JP7080196B2 - 固形癌を患う患者の生存期間の予後判定のための方法 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、固形癌を患う患者の生存期間の予後判定のためのインビトロ方法に関する。
発明の背景
Dieu-Nosjeanら（J Clin Oncol 26:4410-4417. 2008）に示されたように、肺癌は、世界における癌関連死の最も多い原因である。症例の約８０％～９０％が、腺癌及び扁平上皮癌を含む非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）を伴う。腫瘍を完全に切除できる患者だけが、生存期間増大のかなりの機会を有する。しかし、ステージＩ疾患の患者の３０％もの数が、術後に再発を経験する。腫瘍浸潤免疫細胞と肺癌患者の予後との間の相関関係は議論の余地がある。
腫瘍は、不均一なネットワークを形成し、複合した相互作用を示す悪性細胞、間質細胞、内皮細胞、及び免疫細胞から構成される。免疫系による腫瘍の根絶は、多くの場合に能力不足であるものの、多くの発生途中の癌が免疫系によって無視されないという証拠がある。自己免疫の出現と同時に起こる自然腫瘍退縮及び免疫抑制患者でのより高い腫瘍の発生率は、腫瘍拒絶に免疫系が関与することを指し示すものである。免疫機能が欠損したマウスは自然に腫瘍を発生する。細胞傷害性表現型及びメモリー表現型を有する腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）の密度は、多くの固形腫瘍で良好な臨床転帰を高度に予測する。しかし、予後はエフェクター免疫細胞のホーミングに関係するものの、特異的免疫応答の活性化が、腫瘍、流入領域リンパ節又はその両方のどこで起こるかは、まだ不明である。
免疫応答は二次リンパ器官から離れた三次リンパ構造（ＴＬＳ）中で起こる可能性があることが、今や十分に立証されている。Dieu-Nosjeanらは、これらのリンパ節様構造が肺癌患者で発生する可能性があることを観測した。それらは、ＮＳＣＬＣ患者の非腫瘍性組織中から全く見つからなかったので、「腫瘍誘導型気管支付属リンパ組織」（Ｔｉ－ＢＡＬＴ）と名付けられた。そのうえ、Dieu-Nosjeanらは、Ｔｉ－ＢＡＬＴ中から選択的に検出された集団である成熟ＤＣの密度が、早期ＮＳＣＬＣを有する患者（Dieu-Nosjean et al., J. Clin. Oncol., 2008）及び転移期（Remark et al., Clin Cancer Res. 2013 Jun 19）において良好な臨床転帰と関連することを実証し、それらが腫瘍特異的Ｔ細胞の活性化部位を表すことを示唆している。
ＴＬＳの存在が、他のヒト腫瘍、例えば結腸直腸癌（Coppola et al., Am J Pathol., 2011;179(1):37-45; McMullen et al., Clin Exp Immunol. 2010;161(1):81-8;）、乳癌（Gobert et al., Cancer Res 2009; 69(5) 2000-2009; Martinet et al., Cancer Res. 2011;71(17) 5678-87; Gu-Trantien et al., J Clin Invest. 2013; 123(7): 2873-92）及び黒色腫（Martinet et al., Cancer Res. 2011;71(17) 5678-87; Cipponi et al., Cancer Res. 2012;72(16):3997-4007）で報告されており、このことは、多くの固形腫瘍で異所性リンパ構造が現れることを示している。
発明の概要
本発明は、固形癌を患う患者の生存期間の予後判定のためのインビトロ方法であって、患者からの腫瘍組織試料中に存在するＣＤ８＋細胞及びＤＣ－ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度の定量を含むインビトロ方法に関し、その際、高密度のＣＤ８＋細胞及びＤＣ－ＬＡＭＰ＋樹状細胞は、患者が予後良好であることを示し、高密度のＣＤ８＋細胞及び低密度のＤＣ－ＬＡＭＰ＋樹状細胞は、患者が予後不良であることを示し、低密度のＣＤ８＋細胞及びＤＣ－ＬＡＭＰ＋樹状細胞は、患者が予後最悪であることを示す。
本方法は、生存期間に反映されるような、患者における癌の起こりそうな経過又は転帰を正確及び精密に予測するという、当技術分野における長年の継続中の必要性を満たすものである。そうできることによって、医師は、癌の処置プロトコールを特定の患者に個別に適応できるようになる。本方法により、良い治療転帰の確率が高い患者は、転帰良好を経験するために最も積極的な処置を受ける必要がない場合があり、したがって、そのような処置に関連する副作用を回避又は最小化することができ、一方で予後不良の患者は、疾患の最も早い可能なステージで、又は使用された治療法と別の治療法によって積極的に処置することができる。
さらに、本発明の方法と、現在使用されている病期分類法であるＵＩＣＣ－ＴＮＭ分類との組合せは、さらに高い正確度を有する生存期間の予後判定のための方法につながる。
発明の詳細な説明
本発明は、固形癌を患う患者の生存期間の予後判定のためのインビトロ方法であって、以下の段階：
ａ）患者からの腫瘍組織試料中のＣＤ８＋細胞の細胞密度を定量する段階、
ｂ）患者からの腫瘍誘導型リンパ構造中のＤＣ－ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度を定量する段階、
ｃ）段階ａ）及びｂ）で得られた細胞密度の値を、各位置の各細胞型について予め決定された参照値と比較する段階、並びに
ｄ）ＣＤ８＋細胞及びＤＣ－ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度が、予め決定された参照値よりも高い場合、患者に生存期間の予後良好を提供し、
ＣＤ８＋細胞及びＤＣ－ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度が、予め決定された参照値よりも低い場合、患者に生存期間の予後不良を提供し、又は
一方のマーカーの細胞密度が予め決定された参照値よりも高く、他方のマーカーの細胞密度が、予め決定された参照値よりも低い場合、患者に生存期間の予後中間を提供する段階
を含む、インビトロ方法に関する。
本発明による予後判定の方法は、単独で、又は非限定的にステージ、人口統計学及び人体計測的パラメーター、腫瘍のサイズ、腫瘍塞栓の存在の有無、及びリンパ節浸潤の有無を含む、日常的な臨床若しくは検査室検査の結果を含む、固形癌の予後判定のためにすでに使用されている任意の他の方法と組合せて使用してもよい。
腫瘍誘導型リンパ構造によって、成熟樹状細胞－Ｔ細胞クラスター（Ｔ細胞領域）及びＢ細胞濾胞（Ｂ細胞領域）から構成される、腫瘍塊の間質中のリンパ節様構造（三次リンパ構造とも呼ばれる）への腫瘍浸潤白血球の組織体が意味される。典型的には、腫瘍切片に応じて、２つの領域の一方のみ又は両方の領域を観測することができる。この組織体は、肺癌における腫瘍誘導型気管支付属リンパ組織にちなんでＴｉ－ＢＡＬＴと呼ばれた。
成熟樹状細胞によって、プロセシング済み抗原のＴ細胞への提示を専門に行う樹状細胞集団が意味される。腫瘍に浸潤している成熟樹状細胞は、腫瘍誘導型リンパ構造の富Ｔ細胞領域中でＴ細胞と接触して選択的に局在する。
好ましい一実施態様では、ＤＣ－ＬＡＭＰ＋ ＤＣ、ＣＤ８＋細胞及び腫瘍ステージの組合せが全生存期間のためのよりいっそう強力な予後判定方法を構成するので、本発明の方法は、腫瘍のＴＮＭ病期分類（UICC-TNM classification, 2009）と組合せて使用される。
本発明の一実施態様では、患者は、小さなサイズの腫瘍を有する患者であり、すなわち患者の癌の病理学的ＴステージはｐＴ１である。
代替的な一実施態様では、患者は、中間サイズの腫瘍を有する患者であり、すなわち患者の癌の病理学的ＴステージはｐＴ２である。
なお別の実施態様では、患者は、より大きなサイズの腫瘍を有する患者であり、すなわち患者の癌の病理学的ＴステージはｐＴ３又はｐＴ４である。
別の実施態様では、癌は、隣接リンパ節に拡散しなかった、すなわち患者の癌の病理学的ＮステージはｐＮ０である。
なお別の実施態様では、癌は、隣接リンパ節に拡散した、すなわち患者の癌の病理学的ＮステージはｐＮ１又はｐＮ２である。
別の実施態様では、患者の腫瘍は転移しており、癌の病理学的ＭステージはｐＭ１である。
別の実施態様では、患者の腫瘍は転移しておらず、癌の病理学的ＭステージはｐＭ０である。
別の実施態様では、患者はステージＩの癌などの早期癌を有する患者である。
なお別の実施態様では、患者は、ステージＩＩの癌を有する患者である。
なお別の実施態様では、患者はステージＩＩＩの癌などの進行期癌を有する患者である。
本発明の一実施態様では、患者は、化学療法及び／又は放射線療法などのネオアジュバント療法もアジュバント療法も全く受けなかった、早期癌を有する患者である。
本発明の代替的な一実施態様では、患者は、化学療法及び／又は放射線療法などの、ネオアジュバント療法と共に又はネオアジュバント療法なしにアジュバント療法を受けている進行期癌を有する患者である。
多種多様な癌のステージは、例えばUICC. TNM Classification of Malignant Tumours. 7th ed. Sobin LH, Gospodarowicz M, Wittekind Ch: New York, 2009に定義されている。
典型的には、腫瘍組織試料は、（ｉ）全体的原発性腫瘍試料（全体として）、（ｉｉ）腫瘍巣試料、（ｉｉｉ）全腫瘍切片の間質試料及び（ｉｖ）腫瘍誘導型リンパ構造試料からなる群より選択される。
細胞巣は、組織中の他の細胞と異なる１種類の細胞の小さなフォーカス又は集積である。したがって、腫瘍巣は、非癌性細胞に囲まれた腫瘍細胞の集積である。
間質は、生体細胞、組織又は器官の結合性支持フレームワークである。腫瘍において、間質細胞は非腫瘍細胞である。間質は、結合組織、脈管、白血球及び細胞外マトリックスを含む。
より好ましい一実施態様では、ＣＤ８＋細胞は全腫瘍切片の間質試料中から定量される。
本発明の方法に定義された生存期間は、全生存期間（ＯＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）又は疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）の可能性がある。好ましい一実施態様では、生存は全生存期間（ＯＳ）である。
腫瘍誘導型リンパ構造を有する固形癌の例は、肺癌、結腸直腸癌及び乳癌である。
好ましい一実施態様では、固形癌は肺癌である。
より好ましい一実施態様では、固形癌は非小細胞肺癌である。
典型的には、ＣＤ８＋細胞密度及びＤＣ－ＬＡＭＰ＋樹状細胞密度は、例えば、生検によって得られた試料の腫瘍切片（凍結又はパラフィン包埋組織切片）に行われた免疫組織化学検査によって測定され得る。
本発明の方法の一実施態様では、ＣＤ８＋細胞は、Calopixソフトウェア（Tribvn）を用いて全腫瘍切片の腫瘍巣及び間質中において数えられ、腫瘍表面積１μm2あたりの陽性細胞の絶対数として、算出されたＳＥＭと共に表現される。
本発明の一実施態様では、ＤＣ－ＬＡＭＰ＋樹状細胞は、ＤＣ－ＬＡＭＰ（ＣＤ２０８）分子に対する抗体を用いた免疫組織化学検査によって検出される。成熟樹状細胞は、全腫瘍切片から計数される。細胞密度は、腫瘍切片の表面積１単位あたりで計数された細胞数として、例えば中倍率（本来の倍率×１００）１視野あたり又は腫瘍表面積１μm2あたりで計数された細胞数として表現され得る。
典型的には、ＣＤ８＋細胞の細胞密度及び樹状細胞の細胞密度について予め決定された参照値は、癌患者に関する大規模研究に統計的方法を適用することによって決定され得る。
本発明の一実施態様は、固形癌を患う患者をアジュバント療法によって処置するための方法であって、以下の段階：
ａ）本発明の予後判定方法で生存期間の予後不良の患者を特定する段階、及び
ｂ）特定された患者をアジュバント療法で処置する段階
を含む方法に関する。
本発明は、また、
ａ）本発明の予後判定方法を用いて生存期間の予後不良の患者を特定する段階、及び
ｂ）特定された患者を抗癌化合物で処置する段階
を含む、固形癌を患う患者をアジュバント療法によって処置するための方法における使用のための抗癌化合物に関する。
典型的には、抗癌化合物は、細胞傷害性薬物又は細胞傷害性放射性同位体のいずれかの細胞傷害性作用因子である。細胞傷害性薬物の例は、非限定的に、白金塩、タキサン、ビンカ誘導体及び類似体、ゲムシタビン、メトトレキサート、ドキソルビシン、シュードモナス（Pseudomonas）外毒素などの細胞毒、ｇタンパク質、及びｇタンパク質共役受容体阻害剤である。一般的な細胞傷害性放射性同位体は、例えば１３１Ｉ、９０Ｙ、７７Ｌｕ、６７Ｃｕ、１８６Ｒｅ、１８８Ｒｅ、２１２Ｂｉ及び２１３Ｂｉである。
以下に、以下の実施例及び図面によって、本発明が例証される。
ＮＳＣＬＣ患者の全コホート並びにＤＣ及びＣＤ８＋細胞密度によって層別化された患者についての全生存率を示す図である。ＮＳＣＬＣ患者３４２人についての全生存率のカプラン-マイヤー曲線：（Ａ）全患者、及び（Ｂ）ＤＣ／ＣＤ８スコアに応じた患者。ログランク検定を用いて患者の群間の差を評価した。Altmanら（Altman DG, Lausen B, Sauerbrei W, Schumacher M. Dangers of using "optimal" cutpoints in the evaluation of prognostic factors. Medical Statistics Laboratory, Imperial Cancer Research Fund, London, England. J Natl Cancer Inst. 1994 Jun 1;86(11):829-35.）によって提唱された式を用いてログランクのＰ値を補正した。 Ｔステージ及びＴステージ毎のＤＣ／ＣＤ８スコアに応じたＮＳＣＬＣ患者についての全生存率を示す図である。病理学的Ｔステージ（Ａ）、並びにＴ１（Ｂ）、Ｔ２（Ｃ）、及びＴ３（Ｄ）ステージ中のＤＣ／ＣＤ８スコアに応じたＮＳＣＬＣ患者３５９人についての全生存率のカプラン-マイヤー曲線。ログランク検定を用いて患者の群間の差を評価した。Altmanらによって提唱された式を用いてログランクのＰ値を補正した。 Ｎステージ及びＮステージ毎のＤＣ／ＣＤ８スコアに応じたＮＳＣＬＣ患者についての全生存率を示す図である。病理学的Ｎステージ（Ａ）、並びにＮ０（Ｂ）及びＮ陽性（Ｃ）ステージ中のＤＣ／ＣＤ８スコアに応じたＮＳＣＬＣ患者３５９人についての全生存率のカプラン-マイヤー曲線。ログランク検定を用いて患者の群間の差を評価した。Altmanらによって提唱された式を用いてログランクのＰ値を補正した。 塞栓及び塞栓の存在下又は不在下でのＤＣ／ＣＤ８スコアに応じたＮＳＣＬＣ患者についての全生存率を示す図である。塞栓（Ａ）、並びに塞栓の不在下（Ｂ）又は存在下（Ｃ）での患者中のＤＣ／ＣＤ８スコアに応じたＮＳＣＬＣ患者３３８人についての全生存率のカプラン-マイヤー曲線。ログランク検定を用いて患者の群間の差を評価した。Altmanらによって提唱された式を用いてログランクのＰ値を補正した。 ｐＴＮＭステージ及びｐＴＮＭステージ毎のＤＣ／ＣＤ８スコアに応じたＮＳＣＬＣ患者についての全生存率を示す図である。病理学的ＴＮＭステージ（Ａ）、並びにステージＩ（Ｂ）、ステージＩＩ（Ｃ）、及びステージＩＩＩ（Ｄ）中のＤＣ／ＣＤ８スコアに応じたＮＳＣＬＣ患者３７２人についての全生存率のカプラン-マイヤー曲線。ログランク検定を用いて患者の群間の差を評価した。Altmanらによって提唱された式を用いてログランクのＰ値を補正した。
実施例
実施例１
患者
Institut Mutualiste Montsouris又はHotel Dieu Hospital（Paris, France）で肺腫瘍の外科的完全切除を受けたＮＳＣＬＣ患者から、新鮮（ｎ＝５４人）、凍結（ｎ＝２８人）、及びパラフィン包埋（ｎ＝３７６人）肺腫瘍試料を得た。２００１年６月１５日から２００４年１１月２６日の間に手術されたＮＳＣＬＣ患者３７６人（ステージＩ～ＩＶ、ＵＩＣＣ ＴＮＭ分類２００９）を後ろ向き検索した。腫瘍グレードの分類は、International Union Against Cancer及びAmerican Joint Committee on Cancerによって公表された悪性腫瘍のＴＮＭ分類第７版（Sobin, Cancer, 2010）の推奨に従って行った。ネオアジュバント化学療法又は放射線療法を受けた患者は不適格であった。コホートの観察時間は、手術から最後の接触（患者の最後の経過観察又は死亡）までの間隔であった。試験の完了時に、コホートに算入された最後の患者についての最短臨床経過観察期間は９０ヶ月であった。自治体の記録又は患者の家族の問い合わせによって、長期転帰に関するデータを後ろ向きに得た。前向き試験に算入する前に、患者から書面のインフォームドコンセントを得た。プロトコールは、フランス法律Ｌ．１１２１－１条を適用して、地域の倫理委員会によって承認された（番号：２００８－１３３及び２０１２－０６１２）。
フローサイトメトリー
新鮮肺腫瘍検体を機械的に解離させ、以前に記載されたように単核細胞を単離した（De Chaisemartin, L. et al.. Cancer Res 71, 6391-6399 (2011)）。蛍光色素とコンジュゲートした複数パネルの抗体で単核細胞を染色した。簡潔には、２％ヒト血清で飽和後、単核細胞を一次抗体又は適切なアイソタイプ対照と共に遮光下で４℃で３０分間インキュベートした。細胞を洗浄し、０．５％ホルムアルデヒド中で固定し、その後ＬＳＲＩＩ又はFortessaサイトメーター（BD Biosciences）で分析した。フローサイトメトリーのデータをDiva（BD Biosciences）及びFlowJo（Tree Star, Inc）で解析した。
免疫組織化学
各パラフィン包埋肺腫瘍について、２人の観察者（専門の病理学者１人及びＮＳＣＬＣの病理学的特徴を特定する訓練を受けた検査員１人）が、隣接する肺実質と共に腫瘍の代表的な領域を含む腫瘍切片、並びにヘマトキシリン及びエオシン染色組織切片上の最高密度の免疫細胞を選択した。簡潔には、連続的な５μm組織切片を脱パラフィンし、再水和させ、抗原賦活化（antigen retrieval）のために適切な緩衝液中で前処理した。次に、切片を５％ヒト血清と共に３０分間インキュベートし、その後、適切な一次抗体に続いて二次抗体を添加した。記載されたように酵素活性が明らかとなった（Dieu-Nosjean. et al. J. Clin. Oncol 26, 4410-4417 (2008)）。NDPviewソフトウェアで操作されたNanozoomer（Hamamatsu）を使用して画像を取得した。
細胞の定量方法
組織切片全体の腫瘍領域における各中倍率視野（ＩＰＦ）内からＤＣ－ＬＡＭＰ＋ ＤＣを半定量的に計数し（それぞれ陽性細胞なし、非常に低密度、低密度、中密度、及び高密度の陽性細胞についてスコア０、１、２、３、及び４）、ＩＰＦあたりの平均スコアとして表現し、ＳＥＭを計算した。ＤＣ－Ｌａｍｐ＋成熟ＤＣの数は、上記細胞数よりも少なかったので、本発明者らは、定量的計数を実現できた。それらの染色細胞を、ＩＰＦあたりの平均細胞数として、算出されたＳＥＭと共に表現した。
Calopixソフトウェアを用いて、全腫瘍切片の腫瘍巣及び間質中からＣＤ８＋細胞を数え上げ、対象となる領域１μm2あたりの陽性細胞の絶対数として、算出されたＳＥＭと共に表現した。少なくとも２人の観察者が免疫染色及び定量の両方を点検した。
統計解析
本発明者らは、異なる腫瘍に浸潤している免疫細胞の密度を比較するためにマン－ホイットニー検定を使用した。スピアマンの検定によって相関関係を評価した。ＯＳ曲線をカプラン-マイヤー法によって推定し、ログランク検定を用いて患者の群間の差を計算した。ＯＳについての経過観察の開始は、手術時であった。成熟ＤＣ及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の密度と一緒に、以下の入手可能な臨床パラメーターを検定した：ＴＮＭステージ２００９、Ｔステージ、Ｎステージ、喫煙歴、組織型、腺癌のサブタイプ、塞栓、及び胸膜浸潤。免疫細胞密度に関して、ＯＳ転帰を引き合いに出している患者を最もうまく分離するためのカットオフを、「最小Ｐ値」アプローチを用いて判定した（転帰指向のアプローチ）。得られたＰ値は過大評価されたおそれがあるので、Altmanらによって提唱された式を使用して、又は１０分割交差確認を用いて、ＯＳのログランクＰ値を補正した。０．０５未満のＰ値を統計的に有意と見なした。単変量解析で転帰に影響する可能性ありと特定されたパラメーター（Ｐ＜０．０５）を多変量コックス比例ハザード回帰モデルに導入した。全ての解析をPrism 5（GraphPad）、Statview（Abacus Systems）及びＲ（http://www.r-project.org/)で行った。Genesisソフトウェア（Institute for Genomics and Bioinformatics, Gratz, Austria; Sturn et al., Bioinformatics, 2002）を用いた階層的クラスタリングを用いて相関行列を求めた。
１ － 高密度の成熟ＤＣは、肺腫瘍における高レベルのＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤を予測する
本発明者らは、成熟ＤＣの密度と細胞傷害－エフェクター機能との間の密接な関連を観察したので、本発明者らは、さらに、成熟ＤＣとＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤との間の関係を検討した。ＣＤ８＋ Ｔ細胞は、腫瘍細胞との接触を確立してそれらの細胞溶解機能を発揮すると予想されるので、本発明者らは、以下の解析で腫瘍巣及び間質中に存在するＣＤ８＋Ｔ細胞を識別した。
後ろ向き系列のＮＳＣＬＣ患者３７６人において（ステージＩ～ＩＶ、ＵＩＣＣ ＴＮＭ分類２００９）、本発明者らは、間質ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ８Ｓ）、腫瘍巣ＣＤ８＋ Ｔ細胞（ＣＤ８Ｔ）及び成熟ＤＣ－Ｌａｍｐ＋ＤＣを定量した。早期肺腫瘍で以前に観察されたように、本発明者らは、全てのステージの肺腫瘍においてＰＮＡｄ＋血管及びＢ細胞濾胞に隣接するＴＬＳのＴ細胞豊富な領域中に、成熟ＤＣが選択的にホーミングすることを確認した。
上記結果に従って、本発明者らは、ＤＣ－ＬａｍｐＨｉ腫瘍の方がＤＣ－ＬａｍｐＬｏ腫瘍よりもＣＤ８Ｔ細胞及びＣＤ８Ｓ細胞の両方が高密度であることを観察した（それぞれＣＤ８Ｔの平均＝２５４対１３８個/mm２、Ｐ＝０．０００３；ＣＤ８Ｓの平均＝８４３対５５３個/mm２、Ｐ＜０．０００１）。結果として、ＣＤ８Ｓ及びＣＤ８Ｔ細胞密度に応じたＤＣ－ＬａｍｐＨｉ及びＤＣ－ＬａｍｐＬｏ患者の二断層化から、ＤＣ－ＬａｍｐＨｉ患者の８４％が少なくとも１つの領域でＣＤ８Ｈｉであり、特に５５％が両方の領域で高かったことが明らかとなった。これらの比率は、ＤＣ－ＬａｍｐＬｏ患者で大きく減少し、ＣＤ８Ｈｉは少なくとも１つの領域で６１％、両方の領域でわずかに３３％であった。興味深いことに、間質から腫瘍巣に浸潤性Ｔ細胞が輸送されたことに基づくＣＤ８Ｓ Ｌｏ／ＣＤ８Ｔ Ｈｉ腫瘍を有する患者は、両方のＤＣ－Ｌａｍｐ群でまれであった。ＤＣ－ＬａｍｐＨｉに対するＤＣ－ＬａｍｐＬｏ患者の主な差は、ＣＤ８Ｓ ＨｉＣＤ８Ｔ Ｈｉ及びＣＤ８Ｓ ＬｏＣＤ８Ｔ Ｌｏ患者の率に関係し、一方で混合群（ＣＤ８Ｓ ＨｉＣＤ８Ｔ Ｌｏ及びＣＤ８Ｓ ＬｏＣＤ８Ｔ Ｈｉ）の率は全く不変であった。
まとめると、これらの結果は、高密度の成熟ＤＣが強いＣＤ８＋Ｔ細胞浸潤に密接に関係することを実証している。
２ － 成熟ＤＣ密度は、ヒト肺腫瘍における早期分化型及びエフェクター－メモリーＣＤ８＋Ｔ細胞の浸潤に関連する
本発明者らは、５４個の新鮮切除されたヒトＮＳＣＬＣに対して大規模フローサイトメトリー分析を行って、免疫浸潤物をＤＣ－Ｌａｍｐ＋成熟ＤＣの密度に応じて特徴付けた。本発明者らは、ＤＣ－Ｌａｍｐ＋ＤＣが高密度の患者（ＤＣ－ＬａｍｐＨｉ患者）とＤＣ－Ｌａｍｐ＋ ＤＣが低密度の患者（ＤＣ－ＬａｍｐＬｏ患者）の間で総単核細胞中の総ＣＤ３＋、ＣＤ３＋ＣＤ４＋及びＣＤ３＋ＣＤ８＋Ｔ細胞の有意に高い率、ＣＤ１９＋ Ｂ細胞について有意でない傾向、並びにＣＤ３－ＣＤ５６＋ ＮＫ細胞について差がないことを観察した。ＴＬＳ内のＣＤ６２Ｌ＋Ｔ細胞の選択的局在に従って、ＤＣ－ＬａｍｐＨｉ腫瘍は、ＤＣ－ＬａｍｐＬｏ腫瘍よりも有意に大量のＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ６２Ｌ＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞を有した。本発明者らは、ＤＣ－ＬａｍｐＨｉ腫瘍とＤＣ－ＬａｍｐＬｏ腫瘍との間で総単核細胞中のＴＩＬの大多数に相当する、抗原を経験したＣＤ６２Ｌ－ＣＤ４＋Ｔ細胞及びＣＤ６２Ｌ－ＣＤ８＋ Ｔ細胞が有意に同時に増加することも観察した。ＤＣ－ＬａｍｐＬｏ腫瘍に比べてＤＣ－ＬａｍｐＨｉ腫瘍の方が、活性化ＣＤ３８＋又はＣＤ６９＋ＣＤ８＋ Ｔ細胞によって、及びエフェクター－メモリーＣＤ８＋ Ｔ細胞の４つの主要亜集団（ＣＤ４５ＲＡ－ＣＣＲ７－ＣＤ２７＋又は－ＣＤ２８＋又は－）によって大きく浸潤されていた。
まとめると、これらの結果は、ＤＣ－ＬａｍｐＨｉ腫瘍が、ＤＣ－ＬａｍｐＬｏ腫瘍よりも多数のＴＬＳ関連ナイーブＴ細胞及び初期分化Ｔ細胞並びに多数の活性化エフェクター－メモリー非ＴＬＳ Ｔ細胞を有することを実証している。
３ － ＴＬＳ ＤＣの密度は、死亡リスクが高いＣＤ８Ｈｉ患者及びＣＤ８Ｌｏ患者の特定を可能にする
本発明者らは、高密度のＣＤ８＋Ｔ細胞がＤＣ－ＬａｍｐＨｉ患者群及びＤＣ－ＬａｍｐＬｏ患者群の両方で検出されたことを観察したので、本発明者らは、次に、各変数の単独及び組合せの予後的価値を評価した。
カプラン-マイヤー曲線は、成熟ＤＣ（Ｐ＝９．１×１０－０５）、ＣＤ８Ｓ細胞（Ｐ＝０．００１９）、及びＣＤ８Ｔ細胞（Ｐ＝０．０２２８）の密度が、より長い全生存（ＯＳ）と相関したことを示している。
腫瘍における成熟ＤＣ及びＣＤ８＋細胞の存在が肺癌患者の転帰にプラスの影響を及ぼすので、本発明者らは、高又は低密度の各マーカー（ＤＣ－ＬａｍｐＨｉ／ＣＤ８Ｈｉ、ＤＣ－ＬａｍｐＨｉ／ＣＤ８Ｌｏ、ＤＣ－ＬａｍｐＬｏ／ＣＤ８Ｈｉ、及びＤＣ－ＬａｍｐＬｏ／ＣＤ８Ｌｏ）に従って患者を４群に層別化した。ＤＣ－ＬａｍｐＨｉ患者に観察されたように、本発明者らは、ＣＤ８Ｓ細胞の密度に関係なく、ＤＣ－ＬａｍｐＨｉ腫瘍を有する患者群の死亡リスクが最低であったことを観察した（Ｐ＝３．４×１０－０７、ＯＳの中央値は、ＤＣ－ＬａｍｐＨｉ／ＣＤ８Ｓ Ｈｉ患者について９２ヶ月であり、ＤＣ－ＬａｍｐＨｉ／ＣＤ８Ｓ Ｌｏ患者について１００ヶ月であった）。興味深いことに、ＤＣ－ＬａｍｐＨｉ患者だけが、コホート全体に比べて改善した生存期間を表した。対照的に、樹状細胞及びＣＤ８Ｓ細胞の両方が低密度の患者は、各免疫マーカー単独（平均ＯＳ ＤＣ－ＬａｍｐＬｏ＝３６ヶ月、平均ＯＳ ＣＤ８Ｓ Ｌｏ＝４０ヶ月）に比べて死亡のリスクが最高であった（ＯＳの中央値は２２ヶ月であった）。ＤＣ－ＬａｍｐＬｏ／ＣＤ８Ｓ Ｈｉ腫瘍を有する患者は、死亡リスクが中間であった（ＯＳの中央値＝４１ヶ月）。ＤＣ－ＬａｍｐとＣＤ８Ｔ細胞の組合せで解析を行ったときに同じ結果が得られた（データは示さず）。２分割交差確認を１００回繰り返した追加的な解析から、ＤＣ－Ｌａｍｐ／ＣＤ８Ｓスコアの高く有意な予後的価値を確認した（交差検定１００回中９９回、Ｐの中央値＝４．７×１０－０４）。コックス多変量回帰分析を用いると、ｐＴＮＭステージ及びＤＣ－Ｌａｍｐ／ＣＤ８Ｓスコアは、ＯＳと有意に及び独立して関連した唯一の基準であった（それぞれＨＲ＝１．７０及び０．７１、Ｐ＝２．８３×１０－０７及び４．５０×１０－０７）。
全体的に、これらのデータは、ＤＣ－Ｌａｍｐ単独が好都合な転帰を有する患者の特定に有効なマーカーである一方で、ＣＤ８とＤＣ－Ｌａｍｐの組合せは、死亡リスクが最高の患者の特定を可能にすることを実証している。最終的に、ＤＣ－Ｌａｍｐ／ＣＤ８Ｓスコア及びｐＴＮＭステージは、２つの独立した強力な予後因子を構成する。
実施例２
患者
Institut Mutualiste Montsouris又はHotel Dieu Hospital（Paris, France）で肺腫瘍の外科的完全切除を受けたＮＳＣＬＣ患者（ステージＩ～ＩＶ、ＵＩＣＣ ＴＮＭ分類２００９）からパラフィン包埋肺腫瘍試料（ｎ＝３７２個）を得た。Eastern Cooperative Oncology Group活動状態（Finkelstein et al., Am J Clin Oncol, 1988）が≦１の患者が適格であった。International Union Against Cancer及びAmerican Joint Committee on Cancer（Sobin, Cancer, 2010）によって公表された悪性腫瘍のＴＮＭ分類第７版の勧告に従って腫瘍グレードの分類を行った。２００１年６月１５日から２００４年１２月３１日の間に手術された患者を後ろ向き検索した。ネオアジュバント化学療法又は放射線療法を受けた患者は不適格であった。コホートの観察時間は、診断から最後の接触（患者の最後の経過観察又は死亡）までの間隔であった。試験の完了時に、コホートに算入された最後の患者についての最短臨床経過観察期間は９０ヶ月であった。自治体の記録の問い合わせによって、長期転帰に関するデータを後ろ向きに得た。前向き試験に算入する前に、患者から書面のインフォームドコンセントを得た。プロトコールは、フランス法律Ｌ．１１２１－１条を適用して、地域の倫理委員会（番号：２００８－１３３及び２０１２－０６１２）及びAssistance Publique-Hopitaux de Paris（ＡＰ－ＨＰ）によって承認された。
１ － コホートの臨床病理パラメーター
ＮＳＣＬＣ（全てのステージ）のために手術された患者合計３７２人を後ろ向き試験に登録した。コホート全体の全生存率を図１Ａに示す。文献に記載されているように、病理学的Ｔ（ｐＴ）ステージ、Ｎ（ｐＮ）ステージ、ＴＮＭ（ｐＴＮＭ）ステージ（第７版、２０１０）及び腫瘍塞栓は、全生存率と有意に相関した。
２ － Ｔステージは、成熟ＤＣ及びＣＤ８＋細胞の密度と組合せるとＮＳＣＬＣ患者の臨床的転帰をよりうまく予測する
病理学的Ｔステージは、臨床におけるゴールドスタンダードの１つである。十分に確立されている通り、ｐＴは、ＮＳＣＬＣ患者の生存期間がより長いことに関連した（図２Ａ、Ｐ＜０．０００１）。次に本発明者らは、腫瘍浸潤ＤＣ－Ｌａｍｐ＋ ＤＣ及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の密度によりＴステージの予後的価値を比較することを望んだ。
成熟ＤＣ及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の存在が、ＮＳＣＬＣ患者における良好な臨床転帰と関連することが前もって実証されたので（実施例１参照）、本発明者らは、ＤＣ－Ｌａｍｐ＋成熟ＤＣ及びＣＤ８＋間質Ｔ細胞（ＤＣ ＣＤ８＿Ｈｉ Ｈｉ、ＤＣ ＣＤ８＿Ｈｉ Ｌｏ、ＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｈｉ、ＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｌｏ）の高／低密度に応じて患者を４つの群に層別化した。前もって観察されたように、「ＤＣ ＣＤ８＿Ｈｉ Ｌｏ」腫瘍を有する患者の率は非常に小さく、そのことは、この群を用いた統計解析を非常に困難にし、解釈を非常に限定した。図１Ｂに、組合せＤＣ／ＣＤ８が、良好な全生存率と相関することを示した（Ｐ＜０．０００１）。次に本発明者らは、ｐＴステージにより層別化された患者に及ぼすＤＣ／ＣＤ８スコアの影響を研究した。
ｐＴ１ステージにおいて、カプラン-マイヤー曲線から、免疫細胞の密度が生存と有意に相関しなかったことが示された（図２Ｂ）。少なくとも１つの免疫細胞型が高密度の患者（ＤＣ ＣＤ８＿Ｈｉ Ｈｉ、ＤＣ ＣＤ８＿Ｈｉ Ｌｏ又はＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｈｉ患者）は、ｐＴ１患者と同じ全生存期間（ＯＳ）を有した（約１００ヶ月）。対照的に、ＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｌｏ腫瘍を有する患者は、ｐＴ１患者に比べて予後が最悪であった（平均ＯＳはそれぞれ６８及び９９ヶ月）。この傾向は、ｐＴ２ステージでなおいっそう顕著になった（ＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｌｏ患者及びｐＴ２患者についてそれぞれ平均ＯＳ＝２３及び６４ヶ月）。
ｐＴ２ステージにおいて、組合せＤＣ／ＣＤ８は、長期生存期間の患者群（ＤＣ ＣＤ８＿Ｈｉ Ｈｉ患者についての平均ＯＳは８５ヶ月であった）及び短期生存期間の患者群（ＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｌｏ患者についての平均ＯＳは２３ヶ月であった）の特定を可能にし、一方でＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｈｉ腫瘍を有する患者は、ｐＴ２患者であることと同じ平均ＯＳを有した（それぞれ平均ＯＳ＝６９及び６４ヶ月）。ｐＴ３ステージにおいて、ＤＣ及びＣＤ８＋ Ｔ細胞の両方が高密度であること（平均ＯＳ＝６９ヶ月）は、ＣＤ８＋Ｔ細胞の密度が何であろうと、低密度のＤＣ（ＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｈｉ患者及びＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｌｏ患者についてそれぞれ平均ＯＳ＝２３及び１５ヶ月）又はｐＴ３ステージの患者（平均ＯＳ＝２４ヶ月）であることよりも、良好な転帰を予測した。生存期間に関してｐＴ２ステージとｐＴ３ステージとで主に異なったのは、ＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｈｉ腫瘍を有する患者群であり、その死亡リスクは、両ステージにおいてそれぞれ中間リスクから高リスクに変わり、ｐＴ２及びｐＴ３患者群とまさに同じ転帰を有した。
まとめると、これらのデータは、ＤＣ及びＣＴＬの両方の密度の組合せ並びにｐＴステージが、ゴールドスタンダードであるｐＴステージ単独よりもＮＳＣＬＣ患者の全生存期間をうまく予測することを示した。
３ － Ｎステージと共になったＤＣ及びＣＴＬの両方の密度は、Ｎステージ単独よりもＮＳＣＬＣ患者の臨床転帰をうまく予測する
本発明者らは、次に、Ｎステージの予後的価値に及ぼすＤＣ／ＣＤ８スコアの影響を検討した（図３）。図３Ａに示すように、Ｎステージは、ＯＳについての予後マーカーであることが公知である。リンパ節浸潤が全く検出不能の患者のうち、浸潤性ＤＣが高密度の患者は生存期間が長く（ＤＣ ＣＤ８＿Ｈｉ Ｈｉ腫瘍を有する患者及びＤＣ ＣＤ８＿Ｈｉ Ｌｏ腫瘍を有する患者について平均ＯＳはそれぞれ９９及び１１１ヶ月であった）、一方で、ＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｌｏを有する患者は、Ｎ０ステージを有する患者である参照（平均ＯＳ＝７３ヶ月）よりも転帰が非常に悪かった（平均ＯＳは４９ヶ月であった）（図３Ａ－Ｂ）。ＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｈｉを有する患者は、参照Ｎ０ステージと類似の挙動を有した（それぞれ平均ＯＳ＝７９対７３ヶ月）。リンパ節に波及した患者について（図３Ａ、Ｃ）、状況はいっそうさらに著しい。ＤＣ－Ｌａｍｐ層別化に基づきＯＳに大きな差があった。参照に比べて（Ｎ＋患者について平均ＯＳ＝２５ヶ月）、ＤＣが高密度の患者は、ＣＤ８＋ Ｔ細胞の密度が何であれ、最高の生存率及び平均生存期間を有した（ＤＣ ＣＤ８＿Ｈｉ Ｈｉ患者について１０年ＯＳ＝４５％、平均ＯＳ＝６４ヶ月）。ＤＣ ＣＤ８＿Ｈｉ Ｌｏ患者について同じ傾向が観察されたが、結論するには例数が少なすぎた。対照的に、ＤＣが低密度の患者は、最悪の率及び平均転帰を有した（１０年ＯＳ＝５％、平均ＯＳ＝１４ヶ月）。今回も、ＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｈｉ患者及びＮ＋患者についてのカプラン-マイヤー曲線は、まさに類似していた（図３Ａ－Ｃ）。
これらの結果は、Ｎステージ（参照として）にＤＣ及びＣＤ８を加えることが、特にリンパ節浸潤を有する患者群の中から死亡リスクが高い患者と低い患者とをよりよく識別可能にすることを実証した。
４ － ＤＣ、ＣＤ８及び塞栓の組合せは、塞栓単独よりもうまく全生存期間を予測する
血管及びリンパ管浸潤は、腫瘍細胞が体内に拡散していることの最も早い徴候である。図４Ａに示すように、この基準は生存期間不良に関連するので、臨床家によっても評価される。したがって、本発明者らは、次に、塞栓を有する又は有さないＮＳＣＬＣ患者の間でＤＣ／ＣＤ８スコアの予後的価値を研究した（図４）。ＤＣ／ＣＤ８の組合せは、塞栓単独によって層別化された患者（図４Ａ）よりも、転帰良好及び転帰最悪の患者をうまく特定できるようにした（図４Ｂ－Ｃ）。塞栓が全く検出不能の患者のうち、両方の免疫細胞型が低密度の患者群は、ＯＳが非常に不良であり（平均ＯＳ＝５４ヶ月）、一方で残りの３つの群は、塞栓陰性の患者群（平均ＯＳ＝８３ヶ月）よりもＯＳがわずかに長かった（ＤＣ ＣＤ８＿Ｈｉ Ｈｉ、ＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｈｉ、及びＤＣ ＣＤ８＿Ｈｉ Ｌｏ患者について、平均ＯＳは、それぞれ９２、１０１及び１１１ヶ月であった）。塞栓を有する患者について、免疫的基準は生存期間をよりよく予測した（図４Ｃ、Ｐ＜０．０００１）。ＤＣ ＣＤ８＿Ｈｉ Ｈｉを有する患者は死亡リスクが低く（平均ＯＳ＝８４ヶ月）、ＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｌｏを有する患者は、生存不良のリスクが非常に高く（平均ＯＳ＝１６ヶ月）、一方で免疫細胞の入り混じった密度を有する患者は、塞栓を有する患者（平均ＯＳ＝４０ヶ月）とほぼ同じ平均ＯＳを有した（ＤＣ ＣＤ８＿Ｈｉ Ｌｏ及びＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｈｉ患者について、平均ＯＳは、それぞれ４６及び３２ヶ月であった）。
これらのデータは、ＤＣ、ＣＤ８及び塞栓パラメーターの組合せが、生存についてのＮＳＣＬＣ患者のよりよい層別化を可能にすることを示している。
５ － ＴＮＭステージ及びＤＣ／ＣＤ８スコアによって層別化されたＮＳＣＬＣ患者のより良好な生存期間
最後に、本発明者らは、ＤＣ／ＣＤ８スコアがある場合又はない場合の新しいｐＴＮＭ分類（２０１０）の予後的価値の威力を検定した（図５）。予想通り、ＴＮＭは、ＯＳについての予後マーカーであった（図５）。前述同様に、免疫スコアによって層別化された患者の予後的影響は、疾患の進行中にどんどん顕著になった。早期ＮＳＣＬＣの以後、低密度の樹状細胞及びＣＤ８＋細胞は、転帰が最悪の患者を特定し（ＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｌｏ患者及びステージＩの患者について、平均ＯＳは、それぞれ６１ヶ月対９９ヶ月であった；図５Ａ－Ｂ）、一方でＤＣ／ＣＤ８患者の残りの３群は、ステージＩの患者と同じ平均ＯＳを有した。疾患が最も進行したステージの患者のうち、高密度の成熟ＤＣを有する患者は、低ＤＣ群の患者（ＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｈｉ及びＤＣ ＣＤ８＿Ｌｏ Ｌｏ患者について、平均ＯＳは、それぞれ１０及び１３ヶ月であった）又はステージＩＩＩの患者（平均ＯＳ＝１８ヶ月）に比べて生存期間に関して大きな利益を有した（平均ＯＳ＝６４ヶ月）（図５Ａ、Ｄ）。今回も、疾患の段階が何であろうと、ＤＣ ＣＤ８ Ｌｏ Ｈｉ患者は、常に参照と同じ挙動を有した。
まとめると、ＤＣ／ＣＤ８スコアは、ＴＮＭステージの予後的価値を高める。ＤＣ／ＣＤ８スコアをｐＴＮＭステージと組合せることで、ＮＳＣＬＣなどの腫瘍誘導型リンパ構造を有する固形癌患者の予後のより精密な見解が得られる。
参考文献
本出願にわたり、本発明が属する技術の現状を様々な参考文献が記載している。これらの参考文献の開示は、本開示への参照により本明細書に組み入れられる。

Claims (4)

  1. 非小細胞肺癌を患う患者の生存期間の予後を決定するためのデータを提供するためのインビトロ方法であって、以下の工程：
    ａ）患者からの腫瘍組織試料における、ＣＤ８＋細胞の細胞密度を定量すること、
    ｂ）患者からの腫瘍誘導型リンパ構造における、ＤＣ－ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度を定量すること、
    ｃ）工程ａ）及びｂ）で得られた細胞密度の値を、各位置で各細胞型について予め決定された参照値と比較すること、及び
    ｄ）
    （ｉ）患者が、ＴＮＭステージ分類によるステージＩのガンを有する場合：
    ＣＤ８＋細胞及びＤＣ－ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度が、予め決定された参照値よりも高い場合又は一方のマーカー細胞密度が、予め決定された参照値よりも高く、かつ、他方のマーカーの細胞密度が、予め決定された参照値よりも低い場合、患者に生存期間の予後良好を；又は
    ＣＤ８＋細胞及びＤＣ－ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度が、予め決定された参照値よりも低い場合、患者に生存期間の予後不良を
    （ｉｉ）患者が、ＴＮＭステージ分類によるステージＩＩのガンを有する場合：
    ＣＤ８＋細胞及びＤＣ－ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度が、予め決定された参照値よりも高い場合、患者に生存期間の予後良好を；
    一方のマーカー細胞密度が、予め決定された参照値よりも高く、かつ、他方のマーカーの細胞密度が、予め決定された参照値よりも低い場合、患者に生存期間の予後中間を；又は
    ＣＤ８＋細胞及びＤＣ－ＬＡＭＰ＋樹状細胞の細胞密度が、予め決定された参照値よりも低い場合、患者に生存期間の予後不良を
    提供すること
    を含む、前記方法。
  2. 腫瘍組織試料が、腫瘍巣試料又は全腫瘍切片の間質試料である、請求項１記載の方法。
  3. 腫瘍組織試料が、全腫瘍切片の間質試料である、請求項２記載の方法。
  4. 生存期間が、疾患特異的生存期間（ＤＳＳ）、無病生存期間（ＤＦＳ）又は全生存期間（ＯＳ）である、請求項１～３のいずれか記載の方法。
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