JP7065516B2 - アミロイドベータのｎ末端エピトープおよびそれに対する立体配座選択的抗体 - Google Patents

アミロイドベータのｎ末端エピトープおよびそれに対する立体配座選択的抗体 Download PDF

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Description

（関連出願）
これは２０１５年１１月９日に出願された米国特許出願第６２／２５３０４４号、２０１６年５月４日に出願された米国特許出願第６２／３３１，９２５号、２０１６年７月２２日に出願された米国特許出願第６２／３６５，６３４号および２０１６年９月１２日に出願された米国特許出願第６２／３９３，６１５号の優先権の利益を主張するＰＣＴ出願であり、上記の出願はそれぞれ参照により本明細書に組み込まれる。
（分野）
本開示は、Ｎ末端アミロイドベータ（ＡベータまたはＡβ）エピトープおよびそれに対する抗体、より具体的には、例えばＡベータオリゴマー内で選択的に接触可能な立体配座Ａベータエピトープおよび関連する抗体組成物に関する。
（背景）
３６～４３アミノ酸のペプチドとして存在するアミロイドベータ（Ａベータ）は、酵素であるβセクレターゼおよびγセクレターゼによってアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）から放出される産物である。アルツハイマー病（ＡＤ）患者では、Ａベータは可溶性モノマー、不溶性線維および可溶性オリゴマーの形で存在し得る。モノマー型のＡベータは、主として不定形のポリペプチド鎖として存在する。線維型のＡベータは、よく株と呼ばれる様々な形態に凝集することができる。これらの構造のうちのいくつかは固体ＮＭＲにより決定されている。
例えば、原子分解三次元構造データの結晶学的データベースであるタンパク質データバンク（ＰＤＢ）では、３回対称性のＡβ構造（ＰＤＢエントリー２Ｍ４Ｊ）、Ａβ－４０モノマーの２回対称性構造（ＰＤＢエントリー２ＬＭＮ）およびＡβ－４２モノマーの一本鎖平行ｉｎ－ｒｅｇｉｓｔｅｒ構造（ＰＤＢエントリー２ＭＸＵ）を含めたいくつかの線維の株の構造が入手可能である。
２Ｍ４Ｊの構造はＬｕら［８］に報告されており、２ＭＸＵの構造はＸｉａｏら［９］に報告されている。２ＬＭＮの構造はＰｅｔｋｏｖａら［１０］に報告されている。
Ａベータオリゴマーは、培養した細胞系およびニューロンを死滅させ、脳スライス培養物および動物生体において記憶を促進し長期増強（ＬＴＰ）と呼ばれる極めて重要なシナプス活性を遮断することが示されている。
これまでにオリゴマーの構造は決定されていない。さらに、ＮＭＲおよびその他の証拠から、オリゴマーが単一の明確に定められた構造ではなく、規則性に乏しく立体配座的に可塑性で順応性のある構造アンサンブルの形で存在することがわかっている。さらに、毒性オリゴマー種の濃度はモノマーまたは線維の濃度よりはるかに低い（推定値には幅があるが、約１０００分の１またはそれ以下である）ため、この標的は捉えどころのないものとなっている。
Ａベータと結合する抗体が記載されている。
米国特許第７，７８０，９６３号の抗ＡＤＤＬ抗体は、Ａベータ由来拡散性リガンドの多次元立体配座を区別して認識する抗体に関するものである。
米国特許第９，１７６，１５１号には、患者の生体試料中のＡβオリゴマーを検出するための選択的抗Ａβオリゴマー抗体、キットおよび対の抗Ａβオリゴマー抗体を用いる免疫測定法が記載されている。
「Ａｎｔｉ－ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｕｓｅ」と題する国際公開第２００３０７０７６０号は、β－Ａ４ペプチドの２つの領域を特異的に認識することが可能な抗体分子であって、第一の領域がアミノ酸配列ＡＥＦＲＨＤＳＧＹまたはそのフラグメントを含み、第二の領域がアミノ酸配列ＶＨＨＱＫＬＶＦＦＡＥＤＶＧまたはそのフラグメントを含む抗体分子に関するものである。
「Ｈｕｍａｎｉｚｅｄ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｆｏｒ ｕｓｅ ｉｎ ｉｍｐｒｏｖｉｎｇ ｃｏｇｎｉｔｉｏｎ」と題する国際公開第２００６０６６０８９号は、ベータアミロイドによる疾患の治療のための改善された薬剤および方法、特に、Ａβペプチドと特異的に結合しアミロイド原性障害（例えば、ＡＤ）による斑の量を減少させる効果のあるモノクローナル抗体１２Ａ１１の同定および特徴付けに関するものである。
「Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ａｇａｉｎｓｔ ａｍｙｌｏｉｄ ｂｅｔａ ４ ｗｉｔｈ ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｅｄ ｉｎ ｔｈｅ ｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎ」と題する国際公開第２００７０６８４２９号は、少なくとも１つの抗原結合部位が重鎖（ＶＨ）の可変領域にグリコシル化アスパラギン（Ａｓｎ）を含むことを特徴とする精製抗体分子調製物に関するものである。
Ｙｕらは、ＰＡＤＲＥまたは毒素由来担体タンパク質と融合した六価の折畳み型Ａβ１－１５（６Ａβ１５）について記載している。Ｗａｎｇら（２０１６）は、この抗体の末梢投与により老年性アルツハイマー病のトランスジェニック動物モデルのアルツハイマー病様病態および認知低下が軽減されることを報告している［１１］、［１２］。
Ａベータのモノマーもしくは線維またはモノマーと線維の両方よりもＡベータオリゴマーと優先的または選択的に結合する抗体が望ましい。
本明細書には、残基ＨＤＳＧ（配列番号１）を含むおよび／またはこれよりなるＡベータのエピトープ、より具体的には立体配座エピトープまたは関連エピトープならびに前記エピトープと特異的かつ／または選択的に結合する抗体が記載される。エピトープは、オリゴマー種をモノマーおよび／または線維のものから区別する立体配座のＡベータのオリゴマー種において選択的に露出され得る。
一態様は、環状化合物、好ましくは、ＨＤＳと最大６個のＡベータの連続する残基とを含むＡベータペプチドと、リンカーとを含み、リンカーが、ＡベータペプチドのＮ末端残基およびＡベータのＣ末端残基と共有結合している、環状化合物を含む。
一実施形態では、Ａベータペプチドは、任意選択でＨＤＳＧ（配列番号１）、ＨＤＳＧＹ（配列番号４）、ＨＤＳＧＹＥ（配列番号１１）、ＲＨＤＳＧＹ（配列番号１３）、ＲＨＤＳＧ（配列番号５）、ＲＨＤＳ（配列番号６）およびＤＳＧＹ（配列番号１４）から選択される、配列番号１～１６のいずれか１つの配列を有するペプチドから選択される。
別の実施形態では、環状化合物は環状ペプチドである。
別の実施形態では、本明細書に記載される環状化合物は、ｉ）対応する直鎖状化合物におけるＤまたはＳと比較して、化合物中のＤおよび／またはＳの曲率の少なくとも１０％、少なくとも２０％または少なくとも３０％の増大；ｉｉ）Ｈ、ＤおよびＳから選択される少なくとも１つの残基であって、前記残基の少なくとも１つの二面角が、対応する直鎖状化合物における対応する二面角と比較して少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度または少なくとも８０度異なる残基；ｉｉｉ）対応する直鎖状化合物における対応する二面角と比較して少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度または少なくとも８０度異なるＤのＯ－Ｃ－Ｃα－Ｃβ二面角；ならびに／あるいはｉｖ）エントロピーによって測定され、対応する直鎖状化合物と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％、少なくとも４０％強く拘束されたＨおよび／またはＤの立体配座を含む。
別の実施形態では、Ａベータペプチドは、ＨＤＳＧ（配列番号１）、ＨＤＳＧＹ（配列番号４）およびＲＨＤＳＧ（配列番号５）から選択される。
別の実施形態では、化合物は、検出可能な標識をさらに含む。
別の実施形態では、リンカーは、１～８個のアミノ酸および／またはこれと同等に機能する分子および／または１つもしくは複数の官能化可能な部分を含む、あるいはこれよりなる。
別の実施形態では、リンカーのアミノ酸がＡおよびＧから選択され、かつ／または官能化可能な部分がＣである。
別の実施形態では、リンカーは、アミノ酸ＧＣＧもしくはＣＧＣを含む、またはこれよりなる。
別の実施形態では、リンカーはＰＥＧ分子を含む。
別の実施形態では、環状化合物は、図１１Ｂに示される構造から選択される。
一態様は、本明細書に記載される環状化合物を含む、免疫原を含む。
一実施形態では、化合物は、担体タンパク質または免疫原性増強物質と結合している。
別の実施形態では、担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、または免疫原性増強物質がキーホールキーホールリンペットヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ Ｋｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈａｅｍｏｃｙａｎｉｎ（ＫＬＨ））である。
一態様は、本明細書に記載される化合物または本明細書に記載される免疫原を含む、組成物を含む。
一実施形態では、本明細書に記載される組成物を構成する免疫原は、アジュバントをさらに含む。
別の実施形態では、アジュバントはリン酸アルミニウムまたは水酸化アルミニウムである。
一態様は、任意選択で配列番号１～１６のいずれか１つで示される配列ＨＤＳＧ（配列番号１）または関連エピトープ配列を有するＡベータペプチドと特異的に結合する、単離された抗体を含む。
一実施形態では、抗体は、Ａベータ上のエピトープと特異的に結合し、エピトープは、抗体との結合に主として関与する少なくとも２個の連続するアミノ酸残基を含み、少なくとも２個の連続するアミノ酸は、ＨＤＳ内に組み込まれたＤＳである、または少なくとも２個の連続するアミノ酸は、ＨＤＳ内に組み込まれたＨＤである。
別の実施形態では、エピトープは、ＨＤＳ、ＤＳＧ、ＨＤＳＧ（配列番号１）、ＨＤＳＧＹ（配列番号４）、ＨＤＳＧＹＥ（配列番号１１）、ＲＨＤＳＧＹ（配列番号１３）、ＲＨＤＳＧ（配列番号５）、ＲＨＤＳ（配列番号６）およびＤＳＧＹ（配列番号１４）を含む、またはこれよりなる。
別の実施形態では、抗体は環状化合物内、任意選択で、本明細書に記載される環状化合物内、好ましくは配列番号２または１２で示される配列を有する環状ペプチド内で提示されるＨＤＳＧ（配列番号１）または関連エピトープペプチドと特異的または選択的に結合する、立体配座に特異的かつ／または選択的な抗体である。
別の実施形態では、抗体は、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維よりもＡベータオリゴマーと選択的に結合する。
別の実施形態では、Ａベータオリゴマーに対する選択性は、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍選択的である。
別の実施形態では、抗体は、配列ＨＤＳＧ（配列番号１）または関連エピトープを含む直鎖状ペプチドと特異的かつおよび／または選択的に結合することがなく、任意選択で、直鎖状ペプチドの配列は、抗体を生じさせるのに使用する環状化合物の直鎖型、任意選択で配列番号２または１２で示される配列を有する直鎖状ペプチドである。
別の実施形態では、抗体は、ｉｎ ｓｉｔｕでＡベータモノマー斑および／またはＡベータ線維斑に結合しない、またはほとんど結合しない。
別の実施形態では、抗体はモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である。
別の実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
別の実施形態では、抗体は、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディおよびその多量体から選択される抗体結合フラグメントである。
別の実施形態は、任意選択で融合している軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域は、相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのアミノ酸配列は以下の配列を含む：
Figure 0007065516000001
別の実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号２４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲの配列が配列番号１７、１８および１９で示される、アミノ酸配列；またはｉｉｉ）保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を含む重鎖可変領域を含む。
別の実施形態では、抗体は、ｉ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号２６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲの配列が配列番号２０、２１および２２で示される、アミノ酸配列；またはｉｉｉ）保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。
別の実施形態では、重鎖可変領域のアミノ酸配列が、配列番号２３で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされ；かつ／あるいは、抗体が、配列番号２５で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくはコドン最適化型によってコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。
別の実施形態では、重鎖可変領域が、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなり、かつ／または、軽鎖可変領域が、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなる。
別の実施形態では、抗体は、ヒトＡベータとの結合に関して、表１０に記載されるＣＤＲ配列を含む抗体と競合する。
一実施形態では、本明細書に記載される環状化合物または免疫原を用いて抗体を調製する。
一態様は、本明細書に記載される抗体と、検出可能な標識または細胞毒性物質とを含む、イムノコンジュゲートを含む。
一実施形態では、検出可能な標識は、任意選択でＰＥＴ撮像などの対象の撮像に使用する、陽電子放出放射性核種を含む。
一態様は、任意選択で希釈剤とともに、本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートを含む。
一態様は、本明細書に記載される化合物もしくは免疫原のタンパク質性部分、本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるタンパク質性イムノコンジュゲートをコードする、核酸分子を含む。
一態様は、本明細書に記載されるベクターを含む。
一態様は、本明細書に記載される抗体を発現する細胞を含み、任意選択で、細胞は、ベクターを含むハイブリドーマである。
一態様は、本明細書に記載されるキット、本明細書に記載される免疫原、本明細書に記載される抗体、本明細書に記載されるイムノコンジュゲート、本明細書に記載される核酸分子、本明細書に記載されるベクターまたは本明細書に記載される細胞を含む。
一態様は、本明細書に記載される抗体を作製する方法であって、本明細書に記載される化合物もしくは免疫原または前記化合物もしくは免疫原を含む組成物を対象に投与することと、投与する化合物もしくは免疫原および／またはＡベータオリゴマーに特異的または選択的であり、任意選択で、Ａベータペプチドを含む直鎖状ペプチドと結合しない、もしくはほとんど結合せず、かつ／または斑と結合しない、もしくはほとんど結合しない、抗体および／または抗体を発現する細胞を単離することとを含む、方法を含む。
一態様は、生体試料がＡベータを含むかどうかを判定する方法であって、
ａ．生体試料と、本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートとを接触させること；および
ｂ．何らかの抗体複合体の存在を検出すること
を含む、方法を含む。
一実施形態では、本明細書に記載される、生体試料がＡベータオリゴマーを含有するかどうかを判定する方法であって、
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の形成が可能な条件下で、試料と、Ａベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な本明細書に記載される抗体または本明細書に記載されるイムノコンジュゲートとを接触させること；および
ｂ．何らかの複合体の存在を検出すること
を含み、
検出可能な複合体の存在により、試料がＡベータオリゴマーを含有し得ることが示される、
方法。
別の実施形態では、複合体の量を測定する。
別の実施形態では、試料は、脳組織もしくはその抽出物、全血、血漿、血清および／またはＣＳＦを含む。
別の実施形態では、試料はヒト試料である。
別の実施形態では、試料を対照、任意選択で以前の試料と比較する。
別の実施形態では、ＳＰＲによりＡベータのレベルを検出する。
一態様は、対象のＡベータのレベルを測定する方法であって、ＡＤを有するリスクもしくは疑いがある、またはＡＤを有する対象に、本明細書に記載される抗体を含み、抗体が検出可能な標識とコンジュゲートされているイムノコンジュゲートを投与すること；および標識を検出すること、任意選択で標識を定量的に検出することを含む、方法を含む。
一実施形態では、標識は陽電子放出放射性核種である。
一態様は、対象に免疫応答を誘導する方法であって、本明細書に記載される化合物もしくは化合物の組合せ、任意選択で、ＨＤＳＧ（配列番号１）もしくは関連エピトープペプチド配列を含む環状化合物、免疫原および／または前記化合物もしくは前記免疫原を含む組成物を対象に投与すること；ならびに任意選択で、投与した化合物または免疫原中のＡベータペプチドと特異的または選択的に結合する細胞および／または抗体を単離することを含む、方法を含む。
一態様は、Ａベータオリゴマー伝播を阻害する方法であって、有効量の本明細書に記載されるＡベータオリゴマーに特異的または選択的な抗体またはイムノコンジュゲートを、Ａベータを発現する細胞もしくは組織と接触させる、または必要とする対象に投与して、Ａベータの凝集および／またはオリゴマー伝播を阻害することを含む、方法を含む。
一態様は、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患を治療する方法であって、必要とする対象にｉ）有効量の本明細書に記載される抗体またはイムノコンジュゲート、任意選択で、Ａベータオリゴマーに特異的もしくは選択的な抗体または前記抗体を含む医薬組成物を投与すること；２）ＨＤＳＧ（配列番号１）もしくは関連エピトープ配列を含む単離環状化合物または免疫原または前記環状化合物を含む医薬組成物あるいは３）１の抗体または２の免疫原をコードする核酸または核酸を含むベクターを、必要とする対象に投与することを含む、方法を含む。
一実施形態では、本明細書に記載される抗体を用いて、治療する対象由来の生体試料をＡベータの有無またはレベルに関して評価する。
一実施形態では、２つ以上の抗体または免疫原を投与する。
一実施形態では、抗体、イムノコンジュゲート、免疫原、組成物または核酸もしくはベクターを脳またはＣＮＳの他の部分に直接投与する。
一実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤または担体と混合した化合物または免疫原を含む、医薬組成物である。
一態様は、配列番号１～１６で示される配列のいずれか１つの配列よりなるＡベータペプチドを含む、単離ペプチドを含む。
一実施形態では、単離ペプチドは、リンカーを含み、リンカーがＡベータペプチドのＮ末端残基および／またはＡベータのＣ末端残基と共有結合している、環状ペプチドである。
一実施形態では、単離環状ペプチドは検出可能な標識を含む。
一態様は、本明細書に記載される単離ペプチドをコードする核酸配列を含む。
一態様は、本明細書に記載される抗体を発現するハイブリドーマを含む。
以下の詳細な説明から本開示のその他の特徴と利点が明らかになるであろう。ただし、この詳細な説明から本開示の趣旨および範囲内に含まれる様々な変更および改変が当業者に明らかになることから、詳細な説明および具体例は、本開示の好ましい実施形態を示すと同時に、単に説明を目的として記載されるものであることが理解されるべきである。
これより本開示の実施形態を図面と関連させて説明する。
集団座標法により求めた配列の関数としての露出の可能性を示す図である。 曲率を残基インデックスの関数として示す図である。環状ペプチドＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）の平衡アンサンブルの平均曲率（薄灰色の実線）が直鎖状ペプチドの曲率（濃灰色の実線）および線維での様々なモノマーの曲率（点線）とともに示されている。 Ｈ６の側鎖重原子の二面角分布である。残基Ｈ６の模式図が挿入図に示されており；二面角を取る対応する結合には他の結合より濃い色が与えられており、二面角を定める４つの原子がそれより薄い灰色で示されている。直鎖状ペプチド、環状ペプチドおよび（２Ｍ４Ｊ）線維アンサンブルの全３種の二面角分布のピーク値に対応する角が表１に記載されている。表１にはピーク値間の差も記載されている。線維では、線維アンサンブルの二面角分布がＰＤＢ構造内のＡベータ４２鎖全９本にわたっているため、観察される二面角分布は全体的に、構造２Ｍ４Ｊから取ったいずれの単一鎖の分布より広いものとなっている。 Ｈ６の側鎖重原子の二面角分布である。残基Ｈ６の模式図が挿入図に示されており；二面角を取る対応する結合には他の結合より濃い色が与えられており、二面角を定める４つの原子がそれより薄い灰色で示されている。直鎖状ペプチド、環状ペプチドおよび（２Ｍ４Ｊ）線維アンサンブルの全３種の二面角分布のピーク値に対応する角が表１に記載されている。表１にはピーク値間の差も記載されている。線維では、線維アンサンブルの二面角分布がＰＤＢ構造内のＡベータ４２鎖全９本にわたっているため、観察される二面角分布は全体的に、構造２Ｍ４Ｊから取ったいずれの単一鎖の分布より広いものとなっている。 残基Ｄ７の側鎖重原子を含む角Ｏ－Ｃ－Ｃα－Ｃβの二面角分布である。Ｄ７の模式図が挿入図に示されており；二面角を取る対応する結合には他の結合より濃い色が与えられている。数値は表１に記載されている。 Ｓ８の側鎖重原子を含む角の二面角分布である。Ｓ８の模式図が挿入図に示されており；二面角を取る対応する結合には他の結合より濃い色が与えられている。数値は表１に記載されている。 最上段のパネル（Ａ）：線維でのエントロピーと比較した直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドの側鎖エントロピーの変化を残基Ｈ、ＤおよびＳそれぞれに対してプロットしたもの。（Ｂ）上から２段目のパネル：Ｈ６の個々の二面角のエントロピー。例えば、ＣＡ－ＣＢ－ＣＧ－ＮＤ１は線維ペプチドまたは直鎖状ペプチドよりエントロピーが大幅に低く、このことは、図３においてこの特定の二面角の二面角分布の方がピークが鋭いことからもわかることに注目されたい。 （Ｃ）下から２段目のパネル：Ｄ７の個々の二面角のエントロピー。（Ｄ）最下段のパネル：Ｓ８の個々の二面角のエントロピー。 直鎖型および環状型の両方のペプチドＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）の残基Ｈ、Ｄ、ＳおよびＧの平衡主鎖ラマチャンドラン角を線維２Ｍ４Ｊにおける残基Ｈ、Ｄ、ＳおよびＧの主鎖ラマチャンドラン角とともに示す図である。 直鎖型および環状型の両方のペプチドＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）の残基Ｈ、Ｄ、ＳおよびＧの平衡主鎖ラマチャンドラン角を線維２Ｍ４Ｊにおける残基Ｈ、Ｄ、ＳおよびＧの主鎖ラマチャンドラン角とともに示す図である。 Ａベータ４２ペプチドの溶解度対残基インデックスを示す図である。ＨＤＳＧ（配列番号１）の値はそれぞれ＋１．１、＋０．１４、＋１．２および＋０．３０である。 溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）、重み付けＳＡＳＡ、（（ｓｉ－＜ｓ＞）／δｓ）・ＳＡＳＡｉ、および（（ｓｉ－＜ｓ＞）／δｓ）・ＳＡＳＡｉ－（（（ｓｉ－＜ｓ＞）／δｓ）・ＳＡＳＡｉ）線維のプロットである。 溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）、重み付けＳＡＳＡ、（（ｓｉ－＜ｓ＞）／δｓ）・ＳＡＳＡｉ、および（（ｓｉ－＜ｓ＞）／δｓ）・ＳＡＳＡｉ－（（（ｓｉ－＜ｓ＞）／δｓ）・ＳＡＳＡｉ）線維のプロットである。 直鎖状ペプチドアンサンブルの最も大きい３つのクラスターの重心に対する平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）の値に関する別個の図である。各点は、直鎖状ペプチドアンサンブル、環状ペプチドアンサンブルまたは線維平衡アンサンブルから取った所与の立体配座に対応する。 直鎖状ペプチドアンサンブルの最も大きい３つのクラスターの重心に対する平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）の値に関する別個の図である。各点は、直鎖状ペプチドアンサンブル、環状ペプチドアンサンブルまたは線維平衡アンサンブルから取った所与の立体配座に対応する。 側鎖の配向が見えるようにリコリスで表示した環状ペプチド構造ＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）の２つの図である。薄灰色に着色した立体配座は、図１０に関して上に記載した最も大きいクラスターの重心であり、環状ペプチドの典型的な立体配座を最もよく表している。直鎖状ペプチドの最も可能性の高い二面角に近い二面角を有する直鎖状立体配座には黒色の側鎖が与えられており；直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドに好ましい傾向のある様々な二面角を示すため、この直鎖状ペプチドの側鎖を環状ペプチドに重ね合わせてある。 環状のペプチド結合を有する環状ペプチド、Ｇ残基とＣ残基の間にＰＥＧ２リンカーを有する環状ペプチドおよびＣ残基とＨ残基の間にＰＥＧ２リンカーを有する環状ペプチドを含めたＨＤＳＧ（配列番号１）を含む環状ペプチドの略図である。 平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）によるクラスタリングプロットであり；軸は図１０と同じく、直鎖状ペプチドアンサンブルの最も大きい３つのクラスターの重心に再度対応する。 平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）によるクラスタリングプロットであり；軸は図１０と同じく、直鎖状ペプチドアンサンブルの最も大きい３つのクラスターの重心に再度対応する。 抗体の表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）直接結合アッセイを示す図であり、パネルＡは環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドに対するもの、パネルＢはＡベータオリゴマーおよびＡベータモノマーに対するものである。 組織培養上清由来のクローンに関するＥＬＩＳＡおよびＳＰＲ直接結合アッセイを用いた一次スクリーニングを示す図である。プロットは、ｍＡｂ結合をＳＰＲ直接結合アッセイとＥＬＩＳＡとで比較したものである。 選択したクローンの環状ペプチド（構造化ペプチド：丸）、直鎖状ペプチド（非構造化ペプチド、四角）、Ａベータモノマー（上向きの三角形）およびＡベータオリゴマー（下向きの三角形）に対するＳＰＲ直接結合アッセイを示す図である。アスタリスクは、対照目的で未構造化直鎖状ペプチドに対して反応性のクローンを示している。 ６Ｅ１０陽性対照抗体（Ａ）およびシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）（Ｂ）に対して生じさせた抗体（３０３－２５－１Ｂ４）を用いた死体ＡＤ脳の斑の免疫組織化学染色を示す図である。 選択し精製した抗体に関するＳＰＲ間接（捕捉）結合アッセイを用いた二次スクリーニングを示す図である。Ａベータオリゴマーの捕捉抗体に対するＳＰＲ結合応答からＡベータモノマーの捕捉抗体に対する結合応答を差し引いたもの（丸）；ＡＤ患者からプールした可溶性脳抽出物の捕捉抗体に対するＳＰＲ結合応答から、非ＡＤ対照からプールした脳抽出物の捕捉抗体に対する結合応答を差し引いたもの（三角）；ＡＤ患者からプールした脳脊髄液（ＣＳＦ）の捕捉抗体に対するＳＰＲ結合応答から、非ＡＤ対照からプールしたＣＳＦの捕捉抗体に対する結合応答を差し引いたもの（四角）。 Ａベータオリゴマーに対する抗体結合の検証を示す図である。様々な濃度の市販の調製済みの安定なＡベータオリゴマーと固定化抗体との結合に関するＳＰＲセンサグラムおよび結合応答プロット。パネルＡは陽性対照ｍＡｂ６Ｅ１０での結果を示し、パネルＢは陰性アイソタイプ対照での結果を示し、パネルＣはシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体での結果を示している。パネルＤは、ＨＤＳＧ（配列番号１）を含む環状ペプチドに対して生じさせたいくつかの抗体クローンと、濃度１マイクロモルのＡベータオリゴマーとの結合をプロットしたものである。 Ａベータオリゴマーに対する抗体結合の検証を示す図である。様々な濃度の市販の調製済みの安定なＡベータオリゴマーと固定化抗体との結合に関するＳＰＲセンサグラムおよび結合応答プロット。パネルＡは陽性対照ｍＡｂ６Ｅ１０での結果を示し、パネルＢは陰性アイソタイプ対照での結果を示し、パネルＣはシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体での結果を示している。パネルＤは、ＨＤＳＧ（配列番号１）を含む環状ペプチドに対して生じさせたいくつかの抗体クローンと、濃度１マイクロモルのＡベータオリゴマーとの結合をプロットしたものである。 Ａベータオリゴマーに対する抗体結合の検証を示す図である。様々な濃度の市販の調製済みの安定なＡベータオリゴマーと固定化抗体との結合に関するＳＰＲセンサグラムおよび結合応答プロット。パネルＡは陽性対照ｍＡｂ６Ｅ１０での結果を示し、パネルＢは陰性アイソタイプ対照での結果を示し、パネルＣはシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体での結果を示している。パネルＤは、ＨＤＳＧ（配列番号１）を含む環状ペプチドに対して生じさせたいくつかの抗体クローンと、濃度１マイクロモルのＡベータオリゴマーとの結合をプロットしたものである。 Ａベータオリゴマーに対する抗体結合の検証を示す図である。様々な濃度の市販の調製済みの安定なＡベータオリゴマーと固定化抗体との結合に関するＳＰＲセンサグラムおよび結合応答プロット。パネルＡは陽性対照ｍＡｂ６Ｅ１０での結果を示し、パネルＢは陰性アイソタイプ対照での結果を示し、パネルＣはシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体での結果を示している。パネルＤは、ＨＤＳＧ（配列番号１）を含む環状ペプチドに対して生じさせたいくつかの抗体クローンと、濃度１マイクロモルのＡベータオリゴマーとの結合をプロットしたものである。 ＨＤＳＧ（配列番号１）を含む環状ペプチドを用いて生じさせた代表的な抗体の存在下または不在下におけるｉｎ ｖｉｖｏでのＡベータ凝集伝播のプロットである。
表１に、環状ペプチドと他の種との間に分布の有意な差がみられる二面角の二面角分布のピーク値を示す。
表２に、ラマチャンドラン主鎖ファイ／プサイ角分布のピーク値を示す。
表３に、最大の立体配座クラスターの重心立体配座である環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドアンサンブルから得た最大のクラスターの重心立体配座のラマチャンドラン主鎖二面角および側鎖二面角を示す。
表４は、環状アンサンブル、直鎖状アンサンブルおよび２Ｍ４Ｊ線維アンサンブルの各残基の平均曲率値の表である。
表５に、選択した抗体の結合特性を示す。
表６に、選択した抗体の結合特性のまとめを示す。
表７に、シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体のオリゴマー結合－モノマー結合を記載する。
表８に、ホルマリン固定組織で試験した抗体の特性を記載する。
表９は例示的毒性試験である。
表１０にＣＤＲ配列を記載する。
表１１に重鎖および軽鎖の可変配列を記載する。
表１２は、Ａベータエピトープ配列およびリンカーを有する選択配列の表である。
表１３にＡベータ１～４２ヒトポリペプチド配列全体を記載する。
（本開示の詳細な説明）
本明細書には、アルツハイマー病に関連するオリゴマー種を含めたＡベータの毒性オリゴマー種内で優先的に接触可能なエピトープを標的とし得る抗体、免疫療法組成物および方法が提供される。Ａベータのオリゴマー種内での抗体結合に特異的かつ／または選択的に接触可能であり得るＡベータの領域が特定された。
本明細書で示されるように、モノマーおよび／または線維上に存在しない、またはわずかに存在するＡベータペプチド上の標的を特定することにより、オリゴマー特異的抗体またはオリゴマー選択的抗体の作製を達成した。オリゴマー特異的エピトープは、モノマーまたは線維の対応するセグメントと一次配列が異なっている必要はないが、オリゴマーにおいて立体配座的に際立ったものであり得る。つまり、これらは、オリゴマー内で、主鎖および／または側鎖の配向の点でモノマーおよび／または線維にはみられない（または好ましくない）と考えられる際立った立体配座を示す。
直鎖状ペプチド領域に対して生じさせた抗体は、オリゴマーに選択的でないものであり得、したがって、モノマー斑またはＡベータ斑にも結合し得る。
本明細書に記載されるように、オリゴマー型のＡベータに選択的になり得る抗体を開発するため、本発明者らは、線維において破壊されやすく、オリゴマーの表面に露出し得るＡベータ配列の領域を特定することを目指した。
実施例に記載されるように、本発明者らは、線維において破壊されやすいことが明らかになった領域を特定した。本発明者らは、その特定された標的を含む環状化合物が直鎖状アンサンブルまたは線維アンサンブルに対して別の立体配座の基準、例えば、より高い曲率、より大きい露出表面積、別の二面角分布および／または平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）によるアライメントが容易ではないことなどを満たすようこれを設計した。
標的領域を含む環状ペプチドを用いて、同じ配列の直鎖状ペプチド（例えば、対応する直鎖状配列）と比較して環状ペプチドと優先的に結合する抗体を生じさせることができた。実験結果が記載されており、合成モノマーと比較して合成オリゴマーと選択的に結合し、対照ＣＳＦよりもＡＤ患者のＣＳＦと優先的に結合し、かつ／または対照の可溶性脳抽出物よりもＡＤ患者の可溶性脳抽出物と優先的に結合する、エピトープ特異的かつ立体配座選択的な抗体が特定される。さらに、ＡＤ脳組織の染色では、斑との結合を全くまたはほとんど示さない抗体が特定され、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験では、抗体がＡβオリゴマーの伝播および凝集を阻害することがわかった。
Ｉ．定義
本明細書で使用される「Ａベータ（Ａ－ｂｅｔａ）」という用語は、代替的に「アミロイドベータ」、「アミロイドβ」、Ａベータ（Ａｂｅｔａ）、Ａベータ（Ａ－ｂｅｔａ）または「Ａβ」と呼ばれ得る。アミロイドベータは、３６～４３個のアミノ酸よりなるペプチドであり、あらゆる種のあらゆる野生型および変異型、特にヒトＡベータを包含する。Ａベータ４０は４０アミノ酸型を指し、Ａベータ４２は４２アミノ酸型を指すなど。ヒト野生型Ａベータ４２のアミノ酸配列は配列番号３で示されるものである。
本明細書で使用される「Ａベータモノマー」という用語は、Ａベータ（例えば、１～４０、１～４２、１～４３）ペプチドの個々のサブユニット型のいずれかを指す。
本明細書で使用される「Ａベータオリゴマー」という用語は、本明細書では、複数（例えば、少なくとも２つ）のＡベータモノマーが非共有結合によって、約１００個未満またはより通常には約５０個未満のモノマーからなり、立体配座に柔軟性があり、部分的に規則的である三次元の小球に凝集したＡベータサブユニットのいずれか複数のものを指す。例えば、オリゴマーは、３個、４個、５個またはそれ以上のモノマーを含み得る。本明細書で使用される「Ａベータオリゴマー」という用語は、合成Ａベータオリゴマーおよび／または天然Ａベータオリゴマーの両方を包含する。「天然Ａベータオリゴマー」は、ｉｎ ｖｉｖｏで、例えばＡＤを有する対象の脳およびＣＳＦ内で形成されるＡベータオリゴマーを指す。
本明細書で使用される「Ａベータ線維」という用語は、電子顕微鏡下で線維構造を示す個々のＡベータペプチドが非共有結合により会合した集合体を含む分子構造を指す。線維構造は通常、「クロスベータ」構造であり、理論上、多量体の大きさに上限はなく、線維は数千個または何千個ものモノマーを含み得る。線維は数千個単位で凝集し、ＡＤに特徴的な主な病理学的形態の１つである老人斑を形成し得る。
「ＨＤＳＧ」という用語は、配列番号１で示されるヒスチジン、アスパラギン酸、セリンおよびグリシンというアミノ酸配列を意味する。これと同様に、ＤＳＧ、ＤＳＧＧ（配列番号３）、ＨＤＳＧＹＥ（配列番号１１）、ＨＤＳＧＹ（配列番号４）、ＲＨＤＳＧ（配列番号５）、ＲＨＤＳ（配列番号６）は、１文字アミノ酸コードによって識別されるアミノ酸配列を指す。文脈によっては、アミノ酸配列と記載される場合、それはＡベータまたは単離ペプチド内の配列、例えば環状化合物のアミノ酸配列などを指すことがある。
本明細書で使用される「直鎖状化合物、モノマーおよび／または線維内でアミノ酸残基（例えば、Ｈ、Ｄ、Ｓおよび／またはＧ）によって占められるものとは別の立体配座」という用語は、溶媒露出度、エントロピー、曲率（例えば、ペプチドＨＤＳＧ（配列番号１）の場合と、例えば実施例に記載される環状ペプチドの場合との比較）、ＲＭＳＤ構造アライメントおよび１つもしくは複数の主鎖二面角または側鎖二面角から選択される１つまたは複数の立体配座特性が、例えば、ＰＤＢ、２Ｍ４Ｊ、２ＭＸＵ、２ＬＭＮまたは２ＬＭＰならびに図１～１２および／または表に示される状況、Ａベータモノマー構造および／またはＡベータ線維構造でＨ、Ｄおよび／またはＳを含むＡベータ直鎖状化合物と比較して、その残基の前記特性が異なることを意味する。例えば、図２および表４は、環状ペプチドアンサンブルのＨＤＳＧ（配列番号１）の曲率が、線維立体配座のアンサンブルでのＨＤＳＧ（配列番号１）の曲率より有意に大きいことを示している。このことは、Ｄ７、Ｓ８およびＧ９で特に明白である。さらに、Ｄ７およびＳ８では、環状ペプチドアンサンブルでの曲率は、直鎖状ペプチドアンサンブルでの曲率より大幅に大きい。このことは、立体配座選択性が特に残基Ｄ７およびＳ８によって付与され得ることを示している。図３の最後の２つのパネルは、環状ペプチドアンサンブルではＨ６の角（Ｎ－ＣＡ－ＣＢ－ＣＧ）および（Ｃ－ＣＡ－ＣＢ－ＣＧ）の二面角分布が確かに重なっているが、直鎖状ペプチドおよび線維のアンサンブルで最も頻度の高い角ではない（Ｎ－ＣＡ－ＣＢ－ＣＧの確率は直鎖状および線維でそれぞれ３６％および１３％であり、Ｃ－ＣＡ－ＣＢ－ＣＧの確率は直鎖状および線維でそれぞれ３６％および１３％である）ことを示している。図４の最後のパネルは、残基Ｄ７の側鎖に関する角（Ｏ－Ｃ－ＣＡ－ＣＢ）の二面角分布が、モノマーまたは線維と比較して別の立体配座の分布を反映していることを示している。図５は、残基Ｓ８の側鎖に関する角（Ｎ－ＣＡ－ＣＢ－ＯＧ）、（Ｃ－ＣＡ－ＣＢ－ＯＧ）および（Ｏ－Ｃ－ＣＡ－ＣＢ）の二面角分布が、モノマーまたは線維と比較して別の立体配座の分布を反映していることを示している。これと同様に、別の立体配座は、比較立体配座より弱くまたは強く「拘束された」ものであり得る。例えば、図６は、Ｈ６は、環状ペプチドでは線維またはモノマーの場合より強く拘束されていることを示している。残基Ｄ７は、環状ペプチドアンサンブルではモノマーの場合より強く拘束されているが、線維の場合より弱く拘束されている。残基Ｓ８は、環状ペプチドアンサンブルでは線維の場合より弱く拘束されており、同じくモノマーの場合よりわずかに弱く拘束されている。図７は、環状ペプチドの主鎖のラマチャンドラン二面角の分布が、残基Ｄ７およびＳ８に関してモノマーまたは線維の分布と大幅に異なっていることを示している。図８は、残基ＨＤＳＧ（配列番号１）が、Ａベータペプチドでみられる平均溶解度よりも溶解度が大きいことを示しており、このことから、立体配座のオリゴマーアンサンブルではこれらの残基が露出している可能性があることがわかる。図９は、残基ＨＤＳＧ（配列番号１）の溶媒接触表面積ＳＡＳＡが線維と比較して増大していること、および溶解度による重み付けを実施した場合、環状ペプチドアンサンブルではいずれの残基も重み付けＳＡＳＡが線維のものより増大しており、残基Ｓ８は線維より重み付けＳＡＳＡが大幅に増大していることを示している。図１０は、ＨＤＳＧ（配列番号１）の環状ペプチド平衡構造が直鎖状ペプチドまたは線維内の対応する配列の平衡構造とは異なる方法でクラスター化し、直鎖状および線維のアンサンブルは明確に分化しないことを示している。
「アミノ酸」という用語は、天然のアミノ酸および修飾されたＬ－アミノ酸をすべて包含する。アミノ酸の原子は様々な同位体を含み得る。例えば、アミノ酸は、水素に代わるジュウテリウム、窒素１４に代わる窒素１５および炭素１２に代わる炭素１３ならびにその他の同様の変化を含み得る。
本明細書で使用される「抗体」という用語は、モノクローナル抗体、ポリクローナル抗体、一本鎖抗体、ベニヤ化（ｖｅｎｅｅｒｅｄ）抗体、ヒト化抗体およびキメラ抗体ならびに例えば一本鎖Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’２フラグメントまたは一本鎖Ｆｖフラグメントを含めた上記の抗体のフラグメントを包含するものとする。抗体は、組換え供給源由来のものおよび／またはウサギ、ラマ、サメなどの動物で産生されたものであり得る。また、トランスジェニック動物で産生され得る、もしくは生化学技術を用いて作製され得る、またはファージライブラリーなどのライブラリーから単離され得るヒト抗体も包含される。ヒト化抗体またはその他のキメラ抗体は、１種類または２種類以上のアイソタイプもしくはクラスまたは種由来の配列を含み得る。
「単離された抗体」という語句は、ｉｎ ｖｉｖｏまたはｉｎ ｖｉｔｒｏで産生され、抗体を産生した供給源、例えば、動物、ハイブリドーマまたはその他の細胞系（抗体を産生する組換え昆虫、酵母または細菌細胞など）から取り出された抗体を指す。単離された抗体は任意選択で「精製」されており、これは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の純度であることを意味する。
本明細書で使用される「結合フラグメント」という用語は、抗体または抗体鎖の一部または一部分であって、インタクトの抗体もしくは抗体鎖または完全な抗体もしくは抗体鎖より少ないアミノ酸残基を含み、抗原と結合する、またはインタクトの抗体と競合するものを指す。例示的結合フラグメントとしては、特に限定されないが、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディおよびその多量体が挙げられる。フラグメントは、インタクトの抗体もしくは抗体鎖または完全な抗体もしくは抗体鎖の化学処理または酵素処理によって得ることができる。フラグメントは、組換え手段によっても得ることができる。例えば、抗体をペプシンで処理することによりＦ（ａｂ’）２フラグメントを作製することができる。得られたＦ（ａｂ’）２フラグメントにジスルフィド架橋を還元する処理を実施して、Ｆａｂ’フラグメントを作製することができる。パパイン消化によりＦａｂフラグメントの形成を引き起こすことができる。また、組換え発現技術によりＦａｂ、Ｆａｂ’およびＦ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ミニボディ、ダイアボディ、二重特異性抗体フラグメントならびにその他のフラグメントを構築することもできる。
当該技術分野で認識されている「ＩＭＧＴ番号付け」または「ＩｍＭｕｎｏＧｅｎｅＴｉｃｓデータベース番号付け」という用語は、抗体またはその抗原結合部分の重鎖可変領域および軽鎖可変領域の他のアミノ酸残基より可変性のある（すなわち、超可変性の）アミノ酸残基を番号付けするシステムを指す。
ある抗体がＨＤＳＧ（配列番号１）などのエピトープと特異的に結合すると記載される場合、それは、その抗体が特定の残基またはその一部、例えばＨＤＳＧの少なくとも２つの残基を含むペプチドと最小限の親和性で特異的に結合し、例えばアイソタイプ対照抗体より大きい無関係な配列にも無関係な配列の空間定位にも結合しないことを意味する。このような抗体は必ずしもＨＤＳＧ（配列番号１）の各残基と接触するわけではなく、前記エピトープ内のあらゆる単一のアミノ酸置換またはアミノ酸欠失が、必ずしも結合親和性に大きな影響を及ぼし、かつ／または同程度の影響を及ぼすというわけではない。
ある抗体がエピトープ、例えばＨＤＳＧ（配列番号１）などの立体配座エピトープなどと選択的に結合すると記載される場合、それは、その抗体が特定の残基またはその一部を含む１つまたは複数の特定の立体配座に、別の立体配座の前記残基と結合する場合より大きい親和性で優先的に結合することを意味する。例えば、ある抗体が対応する直鎖状ペプチドよりもＨＤＳＧまたは関連エピトープを含むシクロペプチドと選択的に結合すると記載される場合、その抗体は、直鎖状ペプチドと結合する場合の少なくとも２倍の親和性でそのシクロペプチドと結合する。
本明細書で使用される「立体配座エピトープ」という用語は、アミノ酸配列が特定の三次元構造を有し、対応する直鎖状ペプチド中に存在しない、または存在する可能性が低い三次元構造の少なくとも一面がコグネイト抗体によって特異的かつ／または選択的に認識される、エピトープを指す。エピトープ、例えばＨＤＳＧ（配列番号１）は、オリゴマーＡベータの分子表面に一部もしくは全部が露出しているもの、およびモノマー斑Ａベータもしくは線維斑Ａベータでは一部もしくは全部が抗体に認識されにくいものであり得る。立体配座特異的エピトープと特異的かつ／または選択的に結合する抗体は、その立体配座特異的／選択的エピトープの１つまたは複数のアミノ酸の空間的配置を認識する。例えば、ＨＤＳＧ（配列番号１）立体配座エピトープは、抗体によって特異的かつ／または選択的に、例えば直鎖状ＨＤＳＧ（配列番号１）と比較して少なくとも２倍、３倍、５倍、１０倍、５０倍、１００倍、２５０倍、５００倍もしくは１０００倍またはそれ以上選択的に認識される、ＨＤＳＧ（配列番号１）のエピトープを指す。
本明細書で使用される「関連エピトープ」という用語は、抗原性であるＨＤＳＧ（配列番号１）の少なくとも２つの残基および／またはＡベータのＨＤＳＧ（配列番号１）の少なくとも２つの残基のＮ末端側もしくはＣ末端側のいずれかに１つもしくは２つのアミノ酸残基を含む配列を意味する。例えば、本明細書では、ＨＤＳＧ（配列番号１）、ＨＤＳＧＹ（配列番号４）およびＲＨＤＳＧ（配列番号５）がＡベータ線維において不規則になりやすい領域として特定されたことが示される。したがって、ＨＤＳＧＹ（配列番号４）およびＲＨＤＳＧ（配列番号５）は関連エピトープである。さらに、モデル化により、特に残基Ｄ７およびＳ８は環状化合物において対応する直鎖状配列と比較して差がみられることが明らかになっており、したがって、ＤＳ、ＨＤＳ、ＤＳＧ、ＤＳＧＹ（配列番号１３）およびＲＨＤＳ（配列番号６）は関連エピトープである。例示的関連エピトープとしては、表１２に記載されるＡベータ配列が挙げられる。
本明細書でアミノ酸配列内のアミノ酸もしくはその側鎖（例えば、ＨＤＳＧ（配列番号１）のＨもしくはＤ）またはより大きいポリペプチド内のアミノ酸配列に関して使用される「拘束された立体配座」という用語は、アミノ酸二面角の回転運動性が対応する直鎖状ペプチド配列または配列もしくはより大きいポリペプチドよりも低下し、それにより、許容される立体配座の数が少なくなっていることを意味する。このことは、例えば、側鎖二面角自由度のアンサンブルのエントロピー減少を見出すことによって定量化することが可能であり、Ｈ、ＤおよびＳについては図６にプロットされている。例えば、配列内の側鎖の立体配座自由度が直鎖状ペプチドより低ければ、エントロピーが減少することになる。このような立体配座の制約があれば、この抗原に対して特異的に生じた抗体の立体配座選択性が増大するものと思われる。本明細書で使用される「より拘束された立体配座」という用語は、１つまたは複数の二面角の二面角分布（許容される二面角のアンサンブル）が、例えば、アミノ酸、例えばＨおよび／またはＤのエントロピーによる判定（例えば、立体配座の拘束が強いほどエントロピーが低くなる）で、比較立体配座より少なくとも１０％強く拘束されていることを意味する。具体的には、より拘束された環状立体配座のアンサンブル全体のＨＤＳの直鎖状ペプチドにおけるエントロピーに対する平均エントロピー変化、Ｓ（環状）－Ｓ（直鎖状）は、拘束されていない立体配座アンサンブルから、例えば量が平均で１０％超、２０％超、３０％超または４０％超減少しており、直鎖状ペプチドのＳ（直鎖状）－Ｓ（線維）／［平均（Ｓ（直鎖状）＋Ｓ（線維））］は、Ｈ６が約８１．７％のエントロピー減少、Ｄ７が４９．８％のエントロピー減少、Ｓ８が－８．８３％のエントロピー減少（負の数は環状ペプチドの方が直鎖状ペプチドよりＳ８のエントロピーが大きいことを示す）である。
本明細書で抗体に関して使用される「斑との結合が全くまたはほとんどみられない」または「斑と結合しない、またはほとんど結合しない」という用語は、抗体が（例えば、ｉｎ ｓｉｔｕの）免疫組織化学法で典型的な斑の染色形態を示さず、染色のレベルが、ＩｇＧ陰性の（例えば、無関係な）アイソタイプ対照でみられるレベルと同等である、またはその２倍以下であることを意味する。
「単離ペプチド」という用語は、例えば組換え技術または合成技術によって作製され、ペプチドを作製した組換え細胞または残存ペプチド合成反応物などの供給源から取り出されたペプチドを指す。単離ペプチドは、任意選択で「精製」されており、これは少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の純度および任意選択で医薬品等級の純度であることを意味する。
本明細書で使用される「検出可能な標識」という用語は、本明細書に記載されるペプチドまたは化合物内に付加または導入することができるペプチド配列（ｍｙｃタグ、ＨＡタグ、Ｖ５タグまたはＮＥタグなど）、蛍光タンパク質などの部分であって、直接的または間接的に検出可能なシグナルを発生することが可能な部分を指す。例えば、標識は、（例えば、ＰＥＴ撮像に使用する）放射線不透性の陽電子放出放射性核種もしくは放射性同位元素、例えば３Ｈ、１３Ｎ、１４Ｃ、１８Ｆ、３２Ｐ、３５Ｓ、１２３Ｉ、１２５Ｉ、１３１Ｉなど；蛍光化合物（フルオロフォア）もしくは化学発光化合物（発色団）、例えばフルオレセインイソチオシアナート、ローダミンもしくはルシフェリンなど；酵素、例えばアルカリホスファターゼ、β‐ガラクトシダーゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼなど；造影剤；または金属イオンであり得る。検出可能な標識はまた、例えば二次抗体を用いて間接的に検出可能なものであり得る。
通常使用される「エピトープ」という用語は、抗体によって特異的に認識される抗原の抗体結合部位、通常、ポリペプチドセグメントを意味する。本明細書で使用される「エピトープ」はまた、記載される集団座標法を用いてＡベータ上で特定され得るアミノ酸配列またはその一部を指すこともある。例えば、特定された標的領域ＨＤＳＧ（配列番号１）を含む環状化合物に対応する単離ペプチドに対して作製した抗体は、前記エピトープ配列の一部または全部を認識する。エピトープが抗体による結合に接触可能な場合、それは本明細書において「接触可能な」ものである。
本明細書で使用される「より高い親和性」という用語は、抗体Ｘが標的Ｚより強く（Ｋｏｎ）かつ／または小さい解離定数（Ｋｏｆｆ）で標的Ｙと結合する場合の相対的抗体結合度を指し、この文脈では、抗体Ｘは標的Ｙに対して標的Ｚより高い親和性を有する。これと同様に、本明細書の「より低い親和性」という用語は、抗体Ｘが標的Ｚより弱くかつ／または大きい解離定数で標的Ｙと結合する場合の抗体結合度を指し、この文脈では、抗体Ｘは標的Ｙに対して標的Ｚより低い親和性を有する。抗体とその標的抗原との間の結合の親和性はＫＡ＝１／ＫＤで表すことができ、式中、ＫＤ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆである。ｋｏｎおよびｋｏｆｆの値は、表面プラズモン共鳴技術を用いて、例えばＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ－１）（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて測定することができる。環状化合物、例えば任意選択の環状ペプチド中に提示される立体配座に選択的な抗体は、環状化合物（例えば、環状ペプチド）に対する親和性が直鎖状形態の対応する配列（例えば、非環化配列）より大きい。
同じく本明細書で使用される「免疫原性」という用語は、抗体の産生を誘発し、免疫原の免疫原性部分に対するＴ細胞およびその他の反応性免疫細胞を活性化する物質を指す。
環状化合物に関する「対応する直鎖状化合物」という用語は、環状化合物と同じ配列もしくは化学的部分を含む、またはこれよりなるが、直鎖状（すなわち、非環状）形態であり、例えば溶液中でみられ得る直鎖状ペプチドの特性を有する、化合物、任意選択で直鎖状ペプチドを指す。例えば、対応する直鎖状化合物は、環化されていない合成ペプチドであり得る。
ある抗体に関して本明細書で使用される「特異的に結合する」は、その抗体がエピトープ配列を認識し、最小限の親和性でその標的抗原と結合することを意味する。例えば、多価抗体は、その標的と少なくとも１ｅ－６、少なくとも１ｅ－７、少なくとも１ｅ－８、少なくとも１ｅ－９または少なくとも１ｅ－１０のＫＤで結合する。少なくとも１ｅ－８より高い親和性が好ましいものであり得る。可変ドメインを１つ含むＦａｂフラグメントなどの抗原結合フラグメントは、非フラグメント化抗体との多価相互作用の１０倍または１００倍低い親和性でその標的と結合する。
ある形態のＡベータ（例えば、線維、モノマーまたはオリゴマー）または環状化合物と選択的に結合する抗体に関して本明細書で使用される「選択的に結合する」という用語は、その抗体が上記の形態と少なくとも２倍、少なくとも３倍または少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも１００倍、少なくとも２５０倍、少なくとも５００倍もしくは少なくとも１０００倍またはそれ以上の親和性で結合することを意味する。したがって、特定の立体配座（例えば、オリゴマー）に対してより選択的な抗体は、別の形態のペプチドおよび／または直鎖状ペプチドの少なくとも２倍などの親和性で特定の形態のＡベータと優先的に結合する。
本明細書で使用される「リンカー」という用語は、ＨＤＳＧ（配列番号１）エピトープペプチドを含むペプチドと共有結合して、任意選択でＨＤＳＧ（配列番号１）ペプチドのＮ末端およびＣ末端と結合して、環状化合物を生じさせることができる化学的部分を指す。リンカーは、スペーサーおよび／または１つもしくは複数の官能化可能な部分を含み得る。リンカーは、官能化可能な部分を介して担体タンパク質またはキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原強化物質と結合することができる。
本明細書で使用される「スペーサー」という用語は、ペプチドのＮ末端およびＣ末端と直接的または間接的に共有結合して、長さがペプチド自体より長い環状化合物を生じさせることができる、好ましくは非免疫原性または低免疫原性の任意の化学的部分を意味し、例えば、スペーサーは、ＨＤＳＧ（配列番号１）よりなるペプチドのＮ末端およびＣ末端と結合して、主鎖の長さがＨＤＳＧ（配列番号１）配列自体より長い環状化合物を生じさせることができる。つまり、（例えば、３アミノ酸残基の）スペーサーを有するペプチドが環化されると、スペーサーのないペプチドより大きい閉環が生じる。スペーサーとしては、特に限定されないが、Ｇリピート、ＡリピートまたはＰＥＧリピートなどの部分、例えばＧＨＤＳＧ（配列番号７）、ＧＨＤＳＧＧ（配列番号８）、ＧＧＨＤＳＧＧ（配列番号９）、ＧＨＤＳＧＧＧ（配列番号１０）などが挙げられる。スペーサーは、１つもしくは複数のシステイン（Ｃ）残基などの１つもしくは複数の官能化部分を含む、またはこれと結合しているものであり得、官能化部分はスペーサー内に散在している、またはスペーサーの一端または両端と共有結合しているものであり得る。Ｃ残基などの官能化可能な部分がスペーサーの１つまたは複数の末端と共有結合している場合、スペーサーはペプチドと間接的に共有結合している。スペーサーはまた、ビオチン分子がアミノ酸残基内に導入されている場合のように、スペーサー残基内に官能化可能な部分を含み得る。
本明細書で使用される「官能化可能な部分」という用語は、「官能基」を有する化学物質を指し、本明細書で使用される「官能基」は、別の原子団または単一原子（いわゆる「相補性官能基」）と反応して、２つの原子団または原子の間で化学的相互作用を形成する、原子団または単一原子を指す。システインの場合、官能基は、反応してジスルフィド結合を形成することができる－ＳＨであり得る。したがって、リンカーは、例えばＣＣＣであり得る。別の原子団との反応は、共有結合または例えば、Ｋｄが約１ｅ－１４になり得るビオチン－ストレプトアビジン結合の場合のような強い非共有結合であり得る。本明細書で使用される強い非共有結合は、Ｋｄが少なくとも１ｅ－９、少なくとも１ｅ－１０、少なくとも１ｅ－１１、少なくとも１ｅ－１２、少なくとも１ｅ－１３または少なくとも１ｅ－１４の相互作用を意味する。
タンパク質および／またはその他の物質を免疫原性に役立つ、またはｉｎ ｖｉｔｒｏ研究のプローブとして作用するよう環状化合物に機能化（例えば、結合）させ得る。この目的には、反応すること（例えば、共有結合または共有結合ではない強い結合を形成すること）が可能な任意の官能化可能な部分を使用し得る。ある特定の実施形態では、官能化可能な部分は、目的のタンパク質上にある対形成していないシステインと反応してジスルフィド結合を形成するシステイン残基であり、目的のタンパク質は、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強物質またはｉｎ ｖｉｔｒｏ免疫ブロットもしくは免疫組織化学アッセイに使用するウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体タンパク質であり得る。
本明細書で使用される「～と反応する」という用語は一般に、電子の流れまたは静電荷の移動が起こることにより化学的相互作用が形成されることを意味する。
本明細書で使用される「動物」または「対象」という用語は、任意選択でヒトを含む、または含まない哺乳動物を含めた動物界のあらゆるメンバーを包含する。
本明細書で使用される「保存的アミノ酸置換」とは、タンパク質の所望の特性を打ち消すことなく、あるアミノ酸残基が別のアミノ酸残基に置き換わるアミノ酸置換のことである。適切な保存的アミノ酸置換は、疎水性、極性およびＲ鎖長が互いに類似したアミノ酸同士を置き換えることにより実施することができる。保存的アミノ酸置換の例としては以下のものが挙げられる。
Figure 0007065516000002
本明細書で使用される「配列同一性」という用語は、２つのポリペプチド配列または２つの核酸配列の間の配列同一性のパーセンテージを指す。２つのアミノ酸配列または２つの核酸配列のパーセント同一性を決定するには、配列を最適な比較目的で整列させる（例えば、第二のアミノ酸配列または核酸配列との最適アライメントのために第一のアミノ酸配列または核酸配列の配列内にギャップを導入することができる）。次いで、対応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置のアミノ酸残基またはヌクレオチドを比較する。第一の配列内のある位置が第二の配列内の対応する位置と同じアミノ酸残基またはヌクレオチドで占められている場合、その分子は上記の位置において同一である。２つの配列間のパーセント同一性は、その配列が共有する同一位置の数の関数である（すなわち、％同一性＝同一の重複位置の数／位置の総数×１００％）。一実施形態では、２つの配列は同じ長さである。２つの配列間のパーセント同一性の決定はまた、数学的アルゴリズムを用いて実施することができる。２つの配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例には、ＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９３，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９０：５８７３－５８７７で改変されたＫａｒｌｉｎおよびＡｌｔｓｃｈｕｌ，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：２２６４－２２６８のアルゴリズムがある。Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３のＮＢＬＡＳＴプログラムおよびＸＢＬＡＳＴプログラムにはそのようなアルゴリズムが組み込まれている。ＮＢＬＡＳＴヌクレオチドプログラムパラメータを例えばスコア＝１００、ワード長＝１２に設定してＢＬＡＳＴヌクレオチド検索を実施し、本願の核酸分子と相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＸＢＬＡＳＴプログラムパラメータを例えばスコア－５０、ワード長＝３に設定してＢＬＡＳＴタンパク質検索を実施し、本明細書に記載されるタンパク質分子と相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的でギャップ付きアライメントを得るには、Ａｌｔｓｃｈｕｌら，１９９７，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５：３３８９－３４０２に記載されているＧａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴを用いることができる。あるいは、ＰＳＩ－ＢＬＡＳＴを用いて、分子間の距離関係を検出する反復検索を実施することができる（同文献）。ＢＬＡＳＴプログラム、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴプログラムおよびＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを用いる場合、それぞれのプログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴおよびＮＢＬＡＳＴ）の初期パラメータを用いることができる（例えば、ＮＣＢＩのウェブサイトを参照されたい）。配列の比較に用いられる数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例には、ＭｙｅｒｓおよびＭｉｌｌｅｒ，１９８８，ＣＡＢＩＯＳ ４：１１－１７のアルゴリズムがある。ＧＣＧ配列アライメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）には、そのようなアルゴリズムが組み込まれている。アミノ酸配列の比較にＡＬＩＧＮプログラムを用いる場合、ＰＡＭ１２０加重残基表、ギャップ長ペナルティ１２およびギャップペナルティ４を用いることができる。ギャップを許容するかしないかを問わず、上記のものと類似した技術を用いて２つの配列間のパーセント同一性を決定することができる。パーセント同一性を算出する際には通常、完全一致のみをカウントする。
抗体に関しては、抗体配列をＩＭＧＴまたはその他のもの（例えば、Ｋａｂａｔ番号付けの慣例）により最大限に整列させたとき、パーセンテージ配列同一性を決定することができる。アライメント後、対象抗体領域（例えば、重鎖または軽鎖の全成熟可変領域）を参照抗体の同じ領域と比較している場合、対象抗体領域と参照抗体領域の間のパーセンテージ配列同一性は、ギャップをカウントせず、対象抗体領域および参照抗体領域の両方で同じアミノ酸によって占められている位置の数を、整列させた２つの領域の位置の総数で除したものに１００を乗じてパーセンテージに変換したものとする。
本明細書で使用される「核酸配列」という用語は、天然の塩基、糖および糖間（主鎖）結合よりなるヌクレオシドモノマーまたはヌクレオチドモノマーの配列を指す。この用語はまた、非天然のモノマーまたはその一部分を含む修飾または置換された配列を包含する。本願の核酸配列は、デオキシリボ核酸配列（ＤＮＡ）またはリボ核酸配列（ＲＮＡ）であり得、アデニン、グアニン、シトシン、チミジンおよびウラシルを含めた天然の塩基を包含し得る。配列はまた、修飾塩基を含み得る。このような修飾塩基の例としては、アザおよびデアザアデニン、グアニン、シトシン、ミジンおよびウラシル；ならびにキサンチンおよびヒポキサンチンが挙げられる。核酸は二本鎖または一本鎖であり得、センス鎖またはアンチセンス鎖を表す。さらに、「核酸」という用語は、相補的核酸配列およびコドン最適化等価物または同義コドン等価物を包含する。本明細書で使用される「単離核酸配列」という用語は、組換えＤＮＡ技術により作製された場合は実質的に細胞物質も培地も含まない核酸、あるいは化学的に合成された場合は化学的前駆体またはその他の化学物質を指す。単離核酸はまた、その核酸が由来する核酸に天然の状態で隣接する配列（すなわち、核酸の５’側および３’側に位置する配列）を実質的に含まない。
「作動可能に連結されている」は、核酸の発現が可能なようにその核酸が制御配列を連結されていることを意味するものとする。適切な制御配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫の遺伝子を含めた様々な供給源に由来するものであり得る。適切な制御配列の選択は、選択する宿主細胞によって決まり、当業者により容易に達成され得る。このような制御配列の例としては、転写プロモーターおよび転写エンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含めたリボソーム結合配列が挙げられる。さらに、選択する宿主細胞および用いるベクターに応じてその他の配列、例えば複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導性を付与する配列などを発現ベクター内に組み込み得る。
本明細書で使用される「ベクター」という用語は、核酸分子を例えば、原核細胞および／または真核細胞内に導入し、かつ／あるいはゲノム内に組み込むことを可能にする前記核酸分子の任意の中間運搬体を含み、プラスミド、ファージミド、バクテリオファージまたはウイルスベクター、例えばレトロウイルス系ベクター、アデノ関連ウイルスベクターなどがこれに包含される。本明細書で使用される「プラスミド」という用語は一般に、通常は環状ＤＮＡ二本鎖であり、染色体ＤＮＡとは独立して複製することができる、染色体外遺伝物質の構築物を指す。
「少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、溶液中の２つの相補的核酸分子の間の選択的ハイブリダイゼーションを促進する条件を選択することを意味する。ハイブリダイゼーションは核酸配列分子の全部または一部に起こり得る。ハイブリダイズする部分は通常、少なくとも１５（例えば、２０、２５、３０、４０または５０）ヌクレオチドの長さである。当業者には、核酸の二本鎖またはハイブリッドの安定性が、ナトリウム含有緩衝液中でのナトリウムイオン濃度と温度の関数であるＴｍ（Ｔｍ＝８１．５℃－１６．６（Ｌｏｇ１０［Ｎａ＋］）＋０．４１（％（Ｇ＋Ｃ）－６００／ｌ）またはこれと類似した方程式）によって決まることが認識されよう。したがって、ハイブリッドの安定性を決定する洗浄条件のパラメータはナトリウムイオン濃度および温度である。既知の核酸分子に類似しているが同一ではない分子を特定するには、１％のミスマッチによりＴｍが約１℃低下するものと考えられ、例えば、同一性が９５％を上回る核酸分子を探索するのであれば、最終洗浄温度は約５℃低下することになる。当業者は、これらの考慮事項に基づき、適切なハイブリダイゼーション条件を容易に選択することが可能であろう。好ましい実施形態では、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件を選択する。例として、以下の条件を用いてストリンジェントなハイブリダイゼーションを実施し得る：上の方程式に基づき、Ｔｍを－５℃とし、５×塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム（ＳＳＣ）／５×デンハルト溶液／１．０％ＳＤＳで、ハイブリダイゼーションを実施し、次いで、６０℃にて０．２×ＳＳＣ／０．１％ＳＤＳで洗浄する。中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件には、４２℃、３×ＳＳＣでの洗浄段階が含まれる。ただし、上のものに代わる緩衝液、塩および温度を用いても同等のストリンジェンシーが達成され得ることが理解される。ハイブリダイゼーション条件に関するさらなる指針については、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎ．Ｙ．，２００２およびＳａｍｂｒｏｏｋら，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，２００１にみることができる。
本明細書で使用され、当該技術分野でも十分に理解されている「治療すること」または「治療」という用語は、臨床結果を含めた有益な結果または所望の結果を得る方法を意味する。有益な臨床結果または所望の臨床結果としては、特に限定されないが、検出可能なものであるか検出不可能なものであるかを問わず、１つまたは複数の症状または病態の軽減または改善、疾患の程度の減少、疾患の状態の安定化（すなわち、悪化しないこと）、疾患の拡散の予防、疾患進行の遅延または緩徐化、病状の改善または緩和、疾患再発の減少および寛解（部分寛解または完全寛解を問わない）が挙げられる。「治療すること」および「治療」はまた、治療を受けない場合に予想される生存期間と比較して生存期間が長くなることを意味し得る。本明細書で使用される「治療すること」および「治療」はまた、予防的治療を包含する。例えば、初期段階のＡＤを有する対象を本明細書に記載される化合物、抗体、免疫原、核酸または組成物で治療して進行を予防することができる。
本明細書で使用される「投与される」という用語は、細胞または対象への治療有効量の開示の化合物または組成物の投与を意味する。
本明細書で使用される「有効量」という語句は、所望の結果を得るのに必要な投与回数および期間で効果が得られる量を意味する。対象に投与する場合、有効量は対象の病状、年齢、性別、体重などの因子に応じて異なり得る。最適な治療反応を得るために投与レジメンを調整し得る。
「薬学的に許容される」という用語は、担体、希釈剤または補形剤が、製剤の他の成分と適合性があり、その被投与者に対して実質的に有害でないことを意味する。
１つまたは複数の記載される要素を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇまたはｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」組成物または方法は、具体的に記載されていない他の要素を含み得る。例えば、抗体を「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅまたはｉｎｃｌｕｄｅ）」組成物は、抗体を単独で、または他の成分とともに含有し得る。
本開示の範囲を理解するにあたっては、本明細書で使用される「～よりなる」という用語またはその派生語は、記載される特徴、要素、成分、グループ、整数および／または段階の存在を明記し、また他の記載されていない特徴、要素、成分、グループ、整数および／または段階の存在を排除する、オープンエンドな用語であるものとする。
本明細書で端点により数値範囲が記載されている場合、その範囲内に含まれる数および端数がいずれも含まれる（例えば、１～５には、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４および５が含まれる）。また、数およびその端数はすべて「約」という用語によって修飾されるものと考えられることを理解するべきである。さらに、「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、内容からそうでないことが明らかでない限り、複数形の指示対象を包含することを理解するべきである。「約」という用語は、言及されている数のプラスまたはマイナス０．１～５０％、５～５０％または１０～４０％、好ましくは１０～２０％、より好ましくは１０％または１５％を意味する。
さらに、当業者であれば理解するように、特定のセクションに記載される定義および実施形態は、本明細書に記載される他の実施形態のうちそれらが適しているものに適用可能であるものとする。例えば、以下の節では、本発明の様々な態様がさらに詳細に定義される。そのように定義された各態様は、そうでないことが明記されない限り、１つまたは複数の他の任意の態様と組み合わせ得る。特に、好ましいまたは有利であると示されている任意の特徴と、好ましいまたは有利であると示されている他の任意の特徴とを組み合わせ得る。
冠詞の単数形である「ａ」、「ａｎ」および「ｔｈｅ」は、文脈上そうでないことが明らかでない限り、複数の指示物を包含する。例えば、「化合物（ａ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）」または「少なくとも１つの化合物」という用語は、複数の化合物をその混合物も含め包含し得る。
ＩＩ．エピトープおよび結合タンパク質
本発明者らは、Ａベータのアミノ酸残基６～９にＡベータの「エピトープ領域」ＨＤＳＧ（配列番号１）を特定した。本発明者らはさらに、そのエピトープ領域が立体配座エピトープであり得る、またはこれを含み得ることおよびＨＤＳＧ（配列番号１）がＡベータのオリゴマー種での抗体結合に選択的に接触可能であり得ることを明らかにした。
理論に束縛されることを望むものではないが、線維は、オリゴマー化を触媒する傾向のある相互作用部位を示し得る。このことは、正常な個体には存在しない選択的な線維表面が露出され、Ａベータモノマーとの異常な相互作用を起こすことが可能である場合にのみ起こり得る。低ｐＨ、炎症時に存在するオスモライトまたは酸化的損傷などの環境変化が線維の破壊を誘発し、より安定性の低い領域の露出を引き起こし得ると考えられる。その結果、これらの低安定性領域を予測し、そのような予測を用いて、上記の領域を標的とする抗体を合理的に設計することに関心が持たれている。線維内で破壊される可能性のある領域はまた、オリゴマー種内で露出する領域の有力な候補となり得る。
不規則になりやすい隣接するタンパク質領域を予測するためのコンピュータに基づくシステムおよび方法が、２０１５年１１月９日に出願され全体が参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６２／２５３０４４号「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｂｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｂｉａｓｉｎｇ」に記載されている。実施例に記載されるように、この方法をＡベータに適用し、本明細書で示されるように、Ａベータオリゴマーにおいて特異的または選択的により接触可能なエピトープを特定した。
実施例に記載されるように、環状ペプチドであるシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）は、モノマー種および／または線維種と比較したオリゴマーのＨＤＳＧ（配列番号１）エピトープの立体配座の差を１つまたは複数捕捉し得る。例えば、環状７量体シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）の溶媒接触表面積、曲率、ＲＭＳＤ構造アライメントならびにいくつかのアミノ酸および二面角の二面角分布の差は、モノマーおよび／または線維と実質的に異なっていることが明らかになり、環状ペプチドが直線状エピトープとは異なる立体配座エピトープをもたらすことが示唆された。シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）を含む免疫原を使用して生じさせた抗体は、直鎖状ＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）よりも選択的にシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）と結合し、単量体のＡベータ斑およびＡベータ線維斑と比較して合成および／または天然のオリゴマーＡベータ種と選択的に結合した。さらに、シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）に対して生じさせた抗体によりＡベータ凝集のｉｎ ｖｉｔｒｏでの伝播を阻害することができた。
ＩＩ．ＨＤＳＧ（配列番号１）「エピトープ」化合物
したがって、本開示は、アミノ酸ＨＤＳＧ（配列番号１）またはその一部よりなるＡベータのエピトープを特定するものであり、ＨＤＳＧ（配列番号１）はＡベータのアミノ酸残基６～９に対応する。実施例で示されるように、エピトープＨＤＳＧ（配列番号１）、ＨＤＳＧＹ（配列番号４）およびＲＨＤＳＧ（配列番号５）（本明細書でまとめて「ＨＤＳＧおよび関連エピトープ」と呼ばれるエピトープに包含される）がＡベータ線維で不規則になりやすい領域として特定された。残基ＨＤＳＧ（配列番号１）は集団座標法を用いた２つの予測に現れたものであり、このエピトープの隣接残基であるＲ５およびＹ１０はそれぞれ、１つの予測にみられたものである。
一態様は、ＨＤＳＧ（配列番号１）、関連エピトープの配列および／または上記のいずれかのものの一部を含む、あるいはこれよりなる単離Ａベータペプチドを含む、化合物を含む。
一実施形態では、Ａベータペプチドは、ＨＤＳＧ（配列番号１）、ＨＤＳＧＹ（配列番号４）もしくはＲＨＤＳＧ（配列番号５）を含む、またはこれよりなるアミノ酸配列から選択される。一実施形態では、Ａベータペプチドは、表１２のいずれか１つのエピトープに記載されるＡベータペプチドの配列を有する。一実施形態では、化合物は、配列番号２、配列番号２、２８および２９のいずれかで示される配列を含む。
一実施形態では、化合物はシクロペプチドなどの環状化合物である。シクロペプチドおよび環状ペプチドという用語は、本明細書では互換的に使用される。
いくつかの実施形態では、ＨＤＳＧ（配列番号１）（またはその一部）を含むＡベータペプチドは、ＨＤＳＧ（配列番号１）（またはその一部）のＮ末端および／またはＣ末端に、Ａベータ内に存在する追加の残基を１個、２個または３個含んでよく、例えば、Ａベータペプチドは、Ｎ末端側に残基を１個含み、ＲＨＤＳＧ（配列番号５）となり得る。例えば配列番号３のＡベータ配列に示されるように、ＡベータのＨＤＳＧ（配列番号１）のＮ末端側の３個のアミノ酸はＥＦＲであり、ＨＤＳＧ（配列番号１）のＣ末端側の３個のアミノ酸はＹＥＶである。Ａベータペプチドを含む化合物が環化されている実施形態では、Ａベータペプチドは、８個のＡベータ残基、７個のＡベータ残基もしくは６個のＡベータ残基である、またはこれを最長とする残基である。一実施形態では、Ａベータペプチドは、５個のＡベータ残基である、またはこれを最長とする残基である。例えば、Ａベータペプチドが６個のアミノ酸である場合、それはアミノ酸配列ＲＨＤＳＧＹ（配列番号１３）、ＨＤＳＧＹＥ（配列番号１１）、ＤＳＧＹＥＶ（配列番号１５）もしくはＦＲＨＤＳＧ（配列番号１６）を含む、またはこれよりなるものであり得る。
一実施形態では、化合物はリンカーをさらに含む。リンカーは、スペーサーおよび／または１つもしくは複数の官能化可能な部分を含む。リンカーは、例えば、１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個もしくは８個のアミノ酸および／またはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）部分などの同等に機能する分子ならびに／あるいはその組合せを含み得る。一実施形態では、スペーサーアミノ酸は、非免疫原性または低免疫原性のアミノ酸残基、例えばＧおよびＡなどから選択され、例えば、スペーサーは、ＧＧＧ、ＧＡＧ、Ｇ（ＰＥＧ）Ｇ、ＰＥＧ－ＰＥＧ－ＧＧなどであり得る。１つまたは複数の官能化可能な部分、例えば官能基を有するアミノ酸は、例えば、化合物と、作用物質もしくは検出可能な標識、ＢＳＡなどの担体またはＫＬＨなどの免疫原性増強物質とを結合させるために含まれ得る。
一実施形態では、リンカーは、ＧＣ－ＰＥＧ、ＰＥＧ－ＧＣ、ＧＣＧまたはＰＥＧ－Ｃ－ＰＥＧを含む。
一実施形態では、リンカーは、２、３、４、５、６、７個または８個のアミノ酸を含む。
ＨＤＳＧ（配列番号１）またはその一部を含むＡベータペプチドが、ＡベータにみられＨＤＳＧ（配列番号１）のＮ末端側および／またはＣ末端側にある追加の残基を１個、２個または３個含む実施形態では、リンカーは、Ａベータ残基のＮ末端および／またはＣ末端と共有結合している（例えば、ペプチドがＲＨＤＳＧ（配列番号５）である場合、リンカーはＲ残基およびＧ残基と共有結合している）。これと同様に、ＡベータペプチドがＨＤＳＧ（配列番号１）である場合、リンカーは残基ＨおよびＧと共有結合し、ＡベータペプチドがＨＤＳＧＹ（配列番号４）である場合、リンカーは残基ＨおよびＹと共有結合している。
化合物（またはリンカーもタンパク質性である化合物）のタンパク質性部分は、タンパク質化学でよく知られている固相合成または均質溶液中での合成などの技術を用いる化学合成により調製し得る。
上記のように、化合物は環状化合物であり得る。本明細書で「環状ペプチド」と記載される場合、それは（例えば、リンカーが１個、２個、３個、４個、５個、６個、７個または８個のアミノ酸である）完全にタンパク質性の化合物を指す。実施例で決定され環状ペプチドについて記載される特性を、非アミノ酸リンカー分子を含む他の化合物（例えば、他の環状化合物）に組み込み得ることが理解される。「シクロペプチド」および「環状ペプチド」という用語は、本明細書では互換的に使用される。
したがって、一態様では、ペプチドＨＤＳＧ（配列番号１）（またはＤＳＧなどの上記ペプチドの一部）とリンカーとを含み、リンカーが、ＨＤＳＧ（配列番号１）を含むペプチド（例えば、ペプチドがＨＤＳＧ（配列番号１）よりなる場合、Ｈ残基およびＧ残基）と直接的または間接的に共有結合している、環状化合物が提供される。環状化合物内では、例えば、少なくともＨ、Ｄおよび／またはＳが、対応する直鎖状ペプチド、任意選択で、より拘束された立体配座でのＨ、Ｄおよび／またはＳとは別の立体配座にある。
一実施形態では、環状化合物は、ＨＤＳＧ（配列番号１）と最大６個のＡベータ残基（例えば、ＨＤＳＧ（配列番号１）のＮ末端および／またはＣ末端の１個または２個のアミノ酸）とを含むＡベータペプチドと、リンカーとを含み、リンカーが、ＡベータペプチドのペプチドＮ末端残基およびＣ末端残基と直接的または間接的に共有結合している。環状化合物内では、例えば、少なくともＤが対応する直鎖状ペプチド内でのＤとは別の立体配座にある、または少なくともＳが対応する直鎖状ペプチド内でのＳとは別の立体配座にあり、任意選択で、少なくともＨまたは少なくともＤが、含む対応する直鎖状ペプチド内で占められる立体配座より拘束された立体配座にある。
環状化合物を環化前に、Ａベータペプチド、任意選択でＨＤＳＧ（配列番号１）または関連エピトープを含むペプチドのＮ末端またはＣ末端と共有結合したリンカーを有する、直鎖状分子として合成することができる。あるいは、環化前に、リンカーの一部をＮ末端と共有結合させ、一部をＣ末端と共有結合させる。いずれの場合も、直鎖状化合物を例えば頭－尾環化（例えば、アミド結合環化）で環化する。
一実施形態では、環状化合物は、ＨＤＳＧ（配列番号１）を含む、またはこれよりなるＡベータペプチドと、リンカーとを含み、リンカーが、ペプチドのＮ末端およびＣ末端（例えば、ペプチドがＨＤＳＧ（配列番号１）よりなる場合、Ｈ残基およびＧ残基）と結合している。一実施形態では、少なくともＨ、Ｄおよび／またはＳが環状化合物内で、ＨＤＳＧ（配列番号１）を含む直鎖状化合物（例えば、直鎖状ペプチド）内でＨ、Ｄおよび／またはＳによって占められるものとは別の立体配座にある。
Ａベータ配列を含む直鎖状ペプチドは直鎖状化合物に含まれ得る。ＨＤＳＧ（配列番号１）を含む直鎖状化合物または直鎖状ペプチドは、一実施形態では、対応する直鎖状ペプチドである。別の実施形態では、直鎖状ペプチドは、例えば、Ａベータ残基１～３５またはそれより小さいＡベータ残基１～２０、２～２０、３～２０、１～１５、３～１５、３～１２などの部分を含む直鎖状ペプチドを含めた、ＨＤＳＧ（配列番号１）を含む任意の長さのＡベータペプチドである。直鎖状ペプチドはまた、いくつかの実施形態では完全長のＡベータペプチドであり得る。
一実施形態では、少なくともＨ、Ｄおよび／またはＳが環状化合物内で、モノマーおよび／または線維内で残基、任意選択でＨおよび／またはＤによって占められるものとは別の立体配座にある。
一実施形態では、少なくともＤ、Ｓおよび／またはＨが環状化合物内で、モノマーおよび／または線維内で残基、任意選択でＤおよび／またはＳによって占められるものとは別の立体配座にある。
一実施形態では、別の立体配座は拘束された立体配座である。
一実施形態では、少なくともＨは任意選択で、単独で、または少なくともＤと組み合わさって、ＨＤＳＧ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチドにおいて占められる立体配座より拘束された立体配座にある。
一実施形態では、Ｈならびに／あるいはＤおよび／またはＳのうちの１つまたは複数のものと組み合わさったＨの立体配座は、別の立体配座、任意選択でより拘束された立体配座の化合物に含まれる。
図６に示されるように、残基ＨおよびＤは、環状化合物内では直鎖状ペプチド内に存在する立体配座アンサンブルより拘束された立体配座にある。この図から、Ｈに関しては約８１．７％のエントロピー減少があり、Ｄに関しては約４９．８％のエントロピー減少があることがわかる。一実施形態では、環状化合物は、残基Ｈおよび／またはＤのエントロピー減少により定量化したとき、対応する直鎖状化合物より少なくとも１０％、少なくとも２０％、少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも３５％または少なくとも４０％拘束された立体配座Ｈおよび／またはＤを有する。
例えば、別の立体配座は、残基Ｈおよび／またはＤおよび／またはＳに、ならびに任意選択で直鎖状ペプチドおよび／または線維におけるペプチドの二面角と異なるＤおよび／またはＳに、１つあるいは複数の異なる二面角を含み得る。
図４に示されるように、環状ペプチドのＤ７の二面角分布は、直鎖状ペプチドまたは線維における残基と比較して大幅に異なる。一実施形態では、環状化合物は、直鎖状ペプチドおよび／または線維において対応する二面角と少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度または少なくとも１４０度異なるＯ－Ｃ－Ｃα－Ｃβ（Ｏ－Ｃ－ＣＡ－ＣＢとも呼ばれる）二面角を含む、Ｄを含む。例えば、表１から、シミュレートした直鎖状ペプチド、環状ペプチドおよび線維では、この二面角の差は、環状と直鎖状との間では約１６０度であり、環状と線維との間では約１９５度であることがわかる。したがって、一実施形態では、環状化合物は、線維において対応する二面角と少なくとも１４０度異なる、少なくとも１５０度異なる、少なくとも１６０度異なる、少なくとも１７０度異なるＯ－Ｃ－Ｃα－Ｃβ（Ｏ－Ｃ－ＣＡ－ＣＢとも呼ばれる）二面角を含む、Ｄを含む。
表１からまた、例えば残基Ｈ、ＤおよびＳのものを含めた他の角の二面角分布に差があることが確認される。
したがって、一実施形態では、環状化合物は、Ｈ、ＤおよびＳから選択されるＡベータペプチド残基を含み、少なくとも１つの二面角が、直鎖状化合物において対応する二面角と少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度または少なくとも１４０度異なる。
一実施形態では、環状化合物は、環状化合物と直鎖状ペプチドとの間で最小の平均側鎖／主鎖二面角差を含む。例えば、表３に挙げる重心立体配座について、環状ペプチドと直鎖状ペプチドとの間の平均側鎖／主鎖二面角差は、Ｈ：２８．５度，Ｄ：１３３度，Ｓ：１２９度，Ｇ：１３度であることが示されている。環状と線維との間でこれに対応する数は、Ｈ：５１度，Ｄ：１０３度，Ｓ：１１４度，Ｇ：７３度である。
したがって、一実施形態では、環状化合物は、直鎖状ペプチドと比較して少なくとも、Ｈについては少なくとも２０度；Ｄおよび／またはＳについては少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度もしくは少なくとも１２０度；および／またはＧについては少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度もしくは少なくとも６０度の平均側鎖差を含む。
角の差は、例えば正または負、（＋）または（－）であり得る。
別の立体配座は別の主鎖配向を含み得る。例えば、環状エピトープが抗体に対して露出する主鎖配向は、直鎖型または線維型と比較して異なるものである。
図７は、配列ＣＧＨＧＳＧＧよりなる直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドの両方ならびにＰＤＢ ２Ｍ４Ｊの初期条件を用いた平衡化線維構造におけるＨＤＳＧ（配列番号１）の残基Ｈ６、Ｄ７、Ｓ８およびＧ９について、平衡シミュレーションでサンプリングしたファイ角およびプサイ角をプロットしたものである。図７から、環状ペプチドの主鎖二面角（ラマチャンドランファイ／プサイ角）の分布が、直鎖状ペプチドまたは線維構造２Ｍ４ＪにおけるＡベータペプチドＨＤＳＧ（配列番号１）についてサンプリングしたラマチャンドラン角の分布とは特に残基Ｄ７およびＳ８で異なることがわかる。表２に、主鎖ファイ／プサイ角の分布のピーク値の差を記載する。同様に、表３は、主鎖ファイ／ファイ角および重心構造の差（図１０にプロットする）を示している。例えば、表３に二面角が記載されている最大の直鎖状クラスターおよび最大の線維クラスターの重心立体配座について、環状ペプチドと直鎖状ペプチドとの間の平均主鎖ラマチャンドラン角差（ΔΦ、デルタΨ）は、ＨＤＳＧ（配列番号１）：（－３．０、－１．１）度、（７２．６、１６４．１）度：（６７．８、１９５．１）度、（－３８．８、１３．４）度となり；環状ペプチドと線維ペプチドとの間の平均主鎖ラマチャンドラン角差（ΔΦ、デルタΨ）は、（－５３．７、２９．７）度、（４．７、－１５４．５）度、（８６．５、１２９）度、（１２７、－１６３．８）度となる。
したがって、一実施形態では、環状化合物は、主鎖ファイ／プサイ角が、対応する直鎖状ペプチドまたは線維ＰＤＢ構造におけるものと比較して少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度異なる、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度、少なくとも１４０度、少なくとも１５０度、少なくとも１６０度、少なくとも１７０度または少なくとも１８０度である少なくとも１個の残基を有する、Ａベータペプチドを含む。
別の立体配座はまた、対応する直鎖状ペプチドおよび／またはＡベータ線維と比較して、アミノ酸を中心とする曲率またはＨＤＳＧ（配列番号１）もしくは関連エピトープを含む環状化合物の曲率の増大を含み得る。
一実施形態では、別の立体配座ＨＤＳＧ（配列番号１）は、直鎖状ＨＤＳＧ（配列番号１）と比較して増大した曲率を有する。実施例に示されるように、環状化合物の主鎖のＤ７およびＳ８の位置における曲率は、実施例２に記載されるように、直鎖状ペプチドまたは線維におけるペプチド（図２）の上記の位置における曲率と比較して増大している。
シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）、直鎖状ＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）および線維におけるＨＤＳＧ（配列番号１）のＨ、Ｄ、Ｓ、Ｇの曲率の値が決定されており、これを実施例２に記載する。
したがって、化合物は、別の立体配座のＤおよび／またはＳの曲率が、対応する直鎖状ペプチドまたは線維におけるＤ７もしくはＳ８と比較して少なくとも０．１ラジアン、０．２ラジアン、０．３ラジアンまたはそれ以上増大している、Ａベータペプチドを含む。
一実施形態では、ＨＤ、ＤＳ、ＳＧ、ＨＤＳ、ＤＳＧおよび／またはＨＤＳＧ（配列番号１）は、例えば直鎖状ペプチドおよび／または線維などの非オリゴマー立体配座でこれら残基によって占められるものと比較して、別の立体配座にある。
さらに、環状ペプチドでは、側鎖のエントロピーが直鎖状ペプチドと比較して減少しており、側鎖が直鎖状ペプチドよりも構造化された立体配座になっている。
本明細書で示されるように、環状化合物の曲率は、直鎖状ペプチドのものまたは線維におけるペプチドに対するものとは異なるいくつかのアミノ酸に関するものである（図２）。例えば、対応する直鎖状ペプチドと比較した環状化合物ＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）におけるＤ７の曲率が増大している。
したがって、一実施形態では、環状化合物のＤおよび／またはＳの曲率は、対応する直鎖状化合物と比較して少なくとも１０％、少なくとも２０％または少なくとも３０％増大している。
また、残基Ｈおよび／またはＤおよび／またはＳの二面角のうち１つまたは複数のものは、直鎖状ペプチドまたは線維におけるペプチドの二面角と大幅に異なる傾向があることが示されている。これらのアミノ酸では、溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）を溶解度により重み付けすると、残基Ｓ８がより強調される。Ｈ６の側鎖のエントロピーは、環状ペプチドの方が直鎖状ペプチド、さらには線維よりも減少しており、この残基には制約されたポーズを有する傾向があることを示している。
同様の変化を示す環状化合物も包含される。
ＨＤＳＧ（配列番号１）または関連エピトープを含むペプチドを含む、いくつかの実施形態の環状化合物は、ＡベータのＨＤＳＧ（配列番号１）または関連エピトープのすぐ上流および／または下流に１個、２個、３個またはそれ以上の残基を含み得る。このような場合、Ａベータ配列の対応する残基の末端のＮ末端およびＣ末端にスペーサーが共有結合している。
いくつかの実施形態では、リンカーまたはスペーサーは、ＡベータペプチドのＮ末端残基およびＣ末端残基と間接的に結合している。
一実施形態では、環状化合物は図１１Ｂに示される化合物である。
環化ペプチドを作製する方法は当該技術分野で公知であり、ＳＳ環化またはアミド環化（頭－尾環化または主鎖環化）がこれに含まれる。実施例３に方法をさらに記載する。例えば、Ｎ末端およびＣ末端に「Ｃ」残基を有するペプチド、例えばＣＧＨＤＳＧＧＣ（配列番号２）をＳＳ環化により反応させて、環状ペプチドを得ることができる。
実施例２に記載されるように、図１１Ｂの環状化合物について、特定された立体配座エピトープとの関連性を評価した。ＨＤＳＧ（配列番号１）ペプチドを含む環状化合物は、例えば、１つまたは複数の立体配座的特徴に選択的な抗体を生じさせるのに使用することができる。
本明細書に記載されるエピトープＨＤＳＧ（配列番号１）および／またはその一部は、Ａベータに含まれるＡベータのミスフォールドされた伝播性の株における潜在的な標的となり得、その立体配座エピトープを認識する抗体は、例えば、そのような伝播性の株の検出に有用であり得る。
別の態様では、直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドを含めた本明細書に記載されるＡベータペプチド配列を含む、単離ペプチドも提供される。直鎖状ペプチドは、例えば、それと結合しない抗体の選択に使用することができる。単離ペプチドは、本明細書に記載されるリンカー配列を含み得る。リンカーは、ＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）直鎖状ペプチドでは、Ｎ末端またはＣ末端と共有結合していても、あるいは一部がＮ末端と結合し、一部がＣ末端と結合していてもよい。環状ペプチドでは、リンカーはＣ末端およびＮ末端と直接的または間接的に結合している。
別の態様は、本明細書に記載される化合物、任意選択で環状化合物を含む、免疫原を含む。免疫原はまた、例えばＨＤＳ、ＤＳＧもしくはＨＤＳＧ（配列番号１）またはほかのＡベータ配列を含み得る。ＨＤＳ、ＤＳＧもしくはＨＤＳＧ（配列番号１）または関連エピトープ配列のすぐ上流および／または下流（すなわち、Ｎ末端側および／またはＣ末端側）にはアミノ酸が存在し得る。このような免疫原に対して生じさせた抗体を、例えば、ＨＤＳＧ（配列番号１）または関連エピトープを含むシクロペプチドとの結合に関して選択することができる。
免疫原を対象への投与のために適切に調製または製剤化され、例えば、免疫原は無菌のものまたは精製されたものであり得る。
一実施形態では、免疫原は、ＨＤＳＧまたは関連エピトープを含む環状ペプチドである。
一実施形態では、免疫原は、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはＭＡＰ抗原などの免疫原性増強物質を含む。免疫原性増強物質は、アミド結合などを介して直接、またはリンカーの官能化可能な部分を介して間接的に、化合物と結合していてよい。（例えば、環状化合物内のＡベータペプチドが６アミノ酸残基であり）リンカーが単一のアミノ酸残基である場合、リンカーは官能化可能な部分（例えば、システイン残基）であり得る。
免疫原は、例えば、参照により本明細書に組み込まれるＬａｔｅｅｆら（２００７）に記載されている方法を用いて、拘束されたエピトープペプチドを含む環状化合物と、キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）などの免疫原性増強物質またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）などの担体とをコンジュゲートすることにより作製することができる。一実施形態では、実施例３または４に記載される方法を用いる。
さらなる態様は、本明細書に記載される化合物または免疫原のタンパク質性部分をコードする単離核酸分子である。
実施形態では、核酸分子は、配列番号１～１６で示されるアミノ酸配列のいずれか１つをコードする。
一実施形態では、核酸分子は、ＨＤＳＧ（配列番号１）または関連エピトープおよび任意選択で、本明細書に記載されるリンカーをコードする。
さらなる態様は、前記核酸を含むベクターである。適切なベクターについては本明細書の他の箇所に記載する。
ＩＩＩ．抗体、細胞および核酸
上記の化合物および特に環状化合物を用いて、Ａベータ内のＤＳ、ＨＤＳもしくはＨＤＳＧ（配列番号１）（例えば、残基６～７、６～８もしくは６～９）と特異的に結合する抗体および／またはＡベータの種、例えばＡベータのオリゴマー種のＤＳ、ＨＤＳＶもしくはＨＤＳＧ（配列番号１）の特定の立体配座を認識する抗体を生じさせることができる。これと同様に、例えばＲＨＤＳＧ（配列番号５）、ＨＤＳＧＹ（配列番号４）、ＨＤＳＧ（配列番号１）および／または本明細書に記載されるその他の関連エピトープ配列を含む環状化合物を用いて、ＨＤＳＧ（配列番号１）などおよび／またはその特定の立体配座エピトープと特異的に結合する抗体を生じさせることができる。本明細書で示されるように、シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）に対する抗体を生じさせ、この抗体は、直鎖状ＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）よりもシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）と特異的かつ／または選択的に結合した。
したがって、一態様は、例えば配列番号１～１６のいずれか１つで示される配列ＨＤＳＧ（配列番号１）または関連エピトープ配列を有するＡベータペプチドと特異的に結合する、抗体（その結合フラグメントを含む）を含む。
一実施形態では、Ａベータペプチドは環状ペプチド内に含まれており、抗体は、環状化合物内で提示されるＡベータに対して特異的または選択的なものである。
一実施形態では、抗体は環状化合物のＡベータペプチドと特別かつ／または選択的に結合し、Ａベータは、配列番号１～１６のいずれか１つで示される配列を有する。
一実施形態では、環状化合物は環状ペプチドである。一実施形態では、環状ペプチド内のＡベータペプチドは配列番号１～１６のいずれか１つである。さらなる実施形態では、環状ペプチドは配列番号２、１２、２８または２９で示される配列を有する。
実施例に記載されるように、実施例に記載されるアッセイを用いて、１つまたは複数の特性を有する抗体を選択することができる。
一実施形態では、抗体は、配列ＨＤＳＧ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチドとは結合せず、任意選択で、直鎖状ペプチドの配列は、抗体を生じさせるために使用され任意選択で配列番号２、１２、２８または２９で示される環状配列の直鎖型である。
一実施形態では、抗体は、Ａベータペプチドを含む対応する直鎖状化合物よりも環状化合物内で提示されるＡベータペプチドに対して選択的である。
一実施形態では、抗体はＡベータ上のエピトープと特異的に結合し、エピトープは、ＨＤＳＧ（配列番号１）またはその関連エピトープを含む、またはこれよりなる。
一実施形態では、Ａベータ上で抗体により特異的または選択的に認識されるエピトープは、立体配座エピトープである。
一実施形態では、抗体は単離されている。
一実施形態では、抗体は外来抗体である。
実施例に記載されるように、環状化合物内のＨ、Ｄおよび／またはＳは、モノマー型および／または線維型の対応する直鎖状ペプチドとは異なるＡベータの立体配座で主として接触可能である、または露出し得る。
したがって、さらなる態様は、Ａベータ上のエピトープと特異的に結合する抗体であり、ここでは、エピトープは、抗体との結合に主として関与する少なくとも１個のアミノ酸残基を含む、またはこれよりなるものであり、その少なくとも１個のアミノ酸は、配列ＨＤＳＧ（配列番号１）内に組み込まれたＨ、ＤまたはＳである。一実施形態では、エピトープは、抗体との結合に主として関与する少なくとも２個の連続するアミノ酸残基を含む、またはこれよりなるものであり、その少なくとも２個の連続するアミノ酸は、ＨＤＳＧ（配列番号１）内に組み込まれたＨＤ、ＤＳまたはＳＧである。
別の実施形態では、エピトープはＨＤＳＧ（配列番号１）または関連エピトープよりなる。
一実施形態では、抗体は立体配座選択的抗体である。一実施形態では、抗体は、対応する直鎖状配列よりも本明細書に記載されるエピトープペプチド配列を含む環状化合物と選択的に結合する。例えば、特定のエピトープ立体配座と結合する抗体は、立体配座特異的抗体と呼ぶことができる。このような抗体は、本明細書に記載される方法を用いて選択することができる。立体配座選択的抗体は、特定のＡベータ種または関連種（例えば、二量体、三量体およびその他のオリゴマー種）のグループを区別して認識することが可能であり、ある種または種のグループに対して別の種（例えば、モノマー種または線維種）より高い親和性を有し得る。
一実施形態では、抗体は単量体Ａベータと特異的に結合しない。一実施形態では、抗体は、例えばＡＤの脳組織においてｉｎ ｓｉｔｕで、Ａベータ老人斑と特異的に結合しない。
別の実施形態では、抗体は、天然または合成のオリゴマーＡベータより単量体Ａベータと選択的に結合することはない。
例えば、抗体は、Ｈ、ＤおよびＳから選択され、環状化合物における少なくとも１つの二面角が、直鎖状化合物において対応する二面角と少なくとも３０度、少なくとも４０度、少なくとも５０度、少なくとも６０度、少なくとも７０度、少なくとも８０度、少なくとも９０度、少なくとも１００度、少なくとも１１０度、少なくとも１２０度、少なくとも１３０度または少なくとも１４０度異なる残基を含む、環状化合物と特異的に結合し得る。
一実施形態では、抗体は、対応する配列などのＨＤＳＧ（配列番号１）を含む直鎖状ペプチドよりも、環状化合物内にありＨＤＳＧ（配列番号１）またはその一部を含むＡベータペプチドと選択的に結合する。例えば、一実施形態では、抗体は、環状立体配座のＨＤＳＧ（配列番号１）と選択的に結合し、例えばＥＬＩＳＡまたは任意選択で本明細書に記載される方法によって測定される、環状立体配座のＨＤＳＧ（配列番号１）に対する選択性（例えば、結合親和性）が、直鎖状ペプチド内のＨＤＳＧ（配列番号１）の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍である。
一実施形態では、環状化合物は、シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）または配列番号１２、２８もしくは２９で示される配列を有する環状化合物である。
一実施形態では、抗体は、環状化合物内のＡベータペプチドおよび／またはオリゴマーＡベータと選択的に結合する。一実施形態では、選択性は、環状化合物内のＡベータペプチドおよび／またはＡベータオリゴマーに対して、Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維から選択されるＡベータ種ならびに／あるいは対応する直鎖状ペプチドを含む化合物の少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも５倍、少なくとも１０倍、少なくとも２０倍、少なくとも３０倍、少なくとも４０倍、少なくとも５０倍、少なくとも１００倍、少なくとも５００倍、少なくとも１０００倍選択的である。
一実施形態では、抗体はＡベータ線維斑（老人斑とも呼ばれる）染色を示さない。斑染色がみられないことは、Ａベータ特異的抗体である６Ｅ１０および４Ｇ８（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）または２Ｃ８（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ社、ファーミングデール、ニューヨーク州）などの陽性対照ならびにアイソタイプ対照と比較することにより評価することができる。本明細書に記載される抗体は、その抗体が典型的な斑形態染色を示さず、染色のレベルがＩｇＧ陰性アイソタイプ対照でみられるレベルの２倍と同等またはそれ以下である場合、Ａベータ線維斑染色を示さない、またはほとんど示さないことになる。尺度は、例えば、アイソタイプ対照での染色レベルを１に設定し、６Ｅ１０での染色レベルを１０に設定することができる。抗体は、そのような尺度で染色レベルが２以下である場合、Ａベータ線維斑染色を示さないことになる。実施形態では、抗体は、例えば上記の尺度で、最小限のＡベータ線維斑染色を示し、そのレベルのスコアは少なくとも３程度または３未満である。
一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。
モノクローナル抗体を作製するには、本明細書に記載される免疫原で免疫感作した対象から抗体産生細胞（Ｂリンパ球）を回収し、標準的な体細胞融合法によりミエローマ細胞と融合し、それにより上記の細胞を不死化してハイブリドーマ細胞を得ることができる。このような技術は当該技術分野で周知である（例えば、ＫｏｈｌｅｒおよびＭｉｌｓｔｅｉｎにより最初に開発されたハイブリドーマ技術（Ｎａｔｕｒｅ ２５６：４９５－４９７（１９７５））ならびにその他の技術、例えばヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術（Ｋｏｚｂｏｒら，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｔｏｄａｙ ４：７２（１９８３））、ヒトモノクローナル抗体を作製するＥＢＶハイブリドーマ技術（Ｃｏｌｅら，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ，１２１：１４０－６７（１９８６））およびコンビナトリアル抗体ライブラリーのスクリーニング（Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５（１９８９）など）。本明細書に記載されるエピトープ配列と特異的に反応する抗体の産生に関してハイブリドーマ細胞を免疫学的にスクリーニングし、モノクローナル抗体を単離することができる。
特定の抗原または分子に対して反応性の特異的抗体または抗体フラグメントはまた、細胞表面成分とともに細菌内で発現する免疫グロブリン遺伝子またはその一部をコードする発現ライブラリーをスクリーニングすることにより作製し得る。例えば、ファージ発現ライブラリーを用いて、完全Ｆａｂフラグメント、ＶＨ領域およびＦＶ領域を細菌内で発現させることができる（例えば、Ｗａｒｄら，Ｎａｔｕｒｅ ４１：５４４－５４６（１９８９）；Ｈｕｓｅら，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４６：１２７５－１２８１（１９８９）；およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２－５５４（１９９０）を参照されたい）。
一実施形態では、抗体はヒト化抗体である。
非ヒト種からの抗体のヒト化については文献に十分に記載されている。例えば、欧州特許第号第０２３９４００号（Ｂ１）ならびにＣａｒｔｅｒおよびＭｅｒｃｈａｎｔ １９９７（全体が参照により本明細書に組み込まれるＣｕｒｒ Ｏｐｉｎ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ８，４４９－４５４，１９９７）を参照されたい。ヒト化抗体はまた、商業的に容易に入手できる（例えば、イギリス、ミドルセックス、トゥイッケナム、ホーリーロード２番のＳｃｏｔｇｅｎ Ｌｉｍｉｔｅｄ社）。
ヒト化型のげっ歯類抗体は、ＣＤＲ移植（Ｒｉｅｃｈｍａｎｎら，Ｎａｔｕｒｅ，３３２：３２３－３２７，１９８８）によって容易に作製される。この方法では、げっ歯類モノクローナル抗体の抗原結合部位を含む６つのＣＤＲループと、対応するヒトフレームワーク領域とを結合させる。ＣＤＲ移植では、フレームワーク領域のアミノ酸が抗原認識に影響を及ぼし得ることから、親和性が低下した抗体が得られることが多い（ＦｏｏｔｅおよびＷｉｎｔｅｒ．Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２２４：４８７－４９９，１９９２）。抗体の親和性を維持するには多くの場合、部位特異的変異誘発またはその他の組換え技術により特定のフレームワーク残基を置き換える必要があり、コンピュータによる抗原結合部位のモデル化を援用することもある（Ｃｏら，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ，１５２：２９６８－２９７６，１９９４）。
ヒト化型の抗体は任意選択で、リサーフィシング（ｒｅｓｕｒｆａｃｉｎｇ）（Ｐｅｄｅｒｓｅｎら，Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ，２３５：９５９－９７３，１９９４）によって得られる。この方法ではげっ歯類抗体の表面残基のみをヒト化する。
特定の抗原に特異的なヒト抗体は、ファージディスプレイ戦略（Ｊｅｓｐｅｒｓら，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１２：８９９－９０３，１９９４）によって特定され得る。１つの方法では、特異的抗原に対するげっ歯類抗体の重鎖をクローン化し、ヒト軽鎖のレパートリーと対にして、繊維状ファージ上にＦａｂフラグメントとして提示させる。抗原との結合によりファージを選択する。次いで、選択されたヒト軽鎖をヒト重鎖のレパートリーと対にしてファージ上に提示させ、再び抗原との結合によりファージを選択する。その結果は、特定の抗原に特異的なヒト抗体Ｆａｂフラグメントとなる。別の方法では、メンバーがその外表面に様々なヒト抗体フラグメント（ＦａｂまたはＦｖ）を提示するファージのライブラリーを作製する（Ｄｏｗｅｒら，国際公開第９１／１７２７１号およびＭｃＣａｆｆｅｒｔｙら，国際公開第９２／０１０４７号）。特異的抗原に対するアフィニティー濃縮により所望の特異性を有する抗体を提示するファージを選択する。いずれかの方法で特定されたヒトＦａｂフラグメントまたはヒトＦｖフラグメントをクローン化して、哺乳動物細胞でヒト抗体として発現させ得る。
ヒト抗体は任意選択で、トランスジェニック動物から得られる（米国特許第６，１５０，５８４号；同第６，１１４，５９８号；および同第５，７７０，４２９号）。この方法では、キメラマウスまたは生殖系列変異体マウスの重鎖連結領域（ＪＨ）遺伝子を欠失させる。次いで、そのような変異体マウスにヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子アレイを導入する。次いで、得られたトランスジェニックマウスは抗原曝露時にヒト抗体の全レパートリーを作製することが可能になる。
ヒト化抗体は通常、Ｆａｂ、Ｆａｂ’Ｆ（ａｂ’）２、Ｆｄ、Ｆｖおよび単一ドメイン抗体フラグメントなどの抗原結合フラグメントまたは重鎖と軽鎖がスペーサーにより連結された一本鎖抗体として作製される。また、ヒト抗体またはヒト化抗体はモノマー型またはポリマー型で存在し得る。ヒト化抗体は任意選択で、１本の非ヒト鎖と１本のヒト化鎖（すなわち、１本のヒト化重鎖または軽鎖）とを含む。
ヒト化抗体またはヒト抗体を含めた抗体は、ＩｇＭ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＡまたはＩｇＥを含めた任意のクラスの免疫グロブリン；ならびにＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含めた任意のアイソタイプから選択される。キメラ抗体、ヒト化抗体またはヒト抗体は、１つまたは２つ以上のアイソタイプまたはクラスに由来する配列を含み得る。
さらに、本明細書に記載されるエピトープに特異的な抗体は、抗体ファージディスプレイライブラリーをスクリーニングすることにより容易に単離される。例えば、任意選択で、本明細書に開示されるエピトープに対応するペプチドを含む環状化合物を用いることにより抗体ファージライブラリーをスクリーニングして、立体配座特異的抗体に特異的な抗体フラグメントを特定する。任意選択で、特定された抗体フラグメントを用いて、本明細書に記載される様々な実施形態に有用な様々な組換え抗体を作製する。抗体ファージディスプレイライブラリーは、例えばＸｏｍａ社（バークレー、カリフォルニア州）から市販されている。抗体ファージライブラリーをスクリーニングする方法は当該技術分野で周知である。
さらなる態様は、軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含み、重鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ－Ｈ１、ＣＤＲ－Ｈ２およびＣＤＲ－Ｈ３を含み、軽鎖可変領域が相補性決定領域ＣＤＲ－Ｌ１、ＣＤＲ－Ｌ２およびＣＤＲ－Ｌ３を含み、前記ＣＤＲのアミノ酸配列が、以下に記載する配列を含む、抗体および／またはその結合フラグメントである。
Figure 0007065516000003
一実施形態では、抗体はモノクローナル抗体である。一実施形態では、抗体はキメラ抗体、例えば表１０に記載されるＣＤＲ配列を含むヒト化抗体などである。
別の実施形態では、任意選択で一本鎖抗体において、表１０のＣＤＲと軽鎖可変領域と重鎖可変領域とを含む、抗体も提供される。
さらに別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列；ｉｉ）配列番号２４と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号１７、１８および１９で示される、アミノ酸配列またはｉｉｉ）保存的に置換されたアミノ酸配列ｉ）を含む、重鎖可変領域を含む。別の態様では、抗体は、ｉ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列、ｉｉ）配列番号２６と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％もしくは少なくとも９０％の配列同一性を有し、ＣＤＲ配列が配列番号２０、２１および２２で示される、アミノ酸配列またはｉｉｉ）保存的に置換されたｉ）のアミノ酸配列を含む、軽鎖可変領域を含む。別の実施形態では、重鎖可変領域アミノ酸配列が、配列番号２３で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重最適化型によってコードされている。別の実施形態では、抗体は、配列番号２５で示されるヌクレオチド配列またはそのコドン縮重型もしくコドン最適化型によってコードされる軽鎖可変領域のアミノ酸配列を含む。一実施形態では、重鎖可変領域は配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む。
別の態様は、表１０に記載されるＣＤＲ配列を有する抗体と同じエピトープと特異的に結合する抗体である。
別の態様は、ヒトＡベータとの結合に関して、表１０に記載されるＣＤＲ配列を含む抗体と競合する、抗体を含む。
抗体間の競合は、例えば、被験抗体が参照抗体と共通の抗原との特異的結合を阻害する能力を評価するアッセイを用いて判定することができる。競合結合アッセイで測定したとき、過剰の被験抗体（例えば、少なくとも２倍、５倍、１０倍または２０倍）が参照抗体の結合を少なくとも５０％、少なくとも７５％、少なくとも８０％、少なくとも９０％または少なくとも９５％阻害する場合、被験抗体は参照抗体と競合することになる。
さらなる態様は、治療剤、検出可能な標識または細胞毒性物質とコンジュゲートした抗体である。一実施形態では、検出可能な標識は陽電子放出放射性核種である。陽電子放出放射性核種は、例えばＰＥＴ撮像で使用され得る。
さらなる態様は、本明細書に記載される抗体および／またはその結合フラグメントとオリゴマーＡベータとを含む、抗体複合体に関する。
さらなる態様は、本明細書に記載される抗体またはその一部をコードする、単離核酸である。
また、重鎖または軽鎖をコードする、例えば、本明細書に記載されるＣＤＲ－Ｈ１領域、ＣＤＲ－Ｈ２領域および／またはＣＤＲ－Ｈ３領域を含む重鎖をコードする、あるいは本明細書に記載されるＣＤＲ－Ｌ１領域、ＣＤＲ－Ｌ２領域および／またはＣＤＲ－Ｌ３領域を含む軽鎖をコードする、核酸も提供される。
本開示はまた、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸配列のバリアントを提供する。例えば、バリアントとしては、本明細書に開示される抗体および／またはその結合フラグメントをコードする核酸配列と少なくとも中程度にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下でハイブリダイズするヌクレオチド配列またはコドン縮重配列もしくはコドン最適化配列が挙げられる。別の実施形態では、バリアント核酸配列は、配列番号２４および２６をコードする核酸配列と少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、最も好ましくは少なくとも８０％、さらにより好ましくは少なくとも９０％、さらに最も好ましくは少なくとも９５％の配列同一性を有する。
一実施形態では、核酸は単離核酸である。
別の態様は、本明細書に開示される核酸を含む発現カセットまたはベクターである。一実施形態では、ベクターは単離ベクターである。
ベクターは、抗体および／またはその結合フラグメントの作製あるいは本明細書に記載されるペプチド配列の発現に適したベクターを含めた任意のベクターであり得る。
既知の方法で、タンパク質を確実に発現させる適切な発現ベクター内に核酸分子を組み込み得る。考え得る発現ベクターとしては、特に限定されないが、コスミド、プラスミドまたは改変ウイルス（例えば、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルスおよびアデノ随伴ウイルス）が挙げられる。ベクターは使用する宿主細胞と適合性のあるものであるべきである。発現ベクターは「宿主細胞の形質転換に適した」ものであり、これは、その発現ベクターが、本明細書に記載されるエピトープまたは抗体に対応するペプチドをコードする核酸分子を含んでいることを意味する。
一実施形態では、ベクターは、遺伝子治療により例えば一本鎖抗体を発現させるのに適したものである。ベクターは、例えば神経特異的プロモーターなどを用いて、神経組織での特異的発現に適合させることができる。一実施形態では、ベクターは、ＩＲＥＳを含み、軽鎖可変領域および重鎖可変領域の発現を可能にする。このようなベクターは、ｉｎ ｖｉｖｏで抗体を送達するのに用いることができる。
適切な制御配列は、細菌、真菌、ウイルス、哺乳動物または昆虫の遺伝子を含めた様々な供給源に由来するものであり得る。
このような制御配列の例としては、転写プロモーターおよび転写エンハンサーまたはＲＮＡポリメラーゼ結合配列、翻訳開始シグナルを含めたリボソーム結合配列が挙げられる。さらに、選択する宿主細胞および用いるベクターに応じてその他の配列、例えば複製起点、追加のＤＮＡ制限部位、エンハンサーおよび転写の誘導性を付与する配列などを発現ベクター内に組み込み得る。
一実施形態では、制御配列は、神経組織および／または細胞での発現を指令する、または増大させる。
一実施形態では、ベクターはウイルスベクターである。
組換え発現ベクターはまた、本明細書に記載される抗体またはエピトープペプチドを発現させるためにベクターにより形質転換、感染または形質移入した宿主細胞の選択を容易にするマーカー遺伝子を含み得る。
組換え発現ベクターはまた、組換えペプチドの発現または安定性を増大させる；組換えペプチドの溶解度を増大させる；ならびに例えば本明細書に記載されるタグおよび標識を含めたアフィニティー精製のリガンドとして作用することにより標的組換えペプチドの精製を補助する融合部分（すなわち、「融合タンパク質」）をコードする、発現カセットを含み得る。さらに、標的組換えタンパク質にタンパク質分解切断部位を付加して、融合タンパク質精製後に融合部分から組換えタンパク質を分離させ得る。典型的な融合発現ベクターとしては、ｐＧＥＸ（Ａｍｒａｄ社、メルボルン、オーストラリア）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社、ビバリー、マサチューセッツ州）およびｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社、ピスカタウェイ、ニュージャージー州）が挙げられ、これらは組換えタンパク質にそれぞれグルタチオンＳ－トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質またはプロテインＡを融合させるものである。
例えばニューロンおよび神経組織内にｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの両方で遺伝子を導入するシステムとしては、ウイルス、中でもとりわけ単純ヘルペスウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）およびレンチウイルスを含めたレトロウイルスに基づくベクターが挙げられる。これに代わる遺伝子送達の方法としては、裸のプラスミドＤＮＡおよびリポソーム－ＤＮＡ複合体の使用が挙げられる。別の方法には、ＤＮＡをポリカチオン濃縮して脂質に封入し、脳内遺伝子送達により脳内に導入する、ＡＡＶプラスミドの使用（Ｌｅｏｎｅら，米国特許出願公開第２００２０７６３９４号）がある。
したがって、別の態様では、本明細書に記載される化合物、免疫原、核酸、ベクターおよび抗体をリポソーム、ナノ粒子およびウイルスタンパク質粒子などの小胞で製剤化し、例えば、本明細書に記載される抗体、化合物、免疫原および核酸を送達し得る。特に、ポリマーソームを含めた合成ポリマー小胞を用いて抗体を投与することができる。
別の態様では、本明細書に記載される抗体を発現する、または本明細書に開示されるベクターを含む細胞、任意選択で単離細胞および／または組換え細胞も提供される。
組換え細胞は、ポリペプチドの産生に適した、例えば抗体および／またはその結合フラグメントの産生に適した任意の細胞を用いて作製することができる。例えば、核酸（例えば、ベクター）を細胞内に導入するには、用いるベクターに応じて、細胞に形質移入し得る、細胞を形質転換し得る、または細胞に感染させ得る。
適切な宿主細胞としては、多種多様な原核宿主細胞および真核宿主細胞が挙げられる。例えば、本明細書に記載されるタンパク質を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）などの細菌細胞、昆虫細胞（バキュロウイルスを用いる）、酵母細胞または哺乳動物細胞で発現させ得る。
一実施形態では、細胞は、酵母細胞、植物細胞、蠕虫細胞、昆虫細胞、鳥類細胞、魚類細胞、爬虫類細胞および哺乳動物細胞から選択される真核細胞である。
別の実施形態では、哺乳動物細胞は、ミエローマ細胞、脾臓細胞またはハイブリドーマ細胞である。
一実施形態では、細胞は神経細胞である。
抗体またはペプチドを発現させるのに適した酵母宿主細胞および真菌宿主細胞としては、特に限定されないが、出芽酵母（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）、分裂酵母（Ｓｃｈｉｚｏｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｐｏｍｂｅ）、ピキア（Ｐｉｃｈｉａ）属またはクリベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ）属およびアスペルギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の様々な種が挙げられる。酵母（Ｓ．ｃｅｒｉｖｉｓｉａｅ）で発現させるためのベクターの例としては、ｐＹｅｐＳｅｃ１、ｐＭＦａ、ｐＪＲＹ８８およびｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社、サンディエゴ、カリフォルニア州）が挙げられる。酵母および真菌を形質転換させるプロトコルは当業者に周知である。
適切であり得る哺乳動物細胞としては、特にＣＯＳ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ１６５０または１６５１）、ＢＨＫ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ６２８１）、ＣＨＯ（ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ６１）、ＨｅＬａ（例えば、ＡＴＣＣ番号ＣＣＬ２）、２９３（ＡＴＣＣ番号１５７３）およびＮＳ－１細胞が挙げられる。哺乳動物細胞での発現を指令するのに適した発現ベクターは一般に、プロモーター（例えば、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルスおよびサルウイルス４０などのウイルス材料由来のもの）ならびにその他の転写制御配列および翻訳制御配列を含む。哺乳動物発現ベクターの例としては、ｐＣＤＭ８およびｐＭＴ２ＰＣが挙げられる。
さらなる態様は、本明細書に記載されるエピトープに特異的な抗体を産生するハイブリドーマである。
ＩＶ．組成物
さらなる態様は、本明細書に記載される化合物、免疫原、核酸、ベクターまたは抗体を含む組成物である。
一実施形態では、組成物は希釈剤を含む。
核酸に適した希釈剤としては、特に限定されないが、水、生理食塩水およびエタノールが挙げられる。
抗体もしくはそのフラグメントを含めたポリペプチドおよび／または細胞に適した希釈剤としては、特に限定されないが、生理食塩水、ｐＨ緩衝溶液およびグリセロール溶液あるいはポリペプチドおよび／または細胞を凍結させるのに適した他の溶液が挙げられる。
一実施形態では、組成物は、本明細書に開示されるペプチド、免疫原、抗体、核酸またはベクターのいずれかを含み、任意選択で薬学的に許容される担体を含む、医薬組成物である。
本明細書に記載される組成物は、対象に投与することができる薬学的に許容される組成物を調製する既知の方法それ自体により、任意選択でワクチンとして、有効量の活性物質が薬学的に許容される溶媒との混合物の形で組み合わさるように調製することができる。
医薬組成物としては、特に限定されないが、凍結乾燥粉末剤または水性もしくは非水性の無菌注射用液剤もしくは無菌注射用懸濁剤が挙げられ、これらは、抗酸化剤、緩衝剤、静菌剤および組成物を目的とする被投与者の組織または血液に実質的に適合させる溶質をさらに含有し得る。このような組成物中に記載の存在し得るその他の成分としては、例えば水、界面活性剤（Ｔｗｅｅｎなど）、アルコール、ポリオール、グリセリンおよび植物油が挙げられる。無菌粉末剤、顆粒剤、錠剤または濃縮した液剤もしくは懸濁剤から即時注射液剤および即時注射懸濁剤を調製し得る。組成物は、例えば、特に限定されないが、患者に投与する前に滅菌水または生理食塩水で再構築する凍結乾燥粉末として供給され得る。
医薬組成物は薬学的に許容される担体を含み得る。適切な薬学的に許容される担体としては、実質的に化学的に不活性で無毒性であり医薬組成物の生物活性の効果に干渉しない組成物を含む。適切な医薬担体の例としては、特に限定されないが、水、生理食塩水、グリセロール溶液、エタノール、Ｎ－（１（２，３－ジオレイルオキシ）プロピル）Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルアンモニウムクロリド（ＤＯＴＭＡ）、ジオレシルホスファチジル－エタノールアミン（ｄｉｏｌｅｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｔｉｄｙｌ－ｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ）（ＤＯＰＥ）およびリポソームが挙げられる。このような組成物は、患者に直接投与する形態になるように、治療有効量の化合物を適量の担体とともに含有するべきである。
組成物は薬学的に許容される塩の形態であり得、このような塩としては、特に限定されないが、遊離アミノ基を用いて形成される塩、例えば塩酸、リン酸、酢酸、シュウ酸、酒石酸などに由来するなどおよび遊離カルボキシル基を用いて形成される塩、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、水酸化アンモニウム、水酸化カルシウム、水酸化第二鉄、イソプロピルアミン、トリエチルアミン、２－エチルアルニノエタノール（２－ｅｔｈｙｌａｒｎｉｎｏ ｅｔｈａｎｏｌ）、ヒスチジン、プロカインなどに由来するなどが挙げられる。
本明細書に記載される化合物または免疫原を含む実施形態では、組成物はアジュバントを含む。
使用し得るアジュバントとしては例えば、通常、ワクチンとして使用される死菌または弱毒菌の成分である、内因性アジュバント（リポ多糖など）が挙げられる。外因性アジュバントには、通常、抗原と非共有結合し、宿主免疫応答を増強するよう製剤化される、免疫調節物質がある。水酸化アルミニウム、硫酸アルミニウムおよびリン酸アルミニウム（一般にミョウバンと総称される）はアジュバントとして日常的に使用される。様々な外因性アジュバントが免疫原に対する強力な免疫応答を引き起こし得る。このようなものとしては、サポニン、例えばＳｔｉｍｕｌｏｎ（ＱＳ２１、Ａｑｕｉｌａ社、ウスター、マサチューセッツ州）またはそれから生成されるＩＳＣＯＭおよび（免疫刺激複合体）および膜タンパク質抗原と複合体を形成したＩＳＣＯＭＡＴＲＩＸ（免疫刺激複合体）などの粒子など、プルロニックポリマーと鉱油、死滅マイコバクテリアと鉱油、フロイント完全アジュバント、ムラミルジペプチド（ＭＤＰ）およびリポ多糖などの細菌生成物ならびにリピドＡおよびリポソームが挙げられる。
一実施形態では、アジュバントは水酸化アルミニウムである。別の実施形態では、アジュバントはリン酸アルミニウムである。水中油型乳剤としては、スクアレン；ラッカセイ油；ＭＦ５９（国際公開第９０／１４３８７号）；ＳＡＦ（Ｓｙｎｔｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、パロアルト、カリフォルニア州）；およびＲｉｂｉ（商標）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ社、ハミルトン、モンタナ州）が挙げられる。水中油型乳剤は、免疫刺激物質、例えばムラミルペプチド（例えば、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ｎｏｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）、Ｎ－アセチルグルクサミニル－Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－イソグル－Ｌ－Ａｌａ－ジパルミトキシプロピルアミド（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－ｉｓｏｇｌｕ－Ｌ－Ａｌａ－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄｅ）（ＤＴＰ－ＤＰＰ）、ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））またはその他の細菌細胞壁成分とともに使用し得る。
アジュバントを単一組成物として免疫原とともに投与し得る。あるいは、アジュバントを免疫原投与の前に、免疫原投与と同時に、かつ／または免疫原投与の後に投与し得る。
アジュバントは一般に、リン酸緩衝生理食塩水に溶かした０．０５～１．０パーセント溶液として使用される。アジュバントは免疫原の免疫原性を増強するが、アジュバント自体は必ずしも免疫原性であるわけではない。アジュバントは、投与部位付近に免疫原を局所的に保持することよって作用し、免疫系細胞への免疫原の緩徐で持続的な放出を促進するデポとしての効果をもたらし得る。アジュバントはまた、免疫原デポに免疫系細胞を誘引し、そのような細胞を刺激して免疫応答を誘発し得る。したがって、諸実施形態は、アジュバントをさらに含む組成物を包含し得る。
非経口免疫感作のためのアジュバントとしては、アルミニウム化合物（水酸化アルミニウム、リン酸アルミニウムおよびヒドロキシリン酸アルミニウム）が挙げられる。標準的プロトコルに従って、抗原をアルミニウム化合物とともに沈殿させる、またはアルミニウム化合物上に吸着させることができる。ＲＩＢＩ（ＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍ社、ハミルトン、モンタナ州）などのその他のアジュバントも非経口投与に使用することができる。
粘膜免疫感作のためのアジュバントとしては、細菌毒素（例えば、コレラ毒素（ＣＴ）、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）易熱性毒素（ＬＴ）、ディフィシル菌（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）毒素Ａおよび百日咳毒素（ＰＴ）またはその組合せ、サブユニット、トキソイドもしくは変異体）が挙げられる。例えば、天然のコレラ毒素サブユニットＢ（ＣＴＢ）の精製調製物が有用であり得る。上記のいずれかの毒素のフラグメント、ホモログ、誘導体および融合物も、アジュバント活性を保持している限り適切なものである。好ましくは、毒性が低下した変異体を使用する。適切な変異体については、（例えば、国際公開第９５／１７２１１号（Ａｒｇ－７－Ｌｙｓ ＣＴ変異体）、国際公開第９６／６６２７号（Ａｒｇ－１９２－Ｇｌｙ ＬＴ変異体）および国際公開第９５／３４３２３号（Ａｒｇ－９－ＬｙｓおよびＧｌｕ－１２９－Ｇｌｙ ＰＴ変異体）に）既に記載されている。方法および組成物に使用し得る追加のＬＴ変異体としては、例えば、Ｓｅｒ－６３－Ｌｙｓ変異体、Ａｌａ－６９－Ｇｌｙ変異体、Ｇｌｕ－１１０－Ａｓｐ変異体およびＧｌｕ－１１２－Ａｓｐ変異体が挙げられる。その他のアジュバント（様々な供給源（例えば、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）、サルモネラ・ミネソタ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｍｉｎｎｅｓｏｔａ）、サルモネラ・チフィムリウム（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍもしくはシゲラ・フレックスネリ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｆｌｅｘｎｅｒｉ））の細菌モノホスホリルリピドＡ（ＭＰＬＡ）、サポニンまたはポリラクチドグリコリド（ＰＬＧＡ）マイクロスフェアなど）も粘膜投与に使用することができる。
その他のアジュバントとしては、インターロイキンなどのサイトカイン、例えばＩＬ－１、ＩＬ－２およびＩＬ－１２、ケモカイン、例えばＣＸＣＬ１０およびＣＣＬ５、マクロファージ刺激因子ならびに／あるいは腫瘍壊死因子が挙げられる。使用し得るその他のアジュバントとしては、ＣｐＧオリゴヌクレオチド（Ｄａｖｉｓ．Ｃｕｒｒ Ｔｏｐ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２４７：１７１－１８３，２０００）が挙げられる。
水中油型乳剤としては、スクアレン；ラッカセイ油；ＭＦ５９（国際公開第９０／１４３８７号）；ＳＡＦ（Ｓｙｎｔｅｘ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、パロアルト、カリフォルニア州）；およびＲｉｂｉ（商標）（Ｒｉｂｉ Ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍ社、ハミルトン、モンタナ州）が挙げられる。水中油型乳剤は、免疫刺激物質、例えばムラミルペプチド（例えば、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－スレオニル－Ｄ－イソグルタミン（ｔｈｒ－ＭＤＰ）、－アセチル－ノルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミン（ｎｏｒ－ＭＤＰ）、Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－アラニル－Ｄ－イソグルタミル－Ｌ－アラニン－２－（１’－２’ジパルミトイル－ｓｎ－グリセロ－３－ヒドロキシホスホリルオキシ）－エチルアミン（ＭＴＰ－ＰＥ）、Ｎ－アセチルグルクサミニル－Ｎ－アセチルムラミル－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－イソグル－Ｌ－Ａｌａ－ジパルミトキシプロピルアミド（Ｎ－ａｃｅｔｙｌｇｌｕｃｓａｍｉｎｙｌ－Ｎ－ａｃｅｔｙｌｍｕｒａｍｙｌ－Ｌ－Ａｌ－Ｄ－ｉｓｏｇｌｕ－Ｌ－Ａｌａ－ｄｉｐａｌｍｉｔｏｘｙ ｐｒｏｐｙｌａｍｉｄｅ）（ＤＴＰ－ＤＰＰ）、ｔｈｅｒａｍｉｄｅ（商標））またはその他の細菌細胞壁成分とともに使用され得る。
粘膜免疫感作および非経口免疫感作の両方に有用なアジュバントとしては、ポリホスファゼン（例えば、国際公開第９５／２４１５号）、ＤＣ－ｃｈｏｌ（３ｂ－（Ｎ－（Ｎ’，Ｎ’－ジメチルアミノメタン）－カルバモイル）コレステロール（例えば、米国特許第５，２８３，１８５号および国際公開第９６／１４８３１）号およびＱＳ－２１（例えば、国際公開第８８／９３３６号）が挙げられる。
アジュバントを免疫原と結合させて投与し得る。例えば、免疫原を含むペプチドの立体配座の変化が免疫原に対する免疫応答の性質に影響を及ぼさないように、パルミチン酸などの脂質を１つまたは複数のペプチドと直接結合させ得る。
一実施形態では、組成物は本明細書に記載される抗体を含む。別の実施形態では、組成物は、本明細書に記載される抗体と希釈剤とを含む。一実施形態では、組成物は無菌組成物である。
Ｖ．キット
さらなる態様は、無菌バイアルなどのバイアルあるいはその他の筐体に入った本明細書に記載されるｉ）抗体および／またはその結合フラグメント、ｉｉ）核酸、ｉｉｉ）ペプチドまたは免疫原、ｉｖ）組成物あるいはｖ）組換え細胞と、任意選択で参照物質および／またはキットの使用のための説明書とを含む、キットに関する。
一実施形態では、キットは、収集バイアル、標準緩衝液および検出試薬のうちの１つまたは複数のものをさらに含む。
ＶＩ．方法
本明細書に記載される化合物、免疫原および抗体を作製および使用する方法が含まれる。
特に、ＨＤＳＧ（配列番号１）または関連エピトープの立体配座エピトープに特異的かつ／または選択的な抗体を作製する方法であって、対象、任意選択で非ヒト対象に本明細書に記載されるエピトープ配列を含み立体配座的に制約のある化合物、任意選択でＨＤＳＧ（配列番号１）または関連エピトープを含む環状化合物を投与することと、環状化合物と特異的または選択的に結合し、任意選択で、ｉ）合成および／または天然のオリゴマーと特異的または選択的に結合し、かつ／あるいはｉｎ ｓｉｔｕ組織試料で老人斑との結合が全くもしくはほとんどみられない、または対応する直鎖状ペプチドとの結合が全くもしくはほとんどない、抗体産生細胞あるいは抗体を単離することとを含む、方法が提供される。環状化合物は、例えば、本明細書に記載される環状化合物を含む、本明細書に記載されるいずれかの「エピトープ」を含み得る。
一実施形態では、この方法は、例えば本明細書に記載される方法を用いて、モノクローナル抗体を作製するためのものである。
一実施形態では、この方法は、例えば本明細書に記載される方法を用いて、ヒト化抗体を作製するためのものである。
一実施形態では、本明細書に記載される環状化合物、任意選択で環状ペプチドを用いて抗体を作製する。
環状化合物を用いて作製する抗体は、本明細書および実施例に記載される通りに選択される。一実施形態では、この方法は、任意選択で本明細書に記載される方法を用いて、直鎖状ペプチドよりも環状ペプチドと特異的または選択的に結合し、エピトープ配列に特異的であり、オリゴマーと特異的に結合し、かつ／あるいはｉｎ ｓｉｔｕの斑および／または対応する直鎖状ペプチドと結合しない、またはほとんど結合しない抗体を単離することを含む。
さらなる態様では、生体試料がＡベータを含むかどうかを検出する方法であって、生体試料と本明細書に記載される抗体とを接触させることと、何らかの抗体複合体の存在を検出することとを含む、方法が提供される。一実施形態では、この方法は、生体試料が、少なくともＨ、Ｄおよび／またはＳが非オリゴマー立体配座のＨ、Ｄおよび／またはＳによって占められるものとは別の立体配座にある、Ａベータを含むかどうかを検出するためのものである。
一実施形態では、この方法は、生体試料がオリゴマーＡベータを含むかどうかを検出するためのものである。
一実施形態では、この方法は、
ａ．抗体：Ａベータオリゴマー複合体の形成が可能な条件下で、生体試料と、本明細書のＡベータオリゴマーに特異的かつ／または選択的な本明細書に記載される抗体とを接触させること；および
ｂ．何らかの複合体の存在を検出すること
を含み、
検出可能な複合体の存在により、試料がＡベータオリゴマーを含有し得ることが示される。
一実施形態では、形成された複合体のレベルを、適切なＩｇ対照または無関係な抗体などの被験抗体と比較する。
一実施形態では、検出を定量化し、生成した複合体の量を測定する。測定は、例えば標準物質に対して相対的なものであり得る。
一実施形態では、測定された量を対照と比較する。
別の実施形態では、この方法は、
（ａ）抗体－抗原複合体の生成が可能な条件下で、前記対象の生体試料と本明細書に記載される抗体とを接触させること；
（ｂ）被験試料中の抗体－抗原複合体の量を測定すること；および
（ｃ）被験試料中の抗体－抗原複合体の量と対照とを比較すること
を含み、
対照と比較して生体試料中に抗体－抗原複合体が検出されることにより、試料がＡベータを含むことが示される。
対照は、試料対照（例えば、ＡＤを有さない対象または軽度、中等度もしくは進行型といった特定の型のＡＤを有する対象に由来するもの）または対象のＡベータオリゴマーレベルの変化をモニターするための同じ対象由来の以前の試料であり得る。
一実施形態では、本明細書に記載される抗体を使用する。
一実施形態では、抗体は、ＨＤＳＧ（配列番号１）または関連立体配座エピトープを含むＡベータの立体配座を特異的かつ／または選択的に認識し、生体試料中に抗体抗原複合体が検出されることにより、試料がＡベータオリゴマーを含むことが示される。
一実施形態では、試料は生体試料である。一実施形態では、試料は、脳組織もしくはその抽出物および／またはＣＳＦを含む。一実施形態では、試料は、全血、血漿または血清を含む。一実施形態では、試料はヒト対象から採取されるものである。一実施形態では、対象は、ＡＤが疑われる、ＡＤのリスクがある、またはＡＤを有する。
本明細書に記載される抗体を用いてＡベータ：抗体複合体を検出し、それにより生体試料中にＨＤＳＧ（配列番号１）もしくは関連立体配座エピトープを含むＡベータおよび／またはＡベータオリゴマーが存在するかどうかを判定するには、フローサイトメトリー、免疫ブロット、ＥＬＩＳＡおよび免疫沈降とそれに続くＳＤＳ－ＰＡＧＥなどのイムノアッセイならびに免疫細胞化学を含めたいくつかの方法を用いることができる。
実施例に記載されるように、表面プラズモン共鳴技術を用いて立体配座特異的結合を評価することができる。抗体を標識する、または複合体の抗体に特異的な検出可能に標識した二次抗体を用いる場合、その標識を検出することができる。一般に用いられる試薬としては、蛍光発光抗体およびＨＲＰ標識抗体が挙げられる。定量的方法では、発生したシグナルの量を標準物質または対照との比較により測定することができる。測定はまた、相対的なものであり得る。
さらなる態様は、対象または組織中のＡベータのレベルを測定する、またはそのようなＡベータを撮像する方法であって、任意選択で、測定または撮像するＡベータがオリゴマーＡベータである、方法を含む。一実施形態では、この方法は、ＡＤを有するリスクがある、ＡＤを有することが疑われる、またはＡＤを有する対象に検出可能な標識とコンジュゲートした抗体を投与すること；および標識を検出すること、任意選択で標識を定量的に検出することを含む。標識は、一実施形態では、例えばＰＥＴ撮像に使用することができる陽電子放出放射性核種である。
さらなる態様は、対象に免疫応答を誘導する方法であって、対象に本明細書に記載される化合物、任意選択で、ＨＤＳＧ（配列番号１）もしくは関連エピトープペプチド配列を含む環状化合物、免疫原および／または前記化合物もしくは前記免疫原を含む組成物を投与すること；ならびに任意選択で、投与した化合物または免疫原中のＡベータペプチドと特異的または選択的に結合する細胞および／または抗体を単離することを含む、方法を含む。一実施形態では、組成物は、薬学的に許容される希釈剤または担体と混合した化合物または免疫原を含む、医薬組成物である。
一実施形態では、対象はげっ歯類などの非ヒト対象である。作製された抗体産生細胞は、一実施形態ではハイブリドーマ細胞系を作製するために使用する。
一実施形態では、投与する免疫原は、図１１Ｂに示される化合物を含む。
本明細書では、シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）に対して生じさせた抗体が、Ａベータオリゴマーと特異的かつ／または選択的に結合し、Ａベータ斑染色を示さないことが示される。オリゴマーＡベータ種は、ＡＤにおいて毒性のある伝播性の種であると考えられる。さらに、図１９に示されるように、シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）を用いて生じさせ、オリゴマーに特異的な抗体は、Ａベータの凝集およびＡベータオリゴマーの伝播を阻害した。したがって、Ａベータオリゴマーの伝播を阻害する方法であって、有効量の本明細書に記載されるＡベータオリゴマーに特異的または選択的な抗体を、Ａベータを発現する細胞もしくは組織と接触させる、または必要とする対象に投与して、Ａベータの凝集および／またはオリゴマーの伝播を阻害することを含む、方法も提供される。実施例１０に記載されるように、ｉｎ ｖｉｔｒｏでアッセイをモニターすることができる。
抗体はまた、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患の治療に有用であり得る。例えば、レビー小体型認知症のバリアントおよび封入体筋炎（筋肉疾患の１つ）では、それぞれ脳および筋肉にＡＤと類似した斑がみられ、脳アミロイド血管症に関与する凝集体にもＡベータが形成され得る。さらに、神経変性疾患（パーキンソン病および前頭側頭型認知症を含む）の「混合型」病態は、明らかなＡＤの臨床症候群がなくてもＡＤ病態の特徴が観察されることでわかる。上記のように、シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体は、ＡＤの毒素原性のＡベータ種であると考えられるオリゴマーＡベータと結合し、毒素原性Ａベータオリゴマーの形成を阻害する。
したがって、さらなる態様は、ＡＤおよび／またはその他のＡベータアミロイド関連疾患を治療する方法であって、必要とする対象にｉ）有効量の本明細書に記載される抗体、任意選択で、前記抗体を含むＡベータオリゴマー特異的もしくはＡベータオリゴマー選択的組成物または医薬組成物を投与すること；あるいは２）必要とする対象にＨＤＳＧ（配列番号１）もしくは関連エピトープ配列を含む単離環状化合物、免疫原または前記環状化合物を含む医薬組成物を投与することを含む、方法である。
一実施形態では、本明細書に記載される抗体を用いて、治療する対象由来の生体試料をＡベータの有無またはレベルに関して評価する。一実施形態では、検出可能なＡベータレベル（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定される、または撮像により測定されるＡベータ抗体複合体）を有する対象を抗体で治療する。
抗体および免疫原を例えば、本明細書に記載される医薬組成物に含ませ、例えば小胞に製剤化して送達を改善することができる。
ＨＤＳＧ（配列番号１）を標的とする１つまたは複数の抗体および／または関連抗体を組み合わせて投与することができる。さらに、本明細書に開示される抗体をベータセクレターゼ阻害剤またはコリンエステラーゼ阻害剤などの１つまたは複数の他の治療剤とともに投与することができる。
一実施形態では、抗体は、任意選択でＡベータオリゴマーと特異的または選択的に結合する、立体配座特異的／選択的抗体である。
また、ＡＤを標的とする組成物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸の使用が提供される。
本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸、ベクターなどを、例えば、非経口投与、静脈内投与、皮下投与、筋肉内投与、頭蓋内投与、脳室内投与、髄腔内投与、眼窩内、点眼、脊髄内投与、槽内投与、腹腔内投与、鼻腔内投与、エアゾール投与または経口投与により投与することができる。
ある特定の実施形態では、医薬組成物を全身投与する。
他の実施形態では、医薬組成物を脳またはＣＮＳの他の部分に直接投与する。例えば、このような方法は、埋込み型カテーテルおよびポンプの使用を含み、これらはカテーテルを通して注入部位に所定用量を放出するものである。当業者であればさらに、理解されよう。カテーテルは、それを可視化して脳内の所望の投与部位または注入部位に隣接する位置に配置することが可能な外科技術により埋め込まれ得る。このような技術は、参照により本明細書に組み込まれるＥｌｓｂｅｒｒｙらの米国特許第５，８１４，０１４号「Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｏｆ Ｔｒｅａｔｉｎｇ Ｎｅｕｒｏｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｖｅ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ ｂｙ Ｂｒａｉｎ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ」に記載されている。また、米国特許出願公開第２００６０１２９１２６号（ＫａｐｌｉｔｔおよびＤｕｒｉｎｇ，「Ｉｎｆｕｓｉｏｎ ｄｅｖｉｃｅ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｆｕｓｉｎｇ ｍａｔｅｒｉａｌ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｂｒａｉｎ ｏｆ ａ ｐａｔｉｅｎｔ」）に記載されているもの方法などの方法が企図される。脳およびＣＮＳの他の部分に薬物を送達する装置が市販されている（例えば、ＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ（登録商標）ＥＬ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｓｙｓｔｅｍ；Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ社、ミネアポリス、ミネソタ州）。
別の実施形態では、血液脳関門を通過する受容体介在型輸送が可能になるよう投与する化合物を修飾するなどの方法を用いて、医薬組成物を脳に投与する。
他の実施形態では、本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸と、血液脳関門を通過する輸送を促進することが知られている生物学的に活性な分子との共投与が企図される。
また、ある特定の実施形態では、本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸を血液脳関門を通過させて投与する方法、例えば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第７０１２０６１号「Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｔｈｅ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｂｌｏｏｄ ｂｒａｉｎ ｂａｒｒｉｅｒ」に記載されている、血液脳関門の透過性を一時的に増大させることを目的とする方法などが企図される。
当業者には、本明細書に記載される組成物、化合物、抗体、単離ペプチド、免疫原および核酸を脳に直接投与する、または血液脳関門を通過させて投与するのに適切な様々な方法が理解され、本明細書に記載される製品を安全に投与するためにこれらの方法を修正することが可能であろう。
上の開示は本願を全体的に説明するものである。以下の具体例を参照することにより、さらに十全な理解することができる。これらの例は単に説明を目的として記載されるものであって、本願の範囲を限定することを意図するものではない。状況によって好都合であることが示唆される、または好都合である場合、形態の変更および均等物による置換が企図される。本明細書では特定の用語が使用されているが、このような用語は説明的な意味を意図するものであって、限定を目的とするものではない。
以下の非限定的な例は本開示を例示するものである。
（実施例）
実施例１
集団座標予測
ミスフォールドされたエピトープを予測する方法は、２０１５年１１月９日に出願され参照により本明細書に組み込まれる米国特許出願第６２／２５３０４４号、「Ｓｙｓｔｅｍｓ ａｎｄ ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｐｒｅｄｉｃｔｉｎｇ ｍｉｓｆｏｌｄｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｐｉｔｏｐｅｓ ｂｙ ｃｏｌｌｅｃｔｉｖｅ ｃｏｏｒｄｉｎａｔｅ ｂｉａｓｉｎｇ」に記載されている「集団座標バイアス」によって得られる。そこに記載されているように、この方法は、あるタンパク質（またはペプチド凝集体）にグローバル座標のバイアスをかけて、そのタンパク質（またはペプチド凝集体）をミスフォールドさせた後、部分的に構造化されていないタンパク質（またはペプチド凝集体）のフォールドされない可能性が最も高いアンフォールド領域を予測する、分子動力学に基づくシミュレーションを用いるものである。バイアスシミュレーションを実施し、各残基インデックスに対応する（検討するタンパク質の初期構造のものと比較した）溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）。ＳＡＳＡはＨ２Ｏが接触可能な表面積を表す。ＳＡＳＡの（検討するタンパク質の初期構造のものと比較した）正の変化は、関連する残基インデックスの領域におけるアンフォールドを示すと考え得る。この方法をそれぞれが独自の形態を有する３種類のＡベータ株、すなわち、３回対称性構造（またはモノマー）（ＰＤＢエントリー２Ｍ４Ｊ）のＡβ－４０ペプチド、２回対称性構造（ＰＤＢエントリー２ＬＭＮ）のＡβ－４０モノマーおよび一本鎖平行ｉｎ－ｒｅｇｉｓｔｅｒ（例えば、一本の鎖の残基が近接する鎖の同じ残基と相互作用するベータシートが反復したもの）構造（ＰＤＢエントリー２ＭＸＵ）のＡβ－４２モノマーに適用した。
米国特許出願第６２／２５３０４４号に記載されている集団座標法ならびにＫ．Ｖａｎｏｍｍｅｓｌａｅｇｈｅ，Ｅ．Ｈａｔｃｈｅｒ，Ｃ．Ａｃｈａｒｙａ，Ｓ．Ｋｕｎｄｕ，Ｓ．Ｚｈｏｎｇ，Ｊ．Ｓｈｉｍ，Ｅ．Ｄａｒｉａｎ，Ｏ．Ｇｕｖｅｎｃｈ，Ｐ．Ｌｏｐｅｓ，Ｉ．ＶｏｒｏｂｙｏｖおよびＡ．Ｄ．Ｍａｃｋｅｒｅｌｌ．Ｃｈａｒｍｍ ｇｅｎｅｒａｌ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ：Ａ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ ｆｏｒ ｄｒｕｇ－ｌｉｋｅ ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ ｃｏｍｐａｔｉｂｌｅ ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｃｈａｒｍｍ ａｌｌ－ａｔｏｍ ａｄｄｉｔｉｖｅ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄｓ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３１（４）：６７１－６９０，２０１０；ならびにＰ．Ｂｊｅｌｋｍａｒ，Ｐ．Ｌａｒｓｓｏｎ，Ｍ．Ａ．Ｃｕｅｎｄｅｔ，Ｂ．ＨｅｓｓおよびＥ．Ｌｉｎｄａｈｌ．Ｉｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＨＡＲＭＭ ｆｏｒｃｅ ｆｉｅｌｄ ｉｎ ＧＲＯＭＡＣＳ：ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｅｆｅｃｔｓ ｆｒｏｍ ｃｏｒｒｅｌａｔｉｏｎ ｍａｐｓ，ｖｉｒｔｕａｌ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｓｉｔｅｓ，ａｎｄ ｗａｔｅｒ ｍｏｄｅｌｓ．Ｊ．Ｃｈｅｍ．Ｔｈｅｏ．Ｃｏｍｐ．，６：４５９－４６６，２０１０に記載されているＣＨＡＲＭＭ力場パラメータ（ともに参照により本明細書に組み込まれる）をＴＩＰ３Ｐ水とともに用いて、各初期構造に対するシミュレーションを実施した。
この方法を用いて予測されたエピトープを実施例２に記載する。
実施例２
Ｉ．集団座標予測
エピトープＨＤＳＧ（配列番号１）は実施例１に記載した集団座標法から予測される２Ｍ４Ｊ株由来のエピトープとして現れる。いくつかの他の線維の株では、この領域は不規則な状態であり、このためＰＤＢエントリーの構造をもたない。例えば、２ＬＭＮではＨＤＳが構造化されておらず、このため、これらの残基の座標はＰＤＢ構造に存在せず、２ＬＭＰではＨＤＳがＰＤＢに構造化されておらず、２ＭＸＵではＨＤＳＧ（配列番号１）がＰＤＢに構造化されていない。予測されたエピトープを示す対応する図が図１である。線維構造２Ｍ４Ｊに関しては、ＨＤＳＧ（配列番号１）を左右から挟む２つの配列、ＲＨＤＳＧ（配列番号５）およびＨＤＳＧＹ（配列番号４）が予測され；残基Ｒ５およびＹ１０はそれぞれ１つの予測から現れるが、残基ＨＤＳＧ（配列番号１）は２つの予測から現れ、このため、これら２つの予測の間の推定コンセンサス配列として扱った。
ＩＩ．立体配座特異的エピトープ
本明細書に記載され、図１に示されるように、ＨＤＳＧ（配列番号１）エピトープは、線維ＰＤＢ構造２Ｍ４Ｊに変性ストレスを加えたときの予測として現れる。ＨＤＳＧＹ（配列番号４）およびＲＨＤＳＧ（配列番号５）も予測される。
Ａβは、ガンマセクレターゼによるアミロイド前駆体タンパク質（ＡＰＰ）の切断により生じる長さ３６～４３アミノ酸のペプチドである。ＡＤ患者では、モノマー、不溶性線維および不溶性オリゴマーの複数の立体配座として存在する。Ａβ線維はＡＤ患者の脳にみられる老人斑の主成分である。
モノマー型では、Ａβは非構造化ポリペプチド鎖として存在する。線維型では、Ａβは異なる形態に凝集することができ、これらは多くの場合、株と呼ばれる。上記の構造のうちいくつかのものは固体ＮＭＲにより決定されたものであり、一部の線維構造はｉｎ ｖｉｔｒｏ試験で得られたものであり、それ以外は、ＡＤ患者から採取したアミロイド斑を用いて線維を播種することにより得られたものである。
オリゴマーは、毒性のある伝播性のペプチド種であることが示唆されている。
オリゴマー特異的抗体を作製するための必要条件の１つが、モノマー立体配座または線維立体配座には存在しない、またはあまり有利ではないＡβペプチド上の標的の特定である。これらのオリゴマー特異的エピトープは、モノマーまたは線維の対応するセグメントと一次配列が異なるわけではないが、オリゴマーにおいて立体配座が異なるものとなる。つまり、これらは、モノマーにも線維にも存在しない独特の立体配座でオリゴマー中に存在することになる。
これまでにオリゴマーの構造は決定されておらず、さらに、ＮＭＲの証拠から、オリゴマーが単一の明確に定められた構造ではなく、規則性に乏しく立体配座的に可塑性で順応性のある構造アンサンブルの形で存在することが示されている。さらに、オリゴマー種の濃度はモノマーまたは線維のものよりもはるかに低い（推定値には幅があるが、約１０００分の１またはそれ以下である）ため、この標的は捉えどころのないものとなっている。
一次配列（例えば、直鎖状配列）の連続する鎖または線維構造に対する抗体は、その効果を制限する問題点をいくつか抱え得る。直鎖状ペプチド領域に対して生じさせた抗体は、オリゴマーに対して選択的ではない傾向があり、このため、モノマーとも結合する。モノマーの濃度は実質的にオリゴマーの濃度より高いため、そのような抗体治療剤は「標的に対する注意散漫」という問題を抱えることがあり、オリゴマー種を選択的に標的とし除去するのではなく、むしろ主としてモノマーと結合し、機能的Ａβの除去を促進する。アミロイド封入体に対して生じさせた抗体は主として線維と結合し、その結果、血管原性浮腫および／または微小出血を表すと考えられるシグナル変化を含めたアミロイド関連画像異常（ＡＲＩＡ）が生じた。
オリゴマー型のＡβに選択的な抗体を開発するため、線維内で破壊され得る領域を特定した。理論に拘束されるのを望むわけではないが、線維における破壊がオリゴマーの表面に露出するのではないかという仮説を立てた。しかし、オリゴマー上では、これらの配列領域は、モノマーおよび／または線維のものとは異なる立体配座で露出し得る。例えば、表面にあるとき、それらは線維またはモノマーにみられる対応する量より曲率が高く、露出表面積が大きく、それとは異なる二面角分布を示すターン領域の形で露出し得る。
ＨＤＳＧ（配列番号１）を含む環状化合物を本明細書に記載し、図１１Ｂに示す。この環状化合物は、曲率が高く、露出表面積が大きく、別の二面角分布という上記の基準を１つまたは複数満たすよう設計したものである。
線維内の破壊されやすい領域を特定することの潜在的有益性の１つは、それにより線維がモノマーからオリゴマーの核を形成する触媒基質としての役割を果たし得る二次的な核形成過程に関与する領域が特定され得ることである［３］。側鎖が露出した線維の領域の方が付近のモノマーとの異常な相互作用に関与してモノマーの付着を促進する可能性が高いと思われ、次いで、このように付着したモノマーは、線維の表面またはその付近で効率的に増大する濃度という環境に曝され、それによりオリゴマーを含めた多量体凝集体を形成する可能性が高くなるものと思われる。Ａβの露出領域を有する加齢線維または損傷線維は毒性オリゴマーの産生を増大させ得るものであり、線維上のこれらの不規則な領域に対する抗体は、このような伝播機序を阻止するのに効果的であるものと思われる。
ＩＩＩ．環状ペプチドの曲率
環状ペプチドＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）の曲率プロファイルにより環状ＨＤＳＧ（配列番号１）と直鎖状ペプチドまたは線維が区別される。曲率プロファイルを図２に示す。位置６のヒスチジン残基は直鎖状ペプチドまたは線維よりも曲率が小さい。直鎖状ペプチドは、環状ペプチドまたは線維により検討した立体配座と比較して曲がる傾向がある。一方、アスパラギン酸残基Ｄ７およびセリン残基Ｓ８は、環状ペプチド内での曲率が、直鎖状ペプチドまたは線維内でのこれらの残基の曲率と比較して高い。環状ペプチド内でのグリシン残基（Ｇ）は、曲率が線維内での曲率より若干高いが、直鎖状ペプチド内での曲率より若干低い。以上の結果は、環状ペプチドに対する抗体が、モノマーまたは線維のものとは異なる立体配座アンサンブルを示す種に対して選択性を示す可能性があることを示している。
本明細書で考察する曲率のプロットおよび二面角分布に関しては、Ｃｈａｒｍｍ２７を用いる陽溶媒（ＴＩＰ３Ｐ）での平衡シミュレーションからデータを得る。各アンサンブルのシミュレーション時間および立体配置数は以下の通りである。環状ペプチドアンサンブル：シミュレーション時間１０ナノ秒、１００１のフレームを含む；直鎖状ペプチドアンサンブル：シミュレーション時間１０ナノ秒、１００１のフレームを含む；２Ｍ４Ｊアンサンブル：６８０ピコ秒、６９のフレームを含む。
環状エピトープの曲率は直鎖状ペプチドまたは線維とプロファイルが異なるため、これらの残基を含むオリゴマー上のアミノ酸の対応する伸縮振動は線維またはモノマーのものとは異なる主鎖配向を有するのでなないかと予想される。しかし、曲率の大きさは非物理学的なものであると思われ、環状ペプチドを特徴付ける曲率の数値は線維のいくつかの位置で得られる。
残基Ｈ、Ｄ、ＳおよびＧの曲率の数値を表４に記載する。直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドはともにＨＤＳＧ（配列番号１）の曲率が線維内でのこれらの残基の曲率より全般的に大きいが、線維全体での曲率より有意に大きいというわけではないことに留意されたい。このことは、主として、線維構造２Ｍ４ＪではＨＤＳＧ（配列番号１）が比較的伸長したベータ鎖立体配座にあることに起因し、環状ペプチドまたは直鎖状ペプチドに対して生じさせた抗体が、線維に対して立体配座的に選択的であり得る、すなわち、線維に対して低い親和性を有し得ることを示唆している。
ＩＶ．二面角分布
オリゴマー選択的エピトープを特定するためのさらなるコンピュータ支援が、オリゴマー内の露出エピトープの代わりである環状ペプチドの側鎖二面角分布ならびに主鎖二面角のラマチャンドランφおよびΨ分布の両方によって得られ、これらの分布は、多数の角について線維またはモノマーの対応する分布とは実質的に異なる。
残基Ｈ、ＤおよびＳの側鎖二面角分布を検討した。Ｈ６のＣ－Ｃα－Ｃβ－Ｃγ二面角およびＮ－Ｃα－Ｃβ－Ｃγ二面角の分布には、環状ペプチドのものとモノマーまたは線維のものとで差がみられる（図３）。直鎖状ペプチドが、環状ペプチドの二面角のほぼ全体（９０％）の範囲内にある二面角を占める確率は、上記２つの二面角とも３６％であり、線維におけるペプチドが、環状ペプチドの二面角のほぼ全体（９０％）の範囲内にある二面角を占める確率は、上記２つの二面角ともわずか１３％である。その他の二面角の対応する確率は、線維またはモノマーのアンサンブルの約３０％以上である。あるいは、以下の説明および図では、ＣＡ、ＣａまたはＣαを用いてＣアルファ原子を記載し、ＣＢ、ＣｂおよびＣβなどについても同様に記載する。
Ｄ７に関する二面角分布を図４に示す。Ｄ７の二面角に関して、直鎖状ペプチドが、環状ペプチドの二面角のほぼ全体（９０％）の範囲内にある二面角を占める確率は以下の通りである：
Ｃ－ＣＡ－ＣＢ－ＣＧ：１２％
Ｎ－ＣＡ－ＣＢ－ＣＧ：１９％
Ｏ－Ｃ－ＣＡ－ＣＢ：１５％。
Ｄ７の二面角に関して、線維におけるペプチドが、環状ペプチドの二面角のほぼ全体（９０％）の範囲内にある二面角を占める確率は以下の通りである：
Ｃ－ＣＡ－ＣＢ－ＣＧ：３０％
Ｎ－ＣＡ－ＣＢ－ＣＧ：４９％
Ｏ－Ｃ－ＣＡ－ＣＢ：６％
Ｓ８に関する二面角分布を図５に示す。二面角分布は、環状立体配座アンサンブルでの二面角が実質的に異なっており、次いで、これらが直鎖状または線維のアンサンブルにあることがわかる。Ｓ８の二面角に関して、直鎖状ペプチドが、環状ペプチドの二面角のほぼ全体（９０％）の範囲内にある二面角を占める確率は以下の通りである：
Ｃ－ＣＡ－ＣＢ－ＯＧ：９２％（このことは実質的に重なり合っていることを示しているが、図５からわかるように、図５で重なり合っているピークの重みは実質的に異なっており、好ましい二面角が依然として異なり得ることを示している）
Ｎ－ＣＡ－ＣＢ－ＯＧ：８４％（この二面角についても上のＣ－ＣＡ－ＣＢ－ＯＧと同じことが言える）
Ｏ－Ｃ－ＣＡ－ＣＢ：１９％。
Ｓ８の二面角に関して、線維におけるペプチドが、環状ペプチドの二面角のほぼ全体（９０％）の範囲内にある二面角を占める確率は以下の通りである：
Ｃ－ＣＡ－ＣＢ－ＯＧ：３０％
Ｎ－ＣＡ－ＣＢ－ＯＧ：２８％
Ｏ－Ｃ－ＣＡ－ＣＢ：２５％。
上の側鎖二面角分布の解析によれば、７Ｄおよび８Ｓが直鎖状ペプチドおよび線維のアンサンブルとの相違が最も大きい残基である。７Ｄおよび／または８Ｓは、立体配座選択性を付与するエピトープ上の重要な残基であり得る。
図３～５に示されるデータに基づき、環状ペプチド種とそれ以外の種との間に分布の有意差がみられる二面角について二面角分布のピーク値を表１に挙げる。表１の列１は、検討した具体的な二面角であり、列２は、直鎖状ペプチドＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）におけるその角の二面角分布のピーク値であり、列３は、環状ペプチドＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）におけるその角の二面角分布のピーク値であり、列４は、直鎖状ペプチドと環状ペプチドの二面角分布のピーク値の差であり、列５は、線維構造２Ｍ４ＪにおけるペプチドＨＤＳＧ（配列番号１）の二面角分布のピーク値である。
Figure 0007065516000004
Ｖ．側鎖のエントロピー
残基の側鎖のエントロピーは、
Figure 0007065516000005
 から概算され得る。
式中、総和は特定の残基の側鎖の全二面角であり、ｐ（φｉ）は上で解析した二面角分布である。
線維のエントロピーに対する環状ペプチドアンサンブルの残基エントロピーの増分のプロットを図６に示す。Ｈ６のエントロピーは直鎖状および線維と比較して減少しており、このことは、Ｈ６がより拘束されたポーズであることを示している。これと同様に、直鎖状ペプチドまたは環状ペプチドのＳ８のエントロピーは線維よりごくわずかに大きい。Ｄ７のエントロピーはモノマーより減少しているが、線維に比べて増大している。
残基側鎖部分のエントロピーの詳細な分析
Ｈ、ＤおよびＳのそれぞれの側鎖の各二面角のエントロピーを検討した。Ｈ６、Ｄ７およびＳ８の二面角のエントロピーを図６にプロットする。Ｈ、ＤおよびＳのいくつかの二面角のエントロピーが線維と比較して減少しており、このことは、線維モノマーまたは直鎖状モノマーとは異なる傾向がある立体配座においてそれらの角のポーズが制約されることを示している。
環状ペプチドは全般的に直鎖状ペプチドより強固であり、特にＨ６についてそのことが言える。さらに、残基Ｈ６は線維立体配座より環状ペプチドの方が強固である。このことは、特にＨ６周辺に明確に定められた抗原プロファイルが存在し得ることを示唆している。しかし、このプロファイルは直鎖状アンサンブルおよび線維アンサンブルと確かに重なり合っている。つまり、これらのアンサンブルがＨ６の分布の上位９０％以内に入る確率は以下の通りである：環状－直鎖状アンサンブルおよび環状－線維アンサンブルでのＣ－ＣＡ－ＣＢ－ＣＧ、Ｎ－ＣＡ－ＣＢ－ＣＧ、ＣＡ－ＣＢ－ＣＧ－ＮＤ１、ＣＢ－ＣＧ－ＮＤ１－ＣＥ１およびＯ－Ｃ－ＣＡ－ＣＢはそれぞれ（３６％、３６％、３６％、３５％、３３％）および（１３％、１３％、３０％、３４％、６５％）。環状ペプチドの側鎖立体配座のエントロピーが低いことから、選択性を付与するのに役立つ可能性のある明確に定められた立体配座のポーズが裏付けられる。
ＶＩ．ラマチャンドラン角
エピトープが抗体に対して露出する主鎖配向は、ペプチドが直鎖状型であるか、環状型であるか、または繊維型であるかによって異なる。この相違は、直鎖ペプチドおよび環状ペプチドの両方の残基Ｈ、Ｄ、Ｓ、Ｇについて、主鎖に沿ってラマチャンドラン角ファイおよびプサイ（またはΦおよびΨ）をプロットすることにより定量化することができる。配列ＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）よりなる直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドの両方ならびに線維構造２Ｍ４ＪにおけるＨＤＳＧ（配列番号１）の残基Ｈ６、Ｄ７、Ｓ８およびＧ９について平衡シミュレーションでサンプリングしたファイ角およびプサイ角を図７にプロットする。図７から、残基Ｄ７およびＳ８のＢＢ二面角に関して、環状ペプチドの主鎖二面角分布は、直鎖状ペプチドまたは線維構造２Ｍ４ＪにおけるペプチドＨＤＳＧ（配列番号１）についてサンプリングした二面角の分布との差が最も大きいことがわかる。
具体例として、残基Ｄ７に関して、図７は環状ペプチドが（Φ、Ψ）＝（（－６５．９°、－４４．５°）でピーク値（最も可能性が高い値）となるラマチャンドランΦ、Ψ角の分布を示している。直鎖状ペプチドは、これらの最も可能性が高い値が（Φ、Ψ）＝（－１５３°、１６５°）および（－６６°、１４３°）（ピークが２つ存在する）であり、線維構造２Ｍ４Ｊは、これらの最も可能性が高い値が（Φ、Ψ）＝（－６０°、１４３°）および（－１５０°、１４３°）である。このピーク二面角値の実質的な差は、環状エピトープ立体配座に対して選択した抗体が直鎖状エピトープおよび線維エピトープに対して低い親和性を有する可能性があることを示している。
Ｈ６、Ｄ７、Ｓ８およびＧ９に関するラマチャンドラン主鎖Φ、Ψ分布のピーク値（最も可能性が高い値）を表２に示す。表２の第１列には、検討した残基が記載されており、この残基は括弧内に示される２つの角ファイおよびプサイを示す。第２列には、直鎖状ペプチドＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）におけるＨＤＳＧ（配列番号１）のラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値が示されており、第３列には、環状ペプチドＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）におけるＨＤＳＧ（配列番号１）のラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値が示されており、最終列には、線維構造２Ｍ４ＪにおけるＨＤＳＧ（配列番号１）のラマチャンドランファイ／プサイ角のピーク値が示されている。図７を参照されたい。Ｈ６に関しては、主鎖ラマチャンドラン角が全３種の間で極めて類似している。Ｄ７に関しては、環状アンサンブルの点と重なり合う直鎖状アンサンブルおよび線維アンサンブルの点が少数みられる。環状アンサンブルの点の９０％を取り囲む楕円を考えると、直鎖状アンサンブルの約１６％のみがこの楕円の内側に入り、線維アンサンブルの約１０％のみがこの包の内側に入る。Ｈ６に関する類似した測定値について、対応する数は、直鎖状アンサンブルが２７％、線維アンサンブルが３２％である。Ｓ８に関しては、環状アンサンブルの点の９０％を取り囲む最も小さい凸包に直鎖状アンサンブルおよび線維アンサンブルの３７％および１５％がそれぞれ含まれる。Ｇ９に関しては、９０％凸包は点の９０％を含む２つの凸包に最もよく分割される。これらの包に含まれる点の割合は、直鎖状アンサンブルのものが７９％、線維アンサンブルのものが１１％である。
Figure 0007065516000006
ＶＩＩ．予測エピトープ配列の溶解度および抗原性
ＣａｍＳｏｌ予測スキーム［４］によるＡベータ４２の残基の溶解度を図８に示す。残基Ｈ６～Ｇ９が縦の線により示されている。
残基の溶解度が高いほどオリゴマーの表面で出会う可能性が高い。残基ｉの相対溶解度係数σｉは
Figure 0007065516000007
のように導入され、式中、ｓｉは残基ｉの溶解度であり、ｓｓａｖｅは４２残基Ａベータペプチドの平均溶解度であり、上に記載されるδｓは、４２残基Ａベータペプチドの溶解度の標準偏差である。
正の溶解度は、残基が溶媒に露出しやすく抗体に接触可能なものである可能性が高いことを示し、この尺度でのＡベータ４２の１～４２の全残基の平均溶解度は－０．３９である。構造に関する情報がそれ以上存在しない場合、この領域の溶解度の増大は、それが埋没しているのではなく溶媒に露出している可能性があることを示している。したがって、候補オリゴマーのアンサンブルでは、この領域は平均よりも露出しやすい傾向があると思われる。ＣａｍＳｏｌ法［４］は、アミノ酸の疎水性、中性ｐＨでの残基の静電荷、αへリックス傾向およびβ鎖傾向を含めた特定の物理化学的特性の線形結合を用いるものであり、この線形結合は、隣接残基の作用の主要因である７残基のウィンドウにわたってなめらかになる。溶解度スコアを無次元数（Ａ．Ｕ．またはＡＵ）として算出し、ランダムなポリペプチドで平均値０および標準偏差１のプロファイルが得られるように溶解度プロファイルの尺度を変更する。その結果、溶解度スコアが－１より小さいアミノ酸は、溶解性に乏しくタンパク質の溶解度に負の影響を及ぼすものと見なされ、１より大きいスコアは、溶解性が高く全体の溶解度に積極的に寄与する領域を表す。
図９に、溶媒接触表面積（ＳＡＳＡ）、各残基の溶解度係数により重み付けしたＳＡＳＡ、σｉ・ＳＡＳＡｉおよびσｉ・ＳＡＳＡｉから線維での値を減じたもの、すなわち、モノマーペプチドおよび環状ペプチドでのこの量の線維に対する増分σｉΔＳＡＳＡｉをプロットする。ここでは、ｓｉは図８から取り上げた残基ｉの溶解度であり、＜ｓ＞はＡベータの４２残基全体の平均溶解度、＜ｓ＞＝－０．３９であり、
Figure 0007065516000008
はＡβの４２残基全体の溶解度の標準偏差である。ＳＡＳＡ対残基インデックスのプロットは、全立体配座において、残基がＮ末端の方向に向かって、より抗体が接触可能な表面を提示する傾向があることを示している。明確に定められていない状況において所与の残基が溶媒に表面を露出する可能性の尺度を示す溶解度により重み付けした場合、環状ペプチドアンサンブルでは残基Ｈ６とＳ８に差がみられない。ＳＡＳＡを上記のように溶解度により重み付けし、次いで対応する線維の値を減じて残基に対する値を示した場合、残基Ｓ８は環状ペプチドで最も露出し溶解性の高いものとして現れる。この解析から、このペプチドでは残基Ｓ８およびＨ６が潜在的に結合に特に重要なものであるものとして強調される。
環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドのＳＡＳＡは同程度であり、ともに線維でのＳＡＳＡより大きい。
溶解度による重み付けによって、線維構造でのＨＤＳＧ（配列番号１）の立体配座と比較して露出および抗体結合への接触可能性が異なる可能性が最も高い残基Ｓ８が得られる。
ＶＩＩＩ．環状ペプチド立体配座のアンサンブルは直鎖状立体配座または線維立体配座のアンサンブルとは異なる方法でクラスター化する
立体配座間に標準的な構造アライメントの測定基準を用い、次いでクラスタリング解析を実施することにより、配列ＨＤＳＧ（配列番号１）が環状ペプチドにおいて直鎖状ペプチドとは異なる立体配座を提示するという決定的証拠を確認することができる。直鎖状ペプチドおよび環状ペプチドのＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）ならびにＰＤＢ ＩＤ ２Ｍ４Ｊに対応する３回対称性構造の完全長線維について立体配座の平衡アンサンブルを得る。これらのアンサンブルから残基ＨＤＳＧ（配列番号１）に関する立体配座のスナップショットを収集し、次いで、直鎖状ペプチドアンサンブルの最も大きい３つのクラスターの重心を構造的に整列させ、平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）を記録する。ここでは、最大クラスターアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｓｂｇ．ｂｉｏ．ｉｃ．ａｃ．ｕｋ／ｍａｘｃｌｕｓｔｅｒ）によりクラスタリングを実施する。図１０に、直鎖状アンサンブル、環状アンサンブルおよび線維アンサンブルの３つの対応するＲＭＳＤ値を三次元散布図としてプロットする。
濃い丸で示される環状ペプチドアンサンブルは、灰色の十字で示される直鎖状ペプチドまたは灰色の逆三角で示される線維アンサンブルとは立体配座的に異なっている。図１０の上部のプロットは、環状ペプチドは線維によって示される立体配座と異なっているが、直鎖状ペプチドはそうではないことを示している。このことは、環状ペプチドに対して生じさせた抗体が立体配座に選択的であり、線維またはモノマーとは優先的に結合しないものであり得るが、モノマーに対して生じさせた抗体は依然として線維と結合し得ることを示している。したがって、理論に拘束されるのを望むわけではないが、環状ペプチドをオリゴマーの模倣物として使用すれば、その模倣体に対して生じさせた抗体がモノマーまたは線維と結合する可能性は低いと思われる。
図１０から、３つのアンサンブルが互いに異なる方法でクラスター化することは明らかである。特に、環状ペプチド構造のアンサンブルは直鎖状アンサンブルまたは線維アンサンブルとは異なっており、このことは、環状ペプチドエピトープに特異的な抗体が直鎖状アンサンブルまたは線維アンサンブル内で提示される立体配座に対して低い親和性を有する可能性があることを示している。
図１１Ａに、環状ペプチドの構造アンサンブルの最大のクラスターの重心を構成する代表的なスナップショットの図を２つ示す。図１１Ａにはさらに、直鎖状ペプチドアンサンブルのうち直鎖状ペプチドアンサンブルの二面角分布のピーク付近に二面角を有する代表的な立体配座について示した側鎖配向を環状ペプチドに重ね合わせて黒色で示し、それらの配向の差を明確にした。上で考察した二面角の差に基づけば、残基Ｄ７およびこれより若干程度は低いが残基Ｓ８が異なる方法で露出する可能性がある。
図１２は、平均二乗偏差（ＲＭＳＤ）による一連のクラスタリングプロットであり、軸は、図１０と同じく直鎖状ペプチドアンサンブルの最も大きい３つのクラスターの重心に対応する。
各点は、環状ペプチドまたはＰＤＢ ＩＤ ２ＬＭＮ、２ＭＸＵおよび２ＬＭＰの線維平衡アンサンブルの様々な「株」から取り上げた所与の立体配座に対応する。濃い丸で示される環状ペプチドアンサンブルは、いずれの線維アンサンブルとも立体配座的に異なっている。これらの線維はいずれも不規則なＮ末端の程度にばらつきがあるため、線維アンサンブルは直鎖状アンサンブルをある程度再現している。このことは、環状ペプチドに対して生じさせた抗体が立体配座に選択的であり、Ａベータの複数の株の線維立体配座と結合しない可能性を示している。
図１０から取り上げたクラスター重心環状ペプチド立体配座ならびに直鎖状ペプチドアンサンブルおよび線維アンサンブルの対応する重心立体配座に関して実施したラマチャンドラン主鎖二面角および側鎖二面角の値を表３に挙げる。ここでは、平衡線維アンサンブルの最大クラスターの重心立体配座も取り上げる。環状立体配座と直鎖状立体配座との間および環状立体配座と線維立体配座との間の対応する二面角の差も記載する。本明細書に記載されるように、この表の二面角の大部分に有意な差がみられる。
Figure 0007065516000009
Figure 0007065516000010
Figure 0007065516000011
実施例３
立体配座拘束エピトープを含む環状化合物構築
シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）などのＨＤＳＧ（配列番号１）を含むペプチドは頭－尾環化することができる。
Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成などの既知の方法を単独で、または他の方法と組み合わせて用い、ＨＤＳＧ（配列番号１）と、好ましくは２個、３個もしくは４個のアミノ酸および／またはＰＥＧ単位を含むリンカーとを含む、直鎖状ペプチドを合成することができる。例えばＨａｍｌｅｙ（２０１４）［６］およびＲｏｂｅｒｔｓら（２０１２）［７］（それぞれ参照により本明細書に組み込まれる）に記載されているカップリング化学を用いて、ＰＥＧ分子をＮ末端のアミン基に結合させることができる。直鎖状ペプチド化合物は、１）ペプチド＋リンカーのアミノ末端とカルボキシ末端を共有結合させてペプチド結合を形成させること（例えば、主鎖の環化）、２）ペプチド＋リンカー内のアミノ末端もしくはカルボキシ末端と側鎖を共有結合させること、または３）ペプチド＋リンカー内の２つの側鎖を共有結合させることにより環化され得る。
環状化合物内の結合は、すべて通常のペプチド結合であっても（ホモデティック環状ペプチド）、あるいはエステル結合、エーテル結合、アミド結合もしくはジスルフィド結合などの他のタイプの結合を含んでも（ヘテロデティック環状ペプチド）よい。
ペプチドをＮ末端もしくはＣ末端またはペプチドの内側にある、例えばシステインおよびホモシステインを含めたチオール含有残基またはメルカプタン含有残基の酸化により環化させ得る。例えば、ペプチドに隣接する２つのシステイン残基を酸化させてジスルフィド結合を形成させ得る。用い得る酸化試薬としては、例えば、酸素（空気）、ジメチルスルホキシド、酸化グルタチオン、シスチン、塩化銅（ＩＩ）、フェリシアン化カリウム、トリフルオロ酢酸タリウム（ＩＩＩ）またはその他の酸化試薬、例えば当業者に公知であり当業者に公知の方法とともに使用し得る酸化試薬などが挙げられる。
米国特許出願公開第２００９／０２１５１７２号、米国特許出願公開第２０１０／０２４０８６５号、米国特許出願公開第２０１０／０１３７５５９号には環状ペプチド合成に関連する方法および組成物が記載されており、米国特許第７，５６９，５４１には環化の様々な方法が記載されている。国際公開第０１／９２４６６号およびＡｎｄｒｅｕら，１９９４．Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ ３５：９１－１６９にはその他の例が記載されている。
より具体的には、システイン残基が隣接し、かつ／または挿入されているスペーサーを含むリンカーを付加することにより、ＨＤＳＧ（配列番号１）エピトープを含む環状ペプチドを構築することができる。ペプチドのＮ末端およびＣ末端に付加した非天然システイン残基の間でジスルフィド結合を形成させることにより、ペプチドを環状立体配座に構築することができる。また、Ｎ末端とＣ末端のアミノ酸の間でペプチド結合を形成させること（例えば、頭－尾環化）により、それを環状化合物に合成することができる。
ペプチド合成を標準的な製造方法に従いＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社（サニーベール、カリフォルニア州、米国）で実施する。
例えば、ＨＤＳＧ（配列番号１）を含むペプチドのＮ末端およびＣ末端に付加したシステイン残基間のジスルフィド結合を用いて、拘束された環状立体配座の立体配座エピトープＨＤＳＧ（配列番号１）を含むシクロ（ＣＧＨＤＳＧＣ）（配列番号１２）環状ペプチドを構築することができる。２つの非天然システイン残基にうち１つをＧＨＤＳＧ（配列番号７）のＣ末端に、１つをＮ末端に付加した。この２つのシステインを制御された条件下で酸化してジスルフィド架橋を形成させる、または頭部と尾部を反応させてペプチド結合を生じさせる。
上記の通り、ＡベータオリゴマーのＨＤＳＧ（配列番号１）のアミノ酸側変化の立体配座および配向を模倣するように環状ペプチドの構造を設計した。
シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）
以下の方法（ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、サニーベール、カリフォルニア州）を用いてシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）を合成した。標準的な従来のＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成により、保護された直鎖状ペプチドを２－クロロトリチルクロリド樹脂上で合成し、次いで、３０％ＨＦＩＰ／ＤＣＭを用いて樹脂から切断した。低濃度のＥＤＣ．ＨＣｌ／ＨＯＢｔ／ＤＩＥＡのＤＭＦ溶液を用いることにより、保護された直鎖状ペプチドを対応する保護された環状ペプチドに環化した。保護された環状ペプチドをＴＦＡにより脱保護して粗環状ペプチドを得、粗ペプチドをＲＰ ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥後、純粋な環状ペプチドを得た。
直鎖状ペプチドＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）のアミド縮合によりシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）を調製することができる。
直鎖状化合物Ｃ－ＰＥＧ２－ＨＤＳＧＧ（配列番号２８）のアミド縮合によりシクロ（Ｃ－ＰＥＧ２－ＨＤＳＧＧ）を調製することができる。
直鎖状（ＣＧＨＤＳＧＧ）を調製した（ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、サニーベール、カリフォルニア州）。標準的な従来のＦｍｏｃベースの固相ペプチド合成により、保護された直鎖状ペプチドをＦｍｏｃ－Ｇｌｙ－Ｗａｎｇ樹脂上で合成し、次いで、保護されたペプチドをＴＦＡにより切断して粗ペプチドを得、粗ペプチドをＲＰ ＨＰＬＣにより精製し、凍結乾燥後、純粋なペプチドを得、これを用いてＢＳＡをコンジュゲートした。
免疫原構築
環状化合物シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）を上記の通りに合成し、次いでＢＳＡおよび／またはＫＬＨとコンジュゲートした（ＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社、サニーベール、カリフォルニア州）。ＰＢＳ緩衝液に溶かしたＳＭＣＣによりＢＳＡまたはＫＬＨを再活性化し、次いで、純粋なペプチドをＰＢＳ緩衝液に溶かした溶液をコンジュゲーション混合物に加え、コンジュゲーション混合物を室温（ＲＴ）で２時間攪拌した。次いで、コンジュゲーション混合物を透析後に凍結乾燥させて、コンジュゲーション産物を得た。
実施例４
抗体の作製および選択
立体配座拘束化合物、任意選択で環状化合物、例えばシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）ペプチドなどのＨＤＳＧ（配列番号１）を含む環状ペプチドなどとキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）とを結合させる。カナダ動物管理協会により承認されたプロトコルに従ったマウスモノクローナル抗体作製（ＩｍｍｕｎｏＰｒｅｃｉｓｅ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ社（ビクトリア、ブリティッシュコロンビア州、カナダ））のためにシクロペプチドを送る。ＢＳＡと結合した、抗体の作製に使用する立体配座ペプチドまたは関連ペプチド、例えばシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）ペプチドを用いて、マウス血清をスクリーニングする。
実施例６にさらに記載するように、シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）を含む免疫原を用いてハイブリドーマを作製した。ＥＬＩＳＡおよびＳＰＲにより、本明細書に記載される直鎖状（未構造化）ペプチドよりもシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）ペプチドと優先的に結合するハイブリドーマ上清をスクリーニングした。陽性ＩｇＧ分泌クローンを大規模生産およびプロテインＧを用いるさらなる精製に供する。
実施例５
斑／線維との結合の有無の評価
新鮮な凍結ヒト脳切片または１０％ホルマリンで固定した後の凍結ヒト脳切片で免疫組織化学を実施することができる。過酸化水素の０．５％メタノール溶液を２０分間用いて、内因性ペルオキシダーゼ活性を失活させることができる。ｐＨ６．０のクエン酸ナトリウムおよび２５分間の蒸気加熱を用いて抗原回復を達成することができ、次いで室温（ＲＴ）で３０分間冷却する。ＴＢＳ中で５～７分間安定化させた後、切片を７０％ギ酸によりＲＴで１５分間処理し、次いでＴＢＳで３×１５分間洗浄する。加湿チャンバ内で無血清タンパク質ブロッキング試薬（Ｄａｋｏ Ｃａｎａｄａ社、ミシサガ、オンタリオ州、カナダ）と１時間インキュベートすることにより非特異的染色をブロックする。
免疫染色には、本明細書に記載される抗体、陽性対照の６Ｅ１０（１μｇ／ｍｌ）およびアイソタイプ対照のＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂ（１μｇ／ｍｌ、Ａｂｃａｍ社）を一次抗体として用いる。切片を４℃で一晩インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔで３×５分間洗浄する。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（１：１０００、ＥＣＬ社）を切片に添加し、４５分間インキュベートし、次いでＴＢＳ－Ｔで３×５分間洗浄する。ＤＡＢ発色試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を加え、バックグランド染色に対して所望の標的レベルに達したとき、切片を蒸留水でリンスする。切片をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバーガラスをかけた。スライドを光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｃａｎａｄａ社、トロント、オンタリオ州、カナダ）下で検査し、Ｌｅｉｃａ社のＤＣ３００デジタルカメラおよびソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｎａｄａ社、リッチモンドヒル、オンタリオ州）を用いて代表的な画像を５０倍、２００倍および４００倍の倍率で記録する。
実施例６
方法および材料
免疫原
米国カリフォルニア州サニーベールのＣＰＣ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ社で環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドを作製した。トリフルオロ酢酸対イオンプロトコルを用いてペプチドをＫＬＨ（免疫感作用）およびＢＳＡ（スクリーニング用）とコンジュゲートした。ペプチドを脱塩し、ＭＳおよびＨＰＬＣにより確認し、純度９５％であると判断された。ペプチドをＩＰＡ社に発送し、マウスを用いたモノクローナル抗体の作製に使用した。
抗体
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）と結合したシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）に対するハイブリドーマおよびモノクローナル抗体をいくつか作製した。
５０日齢の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス（Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、ケベック州）を免疫感作した。抗原を含有するがアジュバントは含有しない一連の皮下水性注射剤を１９日間にわたって投与した。環状ペプチド－ＫＬＨの０．５ｍｇ／ｍＬ無菌生理食塩水溶液の注射によりマウスを１匹当たり１００μｇのペプチドで免疫感作した。マウスをＬａｂ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ社の換気ラックシステムで飼育した。第１９日、マウス全４匹を安楽死させ、ハイブリドーマ細胞系の作製用にリンパ球を回収した。
融合／ハイブリドーマの発育
リンパ球を単離し、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ１５００）の存在下でマウスＳＰ２／０ミエローマ細胞と融合させた。融合した細胞をＨＡＴ選択を用いて培養した。この方法では、半固形メチルセルロース系ＨＡＴ選択培地を用いてハイブリドーマ選択とクローン化とを１つの段階に組み合わせる。半固形培地上で単一細胞由来のハイブリドーマが増殖してモノクローナルコロニーを形成した。融合事象から１０日後、得られたハイブリドーマクローンを９６ウェル組織培養プレートに移し、中期対数増殖期に達するまで（５日）ＨＴ含有培地で増殖させた。
ハイブリドーマの解析（スクリーニング）
ハイブリドーマの組織培養上清を間接ＥＬＩＳＡによりスクリーニング抗原（環状ペプチド－ＢＳＡ）（一次スクリーニング）で試験し、ヤギ抗ＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）－ＨＲＰ二次抗体を用いてＩｇＧ抗体およびＩｇＭ抗体の両方について探索し、ＴＭＢ基質で発色させた。このアッセイで０．２ＯＤ超であったクローンを次の試験ラウンドに進めた。陽性培養物をスクリーニング抗原で再試験して分泌を確認し、無関係の抗原（ヒトトランスフェリン）で再試験して非特異的ｍＡｂを除去し、偽陽性を除外した。抗体捕捉ＥＬＩＳＡにより目的とする全クローンにアイソタイピングを実施して、それらがＩｇＧアイソタイプであるのか、またはＩｇＭアイソタイプであるのかを判定した。また、目的とする全クローンを間接ＥＬＩＳＡにより他の環状ペプチド－ＢＳＡコンジュゲートおよび直鎖状ペプチド－ＢＳＡコンジュゲートで試験して、交差反応性を評価した。
ＢＳＡとコンジュゲートしたシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）を用いた間接ＥＬＩＳＡにより、マウスハイブリドーマ抗体をスクリーニングした。
ＥＬＩＳＡ抗体スクリーニング
簡潔に述べれば、ＥＬＩＳＡプレートを４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルのシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）コンジュゲートＢＳＡ １００ｕＬ／ウェルでコートし、脱脂粉乳の３％ＰＢＳ溶液を用いて室温で１時間ブロックした。一次抗体：３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした１００ｕＬ／ウェルのハイブリドーマ上清。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中１：１０，０００の１００ｕＬ／ウェルのヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ ＨＣｌで停止させた。
さらなる試験のため陽性クローンを選択した。マウスハイブリドーマの陽性クローンを間接ＥＬＩＳＡにより、シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）コンジュゲートＢＳＡおよびヒトトランスフェリン（ＨＴ）に対する反応性について試験した。プレートを１）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルのシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）コンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）１００ｕＬ／ウェル；または２）３７℃のｄＨ２Ｏ Ｏ／Ｎ中０．２５ｕｇ／ウェルのＨＴ抗原５０ｕＬ／ウェルでコートした。一次抗体：３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした１００ｕＬ／ウェルのハイブリドーマ上清。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルの１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質３，３’，５，５’－テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）を５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ ＨＣｌで停止させた。
ＥＬＩＳＡによるシクロＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）化合物と直鎖状ＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）化合物の選択性
ＥＬＩＳＡプレートを１）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルのシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）コンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）１００ｕＬ／ウェル；２））４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルの直鎖状ＣＧＨＤＳＧＧコンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）１００ｕＬ／ウェル；または３）４℃の炭酸塩コーティング緩衝液（ｐＨ９．６）Ｏ／Ｎ中０．１ｕｇ／ウェルの陰性ペプチド１００ｕＬ／ウェルでコートした。一次抗体：３７℃で振盪しながら１時間インキュベートした１００ｕＬ／ウェルのハイブリドーマ上清。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルの１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＋Ｌ）－ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質ＴＭＢを５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ ＨＣｌで停止させた。
アイソタイピング
抗体捕捉実験を用いてハイブリドーマ抗体にアイソタイピングを実施した。捕捉プレートをｐＨ９．６の炭酸塩コーティング緩衝液中、４℃で一晩、１００ｕＬ／ウェルの１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＧ／ＩｇＭ（Ｈ＆Ｌ）抗体でコートした。ブロッキング段階は用いなかった。一次抗体（ハイブリドーマ上清）を加えた（１００ｕｇ／ｍＬ）。二次抗体：３７℃で１時間振盪したＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎ中１００ｕＬ／ウェルの１：５，０００ヤギ抗マウスＩｇＧγ－ＨＲＰまたは１：１０，０００ヤギ抗マウスＩｇＭμ－ＨＲＰ。全洗浄段階をＰＢＳ－Ｔｗｅｅｎで３０分間実施した。基質ＴＭＢを５０ｕＬ／ウェルで加え、暗所で発色させ、等体積の１Ｍ ＨＣｌで停止させた。
ＳＰＲ結合アッセイ－一次および二次スクリーニング
抗体とＡベータモノマーおよびＡベータオリゴマーとの結合に関するＳＰＲ解析
ＡベータモノマーおよびＡベータオリゴマーの調製組換えＡベータ４０およびＡベータ４２ペプチド（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｐｅｐｔｉｄｅ社、ソルトレイクシティ、ユタ州、米国）を氷冷ヘキサフルオロイソプロパノール（ＨＦＩＰ）に溶かした。一晩蒸発させることによりＨＦＩＰを除去し、ＳｐｅｅｄＶａｃ遠心機で乾燥させた。モノマーの調製には、ペプチド薄膜をＤＭＳＯで戻して５ｍＭとし、ｄＨ２Ｏでさらに１００μＭに希釈し、直ちに使用した。５ｍＭのＤＭＳＯペプチド溶液を無フェノールレッドＦ１２培地（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）で希釈して最終濃度１００μＭとすることによりオリゴマーを調製し、４℃で２４時間～７日間インキュベートした。
ＳＰＲ解析高強度レーザー光および高速光学式走査を用いて結合相互作用をリアルタイムでモニターする分析用バイオセンサーであるＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ－１）（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて、全ＳＰＲ測定を実施した。ＳＰＲ直接結合アッセイを用いて組織培養上清の一次スクリーニングを実施し、このアッセイでは、Ｈｉｇｈ Ａｍｉｎｅ Ｃａｐａｃｉｔｙ（ＨＡＣ）センサーチップ（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）の個々のフローセル上にＢＳＡコンジュゲートペプチド、Ａベータ４２モノマーおよびＡベータ４２オリゴマーを共有結合で固定化し、表面に抗体を流した。二次スクリーニングでは、プロテインＧで精製したｍＡｂをＳＰＲ間接（捕捉）結合アッセイを用いて解析し、このアッセイでは、プロテインＡ誘導体化センサーチップ（ＸａｎＴｅｃ Ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃｓ社、デュッセルドルフ、ドイツデュッセルドルフ、ドイツ）上に抗体を捕捉し、表面にＡベータ４０モノマー、Ａベータ４２オリゴマー、可溶性脳抽出物および脳脊髄液を流した。ＳＰＲ直接結合アッセイで、ＨＡＣセンサーチップの個々のフローセル上にＡベータ４２モノマーおよびＡベータ４２オリゴマーを共有結合で固定化し、精製ｍＡｂを流すことにより抗体の特異性を検証した。
可溶性脳抽出物およびＣＳＦ試料のＳＰＲ解析
可溶性脳抽出物およびＣＳＦの調製ＵＢＣ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ Ｃｌｉｎｉｃで評価した患者からヒトの脳組織およびＣＳＦを採取した。推定ＡＤの臨床診断はＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＤＡ基準［５］に基づくものである。腰椎穿刺後１時間以内にＣＳＦをポリプロピレンチューブに収集し、処理し、１００μＬポリプロピレンバイアルに等分し、－８０℃で保管する。
ホモジナイゼーション：ヒト脳組織試料の重量を測定し、次いで、脳組織の最終濃度が２０％（ｗ／ｖ）になるよう一定量の新鮮な氷冷ＴＢＳ（カナダケベック州ラヴァルのＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社の無ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビターカクテルを添加したもの）に浸漬した。この緩衝液中で機械的プローブホモジナイザーを用いて組織をホノジナイズ（間に３０秒の停止を挟んで３×３０秒のパルス、いずれも氷上で実施）する。次いで、ＴＢＳ中でホモジナイズした試料を超遠心分離にかける（７０，０００×ｇで９０分）。上清を収集し、等分し、－８０℃で保管する。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）を用いてＴＢＳホモジネートのタンパク質濃度を求める。
ＳＰＲ解析ＡＤ患者４例および同年齢の対照４例の脳抽出物ならびにＡＤ患者９例および同年齢の対照９例のＣＳＦ試料をプールし解析した。プロテインＡ誘導体化センサーチップの別個のフローセル上に精製ｍＡｂを捕捉し、表面に希釈試料を１８０秒間注入し、次いで、緩衝液で１２０秒間解離を実施し、表面を再生した。マウス対照ＩｇＧ参照の表面結合およびアッセイ緩衝液の減算により結合応答を二重参照し、異なる試料のグループを比較した。
Ａベータモノマーとの結合の有無の評価
組織培養上清の一次スクリーニングでは、Ａベータ４２モノマーおよびＡベータ４２オリゴマーを直接結合アッセイに用いた。二次スクリーニングでは、Ａベータ４０モノマーおよびＡベータ４２オリゴマー、可溶性脳抽出物およびＣＳＦ試料を間接（捕捉）結合アッセイに用いた。
一次スクリーニング
コグネイト環状ペプチドに対する抗体の結合の有無について組織培養上清をスクリーニングした。各試料を希釈し、固定化したペプチドおよびＢＳＡ参照の表面に１２０秒間、二重反復で注入し、次いで、３００秒間の解離相にのみランニング緩衝液を注入した。解析サイクル毎に、センサーチップ表面を再生した。ＢＳＡ参照表面およびブランクランニング緩衝液注入から結合を減算することによりセンサグラムを二重参照し、解離相の結合応答報告点を収集した。
オリゴマー結合アッセイ
次の合成Ａベータ４２オリゴマーを上記の通りに作製および固定化し、抗体結合応答を解析した。Ａベータ４２オリゴマーに対する抗体結合応答を環状に対する結合応答と比較した。
Ａベータオリゴマーとの結合の検証。
Ａベータ４２オリゴマー結合をさらに検証および確認するため、抗体を共有結合で固定化し、次いで、市販の調製済みの安定なＡベータ４２オリゴマー（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社、ヴァンドゥーヴル＝レ＝ナンシー、フランス）を表面に注入した。
結果
ＥＬＩＳＡ試験では、ハイブリドーマクローンの大部分がシクロペプチドと結合することがわかった。
次のクローンをシクロＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）化合物および直鎖状ＣＧＨＤＳＧＧ（配列番号２）化合物に対する結合選択性についてＥＬＩＳＡにより試験した。複数のクローンが直鎖状ＣＧＨＤＳＧＧコンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）よりも優先的にシクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）コンジュゲートＢＳＡ（配列番号２）と結合した。
アイソタイピングでは、クローンの大部分がＩｇＧ１クローン、ＩｇＧ２ａクローンおよびＩｇＧ３クローンを含めたＩｇＧであることがわかった。ＩｇＭクローンおよびＩｇＡクローンも複数同定されたが、それ以上追究しなかった。
表面プラズモン共鳴を用いた直接結合解析を実施して、配列番号２の環状ペプチドと結合する組織培養上清中の抗体についてスクリーニングした。
図１４は、直接結合アッセイの結果およびＥＬＩＳＡの結果をプロットしたものであり、直接結合の結果とＥＬＩＳＡの結果との間に相関があることを示している。
上記の通りに調製した環状ペプチド、直鎖状ペプチド、Ａベータ１～４２モノマーおよびＡベータ１～４２オリゴマーとの結合能についてクローンを再試験した。上記のＳＰＲを用いて結合アッセイを実施した（直接結合アッセイ）。表５に示すように、実施した結合アッセイに基づきクローンをいくつか選択した。
選択したクローンはＩｇＧ ｍＡｂであった。一次スクリーニングの負の数は結合がみられなかった（例えば、アイソタイプ対照未満であった）ことを示している。
Figure 0007065516000012
ＥＬＩＳＡプレスクリーニング
ハイブリドーマ上清のＥＬＩＳＡプレスクリーニングにより、直鎖状ペプチドと比較して環状ペプチドとの結合の増大を示すクローンを特定した。そのクローンの一部はＫＬＨ－エピトープリンカーペプチドに対して反応性であった。これらはさらなる検討から除外した。本明細書に記載されるアイソタイピング法を用いて、クローンの大部分がＩｇＧアイソタイプであることが明らかになった。
表面プラズモン共鳴により測定する直接結合－一次スクリーニング
表面プラズモン共鳴を用いて、抗体クローンを含有する組織培養上清を環状ペプチド、直鎖状ペプチド、ＡベータオリゴマーおよびＡベータモノマーとの直接結合について試験した。
一次スクリーニングの結果を図１３に示す。パネルＡは環状ペプチドおよび直鎖状ペプチドとの結合を示している。パネルＢはＡベータオリゴマーおよびＡベータモノマーとの結合を示している。環状ペプチドに対しては、いくつかのクローンが反応性の増大を示し、直鎖状ペプチドに対しては、いずれのクローンも反応性が最小限であるか、または反応性を全く示さない。全体的にＡベータオリゴマー結合に対する選択性がみられる。モノマー反応性は、大部分のエピトープおよび大部分のクローンがほぼ０または０未満である。
図１５に、選択したクローンの結合プロファイルを比較して示す。表面プラズモン共鳴を用いて、環状ペプチド（構造化）、直鎖状ペプチド（非構造化）、ＡベータモノマーおよびＡベータオリゴマーにおける特定のエピトープに対する直接結合について各クローンを評価する。アスタリスクで示される対照には、非構造化エピトープ（例えば、直線状エピトープ）に対して優先的に反応性を示すクローンを選択した。
実施例７
二次スクリーニング
免疫組織化学
固定も抗原回復も実施していない凍結ヒト脳切片に免疫組織化学を実施した。加湿チャンバ内で無血清タンパク質ブロッキング試薬（Ｄａｋｏ Ｃａｎａｄａ社、ミシサガ、オンタリオ州、カナダ）と１時間インキュベートすることにより非特異的結合をブロックした。免疫染色には以下の一次抗体を使用した：マウスモノクローナルアイソタイプ対照ＩｇＧ１、ＩｇＧ２ａおよびＩｇＧ２ｂならびに抗アミロイドβ６Ｅ１０（以上、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ社から購入）ならびにシクロペプチドに対して反応性を示す選択した精製クローン。いずれの抗体も１μｇ／ｍＬで使用した。切片を室温で１時間インキュベートし、ＴＢＳ－Ｔで３×５分間洗浄した。西洋ワサビペルオキシダーゼとコンジュゲートした抗マウスＩｇＧ（１：１０００、ＥＣＬ社）を切片に添加し、４５分間インキュベートし、次いでＴＢＳ－Ｔで３×５分間洗浄した。ＤＡＢ発色試薬（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社、バーリントン、オンタリオ州、カナダ）を加え、バックグランド染色に対して所望の標的レベルに達したとき、切片を蒸留水でリンスした。切片をマイヤーのヘマトキシリンで対比染色し、脱水し、カバーガラスをかけた。スライドを光学顕微鏡（Ｚｅｉｓｓ Ａｘｉｏｖｅｒｔ ２００Ｍ、Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｃａｎａｄａ社、トロント、オンタリオ州、カナダ）下で検査し、Ｌｅｉｃａ社のＤＣ３００デジタルカメラおよびソフトウェア（Ｌｅｉｃａ Ｍｉｃｒｏｓｙｓｔｅｍｓ Ｃａｎａｄａ社、リッチモンドヒル、オンタリオ州）を用いて代表的な画像を２０倍および４０倍の倍率で記録した。Ａｄｏｂｅ ＰｈｏｔｏｓｈｏｐでＬｅｖｅｌｓ Ａｕｔｏ Ｃｏｒｒｅｃｔｉｏｎを用いて画像を最適化した。
ＣＳＦおよび脳抽出物
ＵＢＣのＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄ（Ｃ０４－０５９５）から承認を受け、メリーランド大学のＢｒａｉｎ ａｎｄ Ｔｉｓｓｕｅ Ｂａｎｋからヒト脳組織を入手した。ＵＢＣ Ｈｏｓｐｉｔａｌ Ｃｌｉｎｉｃ ｆｏｒ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ａｎｄ Ｒｅｌａｔｅｄ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓで評価した患者からＣＳＦを採取した。この試験はＵＢＣのＣｌｉｎｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｅｔｈｉｃｓ Ｂｏａｒｄにより承認を受けたものであり、ＣＳＦ試料を収集する前に参加者または法律上の近親者から書面による同意を得た。推定ＡＤの臨床診断はＮＩＮＣＤＳ－ＡＤＲＤＡ基準に基づくものとした。腰椎穿刺後１時間以内にＣＳＦをポリプロピレンチューブに収集し、処理し、１００μＬポリプロピレンバイアルに等分し、－８０で保管した。
ホモジナイゼーション：ヒト脳組織試料の重量を測定し、次いで、脳組織の最終濃度が２０％（ｗ／ｖ）になるよう一定量の新鮮な氷冷ＴＢＳおよびＲｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ社（ラヴェル、ケベック州、カナダ）の無ＥＤＴＡプロテアーゼインヒビターカクテルに浸漬した。この緩衝液中で機械的プローブホモジナイザーを用いて組織をホモジナイズ（間に３０秒の停止を挟んで３×３０秒のパルス、いずれも氷上で実施）した。次いで、ＴＢＳ中でホモジナイズした試料を超遠心分離にかけた（７０，０００×ｇで９０分）。上清を収集し、等分し、－８０℃で保管した。ＢＣＡタンパク質アッセイ（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社、ロックフォード、イリノイ州、米国）を用いてＴＢＳホモジネートのタンパク質濃度を求めた。
ＣＳＦ：ＡＤを有するドナー９例およびＡＤを有さないドナー９例からＣＳＦをプールした。精製ＩｇＧを全抗体とも３０マイクログラム／ｍｌの濃度で用いて、試料をＳＰＲにより解析した。マウスＩｇＧを抗体対照として使用し、いずれの実験も少なくとも２回反復した。
抗体６Ｅ１０を用いてＣＳＦおよび脳抽出物での陽性結合を確認した。
ＳＰＲ解析：ＡＤ患者の脳抽出物４例および同年齢の対照の脳抽出物４例をプールし解析した。ＴＢＳ中でホモジナイズした脳試料には前頭皮質のブロードマン第９野が含まれていた。いずれの実験も、高強度レーザー光および高速光学式走査を用いて結合相互作用をリアルタイムでモニターする分析用バイオセンサーである、実施例６に記載のＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ａｆｆｉｎｉｔｙ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍ（ＭＡＳＳ－１）（Ｓｉｅｒｒａ Ｓｅｎｓｏｒｓ社、ハンブルク、ドイツ）を用いて実施した。本明細書に記載されるシクロペプチドに対して作製した精製抗体をプロテインＡ誘導体化センサーチップの別個のフローセル上に捕捉し、表面に希釈試料を１８０秒間注入し、次いで、緩衝液で１２０秒間解離を実施し、表面を再生した。マウス対照ＩｇＧ参照の表面結合およびアッセイ緩衝液の減算により結合応答を二重参照し、異なる試料のグループを比較した。
結果
ＣＳＦ脳抽出物および免疫組織化学
いくつかのクローンをＣＳＦ、可溶性脳抽出物中でのＡベータとの結合能について試験し、死体ＡＤ脳の組織試料を表６に示す。表６では陽性度がプラス印の数により示されている。
表６および表７は、選択したクローンが本明細書に記載されるＳＰＲによる測定でモノマーよりもオリゴマーに対して結合選択性を有することのデータとなる。
表６にはＩＨＣの結果もまとめてあり、ここでは、「＋／－」は、アイソタイプ対照と類似した染色またはアイソタイプ対照と異なる染色であるが明確な斑形態はみられないことを表す。
６Ｅ１０抗体でみられる陽性斑染色と比較して、クローン２５－１Ｂ４では新鮮な凍結切片上に斑染色がみられない例を図１６に示す。
ＨＤＳＧ（配列番号１）を含むシクロペプチドに対して生じさせた抗体が、モノマーよりもＡベータオリゴマーと優先的に結合し、ＡＤ患者の脳抽出物および／またはＣＳＦ中のＡベータとも優先的に結合することを図１７に示す。
表６、７ならびに図１６および１７に示されるように、ＨＤＳＧ（配列番号１）を含むシクロペプチドに対して生じさせた抗体は、脳抽出物および／またはＣＳＦ中のＡベータと結合したが、ＳＰＲではモノマーとあまり結合せず、ＩＨＣによる斑線維とあまり結合しなかった。
Figure 0007065516000013
 ＊スコアリングは同じ試料カテゴリーで他のクローンに対して相対的なものである。
Figure 0007065516000014
実施例８
合成オリゴマー結合
共有結合で固定化した抗体との結合について市販の調製済み合成アミロイドベータオリゴマー（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社、ヴァンドゥーヴル＝レ＝ナンシー）の連続２倍希釈物（７．８ｎＭ～２０００ｎＭ）を試験した。対照抗体ｍＡｂ６Ｅ１０の結果を図１８Ａに示し、マウス対照ＩｇＧの結果を図１８Ｂに示す。シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体を用いた結果を図１８Ｃに示す。
実施例９
ホルマリン固定組織での免疫組織化学
シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体を用いてヒト脳組織を評価した。患者はそれまでに、（ｉ）老人斑および神経原線維濃縮体を示すビルショウスキー銀法、（ｉｉ）アミロイドを示すコンゴーレッドならびに（ｉｉｉ）濃縮体を示し老人斑が「神経突起性」であることを確認するタウ免疫組織化学法の３部よりなる方法でアルツハイマー病であることが特徴付けられ診断されていた。この組織を用いて、選択したモノクローナル抗体クローンの斑反応性を試験した。脳組織を１０％緩衝ホルマリンで数日間固定し、Ｓａｋｕｒａ ＶＩＰ組織処理装置でパラフィン処理した。組織切片にマイクロ波による抗原回復（ＡＲ）を実施するか、または実施せずに、１μｇ／ｍｌの抗体で探索した。陽性対照として、汎アミロイドベータ反応性抗体６Ｅ１０を、選択した抗体クローンと同時に含めた。抗体を抗体希釈剤（Ｖｅｎｔａｎａ社）で希釈し、ＯｐｔｉＶｉｅｗ ＤＡＢ（Ｖｅｎｔａｎａ社）で発色させた。Ｖｅｎｔａｎａ Ｂｅｎｃｈｍａｒｋ ＸＴ ＩＨＣ染色装置で染色を実施した。Ｏｌｙｍｐｕｓ ＢＸ４５顕微鏡で画像を取得した。画像は神経病理学の専門知識を有する専門の病理学者が盲検的に解析した。
下の表８に示されるように、固定組織を用いると、被験抗体は抗原回復の有無を問わず、老人斑アミロイドの特異的染色が陰性であった。陽性対照には６Ｅ１０を用いた。
Figure 0007065516000015
実施例１０
オリゴマー伝播の阻害
チオフラビンＴ（ＴｈＴ）結合アッセイを用いてアミロイドベータ（Ａβ）凝集の伝播に対する抗体の効果を検討することにより、その生物学的機能をｉｎ ｖｉｔｒｏで試験した。Ａβ凝集は、予め形成された小さいＡβオリゴマーの核によって誘導され、この核を介して伝播し、単量体Ａβから可溶性オリゴマー、次いで不溶性線維への全過程には同時に、ベータシート形成の増大が伴う。このことはベンゾチアゾール塩のＴｈＴによってモニターすることができ、ＴｈＴがベータシートに富む構造に結合すると、その励起および発光の最大値がそれぞれ３８５ｎｍから４５０ｎｍおよび４４５ｎｍから４８２ｎｍに遷移し、それにより蛍光が増大する。簡潔に述べれば、Ａβ１～４２（Ｂａｃｈｅｍ Ａｍｅｒｉｃａｓ社、トーランス、カリフォルニア州）を可溶化し、超音波処理し、トリス－ＥＤＴＡ緩衝液（ｐＨ７．４）で希釈し、黒色の９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｇｒｅｉｎｅｒ Ｂｉｏ－Ｏｎｅ社、モンロー、ノースカロライナ州）のウェルに加え、これに等体積のシクロペプチドに対する抗体または無関係のマウスＩｇＧ抗体アイソタイプ対照を加え、Ａβ１～４２ペプチドと抗体のモル比を１：５とした。ＴｈＴを加え、プレートを室温で２４時間インキュベートし、１時間毎にＷａｌｌａｃ Ｖｉｃｔｏｒ３ｖ １４２０ Ｍｕｌｔｉｌａｂｅｌ Ｃｏｕｎｔｅｒ（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社、ウォルサム、マサチューセッツ州）を用いてＴｈＴ蛍光を測定し記録した。全ウェルからバックグラウンド緩衝液の蛍光読取り値を減算し、さらに、対応するウェルから抗体単独のウェルの読取り値を減算した。
図１９に示されるように、ＴｈＴ蛍光によりモニターしたＡβ４２凝集は、蛍光が最小である最初の遅滞期、蛍光が急激に増大する対数期および最後にＡβ分子種が平衡状態にあり蛍光の増大がみられないプラトー期を特徴とするＳ字形を示した。Ａβ４２と無関係のマウス抗体との共インキュベーションでは、凝集過程に対する有意な効果が全くみられなかった。これに対し、Ａβ４２と被験抗体との共インキュベーションでは、凝集過程のいずれの期も阻害された。図１９には抗体クローン２５（１Ｂ４；ＩｇＧ２ａアイソタイプ）で得られた結果が示されている。ＴｈＴ凝集アッセイは、ＡＤの病理発生に極めて重要なＡβ伝播およびモノマー、オリゴマー、前原線維および線維からのＡβ凝集のｉｎ ｖｉｖｏの生物物理学的／生化学的段階を模倣するものであることから、シクロＣＧＨＤＳＧＧに対して生じさせた抗体はこの過程を完全に打ち消す可能性を秘めている。ＩｇＧ２ａを用いて実施したアイソタイプ対照では阻害はみられなかった。
実施例１１
アルツハイマー病の免疫療法に最適なプロファイルの達成：毒性Ａベータオリゴマーに特異的な抗体の合理的作製
目的：毒性アミロイドβオリゴマー（ＡβＯ）に特異的な抗体を作製すること
背景：現時点での証拠から、ＡβＯの伝播性プリオン様株は、モノマーおよび線維とは対照的に、ニューロンに対して優先的に毒性を示し、アルツハイマー病（ＡＤ）のタウ病態を誘発することが示唆される。さらに、臨床試験では、用量制限有害作用がＡβ線維認識と関係があることがわかっている。これらの観察結果から、安全性および有効性のためには毒性ＡβＯの特異的中和が望ましいものであり得ることが示唆される。
設計／方法：本明細書に記載されるように、標準力場による分子動力学を用いてＰｒｏｔｅｉｎ Ｄａｔａ Ｂａｓｅに蓄積されているＡβ線維の原子レベルの構造を攪乱するコンピュータシミュレーションを用いた。新生前原線維またはオリゴマーではわずかに安定な領域が露出する可能性が高いという仮説を立てた。オリゴマーにおいて提示される場合とモノマーまたは線維において提示される場合の抗原性プロファイルの差を定量化するクラスタリング解析、曲率、溶媒への露出、溶解度、二面角分布およびラマチャンドラン角分布をすべて用いて予測エピトープの立体配座特性を特徴付けた。局所的なＡβＯ立体配座を模倣し得る環状フォーマットで候補ペプチドエピトープを合成し、担体タンパク質とコンジュゲートし、マウスでのモノクローナル抗体作製に用いた。精製した抗体をＳＰＲおよび免疫組織化学によりスクリーニングした。
結果：
コグネイト構造化ペプチドおよび合成ＡβＯを認識することが可能であり、非構造化ペプチド、リンカーペプチドまたはＡβモノマーとはほとんどまたは全く結合しないことに基づき、５種類の予測エピトープに対するＩｇＧクローンを６６種類選択し精製した。さらなるスクリーニングにより、対照と比較してＡＤ患者のＣＳＦおよび脳抽出物中の天然の可溶性ＡβＯと優先的に結合する抗体を特定した。ＡＤ脳の免疫組織化学的解析により、斑と反応しない抗体クローンを選択することができた。
結論：コンピュータにより特定したＡβＯエピトープにより、天然のＡＤ ＡβＯと選択的に結合しモノマーにも線維にも有意な交差反応性を示さないという所望の標的プロファイルを有する抗体を作製することができた。
実施例１２
毒性阻害アッセイ
シクロペプチドに対して生じさせた抗体によるＡベータ４２オリゴマーの毒性の阻害をラット一次皮質ニューロンアッセイで試験することができる。
抗体および対照ＩｇＧをそれぞれ２ｍｇ／ｍＬなどの濃度に調節する。様々なモル比のＡベータオリゴマーと抗体を溶媒対照、Ａベータオリゴマー単独および神経保護ペプチドのヒューマニン（ＨＮＧ）などの陽性対照とともに試験する。
例示的設定を表９に示す。
室温で１０分間プレインキュベートした後、体積を培地で８４０マイクロリットルに調節する。この溶液を３７℃で５分間インキュベートする。次いで、溶液を一次皮質ニューロンに直接添加し、細胞を２４時間インキュベートする。ＭＴＴ試験を用いて細胞生存率を求めることができる。
Figure 0007065516000016
この試験は、実施例１に記載した集団座標法により予測された他のエピトープを含む他のシクロペプチドに対して生じさせた他の抗体を用いて実施したものである。これらの他のエピトープでＡベータオリゴマー毒性の阻害が観察された。シクロ（ＣＧＨＤＳＧＧ）（配列番号２）に対して生じさせた抗体を試験する。
実施例１３
ｉｎ ｖｉｖｏ毒性阻害アッセイ
シクロペプチドに対して生じさせた抗体によるＡベータ４２オリゴマーの毒性の阻害をマウス行動試験でｉｎ ｖｉｖｏで試験することができる。
マウスの脳室内（ＩＣＶ）に注射する前に、抗体およびアイソタイプ対照をそれぞれＡベータ４２オリゴマーと２以上の様々なモル比で予め混合する。対照群には、溶媒単独を注射するマウス、オリゴマー単独を注射するマウス、抗体単独を注射するマウスおよび神経保護ペプチドのヒューマニンなどの陽性対照を注射するマウスを含める。あるいは、抗体をオリゴマーのＩＣＶ注射前、注射時および／または注射後に全身投与してもよい。オリゴマーのＩＣＶ注射から約４～７日後に開始して、マウス空間認識試験（ＳＲＴ）、Ｙ迷路試験、モーリス水迷路モデルおよび新奇物体認識モデル（ＮＯＲ）などの学習および記憶に関する行動試験で認知を評価する。
マウス空間認識試験（ＳＲＴ）は、海馬機能の尺度である地理的記憶を評価するものである（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）。このモデルでは２チャンバの装置を使用し、この装置のチャンバは形状、模様および色が異なっている（すなわち、地理的差）。チャンバは透明なＰｌｅｘｉｇｌａｓｓ製の廊下で繋がっている。最初に個々のマウスを探索期の５分間、一方のチャンバにのみアクセスできる装置の中に入れておく。次いで、マウスをホームケージに３０分間戻し、「選択」期の５分間、再び装置の中に入れ、その間、マウスは両方のチャンバにアクセスできる。正常な認知機能を有するマウスは前回探索したチャンバを記憶しており、新規なチャンバで費やす時間の方が長い。ＤＩ＝（ＴＮ－ＴＦ）／（ＴＮ＋ＴＦ）で識別指数（ＤＩ）を算出し、式中、ＴＮは新規なチャンバで費やした時間の量であり、ＴＦは馴染みのあるチャンバで費やす時間の量である。毒性ＡベータオリゴマーによりＤＩの低下が起こるが、ヒューマニン陽性対照により一部レスキューされ得る。ＩＣＶ注射後の様々な時間におけるこの試験の成績を用いて、シクロペプチドに対して生じさせた抗体がＡベータオリゴマー毒性をｉｎ ｖｉｖｏで阻害する可能性を評価することができる。
Ｙ迷路試験（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）は、主として前頭前皮質（作業記憶）および海馬（空間構成要素）が仲介する空間作業記憶の試験である。マウスが２本の腕を探索することができるＹ字形の迷路の中にマウスを置く。短期記憶が無傷なマウスは連続試行で交互に２本の腕に行く。毒性ＡベータオリゴマーをＩＣＶ注射したマウスは認知に障害がみられ、ランダム値５０％（これに対し正常個体は約７０％）付近の交互のランダム行動を示す。この障害は、コリンエステラーゼ阻害剤ドネペジル（Ａｒｉｃｅｐｔ）またはヒューマニンによりそれぞれ部分的または全面的に正常に戻る。この試験により、被験抗体のＡベータオリゴマー毒性に対する防御活性に関してまた別のｉｎ ｖｉｖｏ評価ができる。
モーリス水迷路はまた別の広く認められている認知モデルであり、主として海馬機能に依存する空間学習および長期地理的記憶を検討するものである（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）。マウスを複数回の試行で、不透明な水面の下に隠したプラットフォームを見つけるよう訓練する。プラットフォームの位置の想起に関するマウスの学習成績は、視覚的な手掛かりおよび記録したビデオに基づく。マウスを水に放ってからプラットフォームを見つけるまでの時間は着実に短縮され、これをマウスの学習速度とし、複数日にわたって測定する。認知が正常なマウスでは、プラットフォームを見つけるのに必要な時間が連日短縮される（学習）。長期記憶の解析には、訓練後に試験を複数日反復する。つまり、プラットフォームを取り去り、以前のプラットフォームの位置の上を横切る回数または最初に横切るまでの時間を長期記憶を評価する尺度として用いる。毒性ＡベータオリゴマーをＩＣＶ注射したマウスは、学習および長期記憶の両方に欠陥がみられ、被験抗体の防御活性を評価するためのモデルとなる。
新奇物体認識（ＮＯＲ）モデルは、新奇な物体を既知の物体より有意に長い時間をかけて調べるというげっ歯類の正常な行動を利用するものであり、この行動は主として嗅周皮質機能に依存する（ＳｙｎＡｇｉｎｇ社）。習得試行でマウスまたはラットに２つの同一の物体を探索させる。短時間の試行間間隔の後、一方の物体を新奇な物体に置き換える。動物を活動領域に戻し、各物体を能動的に探索して費やした時間を記録する。正常なげっ歯類は馴染みのある物体を思い出し、新奇な物体の方の探索に有意に長い時間を費やす。これに対し、Ａベータオリゴマー処置したげっ歯類は明確な認知障害を示し、「馴染みのある」物体と「新奇な」物体の両方の探索に同程度の時間を費やす。これは、既知の臨床認知機能改善薬（例えば、ドネペジル）により一時的に正常に戻すことができる。ＮＯＲ試験を縦断研究で複数回実施して、被験抗体の認知に対する潜在的な有益性を評価することができる。
行動試験に加え、脳組織を収集し、シナプスマーカー（ＰＳＤ９５、ＳＮＡＰ２５、シナプトフィジン）および炎症マーカー（ＩＬ－１ベータ）のレベルを解析することができる。オリゴマーのＩＣＶ注射から約１４日後にマウスを屠殺し、生理食塩水を灌流する。海馬を収集し、急速凍結し、解析まで－８０℃で保管する。ホモジナイズした試料のタンパク質濃度をＢＣＡにより求める。ＥＬＩＳＡキット（Ｃｌｏｕｄ－Ｃｌｏｎｅ社、米国）を用いてシナプスマーカーの濃度を求める。シナプスマーカーは通常、Ａベータオリゴマーを注射したマウスで２５～３０％減少し、ヒューマニン陽性対照により９０～１００％に回復する。ＩＬ－１ベータ炎症性マーカーの濃度は、Ａベータオリゴマーを注射したマウスで約３倍になり、この増大はヒューマニンによって大幅に抑えられる。これらのアッセイは、被験抗体の防御活性に関する分子レベルでのまた別の尺度となる。
実施例１４
ｉｎ ｖｉｖｏ伝播阻害アッセイ
Ａベータ毒性オリゴマーのｉｎ ｖｉｖｏの伝播およびそれに関連する病態を様々なアルツハイマー病（ＡＤ）げっ歯類モデルで研究することができる。例えば、ヒトＡＰＰのトランスジェニックマウス（例えば、ＡＰＰ２３マウス）またはヒトＡＰＰとＰＳＥＮ１のトランスジェニックマウス（ＡＰＰＰＳ１マウス）は高レベルのＡベータを発現し、加齢とともに炎症および神経損傷を伴うアミロイド沈着が徐々にみられるようになる。オリゴマー含有脳抽出物の脳内接種によりこの過程を大幅に加速させることができる（１３、１４）。これらのモデルは、脳内または全身に投与した被験抗体によるＡベータオリゴマー伝播の阻害を研究するためのシステムとなる。
実施例１５
ＣＤＲシーケンシング
ＩｇＧ２Ａ重鎖とカッパ軽鎖とを有することが明らかになったクローン２５（３０３－２５）を重鎖および軽鎖のＣＤＲおよび可変領域に選択した。
５’ＲＡＣＥならびに適切なマウス免疫グロブリンの重鎖（ＩｇＧ１／ＩｇＧ３／ＩｇＧ２Ａ）および軽鎖（カッパ）の可変領域配列を増幅する遺伝子特異的逆方向プライマーを用いてＲＴ－ＰＣＲを実施した。
シーケンシング用に特異的バンドを切り取ってｐＣＲ－Ｂｌｕｎｔ ＩＩ－ＴＯＰＯベクターにクローン化し、構築物を大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に形質転換した。
各鎖について少なくとも８種類のクローンを選定し、シーケンシングの前に増幅領域の有無についてＰＣＲでスクリーニングした。選択したＰＣＲ陽性クローンにシーケンシングを実施した。
ＣＤＲ配列を表１０に記載する。重鎖および軽鎖の可変部分のコンセンサスＤＮＡ配列およびタンパク質配列を表１１に記載する。
Figure 0007065516000017
Figure 0007065516000018
Figure 0007065516000019
Figure 0007065516000020
ここまで、現時点で好ましい例であると考えるものに関して本願を記載してきたが、本願は本開示の例に限定されないことを理解するべきである。これとは逆に、本願は、添付の請求項の趣旨および範囲に含まれる様々な改変および同等の構成を包含するものとする。
刊行物、特許および特許出願はいずれも、個々の刊行物、特許または特許出願が具体的かつ個別にその全体が参照により組み込まれることが明記された場合と同じように、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。特に、例えば表またはその他の箇所に記載されるアクセッション番号および／またはバイオマーカー配列（例えば、タンパク質および／または核酸）を含めた本明細書に記載される各アクセッション番号に関連する配列は、その全体が参照により組み込まれる。
請求項の範囲は、好ましい実施形態および実施例によって限定されるべきではなく、記載全体と一致する最も広い解釈がなされるべきである。
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Claims (25)

  1. ＨＤＳＧ（配列番号１）の配列からなるＡベータペプチドおよびリンカーからなる、環状化合物であって、
    前記リンカーが、前記ＡベータペプチドのＮ末端残基および前記ＡベータのＣ末端残基と共有結合しているアミノ酸ＧＣＧまたはＣＧＣからなる、
    環状化合物。
  2. 配列番号２の配列からなる、請求項１に記載の化合物。
  3. 請求項１または２に記載の環状化合物を含む、免疫原。
  4. 前記化合物が、担体タンパク質または免疫原性増強物質と結合している、請求項３に記載の免疫原。
  5. 前記担体タンパク質がウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）である、または前記免疫原性増強物質がキーホールキーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）である、請求項４に記載の免疫原。
  6. Ａベータモノマーおよび／またはＡベータ線維よりもＡベータオリゴマーと選択的に結合する抗体であって、配列番号１７の配列を有するＣＤＲ－Ｈ１と配列番号１８の配列を有するＣＤＲ－Ｈ２と配列番号１９の配列を有するＣＤＲ－Ｈ３とを含む重鎖可変領域、および配列番号２０の配列を有するＣＤＲ－Ｌ１と配列番号２１の配列を有するＣＤＲ－Ｌ２と配列番号２２の配列を有するＣＤＲ－Ｌ３とを含む軽鎖可変領域を含む、抗体。
  7. モノクローナル抗体またはポリクローナル抗体である、あるいはヒト化抗体である、請求項６に記載の抗体。
  8. Ｆａｂ、Ｆａｂ’、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ、ｄｓＦｖ、ｄｓ－ｓｃＦｖ、二量体、ナノボディ、ミニボディ、ダイアボディおよびその多量体から選択される抗体結合フラグメントである、請求項６または７に記載の抗体。
  9. 前記抗体は、（ｉ）配列番号２４で示されるアミノ酸配列；または（ｉｉ）配列番号２４と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、そのＣＤＲの配列が配列番号１７、１８および１９で示される、アミノ酸配列；を含む重鎖可変領域を含む、および／または
    前記抗体は、（ｉ）配列番号２６で示されるアミノ酸配列；または（ｉｉ）配列番号２６と少なくとも９０％の配列同一性を有するアミノ酸配列であって、そのＣＤＲの配列が配列番号２０、２１および２２で示される、アミノ酸配列；を含む軽鎖可変領域を含む、
    請求項６～８のいずれか１項に記載の抗体。
  10. 前記重鎖可変領域は、配列番号２４で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなる、および／または
    前記軽鎖可変領域は、配列番号２６で示されるアミノ酸配列を含む、もしくはこれよりなる、
    請求項９に記載の抗体。
  11. 請求項６～１０のいずれか１項に記載の抗体と、検出可能な標識または細胞毒性物質と、を含むイムノコンジュゲート。
  12. 前記検出可能な標識は、陽電子放出放射性核種を含む、請求項１１に記載のイムノコンジュゲート。
  13. 請求項６～１０のいずれか１項に記載の抗体または請求項１１もしくは１２に記載のタンパク質性イムノコンジュゲートをコードする、核酸分子。
  14. ベクターに含まれている、請求項１３に記載の核酸分子。
  15. 請求項６～１０のいずれか１項に記載の抗体を発現する、細胞。
  16. ハイブリドーマまたはＣＨＯ細胞である、請求項１５に記載の細胞。
  17. 請求項１または２に記載の化合物、請求項３～５のいずれか１項に記載の免疫原、請求項６～１０のいずれか１項に記載の抗体、請求項１１もしくは１２に記載のイムノコンジュゲート、請求項１３もしくは１４に記載の核酸または請求項１５もしくは１６に記載の細胞を含む、組成物。
  18. アジュバントをさらに含む、請求項１７に記載の組成物。
  19. 請求項１または２に記載の化合物、請求項３～５のいずれか１項に記載の免疫原、請求項１７もしくは１８に記載の組成物、請求項６～１０のいずれか１項に記載の抗体、または請求項１１もしくは１２に記載のイムノコンジュゲート、請求項１３もしくは１４に記載の核酸分子、前記核酸分子を含むベクターまたは請求項１５もしくは１６に記載の細胞を含む、キット。
  20. 請求項６～１０のいずれか１項に記載の抗体を作製する方法であって、
    請求項１または２に記載の環状化合物、請求項３～５のいずれか１項に記載の免疫原、または前記環状化合物もしくは前記免疫原を含む組成物、をヒト以外の対象に投与することと、
    投与する前記環状化合物もしくは前記免疫原および／またはＡベータオリゴマーに対して特異的または選択的である抗体および／または抗体を発現する細胞を単離することと、を含む方法。
  21. 生体試料がＡベータを含むかどうかを判定する方法であって、
    ａ．前記生体試料を、請求項６～１０のいずれか１項に記載の抗体または請求項１１もしくは１２に記載のイムノコンジュゲートと接触させること、および
    ｂ．抗体複合体の存在を検出すること；
    を含む方法。
  22. Ａベータオリゴマーの伝播の阻害に使用するための、あるいはＡＤおよび／または他のＡベータアミロイド関連疾患を有する対象の治療に使用するための、１）請求項６～１２のいずれか１項に記載の抗体またはイムノコンジュゲート、あるいは前記抗体またはイムノコンジュゲートを含む医薬組成物；２）請求項３～５のいずれか１項に記載の免疫原、または前記免疫原を含む医薬組成物；あるいは３）１）の抗体または２）の免疫原をコードする核酸または前記核酸を含むベクター。
  23. 治療される対象由来の生体試料が、請求項６～１０のいずれか１項に記載の抗体を用いてＡベータの有無またはレベルに関して評価されている、請求項２２に記載の抗体、イムノコンジュゲート、免疫原、医薬組成物、核酸またはベクター。
  24. 脳またはＣＮＳの他の部分に直接投与される、請求項２２または２３に記載の抗体、イムノコンジュゲート、免疫原、医薬組成物、核酸またはベクター。
  25. 投与する前記環状化合物もしくは前記免疫原および／またはＡベータオリゴマーに対して特異的または選択的である抗体は、前記Ａベータペプチドを含む直鎖状ペプチドと結合しない、もしくはほとんど結合しない、および／または斑と結合しない、もしくはほとんど結合しない、請求項２０に記載の方法。
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