JP7126501B2 - 品質管理トレーサー付きアレイ - Google Patents

Description

関連出願との相互参照
本出願は、その内容全体が参照により本明細書に組み入れられる、２０１６年１２月２２日に出願された米国特許仮出願第６２／４３８，２８４号の利益を主張する。

配列表の参照
ＥＦＳ－Ｗｅｂを介して本明細書と共に提出された配列表は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。ファイルの名前はILI104BPCT_IP-1477-PCT_Sequence_Listing_ST25.txt、ファイルのサイズは７，４７７バイト、ファイルの作成日は２０１７年１２月２０日である。

生物学的アレイは、デオキシリボ核酸（ＤＮＡ）およびリボ核酸（ＲＮＡ）を含む、分子を検出、分析、および／または配列決定するために使用される広範囲のツールのうちの１つである。これらの用途では、アレイは、配列決定または増幅プライマーとして、あるいはヒトおよび他の生物の遺伝子に存在するヌクレオチド配列用のプローブとして有用な核酸配列を含むように設計されている。これらの用途を超えて、生物学的アレイは、広範囲の分子、分子のファミリー、遺伝子発現レベル、一塩基多型、および遺伝子型決定の検出および評価に使用され得る。

一般に、遺伝子配列決定は、ＤＮＡまたはＲＮＡの断片などの、ある長さの遺伝物質におけるヌクレオチドまたは核酸の順序を決定することを含む。ますます長い塩基対の配列が分析されており、得られた配列情報は、断片が由来する広範な長さの遺伝物質の配列を確実に決定するために断片を互いに論理的に合わせるために様々なバイオインフォマティクス方法において使用され得る。特徴的な断片の自動化されたコンピュータベースの検査が開発されており、そしてゲノムマッピング、遺伝子およびそれらの機能の同定、特定の状態および病状の危険性の評価などにおいて使用されてきた。特定の用途において、例えば、修飾標的核酸は、アレイの表面上の配列決定または増幅プライマーにハイブリダイズされ、増幅され、そしてそれらの遺伝子配列が決定される。

他の例では、個々のＤＮＡおよびＲＮＡプローブは、アレイ支持体上の幾何学的グリッド内の小さい位置に（またはランダムに）付着されてもよい。 例えば既知の人または生物からの試験試料は、相補的フラグメントがアレイ中の個々の部位でプローブとハイブリダイズするようにグリッドに曝露されてもよい。次に、断片がハイブリダイズした部位の蛍光によって、どの断片が試料中に存在するかを同定するために、その部位にわたって特定の周波数の光を走査することによってアレイを調べることができる。

核酸官能化アレイの適切な機能性および再現性は、それに結合した核酸配列の一貫した表示に依存する。本出願は、品質管理組成物、アレイ、およびアレイ表面への核酸配列の一貫した付着、ならびにその後のアレイの製造および保管後の配列の保持を確実にするための方法に関する。

特定の局面において、本開示は、複数の個別のウェルを含む支持体と、前記複数の個別のウェルのそれぞれに配置されたゲル材料と、前記複数の個別のウェルのそれぞれにおける前記ゲル材料にグラフトされた品質管理トレーサーとを備えるアレイに関する。いくつかの実施形態では、前記ゲル材料にグラフトされた品質管理トレーサーは、（ａ）切断部位を含む切断可能なヌクレオチド配列、および（ｂ）検出可能な標識を含む。いくつかの実施形態では、品質管理トレーサーは、トレーサーの第１の末端でゲル材料にグラフトされている。いくつかの実施形態では、切断可能なヌクレオチド配列は、第１の末端および第２の末端を有するグラフト領域を含み、第１の末端はゲル材料にグラフトされ、第２の末端は検出可能標識に連結される切断可能領域に連結され、切断部位を含む。いくつかの実施形態では、切断可能なヌクレオチド配列は非反応性ヌクレオチド配列を含み、いくつかの例では、グラフト化領域は非反応性ヌクレオチド配列を含む。他の実施形態では、切断可能なヌクレオチド配列はプライマーヌクレオチド配列を含み、場合によっては、グラフト化領域はプライマーヌクレオチド配列を含む。

いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、切断部位で品質管理トレーサーまたは切断可能なヌクレオチド配列に連結されている。他の実施形態では、検出可能な標識は、切断部位およびグラフトされた第１の末端（例えば、支持体－トレーサーのグラフトされた第１の末端－トレーサーの切断部位－トレーサー上の検出可能な標識）から遠位の位置で品質管理トレーサーまたは切断可能ヌクレオチド配列に連結され、さらに別の実施形態では、その位置は切断可能なヌクレオチド配列の３’末端にある。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は切断可能なヌクレオチド配列の３’末端またはその近くに結合している。いくつかの実施形態では、切断可能なヌクレオチド配列は、その５’末端でゲル材料にグラフトされている。いくつかの実施形態では、検出可能な標識は、品質管理トレーサーとエキソヌクレアーゼとの反応によって切断可能である。他の実施形態では、検出可能な標識は、品質管理トレーサーとグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼとの反応によって切断可能である。

いくつかの実施形態では、切断部位は、切断可能な核酸塩基である。いくつかの実施形態では、切断可能な核酸塩基は、酵素的に切断可能な核酸塩基である。いくつかの実施形態では、酵素的に切断可能な核酸塩基は、切除部位を含む。いくつかの実施形態では、切断可能な核酸塩基は、グリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼとの、またはエキソヌクレアーゼとの反応によって切断されやすい。いくつかの実施形態では、切断部位は化学的に切断可能なリンカーを含む。いくつかの実施形態では、化学的に切断可能なリンカーは、ビシナルジオール、ジスルフィド、シラン、アゾベンゼン、光開裂性基、またはアジドを含む。

いくつかの実施形態では、検出可能な標識は蛍光標識である。

いくつかの実施形態では、品質管理トレーサーは、（ａ）その３’末端に蛍光標識でタグ付けされた切断可能なヌクレオチド配列、または（ｂ）切断可能な核酸塩基に結合した蛍光標識を含む非反応性ヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、切断可能なヌクレオチド配列はプライマーヌクレオチド配列を含む。いくつかの態様において、品質管理トレーサーを有するアレイは、複数の別々のウェルのそれぞれにおいてゲル材料にグラフトされた非標識プライマーをさらに含み、ここでプライマーはプライマーヌクレオチド配列を含む。そのようなアレイは、本明細書に記載される方法のうちのいずれかにおける使用のために企図される。

いくつかの実施形態では、品質管理トレーサーはプライマーヌクレオチド配列を含まず、アレイはさらに、複数の個別のウェルのそれぞれにおいてゲル材料にグラフトされたプライマーヌクレオチド配列を含む別々の非標識プライマーを含む。いくつかの実施形態では、品質管理トレーサーおよび非標識プライマー（したがって、プライマーヌクレオチド配列）は、所定の比率でゲル材料上に存在する。

本願は、グラフトされたプライマーヌクレオチド配列の密度および／または分布を決定する方法に関するものであって、複数の個別のウェルと、複数の個別のウェルのそれぞれに配置されたゲル材料と、品質管理トレーサーと、前記複数の個別のウェルのそれぞれの前記ゲル材料にグラフトされたプライマーヌクレオチド配列とを含む支持体を提供し、前記品質管理トレーサーは、（ａ）切断部位を含む切断可能なヌクレオチド配列、および（ｂ）検出可能な標識を含み、前記検出可能な標識からのシグナルを検出し、前記検出可能な標識からのシグナルに少なくとも部分的に基づいて前記品質管理トレーサーの密度および／または分布を決定し、前記品質管理トレーサーの決定された密度および／または分布に少なくとも部分的に基づいてグラフトされたプライマーヌクレオチド配列の密度および／または分布を決定する、方法である。いくつかの実施形態では、方法は、品質管理トレーサーをゲル材料にグラフトすることをさらに含む。いくつかの態様では、品質管理トレーサーはプライマーヌクレオチド配列を含む。他の態様では、品質管理トレーサーは、非反応性ヌクレオチド配列を含み（すなわちプライマーヌクレオチド配列を含まない）、品質管理トレーサーのグラフトの前またはそれと同時に、かつ検出工程の前に、プライマーヌクレオチド配列をゲル材料にグラフトする。他の実施形態では、品質管理トレーサーは、品質管理トレーサーのグラフトがゲル材料にトレーサーとプライマーヌクレオチド配列の両方をグラフトするのに役立つように、プライマーヌクレオチド配列を含む。いくつかの実施形態では、品質管理トレーサーおよびプライマーヌクレオチド配列は、所定の比率でゲル材料にグラフトされ、そしてプライマーヌクレオチド配列の密度および／または分布の決定は、検出されたシグナルおよび所定の比率に基づく。いくつかの実施形態では、方法は、切断部位での切断反応によって品質管理トレーサーから検出可能な標識を除去することをさらに含む。いくつかの例において、除去は酵素的切断または化学的切断によって達成される。いくつかの例において、除去は、切断部位でのグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼとの、またはエキソヌクレアーゼとの反応によって行われる。他の例において、除去は、切断可能なヌクレオチド配列を検出可能な標識に付着させるリンカー分子の化学反応によって達成される。

本明細書に開示される方法の一例において、品質管理トレーサーは支持体上のウェル中のゲル材料にグラフトされる。品質管理トレーサーは、例えば、検出可能な標識が蛍光標識である場合は蛍光を用いて検出され、検出されたシグナルもしくは蛍光に少なくとも部分的に基づいて、ゲル材料にグラフトされたプライマーヌクレオチド配列の密度もしくは分布、または密度および分布が決定される。いくつかの態様において、この方法は、支持体上のウェル中のゲル材料に品質管理トレーサーをグラフトすること、蛍光を用いて品質管理トレーサーを検出すること、および少なくとも部分的に蛍光に基づいて、ゲル材料にグラフトされたプライマーヌクレオチド配列の密度、または分布、または密度および分布を決定することを含む。いくつかの態様では、方法は、切断部位で品質管理トレーサーから検出可能な標識を切断することをさらに含む。

別の態様では、本開示は、品質管理トレーサーおよびプライマーヌクレオチド配列をアレイに共グラフトする方法に関し、前記品質管理トレーサーと前記プライマーヌクレオチド配列を所定の比率で組み合わせてグラフト混合物を形成し、前記グラフト混合物を支持体上のウェル内のゲル材料にさらし、前記グラフト混合物および前記ゲル材料をインキュベートし、これにより、前記品質管理トレーサーおよび前記プライマーヌクレオチド配列を前記ゲル材料に共グラフトすることを含む、方法である。いくつかの態様では、品質管理トレーサーは、その３’末端に蛍光標識でタグ付けされた切断可能なヌクレオチド配列、または切断可能な核酸塩基に結合した蛍光標識を有する非反応性ヌクレオチド配列である。いくつかの態様では、この方法はさらに、検出可能な標識からのシグナルを検出することによってグラフトされた品質管理トレーサーを検出することを含み、検出されたシグナルおよび所定の比率に少なくとも部分的に基づいて、ゲル材料にグラフトされたプライマーヌクレオチド配列の密度、または分布、または密度および分布を決定する。いくつかの態様では、グラフトされた品質管理トレーサーは蛍光を用いて検出され、少なくとも部分的に蛍光および所定の比率に基づいて、ゲル材料にグラフトされたプライマーヌクレオチド配列の密度または分布、あるいは密度および分布が決定される。さらなる態様では、共グラフトされたゲル材料を含む支持体は、次に、本明細書に記載のグラフトされたプライマーヌクレオチド配列の密度および／または分布を決定する方法において使用される。他の態様では、本方法はさらに、本明細書に記載されるように、切断部位での酵素的切断または化学的切断によって切断可能なヌクレオチド配列から検出可能な標識を除去することを含む。

別の態様では、本開示は、品質管理トレーサーをアレイにグラフトする方法に関し、品質管理トレーサーを支持体上のウェル中のゲル材料にグラフトし、前記品質管理トレーサーは、切断部位を含む切断可能なヌクレオチド配列、および検出可能な標識を含み、前記切断可能なヌクレオチド配列は、第１の末端および第２の末端を有するグラフト化領域を含み、第１の末端はゲル材料にグラフトされており、第２の末端は前記検出可能な標識に結合しており、前記切断部位を含む切断可能領域に結合していることを含む、方法である。いくつかの態様では、品質管理トレーサーは、グラフト化領域、すなわち品質管理トレーサーのグラフト化領域のグラフトされた第１末端と切断部位との間にプライマーヌクレオチド配列を含む。この配置では、切断部位での切断はゲル材料にグラフトされた未標識プライマー配列を残す。いくつかの態様では、本方法は、切断部位で品質管理トレーサーを切断し、それによって本明細書に記載の切断方法に従ってゲル材料にグラフトされた検出可能な標識を欠くプライマー配列を提供することをさらに含む。

別の態様では、本発明は、プライマーヌクレオチド配列を含むプライマーおよび品質管理トレーサーを含むグラフト混合物に関し、ここでプライマーおよび品質管理トレーサーは所定の比率で混合物中に存在する。

本開示の実施例の特徴および利点は、以下の詳細な説明および図面を参照することによって明らかになるであろう。図中、類似の参照番号は、おそらく同一ではないが類似の構成要素に対応する。簡潔にするために、前述の機能を有する参照番号または特徴は、それらが現れる他の図面に関連して説明されてもされなくてもよいこととする。

図１は、本開示による例示的なアレイの概略図であり、アレイの全体的なレイアウトを示し、個々のサイトの配置を詳細に示している。 図２Ａから図２Ｄは、アレイを形成する方法の一例を示す断面図である。 図３Ａから図３Ｄは、本明細書に開示される品質管理トレーサーの異なる例の概略図である。 図４は、リンカー分子を含む品質管理トレーサーのいくつかの例、およびリンカー分子を切断するために使用され得る化学物質の例を示す図である。 図５は、品質管理方法の一例を示すフロー図である。 図６Ａおよび図６Ｂは、それぞれ、プライマーでグラフトされ、相補的染料含有オリゴヌクレオチド（ＴＥＴ ＱＣ）とハイブリダイズされた対照フローセルの蛍光画像、および本明細書に開示される品質管理トレーサーの例でグラフトされたフローセルの蛍光画像である。図６Ｃは、図５Ａおよび５Ｂのグラフト化表面についての品質管理トレーサー蛍光対ＴＥＴ蛍光を示すグラフである。 図７Ａおよび図７Ｂは、本明細書に開示する品質管理トレーサーの一例でグラフトされたフローセルの初期蛍光画像（クラスタ生成前）およびクラスタ化後蛍光画像（クラスタ生成後）をそれぞれ示す図である。 図８Ａおよび図８Ｂは、図７Ａおよび図７Ｂのグラフトされたフローセルについて、品質管理トレーサー蛍光グラフト化後のプロットおよび品質管理トレーサー蛍光クラスタリング後のプロットをそれぞれ示す図である。 図９Ａおよび図９Ｂは、図７Ａおよび図７Ｂのグラフトされたフローセルを用いた、１つの配列決定サイクル（Ｃ１）後の赤チャネルについて、それぞれ、リード（読み取り）１（Ｒ１）蛍光強度のプロットおよびリード２（Ｒ２）蛍光強度のプロットを示す。 図１０Ａおよび図１０Ｂは、図７Ａおよび図７Ｂのグラフトされたフローセルを用いた、１つの配列決定サイクル（Ｃ１）後の緑チャネルについての、リード１（Ｒ１）蛍光強度のプロットおよびリード２（Ｒ２）蛍光強度のプロットをそれぞれ示す。 図１１Ａおよび図１１Ｂは、図７Ａおよび図７Ｂのグラフトされたフローセルについての参照ゲノムに対する、リード１（Ｒ１）配列アラインメントのプロットおよびリード２（Ｒ２）配列アラインメントのプロットをそれぞれ示す。 図１２Ａおよび図１２Ｂは、それぞれ、図７Ａおよび図７Ｂのグラフトされたフローセルについて、リード１（Ｒ１）の配列決定エラー率のプロットおよびリード２（Ｒ２）の配列決定エラー率のプロットを示す。

本明細書で使用される用語は、他に特定されない限り、関連技術におけるそれらの通常の意味をとることが理解されるべきである。本明細書中で使用されるいくつかの用語およびそれらの意味を以下に記載する。

単数形「１つの（ａ）」、「１つの（ａｎ）」、および「その（ｔｈｅ）」は、文脈が明らかにそうでないと指示しない限り、複数の指示対象を含む。

本明細書で使用されるとき、「アルキル」は、完全に飽和している（すなわち、二重結合または三重結合を含まない）直鎖または分岐の炭化水素鎖を指す。アルキル基は、１～２０個の炭素原子を有していてもよい。アルキル基の例には、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ターシャリーブチル、ペンチル、ヘキシルなどが含まれる。例として、「Ｃ１－４アルキル」という表示は、アルキル鎖中に１～４個の炭素原子があることを示し、すなわち、アルキル鎖は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ｎ－ブチル、イソブチル、ｓｅｃ－ブチル、およびｔ－ブチルからなる群から選択される。

アルキルはハロゲン化物またはハロゲンで置換されていてもよく、それは元素周期表の第７欄のいずれか１つの放射線安定原子、例えばフッ素、塩素、臭素またはヨウ素を意味する。この基は「アルキルハライド」と呼ばれる。

本明細書中で使用される場合、「アルケニル」または「アルケン」とは、１つ以上の二重結合を含有する直鎖または分岐の炭化水素鎖をいう。アルケニル基は、２～２０個の炭素原子を有していてもよい。アルケニル基の例には、エテニル、プロペニル、ブテニル、ペンテニル、ヘキセニルなどが含まれる。アルケニル基は、例えば、「Ｃ２－４アルケニル」と命名することができ、これはアルケニル鎖中に２～４個の炭素原子があることを示す。

本明細書で使用されるとき、「アルキニル」または「アルキン」は、１つまたは複数の三重結合を含有する直鎖または分岐の炭化水素鎖を指す。アルキン基は、２～２０個の炭素原子を有していてもよい。アルキン基は、例えば、「Ｃ２－４アルキニル」と命名することができ、これは、アルキン鎖中に２～４個の炭素原子があることを示す。

「アミド」官能基は、

を指し、ここで、Ｒは蛍光ラベルに結合することができる任意の基であり、Ｒ’はＨであり、Ｒ’’はヌクレオチド配列に結合することができる任意の基である。

本明細書で定義されているように、「アミノ」官能基は、－ＮＲ_ａＲ_ｂ基を指し、式中、Ｒ_ａおよびＲ_ｂはそれぞれ独立して、水素、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ３－７カルボシクリル、Ｃ６－１０アリール、５－１０員ヘテロアリール、および５－１０員ヘテロシクリルから選択される。）

本明細書中で使用される場合、「アリール」とは、環骨格中に炭素のみを含有する芳香環または環系（すなわち、２つの隣接する炭素原子を共有する２つ以上の縮合環）をいう。アリールが環系であるとき、その系中の全ての環は芳香族である。アリール基は、６～１８個の炭素原子を有していてもよく、これはＣ６～１８と表されてもよい。アリール基の例には、フェニル、ナフチル、アズレニル、およびアントラセニルが含まれる。

「アジド」または「アジド」官能基は、－Ｎ_３を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「結合した」は、２つのものが互いに連結、固定、接着、接続または結合されている状態を指す。例えば、核酸は、共有結合または非共有結合によってゲル材料などの材料に結合することができる。共有結合は、原子間の電子対の共有によって特徴付けられる。非共有結合は、電子対の共有を含まない化学結合であり、例えば、水素結合、イオン結合、ファンデルワールス力、親水性相互作用および疎水性相互作用を含み得る。

本明細書で使用されるとき、「カルボシクリル」は環骨格に炭素原子を含む環または環系を意味する。カルボシクリルが環系であるとき、２つ以上の環が縮合、架橋またはスピロ結合様式で一緒に連結されてもよい。カルボシクリルは、環系中の少なくとも１つの環が芳香族ではないという条件で、任意の程度の飽和を有していてもよい。従って、カルボシクリルはシクロアルキル、シクロアルケニル、およびシクロアルキニルを含む。カルボシクリル基は、３～２０個の炭素原子（すなわち、Ｃ３～２０）を有していてもよい。

本明細書で使用されるとき、「シクロアルケニル」または「シクロアルケン」は、少なくとも１つの二重結合を有するカルボシクリル環または環系を意味し、環系中の環は芳香族ではない。例としては、シクロヘキセニルまたはシクロヘキセンおよびノルボルネンまたはノルボルニル

が挙げられる。また本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクロアルケニル」または「ヘテロシクロアルケン」は、少なくとも１つの二重結合を有し、環系中の環は芳香族ではない、環骨格中に少なくとも１個のヘテロ原子を有するカルボシクリル環または環系を意味する。

本明細書で使用されるとき、「シクロアルキニル」または「シクロアルキン」は、少なくとも１つの三重結合を有するカルボシクリル環または環系を意味し、環系中の環は芳香族ではない。一例はシクロオクチン

である。他の例は、ビシクロノニン（すなわち、

のような二環式環系）である。

また本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクロアルキニル」または「ヘテロシクロアルキン」は、少なくとも１つの三重結合を有する、環骨格中に少なくとも１つのヘテロ原子を有するカルボシクリル環または環系であって、環系中の環は芳香族ではないものを意味する。

本明細書で使用される「化学的切断」という用語は、品質管理トレーサーまたはその一部を支持体から除去する化学反応を指す。

本明細書中で使用される場合、用語「切断可能なヌクレオチド配列」とは、切除部位またはリンカー分子において切断され得る一本鎖核酸配列をいう。

アイテムの集まりに関して使用されるとき、用語「それぞれ」は、コレクション内の個々のアイテムを識別することを意図しているが、必ずしもコレクション内のすべてのアイテムを指すとは限らない。明示的な開示または文脈が明らかにそうではないことを示す場合、例外が発生する可能性がある。

本明細書で使用されるとき、用語「酵素的切断」は、品質管理トレーサーまたはその一部を支持体から除去するためにエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼを利用するプロセスを指す。

本明細書で使用される「切除部位」という用語は、酵素によって標的とされるヌクレオチドまたはヌクレオチドの塩基（すなわち核酸塩基）を指す。品質管理トレーサーまたはその一部を切除部位で切断することができる。そのような切断は、単一の酵素的工程または複数の酵素的工程（例えば、塩基修飾または切除とそれに続く切断）を含み得る。

本明細書で使用される「蛍光標識」という用語は、ヌクレオチド配列に化学的に結合しているフルオロフォアを指す。蛍光標識は、ヌクレオチド配列の３’末端、非反応性ヌクレオチド配列の切断可能な核酸塩基、またはヌクレオチド配列に結合しているリンカー分子に結合していてもよい。

本明細書で使用されるとき、用語「ゲル材料」は、液体および気体に対して透過性である半硬質材料を意味することを意図している。典型的には、ゲル材料は、液体が吸収されたときに膨潤し得、そして液体が乾燥によって除去されたときに収縮し得るヒドロゲルである。

本明細書中で使用される場合、用語「グラフトされた」は、共有結合的に結合され、そしてハイブリダイゼーションのような非共有相互作用を介して単独で結合されないことを意味することを意図する。場合によっては、品質管理トレーサー、切断可能なヌクレオチド配列、非反応性ヌクレオチド配列、および／またはプライマーもしくはプライマーヌクレオチド配列は、トレーサー上の官能基またはゲル材料中の官能基を有する配列間の共有結合の形成によってゲル材料にグラフトされる。本明細書で使用されるとき、用語「共グラフト」は、２つ以上の実体のグラフトを指す。

本明細書では、「ヘテロアリール」とは、環骨格中における、１個以上のヘテロ原子、すなわち、これらに限定されないが、窒素、酸素および硫黄を含む、炭素以外の元素を含有する芳香族環または環系（すなわち、２つの隣接する原子を共有する２つ以上の縮合環）を指す。ヘテロアリールが環系であるとき、その系中のすべての環は芳香族である。ヘテロアリール基は、５～１８個の環員を有し得る。

本明細書で使用されるとき、「ヘテロシクリル」は、環骨格中に少なくとも１個のヘテロ原子を含有する非芳香族環式環または環系を意味する。ヘテロシクリルは、融合、架橋またはスピロ結合様式で一緒に結合することができる。ヘテロシクリルは、環系中の少なくとも１つの環が芳香族ではないという条件で、任意の程度の飽和を有していてもよい。環系において、ヘテロ原子は非芳香族環または芳香族環のいずれかに存在し得る。ヘテロシクリル基は、３～２０個の環員（すなわち、炭素原子およびヘテロ原子を含む環主鎖を構成する原子の数）を有していてもよい。ヘテロシクリル基は、「３～６員ヘテロシクリル」または同様の指定として指定され得る。いくつかの例では、ヘテロ原子はＯ、Ｎ、またはＳである。

本明細書で使用される「ヒドラジン」または「ヒドラジニル」という用語は、－ＮＨＮＨ_２基を指す。

本明細書で使用されるとき、「ヒドラゾン」または「ヒドラゾニル」という用語は、基Ｒ_ａ（Ｒ_ｂ）Ｃ＝Ｎ－ＮＨ_２を指し、式中、Ｒ_ａおよびＲ_ｂは本明細書で先に定義されている。

本明細書で使用されるように、「ヒドロキシル」は－ＯＨ基である。

本明細書で使用されているように、「間質領域」という用語は、基板／支持体または表面上の、基板または表面の他の領域を分離する領域を指す。例えば、間質領域は、アレイの１つの特徴をアレイの別の特徴から分離することができる。互いに分離されている２つの特徴は離散的、すなわち互いに接触していないことがある。別の例では、間質領域は、特徴の第１の部分を特徴の第２の部分から分離することができる。多くの例では、間隙領域は連続的であるが、例えば、他の点では連続的な表面に画定された複数のウェルの場合のように、特徴は離散的である。間質領域によって提供される分離は、部分的または完全な分離であり得る。間質領域は、表面に画定された特徴の表面材料とは異なる表面材料を有することができる。例えば、アレイの特徴は、間質領域に存在する量または濃度を超える量または濃度のゲル材料および品質管理トレーサーを有することができる。いくつかの例では、ゲル材料および品質管理トレーサーは間質領域に存在しなくてもよい。

本明細書で使用される「リンカー分子」という用語は、「一方の末端に、検出可能なまたは蛍光標識に結合することができる官能基、および他方の末端に、ヌクレオチド配列に結合することができる官能基を含む分子を指す。結合点は共有結合である。同様に、本明細書で使用される「連結された」という用語は、直接またはリンカー分子を介してのいずれかで、１つまたは複数の共有結合を介して連結されている２つの実体を指す。

本明細書で使用される「ニトリルオキシド」は、「Ｒ_ａＣ≡Ｎ^＋Ｏ^－」基を意味し、式中、Ｒ_ａは、水素、Ｃ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ３－７カルボシクリル、Ｃ６－１０アリール、５－１０員ヘテロアリール、および５－１０員ヘテロシクリルから選択される。ニトリルオキシドを調製する例としては、クロラミド－Ｔでの処理による、またはイミドイルクロリドに対する塩基の作用による［ＲＣ（Ｃｌ）＝ＮＯＨ］、アルドキシムからのｉｎｓｉｔｕ生成が挙げられる。

本明細書で使用される「ニトロン」は、「Ｒ_ａＲ_ｂＣ＝ＮＲ_ｃ ^＋Ｏ^－」基を意味し、ここでＲ_ａおよびＲ_ｂは本明細書で先に定義されており、Ｒ_ｃは、本明細書に定義のＣ１－６アルキル、Ｃ２－６アルケニル、Ｃ２－６アルキニル、Ｃ３－７カルボシクリル、Ｃ６－１０アリール、５－１０員ヘテロアリール、および５－１０員ヘテロシクリルから選択される。

本明細書で使用されるとき、「ヌクレオチド」は、窒素含有複素環式塩基、糖、および１つ以上のリン酸基を含む。ヌクレオチドは核酸配列の単量体単位である。ＲＮＡでは、糖はリボースであり、ＤＮＡではデオキシリボース、すなわちリボースの２’位に存在するヒドロキシル基を欠く糖である。窒素含有複素環式塩基（すなわち核酸塩基）はプリン塩基またはピリミジン塩基であり得る。プリン塩基としては、アデニン（Ａ）およびグアニン（Ｇ）、ならびにそれらの修飾誘導体または類似体が挙げられる。ピリミジン塩基は、シトシン（Ｃ）、チミン（Ｔ）、およびウラシル（Ｕ）、ならびにそれらの修飾誘導体または類似体を含む。デオキシリボースのＣ－１原子は、ピリミジンのＮ－１またはプリンのＮ－９に結合している。

本明細書で言及される「非反応性ヌクレオチド配列」は、行われている特定のＤＮＡまたはＲＮＡ合成に積極的に関与しない任意の核酸配列であり得る。いくつかの例では、非反応性ヌクレオチド配列は品質管理トレーサーの一部を構成してもよい。例えば、非反応性ヌクレオチド配列は、切除部位も含む切断可能なヌクレオチド配列の一部であるポリＴ配列またはポリＡ配列であり得る。別の例では、非反応性ヌクレオチド配列は、使用されているプライマーヌクレオチド配列と直交してもよく、したがって、非反応性ヌクレオチド配列は、プライマーヌクレオチド配列を利用するＤＮＡまたはＲＮＡ合成には関与しないであろう。

本明細書で使用されるとき、「所定の比率」は、混合物中の２つの化合物間の比率を指す。混合物を調製する前に比率を決定する。比率は、混合物中の成分の濃度またはモル濃度の比率であるか、または混合物を作るために混合される２つの成分の溶液の体積の比率である。いくつかの態様では、「所定の比率」は、ゲル材料上のトレーサーとプライマーの比率を指し、そのような場合、その比率は、ゲル材料と反応した成分の比率に基づき、そして場合により２つの成分の任意の異なる反応性を考慮に入れる。いくつかの態様では、トレーサーとプライマーとの混合物についての所定の比率は、プライマー（または複数のプライマー配列が使用される場合はプライマー混合物）のパーセント容量に設定される。

本明細書中で使用される場合、「プライマーヌクレオチド配列」は、ＤＮＡまたはＲＮＡ合成のための出発点として働く一本鎖核酸配列（例えば、一本鎖ＤＮＡまたは一本鎖ＲＮＡ）として定義される。配列決定用プライマーの５’末端は、ゲル材料とのカップリング反応を可能にするように修飾されてもよい。配列決定プライマー長は、任意の長さの塩基であり得、そして種々の非天然ヌクレオチドを含み得る。一例では、シークエンシングプライマーは、２０塩基から５０塩基を含む短鎖である。

本明細書で使用される「タグなし」という用語は、ヌクレオチド配列に蛍光標識が付着していないことを意味する。

「品質管理トレーサー」は、ヌクレオチド配列およびヌクレオチド配列に結合した蛍光標識を含む。品質管理トレーサーの蛍光標識は、品質管理方法において検出することができる。品質管理トレーサーの蛍光標識も除去することができ、そしてトレーサーの残りの部分は、配列決定法に参加することができるか、または配列決定法の間非反応性であるかのいずれかである。

本明細書で使用される場合、「部位」とは、ゲル材料および品質管理トレーサーを付着させることができる支持体上または支持体内に規定された位置を指す。

「基材」および「支持体」という用語は本明細書では互換的に使用され、その部位がその中または上に位置する表面を指す。支持体は一般に硬質でありそして水性液体に不溶性である。支持体は、ゲル材料を修飾するために使用される化学物質に対して不活性であり得る。例えば、支持体は、本明細書に記載の方法において品質管理トレーサーをゲル材料に付着させるのに使用される化学物質に対して不活性であり得る。適切な支持体の例には、ガラスおよび修飾または官能化ガラス、プラスチック（アクリル、ポリスチレンおよびスチレンと他の材料とのコポリマー、ポリプロピレン、ポリエチレン、ポリブチレン、ポリウレタン、ポリテトラフルオロエチレン（例えば、Chemours製のＴＥＦＬＯＮ（登録商標）、環状オレフィン／シクロオレフィンポリマー（ＣＯＰ）（例えば、ＺｅｏｎからのＺＥＯＮＯＲ（登録商標））、ポリイミドなど）、ナイロン、セラミック、シリカまたはシリカベースの材料、シロキサン、シリコンおよび変性シリコン、カーボン、金属、無機ガラス、および光ファイババンドルが含まれる。

「チオール」官能基は、－ＳＨ（例えば、

を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「テトラジン」および「テトラジニル」は、４個の窒素原子を含む６員ヘテロアリール基を指す。テトラジンは任意に置換され得る。

本明細書で使用される「テトラゾール」は、４個の窒素原子を含む５員複素環式基を指す。テトラゾールは任意に置換され得る。

本明細書で使用されるとき、用語「ウェル」は、支持体表面の隙間領域によって完全に囲まれている表面開口部を有する支持体中の個別の凹状特徴を指す。ウェルは、例えば、円形、楕円形、正方形、多角形、星形（任意の数の頂点を有する）などを含む、表面の開口部に様々な形状のいずれかを有することができる。表面と直角にとられたウェルの断面は、曲線、正方形、多角形、双曲線、円錐、角形などであり得る。

いくつかの実施形態では、切断可能なヌクレオチド配列は、酵素的切断または化学的切断によって切断可能である。

いくつかの例において、切断可能なヌクレオチド配列は蛍光標識を結合するリンカー分子を含み、ここでリンカー分子は酵素的切断または化学的切断により切断可能な部分を含む。いくつかの実施形態では、リンカー分子はビシナルジオールを含み、化学的切断は、例えば過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）などの酸化条件によって達成される。他の実施形態では、リンカー分子はジスルフィドを含み、化学的切断はチオールもしくは第三級ホスフィンを用いて達成され、またはリンカー分子がシランであり、化学的切断が酸もしくはフッ化物イオンで達成され、またはリンカー分子がアゾベンゼンであり、化学的切断がナトリウムジチオネート（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４）で達成され、またはリンカー分子が光開裂性基であり、化学的切断が光で達成され、またはリンカー分子がアジドであり、化学的切断が第三級ホスフィンを用いて達成される。第２の態様の別の例では、方法は、エキソヌクレアーゼを使用して、非反応性ヌクレオチド配列の切断可能な核酸塩基から蛍光標識を切断することをさらに含む。

この態様の一例において、品質管理トレーサーは切断可能なヌクレオチド配列を含み、そして切断可能なヌクレオチド配列は切除部位を含む。一例では、切断可能なヌクレオチド配列はプライマーヌクレオチド配列である。

この態様の別の例において、品質管理トレーサーは切断可能なヌクレオチド配列であり、そして切断可能なヌクレオチド配列は蛍光標識を結合するリンカー分子を含む。いくつかの実施形態では、リンカー分子は、ジオール、ジスルフィド、シラン、アゾベンゼン、光開裂性基、およびアジドからなる群から選択される官能基を含む。この態様のこの他の例において、切断可能なヌクレオチド配列はさらにリンカー分子に結合したプライマーヌクレオチド配列を含む。

この態様のさらに別の例において、品質管理トレーサーは非反応性ヌクレオチド配列であり、そして非反応性ヌクレオチド配列はさらに切除部位を含む。

アレイのこの態様は、複数の個別のウェルのそれぞれにおいてゲル材料にグラフトされたタグなしプライマーヌクレオチド配列をさらに含むことができ、ここで品質管理トレーサーおよびタグなしプライマーヌクレオチド配列は所定の比率で存在する。

アレイのこの態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法および／または構成で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。

本方法の第１の態様の一例では、品質管理トレーサーは切断可能なヌクレオチド配列であり、そして切断可能なヌクレオチド配列はプライマーヌクレオチド配列である。この例では、方法は、プライマーヌクレオチド配列の密度、分布、または密度および分布が決定された後に、プライマーヌクレオチド配列から蛍光標識を切断することをさらに含み得る。

方法の第１の態様の別の例では、品質管理トレーサーは切断可能なヌクレオチド配列であり、プライマーヌクレオチド配列は検出前にタグ付けされておらず、この方法は、プライマーヌクレオチド配列をゲル材料にグラフトすることをさらに含み、切断可能なヌクレオチド配列およびプライマーヌクレオチド配列は所定の比率で存在し、プライマーヌクレオチド配列の密度、または分布、または密度および分布の決定は、蛍光および所定の比率に基づく。方法の第１の態様のこの他の例は、切断可能なヌクレオチド配列から蛍光標識を切断することをさらに含み得る。切断は酵素的切断および／または化学的切断によって達成される。

方法の第１の態様のさらに別の例では、品質管理トレーサーは非反応性ヌクレオチド配列であり、プライマーヌクレオチド配列はタグなしであり、検出する前に、この方法はさらに、プライマーヌクレオチド配列をゲル材料にグラフトすることを含み、非反応性ヌクレオチド配列とプライマーヌクレオチド配列は所定の割合で存在し、プライマーヌクレオチド配列の密度、または分布、または密度および分布の決定は、蛍光および所定の比率に基づく。本方法の第１の態様のこのさらに他の例は、エキソヌクレアーゼを用いて非反応性ヌクレオチド配列の切断可能な核酸塩基から蛍光標識を切断することをさらに含むことができる。

方法の第１の態様の任意の特徴は任意の望ましい方法で互いに組み合わせることができることを理解されたい。さらに、方法および／もしくはアレイの第１の態様の特徴の任意の組み合わせを一緒に使用することができ、並びに／または、これらの態様のいずれかまたは両方からの任意の特徴は、本明細書に開示されている任意の実施例と組み合わせることができることを理解されたい。

第２の態様の一例では、方法はさらに、酵素的切断または化学的切断によって切断可能なヌクレオチド配列から蛍光標識を切断することを含む。第２の態様のこの一例のいくつかの例では、品質管理トレーサーは切断可能なヌクレオチド配列であり、切断可能なヌクレオチド配列は蛍光標識を結合するリンカー分子、および以下のうち１つを含む：リンカー分子はジオールを含み、化学的切断は過ヨウ素酸ナトリウム（ＮａＩＯ_４）で達成される；またはリンカー分子がジスルフィドを含み、化学的切断がチオールまたは第三級ホスフィンを用いて達成される；またはリンカー分子がシランであり、化学的切断が酸またはフッ化物イオンで達成される、またはリンカー分子がアゾベンゼンであり、化学的切断がナトリウムジチオネート（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４）で達成される；またはリンカー分子が光開裂性基であり、化学的切断が光で達成される；またはリンカー分子がアジドであり、化学的切断が第三級ホスフィンを用いて達成される。

第２の態様の別の例では、方法は、エキソヌクレアーゼを使用して、非反応性ヌクレオチド配列の切断可能な核酸塩基から蛍光標識を切断することをさらに含む。

方法のこの第２の態様の任意の特徴は、任意の望ましい方法で一緒に組み合わせることができることを理解されたい。さらに、第１の態様および／もしくは第２の態様の特徴の任意の組み合わせを一緒に使用することができること、並びに／またはこれらの態様のいずれかまたは両方からの任意の特徴は、アレイの任意の特徴および／もしくは本明細書に開示される任意の例と組み合わせることができることを理解されたい。

本明細書に開示されるアレイの例はいくつかの部位を含み、それらの部位の各々はゲル材料に付着した品質管理トレーサーの例を有する。品質管理トレーサーは、プライマーヌクレオチド配列を含むか、またはプライマーヌクレオチド配列と所定の比率で存在するので、プライマーヌクレオチド配列の密度および／または分布を決定するための品質管理方法において使用することができる。品質管理トレーサーは、品質管理方法において使用され得、そしてそれが配列決定を妨害しないようにトレーサーから切断され得る蛍光標識を含む。場合によっては、品質管理トレーサーを含めることにより、品質管理目的のためにハイブリダイゼーションおよびデハイブリダイゼーションを行う必要性が軽減される。本明細書に開示される実施例は、支持体上のプライマーヌクレオチド配列の密度および／または分布を、シークエンシング試薬およびサンプルをロードする必要なしに、そしてシークエンシングワークフローにおける初期工程を実施する必要なしに評価することを可能にする。

本明細書に記載され特許請求の範囲に記載された態様および実施例は、上記の定義に鑑みて理解することができる。

図１を参照すると、アレイ１０の一例が示されている。一般に、アレイ１０は、基板または支持体１２と、支持体１２を横切る線または流路１４とを含む。流路１４のそれぞれは、間隙領域１８によって互いに隔てられている複数の部位１６を含む。各部位１６において、少なくとも品質管理トレーサー２２がゲル材料に結合している（例えば、図２Ｄの２４、２４’）。いくつかの例では、品質管理トレーサー２２に加えて、別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’もゲル材料２４に結合している。

図１に示されかつ本開示において論じられるアレイ１０は、フローセルの一部として配置され得るか、またはその一部として形成され得、それを横切って様々なキャリア流体、試薬などを流すことができる固体表面を含むチャンバである。一例では、フローセルは、シーリング材料（例えば、黒色ポリイミドまたは他の適切な接合材料）を介して上部基板に接合されたアレイ１０を含み得る。接合は、支持体１２、封止材料、および上部基板の接合領域で行われる。シール材料が１つの流路１４を隣接する流路１４から物理的に分離するように（交差汚染を防止するために）結合領域を流路間に配置してもよく、（フローセルを外部汚染から密封するために）フローセルの周囲に配置してもよい。しかしながら、実装領域に応じて、接着領域および封止材料を任意の所望の領域に配置することができることを理解されたい。接合は、レーザ接合、拡散接合、陽極接合、共晶接合、プラズマ活性化接合、ガラスフリット接合、または当技術分野で知られている他の方法を介して達成することができる。

アレイ１０と一体化することができ、および／または本開示の方法において容易に使用することができるフローセルおよび関連する流体システムおよび検出プラットフォームの他の例は、例えば、これらの各々が、その全体が参照により本明細書に組み入れられる、Bentley et al., Nature 456:53-59 (2008)、国際公開第04/018497号、米国特許第7,057,026号、国際公開第91/06678号、国際公開第07/123744号、米国特許第7,329,492号、米国特許第7,211,414号、米国特許第7,315,019号、および米国特許第7,405,281号、米国特許出願公開第2008/0108082号に記載される。

いくつかの用途において、フローセルは、ヌクレオチドシーケンサーのような反応自動化装置において制御された化学的または生化学的反応を行うために使用される。ポート２６は、支持体１２を貫通して穿孔されてもよい。ポート２６に接続することによって、反応自動化装置は、密封流路１４内の試薬および生成物の流れを制御してもよい。反応自動化装置は、いくつかの用途では、フローセルの圧力、温度、ガス組成および他の環境条件を調整することができる。さらに、いくつかの用途では、ポート２６は上部基板または支持体１２と上部基板の両方に穿孔されてもよい。いくつかの用途では、封止された流路１４内で起こる反応は、熱、発光および／または蛍光の画像化または測定によって上部基板および／または支持体１２を通して監視されてもよい。

流路１４、部位１６などの特定の向きは、図１に示すものとは異なり得ることを理解されたい。いくつかの例では、部位１６は連続しており、したがって間質領域１８によって分離される必要はない。

図１のアレイ１０、およびアレイ１０をどのように製造することができるかの例を、図２Ａから図２Ｄを参照してより詳細に説明する。

図２Ａは、その中に画定されそして間質領域１８によって分離された部位１６を有する支持体１２を示す。この支持体１２はパターン化された表面を有する。「パターン化された表面」とは、固体支持体１２の露出層内または上の異なる領域（すなわち部位１６）の配置を指す。例えば、１つ以上の部位１６は、１つ以上の品質管理トレーサー２２、そして場合によっては別々のプライマーヌクレオチド配列２２が存在する特徴であり得る。特徴は、品質管理トレーサー２２および別々のプライマーヌクレオチド配列２０が存在しない間質領域１８によって分離することができる。規則的なパターン、繰り返しのパターン、および規則的でないパターンを含む、サイト１６の多くの異なるレイアウトが考えられ得る。一例では、サイト１６は、最密充填および改善された密度のために六角形格子に配置される。他のレイアウトは、例えば、直線（すなわち、長方形）レイアウト、三角形レイアウトなどを含み得る。例として、レイアウトまたはパターンは、行および列にあるサイト１６のｘ－ｙフォーマットであり得る。いくつかの他の例では、レイアウトまたはパターンは、部位１６および／または間質領域１８の繰り返し配列であり得る。さらに他の例では、レイアウトまたはパターンは、部位１６および／または間質領域１８のランダムな配置であり得る。パターンは、スポット、パッド、ウェル、ポスト、ストライプ、スワール、ライン、トライアングル、レクタングル、サークル、アーク、チェック、格子縞、対角線、矢印、正方形、および／またはクロスハッチを含み得る。本明細書に記載の実施例で使用することができるパターン化表面のさらに他の例は、これらのそれぞれが、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許第8,778,849号、米国特許第9,079,148号、および米国特許第8,778,848、並びに米国特許出願公開第2014/0243224号に記載されている。

レイアウトまたはパターンは、定義された領域内のサイト１６の密度（すなわち、サイト１６の数）に関して特徴付けることができる。例えば、部位１６は、１ｍｍ^２あたり約２００万個の密度で存在し得る。密度は、例えば１ｍｍ^２あたり少なくとも約１００（約１００／ｍｍ^２）、約１０００／ｍｍ^２、約１０万／ｍｍ^２、約１００万／ｍｍ^２、約２００万／ｍｍ^２、約５００万／ｍｍ^２、約１０００万／ｍｍ^２、約５０００万／ｍｍ^２、またはそれ以上の密度を含む異なる密度に調整することができる。代替的または追加的に、密度は、１ｍｍ^２あたり約５０００万個（約５０００万／ｍｍ^２）、約１０００万／ｍｍ^２、約５００万／ｍｍ^２、約２００万／ｍｍ^２、約１００万／ｍｍ^２、約１０万／ｍｍ^２、約１０００／ｍｍ^２、約１００／ｍｍ^２以下に調整することができる。支持体１２上の部位１６の密度は、上記の範囲から選択される下限値のうちの１つと上限値のうちの１つとの間であり得ることがさらに理解されるべきである。例として、高密度アレイは、約１００ｎｍ未満で隔てられたサイト１６を有することを特徴とし得、中密度アレイは、約４００ｎｍから約１μｍ離れた部位１６を有することを特徴とし得、低密度アレイは、約１μｍ以上離れているサイト１６を有することを特徴とし得る。

レイアウトまたはパターンは、平均ピッチ、すなわち部位１６の中心から隣接する間質領域１８の中心までの間隔（中心間間隔）に関してもまたは代替的に特徴付けられる。パターンは、平均ピッチの周りの変動係数が小さくなるように規則的とすることができ、またはパターンは非規則的とすることができ、その場合変動係数は比較的大きくなり得る。いずれの場合も、平均ピッチは、例えば、少なくとも約１０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約５μｍ、約１０μｍ、約１００μｍ、またはそれ以上であり得る。代替的または追加的に、平均ピッチは、例えば、最大で約１００μｍ、約１０μｍ、約５μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、約０．１μｍ以下であり得る。特定のパターンの部位１６の平均ピッチは、上記の範囲から選択された下限値の１つと上限値の１つとの間であり得る。一例では、部位１６は約１．５μｍのピッチ（中心間距離）を有する。

いくつかの例では、部位１６はウェル１６'であり、したがって支持体１２はその表面にウェル１６'のアレイを含む。ウェル１６'（または形状、断面などの異なる構成を有する他の部位１６）は、例えばフォトリソグラフィ、ナノインプリントリソグラフィ、スタンピング技術、エンボス加工技術、成形技術、マイクロエッチング技術、印刷技術などを含む様々な技術を使用して製造することができる。当業者には理解されるように、使用される技術は支持体１２の組成および形状に依存するであろう。

ウェル１６'は、マイクロウェル（ミクロンスケールで少なくとも１つの寸法、例えば、約１μｍ～約１０００μｍを有する）またはナノウェル（ナノスケールで少なくとも１つの寸法、例えば約１ｎｍ～約１０００ｎｍを有する）であり得る。各ウェル１６’は、その容積、ウェル開口面積、深さ、および／または直径によって特徴付けることができる。

各ウェル１６’は、液体を閉じ込めることができる任意の容積を有することができる。最小容量または最大容量は、例えば、アレイ１０の下流での使用について予想されるスループット（例えば、多重度）、分解能、検体組成、または検体反応性に適応するように選択することができる。例えば、体積は、少なくとも約１×１０^－３μｍ^３、約１×１０^－２μｍ^３、約０．１μｍ^３、約１μｍ^３、約１０μｍ^３、約１００μｍ^３、またはそれ以上であり得る。あるいはまたはさらに、体積は、最大で約１×１０^４μｍ^３、約１×１０^３μｍ^３、約１００μｍ^３、約１０μｍ^３、約１μｍ^３、約０．１μｍ^３以下であり得る。ゲル材料２４はウェル１６’の容積の全部または一部を満たすことができることを理解されたい。個々のウェル１６’内のゲル材料２４の体積は、上で特定された値よりも大きい、小さい、またはその間であり得る。

表面上の各ウェル開口部によって占有される面積は、ウェル容積について上述したものと同様の基準に基づいて選択することができる。例えば、表面上の各ウェル開口部の面積は、少なくとも約１×１０^－３μｍ^２、約１×１０^－２μｍ^２、約０．１μｍ^２、約１μｍ^２、約１０μｍ^２、約１００μｍ^２、またはそれ以上であり得る。代替的に又は追加的に、面積は最大で約１×１０^３μｍ^２、約１００μｍ^２、約１０μｍ^２、約１μｍ^２、約０．１μｍ^２、約１×１０^－２μｍ^２以下であり得る。

各ウェル１６’の深さは、少なくとも約０．１μｍ、約１μｍ、約１０μｍ、約１００μｍ、またはそれ以上であり得る。代替的または追加的に、深さは最大で約１×１０^３μｍ、約１００μｍ、約１０μｍ、約１μｍ、約０．１μｍ以下であり得る。

場合によっては、各ウェル１６’の直径は、少なくとも約５０ｎｍ、約０．１μｍ、約０．５μｍ、約１μｍ、約１０μｍ、約１００μｍ、またはそれ以上であり得る。代替的または追加的に、直径は最大で約１×１０^３μｍ、約１００μｍ、約１０μｍ、約１μｍ、約０．５μｍ、約０．１μｍ、約５０ｎｍ以下であり得る。

形成されたアレイ１０において、ゲル材料２４は個々のウェル１６’の各々に配置されている。各ウェル１６’内にゲル材料２４を位置決めすることは、図２に示すように、支持体１２のパターン化表面をゲル材料２４で最初にコーティングすることによって達成することができる。次に、例えば化学的または機械的研磨によって、ウェル１６’間の構造化支持体１２の表面上の少なくとも隙間領域１８からゲル材料２４を除去する。これらのプロセスは、ウェル１６’内にゲル材料２４の少なくとも一部を保持するが、ウェル１６’間の構造化支持体１２の表面上の隙間領域１８からゲル材料２４の少なくとも実質的に全部を除去または不活性化する。そのように、これらのプロセスは、多数のサイクルを伴う配列決定の実行にわたって安定であり得る配列決定に使用されるゲルパッド２４’（図２Ｄ）を作り出す。

特に有用なゲル材料２４は、それが存在する部位１６の形状に適合するであろう。いくつかの有用なゲル材料２４は、（ａ）それが存在する部位１６の形状（例えば、ウェル１６’または他の凹状の特徴）に適合することができ、（ｂ）それが存在する部位１６の体積を少なくとも実質的に超えない体積を有する。

適切なゲル材料２４の一例は、式（Ｉ）：

によって表されるポリマーを含み、
ここで、
Ｒ^１は、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり、
Ｒ^Ａは、アジド、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヒドラゾン、任意に置換されたヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、任意に置換されたテトラゾール、任意に置換されたテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、およびチオールからなる群から選択され、
Ｒ^５は、Ｈおよび任意に置換されたアルキルからなる群から選択され、
－（ＣＨ_２）_ｐ－のそれぞれは、任意に置換されていてもよく、
ｐは、１～５０の範囲の整数であり、
ｎは、１～５０，０００の範囲の整数であり、
ｍは、１～１００，０００の範囲の整数である。
式（Ｉ）の構造において、当業者は、「ｎ」および「ｍ」サブユニットがポリマー全体にランダムな順序で存在する繰り返しサブユニットであることを理解するであろう。当業者はまた、他のモノマー成分がポリマー中に存在し得ることを認識するであろう。

ゲル材料２４の特定の例は、ポリ（Ｎ－（５－アジドアセトアミジルペンチル）アクリルアミド－コ－アクリルアミド（「ＰＡＺＡＭ」）であり（例えば、ＵＳ２０１４／００７９９２３Ａ１およびＵＳ２０１５／０００５４４７Ａ１に記載されており、それぞれ参照によりその全体が本明細書に組み込まれる）、これは以下に示す構造：

を含み、
ここで、ｎは１～２０，０００の範囲の整数であり、そしてｍは１～１００，０００の範囲の整数である。式（Ｉ）と同様に、当業者は、「ｎ」および「ｍ」サブユニットがポリマー構造全体にわたってランダムな順序で存在する繰り返し単位であることを認識するであろう。

ＰＡＺＡＭの分子量は、約１０ｋＤａから約１５００ｋＤａの範囲であり得るか、または特定の例では、約３１２ｋＤａであり得る。

いくつかの例では、ＰＡＺＡＭは線状ポリマーである。いくつかの他の実施形態では、ＰＡＺＡＭはわずかに架橋されたポリマーである。他の例では、ＰＡＺＡＭは分岐を含む。

適切なゲル材料２４の他の例には、アガロースなどのコロイド構造、またはゼラチンのようなポリマーメッシュ構造、またはポリアクリルアミドポリマーおよびコポリマーなどの架橋ポリマー構造、シランフリーアクリルアミド（ＳＦＡ、例えば、その全体が参照により本明細書に組み込まれる、米国特許公開第２０１１／００５９８６５号を参照）。またはアジ化分解版のＳＦＡ、を有するものが含まれる。適切なポリアクリルアミドポリマーの例は、例えば、（その全体が参照により本明細書に組み込まれる）国際公開第２０００／０３１１４８号に記載されているようにアクリルアミドおよびアクリル酸またはビニル基を含有するアクリル酸から、あるいは、例えば、（それぞれの全体が参照により本明細書に組み込まれる）国際公開第２００１／００１１４３号または国際公開第２００３／００１４３９２号に記載されているように、［２＋２］光付加環化反応を形成するモノマーから形成することができる。

ゲル材料２４は予備成形ゲル材料とすることができる。予め形成されたゲル材料は、スピンコーティング、ディッピング、または陽圧もしくは陰圧下でのゲルの流れ、または参照によりその全体が本明細書に組み込まれる米国特許第９，０１２，０２２号に記載の技術を用いてコーティングされ得る。ディッピングまたはディップコーティングは、使用される支持体１２およびゲル材料２４に応じて、選択的堆積技術であり得る。一例として、パターン化された支持体１２を予め形成されたゲル材料２４に浸し、そしてゲル材料２４が部位１６を選択的に充填することができ（すなわち、ゲル材料２４は間質領域１８上に堆積しない）、そして研磨（または他の除去プロセス）は必要ないかもしれない。

予め形成されたＰＡＺＡＭは、スピンコーティング、ディッピング、または陽圧もしくは陰圧下でのゲルの流動、または米国特許第９，０１２，０２２号に記載の技術を使用してパターン化された支持体１２上にコーティングすることができる。ＰＡＺＡＭの付着はまた、共有結合を形成するための化学反応によって、またはシラン化表面への表面開始原子移動ラジカル重合（ＳＩ－ＡＴＲＰ）を介して起こり得る。

いくつかの例において、支持体表面はアルケン誘導体化シランで処理され、ここでアルケン部分は直鎖状、分岐状、または環状であり得る。いくつかの例では、シラン試薬は（ＲＯ）_３Ｓｉ－リンカー－アルケンであり、他の例では、シラン試薬は（ＲＯ）_３Ｓｉ－Ｃ_２－６アルキレン－シクロアルケンであり、他の例では、シラン試薬は（ＲＯ）_３Ｓｉ－ＣＨ_２ＣＨ_２－ノルボルネンであり、ここで各ＲはＣ_１－４アルキルであるか、またはメチルもしくはエチルである。ＰＡＺＡＭなどのゲル材料２４は、熱または紫外線条件下でアルケン誘導体化シランに共有結合する。

他の例では、支持体１２の表面を、アミノプロピルトリアルコキシシラン（ＡＰＴＳ）などのアミノ誘導体化シラン、例えば、３－アミノプロピル－トリメトキシシラン（ＡＰＴＭＳ）または３－アミノプロピル－トリエトキシシラン（ＡＰＴＥＳ）で前処理して、表面上の１つまたは複数の酸素原子にケイ素を共有結合させることができる（機構に拘束されることを意図せずに、各ケイ素は１、２または３個の酸素原子に結合し得る）。この化学的に処理された表面を焼き付けてアミン基単層を形成する。次いでアミン基をスルホ－ＨＳＡＢと反応させてアジド誘導体を形成する。１Ｊ／ｃｍ^２～３０Ｊ／ｃｍ^２のエネルギーで２１℃でのＵＶ活性化は活性ニトレン種を生成し、これはＰＡＺＡＭとの様々な挿入反応を容易に受けることができる。

支持体１２上にＰＡＺＡＭをコーティングするための他の例は、その全体において参照により本明細書に組み込まれる米国特許公開第２０１４／０２００１５８号に記載されており、これには、アミン官能化表面へのＰＡＺＡＭモノマーの紫外線（ＵＶ）媒介結合、または活性基（塩化アクリロイルまたは他のアルケンまたはアルキン含有分子）を含む熱結合反応と、それに続くＰＡＺＡＭの堆積および熱の適用が含まれる。

ゲル材料２４は、後でゲル材料２４を形成する液体を塗布することによって形成することができる。続いてゲル材料２４を形成する液体を塗布する例は、液体形態のシラン不含アクリルアミドおよびＮ－［５－（２－ブロモアセチル）アミノペンチル］アクリルアミド（ＢＲＡＰＡ）で一連の部位１６をコーティングすることであり、試薬が表面で重合することによってゲルを形成することを可能にする。このようにアレイをコーティングすることは、米国特許公開第２０１１／００５９８６５号に記載されているような化学試薬および手順を使用することができる。

ゲル材料２４は、（部位１６において）支持体１２に共有結合していてもよく、または支持体１２に共有結合していなくてもよい。部位１６へのポリマーの共有結合は、様々な使用中にアレイ１０の寿命を通して構造化部位１６内にゲルを維持するのに役立つ。しかしながら、上記のようにそして多くの例において、ゲル材料２４は部位１６に共有結合させる必要はない。例えば、シラン不含アクリルアミド、ＳＦＡは支持体１２のいかなる部分にも共有結合させない。

上述のように、図２Ｃは、間質領域１８からのゲル材料２４の除去を示す。除去は研磨によって達成することができる。研磨は、機械的および／または化学的処理工程であり得る。

機械的研磨は、（その上にゲル材料２４を有する）固体支持体１２の表面に研磨力を加えることによって実施することができる。例示的な方法としては、ビーズのスラリーによる研磨、シートまたは布による拭き取り、掻き取りなどが挙げられる。研磨に使用されるビーズは球状であってもなくてもよく、不規則形状、多角形形状、卵形形状、細長形状、円筒形状などを有することができることが理解されよう。ビーズの表面は滑らかでも粗いものでもよい。様々な粒子のいずれも研磨用ビーズとして有用であり得る。研磨の一例は、間隙領域１８からゲル材料２４を除去するために３μｍのシリカビーズスラリー（水中１０％ｗ／ｖ）で被覆された糸くずの出ない（クリーンルームグレードの）拭き取り用品を使用することを含む。このスラリーと共に砥石車／砥石機を使用することもできる。機械的研磨は、間隙領域１８からゲルを除去するために流体ジェットまたはガス（例えば、アルゴンまたは窒素などの不活性ガスまたは空気）ジェットを使用して達成することもできる。

アクリルアミドの加水分解またはラジカルベースの分解（例えば、過酸化ベンゾイルまたは希過酸化水素への曝露による）などの化学研磨技術を使用することができる。この形態の研磨中、化学薬品は固体、液体、気体またはプラズマ状態で供給することができる。したがって、プラズマ研磨はいくつかの例において有用であり得る。

研磨は、化学的研磨方法と機械的研磨方法との組み合わせを含むこともでき、粒子のコロイド状懸濁液を含有する化学スラリーを使用して、間隙領域１８からゲル材料２４の変位部分を機械的に剥離し、次いで化学的に溶解する。

間質領域１８を研磨または洗浄するための他の方法としては、接着剤ベースの技術、例えば、ゲル材料２４に対して親和性を有する硬質の平面接着フィルムを適用し、それによって間質領域１８においてゲル材料２４と（例えば化学結合により）密接に接触させる技術が挙げられる。この接着フィルムの機械的除去／剥離は、部位１６内にゲル材料２４を残しながら、間質領域１８からゲル材料２４を機械的に除去することになる。

一例では、チオリン酸グラフトＳＦＡは、以下のように支持体１２表面上の間質領域１８から除去することができる：水で湿らせたＷｈａｔｍａｎワイプを酸化アルミニウム（約１００ｍｇ、０．３μｍ）またはスチールビーズに浸すことができ、次いで、形成されたスラリーを、均一な圧力を用いて、小さな同心円状に、（チオホスフェートグラフトＳＦＡをその上に有する）支持体の表面上で擦ることができ、次いできれいな水で濡れたワットマンワイプを使用して、表面からスラリーとチオホスフェートグラフトＳＦＡを除去することができる。

間隙領域１８からゲル材料２４を除去するために本明細書に例示される機械的および化学的研磨方法はまた、ゲル材料２４が除去されるかどうかにかかわらず、間質領域１８でゲル材料を不活性化するために使用され得る。例えば、ゲル材料２４は、品質管理トレーサー２２と別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’とを結合する能力に関して不活性化することができる。

ゲル材料２４が各ウェル１６’内に配置された後、品質管理トレーサー２２、および場合によっては別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’がゲル材料２４にグラフトされる。使用される付着技術、および別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’が含まれるかどうかは、部分的には、利用される品質管理トレーサー２２に依存するであろう。品質管理トレーサー２２の様々な例が図３Ａから図３Ｄおよび図４に示されている。次に各例について説明する。

図３Ａは、別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’を有するゲル材料２４／ゲルパッド２４’に含まれる品質管理トレーサー２２Ａの例を示す。この例では、品質管理トレーサー２２Ａは、その３’末端が蛍光標識２８でタグ付けされた切断可能なヌクレオチド配列２７であり、そしてプライマーヌクレオチド配列２０、２０’はタグなしのプライマーヌクレオチド配列である。

図３Ａの切断可能なヌクレオチド配列２７は、その５’末端にゲル材料２４に結合することができる官能基を含み得る。この官能基の例には、アルキン、ノルボルニル（または他のシクロアルケニル）、銅フリークリック部分（例えば、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、他のシクロアルキンなど）、およびチオールが含まれる。この官能基は、使用されるゲル材料２４に基づいて選択され得る。例えば、アルキン、ノルボルニル、および銅フリークリック部分は、クリック反応を介してＰＡＺＡＭのアジドと反応し得、そしてチオールはＳＦＡと反応し得る。いくつかの実施形態では、官能基はアルキンである。

図３Ａの切断可能なヌクレオチド配列２７はまた、その３’末端に、蛍光標識２８に結合することができる官能基を含み得る。オリゴヌクレオチド合成中に使用できるこの官能基の例は、５’－ジメトキシトリチル－５－［Ｎ－（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）－３－アクリルイミド］－２’－デオキシウリジン、３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ、Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（すなわち、アミノ改質剤Ｃ６ｄＴ）である。他の例には、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ－ジメチルホルムアミジン－５－［Ｎ－（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）－３－アクリルイミド］－２’－デオキシシチジン、３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ、Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（アミノ修飾剤Ｃ６ｄＣ）および例えば（２－ジメトキシトリチルオキシメチル－６－フルオレニルメトキシカルボニルアミノ－ヘキサン－１－スクシノイル）－長鎖アルキルアミノ－ＣＰＧのような固体支持体の使用が含まれる。３’末端の官能基は、使用される蛍光標識２８に基づいて選択され得る。

検出可能または蛍光標識２８は、例えば３’末端（または３’末端またはその近く）で切断可能なヌクレオチド配列２７に結合することができる任意の適切なフルオロフォアであり得る。適切な蛍光標識２８の例には、Ｔｅｘａｓ Ｒｅｄ（登録商標）（塩化スルホニル染料、Thermo Fisher Scientific）、Ｃｙ７（登録商標）、Ｃｙ７．５（登録商標）またはスルホ－シアニン７ＮＨＳエステル（Lumiprobeからのシアニン染料）、ＴＥＸ（商標）６１５（Ｅｘｉｑｏｎ）などの赤色波長染料、Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）シリーズ（Thermo Fisher Scientific）のような蛍光染料、Ａｔｔｏ染料（例えば、その構造が

である、Ａｔｔｏ－４８８シリーズ、Ａｔｔｏ－ＴｅｃからのＡｔｔｏ－Ｔｅｃシリーズ）、ＦＡＭ（商標）染料（フルオレセインの誘導体、Integrated DNA Technologies）、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）染料などのキサンテンフルオロフォア（例えば、LGC Biosearch TechnologiesからのＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）ゴールド５４０、ＣＡＬＦｌｕｏｒ（登録商標）オレンジ４６０、ＣＡＬＦｌｕｏｒ（登録商標）レッド５９０、ＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）レッド６１０、およびＣＡＬ Ｆｌｕｏｒ（登録商標）レッド６３５）、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）染料（例えば、LGC Biosearch TechnologiesからのＱｕａｓａｒ（登録商標）５７０、Ｑｕａｓａｒ（登録商標）６７０、およびＱｕａｓａｒ（登録商標）７０５）などのインドカルボシアニン染料、または当業者に公知の任意の他の適切なフルオロフォアが含まれる。他の例としては、Ｄｙｌｉｇｈｔ（商標）４８８（アミン反応性染料）、または最大発光波長が約５１８ｎｍのフルオロフォアが挙げられる。いくつかの態様では、蛍光標識はキサンテンフルオロフォアである。いくつかの態様では、キサンテンフルオロフォアは、５４０から６４０ｎｍ、または５４０から５７０ｎｍ、または５８０から６４０ｎｍの範囲の最大発光を有する。他の態様では、キサンテンフルオロフォアは５８５から６４０ｎｍの範囲の最大発光を有する。他の態様では、キサンテンフルオロフォアはスペクトルの赤色領域で発光する。他の態様では、キサンテンフルオロフォアは、最大約５９１ｎｍ、または６１０ｎｍ、または６３７ｎｍの最大発光を有する。他の適切な検出可能な標識としては、プラズモニックナノ粒子（例えば、ＳＰＲ検知によって検出される）または量子ドットなどの非蛍光標識が挙げられる。いくつかの態様では、検出可能な標識は、オリゴヌクレオチド配列への結合を可能にするためにＮＨＳなどのアミノ反応性基で誘導体化されている。

蛍光標識２８は、鋳型指向性ライゲーション、ポリメラーゼ媒介オリゴヌクレオチド伸長、化学合成などの任意の適切な方法を使用して切断可能ヌクレオチド配列２７に付着させることができる。蛍光標識２８の付着は、ヌクレオチド合成中（例えば、固相オリゴヌクレオチド合成中の蛍光標識修飾モノマーの使用または相補的なフルオロフォア標識ＤＮＡの合成を可能にする変異型ＤＮＡポリメラーゼの使用）またはヌクレオチド合成後（例えば、カップリング化学反応を介して、ラベル２８を３’位に位置する以前に設置された官能基上に共役させる）に起こり得る。

切断可能ヌクレオチド配列２７のこの例は、切断可能部分３１および残りの部分２９を含む。切断可能部分３１は、蛍光標識２８（および蛍光標識２８を結合するために使用される任意の官能基）、任意のヌクレオチド配列、および切除部位３０を含む。そのため、切断可能なヌクレオチド配列２７の切断可能部分３１は、配列２７が切除部位３０に位置するヌクレオチドを標的とする酵素に曝露されたときに除去され得る。酵素的切断後にゲル材料２４に結合したままである切断可能なヌクレオチド配列２７の部分２９は、非反応性ヌクレオチド配列であり、したがって行われるべきまたは行われている配列決定操作に関与しないかまたは干渉しない。残りの部分は、短いポリＴまたはポリＡ配列であり得るか、またはゲル材料２４にも結合しているプライマーヌクレオチド配列２０、２０’に直交する配列であり得る。

図３Ａの品質管理トレーサー２２Ａは、（例えば、本明細書に開示されている品質管理方法の例において）別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’と組み合わせて使用される。適切なプライマーヌクレオチド配列２０、２０’の例には、相補配列へのハイブリダイゼーションおよび配列の増幅のためのフォワード増幅プライマーまたはリバース増幅プライマーが含まれる。適切なプライマーヌクレオチド配列２０、２０’のいくつかの具体例には、Ｐ５および／またはＰ７プライマーが含まれる。Ｐ５およびＰ７プライマーは、イルミナ社によって販売されている市販のフローセルの表面上で、ＨｉＳｅｑ（登録商標）、ＨｉＳｅｑＸ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）、ＮｅｘｔＳｅｑ（登録商標）、Ｇｅｎｏｍｅ Ａｎａｌｙｚｅｒ（登録商標）、および他の機器プラットフォームでの配列決定に使用される。Ｐ５およびＰ７プライマー、ならびに他の配列決定プライマー２０、２０’は、５’末端でゲル材料２４の官能基と反応することができる基で修飾することができる。適切な官能基の一例は、ビシクロ［６．１．０］ノナ（non）－４－イン（ＢＣＮ）であり、これはゲル材料２４のアジドと反応することができる。末端プライマーの他の例には、テトラジン末端プライマー、ノルボルネン末端プライマー、アルキン末端プライマー、アミノ末端プライマー、エポキシまたはグリシジル末端プライマー、チオホスフェート末端プライマー、およびトリアゾリンジオン末端プライマーが含まれる。アルキン末端であり得るＰ５およびＰ７プライマーの例には、以下
Ｐ５：５’－アルキン－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡＣ－３’（配列番号１）
Ｐ７：５’－アルキン－ＣＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＣＧＧＣＡＴＡＣＧＡＧ＊ＡＴ－３’（配列番号２）
およびその誘導体が含まれる。いくつかの例では、Ｐ７配列はＧ^＊位に修飾グアニン、例えば８－オキソ－グアニンを含む。他の例では、^＊はＧ^＊と隣接する３Ａの間の結合がホスホロチオエート結合であることを示す。いくつかの例では、Ｐ５および／またはＰ７プライマーは非天然リンカーを含む。

場合によっては、Ｐ５およびＰ７プライマーの一方または両方はポリＴテールを含むことができる。ポリＴテールは一般に、配列の５’末端（例えば、５’末端塩基とアルキン単位との間）に位置するが、場合によっては３’末端に位置し得る。ポリＴ配列は、例えば２～２０個の任意の数のＴヌクレオチドを含み得る。

Ｐ５およびＰ７プライマーが例として挙げられているが、本明細書に提示されている例では任意の適切な増幅プライマーを使用できることを理解されたい。当業者は、本明細書に提示されるような核酸の捕捉および増幅に適しているプライマーヌクレオチド配列２０、２０’を設計および使用する方法を理解するであろう。

品質管理トレーサー２２Ａの例は、Ｐ５およびＰ７プライマーヌクレオチド配列２０、２０’に直交している。いくつかの態様において、品質管理トレーサーはウラシル切除部位を含む。

いくつかの態様では、品質管理トレーサーは以下：
５’ＣＡＴＣＴＡＧＧＣＡＴＣＴＡＡＧＣＡＴＣＡＡＵＣＴＴＡＣＡ３’（配列番号３）
５’ＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＵＡＣＡＴＡＣＡ３’（配列番号４）
５’ＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＵＧＡＴＴＧＡＴ３’（配列番号５）
のシーケンスのうちの１つを含む。
ここで、Ｕは切断部位である。いくつかの局面において、Ｕはウラシル切除部位である。

いくつかの態様では、品質管理トレーサーは配列の５’末端にポリＴ配列を含む。いくつかの態様では、ポリＴ領域は、２～２０個、または３、４、５、６、または７個のＴヌクレオチドを含む。いくつかのの態様では、ポリＴ領域は４、５、または６個のＴ塩基を含む。他の態様では、ポリＴ領域は６個のＴヌクレオチドを含む。いくつかの態様では、配列は、
（１）５’ポリＴ－ＣＡＴＣＴＡＧＧＣＡＴＣＴＡＡＧＣＡＴＣＡＡＵＣＴＴＡＣＡ３’（配列番号６）または
（２）５’ポリＴ－ＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＵＡＣＡＴＡＣＡ３’（配列番号７）または
（３）５’ポリＴ－ＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＵＧＡＴＴＧＡＴ３’（配列番号８）
である。

いくつかの態様では、品質管理トレーサーは蛍光標識としてテキサスレッド（登録商標）を含む。いくつかの態様では、品質管理トレーサーは
５’－アルキン－ＣＡＴＣＴＡＧＧＣＡＴＣＴＡＡＧＣＡＴＣＡＡＵＣＴＴＡＣＡ［アミノＣ６ｄＴ－テキサスレッド］－３’（配列番号９）または
５’－アルキン－ＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＵＡＣＡＴＡＣＡ［アミノＣ６ｄＴ－テキサスレッド］－３’（配列番号１０）または
５’－アルキン－ＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＵＧＡＴＴＧＡＴ［アミノＣ６ｄＴ－テキサスレッド］－３’（配列番号１１）
である。
いくつかの態様では、これらのトレーサーはまた、本明細書中に記載されるように、アルキンと残りの配列との間にポリＴ領域を含む。

いくつかの態様では、品質管理トレーサーは、
５’－アルキン－ＣＡＴＣＴＡＧＧＣＡＴＣＴＡＡＧＣＡＴＣＡＡＵＣＴＴＡＣＡ［アミノＣ６ ｄＴ－キサンテンフルオロフォア］－３’（配列番号１２）または
５’－アルキン－ＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＵＡＣＡＴＡＣＡ［アミノＣ６ ｄＴ－キサンテンフルオロフォア］－３’（配列番号１３）または
５’－アルキンＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＴＧＡＴＵＧＡＴＴＧＡＴ［アミノＣ６ ｄＴ－キサンテンフルオロフォア］－３’（配列番号１４）
である。
いくつかの態様では、これらのトレーサーはまた、本明細書中に記載されるように、アルキンと配列の残りの部分との間の５’末端にポリＴ領域を含む。

いくつかの態様では、品質管理トレーサーはアルキン末端を含み、いくつかの態様では、それは５’－ヘキシン末端である。適切な末端を用いてトレーサーをゲル材料に付着させる。

いくつかの態様では、品質管理トレーサーは
５’－アルキン－ＴＴＴＴＴＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＴＡＣＡＵＡＣＡＴＡＣＡ［アミノＣ６ ｄＴ－キサンテンフルオロフォア］－３’（配列番号１５）
である。
いくつかの態様では、アルキンはヘキシンである。いくつかの態様では、Ｕ切断部位はウラシル切除部位である。いくつかの態様では、キサンテンフルオロフォアは５８５から６４０ｎｍの範囲の最大発光を有する。他の態様では、キサンテンフルオロフォアはスペクトルの赤色領域で発光する。他の態様では、キサンテンフルオロフォアは、最大約５９１ｎｍ、または６１０ｎｍ、または６３７ｎｍの最大発光を有する。いくつかの態様では、フルオロフォアはテキサスレッド（登録商標）である。

いくつかの態様では、品質管理トレーサーがプライマー配列と検出可能な標識の両方を含む場合、品質管理トレーサーは、以下のシーケンス：
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡ－３’（配列番号１６）
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＡＣＡＣ－３’（配列番号１７）
５’－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡＣ－３’（配列番号１）
のうちの１つを含む。
いくつかの態様では、品質管理トレーサーは上述のようにポリＴ領域を含む。いくつかの例では、品質管理トレーサーは、以下のシーケンス：
５’－（ポリＴまたはＴＴＴＴＴＴ）ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡ－３’（配列番号１８）
５’－（ポリＴまたはＴＴＴＴＴＴ）ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＡＣＡＣ－３’（配列番号１９）
５’－（ポリＴまたはＴＴＴＴＴＴ）ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡＣ－３’（配列番号２０）
のうちの１つを含む。
いくつかの態様では、品質管理トレーサーはゲル材料へのグラフト化を可能にする末端を含む。いくつかの例では、末端はアルキンまたはヘキシン部分である。したがって、いくつかの態様では、品質管理トレーサーは以下のシーケンス：
５’－（アルキン）－（ポリＴまたはＴＴＴＴＴＴ）ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡ－３’（配列番号１８）
５’－（アルキン）－（ポリＴまたはＴＴＴＴＴＴ）ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＡＣＡＣ－３’（配列番号１９）
５’－（アルキン）－（ポリＴまたはＴＴＴＴＴＴ）ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡＣ－３’（配列番号２０）
のうちの１つを含む。
いくつかの態様では、品質管理トレーサーは、本明細書に記載のキサンテンフルオロフォア、またはテキサスレッドを含む。いくつかの態様では、品質管理トレーサーは以下のシーケンス：
５’－（アルキン）－（ポリＴまたはＴＴＴＴＴＴ）ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡ（アミノＣ６ ｄＴ－キサンテンフルオロフォア）－３’（配列番号２１）
５’－（アルキン）－（ポリＴまたはＴＴＴＴＴＴ）ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣ（アミノＣ６ ｄＴ－キサンテンフルオロフォア）ＡＣＡＣ－３’（配列番号２２）
５’－（アルキン）－（ポリＴまたはＴＴＴＴＴＴ）ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡＣ（アミノＣ６ ｄＴキサンテンフルオロフォア）－３’（配列番号２３）
のうちの１つを含む。

図３Ａの品質管理トレーサー２２Ａが使用されるとき、それは別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’に関して所定の比率で存在することが理解されるべきである。本明細書に開示される品質管理方法の一例において、所定の比率を使用して、別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’の密度および／または分布を間接的に決定することができる。

図３Ａに示す例を形成するために、逐次グラフト化または共グラフト化を使用することができる。

順次グラフト化は、支持体１２（部位１６にゲル材料２４を有する）を、品質管理トレーサー２２Ａを含有する溶液または混合物に曝露し、そしてインキュベートし、次に、プライマーヌクレオチド配列２０、２０’を含む溶液または混合物に曝露し、インキュベートすることによって達成され得る。あるいは、順次グラフト化は、支持体１２（部位１６にゲル材料２４を有する）を、プライマーヌクレオチド配列２０、２０’を含む溶液または混合物に曝露し、そしてインキュベートし、次に、品質管理トレーサー２２Ａを含む溶液または混合物に曝露してインキュベートすることによって達成され得る。

共グラフト化は、支持体１２（部位１６にゲル材料２４を有する）を品質管理トレーサー２２Ａおよびプライマーヌクレオチド配列２０、２０’を含む溶液または混合物に曝露し、次いでインキュベートすることによって達成され得る。この溶液または混合物への支持体１２の曝露は、品質管理トレーサー２２Ａとプライマーヌクレオチド配列２０、２０’との混合物を支持体１２上に堆積させることによって達成され得る。一例では、溶液または混合物は、ゲル材料２４でコーティングされた支持体１２（図２Ｃに示される）にわたって引き込まれてもよい。

図３Ａに示される例を形成するために使用されるグラフト例のいずれにおいても、インキュベーションは、品質管理トレーサー２２Ａおよび使用されるプライマーヌクレオチド配列２０、２０’に部分的に依存する所定の温度で行われる。例として、インキュベーションは、約５０℃から約７０℃の範囲の温度で達成することができる。

また、図３Ａに示される例を形成するために使用されるグラフト例のいずれにおいても、溶液は、品質管理トレーサー２２Ａおよび／またはプライマーヌクレオチド配列２０、２０’、水、緩衝液、および触媒を含み得る。品質管理トレーサー２２Ａおよび／またはプライマーヌクレオチド配列２０、２０’は、同じ溶液／混合物中に存在するかまたは別々の溶液／混合物中に存在するかにかかわらず、任意の所望の所定の比率で存在し得る。

図３Ｂは、別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’を有するゲル材料２４／ゲルパッド２４’に含まれる品質管理トレーサー２２Ｂの別の例を示す。この例では、品質管理トレーサー２２Ｂは、切断可能な核酸塩基に結合した蛍光標識２８を有する非反応性ヌクレオチド配列３２であり、そしてプライマーヌクレオチド配列２０、２０’はタグなしプライマーヌクレオチド配列である。

品質管理トレーサー２２Ｂのこの例の非反応性ヌクレオチド配列３２は、品質管理方法が実行された後およびシーケンスが実行されている間、少なくとも実質的に無傷のままであり、したがって、配列３２は、ゲル材料２４にも結合しているプライマーヌクレオチド配列２０、２０’と直交している。

図３Ｂの非反応性ヌクレオチド配列３２は、その５’末端にゲル材料２４に結合することができる官能基を含み得る。この官能基の例には、アルキン、ノルボルニル（または他のシクロアルケニル）、銅フリークリック部分（例えば、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、他のシクロアルキンなど）、およびチオールが含まれる。この官能基は、使用されるゲル材料２４に基づいて選択され得る。例えば、アルキン、ノルボルニル、および銅フリークリック部分は、クリック反応を介してＰＡＺＡＭのアジドと反応し得、そしてチオールはＳＦＡと反応し得る。

品質管理トレーサー２２Ｂのこの例では、蛍光標識２８は、配列３２の切断可能な核酸塩基に結合している。蛍光標識２８が結合している核酸塩基は、ホスホジエステル骨格を無傷のまま残しながら、特定の塩基の切除を触媒するエキソヌクレアーゼによって切断することができるものである。

この例では、蛍光標識２８は、配列３２の３’末端付近（例えば１０塩基以内）に付着させることができるが、直接付着させることはできない。選択された標識が非反応性ヌクレオチド配列３２の望ましい核酸塩基に共有結合することができる限り、前述の蛍光標識２８のいずれを使用してもよい。

図３Ｂの品質管理トレーサー２２Ｂは、（例えば、本明細書に開示されている品質管理方法の例において）別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’と組み合わせて使用される。適切なプライマーヌクレオチド配列２０、２０’の例には、相補配列へのハイブリダイゼーションおよび配列の増幅のためのフォワード増幅プライマーまたはリバース増幅プライマーが含まれる。適切なプライマーヌクレオチド配列２０、２０’のいくつかの具体例には、前述のＰ５またはＰ７プライマーが含まれる。

図３Ｂの品質管理トレーサー２２Ｂが使用されるとき、それはプライマーヌクレオチド配列２０、２０’に対して所定の比率で存在することが理解されるべきである。本明細書に開示される品質管理方法の一例において、所定の比率を使用して、プライマーヌクレオチド配列２０、２０’の密度および／または分布を間接的に決定することができる。

図３Ｂに示される例を形成するために、品質管理トレーサー２２Ａの代わりに品質管理トレーサー２２Ｂが使用されることを除いて、逐次グラフト化または共グラフト化が前述のように使用されてもよい。図３Ｂに示される例を形成するために使用されるグラフト例のいずれにおいても、インキュベーションは、ある程度、品質管理トレーサー２２Ｂおよび使用されるプライマーヌクレオチド配列２０、２０’に依存する所定の温度で行われる。また、図３Ｂに示される例を形成するために使用されるグラフト例のいずれにおいても、溶液は、品質管理トレーサー２２Ｂおよび／またはプライマーヌクレオチド配列２０、２０’、水、緩衝液、および触媒を含み得る。品質管理トレーサー２２Ｂおよび／またはプライマーヌクレオチド配列２０、２０’は、同じ溶液／混合物中に存在するかまたは別々の溶液／混合物中に存在するかにかかわらず、任意の所望の所定の比率で存在し得る。

図３Ｃは、別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’を有するゲル材料２４／ゲルパッド２４’に含まれる品質管理トレーサー２２Ｃのさらに別の例を示す。この例では、品質管理トレーサー２２Ｃは、切断可能な核酸塩基に結合した蛍光標識２８（３’末端付近）および切除部位３０を有する非反応性ヌクレオチド配列３２’であり、プライマーヌクレオチド配列２０、２０’はタグなしプライマーヌクレオチド配列である。

品質管理トレーサー２２Ｃのこの例は、切断可能な核酸塩基に結合した蛍光標識２８を含むので、品質管理方法が実行された後にエキソヌクレアーゼを用いて蛍光標識２８を除去することができる。この例では、品質管理方法が実行された後、非反応性ヌクレオチド配列３２’は少なくとも実質的に無傷のままであり、したがって、非反応性ヌクレオチド配列３２’は、ゲル材料２４にも付着しているプライマーヌクレオチド配列２０、２０’と直交していてもよい。

さらに、この例の品質管理トレーサー２２Ｃも切除部位３０を含むので、品質管理方法が実行された後に酵素的切断を用いて非反応性配列３２’の切断可能部分３１’を除去することができる。この例では、切断可能部分３１’は、任意のオリゴヌクレオチドの配列、その配列に沿って核酸塩基に結合した蛍光標識２８、および切除部位３０を含む。酵素的切断後にゲル材料２４に付着したままである非反応性ヌクレオチド配列３２’の部分２９’もまた非反応性ヌクレオチド配列であり、したがって、実行されることになっている、または実行されているシーケンス操作に参加したり、それを妨害したりすることはない。残りの部分２９’は、短いポリＴまたはポリＡ配列であり得るか、またはゲル材料２４にも結合したプライマーヌクレオチド配列２０、２０’に対して直交する配列であり得る。

図３Ｃの非反応性ヌクレオチド配列３２’は、その５’末端にゲル材料２４に結合することができる官能基を含み得る。この官能基の例には、アルキン、ノルボルニル（または他のシクロアルケニル）、銅フリークリック部分（例えば、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、他のシクロアルキンなど）、およびチオールが含まれる。この官能基は、使用されるゲル材料２４に基づいて選択され得る。例えば、アルキン、ノルボルニル、および銅フリークリック部分は、クリック反応を介してＰＡＺＡＭのアジドと反応し得、そしてチオールはＳＦＡと反応し得る。

この例では、蛍光標識２８は、配列３２’の３’末端の近く（例えば、１０塩基以内）に付着させることができるが、直接付着させることはできない。選択された標識が非反応性ヌクレオチド配列３２’の望ましい核酸塩基に共有結合することができる限り、前述の蛍光標識２８のいずれを使用してもよい。

図３Ｃの品質管理トレーサー２２Ｃは、別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’と組み合わせて（例えば、本明細書に開示される品質管理方法の例において）使用される。適切なプライマーヌクレオチド配列２０、２０’の例には、相補配列へのハイブリダイゼーションおよび配列の増幅のためのフォワード増幅プライマーまたはリバース増幅プライマーが含まれる。適切なプライマーヌクレオチド配列２０、２０’のいくつかの具体例には、前述のＰ５またはＰ７プライマーが含まれる。

図３Ｃの品質管理トレーサー２２Ｃが使用されるとき、それはプライマーヌクレオチド配列２０、２０’に関して所定の比率で存在することが理解されるべきである。本明細書に開示される品質管理方法の一例において、所定の比率を使用して、プライマーヌクレオチド配列２０、２０’の密度および／または分布を間接的に決定することができる。

図３Ｃに示す例を形成するために、品質管理トレーサー２２Ａの代わりに品質管理トレーサー２２Ｃを使用することを除いて、逐次グラフト化または共グラフト化を前述のように使用することができる。図３Ｃに示される例を形成するために使用されるグラフト例のいずれにおいても、インキュベーションは、品質管理トレーサー２２Ｃおよび使用されるプライマーヌクレオチド配列２０、２０’に部分的に依存する所定の温度で行われる。また、図３Ｃに示される例を形成するために使用されるグラフト例のいずれにおいても、溶液は品質管理トレーサー２２Ｃおよび／またはプライマーヌクレオチド配列２０、２０’、水、緩衝液、および触媒を含み得る。品質管理トレーサー２２Ｃおよび／またはプライマーヌクレオチド配列２０、２０’は、同じ溶液／混合物中に存在するかまたは別々の溶液／混合物中に存在するかにかかわらず、任意の所望の所定の比率で存在し得る。

図３Ｄは、別個のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’を含まずにゲル材料２４／ゲルパッド２４’に含まれる品質管理トレーサー２２Ｄの例を示す。この例では、品質管理トレーサー２２Ｄは、その３’末端が蛍光標識２８でタグ付けされた切断可能なヌクレオチド配列２７’である。蛍光標識２８は、前述のフルオロフォアのいずれでもよい。

切断可能ヌクレオチド配列２７’のこの例は、切断可能部分３１’’および残りの部分２９’’を含む。切断可能部分３１’’は、蛍光標識２８、任意のヌクレオチド配列、および３’末端付近の切除部位３０を含む。切断可能部分３１’はまた、蛍光標識２８をヌクレオチドの配列に結合させる官能基を含み得る。この官能基の例は、５’－ジメトキシトリチル－５－［Ｎ－（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）－３－アクリルイミド］－２’－デオキシウリジン、３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ、Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（すなわち、アミノ改質剤Ｃ６ｄＴ）である。他の例には、５’－ジメトキシトリチル－Ｎ－ジメチルホルムアミジン－５－［Ｎ－（トリフルオロアセチルアミノヘキシル）－３－アクリルイミド］－２’－デオキシシチジン、３’－［（２－シアノエチル）－（Ｎ、Ｎ－ジイソプロピル）］－ホスホルアミダイト（アミノ修飾剤Ｃ６ｄＣ）、（２－ジメトキシトリチルオキシメチル－６－フルオレニルメトキシカルボニルアミノ－ヘキサン－１－スクシノイル）－長鎖アルキルアミノ－ＣＰＧのような固体支持体の使用が含まれる。この官能基は、使用される蛍光標識２８に基づいて選択され得る。切断可能ヌクレオチド配列２７’の切断可能部分３１’’は、配列２７’が切除部位３０に位置するヌクレオチドを標的とする酵素に曝露されたときに除去され得る。

酵素的切断後にゲル材料２４に結合したままである切断可能なヌクレオチド配列２７’の部分２９’’は、プライマーヌクレオチド配列２０、２０’である。切断可能部分３１’’が除去された後に残るプライマーヌクレオチド配列２０、２０’は、行われるべきまたは行われている配列決定操作に関与するであろう。本明細書中に開示されるプライマーヌクレオチド配列２０、２０’の任意の例は、品質管理トレーサー２２Ｄにおいて使用され得る。図３Ｄの切断可能なヌクレオチド配列２７’は、その５’末端にゲル材料２４に結合することができる官能基を含み得る。この官能基の例には、アルキン、ノルボルニル（または他のシクロアルケニル）、銅フリークリック部分（例えば、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、他のシクロアルキンなど）、およびチオールが含まれる。この官能基は、使用されるゲル材料２４に基づいて選択され得る。例えば、アルキン、ノルボルニル、および銅フリークリック部分は、クリック反応を介してＰＡＺＡＭのアジドと反応し得、そしてチオールはＳＦＡと反応し得る。

３’末端に蛍光ラベルテキサスレッド（登録商標）がタグ付けされたＰ５プライマーの例は、
５’－アルキン－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡ［アミノＣ６ｄＴ－テキサスレッド］－３’（配列番号２４）
である。

本明細書に開示される品質管理方法の一例では、図３Ｄの品質管理トレーサー２２Ｄを使用して、トレーサー２２Ｄの一部であるプライマーヌクレオチド配列２０、２０’の密度および／または分布を直接決定することができる。

図３Ｄに示される例を形成するために、１つのタイプの品質管理トレーサー２２Ｄ（それぞれが同じプライマーヌクレオチド配列２０または２０’を含む）のグラフト化を使用することができ、あるいは、異なるタイプの品質管理トレーサー２２Ｄ（例えば、そのうちのいくつかはプライマーヌクレオチド配列２０を含み、他のものは異なるプライマーヌクレオチド配列２０’を含む）の共グラフト化を使用することができる。品質管理トレーサー２２Ａの代わりに品質管理トレーサー２２Ｄが使用されることを除いて、グラフト化または共グラフト化は前述のように実行されてもよい。

品質管理トレーサー２２Ｅのさらに他の例を図４に示す。これらの例では、品質管理トレーサー２２Ｅは、その３’末端に蛍光標識２８でタグ付けされた切断可能なヌクレオチド配列である。切断可能なヌクレオチド配列のこれらの例のそれぞれは、ヌクレオチド配列Ｘ、リンカー分子３４、および蛍光標識２８を含む。

ヌクレオチド配列Ｘは、非反応性ヌクレオチド配列（配列３２など）またはプライマーヌクレオチド配列（配列２０または２０’など）であり得る。ヌクレオチド配列Ｘが非反応性ヌクレオチド配列である場合、品質管理トレーサー２２Ｅは、別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’と組み合わせて使用され得る（図３Ａ～３Ｃに示される例と同様）。ヌクレオチド配列Ｘがプライマーヌクレオチド配列である場合、品質管理トレーサー２２Ｅは単独で（すなわち、別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’なしで）使用され得る（図３Ｄに示される例と同様）。

図４のヌクレオチド配列Ｘは、その５’末端にゲル材料２４に結合することができる官能基を含み得る。この官能基の例には、アルキン、ノルボルニル（または他のシクロアルケニル）、銅フリークリック部分（例えば、ジベンゾシクロオクチン（ＤＩＢＯ）、他のシクロアルキンなど）、およびチオールが含まれる。この官能基は、使用されるゲル材料２４に基づいて選択され得る。例えば、アルキン、ノルボルニル、および銅フリークリック部分は、クリック反応を介してＰＡＺＡＭのアジドと反応し得、そしてチオールはＳＦＡと反応し得る。

リンカー分子３４は、一端に、蛍光標識２８に（直接的または間接的に）結合することができる官能基を含み、もう一方の端には、ヌクレオチド配列Ｘに（直接または間接的に）（たとえば、配列Ｘの３’末端または特定の核酸塩基に）結合することができる官能基を含む。品質管理トレーサー２２Ｅのリンカー分子３４は、品質管理方法の一例が実行された後に品質管理トレーサー２２Ｅから少なくとも蛍光標識２８を除去する切断反応を受けることができる化学結合を提供する。行われる切断反応は、使用されるリンカー分子３４に依存する。例示的なリンカー分子３４は、ジオール、ジスルフィド、シラン、アゾベンゼン、光開裂性基、およびアジドを含む。

ジオールは、２つのヒドロキシル基を含む化合物である。線状または環状ジオールを使用することができる。適切なジオールの例は、ビシナルジオールであり、ここでヒドロキシル基は隣接する炭素原子に結合している。ビシナルジオールは、過ヨウ素酸塩（過ヨウ素酸ナトリウムなど）への曝露などの酸化的条件下または酵素的条件下で切断可能である。適切なジオールの例は、図１において３４Ａとして示される酒石酸由来ジオールである。この例では、ジオールの各末端のアミン基はそれぞれの部分に結合し、その一方はヌクレオチド配列Ｘの３’末端に結合し、他方は任意の適切な結合部位を介して蛍光標識２８に結合している（例えば、アルコール、アミン、カルボン酸）。ジオールは、品質管理トレーサー２２Ｅを過酸化ナトリウム（ＮａＩＯ_４）にさらすことによって切断することができ、過ヨウ素酸ナトリウムはジオールを２つのアルデヒドに酸化切断することができる。

ジスルフィドは一般構造Ｒ^１－Ｓ－Ｓ－Ｒ^２を有し、ここでＲ^１およびＲ^２はアルキルまたはアリール基のいずれでもよい。ジスルフィド結合は還元条件下で切断される。適切なジスルフィドの例は、図４において３４Ｂとして示される。この例では、ジスルフィドの一端のアミン基は、アルキル鎖のようなリンカーを介して３’末端のヌクレオチド配列Ｘに結合し、ジスルフィドの他端のアミン基はアミド結合

を形成し、
ここで、Ｒは-（ＣＨ_２）_４－Ｏ－蛍光標識２８であり、Ｒ’はＨであり、そしてＲ’’は-（ＣＨ_２）_２－Ｓ－Ｓ－（ＣＨ_２）_２-（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ-（ＣＨ_２）_３－Ｘである。蛍光標識２８は、任意の適切な結合部位（例えば、アルコール、アミン、カルボン酸）を介して結合される。一例では、品質管理トレーサー２２Ｅを還元条件にさらすことによってジスルフィドを切断することができ、例えば、チオール（Ｒ^３ＳＨ、ここでＲ^３は任意の適切なアルキル基であり得る）または第三級ホスフィン（Ｒ^４ _３Ｐ、ここでＲ^４は任意の適切なアルキル基）である。チオールとジスルフィドとの反応は、ジスルフィド結合を破壊し、そして元のジスルフィドから誘導された新しいジスルフィドおよびチオールを生成する。第三級ホスフィンとジスルフィドとの反応は、ジスルフィド結合を破壊し、そして２つの硫黄含有生成物を生成するであろう二分子求核置換（Ｓ_Ｎ２）反応である。

本明細書で使用され、図４の３４Ｃに示すように、シランは、２つの酸素原子に結合したケイ素原子と２つのＲ基（例えば、それぞれアルキル基またはアリール基であり得る）を含む。本実施例では、シランの酸素原子はそれぞれリンカー、例えば、３’末端でヌクレオチド配列Ｘに、そして任意の適切な結合部位（例えば、アルコール、アミン、カルボン酸）を介して蛍光標識２８に結合しているアルキル鎖などに結合している。品質管理トレーサー２２Ｅを酸（図４にＨ^＋として示す）にさらすことによって、またはフッ化物イオン（図４には示さず）で処理することによって、シランをＳｉ－Ｏ結合の１つで切断させることができる。

アゾベンゼンは、Ｎ＝Ｎ二重結合で結合した２つのフェニル環からなる化合物である。異なる官能基が、Ｎ＝Ｎ二重結合に対してパラ位でフェニル環から伸びてもよい。これらの官能基は同一でも異なっていてもよく、例としては、アミド基、アルキルアミン、またはヒドロキシル基が挙げられる。適切なアゾベンゼンの例は、図４において３４Ｄとして示される。この例において、官能基はアミド基およびエチルアミンを含む。アミド基は、３’末端のヌクレオチド配列Ｘに結合しているアルキル鎖などのリンカーに結合しており、エチルアミンのアミン基はアミド結合

を形成し、
ここで、Ｒは－（ＣＨ_２）_４－Ｏ－蛍光標識２８であり、Ｒ’はＨであり、Ｒ’’は－（ＣＨ_２）_２－アゾベンゼン－（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ－（ＣＨ_２）_３－Ｘである。蛍光標識２８は、任意の適切な付着部位（例えばアルコール、アミン、カルボン酸）を介して結合される。一例では、品質管理トレーサー２２Ｅをジチオン酸ナトリウム（Ｎａ_２Ｓ_２Ｏ_４）にさらすことによってアゾベンゼンを切断させることができる。ジチオン酸ナトリウムとアゾベンゼンとの反応は、アゾベンゼンを２つのアニリン基に還元する。

光開裂性基は、光切断部位を含む非ヌクレオチド部分であり、所定の波長の光を所定の時間照射することによって切断が起こる。光開裂性基は、ヌクレオチド配列Ｘの３’末端で利用可能な任意のホスホルアミダイト修飾を、蛍光標識２８に結合した官能基に結合するための中間体として使用することができる。適切な光開裂性基、オルト－ニトロベンジル基の例は、図４において３４Ｅとして示される。本実施例では、光開裂性基はどちらかの末端にアミン基を含む。実施例では、光開裂性基の一端のアミン基は、ヌクレオチド配列Ｘに結合しているアルキル鎖のようなリンカーに結合し、光開裂性基の他端のアミン基は、－（ＣＨ_２）_４－Ｏ－を介して蛍光標識２８に結合したアミド結合を形成する。蛍光標識２８は、任意の適切な付着部位（例えばアルコール、アミン、カルボン酸）を介して結合される。一例では、品質管理トレーサー２２Ｅを所定の波長の光に所定の時間暴露することによって、少なくとも蛍光標識２８が光開裂部位で品質管理トレーサー２２Ｅから切断される。

本明細書で述べたように、アジドは基Ｎ_３を含む任意の分子である。適切なアジドの例は、図４のＯ－アジドアルキル基３４Ｆとして示される。本実施例では、アジドの一方の末端にあるアミン基は、３’末端のヌクレオチド配列Ｘに結合しているアルキル鎖などのリンカーに結合し、アジドの反対側のアミン基はアミド結合

を形成し、
ここで（この例では）Ｒは－（ＣＨ_２）_４－Ｏ－蛍光標識２８であり、Ｒ’はＨであり、Ｒ’’は-（ＣＨ_２）_３－Ｏ－（ＣＮ_３）-（ＣＨ_２）－（Ｏ（ＣＨ_２）_２）_２－（ＣＨ_２）-（Ｃ＝Ｏ）－ＮＨ-（ＣＨ_２）_３－Ｘである。蛍光標識２８は、任意の適切な付着部位（例えばアルコール、アミン、カルボン酸）を介して結合される。一例では、アジドは、品質管理トレーサー２２Ｅを第三級ホスフィン（Ｒ^６ _３Ｐ、ここでＲ^６は適切に置換されたアルキルまたはアリール基である）にさらすことによって切断されてもよい。三級ホスフィンおよびアジドはシュタウディンガー還元反応を受ける。

本明細書に開示される各リンカー分子３４は、品質管理方法の一例が実行された後に品質管理トレーサー２２Ｅから少なくとも蛍光標識２８を除去する化学的切断反応を受けることができる。残りの部分は、（配列決定に関与しない）非反応性ヌクレオチド配列または（配列決定に関与するであろう）プライマーヌクレオチド配列であり得る。

品質管理トレーサー２２Ｅのヌクレオチド配列Ｘが非反応性である場合、品質管理トレーサー２２Ｅは、本明細書で前述したように、別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’と順次グラフトまたは共グラフトされてもよい。品質管理トレーサー２２Ｅのヌクレオチド配列Ｘがプライマーヌクレオチド配列２０、２０’である場合、１種類の品質管理トレーサー２２Ｅ（それぞれ同じプライマーヌクレオチド配列２０または２０’を含む）をグラフトしてもよく、あるいは、異なる種類の品質管理トレーサー２２Ｅ（例えば、そのうちのいくつかはプライマーヌクレオチド配列２０を含み、他のものは異なるプライマーヌクレオチド配列２０’を含む）を共グラフトしてもよい。品質管理トレーサー２２Ａの代わりに品質管理トレーサー２２Ｅの例が使用されることを除いて、グラフト化または共グラフト化は前述のように実行されてもよい。

図２Ｄに戻って参照すると、別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’を有する品質管理トレーサー２２の例が示される。プライマーヌクレオチド配列２０、２０’を含むトレーサー２２の例では（例えば、トレーサー２２Ｄおよびトレーサー２２Ｅのいくつかの例）、別個のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’はトレーサー２２と共に存在しないであろう。

本明細書に開示されるアレイ１０は、品質管理方法において使用され得る。品質管理方法の一例を図５に示す。方法５０は、概して、品質管理トレーサー２２を支持体１２上のウェル１６’内のゲル材料２４にグラフトすることを含み、品質管理トレーサーは、その３’末端が蛍光標識２８で標識された切断可能なヌクレオチド配列２７、２７’、および（参照番号５２で示すように）切断可能な核酸塩基に結合した蛍光標識２８を有する非反応性ヌクレオチド配列３２、３２’からなる群から選択され、（参照番号５４に示すように）蛍光を用いて品質管理トレーサー２２を検出し、（参照番号５６で示すように）少なくとも部分的に蛍光に基づいて、ゲル材料２４にグラフトされたプライマーヌクレオチド配列２０、２０’の密度、または分布、または密度および分布を決定する。

品質管理方法は、品質管理トレーサー２２を単独でまたは別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’と組み合わせてゲル材料２４にグラフトした後でかつフローセル製造の完了前（例えば、アレイ１０を上部基板フローセルに結合する前に）に実施することができる。品質管理方法は、追加的にまたは代替的に、完全に製造されたフローセルのエンドユーザーによって実行されてもよい。品質管理方法がフローセルのエンドユーザーによって実施されるとき、その方法は、任意のシークエンシングワークフロー試薬およびＤＮＡサンプルをフローセル上にロードする前に実施され得ることが理解されるべきである。各品質管理トレーサー２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄ、２２Ｅは検出可能な蛍光標識２８を含むので、蛍光標識された相補的ヌクレオチドのハイブリダイゼーションは、本明細書に開示される品質管理方法の一部として行われる必要はない。

方法５０では、品質管理トレーサー２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄ、２２Ｅの様々な例のグラフトは、前述のように達成することができる。

例示的な品質管理トレーサー２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄ、２２Ｅのそれぞれは、より短い波長の入射放射線に露光されると、より長い波長の光を放射する蛍光ラベル２８を含む。したがって、品質管理トレーサー２２を検出することは、アレイ１０（またはアレイ１０を含むフローセル）をレーザによって放出された放射にさらすことによって達成することができる。レーザ励起の後、各品質管理トレーサー２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄ、２２Ｅの蛍光標識２８から放出された蛍光（強度に関して）は、適切な蛍光検出器を介して捕捉される。

品質管理トレーサー２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、またはトレーサー２２Ｅのいくつかの例が、別々のプライマーヌクレオチド配列２０、２０’と共に所定の比率で利用される場合、これらの品質管理トレーサー２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｅからの蛍光強度および所定の比率は、プライマーヌクレオチド配列２０、２０’の密度および／または分布を評価または間接的に決定するために使用され得る。蛍光強度は、品質管理トレーサー２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｅ、および２２Ｃの密度および／または分布を示し、所定の比率により、品質管理トレーサー２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｅのデータをプライマーヌクレオチド配列２０、２０’と相関させることが可能になる。

品質管理トレーサー２２Ｄまたはトレーサー２２Ｅの他の例（プライマーヌクレオチド配列２０、２０’を含む）を利用する場合、蛍光結果のみを使用して、プライマーヌクレオチド配列２０、２０’の密度および／または分布を評価または直接決定することができる。品質管理トレーサー２２Ｄ、２２Ｅのこれらの例は、トレーサー２２Ｄ、２２Ｅの一部として配列２０、２０’を含み、したがって蛍光強度のみがプライマーヌクレオチド配列２０、２０’の密度および／または分布を示す。

品質管理方法の完了後（例えば、ワークフローのエンドユーザー部分で）、蛍光標識２８は、本明細書に記載の方法を使用して品質管理トレーサー２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、２２Ｄ、２２Ｅから切断されてもよい。

図３Ａを参照して上述したように、品質管理トレーサー２２Ａは切除部位３０を含む。したがって、この例のトレーサー２２Ａにおける蛍光標識２８の切断は酵素的切断を介して達成され得る。品質管理トレーサー２２Ａは、切除部位３０に位置するヌクレオチドを標的とする酵素にさらされる。酵素は、配列決定を開始する前に導入されてもよく、または配列決定ワークフローのクラスタ生成プロセスの一部として導入されてもよい。適切な酵素の例には、エキソヌクレアーゼ（配列の末端から連続ヌクレオチドを除去する）、エンドヌクレアーゼ（配列内のホスホジエステル結合を切断する）、塩基除去修復酵素（特定の塩基を除去してアプリン／アピリミジン（ＡＰ）部位を形成し、その後ＡＰエンドヌクレアーゼによって切断され得る）、制限酵素（一本鎖配列を切断する４～６ヌクレオチドの特定の配列について品質管理トレーサー２２Ａをスキャンする）などが含まれる。いくつかの具体例を以下の表１に示す。

表１において、^＊は蛍光標識２８を表し、Ｎはヌクレオチドを表し、そして切除部位は太字である。

表１の一例では、切除部位３０は、ＵＳＥＲ酵素によって標的とされるウラシル（ｄＵ）である。ＵＳＥＲ酵素は、ウラシルＤＮＡグリコシラーゼ（ＵＤＧ）とＤＮＡグリコシラーゼ－リアーゼエンドヌクレアーゼＶＩＩＩとの混合物である。ＵＤＧは、ウラシル塩基の切除を触媒し、ホスホジエステル骨格を無傷のまま残しながら、脱塩基（アピリミジン）部位を形成する。エンドヌクレアーゼＶＩＩＩのリアーゼ活性は、塩基を含まないデオキシリボースが放出されるように、脱塩基部位の３’側と５’側でホスホジエステル主鎖を切断する。そのため、切除部位３０でのトレーサー２２Ａの切断は、支持体１２から配列２７の部分３１および蛍光標識２８を除去する。表１の他の例では、切除部位３０は、ＦＰＧによって標的とされる酸化プリン（例えば、ｏｘｏＧ）である。ＦＰＧは酸化グアニンを認識し除去する。ＦＰＧは、Ｎ－グリコシラーゼおよびＡＰ－リアーゼの両方として作用する。

酵素的切断後にゲル材料２４に付着したままである品質管理トレーサー２２Ａの部分２９は、非反応性ヌクレオチド配列であり、したがって、行われるべきまたは行われている配列決定操作に関与しないかまたは干渉しない。

図３Ｂを参照して上述したように、品質管理トレーサー２２Ｂは、配列３２の切断可能な核酸塩基に結合した蛍光標識２８を含む。品質管理トレーサー２２Ｂは、ホスホジエステル切断による特定の塩基の切除を触媒するエキソヌクレアーゼにさらされる。エキソヌクレアーゼは、配列決定を開始する前に導入され得るか、または配列決定ワークフローのクラスタ生成プロセスの一部として導入され得る。一例として、エキソヌクレアーゼＩは、それに結合した蛍光標識２８を有するウラシル塩基の切除を触媒する。

核酸塩基切断後にゲル材料２４に付着したままである品質管理トレーサー２２Ｂの配列３２は、非反応性であり、したがって、行われるべきまたは行われている配列決定操作に関与しないかまたは干渉しない。

図３Ｃを参照して上述したように、品質管理トレーサー２２Ｃは、切断部位３０と同様に、配列３２’の切断可能な核酸塩基に結合した蛍光標識２８を含む。このように、この例のトレーサー２２Ｃにおける蛍光標識２８の切断は、酵素的切断の前述の例のいずれかを介して達成され得る。一例では、エキソヌクレアーゼを使用して、蛍光標識２８が結合している塩基の切除を触媒することができる。別の例では、切除部位３０に位置するヌクレオチドを標的とする酵素を使用して、配列３２’の部分３１’の切除を触媒することができる。これらの例では、酵素は、配列決定を開始する前に導入されてもよく、または配列決定ワークフローのクラスタ生成プロセスの一部として導入されてもよい。

核酸塩基または部分３１’切断後にゲル材料２４に付着したままである品質管理トレーサー２２Ｃの配列３２’の部分２９’は非反応性であり、したがって、実行されることになっている、または実行されているシーケンス操作に参加したり、それを妨害したりすることはない。

図３Ｄを参照して上述したように、品質管理トレーサー２２Ｄは切断部位３０を含む。このように、この例のトレーサー２２Ｄにおける蛍光標識２８の切断は、酵素的切断の前述の例のいずれかを介して達成され得る。本実施例では、部分３１’の切断後にゲル材料２４に結合したままである配列２７’の部分２９’’は、プライマーヌクレオチド配列２０、２０’であり、したがって、実行される予定の、または実行中の順序付け操作に参加する。

図４を参照して上述したように、品質管理トレーサー２２Ｅの様々な例はリンカー分子３４を含む。これらの例のトレーサー２２Ｅにおける蛍光標識２８の切断は、トレーサー２２Ｅをトレーサー２２Ｅ中に存在するリンカー分子３４を切断するのに適した化学物質にさらすことによる化学的切断によって達成することができる。リンカー分子３４Ａ、３４Ｂ、３４Ｃ、３４Ｄ、３４Ｅ、３４Ｆおよび関連する切断化学物質の様々な例を、図４を参照して説明する。これらの例では、切断化学物質は配列決定を開始する前に導入することができる。

化学的切断後にゲル材料２４に結合したままである品質管理トレーサー２２Ｅの部分は、ヌクレオチド配列Ｘおよび化学的切断が起こる場所に依存するであろう。残りの部分は、非反応性ヌクレオチド配列（これは配列決定に関与しないかまたは干渉しない）またはプライマーヌクレオチド配列（配列決定に関与するであろう）を含み得る。

図には示されていないが、方法の別の例は、品質管理トレーサーの例（例えば、２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、および２２Ｅのいくつかの例）を、所定の比率でプライマーヌクレオチド配列２０、２０’を有するグラフト混合物に組み込み、グラフト混合物を支持体２３上のウェル１６’内のゲル材料２４にさらし、グラフト混合物をインキュベートし、それによって品質管理トレーサー２２Ａ、２２Ｂ、２２Ｃ、ならびに２２Ｅのいくつかの例およびプライマーヌクレオチド配列２０、２０’をゲル材料２４に共グラフトし、蛍光を用いて品質管理トレーサーを検出し、少なくとも部分的に蛍光および所定の比率に基づいて、ゲル材料２４にグラフトされたプライマーヌクレオチド配列２０、２０’の密度、または分布、または密度および分布を決定することを含む。

蛍光標識２８が切断された後に、しばしば合成による配列決定（ＳＢＳ）、連結による配列決定、パイロシーケンシングなどと呼ばれる技術を含む、様々な配列決定アプローチまたは技術を実施することができる。これらの技術のいずれにおいても、ゲル材料２４および付着したプライマーヌクレオチド配列２０、２０’は、間質領域１８上ではなく部位１６内に存在するので、増幅は様々な部位１６に限定されるであろう。

簡単に説明すると、合成による配列決定（ＳＢＳ）反応は、イルミナ（San Diego, CA）製のＨｉＳｅｑ（登録商標）、ＨｉＳｅｑＸ（登録商標）、ＭｉＳｅｑ（登録商標）またはＮｅｘＳｅｑ（登録商標）シーケンサーシステムのようなシステムで行われ得る。配列決定されるべき一組の標的ＤＮＡ分子は、結合したプライマーヌクレオチド配列２０、２０’（そしていかなる非反応性ヌクレオチド配列にもない）にハイブリダイズされ、次いでブリッジ増幅または動的排除増幅によって増幅される。変性により、一本鎖鋳型がゲル材料２４に固定されたままになり、数百万の二本鎖ＤＮＡの密集クラスタが生成される（すなわちクラスタ生成）。次いで配列決定反応を実施する。データを整列させ、そして参照と比較し、そして配列決定の差異を同定する。

本開示をさらに説明するために、一例を本明細書に示す。この実施例は説明目的のために提供され、そして本開示の範囲を限定すると解釈されるべきではないことが理解されるべきである。

実施例
以下の品質管理トレーサー
５’－ヘキシン－ポリＴテール－ＣＡＴＣＴＡＧＧＣＡＴＣＴＡＡＧＣＡＴＣＡＡＵＣＴＴＡＣＡ［アミノＣ６ ｄＴ－テキサスレッド］－３’
（配列番号２５）を使用した。

基材表面へのＰ５／Ｐ７プライマーグラフト化の品質管理のためのＱＣトレーサーの例を評価するために、１０％のスパイクのＱＣトレーサーを用い、ＱＣトレーサースパイクなしで（対照）、Ｐ５／Ｐ７プライマーグラフト混合物を調製した。１０％のスパイクのＱＣトレーサーを含むＰ５／Ｐ７プライマー混合物をグラフトした基質表面を、トレーサー蛍光を測定することによって評価した。対照表面（ＱＣトレーサースパイクなし）をハイブリダイゼーションベースのＴＥＴ ＱＣによって評価した。ＴＥＴは、Ｐ５／Ｐ７プライマーに対して相補的な配列を有する色素標識オリゴヌクレオチドである。ＴＥＴを表面上のＰ５／Ｐ７プライマーとハイブリダイズさせ、過剰のＴＥＴを洗い流し、そして付着した色素濃度を蛍光検出により測定する。

図６Ａおよび６Ｂはそれぞれ、相補的染料含有オリゴヌクレオチド（ＴＥＴ ＱＣ）とハイブリダイズしたグラフト化対照基板表面の蛍光画像およびＱＣトレーサーを含むグラフト化基板表面の蛍光画像を示す。図６Ｃは、図６Ａおよび６Ｂのグラフト表面についてのＱＣトレーサー蛍光対ＴＥＴ蛍光のプロットを示す。図６Ａ～６Ｃのデータは、ＱＣトレーサーからの蛍光強度が基板表面上のＰ５／Ｐ７密度と相関することを示す。

標準的なクラスタ生成プロセス中のフローセルの表面からのグラフト化ＱＣトレーサーの切断を評価するために、異なるＱＣトレーサーをグラフト化したフローセルを使用した。図７Ａは、初期蛍光画像を示し、これは、クラスタ生成前のＱＣトレーサーをグラフトしたフローセルを示す。図７Ｂは、クラスタ形成後のＱＣトレーサーをグラフトしたフローセルを示すクラスタ形成後の蛍光画像を示す。ＱＣトレーサー（２００ｎＭ）は、
５’－ヘキシン－ポリＴテール－ＣＡＴＣＴＡＧＧＣＡＴＣＴＡＡＧＣＡＴＣＡＡＵＣＴＴＡＣＡ［アミノＣ６ｄＴ－テキサスレッド］－３’（配列番号２５）（２００ｎＭトレーサー）
５’－ヘキシン－ポリＴテール－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡ［アミノＣ６ｄＴ－テキサスレッド］－３’（配列番号２６）（２００ｎＭＰ５）
および
１：１の補正最終Ｐ５／Ｐ７比を有する５’－ヘキシン－ポリＴテール－ＡＡＴＧＡＴＡＣＧＧＣＧＡＣＣＡＣＣＧＡＧＡＵＣＴＡＣＡ［アミノＣ６ｄＴ－テキサスレッド］－３’（配列番号２６）（２００ｎＭＰｇ（１：１））
であった。

図７Ａの初期蛍光画像を参照すると、フローセル内の暗い領域はＱＣトレーサーからのシグナルであり、より明るい領域はコントロールレーンである（すなわち、ＱＣトレーサーは存在しなかった）。図７Ｂのポストクラスタ化蛍光画像を参照すると、ＱＣトレーサーからのシグナルは実質的に減少しており、クラスタ形成中のＱＣトレーサーの切断を示している。

図８Ａおよび図８Ｂは、図７Ａおよび図７Ｂのグラフトされたフローセルについて、それぞれ、ＱＣトレーサー蛍光ポストグラフトのプロットおよびＱＣトレーサー蛍光ポストクラスタリングのプロットを示す。データは、クラスタ形成後の残留蛍光が最小であることを示している。切断効率は約９７％～約９９％の範囲である。

下流の配列決定指標に対するＱＣトレーサー移植およびその後の切断の効果を評価するために、図７Ａおよび７Ｂのフローセルを配列決定に使用した。

図９Ａおよび９Ｂは、１つのシークエンシングサイクル（Ｃ１）後の赤色チャネルについて、それぞれリード１（Ｒ１）蛍光強度のプロットおよびリード２（Ｒ２）蛍光強度のプロットを示す。データは、赤チャンネルのＣ１強度がＱＣトレーサーの使用による影響を最小限に抑えていることを示す。

図１０Ａおよび１０Ｂは、１つのシークエンシングサイクル（Ｃ１）後の緑色チャネルについて、それぞれ読み取り１（Ｒ１）蛍光強度のプロットおよび読み取り２（Ｒ２）蛍光強度のプロットを示す。データは、緑色チャンネルのＣ１強度がＱＣトレーサーの使用による影響を最小限に抑えていることを示す。

図１１Ａおよび１１Ｂは、参照ゲノムに対する、リード１（Ｒ１）配列アラインメントのプロットおよびリード２（Ｒ２）配列アラインメントのプロットをそれぞれ示す。データは、ＱＣトレーサーの使用による配列アラインメントの測定基準への影響がほとんどまたはまったくないことを示す。

図１２Ａおよび１２Ｂは、それぞれリード１（Ｒ１）の配列決定エラー率のプロットおよびリード２（Ｒ２）の配列決定エラーレートのプロットを示す。データは、シーケンシングエラー率メトリクスにＱＣトレーサーを使用してもほとんどまたはまったく影響がないことを示す。
補足

（そのような概念が互いに矛盾しない限り）前述の概念のすべての組み合わせが、本明細書に開示されている発明の主題の一部であると考えられることを理解されたい。特に、本開示の終わりに現れる特許請求された主題の全ての組み合わせは、本明細書に開示された発明の主題の一部であると考えられる。また、参照により本明細書に組み込まれる任意の開示にも現れる可能性がある本明細書で明示的に使用される用語は、本明細書で開示される特定の概念と最も矛盾しない意味に一致するはずである。

本明細書で引用した全ての刊行物、特許、および特許出願は、その全体が参照により本明細書に組み入れられる。

本明細書を通して、「一の例」、「他の例」、「一例」などへの言及は、それを意味する。例に関連して説明された特定の要素（例えば、特徴、構造、および／または特性）は、本明細書に説明された少なくとも１つの例に含まれ、他の例には存在してもしなくてもよい。さらに、文脈が明らかにそうでないことを指示しない限り、任意の例について記載された要素は、さまざまな例において任意の適切な方法で組み合わされ得ることを理解されたい。

本明細書に提供される範囲は、記載された範囲、および記載された範囲内の任意の値または部分的な範囲を含むことが理解されるべきである。例えば、約１０ｋＤａ～約１５００ｋＤａの範囲は、約１０ｋＤａ～約１５００ｋＤａの明示的に列挙された限界だけでなく、約１８ｋＤａ、約３２５ｋＤａ、約４２５ｋＤａ、約１０７５ｋＤａなどの個々の値、および約４２５ｋＤａ～約９９０ｋＤａ、約２３５ｋＤａ～約７８０ｋＤａまでなどのサブレンジなども含むと解釈されるべきである。さらに、「約」および／または「実質的に」が値を記載するために利用されるとき、それらは記載された値からのわずかな変動（最大±１０％まで）を包含することを意味する。

いくつかの例が詳細に説明されているが、開示された例が修正されてもよいことが理解されるべきである。したがって、前述の説明は非限定的であると見なされるべきである。

Claims (41)

1. 複数の個別のウェルを含む支持体と、
   前記複数の個別のウェルのそれぞれに配置されたゲル材料と、
   前記複数の個別のウェルのそれぞれにおける前記ゲル材料にグラフトされた品質管理トレーサーとを備えるアレイであって、
   前記品質管理トレーサーは、（ａ）切断部位を含む切断可能なヌクレオチド配列、および（ｂ）検出可能な標識を含み、
   前記検出可能な標識が、前記切断部位で、または、該切断部位に対して遠位の切断可能領域内の位置で、切断可能なヌクレオチド配列に結合しており、
   前記品質管理トレーサーは、前記ゲル材料にグラフトされた第１の末端と、検出可能な標識に結合され、かつ、切断部位を有する切断可能領域に結合される第２の末端と、を有するグラフト化領域を有し、
   前記グラフト化領域は、プライマーヌクレオチド配列を含み、
   さらに、前記検出可能な標識は、蛍光標識であり、前記品質管理トレーサーは、前記切断可能なヌクレオチド配列に結合された前記蛍光標識を有する非反応性ヌクレオチド配列を含む、アレイ。
2. 前記切断可能なヌクレオチド配列は、非反応性ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のアレイ。
3. 前記グラフト化領域は、非反応性ヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載のアレイ。
4. 前記切断部位が酵素的に切断可能な核酸塩基を含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のアレイ。
5. 前記酵素的に切断可能な核酸塩基は、切除部位を含む、請求項４に記載のアレイ。
6. 前記酵素的に切断可能な核酸塩基が、グリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼとの、またはエキソヌクレアーゼとの反応によって切断可能である、請求項４に記載のアレイ。
7. 前記切断可能なヌクレオチド配列が、その５’末端でゲル材料にグラフトされている、請求項６記載のアレイ。
8. 前記検出可能な標識が、前記切断可能なヌクレオチド配列の３’末端またはその近くに結合している、請求項７に記載のアレイ。
9. 前記検出可能な標識が、前記品質管理トレーサーと前記エキソヌクレアーゼとの反応によって切断可能である、請求項８に記載のアレイ。
10. 前記検出可能な標識が、前記品質管理トレーサーと前記グリコシラーゼおよび前記エンドヌクレアーゼとの反応によって切断可能である、請求項８に記載のアレイ。
11. 前記切断部位が化学的に切断可能なリンカーを含む、請求項１～３のいずれか一項に記載のアレイ。
12. 前記化学的に切断可能なリンカーが、ビシナルジオール、ジスルフィド、シラン、アゾベンゼン、光開裂性基、またはアジドを含む、請求項１１に記載のアレイ。
13. 前記複数の個別のウェルのそれぞれにおいて前記ゲル材料にグラフトされたプライマーヌクレオチド配列を含む非標識プライマーをさらに含み、前記品質管理トレーサーおよび前記非標識プライマーが所定の比率で存在する、請求項１～１２のいずれか一項に記載のアレイ。
14. 前記ゲル材料が式（Ｉ）：
    

    

    のポリマーを含む、請求項１～１３のいずれか一項に記載のアレイ。
    ここで、
    Ｒ^１は、Ｈまたは任意に置換されたアルキルであり、
    Ｒ^Ａは、アジド、任意に置換されたアミノ、任意に置換されたアルケニル、任意に置換されたヒドラゾン、任意に置換されたヒドラジン、カルボキシル、ヒドロキシ、任意に置換されたテトラゾール、任意に置換されたテトラジン、ニトリルオキシド、ニトロン、およびチオールからなる群から選択され、
    Ｒ^５は、Ｈおよび任意に置換されたアルキルからなる群から選択され、
    －（ＣＨ_２）_ｐ－のそれぞれは、任意に置換されていてもよく、
    ｐは、１～５０の範囲の整数であり、
    ｎは、１～５０，０００の範囲の整数であり、
    ｍは、１～１００，０００の範囲の整数である。
15. 前記ゲル材料がＰＡＺＡＭを含む、請求項１４に記載のアレイ。
16. 前記蛍光標識は、塩化スルホニル染料、シアニン染料、赤色波長染料、蛍光染料、フルオレセインの誘導体、キサンテンフルオロフォア、およびインドカルボシアニン染料からなる群から選択される、請求項１に記載のアレイ。
17. 支持体にグラフトされたプライマーヌクレオチド配列の密度、分布、または密度および分布を決定する方法であって、
    複数の個別のウェルと、複数の個別のウェルのそれぞれに配置されたゲル材料と、品質管理トレーサーと、前記複数の個別のウェルのそれぞれにおける前記ゲル材料にグラフトされたプライマーヌクレオチド配列とを含む支持体を提供し、前記品質管理トレーサーは、（ａ）切断部位を含む切断可能なヌクレオチド配列、および（ｂ）検出可能な標識を含み、前記検出可能な標識が、前記切断部位または該切断部位に対して遠位にある切断可能領域内の位置で切断可能ヌクレオチド配列に結合されており、
    前記検出可能な標識からのシグナルを検出し、
    前記検出可能な標識からのシグナルに少なくとも部分的に基づいて前記品質管理トレーサーの密度および／または分布を決定し、
    前記品質管理トレーサーの決定された密度および／または分布に少なくとも部分的に基づいてグラフトされたプライマーヌクレオチド配列の密度および／または分布を決定し、
    前記品質管理トレーサーを前記ゲル材料にグラフトすることをさらに含み、
    前記品質管理トレーサーは、前記ゲル材料にグラフトされた第１の末端と、検出可能な標識に結合され、かつ、切断部位を有する切断可能領域に結合される第２の末端と、を有し、
    前記プライマーヌクレオチド配列が、前記品質管理トレーサーのグラフトの前またはそれと同時に、かつ前記検出工程の前に、前記ゲル材料にグラフトされ、
    前記品質管理トレーサーおよび前記プライマーヌクレオチド配列は所定の比率でゲル材料にグラフトされ、そしてプライマーヌクレオチド配列の密度および／または分布の決定は検出されたシグナルおよび前記所定の比率に基づく、方法。
18. 前記品質管理トレーサーが非反応性ヌクレオチド配列を含む、請求項１７に記載の方法。
19. 前記品質管理トレーサーがプライマーヌクレオチド配列を含み、前記品質管理トレーサーのグラフトがプライマーヌクレオチド配列をゲル材料にグラフトするのにも役立つ、請求項１７または１８のいずれか一項に記載の方法。
20. 前記切断可能なヌクレオチド配列が、第１の末端および第２の末端を有するグラフト化領域を含み、
    前記第１の末端はゲル材料にグラフトされており、前記第２の末端は切断部位を含む切断可能領域に連結されており、
    前記グラフト化領域の前記第２の末端は、前記切断可能領域の前記切断部位に結合している、請求項１７～１９のいずれか一項に記載の方法。
21. 前記グラフト化領域が非反応性ヌクレオチド配列を含む、請求項２０に記載の方法。
22. 前記切断部位での切断反応によって品質管理トレーサーから検出可能な標識を除去することをさらに含む、請求項１７～２１のいずれか一項に記載の方法。
23. 前記除去が酵素的切断または化学的切断によって達成される、請求項２２に記載の方法。
24. 前記検出可能な標識が蛍光標識であり、前記検出されたシグナルが蛍光である、請求項１７～２３のいずれか一項に記載の方法。
25. 支持体上のウェル中のゲル材料に品質管理トレーサーをグラフトし、
    前記品質管理トレーサーは、前記ゲル材料にグラフトされた第１の末端と、検出可能な標識に結合され、かつ、切断部位を有する切断可能領域に結合される第２の末端と、を有し、前記検出可能な標識が、前記切断部位または該切断部位に対して遠位にある切断可能領域内の位置で切断可能ヌクレオチド配列に結合され、
    前記品質管理トレーサーは、
    その３’末端に蛍光標識でタグ付けされた切断可能なヌクレオチド配列であり、
    蛍光を用いて品質管理トレーサーを検出し、
    少なくとも部分的に蛍光に基づいて、前記ゲル材料にグラフトされたプライマーヌクレオチド配列の密度、または分布、または密度および分布を決定することを含み、
    品質管理トレーサーが切断可能なヌクレオチド配列であり、該切断可能なヌクレオチド配列がプライマーヌクレオチド配列であり、
    前記プライマーヌクレオチド配列の密度、または分布、または密度および分布が決定された後に、該プライマーヌクレオチド配列から前記蛍光標識を切断することをさらに含み、
    検出する前に、前記プライマーヌクレオチド配列を前記ゲル材料にグラフトすることをさらに含み、前記切断可能なヌクレオチド配列および前記プライマーヌクレオチド配列は所定の比率で存在し、
    前記プライマーヌクレオチド配列の密度、または分布、または密度および分布の決定は、前記蛍光および所定の比率に基づく、方法。
26. 前記切断が酵素的切断または化学的切断によって達成される、請求項２５に記載の方法。
27. 前記切断可能なヌクレオチド配列から前記蛍光標識を切断することが、エキソヌクレアーゼを用いて達成される、請求項２５に記載の方法。
28. 品質管理トレーサーおよびプライマーヌクレオチド配列をアレイに共グラフトする方法であって、
    前記品質管理トレーサーと前記プライマーヌクレオチド配列を所定の比率で組み合わせてグラフト混合物を形成し、
    前記品質管理トレーサーは、（ａ）切断部位を含む切断可能なヌクレオチド配列、および（ｂ）検出可能な標識を含み、前記検出可能な標識が、前記切断部位または該切断部位に対して遠位にある切断可能領域内の位置で切断可能ヌクレオチド配列に結合され、
    前記グラフト混合物を支持体上のウェル内のゲル材料にさらし、
    前記グラフト混合物および前記ゲル材料をインキュベートし、これにより、前記品質管理トレーサーおよび前記プライマーヌクレオチド配列を前記ゲル材料に共グラフトすることを含む、方法。
29. 前記品質管理トレーサーは、その３’末端に蛍光標識でタグ付けされた切断可能なヌクレオチド配列、または切断可能な核酸塩基に結合した蛍光標識を有する非反応性ヌクレオチド配列である、請求項２８に記載の方法。
30. 前記検出可能な標識からのシグナルを検出することによりグラフトされた品質管理トレーサーを検出し、
    検出された前記シグナルおよび所定の比率に少なくとも部分的に基づいて、前記ゲル材料にグラフトされたプライマーヌクレオチド配列の密度、または分布、または密度および分布を決定することをさらに含む、請求項２８または２９に記載の方法。
31. 前記切断部位での酵素的切断または化学的切断によって前記切断可能なヌクレオチド配列から前記検出可能な標識を除去することをさらに含む、請求項２８から３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 前記切断可能なヌクレオチド配列が、前記検出可能な標識を結合するリンカー分子を含む、請求項２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
33. 前記リンカー分子が、ジオール、ジスルフィド、シラン、アゾベンゼン、光開裂性基、またはアジドを含む、請求項３２に記載の方法。
34. 前記切断部位が切断可能な核酸塩基を含む、請求項２８から３１のいずれか一項に記載の方法。
35. 前記切断可能な核酸塩基とグリコシラーゼおよびエンドヌクレアーゼまたはエキソヌクレアーゼとの反応によって検出可能な標識を除去することをさらに含む、請求項３４に記載の方法。
36. 前記検出可能な標識が蛍光標識である、請求項２８または３０～３５のいずれか一項に記載の方法。
37. 品質管理トレーサーをアレイにグラフトする方法であって、
    品質管理トレーサーを支持体上のウェル中のゲル材料にグラフトし、
    前記品質管理トレーサーは、（ａ）切断部位を含む切断可能なヌクレオチド配列、および（ｂ）検出可能な標識を含み、
    前記検出可能な標識が、前記切断部位または該切断部位に対して遠位にある切断可能領域内の位置で切断可能ヌクレオチド配列に結合され、
    前記切断可能なヌクレオチド配列は、第１の末端および第２の末端を有するグラフト化領域を含み、第１の末端はゲル材料にグラフトされており、第２の末端は前記検出可能な標識に結合しており、前記切断部位を含む切断可能領域に結合していることを含み、
    前記グラフト化領域がプライマーヌクレオチド配列を含む、方法。
38. 前記切断部位で前記品質管理トレーサーを切断し、これにより前記検出可能な標識を除去し、前記ゲル材料にグラフトされた未標識プライマーヌクレオチド配列を提供することをさらに含む、請求項３７に記載の方法。
39. 前記グラフト化領域が非反応性ヌクレオチド配列を含む、請求項３７に記載の方法。
40. プライマーヌクレオチド配列を含むプライマーを、前記品質管理トレーサーを用いて所定の割合で前記ゲル材料にグラフトすることをさらに含む、請求項３９に記載の方法。
41. 前記切断部位での切断反応によって前記品質管理トレーサーから検出可能な標識を除去することをさらに含む、請求項４０に記載の方法。
    

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