JP7108306B2

JP7108306B2 - デンドリマー組成物ならびに壊死性腸炎および他の胃腸障害の処置における使用

Info

Publication number: JP7108306B2
Application number: JP2018521536A
Authority: JP
Inventors: デイビッドハックカム，; スハタカナン，; カナンランガラマヌジャム，; ディエゴエフ．ニノ，; ファンザン，
Original assignee: ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー
Priority date: 2015-10-29
Filing date: 2016-10-26
Publication date: 2022-07-28
Anticipated expiration: 2036-10-26
Also published as: WO2017074993A1; AU2020200143A1; JP2018531962A; ES3012645T3; EP3368028C0; CN108289872B; AU2016346304A1; AU2020200143B2; EP3368028A1; JP2022125314A; EP3368028B1; US20220080056A1; US20170119897A1; CN108289872A; CA3003628C; AU2016346304B2; CA3003628A1

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１５年１０月２９日に出願されたＵ．Ｓ．Ｓ．Ｎ．６２／２４８，０６３（その全体が本明細書に援用される）に対する優先権を主張する。

連邦政府により資金供与を受けた研究または開発に関する陳述
この発明は、ＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｓｏｆＨｅａｌｔｈ（ＮＩＨ－ＮＩＣＨＤ）によってＫａｎｎａｎＲａｎｇａｒａｍａｎｕｊａｍおよびＳｕｊａｔｈａＫａｎｎａｎにそれぞれ付与された契約１Ｒ０１ＨＤ０７６９０１－０１Ａ１（ＫＲ）および１Ｒ０１ＨＤ０６９５６２－０１Ａ１（ＳＫ）の下、政府の支援を受けてなされた。政府は、本発明に一定の権利を有する。

この発明は、炎症性および／または感染性障害、例えば壊死性腸炎の処置および／または診断のためのポリ（アミドアミン）デンドリマーの経口製剤に関する。

壊死性腸炎（ＮＥＣ）は、早産幼児の胃腸管に罹患する重度の炎症状態であり、腸壊死の突然の発病、続いて、症例の４０％より多くおける全身性敗血症および死亡によって特徴付けられる。ＮＥＣの発症から生き延びた小児のうちおよそ１５％が、認知の重度欠損によって特徴付けられる重度の神経学的損傷を発病する。全身性炎症および神経炎症は、ＮＥＣと関連した鍵となる公知の結果である。

壊死性腸炎は、粘膜またはより深部の腸壊死によって特徴付けられる主に早産または病気の新生児の後天性疾患である。それは、新生児の中で最も一般的なＧＩ緊急事態である。症状および徴候は、摂食不耐性、嗜眠、不安定な体温、腸閉塞、腹部膨満、胆汁性嘔吐、血便、便における物質の低減、無呼吸、および時々敗血症の徴候を含む。診断は、臨床的であり、画像化研究によって確認される。処置は主に支持的であり、経鼻胃吸引、非経口流体、ＴＰＮおよび抗生物質を含む。現在、早産幼児におけるＮＥＣおよびその関連した全身性炎症のための有効な治療的または予防的な手法は存在しない。壊死性腸炎を有し得る乳児のための処置は、通常の摂食を停止させること；胃にチューブを挿入することによって腸の中のガスを解放すること；静脈内流体および抗生物質薬を与えること；腹部Ｘ線、血液検査、および血液ガスの測定を用いて状態をモニタリングすることを含む。幼児は、腸の穿孔または腹壁の炎症（腹膜炎）があるならば外科手術を必要とする。外科手術は、死んだ腸組織を除去するために使用され、人工肛門形成術または回腸造瘻術を必要とすることがあり、腸が再接続され得る前に数週必要であり得る。

そのため、胃腸管への送達の改善を提供することが本発明の目的である。

胃腸管の炎症性および感染性障害、殊に腸炎を処置する手段を提供することは、本発明のさらなる目的である。

治療剤、予防剤および／または診断剤を送達するデンドリマーを含めた医薬組成物は、経口投与されることで、感染症、炎症およびがんの処置のために胃腸管、ならびに脳における標的細胞に達することができる。実施例によって実証されている通り、製剤は、早産幼児の胃腸管に罹患し、腸壊死の突然の発病、続いて症例の４０％より多くにおける全身性敗血症および死亡によって特徴付けられる重症炎症状態である壊死性腸炎（ＮＥＣ）を処置するのに有効であった。ＮＥＣの発病は、腸上皮上での細菌受容体ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の活性化を必要とし、これは脳の主要な免疫細胞であるミクログリアの活性化に至る。ミクログリア活性化は、マウスにおいて前頭前皮質のミエリンの喪失および認知機能欠損の発病をもたらす炎症性カスケードを開始する。重要なことに、マウスにおいて観察される構造的および炎症的変化は、剖検で得られるヒト脳の切片を免疫染色することによって明らかにされている通り、この疾患を発病するヒトにおいて観察される変化に酷似している。

ポリ（アミドアミン）デンドリマーの経口投与は、胃腸（ＧＩ）管ならびに中枢神経系（ＣＮＳ）における炎症を標的化し、機能改善を生成できる薬物を送達する。デンドリマーの経口投与は、炎症細胞におけるさらなる選択的局在化とともに、ＮＥＣを有するマウスにおける消化管および脳の損傷部域におけるデンドリマーの著しい濃縮をもたらす。際だったことに、デンドリマーを使用する抗炎症剤（Ｎ－アセチルシステイン）の経口投与は、ＮＥＣを有する動物における脳損傷および消化管損傷の劇的な改善をもたらす。損傷された消化管および脳におけるデンドリマーのこの選択的局在化は、経口デンドリマー製剤が、脳損傷をもたらす神経炎症を含めて、関連した全身性炎症の処置と一緒に、消化管を保存するＮＥＣの非外科的手術処置に有用であるはずであることを実証している。加えて、消化管および脳における炎症細胞中のフルオロフォアタグ化デンドリマーを選択的に局在化することによって、この技術は、ＮＥＣの感度の良い検出のための診断用ツールを表すこともできる。

好ましい実施形態では、デンドリマーは、デンドリマーにコンジュゲートされた抗炎症剤およびＴＬＲ４阻害剤の、消化管および脳への送達のために使用される。これは、消化管を保存するという非外科的手術選択肢、およびＮＥＣを有する早産新生児における関連した脳損傷の防止／処置を提供することで、ＧＩ管および脳の両方の損傷を防止または軽減する。診断剤を同時投与することによって、デンドリマーは、ＮＥＣにおいて消化管および脳における炎症および損傷の非侵襲的なリアルタイム検出を提供するために使用することもできる。炎症に関連した細胞におけるデンドリマーナノデバイスの選択的局在化は、ＮＥＣにおいて消化管および脳における炎症および損傷の非侵襲的なリアルタイム検出のための手法を提供する。好ましい診断薬は、非侵襲的な検出のためのインドシアニングリーンなど、ヒト使用に承認されたフルオロフォアである。

好ましい製剤は、そこに結合されたＮ－アセチルシステインを有するＰＡＭＡデンドリマー（第４～６世代）を、ＴＬＲ４阻害剤との組み合わせで含む。好ましいＴＬＲ４阻害剤は、ＴＬＲ４シグナリングを阻害する小分子阻害剤、特にＣ３４を含む｛Ｎｅａｌ、２０１３ＰＬｏＳＯｎｅ。２０１３年；８巻（６号）：ｅ６５７７９頁｝。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
（項目１）
炎症および感染症またはがんによって特徴付けられる胃腸障害を処置するための方法であって、前記障害の処置または診断のための１種または複数の治療剤、予防剤または診断剤と複合体化されたデンドリマーを含む薬学的に許容される組成物を被験体に経口投与することを含む、方法。
（項目２）
前記デンドリマーが、少なくとも１種の治療剤に共有結合したポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）ヒドロキシル末端デンドリマーである、項目１に記載の方法。
（項目３）
前記ＰＡＭＡＭデンドリマーがＧ３、Ｇ４、Ｇ５またはＧ６ＰＡＭＡＭデンドリマーである、項目２に記載の方法。
（項目４）
ジスルフィド結合を介して前記治療剤、前記予防剤または前記診断剤に連結されたＰＡＭＡＭデンドリマーを含む、項目１から３のいずれか一項に記載の方法。
（項目５）
ＳＰＤＰ、グルタチオン（ＧＳＨ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、およびその組み合わせから本質的になる群より選択される１種または複数のスペーサー化合物を介してＰＡＭＡＭデンドリマーに連結された治療剤、予防剤または診断剤を含む、項目２から４のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
処置される前記障害が、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、腹部敗血症、肺炎、関節炎、膵炎およびアテローム性動脈硬化症からなる群より選択される、項目１から５のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
前記組成物が、中枢神経系合併症を有する障害を有する前記被験体に投与される、項目１から６のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記治療剤が抗炎症薬である、項目１から７のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
前記抗炎症性薬がｔｏｌｌ様受容体４の阻害剤である、項目８に記載の方法。
（項目１０）
前記治療剤が、式Ｃ _１７Ｈ _２７ＮＯ _９を有する２－アセトアミドピラノシドであるＣ３４、その塩または類似体である、項目９に記載の方法。
（項目１１）
前記障害が壊死性腸炎であり、治療剤と複合体化された前記デンドリマーが、前記被験体における壊死性腸炎の１つまたは複数の症状を軽減するのに有効な量での単位投与量にある、項目１から１０のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
抗興奮剤（ａｎｔｉ－ｅｘｃｉｔａｔｏｒｙａｇｅｎｔ）を含む、項目１から１１のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
デンドリマー複合体が、ミクログリアおよびアストロサイトを局在化および標的化するための治療活性薬剤を含む、項目１から１２のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
診断剤が前記デンドリマーと複合体化される、項目１から１３のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記診断剤がフルオロフォアである、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記デンドリマーが、懸濁物、エマルジョン、錠剤、カプセルまたは洗浄液中に製剤化される、項目１から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記デンドリマーが乳児用製剤中で製剤化される、項目１から１６のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
項目１から１７のいずれか一項に記載の方法における使用のための組成物。

Ｉ．定義
「治療剤」という用語は、疾患または障害の１つまたは複数の症状を防止または処置するために投与することができる薬剤を指す。例は、以下に限定されないが、核酸、核酸類似体、小分子、ペプチド模倣物、タンパク質、ペプチド、炭水化物もしくは糖、脂質、または界面活性剤、あるいはその組み合わせを含む。

「処置」という用語は、疾患、障害または状態の１つまたは複数の症状を防止または軽減することを指す。疾患または状態の処置は、根底にある病態生理学に影響がないとしても、特定の疾患または状態の少なくとも１つの症状を好転させる（ａｍｅｌｉｏｒａｔｅ）ことを含み、例えば、鎮痛剤は疼痛の原因を処置しないが、このような薬剤を投与することによって被験体の疼痛を処置することなどである。

「薬学的に許容される」という語句は、妥当な利益／リスク比に相応する、過度の毒性、刺激、アレルギー応答または他の問題もしくは合併症なく、健全な医学的判断の範疇内でヒトおよび動物の組織との接触における使用に適当である組成物、ポリマーおよび他の材料ならびに／または剤形を指す。「薬学的に許容される担体」という語句は、薬学的に許容される材料、組成物またはビヒクル、例えば、１つの器官または身体の一部から別の器官または身体の一部に任意の対象組成物を運搬または輸送するのに関与する液体または固体の充填剤、希釈剤、溶媒または封入材料を指す。各担体は、対象組成物の他の成分と適合性があり、患者に害がないという意味で「許容され」なければならない。

「治療有効量」という語句は、任意の医学的処置に適用可能な妥当な利益／リスク比で何らかの所望の効果を生成する治療剤の量を指す。有効量は、処置されている疾患もしくは状態、投与されている特定の標的化構築物、被験体のサイズ、または疾患もしくは状態の重症度などの因子に依存して変動することができる。当業者は、過度の実験法を必要とすることなく、特定の化合物の有効量を経験的に決定することができる。

ＩＩ．製剤
Ａ．デンドリマー
「デンドリマー」という用語は、本明細書で使用される場合、以下に限定されないが、内部コアを有する分子構造物、この開始剤コアに規則的に付着されている反復単位の内部層（または「世代」）、および最外側世代に付着されている末端基の外部表面を含む。デンドリマーの例は、以下に限定されないが、ＰＡＭＡＭ、ポリエステル、ポリリシンおよびＰＰＩを含む。ＰＡＭＡＭデンドリマーは、カルボキシル、アミンおよびヒドロキシル末端を有することができ、以下に限定されないが、第１世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第２世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第３世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第４世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第５世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第６世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第７世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第８世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、第９世代ＰＡＭＡＭデンドリマー、または第１０世代ＰＡＭＡＭデンドリマーを含めて、任意の世代のデンドリマーであってよい。ともに使用するのに適当なデンドリマーは、以下に限定されないが、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリプロピルアミン（ＰＯＰＡＭ）、ポリエチレンイミン、ポリリシン、ポリエステル、イプチセン、脂肪族ポリ（エーテル）および／または芳香族ポリエーテルのデンドリマーを含む。デンドリマー複合体の各デンドリマーは、他のデンドリマーと同様または異なる化学的性質であってよい（例えば、第１のデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーを含むことができ、一方で、第２のデンドリマーはＰＯＰＡＭデンドリマーを含むことができる）。一部の実施形態では、第１または第２のデンドリマーは、追加の薬剤をさらに含むことができる。多腕ＰＥＧポリマーは、スルフヒドリルまたはチオピリジン末端基を保有する少なくとも２つの分枝を有するポリエチレングリコールを含むが；しかしながら、本明細書において開示されている実施形態は、このクラスに限定されず、スクシンイミジルまたはマレイミド末端など他の末端基を保有するＰＥＧポリマーが使用され得る。分子量１０ｋＤａから８０ｋＤａのＰＥＧポリマーを使用することができる。

デンドリマー複合体は、複数のデンドリマーを含む。例えば、デンドリマー複合体は、第３のデンドリマーを含むことができ；ここで第３のデンドリマーは、少なくとも１つの他のデンドリマーと複合体化される。さらに、第３の薬剤は、第３のデンドリマーと複合体化することができる。別の実施形態では、第１および第２のデンドリマーは、第３のデンドリマーと各々複合体化され、ここで、第１および第２のデンドリマーはＰＡＭＡＭデンドリマーであり、第３のデンドリマーはＰＯＰＡＭデンドリマーである。追加のデンドリマーは、本発明の趣旨から逸脱することなく組み込むことができる。複数のデンドリマーが利用される場合、複数の薬剤も組み込むことができる。これは、互いに複合体化されるデンドリマーの数によって限定されない。

本明細書で使用される場合、「ＰＡＭＡＭデンドリマー」という用語は、アミドアミンビルディングブロックとともに異なるコアを含有することができるポリ（アミドアミン）デンドリマーを意味する。それらを作製するための方法は当業者に公知であり、一般に、中心開始剤コアの周囲に樹状β－アラニン単位の同心シェル（世代）を生成する２段階の繰り返し反応順序を伴う。このＰＡＭＡＭコア－シェル構造物は、添加シェル（世代）の関数として直径が直線的に成長する。他方、表面基は、樹状分枝形成の数学に従って各世代で指数関数的に増幅する。それらは、５個の異なるコア型および１０個の官能表面基を有する世代Ｇ０～１０において利用可能である。デンドリマー－分岐ポリマーは、ポリアミドアミン（ＰＡＭＡＭ）、ポリエステル、ポリエーテル、ポリリシンまたはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリペプチドのデンドリマーからなっていてよい。

一部の実施形態によると、使用されるＰＡＭＡＭデンドリマーは、第４世代デンドリマーまたはそれを超えるデンドリマーであってよく、ヒドロキシル基は、それらの官能表面基に付着されている。多腕ＰＥＧポリマーは、スルフヒドリルまたはチオピリジン末端基を保有する２個およびそれより多くの分枝を有するポリエチレングリコールを含むが；しかしながら、実施形態はこのクラスに限定されず、スクシンイミジルまたはマレイミド末端など他の末端基を保有するＰＥＧポリマーが使用され得る。分子量１０ｋＤａから８０ｋＤａのＰＥＧポリマーを使用することができる。

一部の実施形態では、デンドリマーはナノ粒子形態であり、国際特許公開番号ＷＯ２００９／０４６４４６に詳細に記載されている。

ＰＡＭＡＭ－ＮＡＣの調製
下記は、リンカーとしてＮ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）を使用して、Ｎ－アセチルシステインをアミン末端第４世代ＰＡＭＡＭデンドリマー（ＰＡＭＡＭ－ＮＨ_２）にコンジュゲートするための合成スキームである。

スキーム１において、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネート（ＳＰＤＰ）の合成は、２段階手順によって行われる。最初に、３－メルカプトプロピオン酸を、２，２’－ジピリジルジスルフィドとのチオール－ジスルフィド交換により反応させることで、２－カルボキシエチル２－ピリジルジスルフィドを得る。アミン末端デンドリマーのＳＰＤＰへの連結を容易にするため、スクシンイミド基を、２－カルボキシエチル２－ピリジルジスルフィドと反応させることで、Ｎ，Ｎ’－ジシクロヘキシルカルボジイミドおよび４－ジメチルアミノピリジンを使用することによるＮ－ヒドロキシスクシンイミドとのエステル化によって、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）プロピオネートを得る。

スキーム２において、スルフヒドリル－反応性基を導入するため、ＰＡＭＡＭ－ＮＨ_２デンドリマーを、ヘテロ二官能性クロスリンカーＳＰＤＰと反応させる。スキーム２において、ＳＰＤＰのＮ－スクシンイミジル活性化エステルが末端第１級アミンにカップリングすることで、アミド連結２－ピリジルジチオプロパノイル（ＰＤＰ）基が得られる。ＳＰＤＰとの反応後、ＰＡＭＡＭ－ＮＨ－ＰＤＰを、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して分析して、ＳＰＤＰがデンドリマーとどの程度反応したかを決定することができる。

別の実施形態では、下記のスキーム４に記載されている合成経路は、Ｄ－ＮＡＣをピリジルジチオ（ＰＤＰ）－官能化デンドリマー３にまで合成するために使用することができる。次いで化合物３をＤＭＳＯ中のＮＡＣと終夜室温で反応させて、Ｄ－ＮＡＣ５を得る。

デンドリマー－ＰＥＧ－バルプロ酸コンジュゲート（Ｄ－ＶＰＡ）の調製
初めに、バルプロ酸を、チオール－反応性基で官能化する。（ＣＨ_２）_２Ｏ－の３つの反復単位を有する短いＰＥＧ－ＳＨを、スキーム３に示されている通りのカップリング試薬としてＤＣＣを使用して、バルプロ酸と反応させる。得られた粗ＰＥＧ－ＶＰＡを、カラムクロマトグラフィーによって精製し、プロトンＮＭＲによって特徴付ける。ＮＭＲスペクトルにおいて、ＰＥＧ－ＶＰＡの形成が確認された３．６５ｐｐｍから４．２５ｐｐｍへの、ＰＥＧのＯＨ基に隣接するＣＨ_２プロトンのピークの下方シフトがあった。チオール基は酸官能基との反応に対して感受性であり得るが、ＮＭＲスペクトルは、ＰＥＧのチオール基に隣接するＣＨ_２プロトンに属するピークの下方シフトをまったく示さなかった。これは、チオール基がチオール反応性官能化デンドリマーと自由に反応することを示唆する。

スキーム４において、ＰＥＧ－ＶＰＡをＰＡＭＡＭ－ＯＨにコンジュゲートするため、ジスルフィド結合を、デンドリマーとバルプロ酸との間に導入する。最初に、デンドリマーをフルオレニルメチルオキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）保護γ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）と反応させることによって、デンドリマーを二官能性デンドリマー１に変換する。二官能性デンドリマーへのＰＥＧ－ＶＰＡのコンジュゲーションは、２段階プロセスを含んでおり、第１のステップは、アミン官能化二官能性デンドリマー１とＮ－スクシンイミジル－３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオネート（ＳＰＤＰ）との反応であり、第２のステップは、チオール官能化バルプロ酸とコンジュゲートさせることを含む。ＳＰＤＰを、Ｎ，Ｎ－ジイソプロピルエチルアミン（ＤＩＥＡ）の存在下で中間体２と反応させることで、ピリジルジチオ（ＰＤＰ）官能化デンドリマー３を得る。

これはｉｎｓｉｔｕ反応プロセスであるが、構造は^１ＨＮＭＲによって確立された。スペクトルにおいて、ピリジル基の芳香族プロトンについて６．７から７．６ｐｐｍの間の新たなピークは、生成物の形成を確認した。ピリジル基の数およびＧＡＢＡリンカーの数は同じであると検証されており、このことは、アミン基の大部分がＳＰＤＰと反応したことを示す。これは、デンドリマーへの薬物のコンジュゲーションについて鍵となるステップであることから、アミン基当たりのＳＰＤＰのモル当量の使用および反応に必要とされる時間が検証された。最終的に、ＰＥＧ－ＶＰＡを、ｉｎｓｉｔｕでＰＤＰ官能化デンドリマーと反応させることで、デンドリマー－ＰＥＧ－バルプロ酸（Ｄ－ＶＰＡ）を得る。最終コンジュゲートの形成およびＶＰＡの負荷は^１ＨＮＭＲによって確認され、コンジュゲートの純度は逆相ＨＰＬＣによって評価された。ＮＭＲスペクトルにおいて、ＶＰＡの脂肪族プロトンについて０．８５から１．６７ｐｐｍの間の多重線、ＰＥＧのＣＨ_２プロトンについて３．５３から３．６６ｐｐｍの間の多重線、およびピリジル芳香族プロトンの非存在は、コンジュゲート形成を確認した。ＶＰＡの負荷は、プロトン積分方法を使用して推定したところ約２１分子であり、これは、１～２個のアミン基が未反応のままであることを示唆する。ＨＰＬＣチャートにおいて、Ｄ－ＶＰＡの溶出時間（１７．２分）は、Ｇ４－ＯＨについての溶出時間（９．５分）と異なり、コンジュゲートは、純粋であることが確認され、ＶＰＡ（２３．４分）およびＰＥＧ－ＶＰＡ（３９．２分）のトレースは測定できなかった。デンドリマーへのＶＰＡ負荷の百分率は約１２％ｗ／ｗであり、３つの異なるバッチでグラム分量（ｇｒａｍｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ）を作製するための方法を検証している。

Ｂ．カップリング剤およびスペーサー
デンドリマー複合体は、デンドリマーまたは多腕ＰＥＧにコンジュゲートまたは付着されている治療活性薬剤または化合物（以下「薬剤」）で形成することができる。付着は、薬剤とデンドリマーとの間にジスルフィド架橋を提供する適切なスペーサーを介して生じることができる。デンドリマー複合体は、身体に見出される還元条件下で、チオール交換反応によってｉｎｖｉｖｏで薬剤を急速に放出できる。

「スペーサー」という用語は、本明細書で使用される場合、治療活性薬剤をデンドリマーに連結するために使用される組成物を含むと意図される。スペーサーは、ポリマーおよび治療剤または画像化剤を架橋するための、単一の化学実体または一緒に連結された２種もしくはそれより多い化学実体のいずれかであってよい。スペーサーは、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンおよびカーボネート末端を有する任意の小さい化学実体、ペプチドまたはポリマーを含むことができる。

スペーサーは、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジル、マレイミド、ビニルスルホンおよびカーボネート基を末端とする化合物のクラスの中から選択することができる。スペーサーは、チオピリジン末端化合物、例えばジチオジピリジン、Ｎ－スクシンイミジル３－（２－ピリジルジチオ）－プロピオネート（ＳＰＤＰ）、スクシンイミジル６－（３－［２－ピリジルジチオ］－プロピオンアミド）ヘキサノエートＬＣ－ＳＰＤＰまたはスルホ－ＬＣ－ＳＰＤＰを含むことができる。スペーサーはペプチドを含むこともでき、ここでペプチドは、スルフヒドリル基を本質的に有する線状または環状であり、例えばグルタチオン、ホモシステイン、システインおよびその誘導体、ａｒｇ－ｇｌｙ－ａｓｐ－ｃｙｓ（ＲＧＤＣ）、シクロ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－ｄ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ）（ｃ（ＲＧＤｆＣ））、シクロ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ）、シクロ（Ａｒｇ－Ａｌａ－Ａｓｐ－ｄ－Ｔｙｒ－Ｃｙｓ）である。スペーサーは、メルカプト酸誘導体、例えば３メルカプトプロピオン酸、メルカプト酢酸、４メルカプト酪酸、チオラン－２－オン、６メルカプトヘキサン酸、５メルカプト吉草酸、ならびに他のメルカプト誘導体、例えば２メルカプトエタノールおよび２メルカプトエチルアミンであってよい。スペーサーは、チオサリチル酸およびその誘導体、（４－スクシンイミジルオキシカルボニル－メチル－アルファ－２－ピリジルチオ）トルエン、（３－［２－ピリジチオ］プロピオニルヒドラジドであってよい。スペーサーはマレイミド末端を有することができ、ここでスペーサーは、ポリマーまたは小さい化学実体、例えばビス－マレイミドジエチレングリコールおよびビス－マレイミドトリエチレングリコール、ビス－マレイミドエタン、ビスマレイミドへキサンを含む。スペーサーは、１，６－ヘキサン－ビス－ビニルスルホンなどのビニルスルホンを含むことができる。スペーサーは、チオグルコースなどのチオグリコシドを含むことができる。スペーサーは還元型タンパク質、例えばウシ血清アルブミンおよびヒト血清アルブミン、ジスルフィド結合を形成できる任意のチオール末端化合物であってよい。スペーサーは、マレイミド、スクシンイミジルおよびチオール末端を有するポリエチレングリコールを含むことができる。

Ｃ．治療剤、予防剤および診断剤
「デンドリマー複合体」という用語は、本明細書で使用される場合、デンドリマーと治療活性薬剤との組み合わせを指す。これらのデンドリマー複合体は、ｉｎｖｉｖｏに見出される還元条件下で細胞内に薬物を優先的に放出できるＰＡＭＡＭデンドリマーまたは多腕ＰＥＧに付着またはコンジュゲートされた薬剤を含む。デンドリマー複合体は、ｉ．ｖ．注射によって投与される場合、罹患状態下に限り血液脳関門（ＢＢＢ）を優先的に横切ることができ、正常状態下ではできない。

治療活性薬剤、画像化剤および／または標的化部分は、共有結合しているか、または分子内に分散もしくは封入されているかのいずれであってもよい。デンドリマーは、好ましくは、カルボキシル、ヒドロキシルまたはアミン末端を有する最大第１０世代までのＰＡＭＡＭデンドリマーである。ＰＥＧポリマーは、２個またはそれより多い腕および１０ｋＤａから８０ｋＤａの分子量を有する星形状化ポリマーである。ＰＥＧポリマーは、スルフヒドリル、チオピリジン、スクシンイミジルまたはマレイミド末端を有する。デンドリマーは、ジスルフィド、エステルまたはアミド結合において終端するスペーサーを介して標的化部分、画像化剤および／または治療剤に連結される。

代表的な治療剤（プロドラッグを含める）、予防剤または診断剤は、ペプチド、タンパク質、炭水化物、ヌクレオチドもしくはオリゴヌクレオチド、小分子、またはその組み合わせであってよい。例示的な治療剤は、抗炎症薬、抗増殖薬、化学療法薬、血管拡張薬および抗感染剤を含む。

抗生物質は、ペニシリンおよびアンピシリンなどのベータ－ラクタム、セフロキシム、セファクロル、セファレキシン、セファドロキシル（ｃｅｐｈｙｄｒｏｘｉｌ）、セフポドキシム（ｃｅｐｆｏｄｏｘｉｍｅ）およびプロキセチルなどのセファロスポリン、ドキシサイクリンおよびミノサイクリンなどのテトラサイクリン抗生物質、アジスロマイシン、エリスロマイシン、ラパマイシンおよびクラリスロマイシンなどのマクロライド抗生物質、シプロフロキサシン、エンロフロキサシン、オフロキサシン、ガチフロキサシン、レボフロキサシンおよびノルフロキサシンなどのフルオロキノロン、トブラマイシン、コリスチン、またはアズトレオナム、ならびにエリスロマイシン、アジスロマイシンまたはクラリスロマイシンなど、抗炎症活性を有することが知られている抗生物質を含む。好ましい抗炎症薬は、Ｎ－アセチルシステインを含めた抗酸化薬である。好ましいＮＳＡＩＤＳは、メフェナム酸、アスピリン、ジフルニサル、サルサレート、イブプロフェン、ナプロキセン、フェノプロフェン、ケトプロフェン、デクスケトプロフェン（ｄｅａｃｋｅｔｏｐｒｏｆｅｎ）、フルルビプロフェン、オキサプロジン、ロキソプロフェン、インドメタシン、スリンダク、エトドラク、ケトロラク、ジクロフェナク、ナブメトン、ピロキシカム、メロキシカム、テノキシカム、ドロキシカム、ロルノキシカム、イソキシカム、メクロフェナム酸、フルフェナム酸、トルフェナム酸、セレコキシブ（ｅｌｅｃｏｘｉｂ）、ロフェコキシブ、バルデコキシブ、パレコキシブ、ルミラコキシブ、エトリコキシブ、フィロコキシブ、スルホンアニリド、ニメスリド、ニフルム酸およびリコフェロンを含む。

代表的な小分子は、ステロイド、例えばメチルプレドニゾン、デキサメタゾン、ＣＯＸ－２阻害剤を含めた非ステロイド性抗炎症剤、コルチコステロイド抗炎症剤、金化合物抗炎症剤、免疫抑制剤、抗炎症かつ血管新生抑制剤、抗興奮毒性剤、例えばバルプロ酸、Ｄ－アミノホスホノバレレート、Ｄ－アミノホスホノヘプタノエート、グルタメート形成／放出阻害剤、例えばバクロフェン、ＮＭＤＡ受容体アンタゴニスト、サリチレート抗炎症剤、ラニビズマブ、アフリベルセプトを含めた抗ＶＥＧＦ剤、ならびにラパマイシンを含む。他の抗炎症薬は、非ステロイド薬、例えばインドメタシン、アスピリン、アセトアミノフェン、ジクロフェナクナトリウムおよびイブプロフェンを含む。コルチコステロイドは、フルオシノロンアセトニドおよびメチルプレドニゾロンであってよい。ペプチド薬は、ストレプトキナーゼ（ｓｔｒｅｐｔｉｄｏｋｉｎａｓｅ）であってよい。

多くの炎症性疾患は、リポ多糖類（ＬＰＳ）に対する受容体であるｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）を介して病的に上昇させたシグナリングに繋がり得る。したがって、潜在的な抗炎症剤としてＴＬＲ４阻害剤の発見に大きな関心がもたれている。最近、阻害剤Ｅ５５６４に結合されているＴＬＲ４の構造が解かれ、Ｅ５５６４結合性ドメインを標的化する新たなＴＬＲ４阻害剤の設計および合成を可能にした。これらは米国特許第８，８８９，１０１号に記載されており、この内容は、参照により組み込まれる。Ｎｅａｌら、ＰＬｏＳＯｎｅ。２０１３年；８巻（６号）：ｅ６５７７９ｅ頁によって報告されている通り、小分子ライブラリーの制限スクリーニング手法と併せて使用された類似性検索アルゴリズムは、Ｅ５５６４部位に結合し、ＴＬＲ４を阻害する化合物を同定した。リード化合物Ｃ３４は、式Ｃ_１７Ｈ_２７ＮＯ_９を有する２－アセトアミドピラノシド（ＭＷ３８９）であり、これは、ｉｎｖｉｔｒｏで腸細胞およびマクロファージにおけるＴＬＲ４を阻害し、内毒血症および壊死性腸炎のマウスモデルにおいて全身性炎症を低減する。ＴＬＲ４共受容体ＭＤ－２の疎水性内部ポケットへのＣ３４の分子ドッキングは、ポケットの内側深くピラン環を包埋する緊密な嵌合を実証した。際だったことに、Ｃ３４は、壊死性腸炎を有する幼児から切除されたヒト回腸においてｅｘ－ｖｉｖｏでＬＰＳシグナリングを阻害した。これらの所見は、Ｃ３４およびβ－アノマー性シクロヘキシル類似体Ｃ３５を、ＴＬＲ４媒介炎症性疾患に対して潜在的な治療的利益を有する小分子ＴＬＲ４阻害剤のための新規なリードとして同定する。

参照により本明細書に組み込まれるＷｉｐｆら、ＴｅｔｒａｈｅｄｒｏｎＬｅｔｔ．２０１５年５６巻（２３号）：３０９７～３１００頁（「Ｗｉｐｆ」）は、Ｃ３４の類似体を記載している。アノマー性オキサゾリンの銅（ＩＩ）媒介加溶媒分解ならびにβ－グルコサミンおよびβ－ガラクトサミンペンタアセテートの酸媒介変換を使用することで、アノマー炭素でおよびピラノース環のＣ－４でＣ３４の類似体を発生させた。これらの化合物を、培養された腸細胞および単球におけるＴＬＲ４媒介炎症性シグナリングに対するそれらの影響について評価した。ＮＦ－ｋＢ－ルシフェラーゼレポーターマウスを使用して、それらの効力を確認し、したがって、この系列における最初の構造－活性関係（ＳＡＲ）研究を確立し、より効力のあるイソプロピル２－アセトアミド－α－ガラクトシド１７を同定した。これらのデータは、Ｃ３４、その類似体、または他のＴＬＲ４阻害剤が、経口製剤における使用のためにデンドリマーにコンジュゲートすることができることを示している。

デンドリマー複合体は、抗興奮毒性およびＤ－抗グルタメート剤を送達するために使用することもできる。好ましい候補は、ＭＫ８０１、メマンチン、ケタミン、１－ＭＴである。

代表的なオリゴヌクレオチドは、ｓｉＲＮＡ、ｍｉｃｒｏＲＮＡ、ＤＮＡ、およびＲＮＡを含む。治療剤は、アミンまたはヒドロキシル末端を有するＰＡＭＡＭデンドリマーであってよい。

生物活性化合物または治療活性薬剤に連結されたデンドリマー複合体は、標的化すること、患部での局在化、薬物を放出すること、および画像化目的を含めて、いくつかの機能を行うために使用することができる。デンドリマー複合体は、標的化部分をともなってまたはそれをともなわずにタグ化することができ、デンドリマーと薬剤または画像化剤との間のジスルフィド結合はスペーサーまたはリンカー分子を介して形成される。

Ｄ．デバイスおよび製剤
デンドリマーは、経腸的に投与することができる。本発明において使用されている担体または希釈剤は、固体製剤のための固体担体もしくは希釈剤、液体製剤のための液体担体もしくは希釈剤、またはその混合物であってよい。

液体製剤のため、薬学的に許容される担体は、例えば、水性もしくは非水性溶液、懸濁物、エマルジョンまたは油であってよい。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、および注射可能な有機エステル、例えばオレイン酸エチルである。水性担体は、例えば、水、アルコール溶液／水溶液、シクロデキストリン、エマルジョンまたは懸濁物を含み、食塩水および緩衝化媒体も含まれる。

油の例は、石油、動物、植物または合成起源のもの、例えば、落花生油、大豆油、鉱油、オリーブ油、ヒマワリ油、魚肝油、ゴマ油、綿実油、コーン油、オリーブ、ワセリンおよびミネラルである。非経口製剤における使用のための適当な脂肪酸は、例えば、オレイン酸、ステアリン酸およびイソステアリン酸を含む。オレイン酸エチルおよびミリスチン酸イソプロピルは、適当な脂肪酸エステルの例である。

ビヒクルは、例えば、塩化ナトリウム溶液、リンゲルデキストロース、塩化デキストロース（ｄｅｘｔｒｏｓｅｃｈｌｏｒｉｄｅ）および塩化ナトリウム、乳酸加リンゲルおよび固定油を含む。製剤は、例えば、抗酸化剤、緩衝液、静菌薬、および製剤を意図されるレシピエントの血液と等張性にする溶質を含有することができる水性および非水性の等張滅菌注射溶液、ならびに懸濁化剤、可溶化剤、増粘剤、安定剤および保存料を含むことができる水性および非水性滅菌懸濁物を含む。ビヒクルは、例えば、流体および栄養補充液、電解質補充液、例えばリンゲルデキストロースに基づくものを含むことができる。一般に、水、食塩水、水性デキストロースおよび関連糖溶液が好ましい液体担体である。これらは、乳児用製剤（ｉｎｆａｎｔｆｏｒｍｕｌａ）のタンパク質、脂肪、糖類および他の構成成分で製剤化することもできる。

ＩＩＩ．処置の方法
Ａ．処置される障害または疾患
製剤は、感染症、炎症またはがんと関連した障害、特に、ＣＮＳに広がる全身性炎症を有するものを処置するために投与することができる。生得免疫受容体ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）は、細菌エンドトキシン（リポ多糖類、「ＬＰＳ」）に対する、ならびに炎症性または感染性障害中に放出される様々な内在性分子に対する造血性および非造血性細胞上の受容体として認識されてきた。いくつかの疾患が、感染および非感染プロセスの両方を含めたＴＬＲ４シグナリングの増悪に起因していた。これらは、壊死性腸炎（ＮＥＣ）、腹部敗血症、肺炎、関節炎、膵炎およびアテローム性動脈硬化症を含む。好ましい実施形態では、処置される疾患はＮＥＣである。

治療剤、予防剤または診断剤に連結されたデンドリマーを含めたデンドリマー複合体組成物は、ＮＥＣの病因において鍵となる役割を果たすミクログリアおよびアストロサイトを選択的に標的化することができる。Ｎ－アセチルシステイン（「ＮＡＣ」）は、広範に調査および研究されてきた。それは、母体胎児感染症において関連した神経炎症についても調査される。しかしながら、ＮＡＣは、高い血漿タンパク質結合により低い生物学的利用能に陥る。デンドリマー複合体組成物は、ＮＡＣの活性に影響することなく血漿タンパク質結合を克服する。Ｇ４ＰＡＭＡＭ－ＮＡＣは、単回のｉ．ｖ．投与による遊離薬物ＮＡＣよりもｉｎｖｉｖｏで１０倍から１００倍効力があり得る。遊離薬物ＮＡＣは、生物学的利用能の低減をもたらす非常に高い血漿タンパク質結合を呈する。このデンドリマー複合体の主要な利点の１つは、それが、望まれない薬物血漿タンパク質相互作用を制限することによって生物学的利用能を増強すること、および薬物の急速な放出を細胞内で選択的にもたらすことで所望の治療的作用を呈することである。

Ｇ４ＰＡＭＡＭ－ＮＡＣにおける薬物ＮＡＣの高ペイロードは、非常にわずかな量（１０ｍｇ）の担体しか必要とせず、ＰＡＭＡＭデンドリマーは、それによって、毎日投与される量を低減する。薬剤の量の減少は、薬剤に関連した副作用を限定する。薬剤の生物学的利用能は依然として高いので、薬剤のプラス効果は、より少量の薬剤の投与にもかかわらず低下しない。デンドリマー－薬物コンジュゲートを含めたデンドリマー複合体は、組織および臓器へのその体内分布を制限し、標的部位で薬物を優先的に送達し、それによって、所望されない副作用を低減する。

デンドリマー複合体はＢＢＢを横切って有効に輸送し、したがって、神経障害、神経発達障害および神経変性障害、ならびに脳損傷における標的化薬物送達に有用である。Ｇ４－ＰＡＭＡＭ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣコンジュゲートは、神経炎症性障害における活性化ミクログリア細胞およびアストロサイトを特異的に標的化する。

Ｇ４－ＰＡＭＡＭ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣデンドリマーコンジュゲートの治療的効力を、発生中のウサギ脳（脳性麻痺の動物モデル）における白質損傷およびミエリン形成減少を誘発するためのリポ多糖類（ＬＰＳ）で動物を２日間処置した後に評価した。Ｇ４－ＰＡＭＡＭ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣデンドリマー複合体から選択的に送達されたＮＡＣは、炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－６ｍＲＮＡ）、ＮＦκＢおよびニトロチロシンを含めた炎症性シグナリング因子を強く抑制し、ＧＳＨレベルを増強した。Ｇ４－ＰＡＭＡＭ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣは、遊離ＮＡＣと比較して１０倍から１００倍効力があることを見出した。これは、Ｇ４－ＰＡＭＡＭ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣがＢＢＢを横断したという結論を裏付ける。デンドリマー複合体から活性化ミクログリア細胞へのＮＡＣの標的化送達は、運動欠陥を改善し、脳性麻痺の新生児ウサギモデルにおけるＬＰＳ－誘発脳損傷からの回復を弱めた。

炎症促進性サイトカイン（ＴＮＦ－α、ＩＬ－６ｍＲＮＡ）の著しい低減が、Ｇ４－ＰＡＭＡＭ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣデンドリマー複合体の投与で観察された。ＮＡＣおよびＧ４－ＰＡＭＡＭ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣで処置された仔ウサギは、食塩水で処置された仔ウサギと比較した場合、運動欠陥の改善とともに胎児炎症応答の減少を示した。Ｇ４－ＰＡＭＡＭ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣコンジュゲートで処置された仔ウサギは、Ｇ４－ＰＡＭＡＭ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣコンジュゲートからのＮＡＣの持続送達により、ＮＡＣ単独を受容した仔ウサギと比較した場合、脳においてより少ない挙動変化およびより低いミクログリア活性化を有していた。結果は、Ｇ４－ＰＡＭＡＭ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣコンジュゲートが、ＮＡＣ単独よりも大きな効果を有することを示した。なぜなら、それが、活性化されたマクロファージおよびミクログリア細胞によって優先的に取り込まれ、炎症性および酸化性およびニトロソ化の効果を低減するからである。

Ｇ４－ＰＡＭＡＭ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣデンドリマー複合体を用いる処置は、白質損傷およびミクログリア活性化を低減した。遊離ＮＡＣについて観察されたものと同様の応答を誘起するためのＧ４－ＰＡＭＡＭ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣとして投与された場合、ＮＡＣの用量の著しい低減が観察された。濃度１００ｍｇ／ｋｇでの遊離ＮＡＣおよび濃度１０ｍｇ／ｋｇでのＧ４－ＰＡＭＡＭ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣの両方が、１０ｍｇで同一の応答を誘起し、デンドリマーへのコンジュゲートで用量の低減が達成されることを実証する。Ｇ４－ＰＡＭＡＭ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣは遊離ＮＡＣよりも低い濃度で、ＬＰＳ誘発脳損傷に対して著しい保護効果、ＴＮＦ－αの抑制およびＩＬ－６活性の下方調節を示す。デンドリマー－ＮＡＣコンジュゲートのこの活性は、シグナル伝達因子ＮＦ－κＢおよびニトロチロシンを阻止または修飾することによって早期の炎症応答に干渉するその能力に起因し、それによって細胞活性化をモジュレートすることができる。６および８腕ＰＥＧ－ＮＡＣコンジュゲートは、２時間以内に細胞内ＧＳＨ濃度（２および１０ｍＭ）においてＮＡＣの７４％を放出した。０．００８～０．８ｍＭの間の濃度範囲で、コンジュゲートはミクログリア細胞に対して非毒性であった。等モル濃度のＮＡＣ（０．５ｍＭ）で、６腕ＰＥＧ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣおよび８腕ＰＥＧ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣは、ＧＳＨ枯渇の阻害において遊離ＮＡＣよりも効率的であった。６および８腕ＰＥＧ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣコンジュゲートの両方は、各々０．５ｍＭおよび５ｍＭ濃度で、等モル濃度での遊離ＮＡＣと比較した場合のＲＯＳ産生において著しい阻害を示した。研究は、コンジュゲートが、遊離ＮＡＣと比較した場合、ＮＯ産生の阻害において優れていることを実証している。最高濃度（５ｍＭ）で、遊離薬物は、Ｈ_２Ｏ_２レベルおよび亜硝酸イオンレベルを３０～４０％低減したが、コンジュゲートは、Ｈ_２Ｏ_２および亜硝酸イオンレベルを、７０％を超えて低減した。これは、コンジュゲートが細胞の内側で薬物を輸送でき、かつ遊離形態での薬物を放出し、かつ遊離薬物よりも著しく効力があることを示す。５ｍＭ濃度で、６腕ＰＥＧ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣコンジュゲートは、（１）同等の濃度のＮＡＣ（Ｐｂ０．０５）と比較した場合、ＴＮＦ－α産生の有意な阻害（７０％）を示した。８腕ＰＥＧ－Ｓ－－Ｓ－ＮＡＣコンジュゲートは、（３）同等の濃度のＮＡＣ（Ｐｂ０．０５およびＰｂ０．０１）と比較した場合、５ｍＭでＴＮＦ－α産生の有意な阻害（７０％）を示した。ＰＥＧはヒト使用に承認され、このデバイスはＮＡＣの限界に対処し、より大きな効力を提供するので、ＰＥＧ化ＮＡＣは、医薬産業に対して有用性を有するデンドリマー複合体である。

Ｂ．投与量
典型的に、主治医は、年齢、体重、全般的な健康状態、食事、性別、投与される化合物、投与の経路、および処置されている状態の重症度など様々な因子を考慮に入れ、各個々の被験体を処置するための組成物の投与量を決定する。組成物の用量は、処置されている被験体の体重１ｋｇ当たり約０．０００１から約１０００ｍｇ、体重１ｋｇ当たり約０．０１から約１００ｍｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約１０ｍｇ／ｋｇ、および体重１ｋｇ当たり約０．５ｍｇから約５ｍｇであってよい。

一般に、投与のタイミングおよび頻度は、所与の処置または診断スケジュールの効力と所与の送達系の副作用とのバランスをとるために調整される。例示的な投薬頻度は、持続的注入、単回および複数の投与、例えば毎時、毎日、毎週、毎月または毎年投薬することを含む。

本発明の方法において使用される投薬レジメンは、被験体における障害を処置するのに十分な時間の任意の長さであり得ることは、当業者によって理解されよう。「慢性的」という用語は、本明細書で使用される場合、投与レジメンの時間の長さが数時間、数日、数週、数カ月またはおそらく数年であってよいことを意味する。

デンドリマー複合体は、上記で考察されている状態または疾患を処置できることが知られている１種または複数の追加の治療活性薬剤との組み合わせで投与することができる。

本発明は、以下の非限定的な実施例を参照することによりさらに理解されよう。

（実施例１：壊死性腸炎の処置）
ＮＥＣの発病は、腸上皮上の細菌受容体ｔｏｌｌ様受容体４（ＴＬＲ４）の活性化を必要とする。なぜなら、ＴＬＲ４を欠如しているマウスはＮＥＣから保護されており、一方、ＮＥＣを有するヒトは、消化管においてＴＬＲ４活性化の増加を呈するからである。腸上皮上のＴＬＲ４の活性化は、ミクログリアの活性化に至り、前頭前皮質におけるミエリンの喪失、およびヒトにおいて観察される疾患によく似ている方式でマウスにおける認知機能欠損の発病をもたらす。

ポリ（アミドアミン）デンドリマーは、ＣＮＳにおける炎症を標的化し、機能的改善を生成する薬物を送達する。以下の実施例によって実証されている通り、デンドリマーの経口投与は、炎症細胞におけるさらなる選択的局在化とともに、ＮＥＣを有するマウスにおける消化管および脳の損傷部域におけるデンドリマーの著しい蓄積に至る。際だったことに、デンドリマーを使用する抗炎症剤（Ｎ－アセチルシステイン）の経口投与は、ＮＥＣを有する動物における脳損傷および消化管損傷の劇的な改善をもたらす。損傷された消化管および脳におけるデンドリマーのこの選択的局在化は、脳損傷をもたらす神経炎症を含めて、関連した全身性炎症の処置と一緒に、消化管の保存をともなうＮＥＣの非外科手術処置についての暗示を有する。消化管における炎症細胞中のフルオロフォアタグ化デンドリマーの選択的局在化は、ＮＥＣの感度の良い検出のための診断用ツールとして使用することもできる。

材料および方法
デンドリマー。デンドリマー－Ｃｙ５およびデンドリマー－薬物のコンジュゲートを作製するためのプロトコールを含めて、下記の実験において使用される詳細な材料および方法は、ＫａｎｎａｎＳら、Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．、４巻：１３０ｒａ４６頁（２０１２年）によっておよび米国特許第８，８８９，１０１号において記載されてきた。

デンドリマーコンジュゲートのコンジュゲーション。前に報告されている方法（Ｋａｎｎａｎら、ＳｃｉｅｎｃｅＴｒａｎｓ．Ｍｅｄ（２０１２年４月））を使用して、Ｃｙ５へのデンドリマーのコンジュゲーションを行った。薬物実験のため、デンドリマーをＮ－アセチル－システインにコンジュゲートし、異なる時点で２～２０ｍｇ／ｋｇを範囲とする用量で投与した。

統計分析。スチューデントのｔ検定を使用して、データを再現性について分析することで、２つの群の間の有意性を決定した。０．０５に等しいまたはそれ未満のｐ値を有意と考えた。

ＮＥＣの動物モデル。新生児マウス（生後６～１１日目）を壊死性腸炎（ＮＥＣ）のよく確立されたモデルに曝露した。簡潔には、仔マウスに、胃管栄養法を介して５回／日、ヒトＮＥＣから単離された細菌が補充された製剤を給餌し、４日間１日２回低酸素チャンバーにおいて１０分間低酸素（５％のＯ_２、９５％のＮ_２）を受けさせた。

２つの実験プロトコールを用いることで、脳に対するＮＥＣの急性効果対長期効果を決定した。急性効果を決定するため、脳試料を、ＮＥＣプロトコールの完了後（生後１１日目）直ちに収集し、その後、ミエリン化およびミクログリア活性化の免疫組織化学的評価を続けた。モリス水迷路および新規物体認識試験（ｎｏｖｅｌｏｂｊｅｃｔｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎｔｅｓｔ）を使用して、ＮＥＣプロトコールの完了の３週後（生後３２～４６日目）に、ＮＥＣ曝露の挙動上の影響（ｂｅｈａｖｉｏｒａｌｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎ）を決定した。

デンドリマー－ＮＡＣ治療。Ｎ－アセチル－システインをコンジュゲートしたデンドリマー（Ｄ－ＮＡＣ）を、経口胃管栄養法を介してＮＡＣベースで１８ｍｇ／ｋｇ（Ｄ－ＮＡＣコンジュゲートベースで１００ｍｇ／ｋｇ）の臨床関連用量で、ＮＥＣプロトコールの２日目および３日目（即ち、生後８日目および９日目）に送達した。

画像化するため、Ｄ－ＮＡＣの最終用量後から数時間遅れて、Ｃｙ５標識デンドリマー（Ｄ－Ｃｙ５）を、経口胃管栄養法を介して１００ｍｇ／ｋｇで、ＮＥＣプロトコールの３日目に送達した。

高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）分析。Ｅｍｐｏｗｅｒソフトウェアとインターフェース接続された、Ｗａｔｅｒｓインラインデガッサー、バイナリポンプ、フォトダイオードアレイ（ＰＤＡ）検出器、マルチ蛍光λ検出器およびオートサンプラー（４℃で維持される）が備えられているＷａｔｅｒｓＨＰＬＣ機器（ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、Ｍａｓｓａｃｈｕｓｅｔｔｓ）を使用して、デンドリマー－Ｃｙ５コンジュゲート（Ｄ－Ｃｙ５）の純度を分析した。Ｗａｔｅｒｓ２９９８ＰＤＡ検出器を使用して２１０ｎｍでの吸光度でデンドリマーについておよび６５０ｎｍでの吸光度でＣｙ５について、ならびにＷａｔｅｒｓ２４７５蛍光検出器を使用して６４５ｎｍでの励起および６６２ｎｍでの発光により蛍光について、同時に、ＨＰＬＣクロマトグラムをモニタリングした。水／アセトニトリル（０．１％ｗ／ｗのＴＦＡ）を新たに調製し、濾過し、脱ガスし、移動相として使用した。ＴＳＫ－ゲルガードカラムに接続されたＴＳＫ－ゲルＯＤＳ－８０Ｔｓ（２５０×４．６ｍｍ、５μｍの粒子サイズを有する２５ｃｍの長さ）を使用した。勾配流を使用し、初期の条件が９０：１０（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）であり、次いで、３０分で１０：９０（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）にアセトニトリル濃度を徐々に増加させ、１ｍｌ／分の流量を用いて６０分で元の初期条件９０：１０（Ｈ２Ｏ／ＡＣＮ）に戻した。

免疫組織化学および共焦点顕微鏡法。脳スライスをＰＢＳ中２％のパラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）に固定した。イソペンタン中のドライアイスを丁重に使用して、１：２の比での２０％スクロースおよび最適切削温度化合物（ＯＣＴ）（ＳａｋｕｒａＦｉｎｅｔｅｋＵＳＡＩｎｃ．、Ｔｏｒｒａｎｃｅ、ＣＡ）中に、脳を凍結した。冷凍ブロックを切片化するまで－８０℃で貯蔵する。クライオスタットを使用して、８μｍの切片を凍結ブロックから切断した。ミクログリア細胞マーカーであるウサギ抗イオン化カルシウム結合アダプター１分子（Ｉｂａ－１）（Ｗａｋｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、ＵＳＡ）中で、切片をインキュベートし、ヤギ抗ウサギ－Ｃｙ３二次抗体を適用した。切片をＺｅｉｓｓ５１０共焦点顕微鏡上で分析した。ＩＶ注射された動物における全ての組織を分析するための、励起および発光波長ならびにレーザーの設定は同一であった。切片のＺスタックを取り、折り畳む（ｃｏｌｌａｐｓｅ）ことで、切片全体の深さにわたる画像を与えた。

結果
ＮＥＣに曝露された仔マウスは、モリス水迷路および新規物体認識挙動試験における作業記憶および空間学習の欠損によって証明された著しい認知欠陥を呈する。これらの所見は、脳ミエリン化およびミクログリア活性化の組織病理学的評価と相関する。ＮＥＣに曝露された動物は、対照動物と比較した場合、欠損ミエリン化パターンを有し、これは、中脳および脳梁におけるミエリン塩基性タンパク質（ＭＢＰ）の発現の減少によって特に明らかである。さらに、ＮＥＣ処置動物は、対照と比較して、脳梁、海馬および中脳のレベルでミクログリア活性化の増加を呈する。

経口投与されたデンドリマーは、消化管によって容易に取り込まれ、病態依存性体内分布を呈した。デンドリマーは、主に、大脳皮質、殊に頭頂皮質および運動皮質中に蓄積することが見られた。Ｄ－Ｃｙ５は、視床、視床核で蓄積することも見られた。

ＮＥＣ中のＤ－ＮＡＣの投与は、未処置ＮＥＣマウスと比較して、Ｄ－Ｃｙ５取込みの低減（より低いレベルの炎症、ミクログリア活性化の低減、および正常のミエリン化パターンを示す）によって証明される通り、脳に対する保護効果に至る。動物が組織病理学的およびｑＲＴ－ＰＣＲ評価による壊死性腸炎の明らかな証拠を呈するという事実にもかかわらず、Ｄ－ＮＡＣの保護効果が観察された。

Ｃｙ５標識デンドリマー（Ｄ－Ｃｙ５）を投薬した全てのマウス群において、デンドリマーは消化管中に蓄積され、腸絨毛における上皮細胞によって取り込まれており、Ｄ－Ｃｙ５がＧＩ管に吸収され、体循環で分配されたことを示した。

製剤給餌（ＮＥＣ）マウスにおいて、Ｃｙ５標識デンドリマー（Ｄ－Ｃｙ５）は、主に、大脳皮質、殊に頭頂皮質および運動皮質中に蓄積することが見られた（図２）。Ｄ－Ｃｙ５は、視床、視床核で蓄積することも見られた。

目的の領域でＤ－Ｃｙ５の細胞共局在化をさらに同定するため、頭頂領域での体性感覚皮質を、より高い倍率下で検査した。体性感覚皮質で、Ｄ－Ｃｙ５局在化の大部分は、皮質の層２～５中にあると思われ、細胞取り込みのパターンを形成する。

視床および視床核で、Ｄ－Ｃｙ５は、非標識化細胞による優勢な細胞取込みおよび活性化ミクログリア／マクロファージによるある程度の取込みとともに細胞共局在化を明らかに示した。

加えて、Ｄ－ＮＡＣ処置は、ＮＥＣに関連するミクログリア活性化、脳室周囲領域中のＤ－Ｃｙ５蓄積を有意に減少させ、製剤給餌マウスの脳におけるミエリン化を大きく増強した。Ｄ－ＮＡＣ処置は、製剤給餌マウスにおける脳の脳室周囲領域中のＤ－Ｃｙ５蓄積を減少させた。母乳栄養マウス（健康な陽性対照）において、Ｄ－Ｃｙ５は脈絡叢だけに見られた。製剤給餌マウス（ＮＥＣ陰性対照）において、Ｄ－Ｃｙ５は、おそらく細胞取り込みにより、脳室周囲領域に大きな量で蓄積し、散乱パターンを形成した。製剤給餌マウスへのＤ－ＮＡＣ処置（ＮＥＣ、デンドリマー－ＮＡＣ処置）後、Ｄ－Ｃｙ５蓄積は脳室周囲領域の周囲で有意に減少し、最小限のＤ－Ｃｙ５だけが脳室（ｖｅｎｔｒｉｃａｌ）の外層において観察された。脳におけるデンドリマー取込みは、炎症の程度に比例していることが示されているので、これは、経口Ｄ－ＮＡＣ処置が神経炎症を低減したことを示している。

Ｄ－ＮＡＣ処置は、ＮＥＣに関連したミクログリア活性化を減少させた。母乳栄養および製剤給餌＋Ｄ－ＮＡＣ処置マウスにおいて、ミクログリア細胞は、小細胞体を有する同様の集団を有し、ミクログリア細胞が「休止状態」であることを示唆した。対照的に、製剤給餌ＮＥＣマウス（対照）において、ミクログリア集団は細胞体の肥大とともに著しく増加し、ミクログリア活性化を示唆した。

Ｄ－ＮＡＣ処置は、製剤給餌マウスの脳において、ＮＥＣと関連したミエリン化欠陥から保護した。母乳栄養（健康な対照）および製剤給餌＋Ｄ－ＮＡＣ処置（ＮＥＣ、Ｄ－ＮＡＣで処置された）マウスは、製剤給餌だけのマウス（ＮＥＣ未処置）よりも脳において高い程度のミエリン化を有し、製剤給餌＋Ｄ－ＮＡＣ処置群における炎症の低減が神経修復に役立ったことを示した。

同様の結果は、Ｇｏｏｄら、ＡｍＪＰｈｙｓｉｏｌＧａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔＬｉｖｅｒＰｈｙｓｉｏｌ．２０１４年３０６巻（１１号）：Ｇ１０２１～３２頁。ｄｏｉ：１０．１１５２／ａｊｐｇｉ．００４５２．２０１３。Ｅｐｕｂ２０１４年４月１７日によって記載されている仔ブタモデルを使用して得られている。

本明細書において引用されている刊行物、特許出願および特許を含めた全ての参考文献は、各参考文献が参照により組み込まれることが個々におよび具体的に示され、本明細書においてその全体が説明されているのと同じ程度に本明細書によって参照により組み込まれる。

Claims

被験体における炎症性胃腸障害および中枢神経系の関連した炎症を処置するための薬学的に許容される組成物であって、前記組成物が、末端のヒドロキシル基を介して１種または複数の抗炎症剤とコンジュゲートしたポリ（アミドアミン）（ＰＡＭＡＭ）ヒドロキシル末端デンドリマーからなるデンドリマー複合体を含み、前記デンドリマー複合体が、血液脳関門を横切り、
前記組成物が、前記被験体に経口投与されることを特徴とする、薬学的に許容される組成物。
前記ＰＡＭＡＭデンドリマーがＧ３、Ｇ４、Ｇ５またはＧ６ＰＡＭＡＭデンドリマーである、請求項１に記載の薬学的に許容される組成物。
前記ＰＡＭＡＭデンドリマーが、ジスルフィド結合を介して前記１種または複数の抗炎症剤にコンジュゲートしている、請求項１および２のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
前記ＰＡＭＡＭデンドリマーが、ＳＰＤＰ、グルタチオン（ＧＳＨ）、ガンマ－アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、およびその組み合わせからなる群より選択される１種または複数のスペーサー化合物を介して前記１種または複数の抗炎症剤にコンジュゲートしている、請求項１から３のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
処置される前記障害が、壊死性腸炎（ＮＥＣ）である、請求項１から４のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
前記組成物が、中枢神経系合併症を有する障害を有する前記被験体に投与されることを特徴とする、請求項１から５のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
前記抗炎症剤がＮ－アセチルシステインである、請求項１から６のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
前記抗炎症剤がｔｏｌｌ様受容体４の阻害剤である、請求項１から６のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
前記ｔｏｌｌ様受容体４の阻害剤が、式Ｃ_１７Ｈ_２７ＮＯ_９を有する２－アセトアミドピラノシドであるＣ３４、またはその塩である、請求項８に記載の薬学的に許容される組成物。
前記障害が壊死性腸炎であり、前記デンドリマー複合体が、前記被験体における壊死性腸炎の１つまたは複数の症状を軽減するのに有効な量である、請求項１から９のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
前記組成物が、抗興奮毒性剤または抗グルタメート剤にコンジュゲートしたデンドリマーからなるデンドリマー複合体をさらに含む、請求項１から１０のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
前記組成物が、懸濁物、エマルジョン、錠剤、カプセルまたは洗浄液中に製剤化される、請求項１から１１のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
前記組成物が乳児用製剤中で製剤化される、請求項１から１２のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
前記ＰＡＭＡＭデンドリマーが、１種または複数の診断剤とさらにコンジュゲートしている、請求項１～１３のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
前記１種または複数の診断剤がフルオロフォアである、請求項１４に記載の薬学的に許容される組成物。
前記抗興奮毒性剤または抗グルタメート剤が、ＭＫ８０１、メマンチン、ケタミン、および１－ＭＴからなる群から選択される、請求項１１に記載の薬学的に許容される組成物。
前記デンドリマー複合体が、前記被験体の体重１ｋｇ当たり約０．０１ｍｇ～約１００ｍｇの投与量で投与されることを特徴とする、請求項１～１６のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
前記処置される障害が、腹部敗血症および膵炎からなる群から選択される、請求項１～４、７～９および１１～１７のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
前記炎症性胃腸障害が、消化管における炎症および神経炎症を含む、請求項１～４、７～９および１１～１７のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。
前記被験体が早産幼児である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の薬学的に許容される組成物。