JP7119036B2 - 腫瘍組織を含むサンプルから細胞間の空間的近接を表すスコアを決定する方法 - Google Patents

Description

開示の内容

〔関連出願の相互参照〕
本出願は、２０１５年１０月２３日出願の米国仮特許出願第６２／２４５，８５８号、および２０１５年１１月２４日出願の米国仮特許出願第６２／２５９，３１９号の優先日の利益を主張し、これらの仮特許出願のいずれも、参照により全体として本明細書に組み込まれる。

〔背景〕
本発明は、概して、癌治療の分野に関する。

〔概要〕
一態様では、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルにスコアを付ける方法が本明細書で開示され、この方法は、（ｉ）癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルを使用して、少なくとも一対の細胞間の空間的近接を表すスコアを決定する工程であって、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは、第１のバイオマーカーを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは、第１のバイオマーカーとは異なる第２のバイオマーカーを発現する、工程と、（ｉｉ）スコアを記録する工程であって、このスコアは、閾値と比較した場合に、癌患者が免疫療法に陽性的に反応する可能性を示す、工程と、を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは、腫瘍細胞を含み、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは、非腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、非腫瘍細胞は、免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１および第２のメンバーは、免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは、腫瘍細胞、骨髄系細胞、または間質細胞を含み、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは、免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞、骨髄系細胞、または間質細胞は、ＰＤ－Ｌ１を発現し、免疫細胞はＰＤ－１を発現する。いくつかの実施形態では、空間的近接は、ピクセルスケールで評価される。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞間の空間的近接は、約１ピクセル～約１００ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞間の空間的近接は、約０．５μｍ～約５０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、決定する工程は、（ｉ）複数の蛍光タグで染色された、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な、所定の数の視野を選択する工程であって、この選択は、他の視野と比べて第１のバイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、（ｉｉ）選択された視野それぞれについて、第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含むのに十分なマージンだけ第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、（ｉｉｉ）第２のバイオマーカーを発現し、第１のバイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号内に含まれる、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第１の総面積を、規格化因子で割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、を含む。いくつかの実施形態では、蛍光タグのそれぞれは、特異的バイオマーカーを対象にしている。いくつかの実施形態では、複数の蛍光タグは、第１のバイオマーカー用の第１の蛍光タグおよび第２のバイオマーカー用の第２の蛍光タグを含む。いくつかの実施形態では、マージンは、約１～約１００ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞は、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約０．５～約５０μｍ以内にある。いくつかの実施形態では、第１の総面積は、ピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、規格化因子は、選択された視野それぞれからのすべての非腫瘍細胞の第２の総面積である。いくつかの実施形態では、規格化因子は、第２のバイオマーカーを発現する能力を有する、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第２の総面積である。いくつかの実施形態では、規格化因子は、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第２の総面積である。いくつかの実施形態では、第２の総面積はピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、所定の係数は１０^４である。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＨＬＡ－ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ－１、ＧＩＴＲＬ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択された第１のバイオマーカーを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択された第２のバイオマーカーを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＰＤ－Ｌ１を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＰＤ－１を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＰＤ－Ｌ１を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＣＤ８０を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＣＴＬＡ－４を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＣＤ８０を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＰＤ－Ｌ２を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＰＤ－１を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＣＴＬＡ－４を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＣＤ８６を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＬＡＧ－３を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＨＬＡ－ＤＲを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＴＩＭ－３を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはガレクチン９を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは４１ＢＢを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは４．１ＢＢＬを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＯＸ４０を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＯＸ４０Ｌを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＣＤ４０を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＣＤ４０Ｌを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＩＣＯＳを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＩＣＯＳＬを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＧＩＴＲを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＧＩＴＲＬを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＨＬＡ－ＤＲを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＴＣＲを発現する。いくつかの実施形態では、閾値は約５００～約５０００の範囲である。いくつかの実施形態では、閾値は約９００±１００である。いくつかの実施形態では、免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１のバイオマーカーの発現の定量化または第２のバイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予知力を提供する。いくつかの実施形態では、予知力は、陽性的中率、陰性的中率、またはそれらの組み合わせとして定量化される。いくつかの実施形態では、陽性的中率は６５％以上である。いくつかの実施形態では、陽性的中率は７０％以上である。いくつかの実施形態では、陽性的中率は７５％以上である。いくつかの実施形態では、陰性的中率は６５％以上である。いくつかの実施形態では、陰性的中率は８０％以上である。

別の態様では、腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な所定の数の視野に存在する複数の細胞から選択された少なくとも一対の細胞間の空間的近接を表すスコアを決定する方法が本明細書に開示され、このサンプルは、癌患者から採取され、この方法は、（ｉ）複数の蛍光タグで染色された、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な、所定の数の視野を選択する工程であって、この選択は、他の視野と比べて第１の特異的バイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、（ｉｉ）選択された視野それぞれについて、第２の特異的バイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含むのに十分なマージンだけ第１の特異的バイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、（ｉｉｉ）第２の特異的バイオマーカーを発現し、第１の特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号内に含まれる、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第１の総面積を、規格化因子で割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、を含む。いくつかの実施形態では、蛍光タグのそれぞれは、特異的バイオマーカーを対象にしている。いくつかの実施形態では、複数の蛍光タグは、第１のバイオマーカー用の第１の蛍光タグおよび第２のバイオマーカー用の第２の蛍光タグを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の蛍光タグは、特異的バイオマーカーに対する結合親和性を有する抗体または別の抗体に結合したフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、各蛍光タグは、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）２、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３，５、Ｃｙ（登録商標）５、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、４８８色素、５５５色素、５９４色素、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄからなる群の１つ以上から独立して選択されるフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、マージンは、約１～約１００ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、第２の特異的バイオマーカーを発現する近位に位置する細胞は、第１の特異的バイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約０．５～約５０μｍ以内にある。いくつかの実施形態では、第１の総面積はピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、規格化因子は、選択された視野それぞれからのすべての非腫瘍細胞の第２の総面積である。いくつかの実施形態では、規格化因子は、第２の特異的バイオマーカーを発現する能力を有する選択された視野それぞれからのすべての細胞の第２の総面積である。いくつかの実施形態では、規格化因子は、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第２の総面積である。いくつかの実施形態では、第２の総面積はピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、所定の係数は１０^４である。いくつかの実施形態では、空間的近接スコア（ＳＰＳ）は以下の方程式によって決定され：

式中、Ａ_Ｉは、総相互作用面積（第２の特異的バイオマーカーを発現し、第１の特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号により含まれる、細胞の総面積）であり、Ａ_Ｃは、第２の特異的バイオマーカーを発現する能力を有する細胞の総面積である。いくつかの実施形態では、この方法は、第１の特異的バイオマーカーの発現の定量化または第２の特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予知力を提供する。いくつかの実施形態では、予知力は、陽性的中率、陰性的中率、またはそれらの組み合わせとして定量化される。いくつかの実施形態では、陽性的中率は６５％以上である。いくつかの実施形態では、陽性的中率は７０％以上である。いくつかの実施形態では、陽性的中率は７５％以上である。いくつかの実施形態では、陰性的中率は６５％以上である。いくつかの実施形態では、陰性的中率は８０％以上である。

いくつかの実施形態では、第１の特異的バイオマーカーは腫瘍および非腫瘍マーカーを含み、第２の特異的バイオマーカーは非腫瘍マーカーを含む。

〔詳細な説明〕
さまざまな実施形態を以下で説明する。特定の実施形態は、網羅的な説明、または、本明細書で論じられるさらに広い態様への制限のつもりではないことに注意されたい。特定の実施形態と共に論じられた１つの態様は、必ずしもその実施形態に制限されず、任意の他の実施形態で実行され得る。

本明細書で使用される、「約」は、当業者によって理解され、それが使用される文脈に応じてある程度変化するであろう。当業者に明確でない用語が使用されている場合、それが使用されている文脈を考えて、「約」は、特定の用語の±１０％までを意味する。

要素を説明する文脈における（特に以下の特許請求の範囲の文脈における）用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および類似の指示物の使用は、本明細書で特に指示のない限り、または、文脈により明確に否定されない限り、単数および複数の両方をカバーすることが理解される。本明細書における値の範囲の詳述は、単に、本明細書で特に指示のない限り、その範囲に含まれる別個の値それぞれに個別に言及する簡略な方法として役立つことを意図したものであり、別個の値はそれぞれ、個別に本明細書に列挙されたかのように明細書に組み込まれる。本明細書に記載するすべての方法は、本明細書で特に指示のない限り、または、文脈により明確に否定されない限り、任意の適切な順序で実行され得る。本明細書に提供される、ありとあらゆる実施例、または例示的な言語（例えば、「～など」）の使用は、単に実施形態をよりよく際立たせることが意図されており、特に明記しない限り特許請求の範囲に制限を課すものではない。明細書中のいかなる言語も、特許請求されていない要素を本質的なものとして示していると理解すべきではない。

用語「治療する」または「治療」は、統計的に有意な程度まで、もしくは当業者にとって検出可能な程度まで、疾患に関連する健康状態、症状、もしくはパラメータを改善するか、または疾患の進行を防ぐのに有効な量、方法、またはモードで、療法を施すことを指す。有効な量、方法、またはモードは、被験者によって変化し得、患者に合わせることが可能である。

一態様では、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルにスコアを付ける方法が、本明細書で提供される。

いくつかの実施形態では、サンプルは、特異的バイオマーカーに親和性を有する複数の蛍光タグを用いて染色され得る。染色されたサンプルのデジタル画像を得ることができ、この画像は、蛍光タグの場所に基づいてさらに分析される。全画像分析（whole-image analysis）ではなく、視野が、目的の第１のバイオマーカーを発現する細胞の数に基づいて、優先順位を付けられ得る。次に、所定の数の視野が、蛍光信号についてさらに分析され得る。いくつかの実施形態では、４つの異なるタイプの蛍光タグを使用すると、目的の第１のバイオマーカーに対応する蛍光信号の画像、および目的の第２のバイオマーカーに対応する蛍光信号の画像、ならびにすべての細胞により発現されるバイオマーカーに対応する蛍光信号の画像、および腫瘍細胞により発現されるバイオマーカーに対応する蛍光信号の画像が生成される。さらなる実施形態では、蛍光信号の画像は、画像内の細胞に対応する蛍光信号の１つ以上のマスクを生成するように操作される。いくつかの実施形態では、蛍光信号の１つ以上のマスクは、画像内のすべての細胞のマスク、画像内のすべての腫瘍細胞のマスク、画像内のすべての非腫瘍細胞のマスク、画像内の目的の第１のバイオマーカーを発現するすべての細胞のマスク、画像内の目的の第２のバイオマーカーを発現するすべての細胞のマスク、画像内の目的の第１のバイオマーカーを発現するすべての細胞ならびに目的の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を表す相互作用マスクからなる群から選択された１つ以上を含む。さらなる実施形態では、相互作用マスクは、目的の第１のバイオマーカーを発現する細胞より近位に位置した、目的の第２のバイオマーカーを発現する選択された全視野からの細胞の相互作用コンパートメントを生成するのに使用される。相互作用コンパートメントの総面積は、少なくとも一対の細胞間の空間的近接を示すスコアを生成するのに使用され得、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは第１のバイオマーカーを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは、第１のバイオマーカーとは異なる第２のバイオマーカーを発現する。いくつかの実施形態では、スコアは、癌患者が免疫療法に陽性的に反応する可能性を示す。いくつかの実施形態では、この方法は、目的の第１のバイオマーカーの発現の定量化または目的の第２のバイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予知力を提供する。

したがって、いくつかの実施形態では、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルにスコアを付ける方法が本明細書で提供され、この方法は、（ｉ）癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルを使用して、少なくとも一対の細胞間の空間的近接を表すスコアを決定する工程であって、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは第１のバイオマーカーを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは第１のバイオマーカーとは異なる第２のバイオマーカーを発現する、工程と、（ｉｉ）スコアを記録する工程であって、このスコアは、閾値と比較した場合に、癌患者が免疫療法に陽性的に反応する可能性を示す、工程と、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１のバイオマーカーの発現の定量化または第２のバイオマーカーの発現の定量化と比べて、優れた予知力を提供する。

いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは腫瘍細胞を含み、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは非腫瘍細胞を含む。いくつかの実施形態では、非腫瘍細胞は免疫細胞である。いくつかの実施形態では、非腫瘍細胞は間質細胞である。

いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１および第２のメンバーは免疫細胞を含む。

いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは、腫瘍細胞、骨髄系細胞、または間質細胞を含み、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、腫瘍細胞、骨髄系細胞、または間質細胞はＰＤ－Ｌ１を発現し、免疫細胞はＰＤ－１を発現する。

いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは、腫瘍細胞を含み、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは、骨髄系細胞を含み、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは間質細胞を含み、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは免疫細胞を含む。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＰＤ－Ｌ１を発現し、免疫細胞はＰＤ－１を発現する。

いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＨＬＡ－ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ－１、ＧＩＴＲＬ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択された第１のバイオマーカーを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択された第２のバイオマーカーを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＨＬＡ－ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ－１、ＧＩＴＲＬ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択された第１のバイオマーカーを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択された第２のバイオマーカーを発現する。

いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＰＤ－Ｌ１を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＰＤ－１を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＰＤ－Ｌ１を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＣＤ８０を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＣＴＬＡ－４を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＣＤ８０を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＰＤ－Ｌ２を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＰＤ－１を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＣＴＬＡ－４を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＣＤ８６を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＬＡＧ－３を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＨＬＡ－ＤＲを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＴＩＭ－３を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはガレクチン９を発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは４１ＢＢを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは４．１ＢＢＬを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＯＸ４０を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＯＸ４０Ｌを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＣＤ４０を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＣＤ４０Ｌを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＩＣＯＳを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＩＣＯＳＬを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＧＩＴＲを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＧＩＴＲＬを発現する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＨＬＡ－ＤＲを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＴＣＲを発現する。

いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーにより発現された第１のバイオマーカーおよび少なくとも一対の細胞の第２のメンバーにより発現された第２のバイオマーカーは、互いに相互作用する。いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーにより発現された第１のバイオマーカーおよび少なくとも一対の細胞の第２のメンバーにより発現された第２のバイオマーカーは、互いに相互作用しない。

いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞間の空間的近接は、約０．５μｍ～約５０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は２．５μｍ～約５０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は２．５μｍ～約４５μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は２．５μｍ～約４０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は２．５μｍ～約３５μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は２．５μｍ～約３０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は２．５μｍ～約２５μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は２．５μｍ～約２０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は２．５μｍ～約１５μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は５μｍ～約５０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は５μｍ～約４５μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は５μｍ～約４０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は５μｍ～約３５μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は５μｍ～約３０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は５μｍ～約２５μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は５μｍ～約２０μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は５μｍ～約１５μｍの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は、約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０μｍである。

いくつかの実施形態では、少なくとも一対の細胞間の空間的近接は約１ピクセル～約１００ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約５～約１００ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約５～約９０ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約５～約８０ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約５～約７０ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約５～約６０ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約５～約５０ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約５～約４０ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約５～約３０ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約１０～約１００ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約１０～約９０ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約１０～約８０ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約１０～約７０ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約１０～約６０ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約１０～約５０ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約１０～約４０ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は約１０～約３０ピクセルの範囲である。いくつかの実施形態では、空間的近接は、約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ピクセルである。いくつかの実施形態では、ピクセルは０．５μｍ幅である。

いくつかの実施形態では、決定する工程は、（ｉ）複数の蛍光タグで染色された、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な、所定の数の視野を選択する工程であって、この選択は、他の視野と比べて第１のバイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、（ｉｉ）選択された視野のそれぞれについて、第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含むのに十分なマージンだけ、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、（ｉｉｉ）第２のバイオマーカーを発現し、第１のバイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号内に含まれる、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第１の総面積を、規格化因子で割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、を含む。

いくつかの実施形態では、決定する工程は、（ｉ）複数の蛍光タグで染色された、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な、所定の数の視野を選択する工程であって、この選択は、他の視野と比べて第１のバイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、（ｉｉ）選択された視野それぞれについて、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約０．５μｍ～約５０μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含むように第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、（ｉｉｉ）第２のバイオマーカーを発現し、第１のバイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号内に含まれる、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第１の総面積を、規格化因子で割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、を含む。

いくつかの実施形態では、決定する工程は、（ｉ）複数の蛍光タグで染色された、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な、所定の数の視野を選択する工程であって、この選択は、他の視野と比べて第１のバイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、（ｉｉ）選択された視野それぞれについて、第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含むように約１～約１００ピクセルの範囲のマージンだけ第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、（ｉｉｉ）第２のバイオマーカーを発現し、第１のバイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号内に含まれる、選択された視野それぞれからのすべての細胞の、ピクセルで測定された第１の総面積を、規格化因子で割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、を含む。

いくつかの実施形態では、決定する工程は、（ｉ）複数の蛍光タグで染色された、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な、所定の数の視野を選択する工程であって、この選択は、他の視野と比べて第１のバイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、（ｉｉ）選択された視野それぞれについて、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約０．５μｍ～約５０μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する細胞を含むように約１～約１００ピクセルの範囲のマージンだけ第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、（ｉｉｉ）第２のバイオマーカーを発現し、第１のバイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号内に含まれる、選択された視野それぞれからのすべての細胞の、ピクセルで測定された第１の総面積を、規格化因子で割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、を含む。

いくつかの実施形態では、それぞれが異なるバイオマーカーに特異的である４つの蛍光タグが、決定する工程で使用される。さらなる実施形態では、第１の蛍光タグが、第１のバイオマーカーと関連付けられ、第２の蛍光タグが、第２のバイオマーカーと関連付けられ、第３の蛍光タグが、第３のバイオマーカーと関連付けられ、第４の蛍光タグが、第４のバイオマーカーと関連付けられる。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーは腫瘍および非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態では、第２のバイオマーカーは、非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーは腫瘍および非腫瘍マーカーを含み、第２のバイオマーカーは非腫瘍マーカーを含む。いくつかの実施形態では、第３のバイオマーカーは、すべての細胞によって発現される。いくつかの実施形態では、第４のバイオマーカーは、腫瘍細胞においてのみ発現される。いくつかの実施形態では、第３のバイオマーカーは、すべての細胞によって発現され、第４のバイオマーカーは、腫瘍細胞においてのみ発現される。いくつかの実施形態では、１つ以上の蛍光タグは、特異的バイオマーカーに対する結合親和性を有する抗体または別の抗体に結合されたフルオロフォアを含む。いくつかの実施形態では、１つ以上の蛍光タグは、特異的バイオマーカーに対する親和性を有するフルオロフォアである。

フルオロフォアの例としては、フルオレセイン、６－ＦＡＭ、ローダミン、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｒｅｄ、ｉＦｌｕｏｒ５９４、テトラメチルローダミン、カルボキシローダミン、カルボキシローダミン６Ｆ、カルボキシロドール（carboxyrhodol）、カルボキシローダミン１１０、カスケードブルー、カスケードイエロー、クマリン、Ｃｙ２（登録商標）、Ｃｙ３（登録商標）、Ｃｙ３．５（登録商標）、Ｃｙ５（登録商標）、Ｃｙ５．５（登録商標）、Ｃｙ７（登録商標）、Ｃｙ－クロム、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）３５０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４０５、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５４９、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）５９４、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６３３、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６４９、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）６８０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）７５０、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）８００、フィコエリトリン、ＰｅｒＣＰ（ペリジニンクロロフィルａタンパク質）、ＰｅｒＣＰ－Ｃｙ５．５、ＪＯＥ（６－カルボキシ－４’，５’－ジクロロ－２’，７’－ジメトキシフルオレセイン）、ＮＥＤ、ＲＯＸ（５－（および－６－）－カルボキシ－Ｘ－ローダミン）、ＨＥＸ、ルシファーイエロー、マリーナブルー、オレゴングリーン４８８、オレゴングリーン５００、オレゴングリーン５１４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）３５０、Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４３０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５３２、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５４６、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５６８、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６３３、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６４７、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６６０、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）６８０、７－アミノ－４－メチルクマリン－３－酢酸、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＦＬ－Ｂｒ２、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５３０／５５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）５５８／５６８、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６３０／６５０、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）６５０／６６５、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）Ｒ６Ｇ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＭＲ、ＢＯＤＩＰＹ（登録商標）ＴＲ、ＯＰＡＬ（商標）５２０、ＯＰＡＬ（商標）５４０、ＯＰＡＬ（商標）５７０、ＯＰＡＬ（商標）６２０、ＯＰＡＬ（商標）６５０、ＯＰＡＬ（商標）６９０、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに制限されない。いくつかの実施形態では、フルオロフォアは、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）２、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３，５、Ｃｙ（登録商標）５、Ｃｙ（登録商標）７、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、４８８色素、５５５色素、５９４色素、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、およびクマリンからなる群から選択される。４８８色素の例は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）４８８、ＤｙＬｉｇｈｔ（登録商標）４８８、およびＣＦ（商標）４８８Ａを含むがこれらに制限されない。５５５色素の例は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５５５を含むがこれに制限されない。５９４色素の例は、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）５９４を含むがこれに制限されない。

本明細書で使用される、「視野」は、組織サンプルのホールスライドデジタル画像の一部を指す。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は、２～２００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は、１０～２００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は、３０～２００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は、１０～１５０の所定の視野を有する。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は、１０～１００の所定の視野を有する。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は、１０～５０の所定の視野を有する。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は、１０～４０の所定の視野を有する。いくつかの実施形態では、ホールスライド画像は、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、または１００の所定の視野を、これらのうちの増分を含めて、有する。

いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号は、約１～約１００ピクセルの範囲のマージンだけ拡張される。いくつかの実施形態では、マージンは約５～約１００ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約５～約９０ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約５～約８０ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約５～約７０ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約５～約６０ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約５～約５０ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約５～約４０ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約５～約３０ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約１０～約１００ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約１０～約９０ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約１０～約８０ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約１０～約７０ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約１０～約６０ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約１０～約５０ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約１０～約４０ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約１０～約３０ピクセルである。いくつかの実施形態では、マージンは約１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９、または１００ピクセルである。いくつかの実施形態では、ピクセルは、０．５μｍ幅である。

いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約０．５μｍ～約５０μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約２．５μｍ～約５０μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約２．５μｍ～約４５μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約２．５μｍ～約４０μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約２．５μｍ～約３５μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約２．５μｍ～約３０μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約２．５μｍ～約２５μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約２．５μｍ～約２０μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約２．５μｍ～約１５μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約５μｍ～約５０μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約５μｍ～約４５μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約５μｍ～約４０μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約５μｍ～約３５μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約５μｍ～約３０μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約５μｍ～約２５μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約５μｍ～約２０μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約５μｍ～約１５μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張することで、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含む。いくつかの実施形態では、近位に位置する細胞上の第２のバイオマーカーは、第１のバイオマーカーと直接接触している。

いくつかの実施形態では、第２のバイオマーカーを発現する、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第１の総面積は、ピクセルで測定される。

いくつかの実施形態では、規格化因子は、選択された視野それぞれからのすべての非腫瘍細胞の第２の総面積である。いくつかの実施形態では、第２の総面積はピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第１の総面積および第２の総面積の両方がピクセルで測定される。

いくつかの実施形態では、規格化因子は、第２のバイオマーカーを発現する能力を有する、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第２の総面積である。いくつかの実施形態では、第２の総面積はピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第１の総面積および第２の総面積の両方がピクセルで測定される。

いくつかの実施形態では、規格化因子は、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第２の総面積である。いくつかの実施形態では、第２の総面積はピクセルで測定される。いくつかの実施形態では、第１の総面積および第２の総面積の両方がピクセルで測定される。

いくつかの実施形態では、閾値スコアは約５００～約５０００である。いくつかの実施形態では、閾値スコアは約５００～約４５００である。いくつかの実施形態では、閾値スコアは約５００～約４０００である。いくつかの実施形態では、閾値スコアは約５００～約３５００である。いくつかの実施形態では、閾値スコアは約５００～約３０００である。いくつかの実施形態では、閾値スコアは約５００～約２５００である。いくつかの実施形態では、閾値スコアは約５００～約２０００である。いくつかの実施形態では、閾値スコアは約５００～約１５００である。いくつかの実施形態では、閾値スコアは約５００～約１０００である。いくつかの実施形態では、閾値スコアは、約５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、または５０００であり、そのうちの増分を含める。いくつかの実施形態では、閾値スコアは、約５００、５５０、６００、６５０、７００、７５０、８００、８５０、９００、９５０、１０００、１１００、１２００、１３００、１４００、１５００、１６００、１７００、１８００、１９００、２０００、２１００、２２００、２３００、２４００、２５００、２６００、２７００、２８００、２９００、３０００、３１００、３２００、３３００、３４００、３５００、３６００、３７００、３８００、３９００、４０００、４１００、４２００、４３００、４４００、４５００、４６００、４７００、４８００、４９００、または５０００であり、そのうちの増分±１００を含める。

いくつかの実施形態では、所定の係数は約１０～約１０^５である。いくつかの実施形態では、所定の係数は約１０^２～約１０^５である。いくつかの実施形態では、所定の係数は約１０^３～約１０^５である。いくつかの実施形態では、所定の係数は約１０^４～約１０^５である。いくつかの実施形態では、所定の係数は、約１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００、２００、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１０００、１５００、２０００、２５００、３０００、３５００、４０００、４５００、５０００、５５００、６０００、６５００、７０００、７５００、８０００、８５００、９０００、９５００、１００００、２００００、３００００、４００００、５００００、６００００、７００００、８００００、９００００、または１０^５であり、そのうちの増分を含める。

いくつかの実施形態では、予知力は、陽性的中率、陰性的中率、またはそれらの組み合わせとして定量化される。陽性的中率は、閾値スコアを上回るスコアの、治療に反応した患者の数を、治療に反応した患者の総数で割ることにより計算される。陰性的中率は、閾値スコアを下回るスコアの、治療に反応しなかった患者の数を、治療に反応しなかった患者の総数で割ることにより計算される。

いくつかの実施形態では、陽性的中率は６０％超である。いくつかの実施形態では、陽性的中率は６５％以上である。いくつかの実施形態では、陽性的中率は７０％以上である。いくつかの実施形態では、陽性的中率は７５％以上である。いくつかの実施形態では、陽性的中率は８０％以上である。いくつかの実施形態では、陽性的中率は約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、９９％であり、そのうちの増分を含める。

いくつかの実施形態では、陰性的中率は６０％以上である。いくつかの実施形態では、陰性的中率は６５％以上である。いくつかの実施形態では、陰性的中率は７０％以上である。いくつかの実施形態では、陰性的中率は７５％以上である。いくつかの実施形態では、陰性的中率は８０％以上である。いくつかの実施形態では、陰性的中率は約５０、５１、５２、５３、５４、５５、５６、５７、５８、５９、６０、６１、６２、６３、６４、６５、６６、６７、６８、６９、７０、７１、７２、７３、７４、７５、７６、７７、７８、７９、８０、８１、８２、８３、８４、８５、８６、８７、８８、８９、９０、９１、９２、９３、９４、９５、９６、９７、９８、または９９％であり、そのうちの増分を含める。

本明細書に開示する方法では、癌患者は哺乳動物である。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトである。いくつかの実施形態では、哺乳動物はヒトではない。さらなる実施形態では、哺乳動物は、マウス、ラット、モルモット、犬、猫、または馬である。

本明細書に開示する方法では、腫瘍組織は癌患者から採取される。癌の種類としては、以下の部位の癌が含まれるが、これらに制限されない：循環系、例えば、心臓（肉腫［血管肉腫、線維肉腫、横紋筋肉腫、脂肪肉腫］、粘液腫、横紋筋腫、線維腫、脂肪腫および奇形腫）、中隔膜および肋膜、および他の胸腔内器官、血管腫瘍および腫瘍関連の血管組織；気道、例えば、鼻腔および中耳、副鼻腔、喉頭、気管、気管支および肺、例えば小細胞肺癌（ＳＣＬＣ）、非小細胞肺癌（ＮＳＣＬＣ）、気管支原性癌（扁平細胞、未分化小細胞、未分化大細胞、腺癌）、肺胞癌（細気管支癌）、気管支腺腫、肉腫、リンパ腫、軟骨性過誤腫、中皮腫；胃腸系、例えば、食道（扁平細胞癌、腺癌、平滑筋肉腫、リンパ腫）、腹（癌腫、リンパ腫、平滑筋肉腫）、胃、膵臓（管状腺癌、インスリノーマ、グルカゴノーマ、ガストリノーマ、カルチノイド腫瘍、ビポーマ）、小腸（腺癌、リンパ腫、カルチノイド腫瘍、カポジ肉腫、平滑筋腫、血管腫、脂肪腫、神経線維腫、線維腫）、大腸（腺癌、管状腺腫、絨毛腺腫、過誤腫、平滑筋腫）；尿生殖路、例えば、腎臓（腺癌、ウィルムス腫瘍［腎芽腫］、リンパ腫、白血病）、膀胱および／または尿道（扁平細胞癌、移行上皮癌、腺癌）、前立腺（腺癌、肉腫）、精巣（セミノーマ、奇形腫、胚性癌腫、奇形癌腫、絨毛癌、肉腫、間質細胞癌、線維腫、線維腺腫、腺腫様腫瘍、脂肪腫）；肝臓、例えば、肝細胞腫（肝細胞癌）、胆管細胞癌、肝芽腫、血管肉腫、肝細胞腺腫、血管腫、膵内分泌腫瘍（褐色細胞腫、インスリノーマ、血管作動性腸ペプチド腫瘍、膵島腫瘍およびグルカゴノーマなど）；骨、例えば、骨原性肉腫（骨肉腫）、線維肉腫、悪性線維性組織球腫、軟骨肉腫、ユーイング肉腫、悪性リンパ腫（細網細胞肉腫）、多発性骨髄腫、悪性巨細胞腫瘍脊索腫、骨軟骨腫（osteochronfroma）（骨軟骨性外骨症）、良性脊索腫（benign chondroma）、軟骨芽細胞腫、軟骨筋線維腫、類骨腫および巨細胞腫瘍；神経系、例えば、中枢神経系（ＣＮＳ）の新生物、原発性ＣＮＳリンパ腫、頭蓋癌（skull cancer）（骨腫、血管腫、肉芽腫、黄色腫、変形性骨炎）、髄膜（髄膜腫、髄膜肉腫、神経膠腫症）、脳癌（星状細胞腫、髄芽腫、神経膠腫、上衣腫、胚細胞腫［松果体腫］、多形神経膠芽腫（glioblastoma multiform）、乏突起神経膠腫、シュワン腫、網膜芽細胞腫、先天性腫瘍）、脊髄神経線維腫、髄膜腫、神経膠腫、肉腫）；生殖器系、例えば、婦人科、子宮（子宮内膜癌）、子宮頸部（子宮頸癌、腫瘍前（pre-tumor）子宮頸部異形成）、卵巣（卵巣癌［漿液性嚢胞腺癌、粘液性嚢胞腺癌、分類不能癌腫（unclassified carcinoma）］、顆粒膜莢膜細胞腫（granulosa-thecal cell tumors）、セルトリ・ライディッヒ細胞腫、未分化胚細胞腫、悪性奇形腫）、陰門（扁平細胞癌、上皮内癌、腺癌、線維肉腫、黒色腫）、膣（明細胞癌、扁平細胞癌、ブドウ状横紋筋肉腫（胎児性横紋筋肉腫）、卵管（癌）および女性生殖器に関連する他の部位；胎盤、陰茎、前立腺、精巣、および男性生殖器に関連する他の部位；血液系（hematologic system）、例えば、血液（骨髄性白血病［急性および慢性］、急性リンパ性白血病、慢性リンパ性白血病、骨髄増殖性疾患、多発性骨髄腫、骨髄異形成症候群）、ホジキン病、非ホジキンリンパ腫［悪性リンパ腫］；口腔、例えば、唇、舌、歯茎、口腔底部、口蓋、および口の他の部分、耳下腺、および唾液腺の他の部分、扁桃、中咽頭、上咽頭、梨状陥凹、下咽頭、および唇、口腔、咽頭の他の部位；皮膚、例えば、悪性黒色腫、皮膚黒色腫、基底細胞癌、扁平細胞癌、カポジ肉腫、異形成性母斑（moles dysplastic nevi）、脂肪腫、血管腫、皮膚線維腫、および蟹足腫；副腎：神経芽細胞腫；結合組織および軟組織、後腹膜および腹膜、目、眼内黒色腫、および付属器、胸、頭または／および首、肛門領域、甲状腺、副甲状腺、副腎および他の内分泌腺および関連構造を含む他の組織、リンパ節の続発性および詳細不明の悪性新生物、呼吸器系および消化器系の続発性悪性新生物、他の部位の続発性悪性新生物、またはこれらの１つ以上の組み合わせ。

免疫療法の例は、モノクローナル抗体（例えば、アレムツズマブもしくはトラスツズマブ）、結合モノクローナル抗体（例えば、イブリツモマブチウキセタン、ブレンツキシマブベドチン（brentuximab vendotin）、もしくはアドトラスツズマブエムタンシン（ado-trastuzumab emtansine））、二重特異性モノクローナル抗体（ブリナツモマブ）、免疫チェックポイント阻害薬（例えば、イピリムマブ、ペンブロリズマブ、ニボルマブ、アテゾリズマブ、もしくはデュルバルマブ）、サリドマイド、レナリドマイド、ポマリドマイド、およびイミキモド、およびそれらの組み合わせを含むがこれらに制限されない。いくつかの実施形態では、免疫療法は免疫チェックポイント療法を含む。

別の態様では、腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な所定の数の視野に存在する複数の細胞の中から選択された少なくとも一対の細胞間の空間的近接を表すスコアを決定する方法が本明細書で開示され、このサンプルは、癌患者から採取され、この方法は、（ｉ）複数の蛍光タグで染色された、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な、所定の数の視野を選択する工程であって、この選択は、他の視野と比べて第１の特異的バイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、（ｉｉ）選択された視野それぞれについて、第２の特異的バイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含むように第１の特異的バイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、（ｉｉｉ）第２の特異的バイオマーカーを発現し、第１の特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号内に含まれる、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第１の総面積を、規格化スコアで割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１の特異的バイオマーカーの発現の定量化または第２の特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予知力を提供する。

別の態様では、腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な所定の数の視野に存在する複数の細胞の中から選択された少なくとも一対の細胞間の空間的近接を表すスコアを決定する方法が本明細書で開示され、このサンプルは癌患者から採取され、この方法は、（ｉ）複数の蛍光タグで染色された、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な、所定の数の視野を選択する工程であって、この選択は、他の視野と比べて第１のバイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、（ｉｉ）選択された視野のそれぞれについて、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約０．５μｍ～約５０μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する細胞を含むように、第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、（ｉｉｉ）第２のバイオマーカーを発現し、第１のバイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号内に含まれる、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第１の総面積を、規格化因子で割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１の特異的バイオマーカーの発現の定量化または第２の特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予知力を提供する。

別の態様では、腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な所定の数の視野に存在する複数の細胞の中から選択された少なくとも一対の細胞間の空間的近接を表すスコアを決定する方法が本明細書で開示され、このサンプルは癌患者から採取され、この方法は、（ｉ）複数の蛍光タグで染色された、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な、所定の数の視野を選択する工程であって、この選択は、他の視野と比べて第１のバイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、（ｉｉ）選択された視野それぞれについて、第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含むように約１～約１００ピクセルの範囲のマージンだけ第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、（ｉｉｉ）第２のバイオマーカーを発現し、第１のバイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号内に含まれる、選択された視野それぞれからのすべての細胞の、ピクセルで測定された第１の総面積を、規格化因子で割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１の特異的バイオマーカーの発現の定量化または第２の特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予知力を提供する。

別の態様では、腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な所定の数の視野に存在する複数の細胞の中から選択された少なくとも一対の細胞間の空間的近接を表すスコアを決定する方法が本明細書で開示され、このサンプルは癌患者から採取され、この方法は、（ｉ）複数の蛍光タグで染色された、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な、所定の数の視野を選択する工程であって、この選択は、他の視野と比べて第１のバイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、（ｉｉ）選択された視野それぞれについて、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約０．５μｍ～約５０μｍ以内の第２のバイオマーカーを発現する細胞を含むように約１～約１００ピクセルの範囲のマージンだけ第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、（ｉｉｉ）第２のバイオマーカーを発現し、第１のバイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号内に含まれる、選択された視野それぞれからのすべての細胞の、ピクセルで測定された第１の総面積を、規格化因子で割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、を含む。いくつかの実施形態では、この方法は、第１の特異的バイオマーカーの発現の定量化または第２の特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて優れた予知力を提供する。

いくつかの実施形態では、空間的近接スコア（ＳＰＳ）は、以下の方程式によって決定され：

式中、Ａ_Ｉは、総相互作用面積（第２の特異的バイオマーカーを発現し、第１の特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号により含まれる細胞の総面積）であり、Ａ_ＮＴは非腫瘍細胞の総面積である。

いくつかの実施形態では、空間的近接スコアは以下の方程式によって決定され：

式中、Ａ_Ｉは、総相互作用面積（第２の特異的バイオマーカーを発現し、第１の特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号により含まれる細胞の総面積）であり、Ａ_Ｃは、第２の特異的バイオマーカーを発現する能力を有する細胞の総面積である。

別の態様では、癌患者からの腫瘍組織を含むサンプルにスコアを付ける方法は、患者の癌を治療する方法で使用される。いくつかの実施形態では、癌患者からの腫瘍組織を含むサンプルにスコアを付ける方法は、免疫療法を施与する前に行われる。

いくつかの実施形態では、癌治療を必要とする患者において癌を治療する方法が本明細書で開示され、この方法は、（ａ）患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルにスコアを付ける工程であって、（ｉ）患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルを用いて、少なくとも一対の細胞間の空間的近接を表すスコアを決定する工程であって、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーが第１のバイオマーカーを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーが第１のバイオマーカーとは異なる第２のバイオマーカーを発現する、工程、および（ｉｉ）スコアを記録する工程を含む、工程と、（ｂ）スコアを閾値と比較する工程と、（ｂ）スコアが、閾値と比較した場合に、患者が免疫療法に陽性的に反応する可能性を示す場合に、患者に免疫療法を施与する工程と、を含む。いくつかの実施形態では、決定する工程は、本明細書に記載するとおりである。

図１４は、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルにスコアを付ける方法の一実施形態の工程を描いたフローチャートである。工程１４０１では、画像データが得られ、工程１４０２では、さまざまなタイプの蛍光信号に特異的なデータが異なるチャネルに分割されるように画像データが分離される。工程１４０３では、第１のチャネルからのデータを用いて、第１のバイオマーカーに対して陽性であるすべての細胞のマスク（第１のバイオマーカーマスク）を生成する。すべての細胞のマスクは次に、拡張され（工程１４０４）、（第２のバイオマーカーに対して陽性である）相互作用する細胞を見つけることのできる所定の近接を表す拡張マスクを生成する。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーマスクは、１～１００ピクセル拡張される。工程１４０５では、第２のチャネルからのデータを用いて、第２のバイオマーカーに対して陽性であるすべての細胞のマスク（第２のバイオマーカーマスク）を生成する。工程１４０６では、第１のバイオマーカーマスクおよび第２のバイオマーカーマスクが組み合わせられて、第１のバイオマーカーに対して陽性である細胞の所定の近接の範囲内にある、第２のバイオマーカーに対して陽性である細胞を特定する、相互作用マスクを生成する。工程１４０７では、空間的近接スコアが、相互作用マスクの面積に基づいて計算される。

図１５は、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルにスコアを付ける方法の第２の実施形態の工程を描いた第２のフローチャートである。工程１５０１では、画像データが得られ、工程１５０２では、さまざまなタイプの蛍光信号に特異的なデータが異なるチャネルに分割されるように画像データが分離される。工程１５０３では、第１のチャネルからのデータを用いて、視野内のすべての細胞のマスクを生成し、工程１５０４では、第２のチャネルからのデータを用いて、視野内の腫瘍領域などのサブセット領域のマスクを生成する。工程１５０５では、すべての細胞のマスクがサブセット領域のマスクと組み合わせられて、サブセット細胞のマスクおよび非サブセット細胞のマスクを生成する。いくつかの実施形態では、サブセット細胞は腫瘍細胞であり、非サブセット細胞は非腫瘍細胞である。工程１５０６では、第３のチャネルからのデータを用いて、第１のバイオマーカーに対して陽性であるすべての細胞のマスク（第１のバイオマーカーマスク）を生成する。すべての陽性細胞のマスクは次に拡張され（工程１５０７）、相互作用する細胞（すなわち第２のバイオマーカーに対して陽性である細胞）を見つけることのできる所定の近接を表す拡張マスクを生成する。いくつかの実施形態では、第１のバイオマーカーマスクは、１～１００ピクセル拡張される。工程１５０８では、第４のチャネルからのデータを用いて、第２のバイオマーカーに対して陽性であるすべての細胞のマスク（第２のバイオマーカーマスク）を生成する。工程１５０９では、拡張マスクおよび第２のバイオマーカーマスクが組み合わせられて、第２のバイオマーカーに対して陽性であり、第１のバイオマーカーに対して陽性である細胞の所定の近接の範囲内にある細胞を特定する相互作用マスクを生成する。工程１５１０では、空間的近接スコアが、相互作用マスクの面積を、第２のバイオマーカーに対して陽性となることのできるすべての細胞（サブセット細胞）の面積で、またはすべての細胞の面積で、（いずれかの入力の使用を表す図１５のフローチャートの点線によって示されるように）割ることにより計算される。いくつかの実施形態では、第２のバイオマーカーに対して陽性となることのできる細胞は、腫瘍細胞または非腫瘍細胞である。

いくつかの実施形態では、細胞のサブセットおよび細胞の非サブセットは、腫瘍細胞および非腫瘍細胞に、または非腫瘍細胞および腫瘍細胞に、それぞれ対応する。いくつかの実施形態では、細胞のサブセットおよび細胞の非サブセットは、生存細胞および非生存細胞に、または、非生存細胞および生存細胞に、それぞれ対応する。いくつかの実施形態では、細胞のサブセットは、生存細胞のサブセットであり、細胞の非サブセットは、生存細胞のサブセットに含まれていない生存細胞からなる。いくつかの実施形態では、細胞のサブセットおよび細胞の非サブセットは、Ｔ細胞および非Ｔ細胞に、または非Ｔ細胞およびＴ細胞に、それぞれ対応する。いくつかの実施形態では、細胞のサブセットおよび細胞の非サブセットは、骨髄系細胞および非骨髄系細胞に、または非骨髄系細胞および骨髄系細胞に、それぞれ対応する。

いくつかの実施形態では、空間的近接スコアは、一対の細胞の近さを表す。いくつかの実施形態では、一対の細胞の近さは、一対の細胞の境界間の近接によって、一対の細胞の重心間の近接によって、一対の細胞のうちの選択された第１の細胞周辺の外辺部に基づく境界論理（boundary logic）を使用することによって、一対の細胞の境界における交点を決定することによって、および／または一対の細胞の重なり領域を決定することによって、決定され得る。

いくつかの実施形態では、空間的近接スコアは、サンプルの画像と関連付けられたメタデータと関連付けられ、作成されるレポートに含まれ、免疫療法戦略を決定するためにオペレーターに提供され、データベースに記録され、患者の医療記録と関連付けられ、かつ／またはディスプレイデバイス上で表示される。

本明細書に開示する方法では、デジタル画像の操作は、例示的な実施形態によると、図１６のブロック図に示されるコントローラなどのコントローラを含む、コンピューターシステムにより実行され得る。コントローラ２００は、通信インターフェース２０２および処理回路２０４を含むことが示されている。通信インターフェース２０２は、さまざまなシステム、デバイス、またはネットワークとデータ通信を行うために有線または無線インターフェース（例えば、ジャック、アンテナ、送信機、受信機、トランシーバー、ワイヤ端子など）を含み得る。例えば、通信インターフェース２０２は、イーサネットに基づく通信ネットワークを介してデータを送受信するためのイーサネットカードおよびポート、ならびに／または無線通信ネットワークを介して通信するためのＷｉＦｉトランシーバーを含み得る。通信インターフェース２０２は、ローカルエリア・ネットワークまたは広域ネットワーク（例えば、インターネット、建造物のＷＡＮ（building WAN）など）を介して通信するように構成され得、さまざまな通信プロトコル（例えば、ＢＡＣｎｅｔ、ＩＰ、ＬＯＮなど）を使用し得る。

通信インターフェース２０２は、コントローラ２００とさまざまな外部システムもしくはデバイス（例えば、撮像デバイス１０２）との間の電子データ通信を促進するように構成されたネットワークインターフェースであってよい。例えば、コントローラ２００は、撮像デバイス１０２から選択された視野の撮像データを受信して、データを分析し、空間的近接スコア（ＳＰＳ）を計算することができる。

さらに図１６を参照すると、処理回路２０４は、プロセッサ２０６およびメモリ２０８を含むことが示されている。プロセッサ２０６は、汎用もしくは特定用途プロセッサ、特定用途向け集積回路（ＡＳＩＣ）、１つ以上のフィールド・プログラマブル・ゲート・アレイ（ＦＰＧＡ）、処理構成要素群、または他の適切な処理構成要素であってよい。プロセッサ５０６は、メモリ５０８に記憶されるかまたは他のコンピュータ可読媒体（例えば、ＣＤＲＯＭ、ネットワーク記憶装置、リモートサーバーなど）から受信された、コンピュータコードまたは命令を実行するように構成され得る。

メモリ２０８は、本開示に記載されるさまざまなプロセスを完了し、かつ／または容易にするためにデータおよび／またはコンピュータコードを記憶するための１つ以上のデバイス（例えば、メモリ装置、メモリデバイス、記憶デバイスなど）を含み得る。メモリ２０８は、ソフトウェアオブジェクトおよび／もしくはコンピュータ命令を記憶するための、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、読み出し専用メモリ（ＲＯＭ）、ハードドライブ記憶装置、一時記憶装置、不揮発性メモリ、フラッシュメモリ、光学メモリ、または、任意の他の適切なメモリを含み得る。メモリ２０８は、データベース構成要素、オブジェクトコード構成要素、スクリプト構成要素、またはさまざまな活動を支持するための任意の他のタイプの情報構造および本開示に記載される情報構造を含み得る。メモリ５０８は、処理回路２０４を介してプロセッサ２０６に通信可能に接続され得、本明細書に記載する１つ以上のプロセスを（例えば、プロセッサ２０６によって）実行するためのコンピュータコードを含み得る。

さらに図１６を参照すると、コントローラ２００は、撮像デバイス１０２から入力を受信することが示されている。撮像デバイスは、撮像データをすべて取得し、それを説明するすべてのメタデータと共に、その撮像データを記録する。撮像デバイスは次に、データをシリアライズして、コントローラ２００により読み取られ得るストリームにする。このデータストリームは、ファイルシステム、ＲＤＢＭ、または直接ＴＣＰ／ＩＰ通信など、任意のバイナリデータストリームタイプに適応し得る。データストリームの使用のため、コントローラ２００は、スペクトルアンミキサ（spectral unmixer）２１０を含むことが示されている。スペクトルアンミキサ２１０は、撮像デバイス１０２から画像データを受信することができ、これに対してスペクトルアンミキシングを行って、さまざまな波長を示す画像を、波長のバンドごとに個々の別個のチャネルへと分離する。例えば、画像データは、組織サンプル中の目的の細胞またはタンパク質を特定するのに使用されるさまざまなフルオロフォアそれぞれについて別々のチャネルへと「分離され」得る。フルオロフォアは、ほんの一例として、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）２、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３，５、Ｃｙ（登録商標）５、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、４８８色素、５５５色素、５９４色素、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄからなる群の１つ以上であってよい。一実施例では、チャネルのうちの１つが、画像内の核を特定するために、４６１ｎｍの波長（ＤＡＰＩの最大発光波長）を囲む所定のバンドに該当する画像データを含み得る。他のチャネルは、異なるフルオロフォアを用いて組織サンプルの種々の部分を特定するために異なる波長の画像データを含み得る。

コントローラ２００はまた、さまざまなマスカ（maskers）、例えば細胞マスカ２１２、サブセット領域マスカ２１６、第１のバイオマーカーマスカ２２、および第２のバイオマーカーマスカ２２４、を含むことが示されている。コントローラ２００に含まれ得るこれらのマスカ、または他のマスカは、他の実施形態では、スペクトルアンミキサ２１０から分離信号（unmixed signal）を受信し、組織サンプル中のある目的の特徴を特定するのに使用されるフルオロフォアに応じて、目的の特定の細胞または領域のためのマスクを作るのに使用される。マスクを作るために、マスカ（細胞マスカ２１２、サブセット領域マスカ２１６、第１のバイオマーカーマスカ２２、および第２のバイオマーカーマスカ２２４など）は、視野内の各ピクセルの強度に関連する画像データを受信する。ピクセル強度は、サンプルが発する蛍光の量に正比例し、この蛍光の量は、（特定のバイオマーカーを特定するためにフルオロフォアを使用する場合）サンプル中のタンパク質バイオマーカーの量に正比例する。絶対閾値が、画像ピクセルに存在する値に基づいて設定され得る。閾値以上であるピクセルはすべて、１．０、または「オン」にマッピングされ、他のピクセルはすべて、０．０、または「オフ」にマッピングされる。このように、バイナリマスクは、視野内の目的の細胞または組織部分を特定するように作られる。他の実施形態では、マスクは、下限を用いて作られ、下限以上の強度を有するすべてのピクセルは、マスクのためのピクセル値として許容および使用される。強度が下限を下回る場合、ピクセル値は０．０、または「オフ」に設定される。

図１７に示すマスキングのための例としてのフローダイヤグラムでは、（核および腫瘍領域をそれぞれ特定するための）ＤＡＰＩおよび４８８チャネルが下限プロトコルを使用する（工程１７１０、１７１２、１７２０、１７２２）が、（バイオマーカーを特定するための）Ｃｙ５およびＣｙ３．５チャネルは、閾値プロトコルを使用して（工程１７３０、１７４０）、マスク出力を提供することが示されている。下限プロトコルに関連して、下限を決定するためのヒストグラム工程もある。具体的には、ヒストグラム閾値（工程１７１２、１７２２）は、入力画像の閾値を作り出すが、閾値化が生じる時点を決定するスライディングスケール（sliding scale）を用いる。入力は、現在の画像およびユーザが定める閾値パーセンテージである。ユーザが定める閾値パーセンテージは、閾値レベルが設定されるべき全強度のパーセントを決定するのに使用される。最初に、各ピクセルの強度が合計されて全強度になる。閾値パーセンテージに、この全強度をかけ合わせて、切り捨て合計（cut-off sum）を得る。最後に、全ピクセルを強度によって（ヒストグラムで）グループ分けし、それらの強度を、切り捨て合計が達成されるまで、最も低いものから最も高いものまで（ビン単位で）合計する。プロセスで現れる最後の最も高いピクセル強度が、現在の画像の閾値である。その値より高い強度を有するピクセルはすべて、それらの強度が最大に設定されるが、他のものはすべて、最小に設定される。

図１７で工程１７１４、１７１６、１７２４、１７２６、１７２８、１７３２、１７３４、１７３６、１７４２、１７４４として特定される工程は、細胞マスカ２１２、サブセット領域マスカ２１６、第１のバイオマーカーマスカ２２２、第２のバイオマーカーマスカ２２４などの初期マスカで行われる中間工程を表す。これらの工程は以下のとおり定められる。

拡張は、画像中の最も明るい領域の面積を増やす。２つの入力が拡張に必要である。第１の入力は、絶対的な現在の画像であり、第２の入力は、拡張させる反復の回数である。バイナリ画像のみが第１の入力に使用されることが想定される。この処置は、連続的な画像に対して効果があるが、出力は、有効な拡張とはならない。拡張プロセスは、最初に、画像中の最大ピクセル強度を見つけることにより始まる。続いて、画像中の各ピクセルが１回調査される。調査中のピクセルが最大強度に等しい強度を有する場合、そのピクセルは、反復半径（iterations radius）を有し、元のピクセル上に中心を置く円として出力画像に描かれる。その円内の全ピクセルは、最大強度に等しい強度を有する。すべての他のピクセルは、修正なしに、出力画像へコピーされる。

穴埋め処置は、画像の「空の」領域を最大強度のピクセルで埋める。これらの空の領域は、最小強度を有し、かつピクセル面積（サイズ）がユーザにより特定された、領域である。現在の画像およびサイズは、必要とされる２つの入力である。拡張と同様に、この処置は、バイナリ画像にのみ適用されるものとする。

侵食は、拡張と同じように画像を処理する。すべての機能性は、第１の工程で画像中の最小強度を決定し、その最低強度に適合するピクセルのみが変更され、見つかった最小強度ピクセルをブルーミングするのに使用される円が、最低強度値で埋められることを除き、拡張と同じである。拡張と同じように、この処置は、バイナリ画像にのみ適用されるものとする。

オブジェクト除去。２つの入力：現在の画像およびオブジェクトサイズ、が求められる。オブジェクト除去は、穴埋め処置とは反対である。入力されたオブジェクトサイズより小さい面積を埋める最大強度のピクセルのみを含むあらゆる領域が、最小強度に設定され、よって「除去される」。この処置は、バイナリ画像にのみ適用されるものであり、連続した画像への適用は、予想外の結果を生じ得る。

最終工程１７１８、１７２９、１７３８、１７４６での出力は、それぞれ、結果として得られる細胞のマスク、サブセット領域のマスク（または、この特定の実施例では、腫瘍領域のマスク）、バイオマーカー１の細胞のマスク、およびバイオマーカー２の細胞のマスクである。図１７は、空間的近接スコアを計算するための、これらの結果として得られるマスクの組み合わせをさらに描いている。これらの組み合わせは、図１６に描かれる、コントローラ２００の組み合わせマスカを参照して、以下でさらに説明する。

コントローラ２００は、サブセット細胞マスカ２１８、非サブセット細胞マスカ２２０、相互作用マスカ２３０などの組み合わせマスカを含むことが示されている。サブセット細胞のマスカは、図１７の工程１７５２に示すように、Ａｎｄ操作を行い、（画像中のすべての細胞を表す）細胞マスカ２１２の出力を、サブセット領域マスカ２１６の出力と組み合わせる。したがって、サブセット細胞マスカは、画像中のすべてのサブセット細胞のマスクを生成する。いくつかの実施形態では、サブセット細胞は腫瘍細胞である。この同じ組み合わせは、図１７の工程１７５４に示すように非サブセット細胞マスカ２２０によって行われるＯｕｔ操作を用いて、サンプル画像中のすべての非サブセット細胞のマスクを生成する。いくつかの実施形態では、非サブセット細胞は非腫瘍細胞である。

別のマスクと組み合わせられる前に、（第１のバイオマーカーマスカ２２２からの）第１のバイオマーカーマスクが、拡張器２２６によって拡張される。拡張マスクは、第１のバイオマーカーを発現する細胞を取り囲む領域を表し、第２のバイオマーカーを発現する細胞が第１のバイオマーカーを発現する細胞と相互作用するよう適切な近接の範囲内にあるであろう空間を特定する。これは、図１７の工程１７５６および１７５８によって表される。図１７のフローチャートは、２つの工程１７５６および１７５８で行われる拡張を示す。これは、各工程において最大反復に制限がある場合に必要とされ得る。例えば、（１０ピクセルの増加に対応する）最大で１０回の反復があってよく、そのため、２０ピクセルの増加が必要な場合、拡張は、後続の２工程に分割されなければならない。

第２のバイオマーカーマスカ２２４内で、バイオマーカーマスクは、図１７の工程１７６０に示すようなＡｎｄ操作を用いて、前述した非サブセット細胞のマスクと組み合わせられて、第１のバイオマーカーに対して陽性であるすべての非サブセット細胞のマスクを生成することができる。次に、このマスクは、相互作用マスカ２３０において、拡張器２２６からの拡張マスクと組み合わせられて（工程１７６２）、相互作用マスクを生成する。相互作用マスクは、第２のバイオマーカーに対して陽性であり、かつ相互作用領域内にあるか、または、拡張マスクと重なる、非サブセット細胞を特定した。これらの特定された細胞は、その後、第１のバイオマーカーに対して陽性である細胞と相互作用し得る細胞を表し、よって、より高い治療反応性を生じる。

空間的近接スコア（ＳＰＳ）を計算するため、相互作用マスクの面積が、面積評価器２３２においてピクセルで決定される。いくつかの実施形態では、第２のバイオマーカーを発現することができるすべての細胞の面積は、面積評価器２３４においてピクセルで決定される。第２のバイオマーカーを発現することができる細胞は、腫瘍細胞または非腫瘍細胞であってよい。いくつかの実施形態では、いくつかの実施形態では、すべての細胞の面積は、面積評価器２３４においてピクセルで決定される。相互作用または空間的近接スコアは、面積評価器２３２からの面積を面積評価器２３４からの面積で割り、所定の係数をかけ合わせることによって、相互作用計算器２３６において決定される。前述のとおり、一実施形態では、相互作用計算器２３６により実行される方程式は以下のとおりであり：

式中、Ａ_Ｉは、総相互作用面積（第２の特異的バイオマーカーを発現し、第１の特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号により含まれる細胞の総面積）であり、Ａ_Ｃは、第２の特異的バイオマーカーを発現する能力を有する細胞の総面積、または視野内のすべての細胞の総面積である。

Ａｎｄ処置は、バイナリのＡｎｄ操作をモデルにしているが、著しく異なっている。Ａｎｄは、現在の画像、およびユーザが選択した結果を受け入れる。この出力は、２つの入力画像からの適合するピクセルの正規化された強度の掛け算を実行することで作られた画像である。場合によっては、画像の強度データは、既に正規化されている。したがって、Ａｎｄ処置は、単に２つの画像のピクセルごとの掛け算である。Ｏｕｔに必要な２つの入力は、現在の画像およびユーザが選択した結果である。Ｏｕｔは、式Ａ^＊（１－Ｂ／Ｂ_ｍａｘ）に従って第１の画像から第２の画像を除去し、式中、Ａは現在の画像であり、Ｂは、除去されるユーザが選択した画像であり、Ｂ_ｍａｘはＢの最大強度である。ＢをＢ_ｍａｘで割ることによりＢを正規化することに留意されたい。

〔実施例〕
実施例１．ヒト患者からの黒色腫組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
サンプル調製。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルから、ろうを取り除いた。次にスライドは、蒸留水中でインキュベートする前に、一連のキシレンからアルコールまでの洗浄を通じて再水和された。次に、熱によって誘導された抗原回復が、高温高圧条件を用いて実行され、冷却され、トリス緩衝食塩水へと移された。次に染色が行われ、以下の工程が実行された。まず、内在性ペルオキシダーゼが遮断され、続いて、タンパク質遮断溶液でインキュベートして、非特異的抗体染色を低減した。次に、スライドを、マウス抗ＰＤ１一次抗体で染色した。その後、スライドは、抗マウスＨＲＰ二次抗体でインキュベートする前に洗浄した。スライドを洗浄し、その後、ＰＤ－１染色が、ＴＳＡ＋Ｃｙ（登録商標）３．５（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出された。次に、残留ＨＲＰが、新鮮な１００ｍＭのベンズヒドラジドと５０ｍＭの過酸化水素の２回の洗浄を用いて、冷却された。スライドは、ウサギ抗ＰＤ－Ｌ１一次抗体での染色前に再び洗浄された。スライドを洗浄し、次に、４８８色素で直接標識されたマウス抗Ｓ１００を加えた抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）との混合物でインキュベートした。スライドを洗浄し、次にＴＳＡ－Ｃｙ（登録商標）５（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いてＰＤ－Ｌ１染色を検出した。スライドは、封入剤と共にカバーガラスをかける（cover-slipped）前に最後に洗浄し、室温で一晩乾燥させた。抗体および検出試薬の概要を図１に示す。あるいは、スライドは、抗ＰＤ１一次抗体の代わりに抗ＣＤ８一次抗体で染色した。

サンプル撮像および分析。蛍光画像を、Ｖｅｃｔｒａソフトウェアバージョン２．０．８を用いるＶｅｃｔｒａ ２ Ｉｎｔｅｌｌｉｇｅｎｔ Ｓｌｉｄｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ Ｓｙｓｔｅｍ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を使用して、取得した。まず、スライドのモノクローム撮像を、ＤＡＰＩを使用して４ｘの倍率で行った。（ｉｎＦｏｒｍを用いて開発した）自動化アルゴリズムを使用して、組織を収容するスライドの領域を特定した。

組織を収容していると特定されたスライドの領域を、４ｘの倍率でＤＡＰＩ（青色）、ＦＩＴＣ（緑色）、Ｃｙ（登録商標）５（赤色）に関連付けられたチャネルついて撮像し、ＲＧＢ画像を生成した。これらの４ｘの画像は、視野セレクター１０４において（ｉｎＦｏｒｍを用いて開発した）自動化濃縮アルゴリズムを用いて処理し、最も高いＣｙ（登録商標）５発現に従って可能な２０ｘの倍率の視野を特定およびランク付けした。

上位４０の視野を、ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ、Ｃｙ（登録商標）５の波長にわたって２０ｘの倍率で撮像した。原画像を、受容性について再調査し、焦点が外れた、腫瘍細胞がない、非常に壊死性であった、または、予測された抗体局在と関連のない高いレベルの蛍光信号（すなわち背景染色）を含んだ、画像は、分析前に拒絶された。受容された画像は、ＡＱＵＡｄｕｃｔ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて処理し、各フルオロフォアは、スペクトルアンミキサ２１０によって、個々のチャネルへとスペクトルが分離されて、別ファイルとして保存された。

処理されたファイルを、ＡＱＵＡｎａｌｙｓｉｓ（商標）を用いて、またはＡＱＵＡｓｅｒｖｅ（商標）を用いる完全自動化プロセスを通じて、さらに分析した。詳細は以下のとおりであった。

各ＤＡＰＩ画像は、核マスカ２１２によって処理し、その画像内にあるすべての細胞核を特定し（図２ａ）、その後、３ピクセルだけ拡張して、完全な細胞の適切なサイズを表した。この結果として得られたマスクは、その画像内のすべての細胞を表した（図２ｂ）。

４８８色素で検出されたＳ１００（黒色腫用の腫瘍細胞マーカー）（図３ａ）を、腫瘍マスカ２１６によって処理し、その画像内のすべての腫瘍領域のバイナリマスクを作成した（図３ｂ）。このマスクと、すべての細胞のマスクとの重なりが、腫瘍細胞マスカ２１８を用いて腫瘍細胞の新しいマスクを作成した（図３ｃ）。

同様に、すべての核のマスクと組み合わせた腫瘍細胞マーカーがないことで、すべての非腫瘍細胞の新しいマスクを作成し（図３ｄ）、これは非腫瘍細胞マスカ２２０を用いて行った。

各Ｃｙ（登録商標）５画像（図４ａ）は、第１のバイオマーカーマスカ２２２によって処理し、すべての細胞のマスクと重ね合わせて、ＰＤ－Ｌ１陽性であるすべての細胞のバイナリマスクを作成した（図４ｂ）。すべての細胞のマスクとバイオマーカーマスクを重ねることにより、マスク内でバイオマーカー陽性細胞として誤って特定され得るノイズピクセルが排除された。

各Ｃｙ（登録商標）３．５画像（図５ａ）は、第２のバイオマーカーマスカ２２４によって処理して、ＰＤ－１陽性細胞のバイナリマスクを作成し、すべての非腫瘍細胞のマスクと重ね合わせて、ＰＤ－１陽性であるすべての非腫瘍細胞のバイナリマスクを作成した（図５ｂ）。すべての非腫瘍細胞のマスクとバイオマーカーマスクを重ね合わせることで、マスク内でバイオマーカー陽性細胞として誤って特定され得るノイズピクセルが排除された。

すべてのＰＤ－Ｌ１陽性細胞のバイナリマスクは、第２の拡張器２２６を使用して拡張し、最も近い近隣細胞（例えば、ＰＤ－１を有する細胞）を含む相互作用マスクを作成した（図６ａ）。この相互作用マスクは、ＰＤ－１がＰＤ－Ｌ１と相互作用する可能性があるように、相互作用マスカ２３０を用いてすべてのＰＤ－１陽性非腫瘍細胞のバイナリマスクと組み合わせてＰＤ－Ｌ１陽性細胞に十分に近接したＰＤ－１陽性細胞の相互作用コンパートメントを作成した（図６ｂ）。

相互作用コンパートメントについて受容されたすべての視野（最大で４０の視野）からの総面積および非腫瘍細胞の総面積を、面積評価器２３２、２３４それぞれにおいて計算した。相互作用コンパートメントについて受容されたすべての視野からの総面積を、相互作用計算器２３６を用いて、非腫瘍細胞の総面積で割り、１０，０００の係数をかけ合わせ、各標本の相互作用スコアを表す整数を出した。ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１測定値は、非常に再現可能であった（Ｒ^２はそれぞれ０．９８および０．９７）。広範なＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１発現ならびに相互作用スコアが、アーカイブの臨床標本で観察された（ｎ＝５３）。ニボルマブ（ｎ＝５）またはペンブロリズマブ（ｎ＝２１）で治療した２６人の進行性黒色腫患者のコホートでは、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用スコアは、反応者を無反応者と確実に区別することが分かった（ｐ＝０．０１）が、ＰＤ－Ｌ１単独（ｐ＝０．０７）またはＣＤ８単独（ｐ＝０．２３）はそうではなかった。さらに、より高いＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用スコアを示す患者は、優れた反応割合を有した（８２％対２０％、ｐ＝０．０１）。ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用スコアが高い患者は、より低いＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用スコアを有する患者と比べて長い平均無増悪期間を（ｐ＝０．０５９）を経験し、死亡が少なかった（２２％対５８％）。これらの結果は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用スコアを得るために組織サンプルにスコアをつけるこの方法が、ＰＤ－Ｌ１発現単独と比べて優れた予知力を提供することを示唆している（８２％の陽性的中率、８０％の陰性的中率）。

２６人の患者の代表的なスコアを図７ａに示す。データに基づいて、治療への反応の可能性を示すために８００～９００の閾値が選択された。

あるいは、相互作用スコアは、個々の各視野について計算され、各患者の最大スコアを図７ｂに示す。最大スコアに基づいて、治療への反応の可能性を示すために１９００の閾値が選択された。

相互作用スコアに対する濃縮アルゴリズムの影響を評価するため、前述した処置が、濃縮アルゴリズムの代わりにホールスライドイメージングを用いて実行された（図８を参照）。ホールスライドイメージ分析を行うと、抗ＰＤ１療法に反応した患者と反応しなかった患者とで、統計的に有意な差はなかった。したがって、閾値は、この分析で決定できなかった。

相互作用スコアを、患者の無増悪期間（ＰＦＳ）と比較した（図９）。少なくとも８０３の相互作用スコアが、生存と十分に相互に関連していた。とりわけ、ＰＤ－Ｌ１発現は、ＰＦＳの改善と相互に関連していなかった（図１０）。

図１１および図１２は、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞（赤色）、ＰＤ－１陽性細胞（黄色）、腫瘍細胞（Ｓ１００、緑色）、およびすべての細胞（ＤＡＰＩ、青色）を示す、上に置かれたマスクの代表的な実施例を示す。免疫療法への陽性反応者では、図１１のマスクは、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞（赤色）、ＰＤ－１陽性細胞（黄色）、およびすべての腫瘍細胞（緑色）の存在を容易に示す。対照的に、免疫療法への陰性反応者では、図１２のマスクは、腫瘍細胞（Ｓ１００、緑色）およびすべての細胞（ＤＡＰＩ、青色）の存在を示すが、ＰＤ－Ｌ１陽性細胞（赤色）またはＰＤ－１陽性細胞（黄色）は皆無かそれに近い。図１１は、２１７６の相互作用スコア（免疫療法への完全な反応）を表す。図１２は、８の相互作用スコア（免疫療法に無反応）を表す。

組織サンプルはまた、黒色腫組織サンプルには現在使用されていない抗ＰＤ－Ｌ１抗体クローン２２Ｃ３で、非小細胞肺癌におけるＰＤ－Ｌ１を測定する、ＦＤＡ承認済みの方法を用いて評価された。ＰＤ－Ｌ１発現を、患者のＰＦＳと比較し、図１８に示す。この方法は、相互作用スコアを用いる本明細書に記載する方法と比べて、統計的に関連のある診断価値を示さない。

３４人の追加の転移性黒色腫患者の検証コホートを調べ、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用スコアを得た（図１９ａ参照）。これらの相互作用スコアも、患者の無増悪期間（ＰＦＳ）と比較した（図１９ｂ）。統計的に有意ではない（ｐ＝０．１９）が、この比較は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用スコアが高い患者ほど長いＰＦＳを有する傾向を示す。統計的有意性は、クリニックでこれらの療法を比較的最近使用することによって制限され得、したがってこれらの患者では経過観察時間が制限される。

ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用スコア、ならびに２６人の患者の前のコホートを３４人の患者の検証コホートと組み合わせるための患者のＰＦＳまたは患者の全生存（ＯＳ）とこれらのスコアの比較を、図１９ｃ～図１９ｅに示す。組み合わせ分析は、ＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１が高い患者が抗ＰＤ－１療法に対する反応の改善を示すことを、明らかに示している。

実施例２．ヒト患者からの非小細胞肺癌組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
４８８色素で直接標識されたマウス抗Ｓ１００を、上皮腫瘍サンプル用の４８８色素で直接標識されたマウス抗パンサイトケラチンと置き換えて、実施例１と同じような処置を行った。３８のサンプルの相互作用スコアを図１３に示す。

実施例３．ＰＤ－Ｌ１を発現する細胞およびＣＤ８０を発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
サンプル調製。ホルマリン固定パラフィン包埋（ＦＦＰＥ）組織サンプルから、ろうを取り除き、これを再水和し、抗原回復を、高温条件で行った。次に、染色を行い、以下の工程を実施した。まず、組織を、ＲＮＡＳｃｏｐｅ（登録商標）（Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｃｅｌｌ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）を用いて、約１ｋｂのＣＴＬＡ－４ ｍＲＮＡにわたる２０対のハイブリダイゼーションプローブを使用するＣＴＬＡ－４発現検出にかけた。ｉｎ ｓｉｔｕハイブリダイゼーションを、ＴＳＡ－Ｃｙ（登録商標）３で可視化した。スライドを洗浄し、次に残留ＨＲＰを、新鮮な１００ｍＭのベンズヒドラジドと５０ｍＭの過酸化水素での２回洗浄を用いて冷却した。スライドは、マウス抗ＣＤ８０一次抗体で染色する前に再び洗浄した。スライドを洗浄し、次に、抗マウスＨＲＰ二次抗体でインキュベートした。スライドを洗浄し、次にＣＤ８０染色を、ＴＳＡ－Ｃｙ（登録商標）５（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ）を用いて検出した。その後、残留ＨＲＰを、新鮮な１００ｍＭのベンズヒドラジドと５０ｍＭの過酸化水素での２回洗浄を用いて冷却した。スライドは、ウサギ抗ＣＤ３一次抗体で染色する前に再び洗浄した。スライドを洗浄し、次に、抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の混合物でインキュベートした。スライドを洗浄し、次に、ＣＤ３染色を、ＴＳＡ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（登録商標）（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を用いて検出した。スライドを、封入剤と共にカバーガラスをかける前に最後に洗浄し、室温で一晩乾燥させた。

ＤＡＰＩ、ＦＩＴＣ、Ｃｙ（登録商標）３、およびＣｙ（登録商標）５の波長にわたり撮像する、実施例１と同様の撮像および分析処置を実行した。ＣＴＬＡ－４およびＣＤ８０の発現を用いて、２０ｘの画像を得るための濃縮アルゴリズムを確立した。分析を行い、ＣＤ８０陽性細胞の近接の範囲内にあるＣＴＬＡ－４およびＣＤ３陽性細胞の、ピクセルでの総面積を測定し、ＣＤ３陽性細胞の、ピクセルでの総面積で割り、１０，０００の係数をかけ合わせることによって、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０相互作用スコアを決定した。結果を図２０に示す。

実施例４．ＣＴＬＡ－４を発現する細胞およびＣＤ８０を発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１の染色および分析を、ＣＴＬＡ－４およびＣＤ８０の染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。

実施例５．ＰＤ－Ｌ２を発現する細胞およびＰＤ－１を発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ－Ｌ１の染色および分析を、ＰＤ－Ｌ２の染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。

実施例６．ＣＴＬＡ－４を発現する細胞およびＣＤ８６を発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１の染色および分析を、ＣＴＬＡ－４およびＣＤ８６の染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。

実施例７．ＬＡＧ－３を発現する細胞およびＨＬＡ－ＤＲを発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１の染色および分析を、ＬＡＧ－３およびＨＬＡ－ＤＲの染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。

実施例８．ＴＩＭ－３を発現する細胞およびガレクチン９を発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１の染色および分析を、ＴＩＭ－３およびガレクチン９の染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。

実施例９．４１ＢＢを発現する細胞および４．１ＢＢＬを発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１の染色および分析を、４１ＢＢおよび４．１ＢＢＬの染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。

実施例１０．ＯＸ４０を発現する細胞およびＯＸ４０Ｌを発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１の染色および分析を、ＯＸ４０およびＯＸ４０Ｌの染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。

実施例１１．ＣＤ４０を発現する細胞およびＣＤ４０Ｌを発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１の染色および分析を、ＣＤ４０およびＣＤ４０Ｌの染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。

実施例１２．ＩＣＯＳを発現する細胞およびＩＣＯＳＬを発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１の染色および分析を、ＩＣＯＳおよびＩＣＯＳＬの染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。

実施例１３．ＧＩＴＲを発現する細胞およびＧＩＴＲＬを発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１の染色および分析を、ＧＩＴＲおよびＧＩＴＲＬの染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。

実施例１４．ＨＬＡ－ＤＲを発現する細胞およびＴＣＲを発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
ＰＤ－Ｌ１およびＰＤ－１の染色および分析を、ＨＬＡ－ＤＲおよびＴＣＲの染色および分析に置き換えて、実施例１と同様の処置を行う。

実施例１５．ＰＤ－１、ＰＤ－Ｌ１、およびＣＤ３を発現する細胞を有する組織サンプルのサンプル調製、撮像、および撮像の分析
マウス抗Ｓ１００抗体なしで、実施例１と同様の処置を行った。代わりに、ＰＤ－Ｌ１検出後、一次および二次抗体を電磁波で除去した。スライドを次に、ウサギ抗ＣＤ３一次抗体で染色した。スライドを洗浄し、次に、抗ウサギＨＲＰ二次抗体と４’，６－ジアミジノ－２－フェニルインドール（ＤＡＰＩ）の混合物でインキュベートした。スライドを洗浄し、次にＣＤ３染色を、ＴＳＡ－ＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）で検出した。撮像および分析は実施例１と同様であり、空間的近接（例えば相互作用スコア）は、ピクセルで測定したＰＤ－Ｌ１陽性領域内のＰＤ－１陽性細胞の面積を、ピクセルで測定したすべての有核細胞の面積で割り、１０，０００の係数をかけ合わせることによって、計算した。２９のサンプルの相互作用スコアを図２１に示す。

段落Ａ．癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルにスコアを付ける方法において、
（ｉ）癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルを使用して、少なくとも一対の細胞間の空間的近接を表すスコアを決定する工程であって、少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは第１のバイオマーカーを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは第１のバイオマーカーとは異なる第２のバイオマーカーを発現する、工程と、
（ｉｉ）スコアを記録する工程であって、このスコアは、閾値と比較した場合に、癌患者が免疫療法に陽性的に反応する可能性を示す、工程と、
を含む、方法。

段落Ｂ．段落Ａの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは腫瘍細胞を含み、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは非腫瘍細胞を含む、方法。

段落Ｃ．段落Ｂの方法において、
非腫瘍細胞は免疫細胞を含む、方法。

段落Ｄ．段落Ａの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１および第２のメンバーは免疫細胞を含む、方法。

段落Ｅ．段落Ａの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは腫瘍細胞、骨髄系細胞、または間質細胞を含み、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは免疫細胞を含む、方法。

段落Ｆ．段落Ｅの方法において、
腫瘍細胞、骨髄系細胞、または間質細胞はＰＤ－Ｌ１を発現し、免疫細胞はＰＤ－１を発現する、方法。

段落Ｇ．段落Ａ～Ｆのいずれかの方法において、
空間的近接は、ピクセルスケールで評価される、方法。

段落Ｈ．段落Ａ～Ｇのいずれかの方法において、
少なくとも一対の細胞間の空間的近接は、約１ピクセル～約１００ピクセルの範囲である、方法。

段落Ｉ．段落Ａ～Ｆのいずれかの方法において、
少なくとも一対の細胞間の空間的近接は、約０．５μｍ～約５０μｍの範囲である、方法。

段落Ｊ．段落Ａの方法において、
決定する工程は、
（ｉ）複数の蛍光タグで染色された、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な、所定の数の視野を選択する工程であって、この選択は、他の視野と比べて第１のバイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、
（ｉｉ）選択された視野それぞれについて、第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含むのに十分なマージンだけ第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、
（ｉｉｉ）第２のバイオマーカーを発現し、第１のバイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号内に含まれる、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第１の総面積を、規格化因子で割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、
を含む、方法。

段落Ｋ．段落Ｊの方法において、
蛍光タグのそれぞれは、特異的バイオマーカーを対象にしている、方法。

段落Ｌ．段落Ｊまたは段落Ｋの方法において、
複数の蛍光タグは、第１のバイオマーカー用の第１の蛍光タグおよび第２のバイオマーカー用の第２の蛍光タグを含む、方法。

段落Ｍ．段落Ｊ～Ｌのいずれかの方法において、
マージンは、約１～約１００ピクセルの範囲である、方法。

段落Ｎ．段落Ｊ～Ｍのいずれかの方法において、
第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞は、第１のバイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約０．５～約５０μｍ以内にある、方法。

段落Ｏ．段落Ｊ～Ｎのいずれかの方法において、
第１の総面積は、ピクセルで測定される、方法。

段落Ｐ．段落Ｊ～Ｏのいずれかの方法において、
規格化因子は、選択された視野それぞれからのすべての非腫瘍細胞の第２の総面積である、方法。

段落Ｑ．段落Ｊ～Ｏのいずれかの方法において、
規格化因子は、第２のバイオマーカーを発現する能力を有する、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第２の総面積である、方法。

段落Ｒ．段落Ｐまたは段落Ｑの方法において、
第２の総面積は、ピクセルで測定される、方法。

段落Ｓ．段落Ｊ～Ｒのいずれかの方法において、
所定の係数は、１０^４である、方法。

段落Ｔ．段落Ａの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＨＬＡ－ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ－１、ＧＩＴＲＬ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択された第１のバイオマーカーを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択された第２のバイオマーカーを発現する、方法。

段落Ｕ．段落Ｔの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＰＤ－Ｌ１を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＰＤ－１を発現する、方法。

段落Ｖ．段落Ｔの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＰＤ－Ｌ１を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＣＤ８０を発現する、方法。

段落Ｗ．段落Ｔの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＣＴＬＡ－４を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＣＤ８０を発現する、方法。

段落Ｘ．段落Ｔの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＰＤ－Ｌ２を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＰＤ－１を発現する、方法。

段落Ｙ．段落Ｔの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＣＴＬＡ－４を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＣＤ８６を発現する、方法。

段落Ｚ．段落Ｔの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＬＡＧ－３を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＨＬＡ－ＤＲを発現する、方法。

段落ＡＡ．段落Ｔの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＴＩＭ－３を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはガレクチン９を発現する、方法。

段落ＡＢ．段落Ｔの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは４１ＢＢを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは４．１ＢＢＬを発現する、方法。

段落ＡＣ．段落Ｔの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＯＸ４０を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＯＸ４０Ｌを発現する、方法。

段落ＡＤ．段落Ｔの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＣＤ４０を発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＣＤ４０Ｌを発現する、方法。

段落ＡＥ．段落Ｔの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＩＣＯＳを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＩＣＯＳＬを発現する、方法。

段落ＡＦ．段落Ｔの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＧＩＴＲを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＧＩＴＲＬを発現する、方法。

段落ＡＧ．段落Ｔの方法において、
少なくとも一対の細胞の第１のメンバーはＨＬＡ－ＤＲを発現し、少なくとも一対の細胞の第２のメンバーはＴＣＲを発現する、方法。

段落ＡＨ．段落Ａ～ＡＧのいずれかの方法において、
閾値は、約５００～約５０００の範囲である、方法。

段落ＡＩ．段落ＡＨの方法において、
閾値は約９００±１００である、方法。

段落ＡＪ．段落Ａ～ＡＩのいずれかの方法において、
免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む、方法。

段落ＡＫ．腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な所定の数の視野に存在する複数の細胞の中から選択された少なくとも一対の細胞間の空間的近接を表すスコアを決定する方法であって、このサンプルは癌患者から採取される、方法において、
（ｉ）複数の蛍光タグで染色された、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な、所定の数の視野を選択する工程であって、この選択は、他の視野と比べて第１の特異的バイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、
（ｉｉ）選択された視野それぞれについて、第２の特異的バイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含むのに十分なマージンだけ第１の特異的バイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、
（ｉｉｉ）第２の特異的バイオマーカーを発現し、第１の特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号内に含まれる、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第１の総面積を、規格化因子で割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、
を含む、方法。

段落ＡＬ．段落ＡＫの方法において、
蛍光タグのそれぞれは、特異的バイオマーカーを対象にしている、方法。

段落ＡＭ．段落ＡＫまたは段落ＡＬの方法において、
複数の蛍光タグは、第１のバイオマーカー用の第１の蛍光タグおよび第２のバイオマーカー用の第２の蛍光タグを含む、方法

段落ＡＮ．段落ＡＫ～ＡＭのいずれかの方法において、
１つ以上の蛍光タグは、特異的バイオマーカーに対する結合親和性を有する抗体または別の抗体に結合したフルオロフォアを含む、方法。

段落ＡＯ．段落ＡＫ～ＡＭのいずれかの方法において、
各蛍光タグは、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）２、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３，５、Ｃｙ（登録商標）５、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、４８８色素、５５５色素、５９４色素、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄからなる群の１つ以上から独立して選択されるフルオロフォアを含む、方法。

段落ＡＰ．段落ＡＫ～ＡＯのいずれかの方法において、
マージンは、約１～約１００ピクセルの範囲である、方法。

段落ＡＱ．段落ＡＫ～ＡＰのいずれかの方法において、
第２の特異的バイオマーカーを発現する近位に位置する細胞は、第１の特異的バイオマーカーを発現する細胞の原形質膜から約０．５～約５０μｍ以内にある、方法。

段落ＡＲ．段落ＡＫ～ＡＱのいずれかの方法において、
第１の総面積は、ピクセルで測定される、方法。

段落ＡＳ．段落ＡＫ～ＡＰのいずれかの方法において、
規格化因子は、選択された視野それぞれからのすべての非腫瘍細胞の第２の総面積である、方法。

段落ＡＴ．段落ＡＫ～ＡＰのいずれかの方法において、
規格化因子は、第２の特異的バイオマーカーを発現する能力を有する、選択された視野それぞれからのすべての細胞の第２の総面積である、方法。

段落ＡＵ．段落ＡＳまたは段落ＡＴの方法において、
第２の総面積は、ピクセルで測定される、方法。

段落ＡＶ．段落ＡＫ～ＡＵのいずれかの方法において、
所定の係数は、１０^４である、方法。

段落ＡＷ．段落ＡＫの方法において、
空間的近接スコア（ＳＰＳ）は、以下の方程式によって決定され：

式中、Ａ_Ｉは、総相互作用面積（第２の特異的バイオマーカーを発現し、第１の特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号により含まれる細胞の総面積）であり、Ａ_Ｃは、第２の特異的バイオマーカーを発現する能力を有する細胞の総面積である、方法。

段落ＡＸ．段落ＡＫの方法において、
第１の特異的バイオマーカーは、腫瘍および非腫瘍マーカーを含み、第２の特異的バイオマーカーは、非腫瘍マーカーを含む、方法。

段落ＡＹ．段落Ａの方法において、
方法は、第１のバイオマーカーの発現の定量化または第２のバイオマーカーの発現の定量化と比べて、優れた予知力を提供する、方法。

段落ＡＺ．段落ＡＫの方法において、
方法は、第１の特異的バイオマーカーの発現の定量化または第２の特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて、優れた予知力を提供する、方法。

段落ＢＡ．段落ＡＹまたは段落ＡＺの方法において、
予知力は、陽性的中率、陰性的中率、またはそれらの組み合わせとして定量化される、方法。

段落ＢＢ．段落ＢＡの方法において、
陽性的中率は６５％以上である、方法。

段落ＢＣ．段落ＢＢの方法において、
陽性的中率は７０％以上である、方法。

段落ＢＤ．段落ＢＣの方法において、
陽性的中率は７５％以上である、方法。

段落ＢＥ．段落ＢＡの方法において、
陰性的中率は６５％以上である、方法。

段落ＢＦ．段落ＢＥの方法において、
陰性的中率は８０％以上である、方法。

特定の実施形態を例示および説明してきたが、以下の特許請求の範囲に定められるようなさらに広範な態様におけるテクノロジーから逸脱せずに、当技術分野の通常の知識に従って変更および改変が行われ得ることを理解されたい。

本明細書で例示的に説明された実施形態は、本明細書に具体的に開示されていない、任意の１つ以上の要素、制限がない場合も適切に実施され得る。よって、例えば、「含む（comprising）」、「含む（including）」、「含む（containing）」などの用語は、制限なしに広く読み取るべきである。さらに、本明細書で使用する用語および表現は、制限する用語ではなく説明の用語として使用されており、このような用語および表現の使用において、図示および説明した特徴またはその一部の任意の等価物を排除する意図はなく、さまざまな改変が、特許請求されたテクノロジーの範囲内で可能であることが認識される。さらに、「から本質的になる」という語句は、具体的に列挙された要素、および特許請求されたテクノロジーの基本的かつ新規な特徴に実質的に影響しない追加要素を含むことが理解される。「からなる」という語句は、特定されていないいかなる要素も排除する。

本開示は、本出願に記載された特定の実施形態の点で限定されない。当業者には明らかであるように、多くの改変および変形が、その趣旨および範囲を逸脱せずに、行われ得る。本明細書で列挙されたものに加えて、本開示の範囲内で機能的に等価な方法および組成が、前記の説明から当業者には明らかであろう。このような改変および変形は、特許請求の範囲に含まれることが意図されている。本開示は、特許請求の範囲が権利を与えられる等価物の全範囲と共に、特許請求の範囲の条件によってのみ制限されるものである。本開示は特定の方法、試薬、化合物組成または生物学的システムに限定されず、これらが当然変化し得ることが理解される。本明細書で使用される用語は、特定の実施形態を説明するためだけのものであり、制限することを意図していないことも理解される。

さらに、開示の特徴または態様がマーカッシュ群の観点から記載されている場合、当業者は、本開示がこれによってマーカッシュ群の任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点でも説明されていることを認識するであろう。

当業者には理解されるように、ありとあらゆる目的で、特に、書面での説明を提供する点で、本明細書に開示されるすべての範囲は、ありとあらゆる可能な下位範囲およびその下位範囲の組み合わせも含む。列挙された範囲は、その同じ範囲が少なくとも等しい半分、３分の１、４分の１、５分の１、１０分の１などに分かれることを十分に説明し、かつ可能にするものとして容易に認識され得る。非限定的な実施例として、本明細書で論じた各範囲は、下３分の１、真ん中の３分の１、上３分の１などに容易に分かれ得る。やはり当業者には理解されるように、「最大で」、「少なくとも」、「超」、「未満」などのすべての語は、列挙された数を含み、続いて前述したような下位範囲に分かれ得る範囲を指す。最後に、当業者には理解されるように、範囲は個々の構成要素それぞれを含む。

本明細書で言及したすべての刊行物、特許出願、発行特許、および他の文献は、個別の刊行物、特許出願、発行特許、または他の文献それぞれが、参照により全体として組み込まれることが具体的かつ個別に示されたかのように、参照により本明細書に組み込まれる。参照により組み込まれるテキストに含まれる定義は、本開示における定義と矛盾する範囲において排除される。

他の実施形態は、以下の特許請求の範囲に記載する。

〔実施の態様〕
（１） 癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルにスコアを付ける方法において、
（ｉ）前記癌患者から採取した前記腫瘍組織を含むサンプルを使用して、少なくとも一対の細胞間の空間的近接を表すスコアを決定する工程であって、前記少なくとも一対の細胞の第１のメンバーは、第１のバイオマーカーを発現し、前記少なくとも一対の細胞の第２のメンバーは、前記第１のバイオマーカーとは異なる第２のバイオマーカーを発現する、工程と、
（ｉｉ）前記スコアを記録する工程であって、前記スコアは、閾値と比較した場合に、前記癌患者が免疫療法に陽性的に反応する可能性を示す、工程と、
を含む、方法。
（２） 実施態様１に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーは、腫瘍細胞を含み、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーは、非腫瘍細胞を含む、方法。
（３） 実施態様２に記載の方法において、
前記非腫瘍細胞は、免疫細胞を含む、方法。
（４） 実施態様１に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１および第２のメンバーは、免疫細胞を含む、方法。
（５） 実施態様１に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーは、腫瘍細胞、骨髄系細胞、または間質細胞を含み、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーは、免疫細胞を含む、方法。

（６） 実施態様５に記載の方法において、
前記腫瘍細胞、骨髄系細胞、または間質細胞は、ＰＤ－Ｌ１を発現し、前記免疫細胞は、ＰＤ－１を発現する、方法。
（７） 実施態様１に記載の方法において、
前記空間的近接は、ピクセルスケールで評価される、方法。
（８） 実施態様１に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞間の前記空間的近接は、約１ピクセル～約１００ピクセルの範囲である、方法。
（９） 実施態様１に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞間の前記空間的近接は、約０．５μｍ～約５０μｍの範囲である、方法。
（１０） 実施態様１に記載の方法において、
前記決定する工程は、
（ｉ）複数の蛍光タグで染色された、前記癌患者から採取した前記腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な、所定の数の視野を選択する工程であって、前記選択は、他の視野と比べて前記第１のバイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、
（ｉｉ）選択された前記視野それぞれについて、前記第２のバイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含むのに十分なマージンだけ前記第１のバイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、
（ｉｉｉ）前記第２のバイオマーカーを発現し、前記第１のバイオマーカーを発現する前記細胞に起因する拡張した前記蛍光信号内に含まれる、前記選択された視野それぞれからのすべての細胞の第１の総面積を、規格化因子で割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、
を含む、方法。

（１１） 実施態様１０に記載の方法において、
前記蛍光タグのそれぞれは、特異的バイオマーカーを対象にしている、方法。
（１２） 実施態様１０に記載の方法において、
前記複数の蛍光タグは、前記第１のバイオマーカー用の第１の蛍光タグおよび前記第２のバイオマーカー用の第２の蛍光タグを含む、方法。
（１３） 実施態様１０に記載の方法において、
前記マージンは、約１～約１００ピクセルの範囲である、方法。
（１４） 実施態様１０に記載の方法において、
前記第２のバイオマーカーを発現する前記近位に位置する細胞は、前記第１のバイオマーカーを発現する前記細胞の原形質膜から約０．５～約５０μｍ以内にある、方法。
（１５） 実施態様１０に記載の方法において、
前記第１の総面積は、ピクセルで測定される、方法。

（１６） 実施態様１０に記載の方法において、
前記規格化因子は、前記選択された視野それぞれからのすべての非腫瘍細胞の第２の総面積である、方法。
（１７） 実施態様１０に記載の方法において、
前記規格化因子は、前記第２のバイオマーカーを発現する能力を有する、前記選択された視野それぞれからのすべての細胞の第２の総面積である、方法。
（１８） 実施態様１６に記載の方法において、
前記第２の総面積は、ピクセルで測定される、方法。
（１９） 実施態様１に記載の方法において、
前記所定の係数は、１０^４である、方法。
（２０） 実施態様１に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＨＬＡ－ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ－１、ＧＩＴＲＬ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択された第１のバイオマーカーを発現し、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーは、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択された第２のバイオマーカーを発現する、方法。

（２１） 実施態様２０に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーはＰＤ－Ｌ１を発現し、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーはＰＤ－１を発現する、方法。
（２２） 実施態様２０に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーはＰＤ－Ｌ１を発現し、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーはＣＤ８０を発現する、方法。
（２３） 実施態様２０に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーはＣＴＬＡ－４を発現し、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーはＣＤ８０を発現する、方法。
（２４） 実施態様２０に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーはＰＤ－Ｌ２を発現し、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーはＰＤ－１を発現する、方法。
（２５） 実施態様２０に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーはＣＴＬＡ－４を発現し、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーはＣＤ８６を発現する、方法。

（２６） 実施態様２０に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーはＬＡＧ－３を発現し、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーはＨＬＡ－ＤＲを発現する、方法。
（２７） 実施態様２０に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーはＴＩＭ－３を発現し、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーはガレクチン９を発現する、方法。
（２８） 実施態様２０に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーは４１ＢＢを発現し、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーは４．１ＢＢＬを発現する、方法。
（２９） 実施態様２０に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーはＯＸ４０を発現し、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーはＯＸ４０Ｌを発現する、方法。
（３０） 実施態様２０に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーはＣＤ４０を発現し、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーはＣＤ４０Ｌを発現する、方法。

（３１） 実施態様２０に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーはＩＣＯＳを発現し、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーはＩＣＯＳＬを発現する、方法。
（３２） 実施態様２０に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーはＧＩＴＲを発現し、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーはＧＩＴＲＬを発現する、方法。
（３３） 実施態様２０に記載の方法において、
前記少なくとも一対の細胞の前記第１のメンバーはＨＬＡ－ＤＲを発現し、前記少なくとも一対の細胞の前記第２のメンバーはＴＣＲを発現する、方法。
（３４） 実施態様１に記載の方法において、
前記閾値は、約５００～約５０００の範囲である、方法。
（３５） 実施態様３４に記載の方法において、
前記閾値は、約９００±１００である、方法。

（３６） 実施態様１に記載の方法において、
前記免疫療法は、免疫チェックポイント療法を含む、方法。
（３７） 腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な所定の数の視野に存在する複数の細胞の中から選択された少なくとも一対の細胞間の空間的近接を表すスコアを決定する方法であって、前記サンプルは癌患者から採取される、方法において、
（ｉ）複数の蛍光タグで染色された、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な、所定の数の視野を選択する工程であって、前記選択は、他の視野と比べて第１の特異的バイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、
（ｉｉ）選択された前記視野それぞれについて、第２の特異的バイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含むのに十分なマージンだけ前記第１の特異的バイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、
（ｉｉｉ）前記第２の特異的バイオマーカーを発現し、前記第１の特異的バイオマーカーを発現する前記細胞に起因する拡張した前記蛍光信号内に含まれる、前記選択された視野それぞれからのすべての細胞の第１の総面積を、規格化因子で割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、
を含む、方法。
（３８） 実施態様３７に記載の方法において、
前記蛍光タグのそれぞれは、特異的バイオマーカーを対象にしている、方法。
（３９） 実施態様３７に記載の方法において、
前記複数の蛍光タグは、前記第１のバイオマーカー用の第１の蛍光タグおよび前記第２のバイオマーカー用の第２の蛍光タグを含む、方法。
（４０） 実施態様３７に記載の方法において、
１つ以上の蛍光タグは、特異的バイオマーカーに対する結合親和性を有する抗体または別の抗体に結合したフルオロフォアを含む、方法。

（４１） 実施態様３７に記載の方法において、
各蛍光タグは、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）２、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３，５、Ｃｙ（登録商標）５、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、４８８色素、５５５色素、５９４色素、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄからなる群の１つ以上から独立して選択されるフルオロフォアを含む、方法。
（４２） 実施態様３７に記載の方法において、
前記マージンは、約１～約１００ピクセルの範囲である、方法。
（４３） 実施態様３７に記載の方法において、
前記第２の特異的バイオマーカーを発現する前記近位に位置する細胞は、前記第１の特異的バイオマーカーを発現する前記細胞の原形質膜から約０．５～約５０μｍ以内にある、方法。
（４４） 実施態様３７に記載の方法において、
前記第１の総面積は、ピクセルで測定される、方法。
（４５） 実施態様３７に記載の方法において、
前記規格化因子は、前記選択された視野それぞれからのすべての非腫瘍細胞の第２の総面積である、方法。

（４６） 実施態様３７に記載の方法において、
前記規格化因子は、前記第２の特異的バイオマーカーを発現する能力を有する、前記選択された視野それぞれからのすべての細胞の第２の総面積である、方法。
（４７） 実施態様４５に記載の方法において、
前記第２の総面積は、ピクセルで測定される、方法。
（４８） 実施態様３７に記載の方法において、
前記所定の係数は、１０^４である、方法。
（４９） 実施態様３７に記載の方法において、
前記空間的近接スコア（ＳＰＳ）は、以下の方程式によって決定され：

式中、Ａ_Ｉは、総相互作用面積（前記第２の特異的バイオマーカーを発現し、前記第１の特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号により含まれる細胞の総面積）であり、Ａ_Ｃは、前記第２の特異的バイオマーカーを発現する能力を有する細胞の総面積である、方法。
（５０） 実施態様３７に記載の方法において、
前記第１の特異的バイオマーカーは腫瘍および非腫瘍マーカーを含み、前記第２の特異的バイオマーカーは非腫瘍マーカーを含む、方法。

（５１） 実施態様１に記載の方法において、
前記方法は、前記第１のバイオマーカーの発現の定量化または前記第２のバイオマーカーの発現の定量化と比べて、優れた予知力を提供する、方法。
（５２） 実施態様３７に記載の方法において、
前記方法は、前記第１の特異的バイオマーカーの発現の定量化または前記第２の特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて、優れた予知力を提供する、方法。
（５３） 実施態様５１に記載の方法において、
前記予知力は、陽性的中率、陰性的中率、またはそれらの組み合わせとして定量化される、方法。
（５４） 実施態様５３に記載の方法において、
前記陽性的中率は６５％以上である、方法。
（５５） 実施態様５４に記載の方法において、
前記陽性的中率は７０％以上である、方法。

（５６） 実施態様５５に記載の方法において、
前記陽性的中率は７５％以上である、方法。
（５７） 実施態様５３に記載の方法において、
前記陰性的中率は６５％以上である、方法。
（５８） 実施態様５７に記載の方法において、
前記陰性的中率は８０％以上である、方法。

撮像および分析のための組織サンプルの調製に使用される抗体および検出試薬の概要の非限定的な実施例を示す。 画像内でＤＡＰＩにより検出されたすべての核の非限定的な実施例を示す。 図２ａ内のすべての細胞の拡張されたバイナリマスクの非限定的な実施例を示す。 ４８８色素で検出されたＳ１００の画像の非限定的な実施例を示す。 図３ａ内のすべての腫瘍領域のバイナリマスクの非限定的な実施例を示す。 図３ａ内のすべての腫瘍細胞のマスクの非限定的な実施例を示す。 図３ａ内のすべての非腫瘍細胞のマスクの非限定的な実施例を示す。 Ｃｙ（登録商標）５で検出されたＰＤ－Ｌ１の画像の非限定的な実施例を示す。 図４ａ内のすべてのＰＤ－Ｌ１陽性細胞のバイナリマスクの非限定的な実施例を示す。 Ｃｙ（登録商標）３．５で検出されたＰＤ－１の画像の非限定的な実施例を示す。 図５ａ内のすべてのＰＤ－１陽性非腫瘍細胞のバイナリマスクの非限定的な実施例を示す。 すべてのＰＤ－Ｌ１陽性細胞および最も近い近隣細胞の相互作用マスクの非限定的な実施例を示す。 ＰＤ－Ｌ１陽性細胞に近接したＰＤ－１陽性細胞の相互作用コンパートメントの非限定的な実施例を示す。 ２６人の黒色腫患者からの相互作用スコアの非限定的な実施例を示す。 図７ａの２６人の患者からの最大相互作用スコア非限定的な実施例を示す。 濃縮アルゴリズムに代わる、ホールスライドイメージングに基づく分析結果を示す。 ２６人の患者の無進行生存との相互作用スコアの比較を示す。注：^＊は、未修正の対数順位検定を示す。 患者の無進行生存とＰＤ－Ｌ１発現の比較を示す。 免疫療法に対する陽性反応者のＰＤ－Ｌ１陽性細胞（赤色）、ＰＤ－１陽性細胞（黄色）、すべての腫瘍細胞（緑色）、およびすべての細胞（青色）に対応する蛍光信号のマスクの非限定的な実施例を示す。 免疫療法に対する陰性反応者のＰＤ－Ｌ１陽性細胞（赤色）、ＰＤ－１陽性細胞（黄色）、すべての腫瘍細胞（緑色）、およびすべての細胞（青色）に対応する蛍光信号のマスクの非限定的な実施例を示す。 ３８人の非小細胞肺癌患者からの代表的なＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用スコアを示す。 例示的な実施形態による、腫瘍組織を含むサンプルにスコアを付けるプロセスのフローチャートである。 第２の例示的な実施形態による、腫瘍組織を含むサンプルにスコアを付けるプロセスのフローチャートである。 例示的な実施形態による、癌患者から採取した腫瘍組織を含むサンプルにスコアを付けるように構成されたコントローラのブロック図である。 例示的な実施形態による、腫瘍組織を含むサンプルにスコアを付けるのに使用される画像処理工程のフローダイヤグラムである。 患者の無進行生存と、ＦＤＡ承認済みの２２Ｃ３ ＩＨＣアッセイを用いて決定されたＰＤ－Ｌ１発現の比較を示す。注：^＊は、ｐ値が未修正の対数順位検定を用いて決定されたことを示す。 ３４人の追加の黒色腫患者からの相互作用スコアの非限定的な実施例を示す。 図１９ａの患者の無進行生存と相互作用スコアの比較を示す。 図７の患者および図１９ａの患者からの相互作用スコアを示す。 図１９ｃの患者の無進行生存と相互作用スコアの比較を示す。注：^＊は、ｐ値が未修正の対数順位検定を用いて決定されたことを示す。 図１９ｃの患者の全生存（ＯＳ）と相互作用スコアの比較を示す。注：^＊は、ｐ値が未修正の対数順位検定を用いて計算されたことを示す。 ２９人の転移性黒色腫患者からのＣＴＬＡ－４／ＣＤ８０相互作用スコアの非限定的な実施例を示す。 ２９人の精巣癌患者からのＰＤ－１／ＰＤ－Ｌ１相互作用スコアの非限定的な実施例を示す。

Claims (19)

1. 腫瘍組織を含むサンプルから利用可能な所定の数の視野に存在する複数の細胞の中から選択された少なくとも一対の細胞間の空間的近接を表すスコアを決定する方法であって、前記サンプルは癌患者から採取される、方法において、
   前記方法は、免疫チェックポイント療法への反応の可能性を決定するための指標を得るためのものであり、前記方法は、
   （ｉ）複数の蛍光タグで染色された、前記癌患者から採取した前記腫瘍組織を含む前記サンプルから利用可能な、前記所定の数の視野の選択をする工程であって、前記選択は、他の視野と比べて第１の特異的バイオマーカーを発現するより多くの数の細胞を含む視野を選択することに偏っている、工程と、
   （ｉｉ）選択された前記所定の数の視野それぞれについて、第２の特異的バイオマーカーを発現する近位に位置する細胞を含むのに十分なマージンだけ、前記第１の特異的バイオマーカーに対して陽性であるすべての細胞からの前記第１の特異的バイオマーカーに起因する蛍光信号を拡張する工程と、
   （ｉｉｉ）前記第２の特異的バイオマーカーを発現し、前記第１の特異的バイオマーカーを発現する前記細胞に起因する拡張した前記蛍光信号内に含まれる、選択された前記所定の数の視野それぞれからのすべての細胞の第１の総面積を、規格化因子で割り、結果として得られた商に、所定の係数をかけ合わせて、空間的近接スコアに至る工程と、
   を含む、方法。
2. 請求項１に記載の方法において、
   前記複数の蛍光タグは、前記第１の特異的バイオマーカー用の第１の蛍光タグおよび前記第２の特異的バイオマーカー用の第２の蛍光タグを含む、方法。
3. 請求項１に記載の方法において、
   前記蛍光タグのうちの１つ以上は、特異的バイオマーカーに対する結合親和性を有する抗体または別の抗体に結合したフルオロフォアを含む、方法。
4. 請求項１に記載の方法において、
   各蛍光タグは、ＤＡＰＩ、Ｃｙ（登録商標）２、Ｃｙ（登録商標）３、Ｃｙ（登録商標）３，５、Ｃｙ（登録商標）５、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、４８８色素、５５５色素、５９４色素、およびＴｅｘａｓ Ｒｅｄからなる群の１つ以上から独立して選択されるフルオロフォアを含む、方法。
5. 請求項１に記載の方法において、
   前記マージンは、１～１００ピクセルの範囲である、方法。
6. 請求項１に記載の方法において、
   前記第２の特異的バイオマーカーを発現する前記近位に位置する細胞は、前記第１の特異的バイオマーカーを発現する前記細胞の原形質膜から０．５～５０μｍ以内にある、方法。
7. 請求項１に記載の方法において、
   前記第１の総面積は、ピクセルで測定される、方法。
8. 請求項１に記載の方法において、
   前記規格化因子は、選択された前記所定の数の視野それぞれからのすべての非腫瘍細胞の第２の総面積である、方法。
9. 請求項１に記載の方法において、
   前記規格化因子は、前記第２の特異的バイオマーカーを発現する能力を有する、選択された前記所定の数の視野それぞれからのすべての細胞の第２の総面積である、方法。
10. 請求項８に記載の方法において、
    前記第２の総面積は、ピクセルで測定される、方法。
11. 請求項１に記載の方法において、
    前記所定の係数は、１０^４である、方法。
12. 請求項１に記載の方法において、
    前記空間的近接スコア（ＳＰＳ）は、以下の方程式によって決定され：
    

    

    式中、Ａ_Ｉは、総相互作用面積（前記第２の特異的バイオマーカーを発現し、前記第１の特異的バイオマーカーを発現する細胞に起因する拡張した蛍光信号により含まれる細胞の総面積）であり、Ａ_Ｃは、前記第２の特異的バイオマーカーを発現する能力を有する細胞の総面積である、方法。
13. 請求項１に記載の方法において、
    前記第１の特異的バイオマーカーは腫瘍マーカーおよび非腫瘍マーカーを含み、前記第２の特異的バイオマーカーは非腫瘍マーカーを含む、方法。
14. 請求項１に記載の方法において、
    前記第１の特異的バイオマーカーは、ＰＤ－Ｌ１、ＰＤ－Ｌ２、Ｂ７－Ｈ３、Ｂ７－Ｈ４、ＨＬＡ－ＤＲ、ガレクチン９、ＣＤ８０、ＣＤ８６、４．１ＢＢＬ、ＩＣＯＳＬ、ＣＤ４０、ＯＸ４０Ｌ、ＩＤＯ－１、ＧＩＴＲＬ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択され、前記第２の特異的バイオマーカーは、ＰＤ－１、ＴＩＭ３、ＬＡＧ３、４１ＢＢ、ＯＸ４０、ＣＴＬＡ－４、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ２８、ＧＩＴＲ、ＩＣＯＳ、ＣＤ２８、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、方法。
15. 請求項１に記載の方法において、
    前記方法は、前記第１の特異的バイオマーカーの発現の定量化または前記第２の特異的バイオマーカーの発現の定量化と比べて、優れた予知力を提供し、
    前記予知力は、治療反応性に関する陽性的中率、陰性的中率、またはそれらの組み合わせとして定量化される、方法。
16. 請求項１５に記載の方法において、
    前記陽性的中率または前記陰性的中率は６５％以上である、方法。
17. 請求項１５に記載の方法において、
    前記陽性的中率または前記陰性的中率は７０％以上である、方法。
18. 請求項１５に記載の方法において、
    前記陽性的中率または前記陰性的中率は７５％以上である、方法。
19. 請求項１に記載の方法において、ステップ（ｉｉ）が、
    ａ） 前記第１の特異的バイオマーカーに対して陽性である全ての細胞のマスクを生成すること、および
    ｂ） 前記第１の特異的バイオマーカーに対して陽性である全ての細胞の前記マスクを拡張して、前記第２の特異的バイオマーカーに対して陽性である相互作用する細胞を見つけ得る所定の近接を表す拡張マスクを生成すること、を含む、方法。

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