JP7127033B2 - デジタル顕微鏡を使用する抗菌剤感受性試験 - Google Patents

Description

（関連出願の相互参照）
本願は、米国仮出願第６２／５７４，７９５号（２０１７年１０月２０日出願）および米国仮出願第６２／４４９，３７３号（２０１７年１月２３日出願）の利益を主張する。

患者診断および治療に関連する種々のタイプの試験が、患者の微生物または「病原菌」の分析によって実施されることができる。病原菌は、単細胞または多細胞であり得る細菌、菌類、またはウイルス等の微視的生命有機体である。患者の微生物を含む生物学的サンプルが、患者の感染部、体液、または膿瘍から採取され得、患者の処置を補助するために、試験パネルまたはアレイ内に設置され、種々の試薬と組み合わせられ、培養され、分析され得る。自動化生化学分析装置が、手動動作を使用する分析と比較したとき、患者サンプルの分析を促進し、アッセイ結果の正確度および信頼性を改良するための医療施設および他の機関の必要性を満たすために、かつ、種々の抗菌剤の有効性を決定することにおいて補助するために開発された。抗菌剤は、細菌に対して使用される抗生物質および菌類に対して使用される抗真菌剤等の微生物を死滅させる、またはそれらの成長を阻害する作用剤である。しかしながら、絶えず変化する細菌属および新しく発見される抗菌剤によって、生物学的試験に対する要求は、複雑性および量の両方において増加している。

ある重要な自動化微生物学的分析装置系は、感染している微生物の同定および微生物の成長を制御することにおいて効果的な抗菌剤の同定の両方を決定するための診断ツールとして機能する。病原菌成長は、細胞サイズではなく、細胞数の増加である。例えば、細菌における病原菌成長は、二分裂を通して提供され、細胞は、１つの細胞から２つの娘細胞に分裂する。二分裂が、温度または栄養素の欠如等のある環境要因を通して阻害されるとき、いかなる成長も、結果として生じない。

自動化微生物学的分析装置は、感染している微生物の同定および微生物の成長を制御することにおいて効果的な抗菌剤の同定の両方を決定するための診断ツールとして機能する。診断試験を実施することにおいて、生物学的サンプルから単離された微生物の同定および生体外抗菌剤感受性パターンが、確認される。そのような分析装置の従来のバージョンは、段階希釈において異なる酵素基質または抗菌剤を含むパネルもしくはアレイ内の複数の小サンプル試験ウェルの中に試験されるべき小サンプルを設置し得る。微生物の同定（ＩＤ）試験および微生物に対して効果的な抗菌剤の最小抑制濃度（ＭＩＣ）を決定するための抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）は、アレイにおいて作成されたサンプル試験ウェル内の色変化、蛍光変化、混濁の程度（濁度）、または試験から導出される他の情報を利用し得る。ＡＳＴおよびＩＤ測定の両方ならびに後続分析は、再現性、処理時間の低減、転写エラーの回避、および実験室で実行される全ての試験に対する標準化における利点を提供するために、コンピュータ制御された微生物学的分析装置によって実施され得る。

微生物のＩＤ試験では、接種材料として公知の患者の微生物サンプルの標準化された希釈物が、所定の既知の濃度を有する細菌または細胞懸濁液を提供するために、最初に調製される。この接種材料は、所定の試験培地を含むか、またはその後にそれを供給され得る複数の試験ウェル内に設置される。存在する微生物の種に応じて、この培地は、培養後の色、濁度、蛍光、または他の特性の変化を促進するであろう。これらの変化は、ＩＤ試験において微生物を同定するために使用される。

ＡＳＴ試験では、複数の試験ウェルが、接種材料および増加する濃度のいくつかの異なる抗菌剤、例えば、抗生物質を充填される。異なる抗菌剤は、成長培地または液体培地中で臨床的に着目されるそれらを含む濃度まで希釈され得る。培養後、濁度は、成長がそれらの試験ウェル内の抗菌剤によって阻害されていない試験ウェル内で増加させられるか、または変化させられないであろう。各抗菌剤のＭＩＣは、各濃度の抗菌剤に対する成長の欠如によって測定される。成長の欠如を示す抗菌剤の最低濃度が、ＭＩＣということになる。

本願明細書は、例えば、以下の項目も提供する。
（項目１）
方法であって、前記方法は、
（ａ）混合物の未加工画像を捕捉することであって、前記混合物は、複数の病原菌と、抗菌剤とを含む、ことと、
（ｂ）前記未加工画像を向上画像に向上させることと、
（ｃ）前記向上画像に関連付けられた病原菌総数を決定することと
を含み、
前記病原菌総数は、前記向上画像内に描写された前記複数の病原菌における病原菌の数に基づく、方法。
（項目２）
（ａ）前記未加工画像を向上させることに先立って、前記未加工画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌のサイズを決定することと、
（ｂ）少なくとも部分的に前記サイズに基づいて、前記未加工画像を前記向上画像に向上させることと
をさらに含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
（ａ）前記向上画像のための閾値を決定することと、
（ｂ）少なくとも部分的に前記閾値に基づいて、前記向上画像をセグメント化することと
をさらに含む、項目２に記載の方法。
（項目４）
（ａ）前記サイズからピクセル半径を導出することと、
（ｂ）少なくとも部分的に前記ピクセル半径に基づいて、前記未加工画像の勾配画像を生成することと、
（ｃ）少なくとも部分的に前記勾配画像に基づいて、前記未加工画像を前記向上画像に向上させることと
をさらに含む、項目３に記載の方法。
（項目５）
方法であって、前記方法は、
（ａ）混合物の未加工画像を捕捉することであって、前記混合物は、複数の病原菌と、抗菌剤とを含む、ことと、
（ｂ）前記未加工画像を向上画像に向上させることと、
（ｃ）前記向上画像をセグメント化画像にセグメント化することと、
（ｄ）前記セグメント化画像内に描写された病原菌の量をカウントすることと
を含む、方法。
（項目６）
前記向上画像の前記セグメント化に先立って、前記向上画像に雑音低減フィルタを適用することをさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目７）
（ａ）前記向上画像のための閾値を決定することと、
（ｂ）少なくとも部分的に前記閾値に基づいて、前記向上画像をセグメント化することと
をさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目８）
（ａ）前記未加工画像を向上させることに先立って、前記未加工画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌のサイズを決定することと、
（ｂ）少なくとも部分的に前記サイズに基づいて、前記未加工画像を前記向上画像に向上させることと
をさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目９）
（ａ）前記サイズからピクセル半径を導出することと、
（ｂ）少なくとも部分的に前記ピクセル半径に基づいて、前記未加工画像の勾配画像を生成することと、
（ｃ）少なくとも部分的に前記勾配画像に基づいて、前記未加工画像を前記向上画像に向上させることと
をさらに含む、項目８に記載の方法。
（項目１０）
（ａ）試験濃度において前記抗菌剤を前記複数の病原菌に添加することと、
（ｂ）少なくとも部分的に前記カウントされた病原菌の量に基づいて、前記試験濃度が前記複数の病原菌に対する前記抗菌剤の最小抑制濃度であるかどうかを決定することと
をさらに含む、項目５に記載の方法。
（項目１１）
方法であって、前記方法は、
（ａ）混合物を試験アレイにおける各試験ウェルの中に堆積させることであって、各試験ウェル内の前記混合物は、複数の病原菌と、異なる濃度の抗菌剤とを含む、ことと、
（ｂ）各試験ウェル内の前記混合物の画像を捕捉することと、
（ｃ）各画像内に描写された前記複数の病原菌の特性を収集することと、
（ｄ）前記複数の病原菌に対する前記抗菌剤の最小抑制濃度を決定することと
を含み、
前記最小抑制濃度は、少なくとも部分的に前記特性に基づき、前記最小抑制濃度は、少なくとも部分的に各試験ウェルに関連付けられる前記抗菌剤の前記濃度に基づく、方法。
（項目１２）
各画像内に描写された前記複数の病原菌の前記特性を収集することに先立って、前記画像を向上させることをさらに含む、項目１１に記載の方法。
（項目１３）
（ａ）前記画像を向上させることに先立って、前記画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌のサイズを決定することと、
（ｂ）少なくとも部分的に前記病原菌の前記サイズに基づいて、前記画像を向上させることと
をさらに含む、項目１２に記載の方法。
（項目１４）
（ａ）前記病原菌の前記サイズからピクセル半径を導出することと、
（ｂ）少なくとも部分的に前記ピクセル半径に基づいて、前記画像の勾配画像を生成することと、
（ｃ）少なくとも部分的に前記勾配画像に基づいて、前記画像を向上画像に向上させることと
をさらに含む、項目１３に記載の方法。
（項目１５）
各画像内に描写された前記複数の病原菌の前記特性を収集することに先立って、前記向上画像をセグメント化することをさらに含む、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記向上画像の前記セグメント化に先立って、前記向上画像に雑音低減フィルタを適用することをさらに含む、項目１５に記載の方法。
（項目１７）
（ａ）前記向上画像のための閾値を決定することと、
（ｂ）少なくとも部分的に前記閾値に基づいて、前記向上画像をセグメント化することと
をさらに含む、項目１６に記載の方法。
（項目１８）
前記特性は、各画像内に描写された前記複数の病原菌における病原菌の量である、項目１１に記載の方法。
（項目１９）
前記特性は、各画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌のサイズである、項目１１に記載の方法。
（項目２０）
前記特性は、比率であり、前記比率は、少なくとも部分的に各画像内に描写された病原菌の量に基づき、前記比率は、少なくとも部分的に各画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌の前記サイズに基づく、項目１１に記載の方法。
（項目２１）
前記特性は、比率であり、前記比率は、少なくとも部分的に各画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌に関連付けられたピクセルの量に基づく、項目１１に記載の方法。
（項目２２）
方法であって、前記方法は、
混合物を試験アレイにおける各試験ウェルの中に堆積させることであって、各試験ウェル内の前記混合物は、複数の病原菌と、異なる濃度の抗菌剤とを含む、ことと、
（ｂ）各試験ウェル内の前記混合物の未加工画像を捕捉することと、
（ｃ）前記未加工画像を最終画像に操作することと、
（ｄ）各最終画像内の病原菌の量をカウントすることと、
（ｅ）各最終画像内でカウントされた前記病原菌の量をデータセット内に記憶することであって、各最終画像内でカウントされた前記病原菌の量は、前記データセット内の前記試験ウェル内の前記抗菌剤の前記濃度に関連付けられている、ことと、
（ｆ）ある期間にわたって待つことと、
（ｇ）前記期間後、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）を繰り返すことと、
（ｈ）前記データセットに基づいて、前記複数の病原菌に対する前記抗菌剤の最小抑制濃度を決定することと
を含む、方法。
（項目２３）
前記未加工画像を向上画像に向上させることをさらに含み、前記最終画像は、少なくとも部分的に前記向上画像に基づく、項目２２に記載の方法。
（項目２４）
（ａ）前記未加工画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌のサイズを決定することと、
（ｂ）少なくとも部分的に前記病原菌の前記サイズに基づいて、前記未加工画像を前記向上画像に向上させることと
をさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目２５）
（ａ）前記病原菌の前記サイズからピクセル半径を導出することと、
（ｂ）少なくとも部分的に前記ピクセル半径に基づいて、前記未加工画像の勾配画像を生成することと、
（ｃ）少なくとも部分的に前記勾配画像に基づいて、前記未加工画像を前記向上画像に向上させることと
をさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目２６）
前記向上画像を前記最終画像にセグメント化することをさらに含む、項目２３に記載の方法。
（項目２７）
前記向上画像を前記最終画像にセグメント化することに先立って、前記向上画像に雑音低減フィルタを適用することをさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２８）
（ａ）前記向上画像のための閾値を決定することと、
（ｂ）少なくとも部分的に前記閾値に基づいて、前記向上画像を前記最終画像にセグメント化することと
をさらに含む、項目２６に記載の方法。
（項目２９）
生物学的試験システムであって、前記生物学的試験システムは、
（ａ）培養器システムであって、前記培養器システムは、ある期間にわたって試験ウェル内に配置された混合物を培養するように構成され、前記混合物は、複数の病原菌と、抗菌剤とを含む、培養器システムと、
（ｂ）光学システムであって、前記光学システムは、
（ｉ）ステージであって、前記ステージは、前記期間にわたって前記培養器システム内で培養した後、前記試験ウェルを選択的に受け取るように構成されている、ステージと、
（ｉｉ）カメラであって、前記カメラは、前記ステージ上の前記試験ウェル内に配置された前記混合物の未加工画像を捕捉するように構成されている、カメラと
を備えている、光学システムと、
（ｃ）前記培養器システムと前記光学システムとの間で前記試験ウェルを移動させるように構成された移動システムと、
（ｄ）データベースであって、前記未加工画像は、前記データベース内に記憶される、データベースと、
（ｅ）プロセッサと
を備え、
前記プロセッサは、
（ｉ）前記未加工画像を最終画像に操作することと、
（ｉｉ）前記最終画像から前記混合物の特性を収集することと、
（ｉｉｉ）前記特性に基づいて、前記複数の病原菌に対する前記抗菌剤の最小抑制濃度を決定することと
を行うように構成されている、生物学的試験システム。
（項目３０）
前記ステージは、第１の方向および第２の方向に移動可能である、項目２９に記載の生物学的試験システム。
（項目３１）
前記ステージは、第３の方向に移動可能である、項目３０に記載の生物学的試験システム。
（項目３２）
前記特性は、前記最終画像内に描写された前記複数の病原菌における病原菌の量である、項目２９に記載の生物学的試験システム。
（項目３３）
前記特性は、前記最終画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌のサイズである、項目２９に記載の生物学的試験システム
（項目３４）
前記特性は、比率であり、前記比率は、少なくとも部分的に前記最終画像内に描写された病原菌の量に基づき、前記比率は、少なくとも部分的に前記最終画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌の前記サイズに基づく、項目２９に記載の生物学的試験システム
（項目３５）
前記特性は、比率であり、前記比率は、少なくとも部分的に前記最終画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌に関連付けられたピクセルの量に基づく、項目２９に記載の生物学的試験システム。
本明細書は、本発明を特に指示し、明確に請求する請求項で終了するが、本発明は、同様の参照番号が同一の要素を識別する付随の図面と併せて検討されるある実施例の以下の説明からより深く理解されるであろうと考えられる。

図１Ａは、例示的生物学的試験システムの図式的図の一部を描写する。

図１Ｂは、図１Ａの生物学的試験システムの図式的図の別の部分を描写する。

図２は、図１Ｂの生物学的試験システムの例示的培養器システムおよび例示的光学システムの斜視図を描写する。

図３は、図２の光学システムの斜視図を描写する。

図４は、光学システムのＸＹステージを示す図２の光学システムの別の斜視図を描写する。

図５は、図２の光学システムの一部の図式的図を描写する。

図６は、例示的コンピュータシステムの図式的図を描写する。

図７は、病原菌に関する理論的成長曲線のチャートを描写する。

図８は、図１Ａおよび１Ｂの生物学的試験システムにおいて使用するための例示的成長試験ウェルの概略図を描写する。

図９は、図１Ａおよび１Ｂの生物学的試験システムにおいて使用するための例示的画像分析サイクルを描写する。

図１０は、図２の光学システムによって捕捉される例示的未加工画像を描写する。

図１１は、図１０の未加工画像から導出される例示的向上画像を描写する。

図１２は、図１０の未加工画像から導出される例示的勾配画像を描写する。

図１３は、例示的画像向上フローチャートを描写する。

図１４は、例示的動的画像向上フローチャートを描写する。

図１５は、図１０の未加工画像から導出される例示的セグメント化画像を描写する。

図１６は、例示的画像セグメント化フローチャートを描写する。

図１７は、伸び要素を有する例示的病原菌を描写する。

図１８は、非伸び要素を有する例示的病原菌を描写する。

図１９は、本発明の例示的最適化抗菌剤感受性試験方法を描写する。

図２０Ａは、複数の異なる抗菌剤希釈物に関する連続的病原菌総数の例示的チャートを描写する。

図２０Ｂは、図２０Ａの抗菌剤希釈物に関する連続的面積総和の例示的チャートを描写する。

図２０Ｃは、図２０Ｂの面積総和と図２０Ａの病原菌総数との間の比率の連続的決定の例示的チャートを描写する。

図２１は、複数の異なる抗菌剤希釈物に関する連続的病原菌総数の例示的チャートを描写する。

図２２は、図２１の病原菌に関する面積総和と図２１の病原菌総数との間の比率の連続的決定の例示的チャートを描写する。

図２３は、図１９と同様に、本発明の例示的最適化抗菌剤感受性試験方法を描写する。

図２４は、図１９と同様に、本発明の例示的最適化抗菌剤感受性試験方法を描写する。

図面は、いかようにも限定であるように意図されず、本発明の種々の実施形態が、必ずしも図面に描写されるわけではないものを含む種々の他の方法で実行され得ることが考慮される。本明細書に組み込まれ、その一部を形成する付随の図面は、本発明のいくつかの側面を図示し、説明とともに、本発明の原理を解説する役割を果たすが、しかしながら、本発明は、示される精密な配列に限定されないことを理解されたい。

本発明のある実施例の以下の説明は、本発明の範囲を限定するように使用されるべきではない。本発明の他の実施例、特徴、側面、実施形態、および利点が、例証として、本発明を実行するために考慮される最良の形態のうちの１つである以下の説明から当業者に明白となるであろう。認識されるであろうように、本発明は、全て本発明から逸脱することなく、他の異なる明白な側面が可能である。故に、図面および説明は、制限ではなく、本質的に例証として見なされるべきである。

本明細書に説明される教示、表現、バージョン、実施例等のうちのいずれか１つ以上のものは、本明細書に説明される他の教示、表現、バージョン、実施例等のうちのいずれか１つ以上のものと組み合わせられ得ることを理解されたい。以下に説明される教示、表現、バージョン、実施例等は、したがって、互いに対して孤立して見なされるべきではない。本明細書の教示が組み合わせられ得る種々の好適な方法が、本明細書の教示に照らして当業者に容易に明白となるであろう。そのような修正および変形例は、請求項の範囲内に含まれることが意図される。

（Ｉ．生物学的試験システムハードウェア）

図１Ａおよび１Ｂは、生物学的試験システム１において利用可能な種々のハードウェア構成要素の図式的実施例を描写する。生物学的試験システム１は、最適化抗菌剤感受性試験（ＡＳＴ）方法１０１（図１９）を促進する。生物学的試験システム１は、大まかには、消耗品調製システム３と、接種システム５と、培養器システム７と、光学システム９とを含む。生物学的試験システム１内の種々のシステムは、互いに協調し、ユーザによって適正な物質を装填されると、自動的に機能する。

生物学的試験システム１を動作させるために、ユーザは、最初に、適切な病原菌サンプルを取得する。図１Ａに示されるように、病原菌サンプルは、寒天板１１から取得され得るか、またはある状況下では、血液サンプルが、使用され得る。次に、ユーザは、好適な液体培地または培養液を含む管の中に病原菌を移送することによって接種材料懸濁液を調製する。１つのそのような管が、接種材料１３として図１Ａに示される。生物学的試験システム１のいくつかのバージョンでは、液体培地または培養液は、ＭＩＣ決定または他の関連付けられる試験に有害に干渉することなく、溶液中に導入される病原菌の生存能力を維持することを補助するための少量のナトリウムおよび塩化カリウムを伴う約０．５ｍＭのリン酸緩衝液であり得る。リン酸緩衝液は、２つのシステムにわたる異なる接種材料の必要性を最小化し、単一の培養液を有することの効率を活用するために、ＩＤ試験およびＡＳＴ試験の両方において使用され得る。各接種材料１３は、接種材料ラック１５の中に設置され、接種材料ラック全体１５が、接種システム５の中に設置される。接種システム５内に入ると、各接種材料１３内の接種材料は、必要に応じて、接種材料１７を生成するために０．５マクファーランドの標準濁度値まで調節される。生物学的試験システム１のいくつかのバージョンでは、１マイクロリットルプラスチックループまたは綿棒が、寒天板からコロニーを容易に採集し、接種材料を所望の濁度値にするために必要とされる調節の量を最小化するために、ユーザに提供され得る。所望の濁度値まで調節されると、接種材料は、完成される。完成された接種材料は、以降では、図１Ｂに描写されるように、接種材料１７と称されるであろう。接種材料１７は、１：２５０希釈物にさらに希釈され、接種材料１８に変換され得る。下でより詳細に議論されるであろうように、各接種材料１７内に含まれる接種材料は、同定（ＩＤ）アレイ保持器２１に適用される一方、各接種材料１８内に含まれる接種材料は、ＡＳＴアレイ保持器２３に適用される。ＩＤアレイ保持器２１およびＡＳＴアレイ保持器２３の両方は、消耗品調製システム３によって組み立てられ、接種材料１７および接種材料１８との使用のために接種システム５に提供される。

消耗品調製システム３は、試験アレイ１９のマガジンを装填され、試験アレイ１９は、一連の試験ウェル２０内に配置される生物学的試験システム１によって要求される種々の抗菌剤または他の作用剤を含み得る。例えば、試験アレイ１９は、抗菌剤希釈物アレイまたは同定アレイを備え得る。消耗品調製システム３は、バルク希釈液（図示せず）、および／または、ＩＤアレイ保持器２１、ＡＳＴアレイ保持器２３およびそれらの中の接種材料を調製し、完成させるための種々の他の要素を装填され得る。主として、消耗品調製システム３は、要求に応じて試験アレイ１９を回収し、各回収された試験アレイ１９をＩＤアレイ保持器２１またはＡＳＴアレイ保持器２３のいずれかに組み合わせるように動作する。試験アレイ１９は、ロボットグリッパ（図示せず）または規定された試験によって指示されるような他の機械的特徴によって選択され、組み立てられ得る。例えば、医師が、抗生物質アモキシシリンを使用する生物学的試験を指図し得る。アモキシシリン試験に関連する試験アレイ１９が、したがって、回収され、適切なＩＤアレイ保持器２１およびＡＳＴアレイ保持器２３に組み立てられる。試験アレイ１９の全てまたはいくつかの部分は、各試験ウェル２０をデジタルで検査するとき、蛍光相互干渉、降下物、および／または気泡を低減させることを補助するために、スチレン材料から形成され得る。スチレン材料から形成された試験アレイ１９は、再水和のために適正であり、接種材料または希釈液が試験ウェル２０から剥がれ落ちることを防止するためのコロナ処理を要求しないことが見出されている。

接種材料１７、接種材料１８、ＩＤアレイ保持器２１、およびＡＳＴアレイ保持器２３が組み立てられると、接種システム５は、実質的に希釈されていない接種材料を接種材料１７からＩＤアレイ保持器２１の試験ウェル２０の中に分注し、希釈された接種材料を接種材料１８からＡＳＴアレイ保持器２３の試験ウェル２０の中に分注する。接種材料１７をＩＤアレイ保持器２１に適用すること、または接種材料１８をＡＳＴアレイ保持器２３に適用することと、その中に配置される病原菌の対数成長の開始との間の時間は、「遅延時間」として公知である。遅延時間は、酵母抽出物、ビタミン、および／またはミネラルを伴う培養液等の強化培養液を使用することによって減少させられ得る。遅延時間は、接種材料を増加させることによっても減少させられ得る。生物学的試験システム１のいくつかのバージョンでは、接種材料の量は、ＭＩＣ決定の正確度に影響を及ぼすことなく、約３０分だけ遅延時間を減少させるために、倍増され得る。分注は、必要に応じて、種々の回路、チャネル、および管類とともに、グリッパ（図示せず）およびピペッタ（図示せず）を伴うＸＹロボットまたはＸＹＺロボット（図示せず）を有するエレベータアセンブリ２６を介して遂行され得る。ＸＹＺロボットは、接種材料ラック１５から接種材料を回収し、接種材料をＩＤアレイ保持器２１およびＡＳＴアレイ保持器２３の試験ウェル２０の中に分注することを任務とする。ＩＤアレイ保持器２１およびＡＳＴアレイ保持器２３が接種材料を十分に装填されると、各ＩＤアレイ保持器２１およびＡＳＴアレイ保持器２３は、エレベータアセンブリ２６を用いて培養器システム７の中に移動させられる。

図２に示されるように、培養器システム７は、多数のＩＤアレイ保持器２１およびＡＳＴアレイ保持器２３を保持するためのスロット２７を含む。各アレイ保持器は、ＸＹＺロボット２９によってグリッパ３１を使用して対応するスロット２７の中に設置される。ＸＹＺロボット２９は、ＸＹＺ平面の任意の部分において移動し、グリッパ３１を所望のＩＤアレイ保持器２１またはＡＳＴアレイ保持器２３に近接して位置付けるように動作する。培養器システム７内にある間、各アレイ保持器は、具体的な所望の環境条件において培養される。例えば、培養器システム７は、摂氏３５度においてアレイ保持器を培養するように設定され得る。培養中、ある時間間隔において、ＸＹＺロボット２９は、特定のＩＤアレイ保持器２１またはＡＳＴアレイ保持器２３を回収し、選択されたアレイ保持器を光学システム９の中に移動させる。

図２－４に示されるように、光学システム９は、ＩＤアレイ保持器２１またはＡＳＴアレイ保持器２３の各試験ウェル２０のための画像を観察、監視、精査、および／または捕捉するように構成される特徴を含む。具体的には、各ＩＤアレイ保持器２１は、ＩＤ蛍光光度計３３によって監視される一方、各ＡＳＴアレイ保持器２３は、ＡＳＴカメラ３５によって監視される。監視を遂行するために、ＸＹＺロボット２９は、グリッパ３１を用いて特定のアレイ保持器を回収し、選択されたアレイ保持器をＸＹステージ３７上に設置する。ＸＹステージ３７は、関連付けられる監視要素の下にアレイ保持器を位置付けるようにＸＹ平面において移動し、すなわち、光学システム９における監視および観察のために、ＩＤアレイ保持器２１は、ＩＤ蛍光光度計３３の下に配置され、ＡＳＴアレイ保持器２３は、ＡＳＴカメラ３５の下に配置される。ＸＹステージ３７は、関連付けられるアレイ保持器の各試験ウェル２０が、ＩＤ蛍光光度計３３またはＡＳＴカメラ３５のいずれかの観察フレーム内に正確に位置付けられることを可能にするために、微調整されたモータ制御を含む。

図５は、光学システム９のＡＳＴ光学部分３９のための例示的アーキテクチャを図示する。ＡＳＴ光学部分３９は、照明源４１と、対物レンズ４３と、管レンズ４５と、折り返しミラー４７とを含む。照明源４１は、ＡＳＴアレイ保持器２３の各試験ウェル２０の単色照明を提供するための集光ＬＥＤシステムを備え得る。対物レンズ４３は、Ｎｉｋｏｎ ２０倍 ０．４５ＮＡ ＥＬＷＤ対物レンズまたは任意の他の好適な種類のレンズを備え得る。対物レンズ４３は、各ピクセルが約０．３３ミクロンに及ぶ２０倍対物レンズを備え得る。２０倍対物レンズは、細胞成長の開始時に相当な数の細胞（約１００～２００個の細胞）を検出する能力と、下で説明されるような伸びから正常な成長を分離するための細胞形態を検出する能力との両方を提供する。対物レンズ４３は、その中の病原菌をカウントするために十分な分解能を維持しながら、各試験ウェル２０のより広いダイナミックレンジおよび／またはより大きいサンプルのための１０倍対物レンズおよび／または５ＭＰカメラを備え得る。光学システム９のいくつかの例示的実施形態では、１回の通過あたりの試験ウェル２０あたり１つのみの写真または画像が、対物レンズ４３によって取得される。対物レンズ４３は、試験ウェル２０の底部からの背景雑音を排除するために、試験ウェル２０の底部からわずかに外して焦点を合わせ得る。光学システム９のいくつかのバージョンでは、対物レンズ４３は、試験ウェル２０の底部から約５～１０ミクロンに焦点を合わせるように構成される。光学システム９のいくつかのバージョンでは、対物レンズ４３は、試験ウェル２０の底部から８ミクロンに焦点を合わせるように構成される。対物レンズ４３はまた、対物レンズ４３がＸＹステージ３７に対してＺ軸に移動することを可能にするためのＺステージ４４を含み得る。したがって、ＡＳＴアレイ保持器２３をＸＹ平面において移動させるＸＹステージ３７と、対物レンズ４３をＺ軸において移動させるＺステージ４４との間で、アレイ保持器２３の各試験ウェル２０は、試験ウェル２０をＡＳＴカメラ３５のフレームと精密に整列させるために、任意の３次元空間において移動させられ得る。管レンズ４５は、色消管レンズにおいて具現化され得る。ＡＳＴカメラ３５は、Ｓｏｎｙ ＩＭＸ２５３カメラまたは任意の他の好適な種類のカメラを備え得る。光学システム９のいくつかのバージョンでは、ＸＹステージ３７およびＺステージ４４は、試験ウェル２０の３次元移動の全ての３つの軸を提供するために、ＸＹＺステージと置換される。

ここで図６を参照すると、生物学的試験システム１の種々の構成要素は、例示的コンピュータシステム４９等の１つ以上のコンピューティングデバイスまたはシステムを組み込み得る。例えば、消耗品調製システム３、接種システム５、培養器システム７、および／または光学システム９のうちのいずれか１つは、例示的コンピュータシステム４９等の１つ以上のコンピューティングシステムを組み込み得る。代替として、生物学的試験システム１のこれらのサブシステムの各々は、例示的コンピュータシステム４９等の１つの全体的コンピューティングシステムからのコマンドを介して機能し得る。

コンピュータシステム４９は、プロセッサ５１と、メモリ５３と、大容量記憶メモリデバイス５５と、入力／出力（Ｉ／Ｏ）インターフェース５７と、ヒューマンマシンインターフェース（ＨＭＩ）５９とを含み得る。コンピュータシステム４９は、ネットワーク６３またはＩ／Ｏインターフェース５７を介して１つ以上の外部リソース６１にも動作可能に結合され得る。外部リソースは、限定ではないが、サーバ、データベース、大容量記憶デバイス、周辺デバイス、クラウドベースのネットワークサービス、またはコンピュータシステム４９によって使用され得る任意の他の好適なコンピュータリソースを含み得る。

プロセッサ５１は、マイクロプロセッサ、マイクロコントローラ、デジタル信号プロセッサ、マイクロコンピュータ、中央処理ユニット、フィールドプログラマブルゲートアレイ、プログラマブル論理デバイス、状態マシン、論理回路、アナログ回路、デジタル回路、またはメモリ５３内に記憶される動作命令に基づいて信号（アナログもしくはデジタル）を操作する任意の他のデバイスから選択される１つ以上のデバイスを含み得る。メモリ５３は、限定ではないが、読み取り専用メモリ（ＲＯＭ）、ランダムアクセスメモリ（ＲＡＭ）、揮発性メモリ、不揮発性メモリ、スタティックランダムアクセスメモリ（ＳＲＡＭ）、ダイナミックランダムアクセスメモリ（ＤＲＡＭ）、フラッシュメモリ、キャッシュメモリ、または情報を記憶することが可能な任意の他のデバイスを含む単一のメモリデバイスもしくは複数のメモリデバイスを含み得る。大容量記憶メモリデバイス５５は、ハードドライブ、光学ドライブ、テープドライブ、不揮発性ソリッドステートデバイス、または情報を記憶することが可能な任意の他のデバイス等のデータ記憶デバイスを含み得る。

プロセッサ５１は、メモリ５３内に常駐するオペレーティングシステム６５の制御下で動作し得る。オペレーティングシステム６５は、コンピュータリソースを管理し得、それによって、メモリ５３内に常駐するアプリケーション６７等の１つ以上のコンピュータソフトウェアアプリケーションとして具現化されるコンピュータプログラムコードは、プロセッサ５１によって実行される命令を有し得る。代替実施形態では、プロセッサ５１は、アプリケーション６７を直接実行し得、その場合、オペレーティングシステム６５は、省略され得る。１つ以上のデータ構造６９も、メモリ５３内に常駐し得、データを記憶または操作するために、プロセッサ５１、オペレーティングシステム６５、またはアプリケーション６７によって使用され得る。

Ｉ／Ｏインターフェース５７は、プロセッサ５１をネットワーク６３または外部リソース６１等の他のデバイスおよびシステムに動作可能に結合する機械インターフェースを提供し得る。アプリケーション６７は、それによって、本発明の実施形態を構成する種々の特徴、機能、アプリケーション、プロセス、またはモジュールを提供するために、Ｉ／Ｏインターフェース５７を介して通信することによってネットワーク６３または外部リソース６１と協働的に機能し得る。アプリケーション６７は、１つ以上の外部リソース６１によって実行されるプログラムコードも有するか、または別様に、コンピュータシステム４９の外部の他のシステムもしくはネットワークコンポーネントによって提供される機能または信号に依拠し得る。実際に、ほぼ無限のハードウェアおよびソフトウェア構成が可能であることを所与として、当業者は、本発明の異なるバージョンが、コンピュータシステム４９の外部に位置する複数のコンピュータまたは他の外部リソース６１間に分散されるか、もしくはクラウドコンピューティングサービス等のネットワーク６３を経由するサービスとして提供されるコンピューティングリソース（ハードウェアおよびソフトウェア）によって提供されるアプリケーションを含み得ることを理解するであろう。

ＨＭＩ ５９は、ユーザがコンピュータシステム４９と直接相互作用することを可能にするために、公知の様式でコンピュータシステム４９のプロセッサ５１に動作可能に結合され得る。ＨＭＩ ５９は、ビデオまたは英数字ディスプレイ、タッチスクリーン、スピーカ、およびデータをユーザに提供することが可能な任意の他の好適なオーディオならびに視覚インジケータを含み得る。ＨＭＩ ５９は、ユーザからコマンドまたは入力を受け取り、入力された入力をプロセッサ５１に伝送することが可能な英数字キーボード、ポインティングデバイス、キーパッド、プッシュボタン、制御ノブ、マイクロホン等の入力デバイスおよび制御装置も含み得る。

データベース７１は、大容量記憶メモリデバイス５５上に常駐し得、本明細書に説明される種々のシステムおよびモジュールによって使用されるデータを収集ならびに編成するために使用され得る。データベース７１は、データおよびデータを記憶ならびに編成する支援データ構造を含み得る。特に、データベース７１は、限定ではないが、リレーショナルデータベース、階層化データベース、ネットワークデータベース、またはそれらの組み合わせを含む任意のデータベース編成もしくは構造で配列され得る。プロセッサ５１上の命令として実行されるコンピュータソフトウェアアプリケーションの形態におけるデータベース管理システムが、クエリに応答して、データベース７１の記録に記憶された情報またはデータにアクセスするために使用され得、クエリは、オペレーティングシステム６５、他のアプリケーション６７、または１つ以上のモジュールによって動的に決定および実行され得る。

（ＩＩ．最適化ＡＳＴシステムおよび方法）

図７－２３は、最適化ＡＳＴ方法１０１（図１９）の種々の特徴およびステップを図示する。いくつかのバージョンでは、上で議論されるようなシステム１は、最適化ＡＳＴ方法１０１において提供される特徴のうちのいくつかまたは全てを促進するために使用され得る。最適化ＡＳＴ方法１０１は、ＭＩＣが決定されるまで、画像分析サイクル１０２を繰り返し実行することを含む。

いくつかの従来のプロセスでは、ＭＩＣは、病原菌が成長することを可能にするための期間を待った後、試験ウェルの手動目視検査を通して決定される。しかしながら、図７に示されるように、試験ウェル内の病原菌サンプル成長は、接種材料が試験ウェル内に配置された後の４～１０時間まで裸眼で観察可能ではない。ＭＩＣを決定する伝統的方法は、試験ウェル内の病原菌の成長に対して人間が視覚的に知覚し得るものによって限定される。さらに、ＭＩＣ濃度を下回る抗菌剤希釈濃度の存在は、成長速度を緩慢にし、知覚するためにさらに長くかかり得る。図７に示されるように、病原菌サンプルの最初の６～７回の倍加は、人の眼によって視覚的に観察されることができない。しかしながら、これらの初期倍加を通して提供される情報は、多くの場合、ＭＩＣを示す。図７－２３に示されるように、最適化ＡＳＴ方法１０１は、試験ウェルにおける接種時点から成長速度を監視するためにデジタル顕微鏡検査を利用し、したがって、ＭＩＣのより迅速かつ正確な検出を可能にする。加えて、病原菌のサイズおよび形状等の試料形態情報が、ＭＩＣ決定の正確度を向上させるために使用されることができる。例えば、目視観察は、ベータラクタム抗生物質によって引き起こされる伸び等の異常成長と正常成長との間を検出することができないので、伸び等の試料形態情報が、ＭＩＣ決定の正確度を向上させるために使用され得る。

図８は、最適化ＡＳＴ方法１０１において使用するためのいくつかの例示的デジタル顕微鏡検査パラメータを提供する。試験ウェル２０は、透明な視認底部を有する「３８４」式試験ウェルによって具現化される。試験ウェル２０内の接種材料の体積は、ＡＳＴ方法１０１によって要求されるバルク希釈液等の材料の量を低減させ、および／または光アーチファクトを最小化し、０．５マクファーランドの接種材料の１：２５０希釈物から一貫した数の病原菌のサンプリングを提供するために、２０マイクロリットルに設定され得る。試験ウェル２０内の接種材料の体積を減少させることは、概して、光アーチファクトを増加させる。いくつかの事例では、ＡＳＴカメラ３５が０．３３ミクロン／ピクセルに設定される２０倍対物レンズにおいて単一の垂直面１０３を捕捉することは、接種材料をサンプリングし、各個々の病原菌が認識可能であることを確実にするために十分であり得る。しかしながら、これらのパラメータは、構成可能であり、ユーザまたはシステムの根本的な必要性によって、所望に応じて変化し得る。単一の垂直面１０３内で約５ミクロン間隔を置かれたた３つの焦点部位を捕捉することも、最適化ＡＳＴ方法１０１における使用のために、カウントするために十分な数のサンプル中の病原菌を提供し得る。これらの３つの焦点部位は、図８において部位１０５、部位１０７、および部位１０９と標識化される。最適化ＡＳＴ方法１０１の例示的バージョンでは、各焦点部位は、３つの異なる垂直面において３つの部位を捕捉するのではなく、単一の垂直面１０３内で約７００×７００ミクロンである。ＡＳＴカメラ３５、光学システム９、およびコンピュータ４９は、連続した期間において各焦点部位の画像を捕捉し、これらの画像の各々を操作し、その後、ＭＩＣ決定を行うためにこれらの操作された画像から導出されるデータを使用するように構成される。

画像分析サイクル１０２は、概して、図９に描写され、画像捕捉ステップ１１１と、画像向上ステップ１１３と、画像セグメント化ステップ１１５と、物体カウントステップ１１７とを含む。最適化ＡＳＴ方法１０１は、ＭＩＣが決定されるまで、画像分析サイクル１０２を繰り返し実施することを含む。画像分析サイクル１０２は、画像捕捉ステップ１１１、画像向上ステップ１１３、画像セグメント化ステップ１１５、および物体カウントステップ１１７、ならびにその中に提供される任意のサブステップを実施するために、コンピュータ４９の１つ以上のインスタンスおよびその種々の要素を利用する。

画像分析サイクル１０２は、画像捕捉ステップ１１１から開始され、光学システム９のＡＳＴカメラ３５を介して接種材料の未加工画像１１９（図１０）を捕捉し、未加工画像１１９をメモリ５３内に記憶する。未加工画像１１９は、単一の画像として描写されるが、未加工画像１１９は、垂直面１０３内で取得されたいくつかの別個の画像の合成物、例えば、部位１０５、部位１０７、および部位１０９の合成物であり得る。未加工画像１１９は、接種材料サンプル内の異なる平面内で取得されたいくつかの画像の合成物でもあり得るか、または、単一の画像であり得る。図１０に図示されるように、未加工画像１１９は、不均一な照明等の欠陥を含み得る。不均一な照明は、照明源４１の経路に影響を及ぼし得る関連付けられる試験ウェル２０の壁と組み合わせて接種材料によって生成されるメニスカスの結果であり得る。不均一な背景強度も、塑性変形等の環境問題によって、または種々の他の源から引き起こされ得る。未加工画像１１９が画像捕捉ステップ１１１において捕捉された後、画像捕捉ステップ１１１は、画像向上ステップ１１３に進む。

図９および１１－１４に示されるように、画像向上ステップ１１３は、向上画像１２１（図１１）を作成するために未加工画像１１９を処理し、それによって、向上画像１２１は、細菌等の病原菌をカウントおよび認識するプロセスのためにより好適である。画像向上ステップ１１３中、未加工画像１１９の１つ以上の属性が、修正される。これらの属性は、基本的グレーレベル変換、雑音フィルタリング、およびメディアンフィルタリングを含み得る。例えば、不均一な照明の問題を解決するために、メディアンフィルタが、勾配画像１２３（図１２）に到達するために未加工画像１１９に適用され得る。これは、未加工画像１１９の背景照明の勾配のみを含む結果として生じる画像を提供するために十分なピクセル半径を選択することによって遂行され得る。勾配画像１２３は、次いで、不均一な照明を補正し、不均一な照明のない向上画像１２１を生成するために、未加工画像１１９から減算される。

画像向上ステップ１１３は、静的に、動的に、または両方のいずれかで画像向上を適用し得る。例えば、メディアンフィルタのためのピクセル半径は、静的に設定された一定値であり得るか、または光学システム９を通して捕捉された各未加工画像１１９の特性から動的に適応的に導出され得る。図１３に示されるように、画像向上ステップ１１３のいくつかのバージョンは、ステップ１２５を含み得、それによって、作業中の画像が向上を受けるべきかどうかに関する決定が、行われる。ステップ１２５が、作業中の画像が向上させられるべきであると決定する場合、ステップ１２５は、ステップ１２７に進む。ステップ１２７において、静的向上が適用されるべきかどうかに関する決定が、行われる。ステップ１２７が、静的向上が適用されるべきであると決定する場合、ステップ１２７は、ステップ１２９に進む。ステップ１２７が、静的向上が適用されるべきではないと決定する場合、ステップ１２７は、ステップ１３１に進む。ステップ１２７において、静的向上が、作業中の画像に適用され、ステップ１２７は、ステップ１２５に戻る。ステップ１３１において、動的向上が、作業中の画像に適用され、ステップ１３１は、ステップ１２５に戻る。ステップ１２５が、作業中の画像がさらに向上させられるべきであると決定する場合、ステップ１２５は、終了に進む。

図１４は、動的画像向上の方法１３３の例を図示する。動的画像向上の方法１３３は、メディアンフィルタ向上において使用するための適切なピクセル半径を動的に決定することを対象とする。動的画像向上の方法１３３は、ステップ１３５から開始され、それによって、未加工画像１１９内に描写される病原菌のサイズが、決定される。病原菌は、グラム陽性細菌、グラム陰性細菌、酵母、または任意の他の生元素もしくは微生物の形態であり得る。未加工画像１１９内の病原菌のサイズは、接種材料および全体的光学システム９に関連付けられる種々の状況ならびにパラメータに応じて変化し得る。したがって、試験されている特定の病原菌の文字通りのサイズは、概して、本質的に一定であるが、未加工画像１１９内に描写される微生物の相対的サイズは、レンズオブジェクト化等のパラメータの差異により、動的かつ可変である。ステップ１３５が未加工画像１１９内の病原菌のサイズを決定すると、ステップ１３５は、ステップ１３７に進む。ステップ１３７において、ピクセル半径が、病原菌の決定されたサイズから導出される。一般的例として、ステップ１３５が、未加工画像１１９内の任意の所与の病原菌の最大長が５ピクセルであると決定する場合、ピクセル半径は、フィルタ処理された画像が背景に含まれる勾配のみを表すように、５を上回るべきことが決定され得る。ステップ１３５が動的に決定された病原菌のサイズに基づいてピクセル半径を導出した後、ステップ１３５は、ステップ１３９に進む。ステップ１３９において、勾配画像１２３が、導出されたピクセル半径を用いて未加工画像１１９を処理することに基づいて生成される。勾配画像１２３が生成された後、ステップ１３９は、ステップ１４１に進む。ステップ１４１において、勾配画像１２３は、向上画像１２１を生成するために未加工画像１１９から減算される。その後、動的画像向上の方法１３３は、終了に進む。

図９、１５、および１６に示されるように、画像セグメント化ステップ１１５は、画像を、病原菌を前景または背景のいずれかとして表すピクセルを含む明確に異なる領域に区分化するために使用される。画像セグメント化ステップ１１５は、図１５に示されるように、向上画像１２１をセグメント化画像１４３に変換する。画像セグメント化ステップ１１５は、向上画像１２１からバイナリ画像を生成し、全ピクセルは、０または１のいずれかの値に等しく、０は、背景を指し、１は、特定の病原菌の一部を指す。

雑音等の画像アーチファクトが、セグメント化アルゴリズムを適用することに先立って、雑音低減フィルタを適用することによって除去され得る。セグメント化は、静的閾値を使用して、またはＯｔｓｕクラスタベースの二値化アルゴリズム等の適応画像二値化方法を使用して取得されることができる。このアルゴリズムでは、グレーレベルサンプルは、背景および前景（物体）として２つの部分にクラスタ化されるか、または代替として、２つのガウス分布の混合物としてモデル化される。使用される特定の画像二値化アルゴリズムに関する閾値は、画像セグメント化ステップ１１５に提供される全体的画像および画像の相対的グレースケールレベルに応じて、動的に決定され得る。例えば、接種システム５またはシステム１の別の要素は、ニグロシンが細菌等のある病原菌に付着しないので、画像を向上させるために各試験ウェル２０にニグロシンを適用するように構成され得る。これは、ニグロシンを伴わない未加工画像１１９と比較して、未加工画像１１９内の相対的グレースケールレベルを改変し、セグメント化アルゴリズムのための異なる閾値を要求し得る。最適化ＡＳＴ方法１０１のいくつかのバージョンでは、閾値は、画像のいくつかのエリア内のエッジを捜すことによって動的に決定され得る。これらのエッジは、背景と病原菌との間の遷移点である。したがって、閾値は、次いで、見つけられたエッジの各側のピクセルに対する平均グレースケール値として計算されることができる。

図１６に示されるように、画像セグメント化ステップ１１５のいくつかのバージョンは、ステップ１４５から開始され得る。ステップ１４５において、雑音低減フィルタを向上画像１２１に適用すべきかどうかに関する決定が、行われる。ステップ１４５が、雑音低減フィルタが適用されるべきであると決定する場合、ステップ１４５は、ステップ１４７に進み、雑音低減フィルタが、適用される。ステップ１４７は、その後、ステップ１４９に進む。ステップ１４５が、雑音低減フィルタが適用されるべきではないと決定する場合、ステップ１４５は、直接、ステップ１４９に進む。ステップ１４９において、閾値を動的に決定すべきかどうかに関する決定が、行われる。ステップ１４９が、閾値が動的に決定されるべきであると決定する場合、ステップ１４９は、ステップ１５１に進み、閾値が、決定される。ステップ１４９は、その後、ステップ１５３に進む。ステップ１４９が、閾値を動的に決定しないと決定する場合、静的な所定の閾値が、使用され、ステップ１４９は、直接、ステップ１５３に進む。ステップ１５３において、向上画像１２１は、選択された閾値を使用してセグメント化され、ステップ１５３は、終了に進み、その後、画像セグメント化ステップ１１５は、終了に進む。

画像セグメント化ステップ１１５がセグメント化画像１４３を生成すると、画像セグメント化ステップ１１５は、物体カウントステップ１１７に進む。物体カウントステップ１１７では、背景および前景ピクセルが、サンプル中の病原菌の数、サンプル中の病原菌によって占有される面積、および病原菌の数と病原菌によって占有される面積との間の比率に関する情報を導出するために考慮される。物体カウントステップ１１７のいくつかのバージョンでは、実際の病原菌総数が、平均病原菌総数と比較され、エラーが画像捕捉プロセス内で起こったかどうかを決定する。比較は、病原菌比較を一般化するために、平均病原菌総数とともに標準偏差を組み込み得る。

物体カウントステップ１１７は、画像内の病原菌の数に関する情報を導出するように構成され得る。物体カウントステップ１１７のいくつかの実施形態では、セグメント化画像１４３内の前景ピクセルの数が、接種材料の撮像された部分内の病原菌の数を決定するために、所定の幅および／または長さに従ってカウントされ得る。潜在的な病原菌の外形が、セグメント化画像１４３内の対応する異なる前景ピクセル形状を提供するので、カウントアルゴリズムは、２つの別個のアルゴリズムに分割され得、１つは、桿形病原菌をカウントするためのものであり、１つは、球形病原菌をカウントするためのものである。例えば、カウントアルゴリズムは、球形病原菌のためのカウント目的のために２×２ピクセルの正方形を病原菌と見なすように構成され得るか、または桿形病原菌のためのカウント目的のために１×４ピクセルの長方形を病原菌と見なし得る。さらに、カウントアルゴリズムは、桿形病原菌の異なる３次元向きを捕捉するために、両方のアルゴリズムを処理するように構成され得る。例えば、細長い桿がＡＳＴカメラ３５に向かって端方向に位置付けられる場合、それは、ＡＳＴカメラ３５を通して２次元において視認されると、非常に異なる外形を有するであろう。したがって、両方のカウントアルゴリズムが、画像分析サイクル１０２のカウント段階の間に使用され得る。代替として、カウントアルゴリズムは、背景ピクセルによって包囲される任意の前景ピクセルを病原菌として見なし、カウントするように構成され得る。

物体カウントステップ１１７は、画像内の病原菌の全てによって占有される合計面積に関する情報を導出するように構成され得る。物体カウントステップ１１７のいくつかのバージョンでは、セグメント化画像１４３内の前景ピクセルの合計数が、カウントされ、セグメント化画像１４３内の背景ピクセルの合計数と比較され得る。物体カウントステップ１１７は、３０％等のパーセントとして、または「４５０個の合計ピクセルのうち１３８個の前景ピクセル」もしくは「１３８個の前景ピクセルおよび３１２個の背景ピクセル」等のピクセルの文字通りの数としてのものを含む任意のフォーマットで面積カウント情報を表し得る。

物体カウントステップ１１７は、画像内の病原菌の全てによって占有される合計面積と病原菌の合計数との間の比率に関する情報を導出するように構成され得る。この情報は、病原菌が経時的に伸びを受けているかどうかを決定することによって有用であり得る。伸びは、死滅の前兆であり、抗菌剤希釈物の濃度が病原菌に悪影響を及ぼしていることを示す。より具体的には、伸びは、細菌等の病原菌が効果的な量の抗生物質に遭遇すると起こり得る。

例えば、図１７および１８は、大腸菌によって具現化される病原菌を描写する。図１７は、抗生物質アンピシリンの希釈物にさらされた後の大腸菌を描写する一方、図１８は、どんなアンピシリン暴露もない大腸菌を描写する。図１７は、アンピシリン暴露の結果としての伸びの形態における異常成長を図示する。この伸びは、細菌の死滅の前兆であり、アンピシリンの濃度が細菌を中和するために十分であることを例証する。図１８は、正常成長を図示する。細菌の全てによって占有される合計面積と細菌総数との間の比率は、各細菌の伸びを表すために経時的に増加するということになる。例えば、特定の画像サンプルが、１００匹の細菌を含み、各細菌が、各々、約４ピクセルと測定される場合、画像内で１００匹の細菌によって占有される面積は、４００ピクセルである。この画像サンプルでは、細菌総数に対する細菌面積の比率は、４．０である。経時的に、サンプル中の各細菌が、各々、約１２ピクセルまで伸びる場合、後の画像内の１００匹の細菌によって占有される面積は、１，２００ピクセルであり、この後の画像内の細菌総数に対する細菌面積の比率は、１２．０である。比率におけるこの増加は、細菌が伸びており、それが、次に、差し迫った死滅を示すので、アンピシリンの濃度が大腸菌を中和させることにおいて効果的であることを示す。

物体カウントステップ１１７がセグメント化画像１４３から所望の情報を導出すると、画像分析サイクル１０２は、終了する。最適化ＡＳＴ方法１０１は、各試験ウェル２０内の病原菌が、特定の抗菌剤希釈物ペアリングに対して変化し、反応している様子を決定するために、設定された時間間隔において画像分析サイクル１０２を反復的に実施する。さらに、最適化ＡＳＴ方法１０１は、病原菌が抗菌剤希釈物の各濃度に対して反応している様子を決定するために、病原菌に関連付けられる各試験ウェル２０に画像分析サイクル１０２を反復的に実施する。例えば、試験される病原菌が大腸菌であり、３つの試験ウェル２０が試験され、各試験ウェル２０がその中に２０マイクロリットルの溶液を有すると仮定する。第１の試験ウェル２０は、１ミリリットルあたり１マイクログラム（ｍｃｇ／ｍｌ）の抗菌剤希釈物を含み得、第２の試験ウェル２０は、２ｍｃｇ／ｍｌの抗菌剤希釈物を含み得、第３の試験ウェル２０は、４ｍｃｇ／ｍｌの抗菌剤希釈物を含み得る。最適化ＡＳＴ方法１０１は、（ａ）各抗菌剤希釈物が病原菌に影響を及ぼしている様子、および、（ｂ）各抗菌剤希釈物が他の抗菌剤希釈物に対して機能している様子を決定するために、各設定された時間間隔において３つの試験ウェルの各々に画像分析サイクル１０２を実施する。データが、１ｍｃｇ／ｍｌの抗菌剤希釈物が病原菌の中和において２および４ｍｃｇ／ｍｌの抗菌剤希釈物と同程度に効果的であることを示す場合、１ｍｃｇ／ｍｌの抗菌剤希釈物が、ＭＩＣである。

最適化ＡＳＴ方法１０１の例示的バージョンが、図１９に図示され、ステップ１５５から開始される。ステップ１５５において、システムは、選択された試験ウェル２０内の病原菌に、特定の抗菌剤希釈物に対する成長速度または反応に関する新しい情報を提供するために十分な時間を可能にするために、設定された期間閾値にわたって待つ。最適化ＡＳＴ方法１０１は、任意の所与の静的または動的期間閾値を利用するように構成され得る。例えば、いくつかの細菌または酵母もしくは他の病原菌は、非常に迅速に反応し、１時間以内にＭＩＣ決定を行うことに関する情報を提供し得る。このシナリオでは、最適化ＡＳＴ方法１０１は、試験ウェル２０内の急速に変化する環境に関するデータを捕捉するために、５分毎に画像分析サイクル１０２を実施するように構成され得る。他の病原菌は、比較的に緩慢に抗菌剤希釈物に反応し得、したがって、１時間の期間閾値が、より適切であり得る。ステップ１５５が規定された期間閾値を待つと、ステップ１５５は、ステップ１５７に進む。

ステップ１５７において、画像分析サイクル１０２の１回の反復が、選択された試験ウェル２０を用いて特定の病原菌に実施される。上で議論されるように、画像分析サイクル１０２の反復は、選択された試験ウェル２０内の病原菌の成長速度に関するデータを導出する。画像分析サイクル１０２の反復が実施された後、ステップ１５７は、ステップ１５９に進む。ステップ１５９において、ステップ１５７において収集されたデータが、メモリ内に記憶および／または更新され、メモリは、データベース、単層ファイル、または任意の他の類似するメモリもしくは記憶デバイスの形態であり得る。最適化ＡＳＴ方法１０１のいくつかの実施形態では、ステップ１５９は、ステップ１５７において収集されたデータをデータベース７１（図６）内に記憶する。ステップ１５９が収集されたデータを記憶／更新すると、ステップ１５９は、ステップ１６１に進む。

ステップ１６１において、最適化ＡＳＴ方法１０１は、ＭＩＣを決定するために十分なデータが収集されたかどうかを決定する。より多くのデータがＭＩＣを正確に決定するために必要とされる場合、ステップ１６１は、ステップ１５５に戻り、将来の時間間隔においてより多くのデータを収集するために別の画像分析サイクル１０２を実施するために待つ。ステップ１６１が、十分な量のデータが収集されたと決定する場合、ステップ１６１は、ステップ１６３に進む。他の試験ウェル２０および抗菌剤希釈物に対する病原菌の相対的成長速度がＭＩＣを示すので、ステップ１６１は、病原菌および抗菌剤希釈物に関連付けられる特定の試験ウェル２０に関して収集されたデータだけを考慮するのではなく、ステップ１６１は、試験ウェル２０の全てに関して収集されたデータの全てを考慮する。

ステップ１６３において、ＭＩＣが、決定される。決定は、病原菌サンプルのための抗菌剤希釈物の全てに関する画像分析サイクル１０２の各反復の間に収集されたデータに基づく。図２０Ａ、２０Ｂ、および２０Ｃに示されるように、決定は、各画像内の各細菌または他の病原菌の総数（図２０Ａ）、各画像内の病原菌によって占有される面積（図２０Ｂ）、もしくは各画像内の病原菌の総数に対する占有面積に関する比率データ（図２０Ｃ）に基づき得る。

図２０Ａは、「総数合計」情報を描写し、それによって、各濃度の抗生物質における細菌総数の合計が、経時的な相対的細菌総数を示すようにプロットされる。図２０Ａに示されるように、「Ｃａｘ ０．１２」希釈物は、細菌総数が、概して、成長培養液を含むが、抗生物質等のいずれの抗菌剤もない成長サンプルと同一の曲線に沿って増加するので、大腸菌サンプルにいかなる影響も及ぼさないと考えられる。大腸菌サンプルに影響を及ぼすための最小量の抗菌剤希釈物は、「Ｃａｘ ０．２５」希釈物であり、したがって、０．２５希釈物において適用されたＣａｘ抗生物質が、ＭＩＣであると決定されることができる。

図２０Ｂは、「面積合計」情報を描写し、それによって、各濃度の抗生物質における細菌の面積が、経時的な細菌集団の相対的集合体サイズを示すようにプロットされる。図２０Ｂに提供される「面積合計」情報は、「Ｃａｘ ０．２５」が大腸菌によって占有された面積に所望の影響を及ぼすための最小量の抗生物質であるので、図２０Ａの決定を確認するために使用され得る。図２０Ｂは、細菌が総数において増加していない（「成長」および「Ｃａｘ ０．１２」チャート線の間の比較によって示されるように）が、面積において増加していることを伝える。したがって、細菌は、抗菌剤希釈物中の抗生物質に起因する細菌の差し迫った死滅の結果として、伸び、異常成長を被っている。

図２０Ｃは、「面積／総数比率」情報を描写し、それによって、「総数合計」データと「面積合計」データとの間の比率が、抗生物質の濃度毎の面積に対する細菌集団の相対的差異を示すようにプロットされる。伸びデータは、面積と総数との間の比率が描写される図２０Ｃにおいてより顕著である。細菌が成長培養液を供給されない「成長なし」チャート線に見られるように、面積と総数との比率は、約４．０において平坦である。これは、各細菌がサイズにおいて約４ピクセルであり、細菌が総数において増加しておらず、伸びも被っていないことを示す。「成長」および「Ｃａｘ ０．１２」を反映するチャート線は、比率において増加するが、漸進的増加は、細菌の総数および面積の両方が増加していることを示す。８．０を上回る比率の急激なスパイクは、面積が増加するが、細菌の全体的総数が一定のままであるので、細菌の伸びを示す。この顕著な伸びスパイクを被る最少量の抗生物質は、「Ｃａｘ ０．２５」サンプルであり、したがって、図２０Ｃの比率データも、図２０Ａおよび２０Ｂにおけるデータによって提供される同一のＭＩＣ決定の確認においてＭＩＣ０．２５を提供する。

ＭＩＣ決定は、データ収集フォーマットおよび経時的なデータの一般的傾向の種々の組み合わせにも基づき得るか、または、データの１つの組が、ＭＩＣを決定するために使用され得る一方、別の組が、決定されたＭＩＣを確認するために使用され得る。上で説明される「総数合計」、「面積合計」、および「面積／総数比率」機構の任意の組み合わせが、ＭＩＣを決定または確認するために使用され得る。例えば、図２１および２２は、抗生物質セフェピムの種々の抗菌剤希釈物を用いて試験される大腸菌サンプルに関して１５分毎に収集されたデータ点を図示する。２００分マークの周囲において、図２１に提供される細菌総数データは、「Ｃｐｅ ０．０６」希釈物がＭＩＣであることを示す。図２２に提供される比率データは、「Ｃｐｅ ０．０３」を上回る抗菌剤希釈物の全てが１２０分マークの周囲において伸びスパイクを提供するので、「Ｃｐｅ ０．０６」が１２０分マークの周囲においてＭＩＣであることを示す。したがって、ＭＩＣの予備決定が、１２０分における比率データ（図２２）を使用して行われ得、決定されたＭＩＣの確認が、２００分における総数データ（図２１）を使用して行われ得る。最適化ＡＳＴ方法１０１の本実施形態は、したがって、１２０分において利用可能な予備ＭＩＣ決定および２００分において利用可能な確認ＭＩＣ決定を用いて、データの二重試験を提供する。図９を参照すると、４時間または２４０分が、手動目視検査方法を使用してＭＩＣ決定を行うための最も早い可能な閾値であり、それは、より不正確であり、より人手がかかる。

（ＩＩＩ．最小抑制濃度（ＭＩＣ）を決定するためのデジタル顕微鏡検査アルゴリズム）

図２３は、同様の要素が同様の特徴を有する方法１０１Ａと以降で称される例示的最適化ＡＳＴ方法１０１の別のバージョンを描写する。方法１０１Ａは、方法２０１として図２３に描写されるＭＩＣを決定するための例示的デジタル顕微鏡検査アルゴリズムを組み込む。方法２０１は、方法１０１のステップ１６１および１６３の代わりに実行され得る。

図２３に示されるように、画像データが更新および記憶された後、ステップ１５９は、方法２０１に進む。方法２０１は、ステップ２０３から開始され、それによって、成長ウェル内の病原菌の総数に関する決定が、行われる。図２０Ａ、２０Ｂ、および２０Ｃに示されるように、各ＡＳＴ試験アレイ２３は、抗生物質等のどんな抗菌剤もない接種材料１８がその中に配置される試験ウェル２０を含み得る。成長ウェルは、したがって、試験を受ける特定の病原菌の阻害されない成長を例証する。ステップ２０３は、成長ウェル内の病原菌の総数が、第１の総数閾値を超えているかどうかを決定する。方法２０１のいくつかのバージョンでは、第１の総数閾値は、設定された静的総数量であり得る。例えば、第１の総数閾値は、１５，０００匹の病原菌であり得る。方法２０１の他のバージョンでは、第１の閾値量は、新しい試験または試験のバッチが開始される度に生物学的試験システム１のユーザによって構成され得る。方法２０１のさらにいくつかの他のバージョンでは、第１の総数閾値は、生物学的試験システム１およびＩＤ蛍光光度計によって病原菌に実施されたＩＤ試験の結果に基づいて、各試験のために動的に設定され得る。

ステップ２０３が、成長ウェル内の病原菌の数が第１の総数閾値を超えていないと決定する場合、ステップ２０３は、期間待ちステップ（ステップ１５５）の別の反復を実施するためのステップ１５５、画像分析サイクルステップ（ステップ１５７）、およびデータ記憶／更新ステップ（ステップ１５９）に戻る。ステップ２０３が、成長ウェル内の病原菌の数が第１の総数閾値を超えていると決定する場合、ステップ２０３は、ステップ２０５に進む。

ステップ２０５において、ＡＳＴアレイ保持器２３内の各試験ウェル２０のための病原菌総数のパーセンテージ変化が、過去の直近の期間にわたって計算される。ステップ２０５のいくつかのバージョンでは、期間は、前の１時間またはステップ１５５においてもたらされた期間であり得る。例えば、試験ウェル２０Ａ（図示せず）内の病原菌総数が、前の１時間にわたって１，０００匹の病原菌から１，２００匹の病原菌に増加する場合、ステップ２０５において計算されるパーセンテージ変化は、２０％である。このように、ＡＳＴアレイ保持器２３内の各試験ウェル２０は、計算され、その後、ステップ２０５は、ステップ２０７に進む。

ステップ２０７は、ステップ２０５において計算されたパーセンテージ変化と各試験ウェルのための現在の病原菌総数とを利用することによって、ＭＩＣを決定する。具体的には、ステップ２０７は、あるパーセント閾値未満のパーセンテージ変化と第２の総数閾値未満の病原菌総数との両方を含む試験ウェル２０を決定する。これらの２つの必要条件を満たす最も低い抗菌薬希釈物が、ＭＩＣであると決定される。第１の総数閾値に関して上で特に言及されるように、パーセンテージ閾値および／または第２の総数閾値は、静的パラメータであるか、試験の開始時にユーザによって入力され得るか、または、特定の病原菌に対してＩＤ蛍光光度計３３によって実施されたＩＤ試験の結果を反映するように動的に変更され得る。例えば、ステップ２０７のいくつかのバージョンでは、パーセント閾値は、１５％であり得、第２の総数閾値は、５，０００匹の病原菌であり得る。この例では、下記の表１に描写されるデータが、生物学的試験システム１によって収集される場合、ＭＩＣは、試験ウェル２０ｃ内で見出される０．５希釈物であろう。なぜなら、これが、両方の基準を満たす最も低い抗菌薬希釈物であるからである。すわなち、試験ウェル２０ｃの抗菌薬希釈物は、１５％未満のパーセンテージ変化と５，０００未満の病原菌総数との両方を含む最も低い試験希釈物である。試験ウェル２０ｂは、５，０００未満の病原菌総数を含むが、パーセンテージ変化は、１７％である。同様に、試験ウェル２０ａのパーセンテージ変化は、１２％であるが、病原菌総数は、６，５００である。試験ウェル２０ｄは、両方の基準を満たすが、抗菌剤希釈は、試験ウェル２０ｃを上回る。

ステップ２０７が両方の基準を満たす最も低い抗菌剤希釈物を決定すると、ステップ２０７は、ＭＩＣをステップ１６５に供給し、方法１０１Ａは、それに応じて、ＭＩＣ情報を記憶および報告するように進む。

図２４は、同様の要素が同様の特徴を有する方法１０１ｂと以降で称される例示的最適化ＡＳＴ方法１０１の別のバージョンを描写する。方法１０１Ａと同様に、方法１０１Ｂは、方法３０１として図２４に描写されるＭＩＣを決定するための例示的デジタル顕微鏡検査アルゴリズムを組み込む。方法３０１は、方法１０１のステップ１６１および１６３の代わりに実行され得る。方法３０１は、特に、メタロベータラクタマーゼに起因するカルバペネム耐性を伴うもの等の病原菌における耐性機構の発現が緩慢である場合に有用であり得る。耐性の発現が緩慢であるいくつかの病原菌は、視覚的に、４時間またはそれを上回るまで成長を開始するように見えない。しかしながら、感受性ＡＳＴカメラ３５は、存在する抗菌剤が導入された瞬間から成長におけるわずかな増加を評価することを可能にする。

方法３０１は、ステップ３０３から開始され、それによって、成長ウェルの病原菌総数が第１の総数閾値を上回るかどうかに関する決定が、行われる。方法２０１の第１の総数閾値で説明されるように、第１の総数閾値は、静的パラメータ、ユーザ入力パラメータであり得るか、または、病原菌に関するＩＤ試験の結果に基づいて動的に変更され得る。例えば、第１の総数閾値は、２０，０００であり得る。この例では、ステップ３０３は、成長ウェル総数が２０，０００未満であるという決定に応じて、ステップ１５５に戻るであろう。成長ウェル総数が２０，０００を上回る場合、ステップ３０３は、ステップ３０５に進む。

ステップ３０５は、各試験ウェルの病原菌総数を成長ウェルの病原菌総数と比較することによって、ＭＩＣを決定する。ＭＩＣは、成長ウェルの病原菌総数の総数パーセンテージ未満である病原菌総数に関連付けられる最も低い抗菌薬希釈物であると決定される。方法２０１の第１の総数閾値で説明されるように、総数パーセンテージパラメータは、静的パラメータ、ユーザ入力パラメータであり得るか、または、病原菌に関するＩＤ試験の結果に基づいて動的に変更され得る。例えば、総数パーセンテージは、成長ウェル総数の４％であり得、方法１０１Ｂは、下記の表２に描写されるデータを含み得る。このシナリオでは、試験ウェル２０ｃが、ＭＩＣである。なぜなら、これが、成長ウェル総数の４％未満である病原菌総数に関連付けられる最も低い抗菌薬希釈物であるからである。試験ウェル２０ｄも、基準を満たすが、試験ウェル２０ｃよりも高い希釈を有する。

ステップ３０５が基準を満たす最も低い抗菌薬希釈物を決定すると、ステップ３０５は、ＭＩＣをステップ１６５に供給し、方法１０１Ｂは、それに応じて、ＭＩＣ情報を記憶および報告するように進む。

方法２０１および／または方法３０１のいくつかのバージョンは、所与の抗菌剤に対するＭＩＣを決定することを補助するために、「面積合計」情報（図２０Ｂ）および「面積／総数比率」情報（図２０Ｃ）等の前述で議論された概念を組み込み得る。

（ＩＶ．結果のマッピング）

方法２０１および／または方法３０１のいくつかのバージョンは、所与の抗菌剤にのための具体的ＭＩＣを提供することなく抗菌剤治療を推奨することを可能にするために、結果のマッピングを組み込み得る。方法２０１および／または方法３０１のいくつかのバージョンでは、抗菌剤の希釈範囲は、切り捨てられる。例えば、１６または３２のＭＩＣは、「＞＝８」または（８以上）の結果にマッピングされ得る。この情報は、抗菌剤治療が具体的ＭＩＣを提供することなく進行することを可能にするであろう。

（Ｖ．病原菌耐性システムおよび方法の決定）

光学システム９から導出される成長パターン情報は、試験されている病原菌における耐性のいくつかの機構を検出するために、ｐＨの変化を測定する蛍光試験とも組み合わせられ得る。例として、蛍光試験基材のうちの１つは、抗菌剤であり得る。抗菌剤の分解は、接種後２時間以内に培地のｐＨの変化につながり、ｐＨ変化は、ｐＨの変化とともに蛍光を変化させる指示薬を用いて検出されることができる。抗菌剤が分解したという指示とともに、上で説明されるような成長パターン（細胞総数、面積、および面積／総数）に関する情報を組み合わせることは、病原菌に耐性があるかどうかを迅速に確認する方法を提供し、有機体のＭＩＣを決定することに役立つ。

例えば、抗生物質メロペネムは、クレブシエラ肺炎カルバペネマーゼ（ＫＰＣ）耐性機構を持つグラム陰性細菌等の病原菌によって酵素的に分解される。メロペネムが分解される場合、培地は、ｐＨにおいて低下する。蛍光ｐＨ指示薬であるＭＥＵ（メチルウンベリフェロン）は、その変化とともに蛍光において変化（減少）するであろう。この変化は、１～２時間以内に起こる。特定の病原菌がＩＤ試験を通して２時間以内に同定され、メロペネムを含む試験ウェルにのためのｐＨが１～２時間以内に変化し、成長パターンが上で説明される面積カウント方法を通して同定される場合、ＭＩＣは、１ｍｃｇ／ｍｌを上回り、微生物は、いくつかの抗生物質に耐性があると予測することができる。

（ＶＩ．例示的組み合わせ）

以下の実施例は、本明細書の教示が組み合わせられる、または適用され得る種々の非包括的方法に関する。以下の実施例は、本願の任意の時点で、または本願の後続出願において提示され得る任意の請求項の範囲を制限するように意図されないことを理解されたい。いかなる放棄も、意図されない。以下の実施例は、単に、例証目的としてしか提供されていない。本明細書の種々の教示は、多数の他の方法で配列および適用され得ることが考慮される。いくつかの変形例が下記の実施例において言及されるある特徴を省略し得ることも考慮される。したがって、下で言及される側面または特徴のいずれも、別様に明示的にそのように示されない限り、後日、本発明者によって、または本発明者の権利相続人によって、不可欠と見なされるべきではない。下で言及されるものを超える追加の特徴を含む任意の請求項が、本願に、または本願に関連する後続出願に提示される場合、それらの追加の特徴は、特許性に関連するいずれかの理由から追加されたと見なされないものとする。

実施例１

（ａ）混合物の未加工画像を捕捉することであって、混合物は、複数の病原菌と、抗菌剤とを含む、ことと、（ｂ）未加工画像を向上画像に向上させることと、（ｃ）向上画像に関連付けられた病原菌総数を決定することであって、病原菌総数は、向上画像内に描写された複数の病原菌における病原菌の数に基づく、こととを含む、方法。

実施例２

（ａ）未加工画像を向上させることに先立って、未加工画像内に描写された複数の病原菌における病原菌のサイズを決定することと、（ｂ）少なくとも部分的にサイズに基づいて、未加工画像を向上画像に向上させることとをさらに含む、実施例１または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例３

（ａ）向上画像のための閾値を決定することと、（ｂ）少なくとも部分的に閾値に基づいて、向上画像をセグメント化することとをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例４

（ａ）サイズからピクセル半径を導出することと、（ｂ）少なくとも部分的にピクセル半径に基づいて、未加工画像の勾配画像を生成することと、（ｃ）少なくとも部分的に勾配画像に基づいて、未加工画像を向上画像に向上させることとをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例５

（ａ）混合物の未加工画像を捕捉することであって、混合物は、複数の病原菌と、抗菌剤とを含む、ことと、（ｂ）未加工画像を向上画像に向上させることと、（ｃ）向上画像をセグメント化画像にセグメント化することと、（ｄ）セグメント化画像内に描写された病原菌の量をカウントすることとを含む、方法。

実施例６

向上画像のセグメント化に先立って、向上画像に雑音低減フィルタを適用することをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例７

（ａ）向上画像のための閾値を決定することと、（ｂ）少なくとも部分的に閾値に基づいて、向上画像をセグメント化することとをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例８

（ａ）未加工画像を向上させることに先立って、未加工画像内に描写された複数の病原菌における病原菌のサイズを決定することと、（ｂ）少なくとも部分的にサイズに基づいて、未加工画像を向上画像に向上させることとをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例９

（ａ）サイズからピクセル半径を導出することと、（ｂ）少なくとも部分的にピクセル半径に基づいて、未加工画像の勾配画像を生成することと、（ｃ）少なくとも部分的に勾配画像に基づいて、未加工画像を向上画像に向上させることとをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例１０

（ａ）試験濃度において抗菌剤を複数の病原菌に添加することと、（ｂ）少なくとも部分的にカウントされた病原菌の量に基づいて、試験濃度が複数の病原菌に対する抗菌剤の最小抑制濃度であるかどうかを決定することとをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例１１

（ａ）混合物を試験アレイにおける各試験ウェルの中に堆積させることであって、各試験ウェル内の混合物は、複数の病原菌と、異なる濃度の抗菌剤とを含む、ことと、（ｂ）各試験ウェル内の混合物の画像を捕捉することと、（ｃ）各画像内に描写された複数の病原菌の特性を収集することと、（ｄ）複数の病原菌に対する抗菌剤の最小抑制濃度を決定することであって、最小抑制濃度は、少なくとも部分的に特性に基づき、最小抑制濃度は、少なくとも部分的に各試験ウェルに関連付けられる抗菌剤の濃度に基づく、こととを含む、方法。

実施例１２

各画像内に描写された複数の病原菌の特性を収集することに先立って、画像を向上させることをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例１３

（ａ）画像を向上させることに先立って、画像内に描写された複数の病原菌における病原菌のサイズを決定することと、（ｂ）少なくとも部分的に病原菌のサイズに基づいて、画像を向上させることとをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例１４

（ａ）病原菌のサイズからピクセル半径を導出することと、（ｂ）少なくとも部分的にピクセル半径に基づいて、画像の勾配画像を生成することと、（ｃ）少なくとも部分的に勾配画像に基づいて、画像を向上画像に向上させることとをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例１５

各画像内に描写された複数の病原菌の特性を収集することに先立って、向上画像をセグメント化することをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例１６

向上画像のセグメント化に先立って、向上画像に雑音低減フィルタを適用することをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例１７

（ａ）向上画像のための閾値を決定することと、（ｂ）少なくとも部分的に閾値に基づいて、向上画像をセグメント化することとをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例１８

特性は、各画像内に描写された複数の病原菌における病原菌の量である、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例１９

特性は、各画像内に描写された複数の病原菌における病原菌のサイズである、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例２０

特性は、比率であり、比率は、少なくとも部分的に各画像内に描写された病原菌の量に基づき、比率は、少なくとも部分的に各画像内に描写された複数の病原菌における病原菌のサイズに基づく、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例２１

特性は、比率であり、比率は、少なくとも部分的に各画像内に描写された複数の病原菌における病原菌に関連付けられたピクセルの量に基づく、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例２２

（ａ）混合物を試験アレイにおける各試験ウェルの中に堆積させることであって、各試験ウェル内の混合物は、複数の病原菌と、異なる濃度の抗菌剤とを含む、ことと、（ｂ）各試験ウェル内の混合物の未加工画像を捕捉することと、（ｃ）未加工画像を最終画像に操作することと、（ｄ）各最終画像内の病原菌の量をカウントすることと、（ｅ）各最終画像内でカウントされた病原菌の量をデータセット内に記憶することであって、各最終画像内でカウントされた病原菌の量は、データセット内の試験ウェル内の抗菌剤の濃度に関連付けられている、ことと、（ｆ）ある期間にわたって待つことと、（ｇ）その期間後、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）を繰り返すことと、（ｈ）データセットに基づいて、複数の病原菌に対する抗菌剤の最小抑制濃度を決定することとを含む、方法。

実施例２３

未加工画像を向上画像に向上させることをさらに含み、最終画像は、少なくとも部分的に向上画像に基づく、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例２４

（ａ）未加工画像内に描写された複数の病原菌における病原菌のサイズを決定することと、（ｂ）少なくとも部分的に病原菌のサイズに基づいて、未加工画像を向上画像に向上させることとをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例２５

（ａ）病原菌のサイズからピクセル半径を導出することと、（ｂ）少なくとも部分的にピクセル半径に基づいて、未加工画像の勾配画像を生成することと、（ｃ）少なくとも部分的に勾配画像に基づいて、未加工画像を向上画像に向上させることとをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例２６

向上画像を最終画像にセグメント化することをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例２７

向上画像を最終画像にセグメント化することに先立って、向上画像に雑音低減フィルタを適用することをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例２８

（ａ）向上画像のための閾値を決定することと、（ｂ）少なくとも部分的に閾値に基づいて、向上画像を最終画像にセグメント化することとをさらに含む、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例２９

（ａ）培養器システムであって、培養器システムは、ある期間にわたって試験ウェル内に配置された混合物を培養するように構成され、混合物は、複数の病原菌と、抗菌剤とを含む、培養器システムと、（ｂ）光学システムであって、光学システムは、（ｉ）ステージであって、ステージは、その期間にわたって培養器システム内で培養した後、試験ウェルを選択的に受け取るように構成されている、ステージと、（ｉｉ）カメラであって、カメラは、ステージ上の試験ウェル内に配置された混合物の未加工画像を捕捉するように構成されている、カメラとを備えている、光学システムと、（ｃ）培養器システムと光学システムとの間で試験ウェルを移動させるように構成された移動システムと、（ｄ）データベースであって、未加工画像は、データベース内に記憶される、データベースと、（ｅ）プロセッサであって、（ｉ）未加工画像を最終画像に操作することと、（ｉｉ）最終画像から混合物の特性を収集することと、（ｉｉｉ）特性に基づいて、複数の病原菌に対する抗菌剤の最小抑制濃度を決定することとを行うように構成されている、プロセッサとを備えている、生物学的試験システム。

実施例３０

ステージは、第１の方向および第２の方向に移動可能である、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例３１

ステージは、第３の方向に移動可能である、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例３２

特性は、最終画像内に描写された複数の病原菌における病原菌の量である、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例３３

特性は、最終画像内に描写された複数の病原菌における病原菌のサイズである、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例３４

特性は、比率であり、比率は、少なくとも部分的に最終画像内に描写された病原菌の量に基づき、比率は、少なくとも部分的に最終画像内に描写された複数の病原菌における病原菌のサイズに基づく、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

実施例３５

特性は、比率であり、比率は、少なくとも部分的に最終画像内に描写された複数の病原菌における病原菌に関連付けられたピクセルの量に基づく、前述または後述の実施例のいずれかに記載の方法。

（ＶＩＩ．雑則）

本明細書に説明される実施例のうちのいずれかは、上で説明されるものに加えて、またはその代わりに、種々の他の特徴を含み得ることを理解されたい。実施例にすぎないが、本明細書に説明される実施例のうちのいずれかは、参照することによって本明細書に組み込まれる種々の参考文献のうちのいずれかに開示される種々の特徴のうちの１つ以上のものも含み得る。

本明細書に説明される教示、表現、実施形態、実施例等のうちのいずれか１つ以上のものは、本明細書に説明される他の教示、表現、実施形態、実施例等のうちのいずれか１つ以上のものと組み合わせられ得ることを理解されたい。上で説明される教示、表現、実施形態、実施例等は、したがって、互いに対して孤立して見なされるべきではない。本明細書の教示が組み合わせられ得る種々の好適な方法が、本明細書の教示に照らして当業者に容易に明白となるであろう。そのような修正および変形例は、請求項の範囲内に含まれることが意図される。

参照することによって本明細書に組み込まれると考えられる任意の特許、刊行物、または他の開示資料が、全体または部分的に、組み込まれる資料が本開示に記載される既存の定義、文言、または他の開示資料と矛盾しない範囲においてのみ本明細書に組み込まれることを理解されたい。したがって、必要な範囲で、本明細書に明示的に記載されるような開示は、参照することによって本明細書に組み込まれる任意の矛盾する資料に優先する。参照することによって本明細書に組み込まれると考えられるが、本明細書に記載される既存の定義、文言、または他の開示資料と矛盾する任意の資料もしくはその一部は、その組み込まれる資料と既存の開示資料との間にいかなる矛盾も生じない範囲においてのみ組み込まれるであろう。

本発明の種々のバージョンを示し、説明したが、本明細書に説明される方法およびシステムのさらなる適合が、本発明の範囲から逸脱することなく、当業者による適切な修正によって遂行され得る。そのような潜在的修正のうちのいくつかが、言及され、その他は、当業者に明白となるであろう。例えば、上で議論される実施例、バージョン、幾何学形状、材料、寸法、比率、ステップ等は、例証的であり、要求されない。故に、本発明の範囲は、以下の請求項の観点から考慮されるべきであり、本明細書および図面に示され、説明される構造ならびに動作の詳細に限定されないように理解される。

Claims (23)

1. 方法であって、前記方法は、
   （ａ）混合物の未加工画像を捕捉することであって、前記混合物は、複数の病原菌と、抗菌剤とを含む、ことと、
   （ｂ）前記未加工画像を向上画像に向上させることと、
   （ｃ）前記向上画像に関連付けられた病原菌総数を決定することと
   を含み、
   前記病原菌総数は、前記向上画像内に描写された前記複数の病原菌における病原菌の数に基づいており、前記方法は、
   （ｉ）前記未加工画像を向上させることに先立って、前記未加工画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌のサイズを決定することと、
   （ｉｉ）前記病原菌の前記サイズからピクセル半径を導出することと、
   （ｉｉｉ）前記ピクセル半径に少なくとも部分的に基づいて、前記未加工画像の勾配画像を生成することと、
   （ｉｖ）前記勾配画像に少なくとも部分的に基づいて、前記未加工画像を前記向上画像に向上させることと
   をさらに含む、方法。
2. （ａ）前記向上画像のための閾値を決定することと、
   （ｂ）前記閾値に少なくとも部分的に基づいて、前記向上画像をセグメント化することと
   をさらに含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記向上画像の前記セグメント化に先立って、前記向上画像に雑音低減フィルタを適用することをさらに含む、請求項２に記載の方法。
4. 試験濃度において前記抗菌剤を前記複数の病原菌に添加することと、
   前記カウントされた病原菌の量に少なくとも部分的に基づいて、前記試験濃度が前記複数の病原菌に対する前記抗菌剤の最小抑制濃度であるかどうかを決定することと
   をさらに含む、請求項１～３のうちのいずれかに記載の方法。
5. 方法であって、前記方法は、
   （ａ）混合物を試験アレイにおける各試験ウェルの中に堆積させることであって、各試験ウェル内の前記混合物は、複数の病原菌と、異なる濃度の抗菌剤とを含む、ことと、
   （ｂ）各試験ウェル内の前記混合物の画像を捕捉することと、
   （ｃ）各画像内に描写された前記複数の病原菌の特性を収集することと、
   （ｄ）前記複数の病原菌に対する前記抗菌剤の最小抑制濃度を決定することと
   を含み、
   前記最小抑制濃度は、前記特性に少なくとも部分的に基づいており、前記最小抑制濃度は、各試験ウェルに関連付けられる前記抗菌剤の前記濃度に少なくとも部分的に基づいており、前記方法は、各画像内に描写された前記複数の病原菌の前記特性を収集することに先立って、前記画像を向上画像に向上させることと、
   （ｉ）前記画像を向上させることに先立って、前記画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌のサイズを決定すること、
   （ｉｉ）前記病原菌の前記サイズからピクセル半径を導出すること、
   （ｉｉｉ）前記ピクセル半径に少なくとも部分的に基づいて、前記画像の勾配画像を生成すること、および
   （ｉｖ）前記勾配画像に少なくとも部分的に基づいて、前記画像を前記向上画像に向上させることと
   をさらに含む、方法。
6. 各画像内に描写された前記複数の病原菌の前記特性を収集することに先立って、前記向上画像をセグメント化することをさらに含む、請求項５に記載の方法。
7. 前記向上画像の前記セグメント化に先立って、前記向上画像に雑音低減フィルタを適用することをさらに含む、請求項６に記載の方法。
8. （ａ）前記向上画像のための閾値を決定することと、
   （ｂ）前記閾値に少なくとも部分的に基づいて、前記向上画像をセグメント化することと
   をさらに含む、請求項７に記載の方法。
9. 前記特性は、各画像内に描写された前記複数の病原菌における病原菌の量である、請求項５に記載の方法。
10. 前記特性は、各画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌のサイズである、請求項５に記載の方法。
11. 前記特性は、比率であり、前記比率は、各画像内に描写された病原菌の量に少なくとも部分的に基づいており、前記比率は、各画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌の前記サイズに少なくとも部分的に基づいている、請求項５に記載の方法。
12. 前記特性は、比率であり、前記比率は、各画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌に関連付けられたピクセルの量に少なくとも部分的に基づいている、請求項５に記載の方法。
13. 方法であって、前記方法は、
    混合物を試験アレイにおける各試験ウェルの中に堆積させることであって、各試験ウェル内の前記混合物は、複数の病原菌と、異なる濃度の抗菌剤とを含む、ことと、
    （ｂ）各試験ウェル内の前記混合物の未加工画像を捕捉することと、
    （ｃ）前記未加工画像を最終画像に操作することと、
    （ｄ）各最終画像内の病原菌の量をカウントすることと、
    （ｅ）各最終画像内でカウントされた前記病原菌の量をデータセット内に記憶することであって、各最終画像内でカウントされた前記病原菌の量は、前記データセット内の前記試験ウェル内の前記抗菌剤の前記濃度に関連付けられている、ことと、
    （ｆ）ある期間にわたって待つことと、
    （ｇ）前記期間後、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、および（ｅ）を繰り返すことと、
    （ｈ）前記データセットに基づいて、前記複数の病原菌に対する前記抗菌剤の最小抑制濃度を決定することと
    を含み、前記方法は、前記未加工画像を向上画像に向上させることをさらに含み、前記最終画像は、前記向上画像に少なくとも部分的に基づいている、ことと、
    前記未加工画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌のサイズを決定することと、
    前記病原菌の前記サイズからピクセル半径を導出することと、
    前記ピクセル半径に少なくとも部分的に基づいて、前記未加工画像の勾配画像を生成することと、
    前記勾配画像に少なくとも部分的に基づいて、前記未加工画像を前記向上画像に向上させることと
    をさらに含む、方法。
14. 前記向上画像を前記最終画像にセグメント化することをさらに含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記向上画像を前記最終画像にセグメント化することに先立って、前記向上画像に雑音低減フィルタを適用することをさらに含む、請求項１４に記載の方法。
16. （ａ）前記向上画像のための閾値を決定することと、
    （ｂ）前記閾値に少なくとも部分的に基づいて、前記向上画像を前記最終画像にセグメント化することと
    をさらに含む、請求項１４に記載の方法。
17. 生物学的試験システムであって、前記生物学的試験システムは、
    （ａ）培養器システムであって、前記培養器システムは、ある期間にわたって試験ウェル内に配置された混合物を培養するように構成され、前記混合物は、複数の病原菌と、抗菌剤とを含む、培養器システムと、
    （ｂ）光学システムであって、前記光学システムは、
    （ｉ）ステージであって、前記ステージは、前記期間にわたって前記培養器システム内で培養した後、前記試験ウェルを選択的に受け取るように構成されている、ステージと、
    （ｉｉ）カメラであって、前記カメラは、前記ステージ上の前記試験ウェル内に配置された前記混合物の未加工画像を捕捉するように構成されている、カメラと
    を備えている、光学システムと、
    （ｃ）前記培養器システムと前記光学システムとの間で前記試験ウェルを移動させるように構成された移動システムと、
    （ｄ）データベースであって、前記未加工画像は、前記データベース内に記憶される、データベースと、
    （ｅ）プロセッサと
    を備え、
    前記プロセッサは、
    （ｉ）前記未加工画像を最終画像に操作することと、
    （ｉｉ）前記最終画像から前記混合物の特性を収集することと、
    （ｉｉｉ）前記特性に基づいて、前記複数の病原菌に対する前記抗菌剤の最小抑制濃度を決定することと
    を行うように構成されており、前記プロセッサは、前記未加工画像を向上画像に向上させるようにさらに構成されており、前記最終画像は、前記向上画像に少なくとも部分的に基づいており、前記プロセッサは、
    前記未加工画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌のサイズを決定することと、
    前記病原菌の前記サイズからピクセル半径を導出することと、
    前記ピクセル半径に少なくとも部分的に基づいて、前記未加工画像の勾配画像を生成することと、
    前記勾配画像に少なくとも部分的に基づいて、前記未加工画像を前記向上画像に向上させることと
    を行うようにさらに構成されている、生物学的試験システム。
18. 前記ステージは、第１の方向および第２の方向に移動可能である、請求項１７に記載の生物学的試験システム。
19. 前記ステージは、第３の方向に移動可能である、請求項１８に記載の生物学的試験システム。
20. 前記特性は、前記最終画像内に描写された前記複数の病原菌における病原菌の量である、請求項１７に記載の生物学的試験システム。
21. 前記特性は、前記最終画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌のサイズである、請求項１７に記載の生物学的試験システム
22. 前記特性は、比率であり、前記比率は、前記最終画像内に描写された病原菌の量に少なくとも部分的に基づいており、前記比率は、前記最終画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌の前記サイズに少なくとも部分的に基づいている、請求項１７に記載の生物学的試験システム
23. 前記特性は、比率であり、前記比率は、前記最終画像内に描写された前記複数の病原菌における前記病原菌に関連付けられたピクセルの量に少なくとも部分的に基づいている、請求項１７に記載の生物学的試験システム。

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