ値とを比較し（図１Ａ）、次いでＲＴ効率を評価するために使用した（ＲＮＡ試料を１００％効率と見なした：図１Ｂ）。

まとめると、この実験は、同一の体積／細胞を模倣する液滴およびバルクをベースとする実験が、試験した３種の遺伝子に関して同等の結果を与えることを示す（図１Ａ）。次に、標準条件を使用すると、ＲＴ効率の平均は、試験した３種の遺伝子に関して約２％である（図１Ｂ）。この値は事前の報告と一致する。

ヒト遺伝子のｑＰＣＲ用のアンチセンスプライマー配列
Ｔｏｐ＿ＳＢＳ１２－ＡＴＰ５Ｇ３：
／５Ｐｈｏｓ／ＣＡＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＡＡＧＧＧＴＴＴＣ（配列番号１）
Ｔｏｐ＿ＳＢＳ１２－ＲＰＳ２９：
／５Ｐｈｏｓ／ＣＡＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＣＡＧＡＣＡＣＧＡＣＡＡＧＡＧＣＧＡ（配列番号２）
Ｔｏｐ＿ＳＢＳ１２－ＺＮＦ７８０Ａ：
／５Ｐｈｏｓ／ＣＡＡＣＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＧＡＴＣＣＡＴＧＧＡＣＣＡＴＧＴＴＧＣＴ（配列番号３）
ヒト遺伝子のｑＰＣＲ用のセンスプライマー配列
ＳＢＳ３－ＡＴＰ５Ｇ３：ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＣＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＡＣＡＧＴＡＧＧＡ（配列番号４）
ＳＢＳ３－ＲＰＳ２９：ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＴＡＣＣＴＣＧＴＴＧＣＡＣＴＧＣＴＧＡ（配列番号５）
ＳＢＳ３－ＺＮＦ７８０Ａ：ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＡＧＡＧＣＧＴＴＡＣＴＧＣＴＧＣＡＣＡ（配列番号６）

実施例２：ＲＴ効率での液滴サイズの影響
実施例１に従って試薬／体積を増加させることにより、ＲＴ効率での１個の細胞当たりの緩衝液体積の影響を評価した。Ｃｐ値を精製済みＲＮＡ条件と比較した（図２）。１００ｐＬ体積では１％ＲＴ効率が達成されており、この効率は報告されたものと比べて高く、１ｎＬ反応／細胞での＞１０％効率まで増加している。

実施例３：ＲＴ効率でのＲＴ酵素、溶解緩衝液の量の影響
サブナノリットル体積でＲＴ効率をさらに改善するために、ＲＴ濃度、溶解緩衝液およびＲＴ反応の試薬の増加の影響を評価した。本発明者らは、（供給業者により説明された通りの）標準ｃＤＮＡ合成において、精製済みＲＮＡ条件をベースとして、これらの変更のＲＴ効率への影響を比較した。

図３Ａは、液滴ベースの実験でのＲＴ濃度の増加の影響を示す。ＲＴ酵素を５倍に増加させることにより、ｃＤＮＡ合成が平均して１０倍増加した（３つの異なる遺伝子のＣｐ値に基づく）。最大の影響が低発現遺伝子に関して達成されており、これは、ＲＴ合成効率の本当の効果を立証する。

細胞のマイクロ流体封入を、ＲＴプライマーおよびＲＴ混合物と一緒に実施例１で説明したように実施した。混合物（溶解緩衝液４× ５０μＬ；ＲＴ緩衝液５× １７，６μＬ；Ｈ₂Ｏ ２２．４μＬ；ポリｄＴオリゴ １００μＭ ２μＬ；プロテアーゼ阻害剤４μＬ；ＤＹ－６４７ １００μＭ ４μＬ）を含む溶解緩衝液と、ＲＴ混合物緩衝液（一本鎖反応緩衝液５× ２２．５μＬ；０．１Ｍ ＤＴＴ １０μＬ；１０ｍＭ各ｄＮＴＰ １０μＬ；ＲＮアーゼ阻害剤２．５μＬ；Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ酵素２．５μＬ；ＤＹ－６４７ １００μＭ溶液２．５μＬ）と、ＰＢＳで予め洗浄し、ペレット化し、かつＤＹ－６４７ １００μＭ溶液１μＬ＋細胞懸濁溶液（Ｐｅｒｃｏｌｌ ３００μＬ；ＮａＣｌ １．５Ｍ ３３．３μＬ；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ１０％ １０μＬ；ヘペス１Ｍ ２５μＬ；血清低ＩｇＧ５％ ５０μＬ；培地ＤＭＥＭ５８１．７μＬ）４９μＬに再懸濁した２００，０００個のヒトＲａｍｏｓ細胞とを同時に流すことにより、液滴ベースの実験を実施した。溶解緩衝液１×は、５０ｍＭトリスＨＣｌ ｐＨ７．５、７５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．２％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１００である。

ＲＴ酵素の濃度が上記の実施例と比べて５×高いエマルジョンでは、本発明者らは、混合物（溶解緩衝液４× ５０μＬ；ＲＴ緩衝液５× ２７．６μＬ；Ｈ２Ｏ １２．４μＬ；ポリｄＴオリゴ１００μＭ ２μＬ；プロテアーゼ阻害剤４μＬ；ＤＹ－６４７ １００μＭ ４μＬ）を含む溶解緩衝液と、ＲＴ混合物緩衝液（一本鎖反応緩衝液５× １２．５μＬ；０．１Ｍ ＤＴＴ １０μＬ；１０ｍＭ各ｄＮＴＰ １０μＬ；ＲＮアーゼ阻害剤２．５μＬ；Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ酵素１２．５μＬ；ＤＹ－６４７ １００μＭ溶液２．５μＬ）とを同時に流し、次いで上記のようにかつ実施例１のように細胞を封入した。ｃＤＮＡ精製およびｑＰＣＲを実施例１のように実行した。図３Ｂは、効率的なｃＤＮＡ合成への溶解緩衝液の影響を示す。ＭｇＣｌ₂（効率的なＲＴ酵素活性に必須である）を補完した低張溶解緩衝液を低張水溶液と比較した。ＭｇＣｌ₂を補完した低張溶解緩衝液は、１個の細胞当たりサブナノリットル反応体積での効率的なｃＤＮＡ合成に必須である。実施例１で説明したように、溶解条件の影響を、バルク反応においてかつ１個の細胞当たり１００ｐＬを模倣する体積で細胞から始めて分析した。１個の細胞当たり１００ｐＬを模倣する反応体積（２０μＬの最終反応）で、２００，０００個のヒトＲａｍｏｓ細胞（実施例１のようにＰＢＳで予め洗浄した）を混合することにより、バルク実験を実施した。この混合物を下記の表４で説明する。

逆転写酵素（ＲＴ）反応混合物中の細胞を最初に氷上で１０分にわたりインキュベートして、細胞を溶解させた。次いで、この反応物を（７５０ｒｐｍで振盪しつつ）５５℃において１時間にわたりインキュベートすることにより、ＲＴを始動させた。ＲＴ酵素を１５分にわたり７０℃で不活性化させた。ＲＴ反応物を１０，０００ｇ ４℃で１０分にわたり遠心分離することにより、細胞破片をペレット化した。懸濁液中のｃＤＮＡを上清で回収し、（７５０ｒｐｍで振盪しつつ）３７℃において１５分にわたりＲＮアーゼＡ ２．５μＬにより、および（７５０ｒｐｍで振盪しつつ）３７℃においてＯＮにわたりプロテイナーゼＫ ４μＬにより、順次処理した。０．８×ビーズ／溶液比でＲＮＡクリーンビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用してｃＤＮＡを精製し、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼフリー水２０μＬで溶出させた。精製済みｃＤＮＡを使用して、ｑＰＣＲによりｃＤＮＡ合成効率を評価した。

図３Ｃは、ｃＤＮＡ合成の効率におけるＲＴ量／溶解条件の変化の影響を再現する。全体的なＲＴ効率が約４０倍改善された（１．２％から４９％超へ；精製済みＲＮＡを１００％に設定した）。

図３Ｄは、ＲＴ効率における液滴体積の増加ならびにＲＴ条件の変化（ＲＴ酵素およびＲＮアーゼ阻害剤の増加量ならびに溶解緩衝液の変化）の両方のさらなる影響を示す。実施例５で説明するように、マウスハイブリドーマ細胞を１００ｐＬまたは５００ｐＬのいずれかの液滴に封入して、並行液滴ベースの単一細胞ＲＮＡｓｅｑ実験を実施した。捕捉されたＡＴＰ５Ｇ３ハウスキーピング遺伝子にバーコードが付与されたｃＤＮＡのＲＴ効率分析は、１００ｐＬと比較して、５００ｐＬの液滴ベースのＲＮＡｓｅｑが、生成されたｃＤＮＡの量の２倍の増加を示した。この結果は、他の遺伝子に関してヒト細胞によりおよびマウスハイブリドーマ系において一貫して繰り返されている。

マウスＡＴＰ５Ｇ３遺伝子のｑＰＣＲ用のアンチセンスプライマー配列
／５Ｐｈｏｓ／ＣＡＡＣ ＴＧＣＡＡＣＴＣＴＧＧＡＴＣＣＡＧＣＴＣ（配列番号７）
マウスＡＴＰ５Ｇ３遺伝子のｑＰＣＲ用のセンスプライマー配列
ＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴＴＣＧＣＣＴＧＴＣＡＣＣＴＡＧＡＴＣＣＡ（配列番号８）

精製済みＲＮＡ条件と比較して１００％のＲＴ効率に達するために、ＲＴ反応条件をさらに最適化した（細胞の封入の最中のＰｅｒｃｏｌｌの除去、広域スペクトルＲＮアーゼ阻害剤の選択、ｃＤＮＡの回収および精製の最適化）。免疫グロブリンを発現するマウスハイブリドーマ細胞を５００ｐＬの液滴に封入し、この液滴中で液滴ベースの単一細胞ＶＨ／ＶＬ ｍＲＮＡの捕捉およびｃＤＮＡ合成を実施した。並行して、同一の細胞集団からＲＮＡを抽出して精製し、ＶＨおよびＶＬのｍＲＮＡの逆転写を、供給業者の推奨で説明されているように、チューブベースのアッセイ（ｔｕｂｅ ｂａｓｅｄ ａｓｓａｙ）で実施した。リアルタイム定量ＰＣＲによりＶＨ／ＶＬ ｃＤＮＡ合成効率を評価した。図３Ｅは、精製済みＲＮＡと比較した液滴ベースのアプローチのＲＴ効率の％を示し、この％は、軽鎖免疫グロブリン可変遺伝子の場合には１００％超であり、重鎖免疫グロブリン可変遺伝子の場合には約３０％である。ＶＨの場合のより低い値は、バーコードが付与された試料へのより低いＰＣＲ効率に起因する可能性がある。

細胞を細胞洗浄緩衝液（ＣＷＢ；ＤＭＥＭ Ｆ１２培地、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、２５ｍＭヘペス、５％低ＩｇＧ血清）で洗浄し、１００μＭ ＤＹ－６４７溶液２．６μＬを含むＣＷＢ緩衝液４７．４μＬ中においてマイクロ流体設計で同時に流した。単一細胞のバーコードならびに液滴中でのＶＨおよびＶＬのｍＲＮＡの捕捉およびｃＤＮＡ合成のためのプライマーを担持するヒドロゲルビーズライブラリを１×ＢＷ緩衝液で１０回洗浄し、４℃において２分にわたり２５００ｇで回転させた。二本鎖バーコードを２分にわたり２２℃において変性溶液（Ｈ₂Ｏ ７００μＬ＋１Ｍ ＮａＯＨ ３００μＬ）１ｍＬ中で変性させた。このビーズをＢＷ緩衝液で３回洗浄し、ＦＩＴＣビオチン１００μＭ １０μＬで標識し、１０分にわたり回転台上で室温においてインキュベートした。ＢＷ緩衝液での３回の洗浄後、このビーズを７０℃で２分にわたり加熱し、上清を除去した。最後に、このビーズを溶解／Ｐｉ／ＤＴＴ／色素含有緩衝液（溶解緩衝液１０× ８０μＬ；プロテアーゼ阻害剤８μＬ、Ｄｙｅ ６４７ １００μＭ ８μＬおよび１Ｍ ＤＴＴ ４μＬ）２００μＬで洗浄した。このビーズを４℃において２分にわたり２５００ｇで回転させ、上清を除去して緩衝液／ＨｇＢ混合物５０μＬを残した。

溶解緩衝液中に単一細胞のバーコードおよびプライマーを担持するヒドロゲルビーズと、ＲＴ混合物緩衝液（一本鎖反応緩衝液５× ５２μＬ；０．１Ｍ ＤＴＴ １０μＬ；１０ｍＭ各ｄＮＴＰ １３μＬ；ＳＵＰＥＲｉｎ ＲＮアーゼ阻害剤１６．２５μＬ；Ｓｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔ ＩＩＩ ＲＴ酵素１６．２５μＬ；ＤＹ－６４７ １００μＭ溶液２．５μＬ）と、１５，０００個のマウスハイブリドーマ細胞とを同時に流すことにより、液滴ベースの実験を実施した。

ＲＴプライマーおよびＲＴ混合物との細胞の封入を表５に示すように実施した。

実施例４：ハイブリドーマ混合物
サブナノリットルの液滴中でのＶＨ／ＶＬ遺伝子の対形成の正確さを評価するために、既知の抗体配列を発現するマウスハイブリドーマ細胞株を等しい割合で混合した。これらの細胞をＰＢＳで洗浄し、細胞懸濁緩衝液（Ｐｅｒｃｏｌｌ３００μＬ；ＮａＣｌ １．５Ｍ ３３．３μＬ；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ１０％ １０μＬ；ヘペス１Ｍ ２５μＬ；血清低ＩｇＧ５％ ５０μＬ；培地ＤＭＥＭ５８１．７μＬ）４７．５μＬおよび１００μＭ ＤＹ－６４７ ２．５μＬに再懸濁させた。

細胞を、単一細胞のバーコードならびに液滴中でのＶＨおよびＶＬのｍＲＮＡの捕捉ならびにｃＤＮＡ合成のためのプライマーを担持するヒドロゲルビーズライブラリと同時に封入した。

ＲＴプライマー配列：
ＶＨ＿１：ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧ（配列番号９）
ＶＨ＿２：ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＧＣ（配列番号１０）
ＶＨ＿３：ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧ（配列番号１１）
ＶＨ＿４：ＧＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＧ（配列番号１２）
ＶＬｋ＿１：ＧＣＧＴＴＴＣＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧ（配列番号１３）
ＶＬｋ＿２：ＧＣＧＴＴＴＧＡＴＴＴＣＣＡＧＣＴＴＧＧ（配列番号１４）
ＶＬｋ＿３：ＧＣＧＴＴＴＴＡＴＴＴＣＣＡＡＴＴＴＴＧ（配列番号１５）

ヒドロゲルビーズを１×ＢＷ緩衝液で１０回洗浄し、４℃において２分にわたり２５００ｇで回転させた。二本鎖バーコードを２分にわたり２２℃において変性溶液（Ｈ₂Ｏ ７００μＬ＋１Ｍ ＮａＯＨ ３００μＬ）１ｍＬ中で変性させた。このビーズをＢＷ緩衝液で３回洗浄し、ＦＩＴＣビオチン２０μＭ １０μＬで標識し、１時間にわたり回転台上で室温においてインキュベートした。４×溶解緩衝液（０．８％ ＴｒｉｔｏｎＸ１００、１２ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２００ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４）での３回の洗浄後、このビーズを７０℃で２分にわたり加熱し、上清を除去した。このビーズを溶解緩衝液４× ５０μＬ、５×一本鎖ＲＴ緩衝液２７．６μＬ、プロテアーゼ阻害剤４μＬ、ＤＹ－６４７ １００μＭ ４μＬ、Ｈ₂Ｏ ４．４μＬおよび０．１Ｍ ＤＴＴ １０μＬに可溶化した。

ビーズおよび細胞を、表６で説明するＲＴ混合物と同時に流した。

Ｆｌｕｉｇｅｎｔポンプを備えたフィードバックモジュールを使用して、表７に示す下記の流速が得られたことを確実にする。

１００～１１０ｐＬの液滴を確実に生成する。エマルジョンを生成すると、オリゴ光開裂が２００ｍＷ／ｃｍ²で３０秒にわたり進行した。このエマルジョンを６０分にわたり５５℃でインキュベートし、ＲＴを１５分にわたり７０℃で不活性化した。チューブを４℃で１分にわたり冷却した。このエマルジョンを、シリンジプランジャーを押すことにより新たな１．５ｍＬ ＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブに移し、３０秒間ボルテックスしてビーズからのオリゴ拡散を可能にした。このエマルジョンを効率的に破壊してｃＤＮＡを回収するために、シリンジで、液滴を少しも取ることなく可能な限り多くの油を除去した。パーフルオロオクタノール（エマルジョンの体積／体積）を添加し、時に優しくボルテックス（５秒）しつつおよび優しく回転させつつ（５秒）、室温で５～１０分にわたり混合して相を分離した。

２回目の光開裂が２００ｍＷ／ｃｍ²で６０秒にわたり進行した。このエマルジョンを３０秒にわたりボルテックスし、室温で５分にわたりインキュベートしてビーズからのオリゴ拡散を可能にした。

油相をシリンジで除去した。このエマルジョンを３０秒間ボルテックスし、室温で５分にわたりインキュベートしてビーズからのオリゴ拡散を可能にした。ｃＤＮＡを、ＲＮアーゼＡ ２．５μＬでエッペンドルフに処理し、３７℃で１５分にわたりＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリーＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブに入れた。このｃＤＮＡ溶液をプロテイナーゼＫ ４μＬで処理し、５０℃で１時間にわたりまたは３７℃で一晩にわたり１．５ｍＬのＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリーＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブに入れた。

ｃＤＮＡおよびヒドロゲルビーズを含む水相を３０μＭフィルタ（Ｐｉｅｒｃｅスピンカラム）にアプライし、Ｈ₂Ｏで洗浄した。ろ過したｃＤＮＡの２５％を１×比のＲＮＡ Ｃｌｅａｎ ＵＰビーズを使用して精製し、ＤＮアーゼおよびＲＮアーゼフリー水４０μＬに溶出させた。ＶＨ／ＶＬ ＰＣＲ反応を下記のように実施した。

表８Ａおよび表８Ｂで説明されているように、４^*１０μＬの精製済みｃＤＮＡを使用してＰＣＲ１を実施した。

このＰＣＲを、１×の比でＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを使用して精製し、水２０μＬで溶出させた。このＰＣＲの１０％を２％アガロースゲルに流した。精製済みＰＣＲ１の５０％を表９および表９Ｂで下記に示すようにＰＣＲ２にかけた。

このＰＣＲを、１×の比でＡＭＰｕｒｅ ＸＰビーズを使用して精製し、水２０μＬで溶出させた。このＰＣＲの１０％を２％アガロースゲルに流した。このゲルを切断し、バンドを秤量した。バンドを、Ｇｅｌ Ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎキット（ＱＩＡＧＥＮ（商標））を使用して精製し、水１０μＬで溶出させた。

ＰＣＲプライマーセット
１回目のＰＣＲ反応
Ｔ７アンチセンスＰＣＲ１プライマー配列
ＧＡＡＴＴＴＡＡＴＡＣＧＡＣＴＣＡＣＴＡＴＡＧＧＧＡＧＡ（配列番号１６）

２回目のネステッドＰＣＲ反応
イルミナインデックスアンチセンスプライマー
ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴインデックスＧＴＧＡＣＴＧＧＡＧＴＴＣＡＧＡＣＧＴＧＴＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号１０３）

増幅されて品質管理されたＶＨおよびＶＬ配列決定ライブラリを多重化させ（それぞれ５０％）、２^*３００ ＰＥ読み取りを使用してＭｉＳｅｑで配列決定した。

図４Ａは、バーコードが付与された単一細胞ＶＨ／ＶＬのネステッドＰＣＲ増幅を示す。

図４Ｂは、ＶＨおよびＶＬの読み取り数に基づいてプロットされた同一バーコード（同一細胞に由来する）を共有する対の配列読み取りを示す。

図４Ｃは、各鎖の読み取り閾値の関数として正確なハイブリドーマＶＬ／ＶＨ対形成率を示す。

図４Ｄは、（両方の鎖の）読み取り閾値の関数としてハイブリドーマ対の対形成率の数を示す。

実施例５：ハイブリドーマの希釈
サブナノリットルの液滴でのＶＨ／ＶＬ遺伝子の捕捉効率を評価するために、既知の抗体配列を発現する３種のマウスハイブリドーマ細胞株を６０％－３０％－１０％の割合で混合した。合計で１０，０００個の細胞（および２４０，０００個のヒト非Ｉｇ発現細胞）をＰＢＳで洗浄し、細胞懸濁緩衝液（Ｐｅｒｃｏｌｌ３００μＬ；ＮａＣｌ １．５Ｍ ３３．３μＬ；Ｐｌｕｒｏｎｉｃ１０％ １０μＬ；ヘペス１Ｍ ２５μＬ；血清低ＩｇＧ５％ ５０μＬ；培地ＤＭＥＭ５８１．７μＬ）９７．４μＬおよび１００μＭ ＤＹ－６４７ ２．６μＬに再懸濁させた。

細胞を、単一細胞のバーコードならびに液滴中でのＶＨおよびＶＬのｍＲＮＡの捕捉ならびにｃＤＮＡ合成のためのプライマーを担持するヒドロゲルビーズライブラリと同時に封入した。

ＲＴプライマー配列：
ＶＨ＿１：ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＡＧＡＴＧＧＧＧＧ（配列番号９）
ＶＨ＿２：ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＣＧＡＴＧＧＧＧＣ（配列番号１０）
ＶＨ＿３：ＧＧＣＣＡＧＴＧＧＡＴＡＧＡＣＴＧＡＴＧＧＧＧＧ（配列番号１１）
ＶＨ＿４：ＧＴＣＡＣＣＧＣＡＧＣＣＡＧＧＧＡＣＣＡＡＧＧＧ（配列番号１２）
ＲＴ＿ＶＬｋ：ＧＡＴＧＧＴＧＧＧＡＡＧＡＴＧＧＡＴＡＣ（配列番号１２５）

ヒドロゲルビーズを１×ＢＷ緩衝液で１０回洗浄し、４℃において２分にわたり２５００ｇで回転させた。二本鎖バーコードを２分にわたり２２℃において変性溶液（Ｈ₂Ｏ ７００μＬ＋１Ｍ ＮａＯＨ ３００μＬ）１ｍＬ中で変性させた。このビーズをＢＷ緩衝液で３回洗浄し、ＦＩＴＣビオチン２０μＭ １０μＬで標識し、１０分にわたり回転台上で室温においてインキュベートした。ＢＷ緩衝液での３回の洗浄後、このビーズを７０℃で２分にわたり加熱し、上清を除去した。このビーズを溶解^*緩衝液（１０×溶解緩衝液｛２％Ｔｒｉｔｏｎ、３０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、５００ｍＭ トリス－ＨＣｌ ｐＨ７．４｝８０μＬ、プロテアーゼ阻害剤８μＬ、ＤＹ－６４７ ８μＬ、ＤＴＴ １Ｍ ４μＬ）２００μＬで洗浄した。このビーズを溶解^*緩衝液５０μＬ中で維持した。

ＲＴ混合物を表１４に示すように調製した。

Ｆｌｕｉｇｅｎｔポンプを備えたフィードバックモジュールを使用して、表１４に示す流速を用いて細胞、ヒドロゲルビーズおよびＲＴ混合物を５００ｐＬの液滴に同時に封入した。

ＲＴ反応、エマルジョンの破壊、ヒドロゲルビーズを含む水相およびｃＤＮＡを実施例４で説明したように回収／処理した。

回収したｃＤＮＡの半分を、１×ビーズ／水相体積でＲＮＡＣｌｅａｎ Ｂｅｃｋｍａｎビーズを使用して連続して２回精製した。表１５Ａおよび表１６Ｂで説明するように、溶出したｃＤＮＡをＰＣＲ（実施例４で列挙したＰＣＲプライマー）によるＶＨ／ＶＬの増幅に使用した。

ＶＨおよびＶＬのＰＣＲ１産物を、それぞれ０．８×比および１×比でＡＭＰｕｒｅ Ｂｅｃｋｍａｎビーズを使用して２回精製した。表１７Ａおよび表１７Ｂに示すようにＰＣＲ１産物の半分をＰＣＲ２反応に使用した。

増幅産物をアガロースゲルでサイズ選択し、ゲル精製し、品質管理し、かつＭｉＳｅｑ ２^*３００ ＰＥ読み取りで配列決定した。

図５Ａは、液滴体積（１００ｐＬまたは５００ｐＬ）およびｃＤＮＡ精製法（１回の溶出対２回の溶出（１．１または１．２と命名し、２回の精製（２．１と称する）と比較する））によって決まる、バーコードが付与された単一細胞ＶＨ／ＶＬのネステッドＰＣＲ増幅を示す。

図５Ｂは、５００ｐＬの液滴および改善されたｃＤＮＡ精製（２回の精製）での、ＶＨおよびＶＬの読み取り数に基づいてプロットした同一バーコード（同一細胞に由来する）を共有する対の配列読み取りを示す。

図５Ｃは、５００ｐＬの液滴および改善されたｃＤＮＡ精製（２回の精製）での、（両方の鎖の）読み取り閾値の関数としてハイブリドーマ対の対形成率の数を示す。

図５Ｄは、（両方の鎖の）読み取り閾値、液滴体積（１００ｐＬまたは５００ｐＬ）およびｃＤＮＡ精製法（１回の溶出対２回の溶出（１．１または１．２と命名し、２回の精製（２．１と称する）と比較する））の関数としてハイブリドーマ対の対形成率の正確な対形成率を示す。

図５Ｆは、液滴体積（１００ｐＬまたは５００ｐＬ）およびｃＤＮＡ精製法（１回の溶出対２回の溶出（１．１または１．２と命名し、２回の精製（２．１と称する）と比較する））によって決まる、１本の鎖当たり１０回の読み取りの閾値での回収したハイブリドーマ対分布を示す。ｃＤＮＡ精製が改善された（２回の精製）５００ｐＬの液滴体積により、最初の６０％－３０％－１０％のハイブリドーマ比がもたらされる。

実施例６：マウス一次Ｂ細胞のスクリーニング
破傷風トキソイド特異的抗体を分泌する一次マウス脾臓Ｂ細胞を選別し、細胞洗浄緩衝液（ＤＭＥＭ／Ｆ１２細胞培養培地９１５μＬ；血清低ＩｇＧ ５０μＬ；ヘペス１Ｍ ２５μＬ；ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８ １０％ １０μＬ）５００μＬで２回洗浄した。最後に、ＣＷＢ ９７．４μＬおよびＤＹ－６４７ ２．６μＬに再懸濁した。

ヒドロゲルビーズを担持する単一細胞を実施例５のように調製した。

細胞、ヒドロゲルビーズおよびＲＴ混合物の５００ｐＬの液滴への同時封入を実施例５で説明したように実施した。エマルジョンを実施例５で説明したように破壊した。

ヒドロゲルビーズおよびｃＤＮＡを含む水相を２つの等体積に分割した。この水相の半分を（３７℃で１５分にわたり）ＲＮアーゼＡ １μＬおよび（３７℃で一晩）プロテイナーゼＫ ４μＬで処理し、次いでこの物質の半分を精製した。この水相の半分を４℃において１０分にわたり１０，０００ｇで遠心分離した。回収した上清を上記のように処理し、次いでこの物質の半分を精製した。

ｃＤＮＡを、１×ビーズ：水相体積比を使用してＲＮＡＣｌｅａｎビーズで２回精製し、表１８Ａおよび表１８Ｂに示すように１回目のＶＨ／ＶＬ ＰＣＲ増幅に使用した。

ＶＨおよびＶＬの増幅産物をそれぞれ０．８×および１×のＡＭＰｕｒｅビーズ比で２回精製した。図１８Ａおよび図１８Ｂに示すように、精製した物質の半分を２回目のネステッドＰＣＲ反応に使用した。

次いで、ＶＨ／ＶＬ増幅産物を、ＰＣＲ精製キット（ＱＩＡＧＥＮ）を使用して精製した。１０分の１を３回目のＰＣＲ反応に使用し、表１９Ａおよび表１９Ｂに示すように実施した。

増幅産物をアガロースゲルでサイズ選択し、ゲル精製し、品質管理し、かつＭｉＳｅｑ ２^*３００ ＰＥ読み取りで配列決定した。遠心分離したｃＤＮＡ配列決定ライブラリの情報と遠心分離していないｃＤＮＡ配列決定ライブラリの情報とを組み合わせることにより、分析を行った。

１回目および２回目のＰＣＲ反応で使用したセンスＶＨ ＰＣＲプライマーおよびセンスＶＬ ＰＣＲプライマーは、文献（Ｒｏｈａｔｇｉ，ｅｔ ａｌ．，２００８ Ｄｅｃ ３１；３３９（２）：２０５－１９）で説明されているものであった。

ＰＣＲ１およびＰＣＲ２に使用したアンチセンスプライマーは、実施例４で説明した通りであった。

ＰＣＲ３で使用したセンスプライマー：
ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＴＣＴＡＣＡＣＴＣＴＴＴＣＣＣＴＡＣＡＣＧＡＣＧＣＴＣＴＴＣＣＧＡＴＣＴ（配列番号１２６）。

ＰＣＲ３で使用したアンチセンスプライマー：ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧＡＴ（配列番号１２７）。

図６Ａは、（ＶＨ鎖およびＶＬ鎖の両方の）読み取り閾値の関数として一次Ｂ細胞のＶＨ／ＶＬ対形成の数を示す。

図６Ｂは、１本の鎖当たりの読み取り閾値に基づいて、重鎖および軽鎖の異なる相補性決定領域（ＣＤＲ）の数を示す。

図６Ｃは、ＶＨおよびＶＬの読み取りの数に基づいてプロットした同一バーコード（同一細胞に由来する）を共有する対の配列読み取りを示す。

図６Ｄは、（１本の鎖当たり４０回の読み取りの閾値での）対の配列における重可変遺伝子の使用を示す。

図６Ｅは、（１本の鎖当たり４０回の読み取りの閾値での）対の配列におけるカッパ可変遺伝子の使用を示す。

図６Ｆは、（１本の鎖当たり４０回の読み取りの閾値での）対の配列における重Ｊ遺伝子ファミリーの使用を示す。

図６Ｇは、（１本の鎖当たり４０回の読み取りの閾値での）対の配列におけるカッパＪ遺伝子ファミリーの使用を示す。

実施例７：遺伝子特異的プライマー濃度の影響の評価
ＲＴ反応における遺伝子特異的プライマー濃度の影響を、細胞から始まるマウス抗体のＶＨおよびＶＬに関するバルク反応で評価している（図７を参照されたい）。このバルク反応は、液滴条件（特に１個の細胞当たりの反応緩衝液の体積、１個の細胞当たりの試薬の量）を模倣することを目的としていた。

従って、４００００個のマウス９Ｅ１０ハイブリドーマ細胞（細胞洗浄緩衝液（ＤＭＥＭ Ｆ１２培地、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、２５ｍＭヘペス、５％低ＩｇＧ血清）で予め洗浄した）を、１個の細胞当たり５００ｐＬ（２０μＬの最終反応）を模倣する反応体積で使用した。この混合物は下記の表２１で示す通りであった。

次いで、ＶＨ遺伝子およびＶＬ遺伝子に特異的なプライマーの様々な量を、表２２に示す濃度で添加した。

ペレット化した細胞を氷上で１０分にわたりインキュベートして混合物にし、溶解を生じさせた。この混合物を５５℃で１時間にわたりインキュベートし、５５０ｒｐｍで混合した。次いで、ＲＴを５５０ｒｐｍで１５分にわたり７０℃において不活性化した。次いで、ｃＤＮＡをＲＮアーゼＡおよびＰＫで処理して、微量のＰＣＲ阻害剤を除去した。本発明者らは、Ｈ₂Ｏ ｑｓｐ ９５μＬを添加し、ＲＮＡアーゼＡ（１０ｍｇ／ｍＬストック濃度、１００ｕｇ／μＬ最終濃度）１μＬを添加し、３７℃で１５分にわたりＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリーＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブに入れた。次いで、本発明者らは、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬストック濃度、０．８ｍｇ／ｍＬ最終濃度）４μＬを添加し、このチューブを５０℃で１時間にわたり置いた。本発明者らは、７０℃で１５分にわたりＰＫを不活性化した。次いで、ｃＤＮＡを、１×比（１体積のビーズ溶液対１体積のｃＤＮＡ）でＲＮＡＣＬｅａｎｕｐビーズを使用して精製し、続いてＢｅｃｋｍａｎ ＲＮＡ ＣｌｅａｎｕｐビーズＳＯＰを使用して精製した。本発明者らは、２分にわたりＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリーＨ₂Ｏ ４０μＬでｃＤＮＡを溶出させ、溶出したｃＤＮＡを回収した。本発明者らは、Ｈ₂Ｏ ４０μＬでビーズを２回溶出させた。これら２回の溶出をプールし、本発明者らは、Ｈ₂Ｏ ４０μＬで１回の溶出のみを行うことを除いて前と全く同じように１×ＲＮＡＣｌｅａｎｕｐビーズ（Ｂｅｃｋｍａｎ）を使用して２回目の精製工程を始める。条件毎に生成されたｃＤＮＡの量を、多重ｑＰＣＲ反応に基づく絶対的定量（ａｂｓｏｌｕｔｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ｑＰＣＲを使用して測定した。

遺伝子特異的プライマー濃度の影響を、細胞から始まるヒト抗体のＶＨおよびＶＬに関する液滴でのＲＴ反応で評価した（図８Ａおよび図８Ｂを参照されたい）。ＰＢＭＣから精製され、かつ５日にわたり活性化された健康なヒトドナー由来の５０００個のヒト活性化スイッチドメモリ（ｓｗｉｔｃｈｅｄ ｍｅｍｏｒｙ）Ｂ細胞を、重／軽＿カッパ／軽＿ラムダ鎖を捕捉するための各遺伝子特異的プライマーの１００ｎＭまたは１０ｎＭのいずれかを含む５００ｐＬの液滴に封入した。各試薬（細胞、溶解およびＲＴの試薬）をマイクロ流体チップ中で同時に流して５００ｐＬの液滴を生成した。溶解／Ｐｉ／ＤＴＴ／色素含有溶液を下記の表２３で示すように調製した。

この混合物５０μＬを封入に使用し、チップへの吸引まで氷上に置いた。２．６×ＲＴ混合調製物を表２４で示すように調製した。

細胞を洗浄し、下記の試薬を含む細胞懸濁緩衝液（ＣＳＢ）に再懸濁した。
ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８ １０％ １０μｌ
ヘペス１Ｍ ２５μｌ
血清低ＩｇＧ ５０μｌ
培地ＤＭＥＭ／Ｆ１２ ９１５μｌ

生成した液滴を氷上で回収し、溶解を生じさせた。エマルジョンを５５℃で１時間にわたりインキュベートし、５５０ｒｐｍで混合した。次いで、ＲＴを５５０ｒｐｍで１５分にわたり７０℃において不活性化した。次いで、ｃＤＮＡをＲＮアーゼＡおよびＰＫで処理して、微量のＰＣＲ阻害剤を除去した。Ｈ₂Ｏ ｑｓｐ ９５μＬを添加し、ＲＮＡアーゼＡ（１０ｍｇ／ｍＬストック濃度、１００μｇ／μＬ最終濃度）１μＬを添加し、３７℃で１５分にわたりＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリーＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブに入れた。次いで、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬストック濃度、０．８ｍｇ／ｍＬ最終濃度）４μＬを添加し、このチューブを５０℃で１時間にわたり置いた。７０℃で１５分にわたりＰＫを不活性化した。次いで、ｃＤＮＡを、０．８×比（１体積のビーズ溶液対１体積のｃＤＮＡ）でＲＮＡＣＬｅａｎｕｐビーズを使用して精製し、続いてＢｅｃｋｍａｎ ＲＮＡ ＣｌｅａｎｕｐビーズＳＯＰを使用して精製した。２分にわたりＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリーＨ₂Ｏ ４０μＬでｃＤＮＡを溶出させ、溶出したｃＤＮＡを回収した。

条件毎に生成されたｃＤＮＡの量を、多重ｑＰＣＲ反応に基づく絶対的定量ｑＰＣＲを使用して測定した。

ＲＴ反応における遺伝子特異的プライマー濃度の影響を、細胞から始まる非抗体遺伝子に関するバルク反応で評価した（図９を参照されたい）。本発明者らは、液滴条件（特に１個の細胞当たりの反応緩衝液の体積、１個の細胞当たりの試薬の量）を模倣することを目的とした。

本発明者らは、１個の細胞当たり５００ｐＬを模倣する反応体積（２０μＬ最終反応）で、４００００個のヒトＪｕｒｋａｔ細胞（細胞洗浄緩衝液（ＤＭＥＭ Ｆ１２培地、０．１％Ｐｌｕｒｏｎｉｃ、２５ｍＭヘペス、５％低ＩｇＧ血清）で予め洗浄した）を使用した。この混合物は表２５で示した通りであった。

ペレット化した細胞を氷上で１０分にわたりインキュベートして混合物にし、溶解を生じさせた。この混合物を５５℃で１時間にわたりインキュベートし、５５０ｒｐｍで混合した。次いで、ＲＴを５５０ｒｐｍで１５分にわたり７０℃において不活性化した。次いで、ｃＤＮＡをＲＮＡｓｅｑ ＡおよびＰＫで処理して、微量のＰＣＲ阻害剤を除去した。Ｈ₂Ｏ ｑｓｐ ９５ｕＬμＬを添加し、ＲＮＡアーゼＡ（１０ｍｇ／ｍＬストック濃度、１００ｕｇ／ｕＬμμ最終濃度）１μＬを添加し、３７℃で１５分にわたりＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリーＤＮＡ ＬｏＢｉｎｄチューブに入れた。次いで、プロテイナーゼＫ（２０ｍｇ／ｍＬストック濃度、０．８ｍｇ／ｍＬ最終濃度）４μＬを添加し、このチューブを５０℃で１時間にわたり置いた。７０℃で１５分にわたりＰＫを不活性化した。次いで、ｃＤＮＡを、１×比（１体積のビーズ溶液対１体積のｃＤＮＡ）でＲＮＡＣＬｅａｎｕｐビーズを使用して精製し、続いてＢｅｃｋｍａｎ ＲＮＡ ＣｌｅａｎｕｐビーズＳＯＰを使用して精製した。２分にわたりＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリーＨ₂Ｏ ４０μＬでｃＤＮＡを溶出させ、溶出したｃＤＮＡを回収した。Ｈ₂Ｏ ４０μＬでビーズを２回溶出させた。これら２回の溶出を一緒にプールした。条件毎に生成されたｃＤＮＡの量を、一重ｑＰＣＲ反応に基づく相対的定量（ｒｅｌａｔｉｖｅ ｑｕａｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ）ｑＰＣＲを使用して測定した。

実施例８：ＲＴ反応におけるポリｄＴプライマー濃度の影響の評価
細胞から始まるヒト全トランスクリプトーム捕捉のためのＲＴ反応におけるポリｄＴプライマー濃度の影響の評価を液滴反応で実施している。９５％のヒトＢ細胞Ｒａｍｏｓ細胞と５％のヒトＴ細胞Ｌｅｕｋｅｍｉａ Ｊｕｒｋａｔ細胞とで構成された２０，０００個の細胞の混合物を溶解緩衝液、ＲＴ試薬、および３．３ｕＭまたは１００ｎＭまたは３３ｎＭのいずれかのポリｄＴプリマーと共に５００ｐＬの液滴に封入した。全ての試薬をマイクロ流体チップ中で同時に流して５００ｐＬの液滴を生成した。

ＲＴ試薬を含む混合物を下記の表２６で示すように調製した。

次いで、ポリｄＴ ＲＴプライマーを表２７で示すように様々な濃度で添加した。

細胞を、表２８に示す濃度を含む混合物に再懸濁した。

最終混合物は、表２９に示す成分および濃度で構成されている。

生成した液滴を氷上で回収し、溶解を生じさせた。エマルジョンを５０℃で２時間にわたりインキュベートし、次いでＲＴを１５分にわたり７０℃で不活性化した。次いで、エマルジョンを氷で冷却し、８０％（体積／体積）のＨＦＥ－７５００および２０％（体積／体積）のパーフルオロオクタノールで構成された溶液１体積を添加して液滴を破壊した。次いで、ｃＤＮＡを４℃において１４，０００ｇで１５分間遠心分離し、上清を回収した。過剰のプライマーおよびプライマー二量体を消化するために、ｃＤＮＡを３７℃で３０分にわたりＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ（ＮＥＢ、参照＃Ｍ０２９３；２０，０００ユニット／ｍｌ）１μＬ、Ｈｉｎｆ１（ＮＥＢ、＃Ｒ０１５５；１０，０００ユニット／ｍｌ）１μＬと共にインキュベートした。８０℃で１０分にわたりＥｘｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｉ酵素およびＨｉｎｆ１酵素を不活性化した。次いで、ｃＤＮＡを、Ｂｅｃｋｍａｎ Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＳＯＰを使用して精製した後、１．２×比（１．２体積のビーズ対１体積のｃＤＮＡ）でＡｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅビーズを使用して精製した。ｃＤＮＡを２分にわたりＤＮアーゼ／ＲＮアーゼフリー水１７μＬで溶出させ、溶出したｃＤＮＡを回収した。条件毎に生成されたｃＤＮＡの量を、一重ｑＰＣＲ反応に基づく相対的定量ｑＰＣＲを使用して測定した。

実施例９：遺伝子特異的逆転写への遺伝子特異的プライマー濃度の影響
マウス免疫グロブリンの可変重鎖（ＶＨ）および可変軽鎖（ＶＬ）の逆転写の捕捉効率（１ｕＭの各遺伝子特異的プライマーに対して正規化されている）。９Ｅ１０個のハイブリドーマ細胞を、液滴条件を模倣するＲＴ反応におけるバルクで処理した。この実験は、液滴条件（特に１個の細胞当たりの反応緩衝液の体積、１個の細胞当たりの試薬の量）を模倣する。各条件に関して、本発明者らは、１ｕＭ～１０ｎＭの各ＶＨおよびＶＬ遺伝子特異的プライマーを使用した。比較はｑＰＣＲデータに基づく。Ｃｐ値（二次導関数最大算出法により決定された交点値）を各プライマー条件と比較した。（ｎ＝２）。エラーバー＝標準偏差（図７）。

ヒト免疫グロブリンの可変重鎖（ＶＨ）および可変軽カッパ鎖（ＶＬｋ）およびラムダ鎖（ＶＬｌ）の逆転写の捕捉効率（１００ｎＭの各遺伝子特異的プライマーに対して正規化されている）。ヒトスイッチド活性化メモリＢ細胞（活性化後５日）を溶解試薬およびＲＴ試薬と共に５００ｐＬの液滴に封入し、この混合物に、１００ｎＭまたは１０ｎＭのいずれかの各遺伝子特異的プライマーを添加した。（左側）比較は、各免疫グロブリン可変鎖のｑＰＣＲデータに基づく。Ｃｐ値（二次導関数最大算出法により決定された交点値）を各プライマー条件と比較した。（右側）２段階のネステッドＰＣＲ反応は、Ｓｙｂｒ Ｇｏｌｄで染色した２％アガロースゲルにロードした各ＶＨおよびＶＬのアンプリコンを増幅させた。（ｎ＝２）。エラーバー＝標準偏差（図８Ａおよび図８Ｂ）。

ヒトハウスキーピング遺伝子ＲＰＳ２９およびＴＲＡＴ１（高発現遺伝子から低発現遺伝子）の捕捉効率（１ｕＭの各遺伝子特異的プライマーに対して正規化されている）。ヒトＴ細胞Ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｊｕｒｋａｔ細胞）を、液滴条件を模倣するおよび１ｕＭ、１００ｎＭ、１０ｎＭ、１ｎＭのいずれかの各遺伝子特異的プライマーでのＲＴ反応におけるバルクで処理した。比較は各特異的遺伝子のｑＰＣＲデータに基づく。（各ｑＰＣＲに関してｎ＝２，３ ｃＤＮＡ希釈）エラーバー＝標準偏差。最も高く発現された遺伝子はプライマー濃度の影響を受けにくいが、最も低く発現された遺伝子の捕捉効率およびＲＴは１０ｎＭのＲＴプライマー濃度で影響を受ける（図９）。

実施例１０：全トランスクリプトーム捕捉および逆転写へのポリｄＴプライマー濃度の影響
ヒトハウスキーピング遺伝子ＲＰＳ２９およびＴＲＡＴ１（高発現遺伝子から低発現遺伝子）の捕捉効率。ヒトＴ細胞Ｌｅｕｋｅｍｉａ（Ｊｕｒｋａｔ）細胞を、溶解試薬およびＲＴ試薬と共に５００ｐＬの液滴に封入し、この混合物に３．３μＭまたは１００または３３ｎＭのいずれかのポリｄＴプライマーを添加した。比較は各特異的遺伝子のｑＰＣＲデータに基づく。（ｎ＝１）。ｎ．ｄ．＝不検出。最も高く発現された遺伝子および最も低く発現された遺伝子の両方がプライマー濃度の影響を受け、特に低ポリｄＴプライマー濃度で影響を受ける（図１０）。

Claims (19)

1. 単一細胞のＲＮＡを捕捉しかつバーコードを付与する方法であって、
   ａ）複数のマイクロ流体液滴を提供することであって、マイクロ流体液滴の少なくともいくつかが、単一細胞、溶解組成物、逆転写酵素、および少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドが、バーコード配列およびプライマー配列を含み、１つのタイプのオリゴヌクレオチドが別のタイプのオリゴヌクレオチドからそのプライマー配列により区別され、複数のマイクロ流体液滴の液滴が、複数のマイクロ流体液滴の他の液滴に含まれるバーコード配列から識別可能な１つまたは複数のバーコード配列を含む、提供すること、
   ｂ）液滴内の細胞の少なくともいくつかを溶解させて、細胞からＲＮＡを放出させること、
   ｃ）放出されたＲＮＡの少なくともいくつかを、液滴の少なくともいくつかの中の前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズさせること、
   ｄ）液滴の少なくともいくつかの中のプライマー配列を使用して、前記オリゴヌクレオチドにハイブリダイズされた放出されたＲＮＡを逆転写すること
   を含み、
   複数のマイクロ流体液滴が３ｎＬ未満の体積を有すること、および
   マイクロ流体液滴中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度が少なくとも１００ｎＭであることを特徴とする、方法。
2. 工程ａ）が、前記複数のマイクロ流体液滴内に含まれる複数の粒子を提供することをさらに含み、マイクロ流体液滴の少なくともいくつかが粒子をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドが前記粒子に結合されている、請求項２に記載の方法。
4. 複数のマイクロ流体液滴が１ｎＬ以下の体積を有する、請求項１～３のいずれか一項に記載の方法。
5. マイクロ流体液滴の少なくともいくつかの中での逆転写によって生成された単一細胞のｃＤＮＡを回収することをさらに含む、請求項１～４のいずれか一項に記載の方法。
6. バーコード配列が、単一細胞によって放出されたＲＮＡを、他の細胞から放出されたＲＮＡから一意的に識別する、請求項１～５のいずれか一項に記載の方法。
7. 少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドが、ポリＴ配列、ランダムＤＮＡ配列および遺伝子特異的配列からなる群から選択されるプライマー配列を含む、請求項１～６のいずれか一項に記載の方法。
8. プライマー配列が遺伝子特異的配列であり、および遺伝子が抗体重可変遺伝子、抗体重定常遺伝子、抗体軽可変遺伝子、抗体軽定常遺伝子、アルファＴ細胞レセプター遺伝子、ベータＴ細胞レセプター遺伝子、およびデルタＴ細胞レセプター遺伝子、およびガンマＴ細胞レセプター遺伝子からなる群から選択される、請求項７に記載の方法。
9. 粒子が１個の粒子／液滴以下で液滴内に封入されている、請求項２～８のいずれか一項に記載の方法。
10. １個の液滴に封入された粒子に結合された異なるタイプのオリゴヌクレオチドが、同一のバーコード配列を含む、請求項９に記載の方法。
11. 細胞を溶解させる前または溶解させた後に粒子からオリゴヌクレオチドの少なくともいくつかを放出させることを含む、請求項１０に記載の方法。
12. 複数のマイクロ流体液滴であって、マイクロ流体液滴の少なくともいくつかが、（ｉ）ＲＮＡを含む単一細胞または単一細胞溶解物と、（ｉｉ）少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドと、（ｉｉｉ）逆転写酵素と、（ｉｖ）溶解組成物とを含み、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドが、バーコード配列およびプライマー配列を含み、１つのタイプのオリゴヌクレオチドが別のタイプのオリゴヌクレオチドからそのプライマー配列により区別され、複数のマイクロ流体液滴の液滴が、複数のマイクロ流体液滴の他の液滴に含まれるバーコード配列から識別可能な１つまたは複数のバーコード配列を含み、
    複数のマイクロ流体液滴が、３ｎＬ未満の体積を有すること、および
    マイクロ流体液滴中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度が少なくとも１００ｎＭであることを特徴とする、マイクロ流体液滴。
13. 複数のマイクロ流体液滴が１ｎＬ未満の体積を有する、請求項１２に記載の複数のマイクロ流体液滴。
14. 単一細胞のＲＮＡを捕捉しかつバーコードを付与するために複数のマイクロ流体液滴を調製する方法であって、
    － 第１の流体源を提供する工程であって、第１の流体が細胞の懸濁液を含む、工程、
    － 第２の流体源を提供する工程であって、第２の流体が少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを含み、少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドが１つのバーコード配列とプライマー配列とを含み、１つのタイプのオリゴヌクレオチドが別のタイプのオリゴヌクレオチドからそのプライマー配列により区別され、前記プライマー配列が、ポリＴ配列、ランダムＤＮＡ配列および遺伝子特異的配列からなる群から選択され、複数のマイクロ流体液滴の各液滴が複数のマイクロ流体液滴の他の液滴に含まれる１つまたは複数のバーコード配列から識別可能な１つまたは複数のバーコード配列を含む、工程、
    － 第３の流体源を提供する工程であって、第３の流体が少なくとも逆転写酵素を濃度５～２５Ｕ／μＬで含む逆転写酵素組成物を含む、工程、
    － 担体流体を提供する工程であって、担体流体が第１の流体および第２の流体と非混和性である、工程、
    － 担体流体をチップの主チャネルに注入する工程、
    － チップの少なくとも副チャネルに第１の流体、第２の流体および第３の流体を注入することにより、担体流体中に液滴の流れを生じさせる工程であって、副チャネルが主チャネル中で開口しており、それぞれの生成された液滴が第１の流体、第２の流体および第３の流体の混合物を含む、工程
    を含み、
    第１の流体中の細胞の濃度、第２の流体中のオリゴヌクレオチドの濃度、第３の流体中の試薬、主チャネルおよび副チャネルの配置、第１の流体、第２の流体、第３の流体および担体流体の注入パラメータが複数の液滴の一液滴が単一細胞のみを含むかまたは細胞を含まず、かつ３ｎＬ未満の体積を示すように適合されており、各液滴中の各タイプのオリゴヌクレオチドの濃度が少なくとも１００ｎＭであることを特徴とする、方法。
15. 第２の流体が複数の粒子をさらに含み、各粒子がそれに結合された少なくとも１つのタイプのオリゴヌクレオチドを含む、請求項１４に記載の方法。
16. 複数のマイクロ流体液滴が２個以下の粒子／液滴が存在するように調製される、請求項１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 粒子および細胞が、液滴内に同時にまたは連続して封入される、請求項１５または１６に記載の方法。
18. 第２または第３の流体源が溶解組成物を含む、請求項１４から１７のいずれか一項に記載の方法。
19. 溶解組成物が、１ｍＭから２０ｍＭの範囲のＭｇＣｌ₂濃度を有する低張緩衝液を含む、請求項１８に記載の方法。

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