JP7108018B2 - 急性肺傷害を処置または予防する化合物、組成物および方法 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、2017年4月17日に出願された米国特許仮出願第62/486,232号の35 U.S.C.§119（e）に基づく優先権を主張するものであり、この仮出願は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載
本発明は、米国立衛生研究所によって付与された助成金番号HL135805での政府の補助を伴ってなされた。米国政府は、本発明において一定の権利を有する。

発明の背景
急性肺傷害（ALI）およびそのより重度の形態である急性呼吸窮迫症候群（ARDS）の発生率は米国で年間200,000例前後、死亡率は40％前後であると報告されている。この疾患は、直接的または間接的な損傷に対する肺の炎症応答の症状発現であり、肺内のびまん性肺胞傷害、好中球性炎症およびタンパク質高含有性（protein-rich）水腫による重度の低酸素血症および肺コンプライアンスの相当な低下を特徴とする。このような病状のケアは対症療法に大きく依存する。現在、有効な薬理学的介入法がない。ALI/ARDSを有する患者で試験された薬理学的療法では死亡率を低下させることはできなかった。したがって、この疾患の治療的介入のためのまだ対処されていない明白な医療的必要性が存在している。

ALIの顕著な特徴の1つは肺内の大量の好中球の存在である。好中球はヒトの循環系内に最も多く存在する白血球であり、微生物感染に対する自然免疫に重要な役割を果たし、また、炎症関連組織損傷の一因でもある。炎症時、好中球は循環系から、内皮細胞上でのローリングおよび固着、血管内這い回り、遊出および血管外走化性を含む多段階プロセスを経て傷害および感染の部位へと動員される。該当部位に達したら、好中球は、食作用、顆粒内貯蔵酵素の放出および活性酸素種（ROS）の産生などのいくつかの務めを果たす。証拠により、好中球とALI/ARDSの病因とが明白に関連付けられている。好中球の肺胞上皮の通り抜けが肺上皮透過性の亢進を直接引き起こすのではないが、好中球は肺水腫に重要な役割を果たしており、その潜在機序の理解は依然として不完全である。

好中球細胞外トラップおよび顆粒内酵素、例えば好中球エラスターゼは、ALIの病態、例えば肺水腫の一因であるが、ALI/ARDSにおけるROSの役割（あれば）はまだ議論の余地がある。好中球は主に、NOXファミリーの構成員である食細胞NADPHオキシダーゼを介してROSを産生する。これは、4つの細胞質成分（p47^phox、p67^phox、p40^phoxおよびRac）ならびに2つの膜サブユニット（gp91^phox/NOX2およびp22^phox）からなる。該細胞が刺激、例えば化学誘引物質によって活性化されると、これらの細胞質成分が膜成分に動員されて活性なホロ酵素を形成し、ROSを産生する。カギとなる活性化事象の1つは、PKCなどのプロテインキナーゼによる細胞質p47^phoxサブユニットのリン酸化である。このリン酸化により、内部SH3ドメインが関与する自己阻害性分子内相互作用が破壊され、NADPHオキシダーゼの活性化に必要とされる、該ドメインとp22^phoxとの相互作用がもたらされる。

MAP3K2およびMAP3K3は、MAP3KスーパーファミリーのMEKキナーゼ（MEKK）サブグループの高度に保存された2つの構成員である。これらは、C末端にキナーゼドメインおよびN末端付近にPB1ドメインを含む。MAP3K2およびMAP3K3のキナーゼドメインは94％の配列同一性を共有し、この2つのキナーゼは共通の基質を有すると予測される。インビトロでの該キナーゼの一過性発現により、これらの自己活性化ならびにERK1とERK2、p38、JNKおよびERK5の活性化がもたらされる。マウスでは、これらのキナーゼは心血管の発生、リンパ球の分化およびNF-κBの調節に関与している。しかしながら、一次骨髄系細胞のバイオロジーまたはALIにおけるこれらの役割は調べられていない。

当技術分野において、ALI/ARDSを処置または予防するために該疾患に罹患している患者に使用され得る新規な治療的処置薬が同定される必要性が存在する。本発明はこの必要性に対処し、それを満たす。

発明の簡単な概要
本発明は、その必要のある対象における、急性肺傷害（ALI）の処置または予防方法を提供する。本発明は、その必要のある対象における、肺線維症の処置または予防方法をさらに提供する。本発明は、本発明の方法において有用な化合物または組成物を含むキットをさらに含む。

一部の特定の態様では、方法は、対象に治療有効量のパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物を投与する工程を含む。他の態様では、投与経路が経口である。他の態様では、投与経路が非経口である。さらに他の態様では、投与経路が経鼻である。さらに他の態様では、投与経路が吸入である。さらに他の態様では、投与経路が気管内である。さらに他の態様では、投与経路が肺内である。さらに他の態様では、投与経路が気管支内である。さらに他の態様では、投与経路が、経口、非経口、経鼻、吸入、気管内、肺内および気管支内からなる群より選択される。さらに他の態様では、投与経路が、経鼻、吸入、気管内、肺内および気管支内からなる群より選択される。さらに他の態様では、投与がネブライザーを用いて行なわれる。

一部の特定の態様では、対象は集中治療室（ICU）または救急処置室（ER）に入っている。他の態様では、急性肺傷害が急性呼吸窮迫症候群（ARDS）である。

一部の特定の態様では、対象に、急性肺傷害の症状を処置、予防または低減する少なくとも1種類のさらなる剤および/または治療がさらに与えられる。他の態様では、対象に、肺線維症の症状を処置、予防または低減する少なくとも1種類のさらなる剤および/または治療がさらに与えられる。

一部の特定の態様では、パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物が対象に、およそ1日3回、およそ1日2回、およそ1日1回、およそ1日おき、およそ3日目毎、およそ4日目毎、およそ5日目毎、およそ6日目毎およびおよそ週1回からなる群より選択される頻度で投与される。他の態様では、パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物が乾燥粉末ブレンドとして製剤化される。

一部の特定の態様では、対象に対するパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物の投与は、がんを患う対象に対するパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物の経口/全身投与に関連する少なくとも1つの有意な有害反応、副作用および/または毒性を引き起こさない。他の態様では、少なくとも1つの有害反応、副作用および/または毒性は、肝毒性、QT間隔延長およびトルサード・ド・ポアント、出血事象、凝固の低減または妨害、動脈血栓事象、胃腸穿孔または瘻孔、高血圧、甲状腺機能低下症、蛋白尿、下痢、髪色の変化、悪心、無食欲ならびに嘔吐からなる群より選択される。

一部の特定の態様では、対象に、がん処置のためにがんを患う対象に経口/全身性で投薬されるパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物の量より少ない量の、パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物が投薬される。

一部の特定の態様では、対象は哺乳動物である。他の態様では、哺乳動物はヒトである。

一部の特定の態様では、キットはパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物を含む。他の態様では、キットはアプリケータを含む。さらに他の態様では、キットは使用のための説明資料を含む。さらに他の態様では、キットは、急性肺傷害および/または肺線維症の症状を処置、予防または低減する少なくとも1種類のさらなる剤を含む。さらに他の態様では、説明資料が、対象の急性肺傷害および/または肺線維症を処置または予防するための使用説明書を含む。

本発明は、ALIの処置における薬物の有効性の評価方法をさらに提供する。一部の特定の態様では、該方法は、好中球を薬物と接触させる工程、および該接触後の好中球ROS産生レベルを測定する工程を含む。他の態様では、好中球ROS産生レベルが該接触後に増大しているならば、薬物はALIの処置に効果がある。

本発明は、ALIを患う対象の処置における薬物の有効性の評価方法をさらに提供する。一部の特定の態様では、該方法は、薬物が投与された後の対象における好中球ROS産生レベルを測定する工程を含む。他の態様では、薬物が投与された後の該対象における好中球ROS産生レベルが、薬物が投与される前の該対象における好中球ROS産生レベルより高いならば、該薬物は該対象のALIの処置に効果がある。
[本発明1001]
その必要のある対象における、急性肺傷害（ALI）の処置または予防方法であって、該対象に治療有効量のパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物を、経口、非経口、経鼻、吸入、気管内、肺内および気管支内からなる群より選択される投与経路を用いて投与する工程を含む、方法。
[本発明1002]
その必要のある対象における、肺線維症の処置または予防方法であって、該対象に治療有効量のパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物を、経口、非経口、経鼻、吸入、気管内、肺内および気管支内からなる群より選択される投与経路を用いて投与する工程を含む、方法。
[本発明1003]
前記投与がネブライザーを用いて行なわれる、本発明1001または1002の方法。
[本発明1004]
前記対象が集中治療室（ICU）または救急処置室（ER）に入っている、本発明1001または1002の方法。
[本発明1005]
急性肺傷害が急性呼吸窮迫症候群（ARDS）である、本発明1001の方法。
[本発明1006]
前記対象に、急性肺傷害の症状を処置、予防または低減する少なくとも1種類のさらなる剤および/または治療がさらに与えられる、本発明1001の方法。
[本発明1007]
前記対象に、肺線維症の症状を処置、予防または低減する少なくとも1種類のさらなる剤および/または治療がさらに与えられる、本発明1002の方法。
[本発明1008]
パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物が、前記対象に、およそ1日3回、およそ1日2回、およそ1日1回、およそ1日おき、およそ3日目毎、およそ4日目毎、およそ5日目毎、およそ6日目毎およびおよそ週1回からなる群より選択される頻度で投与される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1009]
パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物が乾燥粉末ブレンドとして製剤化される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1010]
前記対象に対するパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物の投与が、がんを患う対象に対するパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物の経口/全身投与に関連する少なくとも1つの有意な有害反応、副作用および/または毒性を引き起こさない、本発明1001または1002の方法。
[本発明1011]
前記少なくとも1つの有害反応、副作用および/または毒性が、肝毒性、QT間隔延長およびトルサード・ド・ポアント、出血事象、凝固の低減または妨害、動脈血栓事象、胃腸穿孔または瘻孔、高血圧、甲状腺機能低下症、蛋白尿、下痢、髪色の変化、悪心、無食欲ならびに嘔吐からなる群より選択される、本発明1010の方法。
[本発明1012]
前記対象に、がん処置のためにがんを患う対象に経口/全身性で投薬されるパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物の量より少ない量の、パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物が投薬される、本発明1001または1002の方法。
[本発明1013]
前記対象が哺乳動物である、本発明1001または1002の方法。
[本発明1014]
前記哺乳動物がヒトである、本発明1013の方法。
[本発明1015]
パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物、アプリケータおよび使用のための説明資料を含むキットであって、該説明資料が、経鼻、吸入、気管内、肺内および気管支内からなる群より選択される投与経路を用いて対象の急性肺傷害および/または肺線維症を処置または予防するための使用説明書を含む、キット。
[本発明1016]
パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物が乾燥粉末ブレンドとして製剤化される、本発明1015のキット。
[本発明1017]
急性肺傷害および/または肺線維症の症状を処置、予防または低減する少なくとも1種類のさらなる剤をさらに含む、本発明1015のキット。
[本発明1018]
ALIの処置における薬物の有効性の評価方法であって、好中球を該薬物と接触させる工程、および該接触後の好中球ROS産生レベルを測定する工程を含み、ここで、好中球ROS産生レベルが該接触後に増大しているならば、該薬物はALIの処置に効果がある、方法。
[本発明1019]
ALIを患う対象の処置における薬物の有効性の評価方法であって、該薬物が投与された後の該対象における好中球ROS産生レベルを測定する工程を含み、ここで、該薬物が投与された後の該対象における好中球ROS産生レベルが、該薬物が投与される前の該対象における好中球ROS産生レベルより高いならば、該薬物は該対象のALIの処置に効果がある、方法。

本発明の具体的な態様の以下の詳細説明は、添付の図面と併せて読むと、よりよく理解されよう。本発明の実例を示す目的のため、具体的な態様を図面に示している。しかしながら、本発明は、図面に示された態様の厳密な構成および手段に限定されないことを理解されたい。

図1A～1Hは、造血細胞内のMAP3K2および骨髄系細胞内のMAP3K3の減少によりLPS誘発性肺傷害が軽快することを示す。図1Aは、HS-DKO好中球内のMAP3K2および3タンパク質の減少を示す。図1Bは、HS-DKOマウスにおける肺透過性の低下を示す。HS-DKOおよび対照WTマウスをLPSで鼻腔内経路によって処置した。FITC標識アルブミンに対する肺透過性を、傷害誘導後24時間目のBALの蛍光を測定することにより調べた。図1Fは、HS-DKOマウスにおける肺透過性の低下を示す。HS-DKOおよび対照WTマウスをHClで経口-気管挿管によって処置した。FITC標識アルブミンに対する肺透過性を、傷害誘導後6時間目のBALの蛍光を測定することにより調べた。データを平均±semとして示す（スチューデントのt-検定, ^＊p＜0.05, n＝8）。図1C～1Dおよび1Gは、それぞれ図1Bおよび図1Fの肺試料の代表的な組織学的検査を示す。Br, 気管支; V, 血管; ^＊, 水腫。図1Eは、HS-DKOマウスがLPS誘発性肺傷害に関する生存の延長を示すことを示し、図1Hは、HS-DKOマウスがHCl誘発性肺傷害に関する生存の延長を示すことを示す。マウスは図1Bおよび図1Fの場合のようにして処置し、生存について観察した（マンテル・コックスログランク検定）。 図2A～2Kは、MAP3K2/3-ヌル好中球が正常な走化性、内皮細胞接着、インテグリンの発現および活性化、浸潤ならびに脱顆粒を示すという所見を示す。図2A～2Dは、MAP3K2/3-ヌル好中球が正常な走化性を示すという所見を示す。ダンチャンバー走化性アッセイによる代表的な細胞遊走の図を図2A～2Bに示す。細胞がどれだけ速く移動するか、どれだけ良好に化学誘引物質勾配に従うかに関する移行および方向性のパラメータを図2C～2Dに示す。n＝50。図2Eは、剪断流下での内皮細胞への好中球の接着を示す。n＝3。図2F～2Gは、好中球上におけるLFA-1およびMAC-1インテグリンの細胞表面発現を示す。n＝3。図2Hは、ICAM-1に対する好中球の結合を示し、これは、活性化されたときの好中球上のインテグリンのアビディティを反映している。n＝3。図2Iは、炎症腹膜内への好中球の浸潤を示す。n＝5。図2J～2Kは、刺激を受けたときの好中球顆粒からのMMPおよびMPOの放出を示す。n＝3。 図3A～3Eは、MAP3K2/3が好中球からのROS放出をキナーゼ活性に依存的に阻害するという所見を示す。図3Aは、MAP3K2/3の減少によって好中球からのROS放出が増大するという所見を示す。代表的なROS測定の図を左パネルに示し、一方、5匹より多くのマウスの曲線（trace）下面積から算出したROS量を右パネルに要約する（データを平均±semとして示す, スチューデントのt-検定, ^＊p＜0.05, n＝3）。実験は少なくとも3回繰り返した。図3Bは、WT MAP3K3の発現によりDKO好中球におけるROS産生が抑制されるが、そのキナーゼデッド変異型では抑制されないという所見を示す。好中球を、GFP、MAK3K3-GFP、MAP3K3キナーゼデッド（KD）またはGFPと融合させたPB1ドメイン欠失変異型用のプラスミドで一過的にトランスフェクトした。GFP陽性細胞を翌日分取し、ROS放出アッセイに使用した。MAP3K3およびその変異型の発現をウエスタン解析によって検出した。データを平均±semとして示す（スチューデントのt-検定, ^＊p＜0.05, n＝3）。図3C～3Eは、スーパーオキシドスカベンジャーのBHAがLPS誘発性肺傷害におけるHS-DKOと対照WTのマウス間の差を消失させるという所見を示す。BHA含有飼料摂取のマウスをLPS誘発性肺傷害に供した。n＝5。 図4A～4Gは、MAP3K3がp47phoxのS208をリン酸化してNADPHオキシダーゼ活性を阻害するという所見を示す。図4Aは、MAP3K3がp47phoxをリン酸化するという所見を示す。インビトロキナーゼアッセイは、HEK293細胞から免疫沈降させた組換えMAPK3K3およびNADPHオキシダーゼサブユニットを用いて行なった。NADPHオキシダーゼサブユニットをHA-タグを用いて一過的に発現させ、抗HA抗体を免疫沈降に使用した。図4Bは、MAP3K3がp47phoxのS208をリン酸化するという所見を示す。インビトロキナーゼアッセイは、2つのSH3ドメインを含む野生型（WT）またはS208E変異（SE）p47phox（残基151～286）の組換えMAP3K3およびGST融合断片（p47SH3）を用いて行なった。リン酸化の定量はホスホイメージャーによって行なった。図4Cは、p47phoxのSer-208のリン酸化模倣変異により再構築ROS産生アッセイにおいて活性の低下がもたらされるという所見を示す。COS-7細胞を、WT p47phoxまたはそのS208A（SA）もしくはS208E（SE）変異型と一緒にp22phox、p67phoxおよびp97phox用のプラスミドでコトランスフェクトした。PMA誘発性ROS産生を示す。データを平均±semとして示す（スチューデントのt-検定, ^＊p＜0.05, n＝5）。図4Dは、WT p47phoxはMAP3K3によって阻害されるがそのS208A変異型は阻害されないという所見を示す。COS-7細胞を、MAP3K3の存在下または非存在下で、WT p47phox（左パネル）またはそのS208A（右パネル）変異型と一緒にp22phox、p67phoxおよびp97phox用のプラスミドでコトランスフェクトした。PMA誘発性ROS産生を示す。データを平均±semとして示す（スチューデントのt-検定, ^＊p＜0.05, n＝5）。図4Eは、p47phoxのSer-208のリン酸化模倣変異によってp22phoxとの相互作用が損なわれるという所見を示す。GSTプルダウンアッセイを、p22phoxのSer-208の代わりにAlaまたはGluの置換およびMBP融合C末端（残基96～164）（p22C）を有する組換えGST-p47SH3を用いて行なった。ウエスタン解析をタンパク質の検出に使用した。図4Fは、p47phoxのSer-208のリン酸化がfMLPによって刺激されるという所見を示す。好中球をfMLP（1μM）でいろいろな期間刺激した後、ウエスタン解析を行なった。図4Gは、FMLP刺激p47phoxリン酸化がMAP3K2/3に依存するという所見を示す。図4H～4Kは、インビトロキナーゼアッセイにおいてパゾパニブがp47phoxのリン酸化をMEKK2または3によって阻害するという所見を示す。大腸菌（E. coli）発現系により調製した組換えp47phoxを組換えMAP3K2または3とともに、ATPの存在下、37℃で30分間インキュベートした。タンパク質をウエスタンブロッティングによって解析した。MAP3K2によるp47リン酸化の阻害のIC₅₀は20 nM前後であり、一方、MAP3K3のIC₅₀は10 nM前後である。これらの数値は、ATP結合またはMAP3K2によるMEK5（図4J～4K）のリン酸化に対するパゾパニブの効果の既報の値（これは500 nMより高かった）よりずっと低い。Ahmad, et al., 2013, J. Biomol. Screen. 18:388を参照のこと。 図5A～5Fは、パゾパニブがMAP3K2/3を阻害し、MAP3K2/3の遺伝子不活性化のものと同様の表現型を誘導するという所見を示す。図5Aは、パゾパニブがp47phoxのSer-208のリン酸化を阻害するという所見を示す。好中球をパゾパニブ（pazo）で10分間前処理した後、fMLP（1μM）によって刺激し、その後、ウエスタン解析を行なった。図5B～5Cは、パゾパニブが好中球からのROS放出をMAP3K2/3に依存して増大させるという所見を示す。好中球をパゾパニブ（図5Cでは20 nM）で10分間前処理した後、fMLP（1μM）によって刺激し、ROS測定を行なった。データを平均±semとして示す（スチューデントのt-検定, ^＊p＜0.05, n＝3）。図5D～5Eは、パゾパニブ処置によってLPS誘発性肺傷害が減弱されるという所見を示す。マウス（C57Bl雌）を60 mg/Kg/日のパゾパニブで強制投与により、LPSによる肺傷害誘導の2日前に処置した。肺傷害誘導の1日後、肺透過性（図5D）を調べ、組織学的検査（図5E）を行なった。実験を2回繰り返し、同様の結果であった。一方の実験のデータを平均±semとして示す（スチューデントのt-検定, ^＊p＜0.05, n＝5）。図5Fは、パゾパニブ処置によってLPS誘発性肺傷害を有するマウスの死亡率が低下するという所見を示す。C57Blマウスを上記のようにして処置し、その生存をマンテル・コックスログランク検定によって解析した。 パネルA～Dを含む図6は、AKTがHS-DKOのLPS傷害肺において過剰活性化されるという所見を示す。LPS傷害肺の切片をホスホ-AKTおよびCD31（パネルA～B）または平滑筋アクチン（SMA; パネルC～D）について染色した。ホスホ-AKT染色は、CD31（塗りつぶし三角を比較）および血管（V）付近のSMA染色（白抜き三角を比較）により共染色された領域で強い。対照的に、上腕壁のホスホ-AKT染色（塗りつぶし矢印）および上腕壁の横のSMAによって染色された上腕平滑筋細胞（白抜き矢印）はHS-DKOとWTの試料間で同じままである。CD31およびSMA染色単独の画像を図13A～13Fに示す。 図7A～7Dは、MAP3K2/3がない好中球は内皮細胞におけるAKT活性化をH₂O₂によって増大させるという所見を示す。図7Aは、MAP3K2/3阻害により、好中球によるROS産生増大と内皮細胞ならびに周皮細胞におけるAKT過剰活性化がどのようにしてもたらされるかを示す非限定的なモデルを示す。なんら理論に限定されることを望まないが、AKTの過剰活性化によりALI時に血管完全性の改善および透過性の低下がもたらされ、したがって、肺がより健常になる。図7B～7Cは、MAP3K2/3欠損好中球（DKO）の共培養により、WT好中球のものと比べて多くのAKTリン酸化が引き起こされ、AKTリン酸化のこの差は、カタラーゼ（Cat）の存在によって消失するが、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）の存在によっては消失しないという所見を示す。図7Dは、SODの存在下または非存在下でWTまたはDKO好中球とともに共培養したマウス肺内皮細胞のTEERの測定を示す。矢印は、好中球を添加した時点を示す。 図8A～8Eは、造血細胞内のMAP3K2および骨髄系細胞内のMAP3K3の減少が、LPS傷害肺のBALF中の浸潤骨髄系細胞の数またはサイトカイン含有量に影響しないという所見を示す。図8Aは、LPS誘発性肺傷害モデルのバリデーションを示す。マウスをLPSで鼻腔内経路によって処置した。FITC標識アルブミンに対する肺透過性を、傷害誘導後24時間目のBALFにおける蛍光を測定することにより調べた。データを平均±semとして示す（スチューデントのt-検定, n＝4）。n＝5。図8B～8Eは、図1A～1Eに示したマウスの全肺を、どのようにしてフローサイトメトリー（図8A～8D）およびELISA（図8E）によって解析したかを示す。図8F～8Jは、造血細胞内のMAP3K2および骨髄系細胞内のMAP3K3の減少が、HCl傷害性肺中のBALF中の浸潤骨髄系細胞の数またはサイトカイン含有量に影響しないという所見を示す。図8Fは、HCl誘発性肺傷害モデルの概略を示す。図8H～8Jは、全肺を、どのようにしてフローサイトメトリー（図8G～8I）およびELISA（図8J）によって解析したかを示す。 図9A～9Bは、fMLPの刺激を受けたときの、MAP3K2またはMAP3K3がない好中球からのROS放出を示す。 図10A～10Dは、COS-7細胞における再構築ROS産生系のバリデーションを示す。図10A～10B: COS-7細胞を、図に示したようなNANPHオキシダーゼサブユニット用のプラスミドでトランスフェクトし、PMAあり、およびなしで処理した。ROS産生およびタンパク質発現を測定した。図10Cは、WT MAP3K3は再構築COS-7系におけるROS産生を阻害し得るが、そのキナーゼデッド変異型は阻害し得ないという所見を示す。図10Dは、MAP3K2/3がどのようにしてROS産生を抑制するか示す非限定的な概略モデルを示す。 図11は、抗ホスホ-S208 p47^phox抗体のバリデーションを示す。HEK293細胞を、WTまたはS208A p47^phoxと一緒にWTまたはキナーゼデッドMAP3K3でコトランスフェクトした。翌日、ウエスタン解析を行なった。 図12A～12Kは、LPSが、肺透過性を亢進させることによって肺傷害を誘発したという所見を示す。図12A～12Bは、パゾパニブがMEKK3を阻害し、ヒト好中球によるROS産生を増大させるという所見を示す。ヒト好中球を、20 nMのパゾパニブの存在下および非存在下にてfMLP（100 nM）で刺激した。図12Bのデータは平均±semとして示している（^＊, P＜0.05, スチューデントのt-検定; n＝5）。図12C～12Dは、BHAが肺透過性に対するパゾパニブの効果を消失させるという所見を示す。HS-DKOマウスに通常の飼料またはBHA含有飼料を摂取させ、60 mg/Kg/日のパゾパニブで強制投与により、LPSによる肺傷害誘導の2日前に開始で処置した。肺傷害誘導の1日後、肺透過性を測定した。図12Cのデータは平均±semとして示している（n＝5）。代表的な組織学的検査を図12Dに示す。図12Eは、パゾパニブでの治療的処置によりLPS誘発性肺傷害を有するマウスの死亡率が低下するという所見を示す。マウス（C57Bl雌, 8週齢）を鼻腔内からの1.5 mg/Kgのパゾパニブで、LPSによる肺傷害誘導後24時間目に処置し（80μg/g, 32 mg/ml）、その生存をマンテル・コックスログランク検定によって解析した。図12F～12Gは、パゾパニブ処置によってHCl誘発性肺傷害が減弱されるという所見を示す。マウス（C57Bl雌, 8週齢）を鼻腔内からの1.5 mg/Kgのパゾパニブで、HCl（0.05 M, 2.5μl/g）による肺傷害誘導後1時間目に処置した。肺傷害誘導後6時間目、肺透過性（図12D）を調べ、組織学的検査（図12E）を行なった。実験を2回繰り返し、同様の結果であった。一方の実験のデータを平均±semとして示す（スチューデントのt-検定, ^＊p＜0.05, n＝5）。図12Hは、パゾパニブ処置によってLPS誘発性肺傷害を有するマウスの死亡率が低下するという所見を示す。マウス（C57Bl雌, 8週齢）を鼻腔内からの2.5 mg/Kgのパゾパニブで、HCl（0.1 M, 2.5μl/g）による肺傷害誘導後1時間目に処置し、その生存をマンテル・コックスログランク検定によって解析した。図12I～12Kは、パゾパニブでの予防的処置によりHCl誘発性肺傷害を有するマウスの肺透過性および死亡率が低下するという所見を示す。図12Jは、パゾパニブでの前処置によりHCl誘発性肺傷害が減弱されるという所見を示す。マウス（C57Bl雌, 8週齢）を鼻腔内からの1.5 mg/Kgのパゾパニブで、HCl（0.05 M, 2.5μl/g）による肺傷害誘導の0.5時間前に処置した。肺傷害誘導後6時間目、肺透過性を調べた。実験を2回繰り返し、同様の結果であった。一方の実験のデータを平均±semとして示す（スチューデントのt-検定, ＊p＜0.05, n＝5）。図12Kは、パゾパニブでの前処置によりHCl誘発性肺傷害を有するマウスの死亡率が低下するという所見を示す。マウス（C57Bl雌, 8週齢）を鼻腔内からの1.5 mg/Kgのパゾパニブで、HCl（0.1 M, 2.5μl/g）による肺傷害誘導の0.5時間前に処置し、その生存をマンテル・コックスログランク検定によって解析した。 図13A～13Fは、MAP3K2/3の不活性化によるホスホ-AKTの過剰活性化を示す。図13Aは、HS-DKOマウスのLPS誘発性肺由来のタンパク質抽出物でのS473におけるAKTのリン酸化の増大を示す。図13B～13Cは、図6, パネルA～DのLPS傷害肺切片のCD31およびSMA染色単独の補足画像を示す。図13D～13Eは、WTおよびHS-DKOマウス由来の肺試料におけるAKTリン酸化に対するパゾパニブの効果を示す。図13Fは、AKT-阻害薬MK-2206がLPS傷害肺の透過性に対するパゾパニブの効果を消失させるという所見を示す。マウスをMK-2206（10 mg/Kg）で、強制投与による60 mg/Kg/日のパゾパニブのありまたはなしにて、LPSによる肺傷害誘導の2日前に開始で処置した。n＝5。 図14A～14Dは、MAP3K2/3の不活性化によるRac1の活性化を示す。図14Aおよび14Bは、H2O2誘発性マウス肺内皮細胞（MLEC）由来のタンパク質抽出物でのRac1活性化を示す。図14C～14Dは、fMLP誘導MAP3K2/3欠損好中球とともに共培養したMLECにおけるRac1活性化を示す。 図15は、VEGF阻害薬であるアバスチンがHCl誘発性急性肺傷害に対して有する効果が限定的であるという所見を示す。 図16A～16Eは、パゾパニブ処置により、治療モダリティにおいてHCl（図16A～16C）またはLPS誘発性（図16D～16E）肺傷害が減弱されるという所見を示す。図16Aおよび16Dは、WTおよびp47-HKOマウスでの処置結果を示す。図16B～16Cは透過性に対するパゾパニブの効果を示し、一方、図16D～16Eは生存に対するパゾパニブの有益な効果を示す。図16A、16Bおよび16Dは、ROS生成のカギとなる要素であるp47^phoxの減少によりHCl誘発性肺傷害において肺透過性が悪化し（図16A～16B）、生存率が低下する（図16D）という所見を示す。p47^phoxの減少により、HCl誘発性肺透過性（図16C）および生存率（図16E）によって示されるパゾパニブの治療効果が消失した。 図17は、イマチニブ（4-［（4-メチルピペラジン-1-イル）メチル］-N-（4-メチル-3-｛［4-（ピリジン-3-イル）ピリミジン-2-イル］アミノ｝フェニル）ベンズアミドまたはグリベック（登録商標））での処置では、HCl誘発性肺傷害は減弱されないという結果を示すグラフである。マウス（C57Bl雌, 8週齢）を1.5 mg/Kgのイマチニブまたはパゾパニブで、HClによる肺傷害誘導後1時間目に鼻腔内処置した。肺傷害誘導後6時間目、肺透過性（D）を調べ、組織学的検査（E）を行なった。データを平均±semとして示す（スチューデントのt-検定）。イマチニブは、該傷害を悪化させる傾向を有する。 図18は、パゾパニブがブレオマイシン誘発性肺線維症を抑止するという結果を示す棒グラフである。マウス（C57Bl雌, 8週齢）を0.05単位のブレオマイシンで1回処置した。1週間後、マウスに60 mg/kgのパゾパニブを5日間、経口投与し、肺線維症を、ヒドロキシプロリンレベルを測定することにより調べた。

発明の詳細な説明
本発明は、一部において、MAP3K2および/またはMAP3K3阻害による好中球の活性酸素種（ROS）産生の増大が急性傷害時に肺を保護するという予期しない知見に関する。ROSは組織傷害を悪化させると一般的に考えられている。しかしながら、本明細書で実証しているように、好中球におけるNADPHオキシダーゼ誘導ROSの適度な上昇によって急性肺傷害（ALI）の症状発現が軽快し、マウスの死亡率が低下する。MAP3K2およびMAP3K3は本明細書において、p47^phoxのセリン208をリン酸化することによる好中球NADPHオキシダーゼの新規な負の調節因子であると同定された。MAP3K3およびそのホモログMAP3K2がない好中球は、より多くの量のROSを産生するが、正常な走化性、内皮細胞に対する接着、浸潤および脱顆粒を示す。骨髄系細胞内のMAP3K3および造血細胞内のMAP3K2の遺伝子欠失は、マウスALIモデルにおいてマウスを肺水腫および死亡から保護し、肺血管床におけるAKT活性化の向上が付随することがわかった。このような表現型はMAP3K2/3阻害薬パゾパニブによって再現され得る。

したがって、このような本試験では、ALIにおけるROSの役割を異なる観点から見直し、ROS産生の調節のためのこれまで知られていなかった機構を明らかにする。さらに、本試験により、現時点では薬理学的処置法がない生命を脅かす疾患であるALIの治療的介入のための潜在標的および剤を提供する。非限定的な一局面において、このような結果は、ALIを患う対象に対するパゾパニブのエーロゾル化投与の治療潜在能を支持する。一部の特定の態様では、傷害された肺内へのパゾパニブの標的化投与により、例えば、びまん性肺胞傷害および/または水腫が処置、反転または軽快されることによってALIが減弱されるか、または完全に解消される。

本発明により、対象に治療有効量のパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物を投与する工程を含む、対象の肺線維症および/または急性肺傷害を処置または予防する方法を提供する。一部の特定の態様では、パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物が肺内に、例えば吸入器を用いて直接送達される。これにより、肺患部内への至適薬物用量の有効な送達が可能になり、その治療効果が最大限となり、全身投与によって生じる副作用の可能性が最小限となる。一部の特定の態様では、パゾパニブの局所送達により、非肺組織内でのROS産生増大により起こり得る副作用（あれば）が最小限となる。

本明細書において論考しているように、食作用性NADPHオキシダーゼの負の調節におけるプロテインキナーゼMAP3K2および3のこれまで知られていなかった機能が特定された。これらのキナーゼはp47^phoxのSer-208をリン酸化する。このリン酸化は、p47^phox内のこれまでに知られているリン酸化部位とは対照的に、p47^phoxのp22^phoxとの相互作用を抑制し、NADPHオキシダーゼ活性の阻害をもたらす（図10D）。予測どおり、MAP3K2/3の遺伝子の欠失または薬理学的阻害のいずれかによりROS産生の増大がもたらされた。ROSの増大によりマウスがLPS誘発性ALIから保護された。

本結果は、ROS増大の薬理学的誘導が疾患モデルにおいて防御的であり得ることを示す。過剰量のROSは脂質、タンパク質およびDNAに対して損傷を引き起こし得るため、ROSの有害な効果が注目されることが多かった。本発明の時点では、ROS産生の増大が炎症応答を抑えるのに有効であり得、有益な治療効果が、特に、臨床的に実用的な様式でもたらされ得るかどうかはわからなかった。本試験は、MAP3K2およびMAP3K3の遺伝子阻害または薬理学的阻害によって好中球におけるROS産生の増大がもたらされ、マウスの肺傷害が減弱される（後者はROSに依存する）ことを実証している。MAP3K2/3を阻害するFDA承認小分子薬物であるパゾパニブは、ヒトおよびマウスの両方の好中球においてROSを上昇させてマウスの肺傷害表現型を緩和し、治療有益性を得るための臨床的に実現可能な様式をもたらす。なんら理論に限定されることを望まないが、細胞外に放出されるとROSはH₂O₂に変換され得、スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）が肺組織内に豊富に存在しているため、H₂O₂は適度なレベルで肺血管床の完全性において防御的役割を有し、傷害時に透過性および水腫の低減をもたらす。一部の特定の非限定的な態様において、MAP3K2/3の遺伝子の欠失またはパゾパニブによる薬理学的阻害のいずれかによるROS生成の増大は、ROSが、防御的AKTリン酸化がなされるのに充分であるが不可逆的損傷が引き起こされるのには充分高くなかった最適な状況である。一部の特定の態様では、好中球におけるROS産生の増大が、対象のALIを処置するために使用されている薬物の有効性の読み出し情報として使用され得る。

定義
特に定義していない限り、本明細書で用いる科学技術用語はすべて、本発明が属する技術分野の当業者に一般的に理解されているものと同じ意味を有する。本明細書に記載のものと同様または同等の任意の方法および材料が本発明の実施または試験において使用され得るが、好ましい方法および材料を記載している。

本明細書で用いる場合、以下の各用語は、このセクションのものと関連する意味を有する。

本明細書で用いる場合、冠詞“a”および“an”は、該冠詞の文法上の対象物が1つであるか、または1つより多いこと（すなわち、少なくとも1つ）を示すために用いている。一例として、“ある要素（an element）”は、1つの要素または1つより多くの要素を意味する。

本明細書で用いる場合、「約、およそ」は、測定可能な値、例えば量、時間の長さなどに言及している場合、明記された値からの±20％または±10％、より好ましくは±5％、なおより好ましくは±1％、さらにより好ましくは±0.1％の変動を包含していることを意図し、それは、かかる変動が、本開示の方法を行なうのに妥当だからである。

本明細書で用いる場合、語句「急性肺傷害」または「ALI」は、両側性肺浸潤を伴う急性低酸素呼吸不全からなる症候群であって、肺性リスクファクターおよび非肺性リスクファクターの両方と関連しており、主として左心房性高血圧によるものでないものをいう。

本明細書で用いる場合、語句「急性呼吸窮迫症候群」または「ARDS」は、より重度の低酸素血症を特徴とする亜型の急性肺傷害をいう。

疾患または障害は、疾患または障害の症状の重症度、かかる症状が患者に起こる頻度または両方が低下しているならば「緩和され」ている。

一局面において、用語「共投与される」および「共投与」は、対象に関連している場合、対象に本発明の化合物またはその塩を、本発明において想定される障害または疾患を同様に処置し得る化合物とともに投与することをいう。一部の特定の態様では、共投与される化合物は別々に、または任意の種類の組合せで単一の治療アプローチの一部として投与される。共投与される化合物を任意の種類の組合せで、さまざまな固形、ゲル状および液状の製剤に基づいた固形物および液状物の混合物として、ならびに溶液として製剤化してもよい。

本明細書で用いる場合、用語「組成物」または「薬学的組成物」は、本発明において有用な少なくとも1種類の化合物と薬学的に許容される担体の混合物をいう。薬学的組成物は、患者または対象に対する化合物の投与を容易にする。多くの化合物投与手法、例えば非限定的に、静脈内、経口、エーロゾル、非経口、経眼、経鼻、経肺および経表面投与が当技術分野において存在している。

「疾患」は、本明細書で用いる場合、動物の健康状態であって、動物が恒常性維持することができず、疾患が軽快しなければ該動物の健康は悪化し続けるというものをいう。

「障害」は、動物において本明細書で用いる場合、動物は恒常性を維持できる健康状態であるが、障害がない場合に予想される得るものより良好でないという健康状態である。未処置で放置しても、障害は、必ずしも該動物の健康状態のさらなる低下を引き起こすとは限らない。

本明細書で用いる場合、用語「有効量」、「薬学的有効量」および「治療有効量」は、無毒性だが所望の生物学的結果が得られるのに充分な剤の量をいう。該結果は、疾患の徴候、症状または原因の低減および/または緩和、あるいは生物学的系の任意の他の所望の改変であり得る。任意の個々の症例における適切な治療量は当業者により常套的な実験手法を用いて決定され得る。

「説明資料」は、該用語を本明細書で用いている場合、キットにおける本発明の組成物および/または化合物の有用性を伝えるために使用され得る出版物、記録、図表または任意の他の表現媒体を包含している。キットの説明資料は、例えば、本発明の化合物および/または組成物が収容された容器に貼付され得るか、あるいは該化合物および/または組成物が収容された容器と一緒に出荷され得る。あるいはまた、説明資料を、レシピエントが該説明資料と該化合物を共同的に使用することを意図して、該容器とは別に出荷してもよい。説明資料の配布は、例えば、該キットの有用性を伝える出版物または他の表現媒体の物理的配布によるものであってもよく、あるいはまた、例えばコンピュータによる伝送によって、例えば電子メールまたはウェブサイトからのダウンロードによって行なわれてもよい。

用語「患者」、「対象」または「個体」は本明細書において互換的に用いており、本明細書に記載の方法に適した任意の動物またはその細胞（インビトロであれインサイチューであれ）をいう。非限定的な一態様では、患者、対象または個体がヒトである。

本明細書で用いる場合、用語「パゾパニブ」は、5-（（4-（（2,3-ジメチル-2H-インダゾル-6-イル）（メチル）アミノ）ピリミジン-2-イル）アミノ）-2-メチルベンゼンスルホンアミドあるいはその塩および/または溶媒和物:

をいう。

本明細書で用いる場合、用語「薬学的に許容される」は、物質、例えば担体または希釈剤が化合物の生物学的活性または特性を消失させず、比較的無毒性であること、すなわち、該物質が個体に、望ましくない生物学的効果を引き起こすことなく、または該組成物中に含まれたいずれの成分とも有害な様式で相互作用することなく投与され得ることをいう。

本明細書で用いる場合、用語「薬学的に許容される担体」は、本発明において有用な化合物を患者に、その意図される機能が発揮され得るように運ぶ、または輸送することに関与する薬学的に許容される物質、組成物または担体、例えば液状もしくは固形の増量剤、安定剤、分散化剤、懸濁化剤、希釈剤、賦形剤、増量剤、溶媒または封入材料を意味する。典型的には、かかる構築物は、ある器官または身体の一部から別の器官または身体の一部に運ばれるか、または輸送される。各担体は、製剤のその他の成分、例えば本発明において有用な化合物と適合性があり、患者に対して有害でないという意味で「許容され」なければならない。薬学的に許容される担体としての機能を果たし得る物質の一例としては: 糖類、例えばラクトース、グルコースおよびスクロース; デンプン、例えばコーンスターチおよびジャガイモデンプン; セルロースおよびその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロースおよび酢酸セルロース; 粉末トラガカント; 麦芽; ゼラチン; タルク; 賦形剤、例えばココアバターおよび坐剤用ワックス;油、例えばピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、コーン油およびダイズ油; グリコール、例えばプロピレングリコール; ポリオール、例えばグリセリン、ソルビトール、マンニトールおよびポリエチレングリコール; エステル、例えばオレイン酸エチルおよびラウリン酸エチル; 寒天; 緩衝剤、例えば水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウム; 表面活性剤; アルギン酸; パイロジェンフリー水; 等張性生理食塩水; リンゲル液; エチルアルコール; リン酸バッファー溶液; ならびに薬学的製剤に使用される他の無毒性の適合性の物質が挙げられる。

本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」はまた、本発明において有用な化合物の活性と適合性があり、患者に対して生理学的に許容される任意のあらゆるコーティング、抗菌剤および抗真菌剤ならびに吸収遅延剤なども包含している。また、補助活性化合物を組成物中に組み入れてもよい。

「薬学的に許容される担体」には、本発明において有用な化合物の薬学的に許容される塩もさらに包含され得る。本発明の実施において使用される薬学的組成物に含められ得る他のさらなる成分は当技術分野において公知であり、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences（Genaro, Ed., Mack Publishing Co., 1985, Easton, PA）に記載されており、これは参照により本明細書に組み入れられる。

用語「予防する」、「予防すること」または「予防」は、本明細書で用いる場合、剤または化合物の投与を開始する時点で疾患または病状と関連している症状が発現していない対象のかかる症状の始まりを回避または遅延させることを意味する。

本明細書で用いる場合、用語「ROS」は活性酸素種をいう。ROSの非限定的な例はペルオキシド、スーパーオキシド、ヒドロキシルラジカルおよび一重項酸素である。

用語「塩」は、本発明の方法において有用な遊離酸および/またはベースの付加塩を包含している。用語「薬学的に許容される塩」は、有する毒性プロフィールが、薬学的用途における有用性が賦与される範囲内である塩をいう。とはいえ、薬学的に許容されない塩が、本発明の実施における有用性、例えば本発明の方法において有用な化合物および/または組成物の合成、精製または製剤化の方法における有用性などを有する特性、例えば高い結晶性を有する場合もあり得る。好適な薬学的に許容される酸付加塩は無機酸または有機酸から調製され得る。無機酸の例としては、塩酸、臭化水素酸、ヨウ化水素酸、硝酸、炭酸、硫酸（例えば、スルフェートおよびハイドロジェンスルフェート）ならびにリン酸（例えば、ハイドロジェンホスフェートおよびジハイドロジェンホスフェート）が挙げられる。適切な有機酸は、脂肪族、脂環式、芳香族、芳香族系脂肪族、複素環式、カルボン酸系およびスルホン酸系の分類の有機酸から選択され得、その例としては、ギ酸、酢酸、プロピオン酸、コハク酸、グリコール酸、グルコン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、グルクロン酸、マレイン酸、マロン酸、サッカリン、フマル酸、ピルビン酸、アスパラギン酸、グルタミン酸、安息香酸、アントラニル酸、4-ヒドロキシ安息香酸、フェニル酢酸、マンデル酸、エンボン酸（パモ酸）、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、パントテン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、p-トルエンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、スルファニル酸、シクロヘキシルアミノスルホン酸、ステアリン酸、アルギン酸、β-ヒドロキシ酪酸、サリチル酸、ガラクタル酸およびガラクツロン酸が挙げられる。本発明の化合物および/または組成物の好適な薬学的に許容される塩基付加塩としては、例えば、金属塩、例えばアルカリ金属、アルカリ土類金属および遷移金属の塩、例えば、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウムおよび亜鉛の塩などが挙げられる。また、薬学的に許容される塩基付加塩としては、塩基性アミン、例えば、N,N'-ジベンジルエチレン-ジアミン、クロロプロカイン、コリン、ジエタノールアミン、エチレンジアミン、メグルミン（N-メチルグルカミンとしても知られる）およびプロカインなどから作製される有機塩も挙げられる。このような塩はすべて、対応する化合物から、例えば、適切な酸または塩基を該化合物および/または組成物と反応させることにより調製され得る。

本明細書で用いる場合、化合物の「溶媒和物」は、該化合物と1個または複数の溶媒分子との会合によって形成される物をいう。溶媒和物としては、水、エーテル（例えば、テトラヒドロフラン、メチルtert-ブチルエーテル）またはアルコール（例えば、エタノール）の溶媒和物、アセテートなどが挙げられる。一部の特定の態様では、本明細書に記載の化合物は溶媒、例えば水およびエタノールとの溶媒和物の形態で存在する。他の態様では、本明細書に記載の化合物は非溶媒和物の形態で存在する。

「治療的」処置は、病態の徴候を示す対象に対して、該徴候を減弱または消失させる目的で施される処置である。

本明細書で用いる場合、用語「処置」または「処置すること」は、本明細書において想定される病状、本明細書において想定される病状の症状または本明細書において想定される病状を発現する可能性を治す、癒す、緩和する、軽減させる、改変する、治療する、軽快させる、改善する、または影響を及ぼす目的で、本明細書において想定される病状、本明細書において想定される病状の症状または本明細書において想定される病状を発現する可能性を有する患者に対する治療剤、すなわち本発明の化合物の適用もしくは投与（単独もしくは別の薬学的剤との併用で）、または該患者由来の単離された組織もしくは細胞株に対する治療剤の適用もしくは投与（例えば、診断もしくはエクスビボ用途のため）と定義する。かかる処置は、ファーマコゲノミクス分野から得られる知識に基づいて具体的に個別化または改良され得る。

用語「特異的に結合する」は、本明細書で用いる場合、第1の分子が第2の分子（例えば、特定の受容体または酵素）に優先的に結合するが、必ずしも該第2の分子のみに結合するとは限らないことを意味する。

以下の非限定的な略号を本明細書において用いる: ALI, 急性肺傷害; ARDS, 急性呼吸窮迫症候群; BSA, ウシ血清アルブミン; DMEM, ダルベッコ改変イーグル培地; fMLP, N-ホルミル-L-メチオニル-L-ロイシル-L-フェニルアラニン; HBSS, ハンクス緩衝塩; HRP, ホースラディッシュペルオキシダーゼ; LPS, リポ多糖; MAP3K2またはMEKK2, マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ2; MAP3K3またはMEKK3, マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼキナーゼ3; MEK, マイトジェン活性化プロテインキナーゼキナーゼ; MEKK, MEKキナーゼ; PBS, リン酸緩衝生理食塩水; PFA, パラホルムアルデヒド; PMA, 13-酢酸12-ミリスチン酸ホルボール; RBC, 赤血球; ROS, 活性酸素種; TG, チオグリコレート。

本開示全体を通して、本発明の種々の局面を範囲形式で提示している場合があり得る。範囲形式での記載は、便宜上、略しているにすぎず、本発明の範囲に対する柔軟性のない制限であると解釈されるべきでないことを理解されたい。したがって、範囲の記載は、考えられ得るすべての下位範囲ならびに該範囲内の個々の数値が具体的に開示されているとみなされたい。例えば、1～6などの範囲の記載は、下位範囲、例えば1～3、1～4、1～5、2～4、2～6、3～6など、ならびに該範囲内の個々の数、例えば、1、2、2.7、3、4、5、5.1、5.3、5.5および6が具体的に開示されているとみなされたい。これは、範囲の幅に関係なく適用される。

化合物および組成物
一部の特定の態様では、パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物が本発明の方法において有用である。他の態様では、本発明において有用な化合物および/または組成物は米国特許第7,105,530号; 同第7,262,203号; 同第7,858,626号; および同第8,114,885号（これらはすべて、参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に記載されたものである。また、パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物を含む組成物も本発明において想定される。

方法
本発明は、その必要のある対象における、急性肺傷害の予防または処置方法を含む。本発明は、その必要のある対象における、肺線維症の予防または処置方法を含む。

一部の特定の態様では、方法は、対象に治療有効量のパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物を投与する工程を含む。他の態様では、投与経路が経口である。他の態様では、投与経路が非経口である。さらに他の態様では、投与経路が経鼻である。さらに他の態様では、投与経路が吸入である。さらに他の態様では、投与経路が気管内である。さらに他の態様では、投与経路が肺内である。さらに他の態様では、投与経路が気管支内である。さらに他の態様では、投与経路が、経口、非経口、経鼻、吸入、気管内、肺内および気管支内からなる群より選択される。さらに他の態様では、投与経路が、経鼻、吸入、気管内、肺内および気管支内からなる群より選択される。さらに他の態様では、投与がネブライザーを用いて行なわれる。さらに他の態様では、急性肺傷害が急性呼吸窮迫症候群である。

一部の特定の態様では、本発明の組成物が対象に、およそ1日3回、およそ1日2回、およそ1日1回、およそ1日おき、およそ3日目毎、およそ4日目毎、およそ5日目毎、およそ6日目毎および/またはおよそ週1回投与される。

一部の特定の態様では、経鼻、吸入、気管内、肺内、気管支内および吸入からなる群より選択される投与経路を用いて対象の急性肺傷害を処置するために必要とされるパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物の用量が、対象のがん（例えば非限定的に、進行腎細胞癌）を処置するために必要とされる経口でのパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物の用量より少ない。他の態様では、本発明の方法において使用される該用量が、対象の体重あたりのパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物の質量で換算して、がんを処置するために必要とされる経口用量の約1:2、1:3、1:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95または1:100である。さらに他の態様では、該薬物用量が約5～200 mg/日である。

一部の特定の態様では、対象に対する、化合物および/または組成物の投与は、該化合物および/または組成物の全身投与に関連する有意な有害反応、副作用および/または毒性を引き起こさない。有害反応、副作用および/または毒性の非限定的な例としては、非限定的に、肝毒性（これは、血清トランスアミナーゼレベルおよびビリルビンの上昇によって明示および/または検出され得る）、QT間隔延長およびトルサード・ド・ポアント、出血事象、凝固の低減または妨害、動脈血栓事象、胃腸穿孔または瘻孔、高血圧、甲状腺機能低下症、蛋白尿、下痢、髪色の変化（脱色素化）、悪心、無食欲ならびに嘔吐が挙げられる。

一部の特定の態様では、対象が集中治療室（ICU）で処置を受けている。他の態様では、対象が救急処置室（ER）で処置を受けている。さらに他の態様では、対象が人工呼吸器を使用している。

一部の特定の態様では、対象に、肺線維症および/または急性肺傷害の症状を処置、予防または低減する少なくとも1種類のさらなる剤がさらに投与される。

一部の特定の態様では、対象は哺乳動物である。他の態様では、哺乳動物はヒトである。

本発明により、ALIの処置における薬物の有効性の評価方法をさらに提供する。一部の特定の態様では、該方法は、好中球を薬物と接触させる工程、および該接触後の好中球ROS産生レベルを測定する工程を含む。好中球ROS産生レベルが該接触後に増大しているならば、該薬物はALIの処置に効果がある。

本発明により、ALIを患う対象の処置における薬物の有効性の評価方法をさらに提供する。一部の特定の態様では、該方法は、薬物が投与された後の対象における好中球ROS産生レベルを測定する工程を含む。薬物が投与された後の対象における好中球ROS産生レベルが、薬物が投与される前の対象における好中球ROS産生レベルより高いならば、該薬物は対象のALIの処置に効果がある。

キット
本発明は、パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物、アプリケータおよび使用のための説明資料を含むキットを含む。キットに含められる説明資料は、肺線維症および/または急性肺傷害あるいは本発明において想定される任意の他の疾患または障害を予防または処置するための使用説明書を含む。説明資料には、対象に対して投与されるべきパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物の量および頻度が記載されている。他の態様では、キットは、肺線維症および/または急性肺傷害の症状を処置、予防または低減する少なくとも1種類のさらなる剤をさらに含む。

併用療法
一部の特定の態様では、本発明の化合物が本発明の方法において、肺線維症および/または急性肺傷害の処置または予防に有用な少なくとも1種類のさらなる化合物および/または治療との併用にて有用である。このさらなる化合物には、本明細書において同定される化合物あるいは肺線維症および/または急性肺傷害の症状を処置、予防または低減することが公知の化合物、例えば市販の化合物が包含され得る。

本発明において想定されるさらなる治療の非限定的な例としては、ALI/ARDSの標準治療である低一回換気量での換気が挙げられる。

相乗効果は、例えば、適当な方法、例えば、シグモイド-E_maxの式（Holford＆Scheiner, 19981, Clin. Pharmacokinet. 6: 429-453）、ロエベの加算（Loewe additivity）式（Loewe＆Muischnek, 1926, Arch. Exp. Pathol Pharmacol. 114: 313-326）および半数効果濃度（median-effect）式（Chou＆Talalay, 1984, Adv. Enzyme Regul. 22:27-55）などを用いて計算され得る。上記の各式を実験データに適用し、対応するグラフを作成して薬物併用の効果の評価が補助され得る。上記の式と関連する対応するグラフは、それぞれ、濃度-効果曲線、アイソボログラム曲線および併用係数曲線である。

投与/投薬量/製剤
投与レジメンは、有効量を構成するものに影響を及ぼし得る。治療用製剤は対象に、本発明において想定される疾患または障害の発症の前または後のいずれかに投与され得る。さらに、数回の分割投薬量ならびに時差的投薬量を毎日または逐次投与してもよく、該用量を連続輸注してもよく、ボーラス注射であってもよい。さらに、治療用製剤の投薬量を、治療状況または予防状況の緊急性によって指示されるとおりに比例的に増やしたり減らしたりしてもよい。

本発明の組成物の、患者、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトへの投与は、公知の手順を用いて、本発明において想定される疾患または障害を処置するために有効な投薬量および期間で行なわれ得る。治療効果を得るために必要な治療用化合物の有効量は、患者の疾患または障害の状態; 患者の年齢、性別および体重; ならびに本発明において想定される疾患または障害を処置する治療用化合物の能力などの要素に応じて異なり得る。投薬量レジメンは、最適な治療応答が得られるように調整され得る。例えば、数回の分割用量を毎日投与してもよく、該用量を、治療状況の緊急性によって指示されるとおりに比例的に減らしてもよい。本発明の治療用化合物の有効用量範囲の非限定的な一例は約0.01～5,000 mg/kg体重/日である。当業者であれば、該治療用化合物の有効量に関して必要以上に実験を行なうことなく、関連要素を検討し、決定を行なうことができよう。

本発明の薬学的組成物中の活性成分の実際の投薬量レベルは、具体的な患者、組成物および投与様式で該患者に対して毒性であることなく所望の治療応答が得られるのに有効な活性成分量が得られるように変更され得る。

本発明の化合物の治療有効量または治療有効用量は、患者の年齢、性別および体重、患者の現状の疾病状態ならびに本発明において想定される疾患または障害の進行に依存する。

薬学的組成物の必要とされる有効量は、当技術分野の通常の技能を有する医師、例えば医者または獣医によって容易に決定され、処方され得よう。例えば、医者または獣医であれば、薬学的組成物中に使用される本発明の化合物の用量を、所望の治療効果を得るために必要とされるものより低いレベルで開始し、所望の効果が得られるまで投薬量を漸増することができ得よう。

本発明の化合物の好適な用量は、1日あたり約0.01 mg～約5,000 mg、例えば1日あたり約0.1 mg～約1,000 mg、例えば、約1 mg～約500 mg、例えば約5 mg～約250 mgの範囲であり得る。該用量は単回投薬量で、または反復投薬量、例えば1日あたり1～4回もしくはそれ以上の回数で投与され得る。反復投薬量が使用される場合、各投薬量の量は同じであっても異なっていてもよい。例えば、1日あたり1 mgの用量が0.5 mgの2回用量として、用量間を約12時間間隔にして投与され得る。

投与のための本発明の化合物は約1μg～約10,000 mg、約20μg～約9,500 mg、約40μg～約9,000 mg、約75μg～約8,500 mg、約150μg～約7,500 mg、約200μg～約7,000 mg、約3050μg～約6,000 mg、約500μg～約5,000 mg、約750μg～約4,000 mg、約1 mg～約3,000 mg、約10 mg～約2,500 mg、約20 mg～約2,000 mg、約25 mg～約1,500 mg、約30 mg～約1,000 mg、約40 mg～約900 mg、約50 mg～約800 mg、約60 mg～約750 mg、約70 mg～約600 mg、約80 mg～約500 mg、およびその間の任意のあらゆる整数きざみまたは分数きざみの範囲であり得る。

一部の態様では、本発明の化合物の用量が約1 mg～約2,500 mgである。一部の態様では、本明細書に記載の組成物中に使用される本発明の化合物の用量が約10,000 mg未満、または約8,000 mg未満、または約6,000 mg未満、または約5,000 mg未満、または約3,000 mg未満、または約2,000 mg未満、または約1,000 mg未満、または約500 mg未満、または約200 mg未満、または約50 mg未満である。同様に、一部の態様では、本明細書に記載のような第2の化合物の用量は約1,000 mg未満、または約800 mg未満、または約600 mg未満、または約500 mg未満、または約400 mg未満、または約300 mg未満、または約200 mg未満、または約100 mg未満、または約50 mg未満、または約40 mg未満、または約30 mg未満、または約25 mg未満、または約20 mg未満、または約15 mg未満、または約10 mg未満、または約5 mg未満、または約2 mg未満、または約1 mg未満、または約0.5 mg未満、およびその任意のあらゆる整数きざみまたは分数きざみである。

一部の特定の態様では、本発明の組成物が患者に、1日あたり1～5回の範囲またはそれ以上の投薬量で投与される。別の態様では、本発明の組成物が患者に、非限定的に、毎日、2日毎、3日毎に1回から週1回、および2週毎に1回を含む投薬量範囲で投与される。当業者には、本発明の種々の組合せの組成物の投与頻度は、多くの要素、例えば非限定的に、年齢、処置対象の疾患または障害、性別、全体的な健康状態および他の要素に応じて個体ごとに異なることはすぐにわかるであろう。したがって、本発明はなんら特定の投薬レジメに限定されると解釈されるべきでなく、任意の患者に投与される厳密な投薬量および組成物は、担当医により、患者に関する他のあらゆる要素を考慮して決定される。

1日あたりの化合物の服用量は、非限定的な例において、毎日、1日おき、2日毎、3日毎、4日毎または5日毎に投与され得ることは理解されよう。例えば、1日おきの投与では、1日あたり5 mgの用量が月曜日に開始され、1日あたり5 mgの1回目の後続用量が水曜日に投与され、1日あたり5 mgの2回目の後続用量が金曜日に投与され得る、などである。

患者の状態が改善している場合では、医師の裁量で本発明の阻害薬の投与が任意で連続的に施される; あるいはまた、投与されている薬物の用量が一時的に低減されるか、または一定期間、一時的に停止される（すなわち、「休薬日」）。休薬日の長さは2日間～1年間で任意に変えられ、ほんの一例として、2日間、3日間、4日間、5日間、6日間、7日間、10日間、12日間、15日間、20日間、28日間、35日間、50日間、70日間、100日間、120日間、150日間、180日間、200日間、250日間、280日間、300日間、320日間、350日間または365日間が挙げられる。休薬日の間の用量減少としては10％～100％が挙げられ、ほんの一例として、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％または100％が挙げられる。

患者の病状の改善が起こったら、必要であれば維持用量が投与される。続いて、投薬量または投与頻度または両方が、疾患または障害の関数として、疾患の改善が保持されるレベルまで低減される。一部の特定の態様では、患者は、症状および/または感染の再発があれば、長期ベースの間欠処置が必要とされる。

本発明の方法における使用のための化合物は単位投薬形態に製剤化され得る。用語「単位投薬形態」は、処置を受けている患者に投薬ユニットとして適した物理的に独立した単位をいい、各単位は、所望の治療効果がもたらされるように計算された所定量の活性物質を、任意で適当な薬学的担体とともに含む。単位投薬形態は、単回日用量用であってもよく、反復日用量（例えば、1日あたり約1～4回またはそれ以上）のものであってもよい。反復日用量が使用される場合、単位投薬形態は、各用量について同じであっても異なっていてもよい。

かかる治療レジメンの毒性と治療有効性が任意で細胞培養物または実験動物において測定され、非限定的に、LD₅₀（集団の50％に致死性の用量）およびED₅₀（集団の50％において治療有効性の用量）の測定が挙げられる。毒性効果と治療効果の用量比は治療指数であり、これはLD₅₀とED₅₀の比で示される。細胞培養アッセイおよび動物試験で得られたデータが任意で、ヒトにおける使用ための投薬量範囲の設定に使用される。かかる化合物の投薬量は好ましくは、毒性が最小限のED₅₀を含む循環濃度の範囲内である。投薬量は任意で、使用される投薬形態および使用される投与経路に応じてこの範囲内で変えられる。

一部の特定の態様では、本発明の組成物は、1種類または複数種の薬学的に許容される賦形剤または担体を用いて製剤化される。一部の特定の態様では、本発明の薬学的組成物は治療有効量の本発明の化合物および薬学的に許容される担体を含む。

担体は、例えば、水、エタノール、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコールおよび液状ポリエチレングリコールなど）、その適当な混合物ならびに植物油を含む溶媒または分散媒であり得る。適切な流動性は、例えば、コーティング、例えばレシチンの使用によって、分散剤の場合は必要とされる粒径の維持によって、および界面活性剤の使用によって維持され得る。微生物の作用の抑制は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、例えばパラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによってなされ得る。多くの場合、等張性剤、例えば糖類、塩化ナトリウム、またはポリアルコール、例えばマンニトールおよびソルビトールを組成物中に含めることが好ましい。

一部の特定の態様では、本発明は、治療有効量の本発明の化合物が単独または第2の薬学的剤との組合せで収容された容器; および本発明において想定される疾患または障害の1つまたは複数の症状を処置、予防または低減するために該化合物を使用するための使用説明書を含むパッケージ化された薬学的組成物に関する。

製剤は、任意の適当な投与様式に適した当技術分野で公知の慣用的な賦形剤、すなわち薬学的に許容される有機または無機の担体物質との混合状態で使用され得る。薬学的調製物は滅菌され得、所望により助剤、例えば滑沢剤、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、浸透圧に影響を及ぼすためのバッファー塩、着色、着香および/または芳香物質などと混合され得る。また、所望される場合は、該調製物を他の活性剤、例えば鎮痛剤と合わせてもよい。

任意の本発明の組成物の投与経路としては経鼻、吸入、気管内、肺内および気管支内が挙げられる。

好適な組成物および投薬形態としては、例えば、経鼻または経口投与のための分散剤、懸濁剤、液剤、シロップ剤、顆粒剤、ビーズ剤、散剤、ペレット剤、液体スプレー剤、吸入用の乾燥粉末剤またはエーロゾル化製剤などが挙げられる。本発明において有用であろう製剤および組成物は、本明細書に記載の具体的な製剤および組成物に限定されないことを理解されたい。

本発明の薬学的調製物の粉末化製剤および顆粒状製剤は、公知の方法を用いて調製され得る。かかる製剤は、対象に直接投与され得、例えば、対象への投与に適した物質を形成するために使用され得る。このような製剤には各々、分散化剤または湿潤剤、懸濁化剤および保存料のうちの1種類または複数種がさらに含められ得る。また、さらなる賦形剤、例えば増量剤および甘味、着香または着色剤をこのような製剤に含めてもよい。

本発明の薬学的組成物は、口腔からの経肺投与に適した製剤で調製、パッケージ化または販売され得る。かかる製剤は、活性成分を含み、かつ約0.5～約7ナノメートル、好ましくは約1～約6ナノメートルの範囲の直径を有する乾燥粒子を含み得る。かかる組成物は簡便には、粉末剤を分散させるために噴射剤流が指向され得る乾燥粉末レザーバを備えたデバイスを用いて、または自己噴射性溶媒/粉末剤施薬容器、例えば、密封容器内の低沸点噴射剤中に溶解もしくは懸濁させた活性成分を含むデバイスを用いて投与するための乾燥粉末の形態である。好ましくは、かかる粉末剤は、重量基準で粒子の少なくとも98％が0.5ナノメートルより大きい直径を有し、数基準で粒子の少なくとも95％が7ナノメートルより小さい直径を有する粒子を含む。より好ましくは、重量基準で粒子の少なくとも95％が1ナノメートルより大きい直径を有し、数基準で粒子の少なくとも90％が6ナノメートルより小さい直径を有する。乾燥粉末組成物には好ましくは固形の微粉末希釈剤、例えば糖類を含め、単位用量形態で簡便に提供される。

低沸点噴射剤としては一般的に、大気圧で65°Fより下の沸点を有する液状噴射剤が挙げられる。一般的に、噴射剤は組成物の50～99.9％（w/w）を構成し得、活性成分は組成物の0.1～20％（w/w）を構成し得る。噴射剤にさらなる成分、例えば、液状の非イオン性もしくは固形のアニオン性の界面活性剤または固形の希釈剤（好ましくは、活性成分を含む粒子と同程度の粒径を有するもの）をさらに含めてもよい。

また、肺送達のために製剤化される本発明の薬学的組成物は、活性成分を液剤または懸濁剤の液滴の形態で供給し得る。かかる製剤は、任意で滅菌されており、活性成分を含む水性または希薄なアルコール性の液剤または懸濁剤として調製、パッケージ化または販売され得、任意の噴霧化または霧化デバイスを用いて簡便に投与され得る。かかる製剤には1種類または複数種のさらなる成分、例えば非限定的に、着香剤、例えばサッカリンナトリウム、揮発油、緩衝剤、表面活性剤または保存料、例えばヒドロキシ安息香酸メチルがさらに含められ得る。この投与経路によって供給される液滴は、好ましくは約0.1～約200ナノメートルの範囲の平均直径を有する。

本発明の薬学的組成物は、吸入器、例えば米国特許第8,333,192号（これは参照によりその全体が本明細書に組み入れられる）に記載のものを用いて送達され得る。

一部の特定の態様では、本発明の組成物が、レボチロキシンナトリウム水和物; ラクトースH₂O、ゼラチンおよびトウモロコシデンプンを含むラクトース粒子; デンプングリコール酸ナトリウム; ステアリン酸マグネシウム; ならびに精製タルクとコロイド状二酸化ケイ素を含むケイ化タルクを含む安定な乾燥粉末ブレンドを含む。他の態様では、該乾燥粉末が、該乾燥粉末100 mgあたり4～0.02 mgの量のレボチロキシンナトリウムを含む。さらに他の態様では、該乾燥粉末が、該乾燥粉末調製物100 mgあたり90 mgより多い量のラクトースを含む。さらに他の態様では、該乾燥粉末が、ラクトースH₂O、ゼラチンおよびトウモロコシデンプンからなるラクトース粒子を含み、ここで: 「ラクトースH₂O」:「ゼラチン」:「トウモロコシデンプン」の重量-mg基準での比は55～75:0.20～0.80:20～40である。さらに他の態様では、該乾燥粉末が、乾燥粉末100 mgあたり4～8 mgの量のデンプングリコール酸ナトリウムを含む。さらに他の態様では、該乾燥粉末が、乾燥粉末100 mgあたり0.5～2 mgの量のステアリン酸マグネシウムを含む。さらに他の態様では、該乾燥粉末が、乾燥粉末100 mgあたり2 mgの量のケイ化タルクを含み、ここで、ケイ化タルクは、精製タルクとコロイド状二酸化ケイ素を、2 mgのケイ化タルクに対して精製タルクが0.667 mgおよびコロイド状二酸化ケイ素が1.333 mgの量で含む。さらに他の態様では、該ブレンドがレーキをさらに含む。さらに他の態様では、該乾燥粉末が、乾燥粉末100 mgあたり5～6 mgの量のデンプングリコール酸ナトリウムを含む。さらに他の態様では、該乾燥粉末が、乾燥粉末100 mgあたり1 mgの量のステアリン酸マグネシウムを含む。

肺送達に有用である本明細書に記載の製剤はまた、本発明の薬学的組成物の鼻腔内送達にも有用である。

鼻腔内投与に適した別の製剤は、活性成分を含み、かつ約0.2～500マイクロメートル平均粒子を有する粗粉末である。かかる製剤は、鼻から吸い込む様式で、すなわち、鼻孔近くに保持した該粉末の容器から鼻道を通る急速吸入によって投与される。経鼻投与に適した製剤には、例えば、約0.1％（w/w）という少量から100％（w/w）という多量にわたる活性成分が含まれ得、1種類または複数種の本明細書に記載の該さらなる成分がさらに含まれ得る。

さらなる投与形態
本発明のさらなる投薬形態としては、米国特許第6,340,475号; 同第6,488,962号; 同第6,451,808号; 同第5,972,389号; 同第5,582,837号; および同第5,007,790号に記載のような投薬形態が挙げられる。また、本発明のさらなる投薬形態としては、米国特許出願公開第2003/0147952号; 同第2003/0104062号; 同第2003/0104053号; 同第2003/0044466号; 同第2003/0039688号; および同第2002/0051820号に記載のような投薬形態も挙げられる。また、本発明のさらなる投薬形態としては、国際公開第03/35041号; 同第03/35040号; 同第03/35029号; 同第03/35177号; 同第03/35039号; 同第02/96404号; 同第02/32416号; 同第01/97783号; 同第01/56544号; 同第01/32217号; 同第98/55107号; 同第98/11879号; 同第97/47285号; 同第93/18755号; および同第90/11757号に記載のような投薬形態も挙げられる。

制御放出製剤および薬物送達システム
一部の特定の態様では、本発明の製剤は、非限定的に、短期間用、急速オフセット型（rapid-offset）ならびに制御型、例えば、徐放、遅延放出および脈動放出製剤であり得る。

徐放という用語はその慣用的な意味で用いており、長期間にわたって薬物の緩徐な放出をもたらし、必ずしもそうでなくてもよいが長期間にわたって実質的に一定の血中薬物レベルをもたらし得る薬物製剤をいう。該期間は1ヶ月間またはそれ以上という長期間であり得、ボーラス形態で投与される同量の剤のものより長い放出であるはずである。

徐放のためには、化合物は、該化合物に徐放特性をもたらす適当なポリマーまたは疎水性物質を用いて製剤化され得る。そのため、本発明の方法での使用のための該化合物は、微粒子の形態で例えば注射によって、またはウェハもしくはディスクの形態で埋め込みによって投与され得る。

本発明の一部の特定の態様では、本発明の化合物が患者に、単独または別の薬学的剤との組合せで徐放製剤を用いて投与される。

遅延放出という用語は本明細書においてその慣用的な意味で用いており、薬物投与後、いくらかの遅延後に薬物の初期放出をもたらし、必ずしもそうでなくてもよいが約10分間～最大約12時間の遅延を含み得る薬物製剤をいう。

脈動放出という用語は本明細書においてその慣用的な意味で用いており、薬物投与後、パルス状の血漿薬物プロフィールが生じるような様式での薬物の放出をもたらす薬物製剤をいう。

即放という用語はその慣用的な意味で用いており、薬物投与の直後に薬物の放出をもたらす薬物製剤をいう。

本明細書で用いる場合、短期間は、薬物投与後薬物投与後約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分間、約20分間または約10分間まで、およびそのいずれかまたはあらゆる整数きざみまたは分数きざみを含む任意の期間をいう。

本明細書で用いる場合、急速オフセットは、薬物投与後約8時間、約7時間、約6時間、約5時間、約4時間、約3時間、約2時間、約1時間、約40分間、約20分間または約10分間まで、およびその任意のあらゆる整数きざみまたは分数きざみを含む任意の期間をいう。

当業者は、常套的な範囲内の実験手法を用いて、本明細書に記載の具体的な手順、態様、特許請求の範囲および実施例の数多くの均等物を認識し、確認することができよう。かかる均等物は、本発明の範囲内であるとみなされ、添付の特許請求の範囲に包含された。例えば、当技術分野で認知された択一法を用い、常套的な範囲内の実験手法を用いる反応条件および/または処置条件の改良は本出願の範囲内であると理解されたい。

本明細書において値および範囲を示している場合はいつでも、このような値および範囲に包含されるすべての値および範囲が本発明の範囲内に包含されていることを意図していることを理解されたい。さらに、このような範囲に含まれるすべての値ならびに値の範囲の上下限値もまた本出願によって想定される。

以下の実施例は本発明の局面をさらに示す。しかしながら、この実施例は、決して本明細書に示した本発明の教示または開示の限定ではない。

次に、本発明を以下の実施例に関して説明する。本実施例は例示の目的で示したものにすぎず、決して本発明が本実施例に限定されると解釈されるべきでなく、本明細書に示した教示の結果、明らかとなる任意のあらゆる変形例を包含していると解釈されたい。

方法:
材料
以下の試薬: N-ホルミル-L-メチオニル-L-ロイシル-L-フェニルアラニン（fMLP）、13-酢酸12-ミリスチン酸ホルボール（PMA）、リポ多糖（LPS）、ブチルヒドロキシアニソール（BHA）、リゾレシチン、パラホルムアルデヒド（PFA）、FITCアルブミン、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP）およびイソルミノールはSigmaから購入したパーコールはGE Healthcare（Uppsala, Sweden）から購入し、ウシ血清アルブミン（BSA）はAmerican Bio（Natick, MA）から購入し、GMCSFはPeprotechから購入し、リポフェクタミンキットおよび細胞トレース色素はThermo Fisherから購入した。以下の材料: ダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）、ハンクス緩衝塩溶液（HBSS）、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）はGIBCOから購入した。

本試験で使用した市販の抗体は: GST抗体（2624, Cellシグナル伝達）、His抗体（2366, Cell Signaling）、HA抗体（MMS-101R, Covance）、Myc抗体（MMS-150R, Covance）、抗ホスホ-AKT抗体（4060および2965, Cell Signaling）、抗AKT抗体（9272, Cell Signaling）、抗MEKK3抗体（5727, Cell Signaling）、抗p47^phox抗体（17875, Santa Cruz）、抗CD31抗体（102502, BioLegend）、抗α-平滑筋アクチン抗体（ab8211, Abcam）、および抗β-アクチン抗体（4967, Cell Signaling）である。ウサギポリクローナル抗S208 p47^phoxはAbiocodeから取得した。プロテインA/g PLUS-アガロースビーズはSant Cruz Biotechnology（Santa Cruz, CA）から購入した。サイトカイン測定のためのELISAキットはeBioscience（San Diego, CA）から購入した。MAP3K3およびp67^phoxのcDNAはADDGENEから、p47^phoxおよびgp91^phoxのcDNAはOpen Biosystemsから取得した。

マウス
MEKK2^-/-マウスは以前にGuo, et al., 2002, Mol. Cell Biol. 22:5761-5768に報告され、一方、MEKK3^fl/flマウスはWang, et al., 2009, J. Immunol. 182:3597-3608に報告された。MEKK2^-/-およびMEKK3^fl/flはどちらもC57Blバックグラウンドである。骨髄系細胞特異的MEKK3 KOマウスMEKK3^m/mを、MEKK3^fl/flマウスはJackson LabのB6.129-Lyzs^{tm1（cre）Ifo}/Jマウスと相互交配することにより作出した。ダブルノックアウト（DKO）マウスMEKK2^-/-MEKK3^m/mは、MEKK2^-/-マウスをMEKK3^m/mマウスと相互交配することにより作出した。野生型（WT）マウスC57BL6はTaconic laboratories（Germantown, NY）から購入した。BHA（W218308, Sigma-Aldrich）含有飼料（0.75％ w/w BHA）は、Harlan Laboratoriesによる2018S飼料からの特注であり、放射線照射によって滅菌した。

好中球の調製およびトランスフェクション
マウスをCO₂チャンバー内で承認済みプロトコルに従って安楽死させ、骨髄をマウスの長骨から採取し、赤血球（RBC）を、ACKバッファー（155 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃および127μM EDTA）を用いて溶解させ、細胞を、81％、62％および45％のパーコール層で構成された不連続パーコール勾配に重層し、細胞を81％パーコール層と62％パーコール層の間の中間相から単離した。細胞をHBSS中で洗浄し、種々のアッセイに使用した。

好中球のトランスフェクションのため、好中球（3×10⁶細胞/100μl）および最大1.6μgのDNAを、供給されたヌクレオフェクション溶液中に懸濁させ、Nucleofectorデバイス2b（Lonza, Switzerland）内でエレクトロポレーションした。次いで試料を一晩、培地（RPMI 1640、10％ FBS（V/V）、GMCSF 25ng/ml）中で37℃にて、5％CO₂を含む加湿空気中で培養した。

ダンチャンバー走化性アッセイ
WT（Cell Trace Calcein Red-Orange色素で染色）およびDKO好中球（1.25×10⁶細胞/ml）をアッセイバッファー（Ca^2＋およびMg^2＋を有するHBSS中0.25％のBSA）中に懸濁させ、逆も同様にした。次いで細胞アリコートを15分間、フィブリノゲンコートカバースリップ上に接着させ、カバースリップを、内側ウェル内にアッセイバッファーおよび外側ウェル内にfMLP（10μM）を有するDunn Chamber上で裏返し、コマ撮り画像を30秒間隔で30分間、Olympus BX61顕微鏡下で記録した。細胞トラッキングを、Konstandin, et al., 2006, J. Immunol. Meth. 310:67-77に報告されているとおりに解析した。

インテグリン発現アッセイ
骨髄由来好中球をフローサイトメトリーバッファー（1％のBSAを含むPBS）中に再懸濁させ、fMLP（5μM）で指示された期間刺激し、4％PFAで固定し、次いで、FITC標識抗LFA-1または抗Mac-1で染色した。試料をBD LSR IIフローサイトメーターによって解析した。

ICAM-1結合アッセイ
このアッセイは、Wang, et al., 2008, J. Clin. Invest. 118:195-204に記載のようにして行なった。ICAM-1-Fc-F（ab'）2複合体を、Cy5コンジュゲートAffiniPureヤギ抗ヒトFcγ断片特異的IgG F（ab'）2断片（Jackson Immunobiology）およびICAM-1-Fc（100μg/ml, R＆D）を4℃で30分間、PBS中にてインキュベートすることにより作製した。0.5％のBSA、0.5 mMのMg^2＋および0.9 mMのCa^2＋を含むPBS中に0.5×10⁶細胞/mlで再懸濁させた好中球をICAM-1-Fc-F（ab'）2複合体と、fMLPの存在下または非存在下で、図の説明に明記した期間、混合した。反応は、4％パラホルムアルデヒドを添加することにより停止させた。5分後、3-mlの氷冷FACSバッファーを添加することにより固定を停止させた。細胞をペレット化し、300μlのFACSバッファー中に再懸濁させ、フローサイトメーターで解析した。

炎症腹膜内への好中球浸潤およびフローチャンバー接着アッセイ
腹膜炎浸潤モデルのため、精製した野生型および変異型の好中球を、それぞれ、2.5μMのCFSE［5-（および-6）-カルボキシフルオレセインジアセタートスクシンイミジルエステル］および2.5μMのFar-Red DDAO SEで標識し、逆も同様にした。異なる蛍光標識を有するWTおよび変異型の細胞を1:1の比で混合し、2時間前に2 mlの3％のチオグリコレート（TG）を注射した野生型同腹仔の後眼窩静脈叢内に注射した。マウスを1時間半後に安楽死させた。腹膜内の細胞を収集し、細胞計数およびフローサイトメトリーによって解析した。示したデータは、レシプロカル（reciprocal）蛍光標識での実験と合わせたものである。

剪断応力下での内皮細胞への好中球接着を調べるため、マウス内皮細胞（Wang, et al., 2008, J. Clin. Invest. 118:195-204）を、10μg/mlのフィブロネクチンコートカバースリップ上でコンフルエンシーまで培養し、50 ng/mlのTNFαで4時間処理した。内皮細胞層を含むカバースリップをPBSで洗浄し、フローチャンバー装置（GlycoTech）内に入れた。本明細書の別の箇所に記載したとおりに異なる蛍光標識で標識したWTおよび変異型の細胞を1:1の比で混合し、チャンバー内に1 dyn/cm²の剪断流速で流した。次いで接着細胞を蛍光顕微鏡下で検査し、計数した。

ROS放出アッセイ
好中球を反応混合物（Ca^2＋およびMg^2＋を有するHBSS中0.25％のBSA、10 mMイソルミノール、100μ/ml HRP）中に懸濁させ、96ウェルプレートのウェル内に細胞を分配し、fMLP（10μM）で刺激した。イソルミノール増強化学発光をプレートリーダー（Perkin Elmer）で連続的に記録した。COS-7細胞内のROS産生系の回復のため、PMA（2μM）を刺激に使用した。

好中球脱顆粒アッセイ
100万個の好中球を10μMのCBとともに37℃で5分間インキュベートした後、fMLP（500 nM）でさらに10分間刺激した。氷上に置くことにより反応を停止させ、この懸濁液を500×gで4℃にて5分間、遠心分離した。上清みをMPOおよびMMPの含有量について、それぞれ、EnzChek Myeloperoxidase Activity Assay KitおよびEnzChek Gelatinase/Collagenase Assayキット（Life Technologies, Grand Island, NY）を用いてアッセイした（Li, et al., 2009, Blood 113:4930-4941; Lee, et al., 2007, Am. J. Physiol. Lung Cell. Mol. Physiol. 292:L799-812）。

LPS誘発性肺傷害
マウスをケタミン/キシラジン（1 gm/kgおよび100 mg/kg）で麻酔し、鼻孔上に液滴として置いた50μlのLPS（1 mg/ml）を吸入させた。マウスの姿勢を直立に維持した。傷害の誘導後22時間目、100μlのFITC標識アルブミン（10 mg/ml）を後眼窩静脈から注射し、傷害の誘導後24時間目、マウスを放血によって安楽死させた。気管支肺胞洗浄液を得るため、1 mlのPBSを肺内に滴下し、気管支内カテーテルによって回収した。一部の実験では、マウスにまず、抗酸化剤BHA含有飼料（Harlan Laboratory Services）を7日間摂食させた後、肺傷害の誘導を行なった。

酸誤嚥誘発性肺傷害
マウスをケタミン/キシラジン（1 gm/kgおよび100 mg/kg）によって麻酔し、経口気管内滴下のために特注した台上で、切歯から垂直に吊るした。22Gカテーテル（Jelco, Smiths Medical）を声帯の1.5 cm下にガイドし、2.5μl/gの0.05 M HClを滴下した。傷害誘導後2時間目、100μlのFITC標識アルブミン（10 mg/ml）を後眼窩静脈から注射した。測定は傷害誘導後6時間目に行なった。対照動物には、HClの代わりに生理食塩水を同じ様式で与えた。生存実験では、マウスに2.5μl/gの0.1 M HClを経口気管内投与し、観察期間は最大30時間にまで及んだ。薬理学的介入を調べるため、MEKK2/3阻害薬パゾパニブをHCl滴下後1時間目に使用した。

GSTプルダウンアッセイ
組換えタンパク質を大腸菌内で発現させ、アフィニティクロマトグラフィーによって精製した。次いでこのタンパク質を200μlの結合バッファー（10 mM HEPES pH 7.4、150 mM NaCl、1% Triton、0.12％ SDS、1 mMジチオトレイトール、10％グリセロール、1×プロテアーゼ阻害薬カクテル）中で4℃にて一晩、シェーカー上でインキュベートした。翌朝、グルタチオンビーズをこのタンパク質混合物にさらに2時間添加した。充分に洗浄した後、ビーズ上のタンパク質をSDS/PAGEによって分離し、ウエスタンブロットによって検出した。

MAP3K3キナーゼアッセイ
50μlの反応バッファー（100 mM Tris-HCl pH 7.4、50 mM EGTA、100 mM MgCl₂）中で、100 ngの組換えMAP3K3を、免疫沈降基質タンパク質、［γ-³³P］-ATP（10μCi）および冷ATP（50μM）とともに37℃で30分間インキュベートした。SDSローディングバッファーを添加することにより反応を停止させた。試料を5分間煮沸した。タンパク質をSDS-PAGEによって分離し、ホスホイメージャーによって可視化して定量した。

養子骨髄移入
骨髄をWTおよびDKOのドナーマウスの長骨から採取し、RBCをACKバッファー（155 mM NH₄Cl、10 mM KHCO₃および127μM EDTA）を用いて溶解させ、細胞を、滅菌した通常生理食塩水中に懸濁させ、放射線照射した（9.5グレイ, γ放射線）レシピエントWTマウスに静脈内注射した（5×10⁶細胞/マウス）。マウスには、オートクレーブ処理した飼料と、スルファトリム（Sulfatrim）含有水（48 mg/ml）を4週間与えた。これらのマウス（HS-DKOおよびWT対照）を、移植後8週目に実験目的に使用した。

ヒト好中球
ヒト血液試料のバフィーコートを、EasySep Human Neutrophil Enrichment Kit（Stemcell Technologies）を製造業者のプロトコルに従って用いて好中球富化に供した。簡単には、枯渇抗体カクテルをバフィーコートと混合した後、磁気粒子とともにインキュベーションした。次いで、EasySep Magnetを使用し、無標識好中球を別のコニカルチューブ内に注入しつつ、不要な細胞を固定化した。富化された好中球をペレット化し、ROS産生アッセイ用のアッセイバッファー（Ca^2＋およびMg^2＋を含むハンクスバッファー、0.25％のBSA）中に再懸濁させた。

内皮細胞との好中球の二層共培養
マウス内皮細胞（MEFC; Paik, et al., 2004, Genes Dev. 18:2392-2403）をまず、Transwellインサート（24ウェル型、0.4-μm孔径, Corning, Inc. 353095）のポリカーボネート膜の外側にプレーティングし（25,000細胞/cm²）、培養プレートのウェル内に上下逆にして入れた。内皮細胞が接着したら、Transwellインサートを反転させ、プレートのウェル内に再挿入した。播種後24時間目に培地を無血清培地に交換した。SOD（60 U/ml）、カタラーゼ（100 U/ml）またはモックを下側チャンバーに、2時間後に30分間添加した。次いで、5μMのfMLPで刺激したマウス好中球をインサートの上面に30分間プレーティングした（6×10⁶細胞/cm²）。インキュベーション期間の終了時、インサートの上側の好中球を削り取り、インサートの他方側の内皮細胞を、ウエスタン解析のためにSDS-PAGE試料バッファーを用いて溶解させた。

経内皮電気抵抗（TEER）の測定
ECIS 8W10E＋アレイ（Applied BioPhysics）を10μg/mlのポリ-D-リシン（PDL）でコートし、滅菌水で洗浄した。完全EBM-2培地（300μl）を各ウェルに添加し、速やかにバックグラウンドインピーダンスを確認した。続いて、不死化マウス肺内皮細胞（Murata, et al., 2007, J. Biol. Chem. 282:16631-16643）を、60,000細胞/ウェルの密度でコートアレイ内の300μlのEBM-2培地中に播種し、これを37℃にてCO₂インキュベータ内でインキュベートした。細胞層の電気抵抗をECISシステム（Applied BioPhysics）で、およそ600～700オームの安定な抵抗値が得られるまで連続的に記録し、その後、培地をウェルから除去し、100μlのアッセイバッファー（Ca^2＋およびMg^2＋を含むハンクスバッファー、0.25％のBSA）に交換した。細胞を37℃で2時間、再平衡化させた後、1μlのSOD（60 U/ml）、カタラーゼ（100 U/ml）またはモックをウェルに30分間添加し、続いて、50μlのマウス好中球を（5μMのfMLP含有アッセイバッファー中）を添加した。データは、実験全体を通してリアルタイムで収集した。ECIS測定値はすべて、全周波数範囲（1 kHz～64 kHz）にわたる周波数スキャンによりこの細胞型に対して最も感度のよい周波数であると確認された4 kHzのAC周波数で解析した。TEER値を、モックで処理したWT好中球と共培養したものに対して正規化した。

統計法
データは、Prismソフトウェアを用いて解析した。2つの試料では、t検定を使用し; 複数の試料では、ANOVAを使用し、＜0.05であるp値を有意とした。

実施例1: MAP3K2/3欠損によりLPS誘発性肺傷害が軽快する
遺伝子発現解析により、MAP3K3遺伝子はヒト骨髄系の細胞において特異的に発現されることが示されている（www dot biogps dot org）。また、その発現は、内毒素を吸入したヒト対象の肺滲出液由来の好中球において下方調節されている。急性肺傷害における好中球の重要性のため、骨髄系細胞機能および急性肺傷害におけるMAP3K3の役割を、マウス急性肺傷害（ALI）モデルを用いて調べた。

マウスにおいて、Map3k3遺伝子を種々の造血細胞において大量に発現させると、その発現は骨髄系の細胞において最も高い（www dot immgen dot org）。Map3k3の骨髄系特異的ノックアウト（KO）を、Map3k3^fl/flマウスとリゾチーム-Creマウスを交配することにより作出した。しかしながら、Map3k3欠損では有意な好中球または肺傷害表現型は観察されなかった。なんら理論に限定されることを望まないが、MAP3K3機能は、同様にマウス骨髄系の細胞において発現され（www dot immgen dot org）、MAP3K3と同様、ウエスタン解析によって好中球において容易に検出され得る（図1A）その近縁ホモログMAP3K2によって代償されるのかもしれない。

したがって、両方のキナーゼを不活性化し、続いて、完全（global）MAP3K2ノックアウト（KO）および骨髄系特異的MAP3K3 KOマウス系統（DKO）を、Map3k2^-/-マウスを骨髄系特異的Map3k3^-/-マウスと交配することにより作出した。非造血細胞由来のMAP3K2の寄与を限定的にするため、致死量の放射線を照射した野生型（WT）レシピエントマウスに対してDKO骨髄（BM）の養子移入を行なった。得られたマウスをHS-DKOと表示する。ウエスタン解析は、HS-DKOマウスから単離された好中球におけるMAP3K2およびMAP3K3タンパク質の欠乏を示す（図1A）。

HS-DKOマウスをLPS誘発性肺傷害に供した。このマウスモデルはヒトALIの顕著な特徴、例えば、肺胞腔内への好中球の流入、肺水腫、肺透過性の亢進（図8A）および高い死亡率を再現する。HS-DKOマウスおよび対照WTマウス（これはWT BM移入を受けた）をLPSで経鼻滴下によって処置した場合、透過性、水腫および肺胞壁の肥厚の低減によって明示されるように（図1B～1D）、HS-DKOマウスでは、野生型（WT）対照マウスと比べて肺傷害の有意な低減が持続した。また、HS-DKOマウスは、WT対照マウスと比べて低い死亡率を示した（図1E）。同じ結果が、HCl-ALIモデルを使用した場合でも観察された; MEKK2/3がないことにより、肺の透過性および損傷が低減され、生存が長くなった（図1F～1H）。HS-DKOとWT対照のマウス間で気管支肺胞洗浄液（BALF）中の骨髄系細胞数に有意差はなかった（図8B～8D）。また、BALF中のTNFα、IL-1βまたはIL-6の含有量にも有意差はなかった（図8E）。HClモデルを使用した場合もBALF中の骨髄系浸潤またはIL-1bレベルに差は観察されなかった（図8F～J）。総合すると、このような結果は、骨髄系細胞内のMAP3K3および造血細胞内のMAP3K2がないことは、傷害された肺において、骨髄系浸潤またはサイトカイン産生ではなく肺透過性に大きく影響することを示唆する。

実施例2: MAP3K2/3欠損は好中球のROS放出を特異的に改変する
MAP3K2/3欠損によりBALF中への好中球浸潤に対する効果がないことと整合して、この欠損は、インビトロで好中球の走化性に影響しなかった（図2A～2D）。これは、内皮細胞に対する好中球接着（図2E）にも、β2インテグリンの発現または活性化（図2F～2H）にも影響しなかった。また、好中球浸潤インビボ試験用モデルの炎症腹膜への浸潤においてもWTまたはMAP3K2/3欠損の好中球間に差はみられなかった（図2I）。また、MAP3K2/3欠損によって好中球脱顆粒は改変されなかった（図2J～2K）。しかしながら、MAP3K2/3欠損により、刺激を受けたときに好中球によるROSの産生増大がもたらされた（図3A）。MAP3K2/3欠損好中球における、WT MAP3K3の発現では、ROS放出が抑制され得たが、キナーゼデッドMAP3K3の発現では抑制されず、ROS放出の調節におけるMAP3K3の関与が確認された（図3B）。この結果はまた、MAP3K3調節型ROS放出がそのキナーゼ活性に依存性であることも示す。マウスに、ROSスカベンジャーであるブチルヒドロキシアニソール（BHA）を摂食させてLPS誘発性傷害に供した場合、透過性および水腫の消散におけるHS-DKOとWT対照のマウス間の差（図3C～3E）は、MAP3K2/3欠損の防御的役割がROSに依存することを示唆する。

また、好中球からのROS放出に対する個々のMAP3K2 KOおよびMAP3K3 KOの効果も調べた。MAP3K3 KOではROS放出の増大傾向が示され、一方、MAP3K2 KOは有意な効果を有しなかった（図9A～9B）。このような結果により、この2つのキナーゼが実際に機能的に重複していることが確認される。

実施例3: MAP3K3はp47^phoxをリン酸化してROS産生を阻害する
食作用性NADPHオキシダーゼが好中球におけるROS産生の主な原因であることを考慮し、MAP3K3がこの酵素複合体を介して作用するのかどうかを試験した。最初に、NADPHオキシダーゼがMAP3K3の基質なのかどうかを調べた。MAP3K3とNADPHオキシダーゼのいくつかのサブユニットの組換えタンパク質を作製し、インビトロキナーゼアッセイを行なった。p47^phoxのみがMAP3K3によってリン酸化され得たがp22^phoxまたはp67^phoxはリン酸化されなかった（図4A）。MAP3K3のリン酸化部位のコンセンサス配列はわかっていないが、p47^phoxの配列を、関連キナーゼMAP3K5の報告されたペプチドアレイデータを用いて実行されるプログラムScansiteを用いて解析し、おそらくリン酸化部位であると同定された。この解析により、以前に観察されたものの中でSer-208が最高スコアの部位であると予測された（Obenauer, et al., 2003, Nucleic Acids Res. 31:3635-3641）。この部位を変異させた場合、MAP3K3媒介性リン酸化が有意に低減され（図4B）、この残基が実際にMAP3K3によってリン酸化され得ることが示された。

次に、NDAPHオキシダーゼの活性に対するこのリン酸化の効果を評価した。COS-7細胞におけるNADPHオキシダーゼ活性を、NADPHオキシダーゼサブユニットp47^phox、p67^phox、p40^phox、NOX2およびp22^phoxを発現させることにより再構築した（Price, et al., 2002, Blood 99:2653-2661）。これらのタンパク質は、COS-7細胞において発現されないか、または発現が不充分であるかのいずれかである。PMAを添加すると再構築COS-7細胞からのROS産生を検出することができ、このROS産生はp47^phoxの外因性発現に完全に依存性である（図10A～10B）。この系ではWT MAP3K3の発現によってROS産生が阻害されたが、そのキナーゼデッド変異型では阻害されなかった（図10C）。したがって、MAP3K3によって阻害され得るROS産生系が、好中球で起こるものと同様に再構築された。再構築されたこの系においてWTの代わりにホスホ-模倣性p47^phox S208E変異型を使用した場合、WT p47^phoxと比べてROS産生が非常に少なくなった（図4C）。非リン酸化性S208A p47^phox変異型は、対照的に、ROS再構築アッセイにおいてWT p47^phoxと同様の活性を示した（図4C）。さらに、MAP3K3の発現によってWT p47^phox発現細胞におけるROS産生は阻害されたが、非リン酸化性S208A p47^phoxを発現するものでは阻害されなかった（図4D）。このような結果は、総合すると、p47^phoxのS208のMAP3K3媒介性リン酸化によってNADPHオキシダーゼ活性が阻害されることを示す。

Ser-208は、NADPHオキシダーゼ複合体の活性化の際のp22^phoxとの相互作用に関与するp47^phoxの2つのSH3ドメイン間に存在するため（図10D）、非限定的な一部の特定の態様では、Ser-208のリン酸化が、NADPHオキシダーゼ活性化の極めて重要なステップであるこの相互作用に干渉することがあり得る。実際、リン酸化模倣Ser-208のGluへの変異により、共免疫沈降アッセイにおいてp47^phoxとp22^phoxとの相互作用が無効になった（図4E）。

実施例4: p47^phoxのSer-208が好中球においてリン酸化される
p47^phoxが好中球においてMAP3K2/3によってリン酸化されるかどうかを検出するため、p47^phoxのリン酸化Ser-208に特異的な抗体を作製した。バリデーションアッセイにより、アラニンへのSer-208の変異によって該抗体による検出が顕著に減弱されるため、この抗体はSer-208-リン酸化p47^phoxに対する特異性が大きいことが示されている（図11A～11G）。この抗体を使用し、本発明者らは、Ser-208におけるp47^phoxリン酸化の時間依存性増大を検出した（図4F）。p47phoxリン酸化のfMLP刺激性増大の時間的推移は、Ser-473におけるAKTリン酸化のものと整合する（図4F）。また、その活性化を反映し得るMAP3K3タンパク質の存在量の増加を観察した。この抗体によって検出されるp47phoxリン酸化のfMLP誘発性増大は、MAP3K2/3がない好中球では観察されず（図4G）、fMLPは、p47phoxのSer-208のリン酸化をMAP3K2/3を介して誘導することが示唆された。なんら理論に限定されることを望まないが、DKO好中球において該抗体によって検出されたバンドは、該抗体による非リン酸化p47phoxまたは他のプロテインキナーゼによるSer-208の基底のリン酸化のいずれかの検出を反映しているのかもしれない。

インビトロキナーゼアッセイを行ない、パゾパニブによるMEKK2および3の阻害のIC₅₀を調べた。パゾパニブはMEKK3を約10 nMのIC₅₀で阻害し、MEKK2を20 nMのIC₅₀で阻害した（図4H～4I）。これらの値は、唯一公表されているMEKK2/3の基質MEK5のIC₅₀（＞1μM）よりずっと低い（図4J～4K）。

実施例5: パゾパニブはMAP3K2/3を阻害し、肺傷害を低減させる
パゾパニブは、標的化がん療法のためのFDA承認薬である。これは、いくつかの受容体型チロシンキナーゼ、例えば、VEGF、FGF、PDGFおよびSCFの受容体を阻害する（Keisner＆Shah, 2011, Drugs 71:443-454）。また、これはMAP3K2も、その意図された本来の標的と同等の効力で阻害する（Ahmad, et al., 2013, J. Biomol. Screen. 18:388-399）。パゾパニブを好中球において試験し、ホスホ特異的抗体によって検出されるSer-208におけるp47^phoxリン酸化を阻害することがわかった（図5A）。また、パゾパニブは、fMLPによって誘導されるMAP3K3タンパク質含有量の増加も消失させた（図5A）。MAP3K3は自己リン酸化によって活性化されるため、この結果は、MAP3K3の安定化がその活性化の結果であり得るという着想と整合し、パゾパニブがMAP3Kを介して作用することがさらに確認される。WTマウス好中球をパゾパニブで処理するとROS産生の増大がもたらされたが（図5B）、MAP3K2/3欠損マウス好中球ではもたらされず（図5C）、パゾパニブがROS産生をMAP3K2/3によって増大させることが示された。また、パゾパニブは、ヒト好中球によるROS産生も増大させた（図12A～12B）。LPS誘発性傷害に供したWTマウスにパゾパニブを摂取させた。MAP3K2/3 HS-DKOと同様、パゾパニブ処置により肺透過性（図5D）、肺胞壁の肥厚、および水腫（図5E）の低下が示された。より重要なことには、パゾパニブ処置により、予防的（図5F）または治療的（図12E）モダリティにおいて死亡率が低下した。予防的処置では、パゾパニブを肺傷害の2日前に投与し、一方、薬物は該傷害後24時間目に投与した。

酸誤嚥によって誘導した急性肺傷害の別のモデルを使用した。酸誤嚥誘発性ALIは、誤嚥性肺炎としても知られ、胃の酸分の肺内誤嚥により生じる。これは、意識障害（例えば、薬物の過剰投与、痙攣、脳血管発作、鎮静、麻酔処置）を有する患者に高頻度に起こり、麻酔関連の全死亡例の最大30％を占める。この誤嚥誘発性ALIモデルでは、パゾパニブ処置により肺透過性（図12F）、肺胞壁の肥厚、および水腫（図12G）が減少した。また、該処置によって生存が有意に長くなった（図12H）。したがって、このようなデータは、総合すると、パゾパニブがMAP3K2/3を阻害し、2つの異なるALIモデルにおいて有効な処置をもたらすことを明白に実証する。

また、HClモデルにおけるパゾパニブの予防効果も試験した。パゾパニブは、透過性の低下および生存の延長において有効であった（図12I～12J）。

また、別のチロシンキナーゼ阻害薬イマチニブも試験し、HCl誘発性肺傷害における肺透過性の低減に有効であることがわかった（図17）。この結果は、パゾパニブの本記載の有益な効果が、他のチロシンキナーゼ阻害薬には共有されていないことを示す。

実施例6: パゾパニブは、VEGFRではなくMEKK2/3、p47によって肺傷害を軽快させる
図12C～12Dは、パゾパニブが、これらのキナーゼがないマウスの肺傷害に対して効果を有しなかったため、この薬物がMEKK2/3によって肺傷害を軽快させるという所見を示す。また、パゾパニブは、好中球におけるROS産生のカギとなるサブユニットのp47^phoxがないマウスにおいて効果を示さなかった（図16Cおよび16E）。p47^phoxがないマウスの方が肺傷害に易罹患性であるという事実（図16A～16Bおよび16D）は、好中球ROSが肺傷害において防御的であるという所見と整合する。

また、パゾパニブはVEGFRも阻害する。中和性抗VEGFR抗体の効果を本モデルにおいて試験し、肺傷害に供したマウスの生存に効果を示さなかった（図15）。したがって、パゾパニブのVEGFR阻害は肺傷害の軽快に重要な役割を果たしていない。

実施例7: MAPK2/3阻害により肺AKT活性化が増大する
AKTシグナル伝達は、ALIのマウスモデルにおいて、毛細管漏出を抑制し、肺胞液を除去することにより防御的役割を有する。さらに、ROSは、内皮細胞におけるAKT活性化を刺激して血管バリアの完全性を強化する。したがって、Ser-473におけるAKTリン酸化をLPS処理肺試料において調べ、HS-DKO試料では対照と比べて高いAKTリン酸化がみられた（図13A）。WTとDKOの好中球間でAKTリン酸化に差がなかったため（図5A）、なんら理論に限定されることを望まないが、肺試料で観察されたAKTリン酸化の差は非造血性肺細胞における差によるものである可能性がある。LPS処置マウスの肺切片の免疫蛍光では、HS-DKO試料において、肺の血管および毛細血管（CD31染色によって示される）（図6（パネルA～B）および図13B）ならびに血管平滑筋細胞（平滑筋アクチン染色によって示される）（図6（パネルC～D）および図13C）で、より高レベルのAKTリン酸化が示された。対照的に、気管支の上皮細胞および平滑筋細胞のホスホ-AKT染色は、WTとHS-DKOの試料間で同等であった（図6（パネルA～B）および図13B～13C）。また、パゾパニブ処置はAKTリン酸化に対するHS-DKOの効果を再現する; この阻害薬はLPS傷害肺におけるAKTリン酸化を増大させた（図13D）。パゾパニブのこの効果は、この阻害薬がHS-DKO肺におけるAKTリン酸化に対してほとんど効果を有しなかったため（図13E）、MAP3K2および3の存在に依存する。さらに、マウスをAKT阻害薬MK-2206（8-［4-（1-アミノシクロブチル）フェニル］-9-フェニル-2H-［1,2,4］トリアゾロ［3,4-f］［1,6］ナフチリジン-3-オン）で処置すると、透過性に対するパゾパニブの効果が消失した（図13F）。

前述のデータは、ROSが内皮細胞におけるAKTリン酸化を刺激し得るという知識と総合すると、急性肺傷害時にMAP3K2/3欠損好中球はより多くのROSを放出し、これによって内皮細胞および血管平滑筋細胞におけるAKT活性化が増強され、血管完全性の改善および透過性の低下がもたらされることを示唆する非限定的なモデルを支持する（図7A）。この非限定的な仮説をさらに試験するため、WTおよびDKO好中球の共培養をマウス肺内皮細胞を用いて行なった。fMLP活性化DKO好中球と共培養したマウス内皮細胞は、活性化WT好中球との共培養と比べて高いホスホ-AKTを有した（図7B）。このホスホ-AKTの上昇はカタラーゼの存在によって消失され得たが、スーパーオキシダーゼジスムターゼ（SOD）では消失されなかった（図7C）。カタラーゼはH₂O₂の水への変換を触媒し、一方、SODはスーパーオキシドをH₂O₂に変換させる。さらに、活性化DKO好中球とマウス内皮細胞との共培養では、活性化WT好中球のものと比べて経内皮電気抵抗（TEER）が高く、このTEERの差もまた、カタラーゼの添加によって消失され得た（図7D）。したがって、このような結果は総合すると、活性化DKO好中球が共培養内皮細胞においてH₂O₂によってホスホ-AKTを上昇させ、内皮接合部の完全性を改善でき、図7Aに示した非限定的なモデルと整合するという結論を支持する。

AKTが内皮接合部の完全性をRAC1小GTPaseの活性化によって調節しているかもしれないことがわかったため、H₂O₂によってマウス内皮細胞内のRACが活性化され得るかどうかを試験した。実際、H₂O₂は内皮細胞内のRAC1を活性化させることがわかった。また、MEKK2/3がない好中球の共培養により、WT好中球より大きなRAC1活性化がもたらされ、MEKK2/3 KO好中球が内皮細胞においてRAC1の過剰活性化を引き起こし得ることが示唆された。このような所見は図7Aに示した仮説と整合する。

ALIの長期的有害効果は線維症である。したがって、パゾパニブが肺線維症を抑止し得るかどうかを試験した。ブレオマイシン誘発性肺線維症モデルをこの試験に使用した: Gan, et al., 2012, Nat. Cell Biol. 14:686。パゾパニブは肺線維症を抑止することがわかり（図18）、ALIの抑制におけるパゾパニブの作用機序が多面的であることが示唆された。

本明細書において挙げた1つ1つの特許、特許出願および刊行物の開示内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。

本発明を具体的な態様に関して開示したが、本発明の他の態様および変形例が本発明の真の趣旨および範囲から逸脱することなく当業者によって考案され得ることは明らかである。添付の特許請求の範囲は、かかるあらゆる態様および等価な変形例を包含していると解釈されることを意図している。

Claims (14)

1. 治療有効量のパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物を含む、対象における、急性肺傷害（ALI）を処置または予防するための薬学的組成物であって、経口、非経口、経鼻、吸入、気管内、肺内および気管支内からなる群より選択される投与経路を用いて該対象に投与される、薬学的組成物。
2. 治療有効量のパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物を含む、対象における、肺線維症を処置または予防するための薬学的組成物であって、経口、非経口、経鼻、吸入、気管内、肺内および気管支内からなる群より選択される投与経路を用いて該対象に投与される、薬学的組成物。
3. 前記投与がネブライザーを用いて行なわれる、請求項1または2記載の薬学的組成物。
4. 前記対象が集中治療室（ICU）または救急処置室（ER）に入っている、請求項1または2記載の薬学的組成物。
5. 急性肺傷害が急性呼吸窮迫症候群（ARDS）である、請求項1記載の薬学的組成物。
6. 前記対象に、急性肺傷害の症状を処置、予防または低減する少なくとも1種類のさらなる剤および/または治療がさらに与えられる、請求項1記載の薬学的組成物。
7. 前記対象に、肺線維症の症状を処置、予防または低減する少なくとも1種類のさらなる剤および/または治療がさらに与えられる、請求項2記載の薬学的組成物。
8. パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物が、前記対象に、およそ1日3回、およそ1日2回、およそ1日1回、およそ1日おき、およそ3日目毎、およそ4日目毎、およそ5日目毎、およそ6日目毎およびおよそ週1回からなる群より選択される頻度で投与される、請求項1または2記載の薬学的組成物。
9. パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物が乾燥粉末ブレンドとして製剤化される、請求項1または2記載の薬学的組成物。
10. 前記対象に対するパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物の投与が、がんを患う対象に対するパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物の経口/全身投与に関連する少なくとも1つの有意な有害反応、副作用および/または毒性を引き起こさないように、パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物の投与経路が、経口、非経口、経鼻、吸入、気管内、肺内および気管支内からなる群より選択される、請求項1または2記載の薬学的組成物。
11. 前記少なくとも1つの有害反応、副作用および/または毒性が、肝毒性、QT間隔延長およびトルサード・ド・ポアント、出血事象、凝固の低減または妨害、動脈血栓事象、胃腸穿孔または瘻孔、高血圧、甲状腺機能低下症、蛋白尿、下痢、髪色の変化、悪心、無食欲ならびに嘔吐からなる群より選択される、請求項10記載の薬学的組成物。
12. 前記対象に、がん処置のためにがんを患う対象に経口/全身性で投薬されるパゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物の量より少ない量の、パゾパニブまたはその塩もしくは溶媒和物が投薬される、請求項1または2記載の薬学的組成物。
13. 前記対象が哺乳動物である、請求項1または2記載の薬学的組成物。
14. 前記哺乳動物がヒトである、請求項13記載の薬学的組成物。

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