JP7018105B2 - ヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物及びそれを使用する方法 - Google Patents
ヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物及びそれを使用する方法 Download PDFInfo
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関連出願と優先権主張の相互参照
本出願は、２０１９年９月２７日に出願された出願番号１０８１３５３０２号の台湾出願に基づく利益を主張し、その内容は参考として本明細書に取り入れるものとする。
本出願は、２０１９年９月２７日に出願された出願番号１０８１３５３０２号の台湾出願に基づく利益を主張し、その内容は参考として本明細書に取り入れるものとする。
本発明は、ヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物に関し、特に、ｐＨ５未満の環境でヘリコバクターピロリを殺菌し、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する機能を果たすためのヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物に関する。
世界的なヘリコバクターピロリ感染率は世界人口の５０％を超えており、これらの感染の１０％～１５％は消化性潰瘍疾患の発症に繋がっている。ヘリコバクターピロリは、９５％の十二指腸潰瘍及び８０％の胃潰瘍に関連している。感染者の１％～３％が胃がんを発症する。そのため、ヘリコバクターピロリは世界保健機関（ＷＨＯ）によって一次発がん物質として分類されている（参考文献Ｄ（１）参照）。
近年、胃粘膜におけるヘリコバクターピロリの生存と病因に対する研究は、一般的な粘膜の微生物の病因（慢性感染）を観察する医学界の中心である。腸内菌共生バランス失調（intestinal dysbiosis）は肥満、糖尿病、炎症性疾患などの慢性疾患の原因であることが多いため、医学界は粘膜中のヘリコバクターピロリを効果的に除去することにより、一般的に粘膜中の他の毒性病原性微生物を除去する解決策を考えている（参考文献Ｄ（１）参照）。
ヘリコバクターピロリは、ヒトの消化管で最も興味深い微生物の一つであり、特に胃十二指腸粘膜内の活発な炎症性変化に関連している（胃潰瘍で約５０～６５％、十二指腸潰瘍で約９５％）。研究では、ヘリコバクターピロリに感染した人は、潰瘍の再発と潰瘍の合併症を避けるために、ヘリコバクターピロリを完全に排除する必要がある（参考文献Ｄ（２）参照）。
ヘリコバクターピロリは、一度ヒトの胃の中に住むと、ヒト宿主と平和的に共存できるスマートな細菌である。臨床的には、ヘリコバクターピロリに感染した人の８０％～９０％が慢性胃炎を患っているが、わずか２０％がそれらの症状を示す。感染者の１５％～２０％が胃潰瘍又は十二指腸潰瘍を発症し、ヘリコバクターピロリの保菌者の１％～３％が胃癌を発症し、千人に1人から万人に1人が胃リンパ腫を患っている。ヘリコバクターピロリに感染していない人と比較して、感染者の胃がんを発症するリスクは６倍に増加している（参考文献Ｄ（３）参照）。
最近の証拠は、ヘリコバクターピロリによる胃粘膜における長期のコロニー形成が慢性萎縮性胃炎とその後の腺癌につながる可能性があることを示唆している（参考文献Ｄ（２）参照）。
ヘリコバクターピロリの治療に関する将来の展望は、以下の（１）～（３）で議論できる（参考文献Ｄ（４）参照）。
（１）今日の治療における一般の障害
・ヘリコバクターピロリの抗生物質耐性の上昇
・長期使用に関する健康上の懸念（１０～１４日間、１日３～４回）
・抗生物質耐性のために高い単回投与が必要である（５００～１０００ｍｇの単一抗生物質治療）
・再発の増加
・抗生物質によって引き起こされる他の合併症には、次の通りである。
a、肥満
b、脂肪肝疾患
c、２型糖尿病(Ｔ２ＤＭ)
・抗生物質の予想される主要な効果は、胃粘膜の存在によって著しく影響を受けて減少する。その結果、主要な効果の減少を補うために投与量を増やすことにより、肝臓、腎臓、胃の損傷などの副作用が増大する。
・抗生物質の副作用は、患者の不快感につながる可能性がある。
・ヘリコバクターピロリ感染のみに起因するがん患者（７８万件）は、毎年世界中のすべてのがんの６．２％として非常に高い割合を占めている。
・ヘリコバクターピロリの抗生物質耐性の上昇
・長期使用に関する健康上の懸念（１０～１４日間、１日３～４回）
・抗生物質耐性のために高い単回投与が必要である（５００～１０００ｍｇの単一抗生物質治療）
・再発の増加
・抗生物質によって引き起こされる他の合併症には、次の通りである。
a、肥満
b、脂肪肝疾患
c、２型糖尿病(Ｔ２ＤＭ)
・抗生物質の予想される主要な効果は、胃粘膜の存在によって著しく影響を受けて減少する。その結果、主要な効果の減少を補うために投与量を増やすことにより、肝臓、腎臓、胃の損傷などの副作用が増大する。
・抗生物質の副作用は、患者の不快感につながる可能性がある。
・ヘリコバクターピロリ感染のみに起因するがん患者（７８万件）は、毎年世界中のすべてのがんの６．２％として非常に高い割合を占めている。
（２）最近の従来の「三剤併用」のいくつかの改良：
・ビスマスは、「四剤併用」になり、治療効果を高めるために追加されることがあり、主に、ウレアーゼ活性の阻害をする。
・ビスマスの代わりに、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）を三剤併用に追加するか、単独で使用することもできる。
・ＮＡＣの主な副作用：
a、毒性が高く、高用量で使用する必要がある。
b、胃粘膜の粘度を効果的に低下させるが、潰瘍の悪化も引き起こす傾向がある。
・ビスマスは、「四剤併用」になり、治療効果を高めるために追加されることがあり、主に、ウレアーゼ活性の阻害をする。
・ビスマスの代わりに、Ｎ－アセチルシステイン（ＮＡＣ）を三剤併用に追加するか、単独で使用することもできる。
・ＮＡＣの主な副作用：
a、毒性が高く、高用量で使用する必要がある。
b、胃粘膜の粘度を効果的に低下させるが、潰瘍の悪化も引き起こす傾向がある。
（３）ヘリコバクターピロリ感染の治療に関する最新の研究開発の方向性：
・狭いスペクトル
・非抗生物質
非抗生物質について、例えば、「Helicobacter pyloriに対する梅肉エキスの殺菌効果」（日本消化器病学会雑誌９９巻（２００２）４号ページ３７９～３８５）には、クエン酸とリンゴ酸を含むｐＨ２．５２～２．５７の梅肉エキスによってヘリコバクターピロリを殺菌でき、安価で副作用のない食品が記載されている。この研究によると、梅肉エキスの強酸でウレアーゼを有するヘリコバクターピロリに適した環境を破壊し、殺菌効果があると推測しているが、梅肉エキスの濃度と殺菌効率の間に用量依存関係がなく（表２から、梅肉エキスの異なり濃度（０．３％と０．９％）により、１５分で達成される殺菌効果（細菌数（ＣＦＵ／ｍｌ））はほぼ同じであり、１００％の殺菌（即ち、滅菌）が達成できない）、ヘリコバクターピロリが胃内の環境に寄生する環境を用意していなく、解明していないため、実際に梅肉エキスを胃に使用して発生する効果がまだ推測できない。
特に、クエン酸はヘリコバクターピロリに対する殺菌効果を示さないだけでなく、完全に逆の効果があることを示している（下の参考文献Ｄ（１２）Citric acid-enhanced Helicobacter pylori urease activity in vivo is unrelated to gastric emptying. Aliment Pharmacol Ther 2001; 15: 1763-1767.の1766ページ、左列、第２６～３５行及び図１参照）。参考文献Ｄ（１２）によると、クエン酸がヘリコバクターピロリのウレアーゼ活性を著しく高めることを開示しており、環境のｐＨ値は重大な要因ではないと記載している。又、リンゴ酸はヘリコバクターピロリに対して殺菌効果を示さないだけでなく、クエン酸とリンゴ酸の両方が酸中のヘリコバクターピロリのウレアーゼ活性を強化するという完全に逆の効果も持っている（参考文献Ｄ（１５）: Effect of different organic acids (citric, malic and ascorbic) on intragastric urease activity. Aliment Pharmacol Ther 2005; 21: 1145-1148.の「結論」及び図１～２参照）。これらの矛盾な研究成果から見れば、この分野の研究の難しさがわかる。
・狭いスペクトル
・非抗生物質
非抗生物質について、例えば、「Helicobacter pyloriに対する梅肉エキスの殺菌効果」（日本消化器病学会雑誌９９巻（２００２）４号ページ３７９～３８５）には、クエン酸とリンゴ酸を含むｐＨ２．５２～２．５７の梅肉エキスによってヘリコバクターピロリを殺菌でき、安価で副作用のない食品が記載されている。この研究によると、梅肉エキスの強酸でウレアーゼを有するヘリコバクターピロリに適した環境を破壊し、殺菌効果があると推測しているが、梅肉エキスの濃度と殺菌効率の間に用量依存関係がなく（表２から、梅肉エキスの異なり濃度（０．３％と０．９％）により、１５分で達成される殺菌効果（細菌数（ＣＦＵ／ｍｌ））はほぼ同じであり、１００％の殺菌（即ち、滅菌）が達成できない）、ヘリコバクターピロリが胃内の環境に寄生する環境を用意していなく、解明していないため、実際に梅肉エキスを胃に使用して発生する効果がまだ推測できない。
特に、クエン酸はヘリコバクターピロリに対する殺菌効果を示さないだけでなく、完全に逆の効果があることを示している（下の参考文献Ｄ（１２）Citric acid-enhanced Helicobacter pylori urease activity in vivo is unrelated to gastric emptying. Aliment Pharmacol Ther 2001; 15: 1763-1767.の1766ページ、左列、第２６～３５行及び図１参照）。参考文献Ｄ（１２）によると、クエン酸がヘリコバクターピロリのウレアーゼ活性を著しく高めることを開示しており、環境のｐＨ値は重大な要因ではないと記載している。又、リンゴ酸はヘリコバクターピロリに対して殺菌効果を示さないだけでなく、クエン酸とリンゴ酸の両方が酸中のヘリコバクターピロリのウレアーゼ活性を強化するという完全に逆の効果も持っている（参考文献Ｄ（１５）: Effect of different organic acids (citric, malic and ascorbic) on intragastric urease activity. Aliment Pharmacol Ther 2005; 21: 1145-1148.の「結論」及び図１～２参照）。これらの矛盾な研究成果から見れば、この分野の研究の難しさがわかる。
ヘリコバクターピロリは、主にヒトの胃洞粘膜の上皮細胞にコロニー形成する（参考文献Ｄ（１）参照）。胃粘膜内のｐＨ値は、ｐＨ勾配(pH-gradient)になっている。主な原因は、上皮細胞の先端部分が粘膜に重炭酸塩（HCO3
－）を分泌し、胃管腔からの酸に抵抗することである（参考文献Ｄ（５）参照）。従って、本発明の組成物は、胃に寄生するヘリコバクターピロリを完全に除去するために、胃粘膜中のアルカリ（すなわち、重炭酸塩（HCO3
－））に抵抗することができ、酸性環境を作って殺菌する必要がある。更に、胃液には尿素が含まれており、ヘリコバクターピロリは、生存のため、且つ酸の攻撃に対する耐性を有するため、周囲のｐＨ値が低い時、尿素を加水分解して微小環境のｐＨ値を上げる。一般に、抗生物質は、主にｐＨ５～８で効果的な殺菌力を有するため、胃酸を中和するか胃酸分泌を抑制して失活の原因となる胃内の低いｐＨを避けるために、胃のｐＨを上げるための制酸剤又は胃酸分泌を抑制するプロトンポンプ阻害剤（PPI）と組み合わせて摂取する必要がある（参考文献Ｄ（６）の図３参照）。要約すると、胃粘膜中の重炭酸塩（HCO3
－）は、ヘリコバクターピロリのコロニー形成に不可欠である。更に、ウレアーゼには、ヘリコバクターピロリが胃粘膜にコロニー形成することを助ける別の重要な因子もある。
胃粘膜（粘液ゲル層）における「重炭酸塩バリア」は、次のように詳細に説明する。
胃粘膜の上皮細胞におけるヘリコバクターピロリのコロニー形成は、参考文献Ｄ（１）の図１を参照する。
胃粘膜におけるｐＨ勾配については、参考文献Ｄ（５）の要約を参照する。参考文献Ｄ（５）によると、胃粘膜の「重炭酸塩バリア」の特性には、ｐＨ勾配（胃管腔から上皮細胞の頂端部までのｐＨ値が低いから高いまで変化する）、耐酸性、及びペプシンに対する耐性がある。参考文献Ｄ（５）のＣ６ページの図２のマウスの生体内実験では、グループＡはペンタガストリンを使用して胃壁細胞を刺激して胃液を分泌し、グループＢはラニチジンを使用して胃酸分泌を抑制した。粘膜と上皮細胞との界面におけるｐＨ値変化について、胃酸分泌が一時的に抑制されると、ｐＨが７から２～３に急激に低下し、グループＢで約２０分後にｐＨ６～７に跳ね返る。参考文献Ｄ（５）のＣ６ページ、右列、第４～２０行に述べるように、分子量（Ｄａ）が４００未満の物質に含まれている水素イオンや小分子などのイオンが粘膜を自由に通過できることは、生体内実験で証明されている。したがって、粘膜微小環境における酸による攻撃を防ぐ主な干渉因子は、重炭酸塩（ＨＣＯ３
－）であるべき。
したがって、胃粘膜におけるヘリコバクターピロリを効果的に除去するためには、胃粘膜中の重炭酸塩（HCO3
－）に抵抗し、酸性環境を作って殺菌できる組成物を見つけることが重要である（有機酸に関するヘリコバクターピロリを含むグラム陰性菌を殺菌することについて、参考文献Ｄ（７）の図１及び４/１１ページ、右列、第８～２０行参照）。
ヘリコバクターピロリが有する高性能アスコルビン酸オキシダーゼは、ｐＨ２～７の好ましい活性範囲があるため（参考文献Ｄ（１６）: Investigation of Helicobacter pylori ascorbic acid oxidating activity. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 10, 289-294 (1995)の表１と図３参照）、アスコルビン酸が生体外のアスコルビン酸オキシダーゼの活性を阻害できるが、生体外又は生体内のヘリコバクターピロリを効果的に殺菌できるとは言えない。一方、胃内の尿素と胃粘膜の重炭酸塩の両方は、ヘリコバクターピロリが胃酸（即ち水素イオン）の攻撃を防ぐために不可欠な生存条件を提供している。他の研究報告（参考文献Ｄ（１５））によると、クエン酸とリンゴ酸はｐＨ２.３（酸性環境）でウレアーゼの活性を特に高めるが、アスコルビン酸の場合にはウレアーゼの活性に影響を与えない（参考文献Ｄ（１５）の図１）。
ヘリコバクターピロリが有する高性能アスコルビン酸オキシダーゼは、ｐＨ２～７の好ましい活性範囲があるため（参考文献Ｄ（１６）: Investigation of Helicobacter pylori ascorbic acid oxidating activity. FEMS Immunology and Medical Microbiology, 10, 289-294 (1995)の表１と図３参照）、アスコルビン酸が生体外のアスコルビン酸オキシダーゼの活性を阻害できるが、生体外又は生体内のヘリコバクターピロリを効果的に殺菌できるとは言えない。一方、胃内の尿素と胃粘膜の重炭酸塩の両方は、ヘリコバクターピロリが胃酸（即ち水素イオン）の攻撃を防ぐために不可欠な生存条件を提供している。他の研究報告（参考文献Ｄ（１５））によると、クエン酸とリンゴ酸はｐＨ２.３（酸性環境）でウレアーゼの活性を特に高めるが、アスコルビン酸の場合にはウレアーゼの活性に影響を与えない（参考文献Ｄ（１５）の図１）。
本発明は、胃粘膜におけるヘリコバクターピロリを効果的に除去するためには、胃粘膜中の重炭酸塩（HCO3
－）に抵抗し、ウレアーゼ活性を阻害し、酸性環境を作って殺菌できる組成物を見つけ、ヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物を提供することを目的とする。
本発明の一態様は、重炭酸塩及び尿素の存在下でｐＨ値が５未満の環境でのヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物を提供する。前記非医薬殺菌組成物は、クエン酸、リンゴ酸又はそれらの組み合わせである第一成分であって、水溶液状態において、分子状態と解離状態を有し、前記分子状態は、ｐＨ値が５未満の環境で、ヘリコバクターピロリを殺菌し、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する機能を実行する前記第一成分と、前記第一成分と緩衝組成物を形成し、重炭酸塩を中和するための、クエン酸塩、リンゴ酸塩又はそれらの組み合わせである第二成分であって、前記第一成分のヘリコバクターピロリへの殺菌を効果的に継続させ、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する前記第二成分と、を含むものである。
本発明の別の態様は、重炭酸塩及び尿素の存在下でｐＨ値が５未満の環境で非医薬殺菌組成物を使用することによりヘリコバクターピロリを殺菌する方法を提供する。前記方法は、第一成分及び第二成分を含む緩衝組成物（即ち、非医薬殺菌組成物）を用意するステップであって、前記第一成分はクエン酸、リンゴ酸又はそれらの組み合わせであり、前記第二成分はクエン酸塩、リンゴ酸塩又はそれらの組み合わせである前記ステップと、前記緩衝組成物を哺乳動物に投与するステップと、を含む方法である。
本発明の別の態様は、重炭酸塩及び尿素の存在下でｐＨ値が５未満の環境で非医薬殺菌組成物を使用することによりヘリコバクターピロリを殺菌する方法を提供する。前記方法は、第一成分及び第二成分を含む緩衝組成物（即ち、非医薬殺菌組成物）を用意するステップであって、前記第一成分はクエン酸、リンゴ酸又はそれらの組み合わせであり、前記第二成分はクエン酸塩、リンゴ酸塩又はそれらの組み合わせである前記ステップと、前記緩衝組成物を哺乳動物に投与するステップと、を含む方法である。
本発明の別の態様は、ヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物を提供する。前記非医薬殺菌組成物は、クエン酸、リンゴ酸又はそれらの組み合わせである第一の毎日の食用成分であって、水溶液状態において、分子状態と解離状態を有し、前記分子状態は、ｐＨ値が５未満の環境で、ヘリコバクターピロリを殺し、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する機能を実行する前記第一の毎日の食用成分と、重炭酸塩を中和するための、クエン酸塩、リンゴ酸塩又はそれらの組み合わせである第二の毎日の食用成分と、アスコルビン酸である第三の毎日の食用成分であって、前記第一の毎日の食用成分、前記第二の毎日の食用成分及び塩の存在下で、ヘリコバクターピロリをより完全に殺す前記第三の毎日の食用成分と、を含むものである。
本発明の別の態様は、ヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物を提供する。前記非医薬殺菌組成物は、重炭酸塩を中和するための、有機酸とその塩からなる緩衝液の組み合わせである第一の毎日の食用成分であって、ｐＨ値が５未満の環境で、ヘリコバクターピロリを殺し、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する機能を実行し、前記有機酸がクエン酸、リンゴ酸またはそれらの組み合わせである前記第一の毎日の食用成分と、アスコルビン酸である第二の毎日の食用成分であって、前記第一の毎日の食用成分の存在下で、ヘリコバクターピロリをより完全に殺す前記第二の毎日の食用成分と、を含むものである。
本発明の別の態様は、ヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物を提供する。前記非医薬殺菌組成物は、重炭酸塩を中和するための、有機酸とその塩からなる緩衝液の組み合わせである第一の毎日の食用成分であって、ｐＨ値が５未満の環境で、ヘリコバクターピロリを殺し、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する機能を実行し、前記有機酸がクエン酸、リンゴ酸またはそれらの組み合わせである前記第一の毎日の食用成分と、アスコルビン酸である第二の毎日の食用成分であって、前記第一の毎日の食用成分の存在下で、ヘリコバクターピロリをより完全に殺す前記第二の毎日の食用成分と、を含むものである。
本発明のさらなる態様は、ヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物を提供する。前記非医薬殺菌組成物は、クエン酸、リンゴ酸又はそれらの組み合わせである第一の毎日の食用成分であって、水溶液状態において、分子状態と解離状態を有し、前記分子状態は、ｐＨ値が５未満の環境で、ヘリコバクターピロリを殺し、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する機能を実行する前記第一の毎日の食用成分と、塩である第二の毎日の食用成分であって、重炭酸塩を中和し、前記第一の毎日の食用成分と緩衝液の組み合わせを形成するために使用され、ヘリコバクターピロリの効果的な殺滅を継続して、前記ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する前記第二の毎日の食用成分と、を含むものである。
本発明のさらなる態様は、ヘリコバクターピロリ感染の治療方法を提供する。前記治療方法は、第一の毎日の食用成分と第二の毎日の食用成分を含む非医薬品殺菌組成物を提供するステップであって、前記第一の毎日の食用成分が水溶液状態において、分子状態と解離状態を有し、前記分子状態は、ｐＨ値が５未満の環境で、ヘリコバクターピロリを殺し、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する機能を実行し、前記第一の毎日の食用成分がクエン酸、リンゴ酸、又はそれらの組み合わせであり、前記第二の毎日の食用成分が塩であり、前記塩がクエン酸の塩、リンゴ酸の塩、又はそれらの組み合わせであり、前記第二の毎日の食用成分が重炭酸塩を中和し、前記第一の毎日の食用成分と緩衝液の組み合わせを形成するために使用され、前記ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する前記ステップと、非医薬品殺菌組成物を哺乳動物に投与するステップと、を含む方法である。
本発明に係るクエン酸又はリンゴ酸緩衝組成物は、低いｐＨ値の粘膜微小環境を作って、胃粘膜中の重炭酸塩（HCO3
－）に抵抗し、ウレアーゼ活性及びアスコルビン酸オキシダーゼ活性を効果的に阻害し、ヘリコバクターピロリを殺菌でき、更にアスコルビン酸の添加により、ヘリコバクターピロリを殺菌及び滅菌することにより有利である。特に、５未満のｐＨ値を有するクエン酸塩又はリンゴ酸塩緩衝組成物に対するアスコルビン酸の滅菌効果は有意な「相乗効果」を示し、重炭酸塩環境に添加されたアスコルビン酸に関連する有意な「用量依存性」の殺菌効果を有する。
本発明の前記目的と利点は、当業者は、以下の詳細説明と添付の図面を参照して明らかになる。
ｐＨ３．０、４．０と５５．０でのクエン酸の緩衝液の組み合わせ（アスコルビン酸の有無）及びリン酸の緩衝液の組み合わせ（アスコルビン酸の有無）によるヘリコバクターピロリに対する抗菌実験の結果を示す柱状図である。
ｐＨ３．０のクエン酸の緩衝液の組み合わせとアスコルビン酸によるヘリコバクターピロリに対する抗菌実験の結果を示す柱状図である。
ｐＨ３．０、４．０と５．０でのリンゴ酸の緩衝液の組み合わせ、乳酸の緩衝液の組み合わせ、クエン酸の緩衝液の組み合わせ、及びリン酸の緩衝液の組み合わせによるヘリコバクターピロリに対する抗菌実験の結果を示す柱状図である。
アスコルビン酸とリンゴ酸の緩衝液の組み合わせ、アスコルビン酸と乳酸の緩衝液の組み合わせ、アスコルビン酸とクエン酸緩衝液の組み合わせ、及びリン酸の緩衝液の組み合わせによるヘリコバクターピロリに対する抗菌実験の結果を示す柱状図である。
以下は、本発明の実施形態である。
Ｉ、実験機器
オートクレーブ（FD50R、Zealway、米国）
マイクロ遠心分離機（SpectrafugeTM24D、Labnet、米国）
電子微量天秤（XR 205SM-DR、Precisa、スイス）
電子天秤（PB1502-S、メトラー・トレド、米国）
ｐＨメーター（Delta 320、Mettler Toledo、米国）
オービタルシェーカーインキュベーター（721 SR、HIPOINT、台湾）
生物学的安全キャビネット（Ever Win Technology、台湾）
マイクロプレートリーダー（SPECTROstar(R)Nano、BMG Labtech、ドイツ）
浄水システム（Polycon DIU-3、Scienpak Enterprise、台湾）
ピペット10～100μL（Acura(R)マニュアル825、Socorex、スイス）
ピペット20～200μL（Acura(R)マニュアル825、Socorex、スイス）
ピペット100～1000μL（Acura(R)マニュアル825、Socorex、スイス）
血清ボトル1000mL（ドイツ、ショット）
血清ボトル500mL（ドイツ、ショット）
血清ボトル50mL（ドイツ、ショット）
ビーカー1000mL（Kimax、米国）
ビーカー500mL（Kimax、米国）
ビーカー100mL（Kimax、米国）
スターラー（ドガー、台湾）
ガラス製三角セルスプレッダー（ドガー、台湾）
アルコールバーナー（ドガー、台湾）
AnaeroPack Jar（MGCAnaeroPack(R)、三菱ガス化学、日本）
Ｉ、実験機器
オートクレーブ（FD50R、Zealway、米国）
マイクロ遠心分離機（SpectrafugeTM24D、Labnet、米国）
電子微量天秤（XR 205SM-DR、Precisa、スイス）
電子天秤（PB1502-S、メトラー・トレド、米国）
ｐＨメーター（Delta 320、Mettler Toledo、米国）
オービタルシェーカーインキュベーター（721 SR、HIPOINT、台湾）
生物学的安全キャビネット（Ever Win Technology、台湾）
マイクロプレートリーダー（SPECTROstar(R)Nano、BMG Labtech、ドイツ）
浄水システム（Polycon DIU-3、Scienpak Enterprise、台湾）
ピペット10～100μL（Acura(R)マニュアル825、Socorex、スイス）
ピペット20～200μL（Acura(R)マニュアル825、Socorex、スイス）
ピペット100～1000μL（Acura(R)マニュアル825、Socorex、スイス）
血清ボトル1000mL（ドイツ、ショット）
血清ボトル500mL（ドイツ、ショット）
血清ボトル50mL（ドイツ、ショット）
ビーカー1000mL（Kimax、米国）
ビーカー500mL（Kimax、米国）
ビーカー100mL（Kimax、米国）
スターラー（ドガー、台湾）
ガラス製三角セルスプレッダー（ドガー、台湾）
アルコールバーナー（ドガー、台湾）
AnaeroPack Jar（MGCAnaeroPack(R)、三菱ガス化学、日本）
II、実験用消耗品
ピペットマンチップ10-200μL（Vertex(R)、米国）
ピペットマンチップ100-1000μL（Vertex(R)、米国）
マイクロ遠心チューブ1.5 mL（JetBiofil(R)、中国）
遠心チューブ15 mL（JetBiofil(R)、中国）
遠心チューブ50 mL（JetBiofil(R)、中国）
細胞と組織培養皿9.0cm（JetBiofil(R)、中国）
細胞と組織培養プレート48ウェル（JetBiofil(R)、中国）
細胞と組織培養プレート96ウェル（JetBiofil(R)、中国）
シリンジ駆動フィルター0.22μm（PVDF膜、JetBiofil(R)、中国）
使い捨て注射器1mL（テルモ、日本）
微好気性バッグGenbox Microaer（Ref. 96125、bioMerieux、フランス）
ピペットマンチップ10-200μL（Vertex(R)、米国）
ピペットマンチップ100-1000μL（Vertex(R)、米国）
マイクロ遠心チューブ1.5 mL（JetBiofil(R)、中国）
遠心チューブ15 mL（JetBiofil(R)、中国）
遠心チューブ50 mL（JetBiofil(R)、中国）
細胞と組織培養皿9.0cm（JetBiofil(R)、中国）
細胞と組織培養プレート48ウェル（JetBiofil(R)、中国）
細胞と組織培養プレート96ウェル（JetBiofil(R)、中国）
シリンジ駆動フィルター0.22μm（PVDF膜、JetBiofil(R)、中国）
使い捨て注射器1mL（テルモ、日本）
微好気性バッグGenbox Microaer（Ref. 96125、bioMerieux、フランス）
III、 実験薬
尿素（日本新薬、台湾）
クエン酸（日本新薬、台湾）
クエン酸ナトリウム（日本新薬、台湾）
リン酸二水素カリウム（日本新薬、台湾）
リン酸水素ナトリウム（日本新薬、台湾）
DL-リンゴ酸（SHUN CHING RAW MATERIAL CO., LTD.、台湾）
DL-Malateナトリウム（Gemfont、台湾）
乳酸（Alfa Aesar、米国）
乳酸ナトリウム（Hsin Eing、台湾）
炭酸水素ナトリウム（島久薬品、日本）
塩化ナトリウム（日本新薬、台湾）
塩化水素（日本新薬、台湾）
水酸化ナトリウム（日本新薬、台湾）
BBLTMブルセラブイヨン（BD Biosciences、米国）
BactoTMAgar（BD Biosciences、米国）
ドナー馬血清（Hyclone、米国）
L-アスコルビン酸（Sigma、米国）
尿素（日本新薬、台湾）
クエン酸（日本新薬、台湾）
クエン酸ナトリウム（日本新薬、台湾）
リン酸二水素カリウム（日本新薬、台湾）
リン酸水素ナトリウム（日本新薬、台湾）
DL-リンゴ酸（SHUN CHING RAW MATERIAL CO., LTD.、台湾）
DL-Malateナトリウム（Gemfont、台湾）
乳酸（Alfa Aesar、米国）
乳酸ナトリウム（Hsin Eing、台湾）
炭酸水素ナトリウム（島久薬品、日本）
塩化ナトリウム（日本新薬、台湾）
塩化水素（日本新薬、台湾）
水酸化ナトリウム（日本新薬、台湾）
BBLTMブルセラブイヨン（BD Biosciences、米国）
BactoTMAgar（BD Biosciences、米国）
ドナー馬血清（Hyclone、米国）
L-アスコルビン酸（Sigma、米国）
IV、実験方法
実施形態１
クエン酸の緩衝液の組み合わせ（アスコルビン酸の有無）及びリン酸の緩衝液の組み合わせ（アスコルビン酸の有無）のヘリコバクターピロリに対する抗菌実験（生存率チェックポイント：0/20/40/60分、三回繰り返し）
実施形態１
クエン酸の緩衝液の組み合わせ（アスコルビン酸の有無）及びリン酸の緩衝液の組み合わせ（アスコルビン酸の有無）のヘリコバクターピロリに対する抗菌実験（生存率チェックポイント：0/20/40/60分、三回繰り返し）
細菌株と培養方法
実験で使用された細菌株は、ヘリコバクターピロリ株２６６９５（ＡＴＣＣ７００３９２）であり、細菌はブルセラ固体培地（ブルセラブロス２８ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ及び１０％（ｖ／ｖ）ウマ血清、ｐＨ７．０）で継代培養した。細菌を線画法で植菌した後、湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で７２時間培養した。
実験で使用された細菌株は、ヘリコバクターピロリ株２６６９５（ＡＴＣＣ７００３９２）であり、細菌はブルセラ固体培地（ブルセラブロス２８ｇ／Ｌ、寒天１５ｇ／Ｌ及び１０％（ｖ／ｖ）ウマ血清、ｐＨ７．０）で継代培養した。細菌を線画法で植菌した後、湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で７２時間培養した。
各培地は、使用の準備のために０．２２μｍ注入型フィルターを通してろ過された。１０ｍｇ/ｍＬのNaHCO3を含むブルセラブロスに７２時間継代培養したヘリコバクターピロリを添加し、細菌濃度を細菌溶液として１０７～１０８ CFU/ｍLに調整し、細菌溶液を各培養液と1：1で混合し、湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で培養した。
クエン酸緩衝液は、クエン酸とクエン酸ナトリウムをそれぞれのｐＨ値に応じて異なる比率で混合することにより調製し、調製不可能な部分は一定のｐＨ値に達するようにHClとNaOHにより調製する。リン酸緩衝液は、KH2PO4とNa2HPO4をそれぞれのｐＨ値に応じて異なる比率で混合することにより調製し、調製不可能な部分は一定のｐＨ値に達するようにHClとNaOHで調製する。培養液のｐＨ値をHClとNaOHで調製する。上記の方法を使用して各培地を一定のｐＨ値に調整した後、一定濃度のアスコルビン酸を各培養液に追加する。細菌溶液及び各培養液の組成は以下の通りである。
細菌溶液：（ブルセラブロス28ｇ/L、NaHCO3 10ｇ/L、10 mM尿素）。
グループ1：N3（ブルセラブロス28ｇ/Lと10 mM尿素、ｐＨ3.0）。
グループ2：N3V3000（ブルセラブロス 28ｇ/L及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ3：N4（ブルセラブロス28ｇ/Lおよび10mM尿素、ｐＨ4.0）。
グループ4：N4V3000（ブルセラブロス28ｇ/L及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ5：N5（ブルセラブロス28ｇ/Lおよび10 mM尿素、ｐＨ5.0）。
グループ6：N5V3000（ブルセラブロス28ｇ/L及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ7：P3（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10mM尿素、ｐＨ3.0）。
グループ8：P3V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ9：P4（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10mM尿素、ｐＨ4.0）。
グループ10：P4V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ11：P5（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）。
グループ12：P5V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ13：C3（ブルセラブロス28g / L、0.1Mクエン酸緩衝液及び10mM尿素、ｐＨ 3.0）。
グループ14：C3V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ15：C4（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）。
グループ16：C4V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ17：C5（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）。
グループ18：C5V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
細菌溶液：（ブルセラブロス28ｇ/L、NaHCO3 10ｇ/L、10 mM尿素）。
グループ1：N3（ブルセラブロス28ｇ/Lと10 mM尿素、ｐＨ3.0）。
グループ2：N3V3000（ブルセラブロス 28ｇ/L及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ3：N4（ブルセラブロス28ｇ/Lおよび10mM尿素、ｐＨ4.0）。
グループ4：N4V3000（ブルセラブロス28ｇ/L及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ5：N5（ブルセラブロス28ｇ/Lおよび10 mM尿素、ｐＨ5.0）。
グループ6：N5V3000（ブルセラブロス28ｇ/L及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ7：P3（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10mM尿素、ｐＨ3.0）。
グループ8：P3V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ9：P4（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10mM尿素、ｐＨ4.0）。
グループ10：P4V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ11：P5（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）。
グループ12：P5V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ13：C3（ブルセラブロス28g / L、0.1Mクエン酸緩衝液及び10mM尿素、ｐＨ 3.0）。
グループ14：C3V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ15：C4（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）。
グループ16：C4V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ17：C5（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）。
グループ18：C5V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
生存率チェックポイント（0/20/40/60分）に従って培養した各培養液を生理食塩水で10倍に連続希釈した後、各倍率で希釈した細菌溶液をブルセラ固体培地に塗布して継代培養した。湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で７２時間静置培養した。最後に、各培養液の生菌数を計算した。
実施形態２
アスコルビン酸と組み合わせたクエン酸緩衝液のヘリコバクターピロリに対する抗菌実験（生存率チェックポイント：0/20/40/60分、三回繰り返し）
アスコルビン酸と組み合わせたクエン酸緩衝液のヘリコバクターピロリに対する抗菌実験（生存率チェックポイント：0/20/40/60分、三回繰り返し）
細菌株と培養方法
実験で使用された細菌株は、ヘリコバクターピロリ株26695（ATCC700392）であり、細菌はブルセラ固体培地（ブルセラブロス２８ｇ/L、寒天１５ｇ/L及び１０％（v/v）ウマ血清、ｐＨ7.0）で継代培養した。細菌を線画法で植菌した後、湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で７２時間培養した。
実験で使用された細菌株は、ヘリコバクターピロリ株26695（ATCC700392）であり、細菌はブルセラ固体培地（ブルセラブロス２８ｇ/L、寒天１５ｇ/L及び１０％（v/v）ウマ血清、ｐＨ7.0）で継代培養した。細菌を線画法で植菌した後、湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で７２時間培養した。
各培養液は、使用の準備のために０．２２μｍ注入型フィルターを通してろ過された。１０ｍｇ/ｍLのNaHCO3を含むブルセラブロスに７２時間継代培養したヘリコバクターピロリを添加し、細菌濃度を細菌溶液として１０７～１０８ CFU/ｍLに調整し、細菌溶液を各培養液と1：1で混合し、湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で培養した。
クエン酸緩衝液は、クエン酸とクエン酸ナトリウムをそれぞれのｐＨ値に応じて異なる比率で混合することにより調製し、調製不可能な部分は一定のｐＨ値に達するようにHClとNaOHにより調製する。リン酸緩衝液は、KH2PO4とNa2HPO4をそれぞれのｐＨ値に応じて異なる比率で混合することにより調製し、調製不可能な部分は一定のｐＨ値に達するようにHClとNaOHで調製する。培養液のｐＨ値をHClとNaOHで調製する。上記の方法を使用して各培養液を一定のｐＨ値に調整した後、一定濃度のアスコルビン酸を各培養液に追加する。細菌溶液及び各培養液の組成は以下の通りである。
グループ1：C3V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ2：C3V6000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（12000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ3：C3V9000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（18000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ1：C3V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ2：C3V6000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（12000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ3：C3V9000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（18000ｍｇ/LビタミンC）。
生存率チェックポイント（0/20/40/60分）に従って培養した各培養液を生理食塩水で10倍に連続希釈した後、各倍率で希釈した細菌溶液をブルセラ固体培地に塗布して継代培養した。湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で７２時間静置培養した。最後に、各培養液の生菌数を計算した。
尿素添加の詳細については、参考文献Ｄ（８）と参考文献Ｄ（９）を参照する。また、NaHCO3の添加の詳細については、参考文献Ｄ（６）、Ｄ（１０）及びＤ（１１）を参照する。
また、参考文献Ｄ（５）のマウスin vivo実験（Fig.2）によると、胃粘膜の重炭酸塩は完全に中和された後、約20分で元の濃度に戻る。本実験の目的は、緩衝組成物の滅菌を完了するために、胃粘膜の内部ｐＨ＜5の状態（尿素を含む）を維持し、９０分以上持続する（つまり、６０分の滅菌）。言い換えると、本願は、９０分の実験で最大約６回の重炭酸塩を完全に中和することに耐える必要がある。参考文献Ｄ（１１）によれば、胃の単位粘膜面積あたりの重炭酸塩の分泌量は酸濃度の約5～10％である。Wikipediaによると、胃の胃酸の最高濃度は約160mMである。つまり、胃粘膜の最大濃度は約16mMである。この場合、重炭酸塩の合計量は、９０分の実験で最大約６回の重炭酸塩を完全に中和する総量＝（16mM）×（6回）＝（96mM）。
また、参考文献Ｄ（５）のマウスin vivo実験（Fig.2）によると、胃粘膜の重炭酸塩は完全に中和された後、約20分で元の濃度に戻る。本実験の目的は、緩衝組成物の滅菌を完了するために、胃粘膜の内部ｐＨ＜5の状態（尿素を含む）を維持し、９０分以上持続する（つまり、６０分の滅菌）。言い換えると、本願は、９０分の実験で最大約６回の重炭酸塩を完全に中和することに耐える必要がある。参考文献Ｄ（１１）によれば、胃の単位粘膜面積あたりの重炭酸塩の分泌量は酸濃度の約5～10％である。Wikipediaによると、胃の胃酸の最高濃度は約160mMである。つまり、胃粘膜の最大濃度は約16mMである。この場合、重炭酸塩の合計量は、９０分の実験で最大約６回の重炭酸塩を完全に中和する総量＝（16mM）×（6回）＝（96mM）。
実施形態３
リンゴ酸緩衝液の組み合わせ、乳酸緩衝液の組み合わせ、クエン酸緩衝液の組み合わせ、及びリン酸緩衝液の組み合わせのヘリコバクターピロリに対する抗菌実験（生存率チェックポイント：0/20/40/60分、三回繰り返し）。
リンゴ酸緩衝液の組み合わせ、乳酸緩衝液の組み合わせ、クエン酸緩衝液の組み合わせ、及びリン酸緩衝液の組み合わせのヘリコバクターピロリに対する抗菌実験（生存率チェックポイント：0/20/40/60分、三回繰り返し）。
細菌株と培養方法
実験で使用された細菌株は、ヘリコバクターピロリ株26695（ATCC700392）であり、細菌はブルセラ固体培地（ブルセラブロス２８ｇ/L、寒天１５ｇ/L及び１０％（v/v）ウマ血清、ｐＨ7.0）で継代培養した。細菌を線画法で植菌した後、湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で７２時間培養した。
実験で使用された細菌株は、ヘリコバクターピロリ株26695（ATCC700392）であり、細菌はブルセラ固体培地（ブルセラブロス２８ｇ/L、寒天１５ｇ/L及び１０％（v/v）ウマ血清、ｐＨ7.0）で継代培養した。細菌を線画法で植菌した後、湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で７２時間培養した。
各培養液は、使用の準備のために０．２２μｍ注入型フィルターを通してろ過された。１０ｍｇ/ｍLのNaHCO3を含むブルセラブロスに７２時間継代培養したヘリコバクターピロリを添加し、細菌濃度を細菌溶液として１０７～１０８ CFU/ｍLに調整し、細菌溶液を各培養液と1：1で混合し、湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で培養した。
クエン酸緩衝液は、クエン酸とクエン酸ナトリウムをそれぞれのｐＨ値に応じて異なる比率で混合することにより調製し、調製不可能な部分は一定のｐＨ値に達するようにHClとNaOHにより調製する。リン酸緩衝液は、KH2PO4とNa2HPO4をそれぞれのｐＨ値に応じて異なる比率で混合することにより調製し、調製不可能な部分は一定のｐＨ値に達するようにHClとNaOHで調製する。培養液のｐＨ値をHClとNaOHで調製する。上記の方法を使用して各培養液を一定のｐＨ値に調整した後、細菌溶液及び各培養液の組成は以下の通りである。
細菌溶液：（ブルセラブロス28ｇ/L、NaHCO3 10ｇ/L、10 mM尿素）。
グループ1：M3（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリンゴ酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ 3.0）。
グループ2：M4（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1Mリンゴ酸緩衝液及び10mM尿素、ｐＨ 4.0）。
グループ3：M5（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1Mリンゴ酸緩衝液及び10mM尿素、ｐＨ5.0）。
グループ4：L3（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 M乳酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ 3.0）。
グループ5：L4（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1M乳酸緩衝液及び10mM尿素、ｐＨ 4.0）。
グループ6：L5（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 M乳酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ 5.0）。
グループ7：P3（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ 3.0）。
グループ8：P4（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ 4.0）。
グループ9：P5（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ 5.0）。
グループ10：C3（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ 3.0）。
グループ11：C4（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1Mクエン酸緩衝液及び10mM尿素、ｐＨ 4.0）。
グループ12：C5（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ 5.0）。
細菌溶液：（ブルセラブロス28ｇ/L、NaHCO3 10ｇ/L、10 mM尿素）。
グループ1：M3（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリンゴ酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ 3.0）。
グループ2：M4（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1Mリンゴ酸緩衝液及び10mM尿素、ｐＨ 4.0）。
グループ3：M5（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1Mリンゴ酸緩衝液及び10mM尿素、ｐＨ5.0）。
グループ4：L3（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 M乳酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ 3.0）。
グループ5：L4（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1M乳酸緩衝液及び10mM尿素、ｐＨ 4.0）。
グループ6：L5（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 M乳酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ 5.0）。
グループ7：P3（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ 3.0）。
グループ8：P4（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ 4.0）。
グループ9：P5（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ 5.0）。
グループ10：C3（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ 3.0）。
グループ11：C4（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1Mクエン酸緩衝液及び10mM尿素、ｐＨ 4.0）。
グループ12：C5（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ 5.0）。
生存率チェックポイント（0/20/40/60分）に従って培養した各培養液を生理食塩水で10倍に連続希釈した後、各倍率で希釈した細菌溶液をブルセラ固体培地に塗布して継代培養した。湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で７２時間静置培養した。最後に、各培養液の生菌数を計算した。
実施形態４
アスコルビン酸とリンゴ酸緩衝液の組み合わせ、アスコルビン酸と乳酸緩衝液の組み合わせ、アスコルビン酸とクエン酸緩衝液の組み合わせ、及びアスコルビン酸とリン酸緩衝液の組み合わせのヘリコバクターピロリに対する抗菌実験（生存率チェックポイント：0/20/40/60分、三回繰り返し）。
アスコルビン酸とリンゴ酸緩衝液の組み合わせ、アスコルビン酸と乳酸緩衝液の組み合わせ、アスコルビン酸とクエン酸緩衝液の組み合わせ、及びアスコルビン酸とリン酸緩衝液の組み合わせのヘリコバクターピロリに対する抗菌実験（生存率チェックポイント：0/20/40/60分、三回繰り返し）。
細菌株と培養方法
実験で使用された細菌株は、ヘリコバクターピロリ株26695（ATCC700392）であり、細菌はブルセラ固体培地（ブルセラブロス２８ｇ/L、寒天１５ｇ/L及び１０％（v/v）ウマ血清、ｐＨ7.0）で継代培養した。細菌を線画法で植菌した後、湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で７２時間培養した。
実験で使用された細菌株は、ヘリコバクターピロリ株26695（ATCC700392）であり、細菌はブルセラ固体培地（ブルセラブロス２８ｇ/L、寒天１５ｇ/L及び１０％（v/v）ウマ血清、ｐＨ7.0）で継代培養した。細菌を線画法で植菌した後、湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で７２時間培養した。
各培養液は、使用の準備のために０．２２μｍ注入型フィルターを通してろ過された。１０ｍｇ/ｍLのNaHCO3を含むブルセラブロスに７２時間継代培養したヘリコバクターピロリを添加し、細菌濃度を細菌溶液として１０７～１０８ CFU/ｍLに調整し、細菌溶液を各培養液と1：1で混合し、湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で培養した。
クエン酸緩衝液は、クエン酸とクエン酸ナトリウムをそれぞれのｐＨ値に応じて異なる比率で混合することにより調製し、調製不可能な部分は一定のｐＨ値に達するようにHClとNaOHにより調製した。リン酸緩衝液は、KH2PO4とNa2HPO4をそれぞれのｐＨ値に応じて異なる比率で混合することにより調製し、調製不可能な部分は一定のｐＨ値に達するようにHClとNaOHで調製した。培養液のｐＨ値をHClとNaOHで調製した。上記の方法を使用して各培養液を一定のｐＨ値に調整した後、一定濃度のアスコルビン酸を各培養液に追加した。細菌溶液及び各培養液の組成は以下の通りである。
細菌溶液：（ブルセラブロス28ｇ/L、NaHCO3 10 g / L、10 mM尿素）。
グループ1：M3V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリンゴ酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ2：M4V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリンゴ酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ3：M5V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリンゴ酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ4：L3V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 M乳酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ5：L4V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 M乳酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ6：L5V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 M乳酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ7：P3V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ8：P4V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ9：P5V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ10：C3V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ11：C4V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ12：C5V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
細菌溶液：（ブルセラブロス28ｇ/L、NaHCO3 10 g / L、10 mM尿素）。
グループ1：M3V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリンゴ酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ2：M4V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリンゴ酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ3：M5V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリンゴ酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ4：L3V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 M乳酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ5：L4V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 M乳酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ6：L5V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 M乳酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ7：P3V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ8：P4V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ9：P5V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ10：C3V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ3.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ11：C4V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ4.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
グループ12：C5V3000（ブルセラブロス28ｇ/L、0.1 Mクエン酸緩衝液及び10 mM尿素、ｐＨ5.0）+（6000ｍｇ/LビタミンC）。
生存率チェックポイント（0/20/40/60分）に従って培養した各培養液を生理食塩水で10倍に連続希釈した後、各倍率で希釈した細菌溶液をブルセラ固体培地に塗布して継代培養した。湿式嫌気槽において微好気性バッグ（Genbox microaer、BioMerieux、96125）を使用し、３７℃で７２時間静置培養した。最後に、各培養液の生菌数を計算した。
Ｖ、実験結果
実施形態１
実施形態１の結果を表１と図１に示す。
実施形態１
実施形態１の結果を表１と図１に示す。
実施形態２
実施形態２の結果を表２と図２に示す。
実施形態２の結果を表２と図２に示す。
実施形態３
実施形態３の結果を表３と図３に示す。
実施形態３の結果を表３と図３に示す。
実施形態４
実施形態４の結果を表４と図４に示す。
実施形態４の結果を表４と図４に示す。
実施形態１の結果から、本発明のｐＨ値が５未満のクエン酸緩衝液の組み合わせは、尿素と重炭酸塩環境において有意な殺菌効果を有することが分かる。通常、クエン酸はヘリコバクターピロリに対する殺菌効果を示さないだけでなく、完全に逆の効果があることを考えている（参考文献Ｄ（１２）の１７６６ページ、左列、第２６～３５行及び図１参照）。参考文献Ｄ（１２）は、クエン酸がヘリコバクターピロリのウレアーゼ活性を著しく高めることを開示しており、環境のｐＨ値は重大な要因ではない。本発明において、ｐＨ値が５未満のクエン酸緩衝液の組み合わせは、ヘリコバクターピロリに対する殺菌剤の組み合わせ成分として使用される。これは、クエン酸が、ｐＨ値が５未満の尿素と重炭酸塩環境でヘリコバクターピロリを殺菌するための成分として初めて使用され、殺菌効果を示すため、本発明は新規性と進歩性を有する。また、実施形態１のN3V3000、N4V3000、N5V3000から見れば、尿素と重炭酸塩環境において、アスコルビン酸を単独で使用すると、ヘリコバクターピロリを殺菌する効果がない。
実施形態１と２の結果から、５未満のｐＨ値を有するクエン酸緩衝液の組み合わせに加えたアスコルビン酸は、尿素と重炭酸塩環境における有意な「用量依存性」の殺菌効果を示すことがわかる。更に、C3とC3V3000、C4とC4V3000、及びC3V6000とC3V9000を比較すると、アスコルビン酸がクエン酸緩衝液の組み合わせに対する殺菌に重要な「相乗効果」を示すことがわかる。
逆に、リン酸緩衝液の組み合わせ又は水は、尿素と重炭酸塩の存在下では殺菌効力を示さない。更に、上記の二つのシステムにアスコルビン酸を添加しても、殺菌効果も相乗効果もない。
実施形態１の実験結果によれば、異なる濃度のアスコルビン酸とｐＨ３でのクエン酸緩衝液の組み合わせの抗菌実験を実施例２で実施して、異なる濃度のアスコルビン酸の殺菌及び相乗効果を検証し、２０分以内に殺菌力の最適濃度を確認する。C3V9000は６０分で効果的に滅菌した。
殺菌力は、通常、特定の培養時間での接種密度に対するコロニー形成単位の数が９９.９％に減少して定義される。通常は２０～２４時間を必要がある（参考文献Ｄ（１３）を参照）。
図２の実施形態２の生菌数は、７Ｌｏｇ１０（ＣＦＵ／ｍＬ）～３Ｌｏｇ１０（ＣＦＵ ／ｍＬ）に減少し、言い換えると、９９．９％の殺菌効果を達成する。ｐＨ＝３での異なる濃度のアスコルビン酸の殺菌相乗効果に関して、C3（アスコルビン酸なし）は、６０分以内に細菌を効果的に殺菌することができない。一方、C3V3000（3000ｍｇ/Ｌのアスコルビン酸）は６０分以内に細菌を効果的に殺し、C3V6000（6000ｍｇ/Ｌのアスコルビン酸）は、４０分以内に細菌を効果的に殺し、C3V9000（9000ｍｇ/Ｌのアスコルビン酸）は、２０分以内に細菌を効果的に殺し、実際には60分以内にすべての細菌を本質的に除去する（滅菌する）。本発明の殺菌組成物中のアスコルビン酸の濃度は、人体の推奨される一日摂取量の上限を満たしている限り、更に高くてもよい（１日あたり約２ｇ）。本発明における緩衝液の標準量は１０００ｍＬであるため、３０００ｐｐｍのアスコルビン酸は、１０００ｍＬの緩衝液中の３ｇのアスコルビン酸に相当する。その結果、実際の適用量が200 ｍＬの場合、アスコルビン酸の濃度が３０００ｐｐｍである時、２００ｍLの緩衝液に0.6ｇのアスコルビン酸があり、アスコルビン酸の濃度が１００００ｐｐｍの場合である時、２００ｍＬの緩衝液に２ｇのアスコルビン酸がある。
実施形態１と２は、ｐＨ値が５未満のクエン酸緩衝液の組み合わせに加えたアスコルビン酸は、尿素と重炭酸塩環境で殺菌効果を示し、殺菌効果が「用量依存性」を示し、アスコルビン酸がクエン酸緩衝液の組み合わせに対する殺菌は、有意な相乗効果を有する。更に、本発明の殺菌組成物は、ｐＨ＝３で重炭酸塩（ＨＣＯ３
―）を吸収するためのより大きな緩衝容量を有し（参考文献Ｄ（１４）参照）、滅菌効果がより効果的である。従って、本発明は新規性と進歩性を有する。
実施形態３と４の結果から、本発明のｐＨ値が５未満のリンゴ酸緩衝液の組み合わせは、尿素と重炭酸塩環境でも殺菌効果を有することがわかる。通常、リンゴ酸はヘリコバクターピロリに対して殺菌効果を示さないだけでなく、クエン酸とリンゴ酸の両方が酸中のヘリコバクターピロリのウレアーゼ活性を強化するという完全に逆の効果も有すると考えられる（参考文献Ｄ（１５）の「結論」及び図１～２参照）。しかし、本発明では、ｐＨ値が５未満のクエン酸又はリンゴ酸緩衝液の組み合わせは、ヘリコバクターピロリに対する殺菌剤の組み合わせ成分として使用される。クエン酸又はリンゴ酸は、ｐＨ値が５未満の尿素と重炭酸塩環境でヘリコバクターピロリを殺菌するための成分として初めて使用され、実際に有意な殺菌効果を示す。従って、本発明は新規性と進歩性を有する。
さらに、実施形態３と４を比較することにより、クエン酸又はリンゴ酸緩衝液の組み合わせに対するアスコルビン酸の滅菌効果は有意な「相乗効果」を示すことが観察できる。
逆に、リン酸緩衝液の組み合わせ又は水は、尿素と重炭酸塩の存在下では殺菌効果を示さず、アスコルビン酸を添加しても殺菌効果も相乗効果もない。
５未満のｐＨ値を有するクエン酸又はリンゴ酸緩衝液の組み合わせは、尿素と重炭酸塩環境に添加されたアスコルビン酸に関連する有意な「用量依存性」の殺菌効果を有する。
実施形態におけるC3、C3V3000、C4V3000、M3、M3V3000、及びM4V3000の結果によると、５未満のｐＨ値を有する緩衝液組み合わせが６０分後に測定されたｐＨ値と殺菌結果が観察できることを実証する。
ヘリコバクターピロリのｐＨ値とアスコルビン酸オキシダーゼ活性の相関性を示す参考文献（Ｄ（１６）の２９２ページの図３参照）によると、ヘリコバクターピロリには二つのアスコルビン酸オキシダーゼがある。それらは、間質性アスコルビン酸オキシダーゼと膜内アスコルビン酸オキシダーゼである。この相関性は、二種類のアスコルビン酸オキシダーゼがｐＨ４～５で弱い活性（参考文献Ｄ（１６）の図３参照）、アスコルビン酸の滅菌に有利であることを示す（６０分後のｐＨ値もこの範囲内に維持される、前の段落［００６７］、図２及び表２参照）。
クエン酸とリンゴ酸の両方がアスコルビン酸オキシダーゼ活性に対する阻害効果を示すため、５未満のｐＨ値でアスコルビン酸が消毒に対して相乗効果を著しく発揮できる有利な環境が確立される。一方、リン酸緩衝液の組み合わせと水コントロール群の両方は、アスコルビン酸を添加しても、アスコルビン酸オキシダーゼ活性に対する阻害効果を示さない（実施形態の図１～４及び表１～４参照、６０分後に測定されたｐＨ値と殺菌結果を示す実施形態１、２、３と４）。
ヘリコバクターピロリは、ウレアーゼとアスコルビン酸オキシダーゼの両方の強力な分解作用を示す数少ない微生物の一つであるため（参考文献Ｄ（１６）の表１参照）、ヘリコバクターピロリにはアスコルビン酸を分解する強力な能力がある。ヘリコバクターピロリとｐＨ値との関係は、参考文献Ｄ（１６）の図３に示されている。
本明細書の実験で示されているように、ヘリコバクターピロリの殺菌が難しい主な理由は、ヘリコバクターピロリの寄生環境が粘膜上皮細胞にあり、粘膜上皮細胞は環境塩素イオンによる交換誘導の結果として、重炭酸塩（HCO3
－）を分泌して制酸する（参考文献Ｄ（１９）の図２参照）。胃粘膜は、低いｐＨ粘膜微小環境において、ヘリコバクターピロリの移動性に不利になる（参考文献Ｄ（１７）の要約参照）が、この低ｐＨ粘液微小環境は、本発明の緩衝液組成物にとって有利である。即ち、胃粘膜の細菌を殺菌及び滅菌することに有利である。
本発明の緩衝液の組み合わせは、ｐＨ値が３に等しいとき、胃洞でｐＨ値が３未満に低下することにより、胃酸分泌を有益に抑制する（参考文献Ｄ（１８）の第４２２ページの「ｐＨの変化について」参照）。これに応じて塩化物イオンの分泌の終了につながる。胃での塩化物イオン分泌の一時的な終了により、上皮細胞から分泌される重炭酸塩も一時的に阻害される（参考文献Ｄ（１９）の図２参照）。したがって、上記の実際の条件下で細菌を殺菌及び滅菌することは更に有利である。
測定されたクエン酸のpKaは実際に３．１であり、クエン酸の標準ｐＫａは、文献において３．１２である（参考文献Ｄ（１４）参照）。したがって、クエン酸緩衝液の組み合わせは、用意された他の緩衝液の組み合わせと比較して、３に等しいｐＨ値で重炭酸塩（ＨＣＯ３
－）の吸収に役立ち、更に大きな緩衝容量を示す。
従って、ヘリコバクターピロリを効果的に殺菌及び滅菌するためには、ｐＨ値を３に設定することが重要であり、このｐＨ値条件で示される緩衝容量の大きさも重要である。更に、このｐＨ値条件でアスコルビン酸オキシダーゼ活性を効果的に阻害することも重要である。このｐＨ値条件でのアスコルビン酸の添加は、迅速な滅菌（相乗効果）の最も重要な要因である。実施形態１、２、３及び４の開始時、元のｐＨ値は３に設定されているが、粘膜微小環境に添加されたアスコルビン酸とクエン酸塩又はリンゴ酸塩緩衝液の組み合わせの実際のｐＨ値は、最終的に５未満に近づく傾向があり、ヘリコバクターピロリの殺菌と滅菌に有益であることが証明されている。
本発明のクエン酸又はリンゴ酸緩衝液の組み合わせ（ｐＨ= 3）は、緩衝液を維持するために胃洞におけるｐＨ値が、実際に３未満に維持することを目的として、緩衝液の詳細な組成によって調整することができる。胃洞の低いｐＨ環境（参考文献Ｄ（２０）の図１参照）は、胃酸分泌の抑制（つまり、塩化物イオン分泌の抑制）に有益である。胃洞のｐＨ値が３未満の場合、胃酸分泌が抑制される。本発明に係るクエン酸又はリンゴ酸緩衝液の組み合わせ（ｐＨ= 3）は、制酸剤又はプロトンポンプ阻害剤（PPI）の機能に似ているが、本発明によるｐＨ変化は、制酸剤又はPPIによるｐＨ変化とは全く異なる。本発明は、ｐＨ値の増加をもたらさないため、結果、上皮細胞による通常の継続的な重炭酸塩の分泌が一時的に抑制される（参考文献Ｄ（１８）参照）。これは、本発明のクエン酸塩又はリンゴ酸塩緩衝液の組み合わせが、低いｐＨ粘膜微小環境でヘリコバクターピロリを殺菌及び滅菌することに有利である。
胃粘膜の上皮細胞から分泌される重炭酸塩（HCO3
－）の濃度は、胃の塩化物イオンの濃度と正の相関がある（参考文献Ｄ（２１）の図４参照）。
実施形態１、２、３及び４において、注目すべき重要な結果は、粘膜上皮界面のｐＨ値の経時変化を示す「６０分後のｐＨ値」である。
実施形態２から見れば、本発明に係るｐＨ値が３に等しいクエン酸緩衝液の組み合わせ単独及びアスコルビン酸を添加したクエン酸緩衝液の組み合わせは、細菌を殺菌及び滅菌することができ、前者は細菌を６０分以内に滅菌し、後者は２０分以内に細菌を殺菌する。添加した重炭酸ナトリウム（NaHCO3）の量は、６０分後の粘膜上皮界面のｐＨ値を示している。更に、本発明の必要な緩衝容量は、重炭酸塩（HCO3
－）を効果的に吸収して粘膜微小環境のｐＨ値を６０分で５未満に保つことができることも表す。
上記の実施形態１、２及び４から見れば、本発明に係るｐＨ値が３に等しいアスコルビン酸を添加したクエン酸又はクエン酸緩衝液の組み合わせにおいて、アスコルビン酸は、粘液溶解特性（参考文献Ｄ（２３）の要約参照）と、胃粘膜を修復及び保護する機能（参考文献Ｄ（２２）の要約）とを有する。更に、アスコルビン酸は、本発明に係るｐＨ値が３に等しいクエン酸又はリンゴ酸緩衝液の組み合わせ単独に対して、急速滅菌の著しい効果及び顕著な相乗効果を示す。ｐＨが３未満のときに胃洞に胃酸分泌を阻害する（ｐＨ変化について、参考文献Ｄ（１８）の第４２２ページ参照）。これは、細菌の殺菌と滅菌に有利である。C3V9000（ｐＨ３のクエン酸緩衝液の組み合わせ及びアスコルビン酸）は、ヘリコバクターピロリを６０分以内に完全に滅菌することができるため、好ましい滅菌の組み合わせである。
本発明におけるクエン酸の選択理由は以下の通りである。
（１）ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）は、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼの活性に対する阻害効果を示している（参考文献Ｄ（１６）の図２参照）。
（２）DTEはC4H10O2S2の分子式を持つ直鎖で平面（2D）構造であり、クエン酸もC6H8O7の分子式を持つ直鎖で平面（2D）の構造である。クエン酸は６炭素分子であり、DTEは４炭素原子と２硫黄原子であり、6炭素分子に似ている。
（３）クエン酸は三つのカルボン酸官能基を有し、DTEよりもキレート化能力が強い。
（４）DTEは有毒なものであるが、クエン酸は食用できるものである。
（５）一般には、物理的と化学的特性及び立体効果の観点から見れば、クエン酸はヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼの活性に対して阻害効果を有する可能性がある。
（６）本願の実施形態１～４を図１～４と併せて見ると、クエン酸がピロリ菌のアスコルビン酸オキシダーゼの活性に抑制効果がある。これまでに発明されたことはない。
（７）以上、リン酸（非線形3D構造）の代わりにクエン酸を選択する重要な理由である。
（１）ジチオエリスリトール（ＤＴＥ）は、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼの活性に対する阻害効果を示している（参考文献Ｄ（１６）の図２参照）。
（２）DTEはC4H10O2S2の分子式を持つ直鎖で平面（2D）構造であり、クエン酸もC6H8O7の分子式を持つ直鎖で平面（2D）の構造である。クエン酸は６炭素分子であり、DTEは４炭素原子と２硫黄原子であり、6炭素分子に似ている。
（３）クエン酸は三つのカルボン酸官能基を有し、DTEよりもキレート化能力が強い。
（４）DTEは有毒なものであるが、クエン酸は食用できるものである。
（５）一般には、物理的と化学的特性及び立体効果の観点から見れば、クエン酸はヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼの活性に対して阻害効果を有する可能性がある。
（６）本願の実施形態１～４を図１～４と併せて見ると、クエン酸がピロリ菌のアスコルビン酸オキシダーゼの活性に抑制効果がある。これまでに発明されたことはない。
（７）以上、リン酸（非線形3D構造）の代わりにクエン酸を選択する重要な理由である。
本発明におけるリンゴ酸の選択理由は以下の通りである。
（１）ジチオエリスリトール（DTE）は、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼの活性に対する阻害効果を示している（参考文献Ｄ（１６）の図２参照）。
（２）DTEはC4H10O2S2の分子式を持つ直鎖で平面（2D）構造であり、リンゴ酸は、クエン酸と似ているC4H6O5の分子式を持つ直鎖で平面（2D）の構造である。リンゴ酸は４炭素分子であり、DTEは４炭素原子と２硫黄原子であり、6炭素分子に似ている。
（３）リンゴ酸は、強力なキレート化能力を持つ二つのカルボン酸官能基を有する。
（４）DTEは有毒なものであるが、リンゴ酸は食用できるものである。
（５）一般には、物理的と化学的特性及び立体効果の観点から見れば、リンゴ酸はヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼの活性に対して阻害効果を有する可能性がある。
（６）本願の実施形態３～４を図３～４と併せて見ると、リンゴ酸がピロリ菌のアスコルビン酸オキシダーゼの活性に抑制効果がある。これまでに発明されたことはない。
（７）以上、リン酸（非線形3D構造）の代わりにリンゴ酸を選択する重要な理由である。
（１）ジチオエリスリトール（DTE）は、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼの活性に対する阻害効果を示している（参考文献Ｄ（１６）の図２参照）。
（２）DTEはC4H10O2S2の分子式を持つ直鎖で平面（2D）構造であり、リンゴ酸は、クエン酸と似ているC4H6O5の分子式を持つ直鎖で平面（2D）の構造である。リンゴ酸は４炭素分子であり、DTEは４炭素原子と２硫黄原子であり、6炭素分子に似ている。
（３）リンゴ酸は、強力なキレート化能力を持つ二つのカルボン酸官能基を有する。
（４）DTEは有毒なものであるが、リンゴ酸は食用できるものである。
（５）一般には、物理的と化学的特性及び立体効果の観点から見れば、リンゴ酸はヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼの活性に対して阻害効果を有する可能性がある。
（６）本願の実施形態３～４を図３～４と併せて見ると、リンゴ酸がピロリ菌のアスコルビン酸オキシダーゼの活性に抑制効果がある。これまでに発明されたことはない。
（７）以上、リン酸（非線形3D構造）の代わりにリンゴ酸を選択する重要な理由である。
ヘリコバクターピロリの抗生物質耐性の増加について、本発明の緩衝液組成物（クエン酸又はリンゴ酸緩衝液の組み合わせ及びアスコルビン酸）は、人工的に合成されるのではなく、自然からの殺菌性の組み合わせである。ヘリコバクターピロリの抗生物質耐性は、ヘリコバクターピロリが遺伝子交換又は染色体突然変異を介して抗生物質耐性を発現する能力によるものである（参考文献Ｄ（２４）及び参考文献Ｄ（２５）参照）。ヘリコバクターピロリは、複製中に自然に遺伝子変異を生成する可能性があり、このプロセス中に抗生物質を同時に使用すると、抗生物質耐性変異体を生成しやすく、同時に複製しやすくなる（参考文献Ｄ（２４）及び参考文献Ｄ（２５）参照）。ヘリコバクターピロリは、ｐＨ６～８の環境で分裂及び増殖する。この環境において、抗生物質が細菌を効果的に殺菌ための最適なｐＨ環境でもあるため、ヘリコバクターピロリの抗生物質耐性の増加の主な原因となる（参考文献（Ｄ）６参照）。本発明の緩衝液組成物（クエン酸又はリンゴ酸緩衝液の組み合わせ及びアスコルビン酸）は、主にｐＨ値＝３の環境で細菌を殺菌するため、ヘリコバクターピロリは一般に低いｐＨ環境（ｐＨ値５未満）で分裂及び増殖しなく、抗生物質耐性変異体を生成する可能性は低くなる。従って、ヘリコバクターピロリは、本発明によるｐＨ環境で分裂して繁殖することはなく、抗生物質耐性変異体を生成することは不可能である。
本発明の非医薬殺菌組成物は、抗生物質成分を含まないので、ヒトの医薬品として使用する場合、原則として薬剤耐性及び食品安全性の懸念は無いはずである。
実施例
１、ヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物であって、クエン酸、リンゴ酸又はそれらの組み合わせである第一の毎日の食用成分であって、水溶液状態において、分子状態と解離状態を有し、前記分子状態は、ｐＨ値が５未満の環境で、ヘリコバクターピロリを殺し、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する機能を実行する前記第一の毎日の食用成分と、重炭酸塩を中和するための、クエン酸、リンゴ酸又はそれらの組み合わせである第二の毎日の食用成分と、アスコルビン酸である第三の毎日の食用成分であって、前記第一の毎日の食用成分、前記第二の毎日の食用成分及び塩の存在下で、ヘリコバクターピロリをより完全に殺菌する前記第三の毎日の食用成分と、を含む。
１、ヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物であって、クエン酸、リンゴ酸又はそれらの組み合わせである第一の毎日の食用成分であって、水溶液状態において、分子状態と解離状態を有し、前記分子状態は、ｐＨ値が５未満の環境で、ヘリコバクターピロリを殺し、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する機能を実行する前記第一の毎日の食用成分と、重炭酸塩を中和するための、クエン酸、リンゴ酸又はそれらの組み合わせである第二の毎日の食用成分と、アスコルビン酸である第三の毎日の食用成分であって、前記第一の毎日の食用成分、前記第二の毎日の食用成分及び塩の存在下で、ヘリコバクターピロリをより完全に殺菌する前記第三の毎日の食用成分と、を含む。
２、実施例1の非医薬殺菌組成物において、前記アスコルビン酸が３０００ｐｐｍ～１００００ｐｐｍの範囲の濃度を有する。
３、実施例1～２のいずれかの非医薬殺菌組成物において、前記アスコルビン酸が９０００ｐｐｍの濃度を有する。
４、実施例1～３のいずれかの非医薬殺菌組成物において、前記塩がクエン酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム又はそれらの組み合わせである。
５、ヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物であって、重炭酸塩を中和するための、有機酸とその塩からなる緩衝液の組み合わせである第一の毎日の食用成分であって、ｐＨ値が５未満の環境で、ヘリコバクターピロリを殺し、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する機能を実行し、前記有機酸がクエン酸、リンゴ酸またはそれらの組み合わせである前記第一の毎日の食用成分と、アスコルビン酸である第二の毎日の食用成分であって、前記第一の毎日の食用成分の存在下で、ヘリコバクターピロリをより完全に殺菌する前記第二の毎日の食用成分と、を含む前記非医薬殺菌組成物である。
６、実施例５の非医薬殺菌組成物において、前記非医薬殺菌組成物は、５未満のｐＨ値を有する。
７、実施例５～６の非医薬殺菌組成物において、前記非医薬殺菌組成物は、３から５の範囲のｐＨ値を有する。
８、実施例５～７のいずれかの非医薬殺菌組成物において、前記非医薬殺菌性組成物は、３のｐＨ値を有する。
９、ヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物であって、クエン酸、リンゴ酸又はそれらの組み合わせである第一の毎日の食用成分であって、水溶液状態において、分子状態と解離状態を有し、前記分子状態は、ｐＨ値が５未満の環境で、ヘリコバクターピロリを殺し、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する機能を実行する前記第一の毎日の食用成分と、塩である第二の毎日の食用成分であって、重炭酸塩を中和し、前記第一の毎日の食用成分と緩衝液の組み合わせを形成するために使用され、ヘリコバクターピロリの効果的な殺滅を継続して、前記ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する前記第二の毎日の食用成分と、を含む前記非医薬殺菌組成物である。
１０、実施例９の非医薬殺菌組成物において、前記非医薬殺菌性組成物は、３のｐＨ値を有する。
１１、実施例９～１０の非医薬殺菌組成物において、前記塩がクエン酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム又はそれらの組み合わせである。
１２、実施例９～１１のいずれかの非医薬殺菌組成物において、前記第一の毎日の食用成分及び前記第二の毎日の食用成分の存在下で、ヘリコバクターピロリをより徹底的に殺菌するためのアスコルビン酸を更に含む。
１３、ヘリコバクターピロリ感染の治療方法であって、第一の毎日の食用成分と第二の毎日の食用成分を含む非医薬品殺菌組成物を提供するステップであって、前記第一の毎日の食用成分が水溶液状態において、分子状態と解離状態を有し、前記分子状態は、ｐＨ値が５未満の環境で、ヘリコバクターピロリを殺し、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する機能を実行し、前記第一の毎日の食用成分がクエン酸、リンゴ酸、又はそれらの組み合わせであり、前記第二の毎日の食用成分が塩であり、前記塩がクエン酸の塩、リンゴ酸の塩、又はそれらの組み合わせであり、前記第二の毎日の食用成分が重炭酸塩を中和し、前記第一の毎日の食用成分と緩衝液の組み合わせを形成するために使用され、前記ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する前記ステップと、非医薬品殺菌組成物を哺乳動物に投与するステップと、を含む前記方法である。
１４、実施例１３の治療方法において、前記アスコルビン酸が３０００ｐｐｍ～１００００ｐｐｍの範囲の濃度を有する。
１５、実施例１３～１４の治療方法において、前記アスコルビン酸が９０００ｐｐｍの濃度を有する。
１６、実施例１３～１５のいずれかの治療方法において、前記非医薬殺菌組成物は、５未満のｐＨ値を有する。
１７、実施例１３～１６のいずれかの治療方法において、非医薬殺菌組成物は、３から５の範囲のｐＨ値を有する。
１８、実施例１３～１７のいずれかの治療方法において、前記非医薬殺菌性組成物は、３のｐＨ値を有する。
１９、実施例１３～１８のいずれかの治療方法において、前記第一の毎日の食用成分及び前記第二の毎日の食用成分の存在下で、ヘリコバクターピロリをより徹底的に殺菌するためのアスコルビン酸を更に含む。
２０、実施例１３～１９のいずれかの治療方法において、前記哺乳動物がヒトである。
２１、重炭酸塩及び尿素の存在下でｐＨ値が５未満の環境でのヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物であって、クエン酸、リンゴ酸又はそれらの組み合わせである第一成分であって、水溶液状態において、分子状態と解離状態を有し、前記分子状態は、ｐＨ値が５未満の環境で、ヘリコバクターピロリを殺菌し、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する機能を実行する前記第一成分と、前記第一成分と緩衝組成物を形成し、重炭酸塩を中和するための、クエン酸、リンゴ酸又はそれらの組み合わせである第二成分であって、前記第一成分のヘリコバクターピロリへの殺菌を効果的に継続させ、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する前記第二成分と、を含む前記非医薬殺菌組成物である。
２２、実施例２１の非医薬殺菌組成物において、前記非医薬殺菌組成物は、アスコルビン酸である第三成分を更に含み、前記第三成分は、殺菌の相乗効果と、前記アスコルビン酸の濃度に関連する用量依存性により、前記第一成分及び前記第二成分の存在下でヘリコバクターピロリを滅菌する。
２３、実施例２１又は２２の非医薬殺菌組成物において、前記アスコルビン酸が３０００ｐｐｍ～１００００ｐｐｍの範囲の濃度を有する。
２４、実施例２１又は２２の非医薬殺菌組成物において、前記アスコルビン酸が９０００ｐｐｍの濃度を有する。
２５、実施例２１～２４のいずれかの非医薬殺菌組成物において、前記塩がクエン酸ナトリウム、リンゴ酸ナトリウム又はそれらの組み合わせである。
２６、実施例２１～２５のいずれかの非医薬殺菌組成物において、３から５の範囲のｐＨ値を有する。
２７、実施例２１～２５のいずれかの非医薬殺菌組成物において、３のｐＨ値を有する。
２８、重炭酸塩及び尿素の存在下でｐＨ値が５未満の環境で非医薬殺菌組成物を使用することによりヘリコバクターピロリを殺菌する方法であって、第一成分及び第二成分を含む緩衝組成物を用意するステップであって、前記第一成分はクエン酸、リンゴ酸又はそれらの組み合わせであり、前記第二成分はクエン酸塩、リンゴ酸塩又はそれらの組み合わせである前記ステップと、前記緩衝組成物を哺乳動物に投与するステップと、を含む前記方法である。
２９、実施例２８の方法において、前記非医薬殺菌組成物は、アスコルビン酸である第三成分を更に含み、前記第三成分は、殺菌の相乗効果と、前記アスコルビン酸の濃度に関連する用量依存性により、前記第一成分及び前記第二成分の存在下でヘリコバクターピロリを滅菌する。
３０、実施例２８又は２９の方法において、前記アスコルビン酸が３０００ｐｐｍ～１００００ｐｐｍの範囲の濃度を有する。
３１、実施例２８又は２９の方法において、前記アスコルビン酸が９０００ｐｐｍの濃度を有する。
３２、実施例２８～３１のいずれかの非医薬殺菌組成物において、前記緩衝組成物が３～５の範囲のｐＨ値を有する。
３３、実施例２８～３１のいずれかの非医薬殺菌組成物において、前記緩衝組成物が３のｐＨ値を有する。
３４、実施例２８～３３のいずれかの非医薬殺菌組成物において、前記哺乳動物がヒトである。
以上の説明によると、当業者であれば本発明の技術思想を逸脱しない範囲で、多様な変更及び修正が可能であることが分かる。従って、本発明の技術的な範囲は、明細書の詳細な説明に記載された内容に限らず、特許請求の範囲によって定めなければならない。
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Claims (2)
- 重炭酸塩及び尿素の存在下でｐＨ値が５未満の環境でのヘリコバクターピロリに対する非医薬殺菌組成物であって、
クエン酸、リンゴ酸又はそれらの組み合わせである第一成分であって、水溶液状態において、分子状態と解離状態を有し、前記分子状態は、ｐＨ値が５未満の環境で、ヘリコバクターピロリを殺菌し、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する機能を実行する、前記第一成分と、
前記第一成分と緩衝組成物を形成し、重炭酸塩を中和するための、クエン酸塩、リンゴ酸塩又はそれらの組み合わせである第二成分であって、前記第一成分のヘリコバクターピロリへの殺菌を効果的に継続させ、ヘリコバクターピロリのアスコルビン酸オキシダーゼ活性を阻害する、前記第二成分と、
３０００ｐｐｍ～１００００ｐｐｍの範囲の濃度を有するアスコルビン酸である第三成分であって、殺菌の相乗効果と、前記アスコルビン酸の濃度に関連する用量依存性により、前記第一成分及び前記第二成分の存在下でヘリコバクターピロリを滅菌する、前記第三成分と、
を含むことを特徴とする前記非医薬殺菌組成物。 - 前記クエン酸塩がクエン酸ナトリウムであり、前記リンゴ酸塩がリンゴ酸ナトリウムであることを特徴とする請求項１に記載の非医薬殺菌組成物。
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