JP7148530B2 - 核の機械的シグネチャに基づく細胞分類 - Google Patents

Description

［関連出願の相互参照］
本出願は、２０１７年３月１日に出願された米国仮特許出願第６２／４６５，２３０号の恩典を主張し、この特許出願は、引用することによりその全体が本明細書の一部をなす。

本発明は、核の機械的シグネチャに基づいて細胞を分類する方法及びシステムに関する。具体的には、本発明による方法及びシステムは、ブリルアン技術により可能となったラベルフリーサイトメトリーを使用して取得される細胞核の機械的シグネチャに基づく。その分類は、細胞集団又は単一細胞のいずれかに基づいて達成され得る。本発明はさらに、細胞核の機械的シグネチャに基づいてサンプル内の癌性細胞を特定する方法及びシステムに関する。さらに、本出願は、細胞核の機械的シグネチャに基づいて癌の進行を測定する方法及びシステムを提供する。

細胞分類は、異なる細胞型又は同じ細胞型の異なる時期を細胞特性に従って区別する必要性に起因する。細胞形態及び表現型の明確な特徴は通常、細胞の分類に使用されるが、それは類似の形態又は表現型を有する細胞の場合にはうまくいかない。したがって、細胞分類のための補足的アプローチとして様々なバイオマーカーが発見されてきた。それらの中でも、細胞力学は、多種多様な用途のための有望なバイオマーカーである。

細胞力学は、増殖、遊走、及び遺伝子発現等のその生物学的機能及び活性と密接に関連することが知られている（非特許文献１、非特許文献２）。例えば、細胞が前進する必要がある場合に、細胞体内に収縮力が発生する（非特許文献３）。血管内のせん断流への応答として、ヒト内皮細胞は、せん断応力調節性遺伝子の発現を大きく変えることとなる（非特許文献４）。臨床的には、癌関連死の９０％より多くが、非常に悪性で転移性の癌細胞を原因とすることが示されている（非特許文献５）。遺伝的要因及び外環境的要因に加えて、癌細胞の生体力学は、その活性の主要な決定要因である。様々な生物物理的測定から、癌細胞が正常細胞及び良性細胞よりも軟質であること、そしてこの細胞伸展性が転移能の増加と相関することが一貫して見られる（非特許文献６、非特許文献７）。この相関は、３Ｄマトリックスを通じて効率的に遊走し、及び／又は転移の間に内皮を貫通するために必要とされる癌細胞の最適な機械的特性によるものと考えられる。したがって、細胞の剛性は、癌の進行をグレード分けする固有のバイオマーカーとなり得ることを強く指摘している。近年には、細胞メカノバイオロジーの重要な関心事項として核が浮上している（非特許文献８、非特許文献９、非特許文献１０、非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。力に誘発される核形状の変化は、核内の遺伝物質の大規模な再編をもたらし得る（非特許文献８）。核の剛性の変化は、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群等の疾患と関連している（非特許文献９）。細胞内の最大の最も剛性が高い細胞小器官として、核は細胞遊走のための主たる物理的障壁を授ける（非特許文献１０）。組織を通じて遊走する細胞の場合には、核は、細胞骨格動態と協調して位置、形状及び剛性において複雑な変化を遂げるはずである（非特許文献１１、非特許文献１２、非特許文献１３、非特許文献１４、非特許文献１５）。したがって、核の機械的特性は、それらが細胞機能と密接に関連し、細胞の分類に有用な生物物理学的シグネチャを提供し得るため、非常に関心が持たれている。

これまでの２０年間で、細胞の機械的特性（例えば、弾性及び粘性）を調査するための方法、例えばマイクロピペット吸引（非特許文献１６）、光ピンセット（非特許文献１７）、光ストレッチャー（非特許文献７、非特許文献１８）、変形能サイトメトリー（deformability cytometry）（非特許文献１９）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）（非特許文献２０）、磁気ツイスティングサイトメトリー（非特許文献２１）、及びマイクロレオロジー（非特許文献２２）を開発するために多くの努力がなされてきた。しかしながら、既存の方法の殆どは、全細胞の機械的特性の平均的な測定をもたらすにすぎず、直接的に核を評価することはできない。目下、核の機械的特性を導き出すには、細胞内に力がどのように伝わるかについての追加の情報及び仮定に加えて染色が必要とされた。初期状態の機械的情報のために、ＡＦＭ又はマイクロピペット測定（非特許文献２３）を可能にするために核を単離する必要があり、それは、核を自然の環境から単離するため、侵襲的であるだけでなく、測定値を偏らせる場合もある。

ブリルアン散乱は、物質の音響フォノンによって誘発される非弾性光散乱現象である。弾性的に散乱した光から小さな（通常、ＧＨｚオーダーの）ブリルアン周波数シフトを分離するために、従来のブリルアン分光法では一般に、マルチパス走査型ファブリ－ペロー干渉計のような高分解能分光計が使用される（非特許文献２４）。音響フォノンの動態は物質の粘弾性特性に直接結び付けられるので、散乱光のブリルアン周波数シフトを測定することによって、機械的情報を取得することができる（非特許文献２５）。しかしながら、この方法は、スペクトルを逐点走査することに起因して、かなりの時間を要する。さらに、スループット効率はエタロンのフィネスに制限される。このボトルネックは、大きな角分散を生成することができ（非特許文献２６）、高いスループットを有するＣＣＤカメラによって全てのスペクトル成分を同時に測定できるようにする仮想画像化フェーズドアレイ（ＶＩＰＡ：virtually imaged phased array）を使用することによって克服された。このタイプの分光計を使用して、生物組織内のレーザー走査共焦点ブリルアン顕微鏡法が低い照明電力及び短い積分時間において実行され、その方法では、サンプル内の各点が順次に照明される。ブリルアンに基づく弾性マップを作成するために、ブリルアンスペクトルが分析された（非特許文献２７及び非特許文献２８）。

ブリルアン分光法は、サンプル内の音響的に誘発された光散乱の周波数スペクトルを測定することによって、機械的特性を非侵襲的に測定することが可能なものである。サブミクロン分解能におけるブリルアン顕微鏡法は、細胞の物理化学的特性の測定を可能にした（非特許文献２９）。実際に、細胞の機械的特性は、数多くの細胞機能、例えば、増殖、遊走、遺伝子発現だけでなく、組織レベルの挙動、例えば、組織形態形成、転移及び血管形成も決定的に制御する。結果として、「機械的フェノタイピング（mechanical phenotyping）」、すなわち、その機械的特性に基づいて細胞を分類する能力が、細胞状態及び生理学的／病理学的条件を特徴付ける強力な手法として現れた。例えば、細胞剛性（cell stiffness）の減少が、転移能の向上と相関することがわかっており、それゆえ、腫瘍の検出及び病期分類のための新規のラベルフリーマーカーとして提案されてきた（非特許文献３０及び非特許文献６。）

関連出願において、ブリルアン光散乱に基づくラベルフリーサイトメトリーのシステム及び方法が提供されており、それにより核の機械的特性をサブミクロン分解能で直接的に調査可能であることを実証するのに成功した（非特許文献３１）。この方法は、光ビームを使用して、散乱光のブリルアン周波数シフトを測定することによってサンプルの機械的情報を検知するため、本質的に非接触、非侵襲的、かつラベルフリーである（非特許文献２５、非特許文献２７、非特許文献２９）。

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本発明は、ブリルアン光散乱技術に基づくラベルフリー細胞分析によって細胞核の機械的特性を特定する方法及びシステムに関する。本出願はさらに、細胞核の機械的特性に基づいて癌性細胞を特定する方法及びシステムを提供する。

本発明の一態様において、サンプル内の複数の点においてブリルアン散乱スペクトルに関連付けられる１つ以上のブリルアン指標を同時に取得する方法であって、少なくとも１つの点は細胞の核内にある、方法が提供される。具体的には、サンプルは、第１の方向に沿って光ビームによって照明される。照明光ビームに応答してサンプルから放射されるブリルアン散乱光が収集され、スペクトル分散を誘発する光学配置に送られ、その後、検出ユニットに送られる。光学配置及び検出ユニットは、第１の方向とは異なる第２の方向に沿って位置決めされる。照明光ビームに沿ったサンプルの複数の点が同時に測定されるように、ブリルアン散乱光の空間スペクトルパターンが検出ユニット上で検出される。次に、検出ユニットにおいて各空間点における空間スペクトルパターンが較正される。最終ステップにおいて、検出された空間スペクトルパターンに基づいて、各測定サンプル点において１つ以上のブリルアン指標が計算される。一実施の形態において、ブリルアン指標は、核の少なくとも１つの機械的特性に関する情報を提供する。

本発明の更に別の態様において、サンプル内の複数の点においてブリルアン散乱スペクトルに関連付けられる１つ以上のブリルアン指標を同時に取得するシステムが提供され、少なくとも１つの点は、細胞の核内にある。具体的には、サンプルは、光源によって与えられる光ビームによって第１の方向に沿って照明される。１つ以上のレンズが、照明光ビームに応答してサンプルから放射されるブリルアン散乱光を収集し、ブリルアン散乱光を、スペクトル分散を誘発する光学配置に導光し、その後、検出ユニットに導光する。光学配置、１つ以上のレンズ及び検出ユニットは、第１の方向とは異なる第２の方向に沿って位置決めされる。照明光ビームに沿ったサンプルの複数の点が同時に測定されるように、ブリルアン散乱光の空間スペクトルパターンが検出ユニット上で検出される。検出ユニットと通信するプロセッサが、ＶＩＰＡにおける角分散を考慮に入れるように、各空間点における空間スペクトルパターンを較正する。さらに、プロセッサは、検出された空間スペクトルパターンに基づいて、各測定サンプル点において１つ以上のブリルアン指標を計算する。一実施の形態において、ブリルアン指標は、ブリルアン周波数シフト、ブリルアンスペクトル線幅、ブリルアン利得又は損失スペクトル、及びその組み合わせからなる群から選択される。更に別の実施の形態において、サンプルの物理的特性は、粘弾性率、密度、屈折率、電歪、及びその組み合わせからなる群から選択される。

本発明の更に別の態様において、生体細胞を分類する方法及びシステムが提供される。そのシステムは、媒質内に生体細胞を含む生体サンプルを有する容器を含む。次に、生体サンプルが光源によって照明され、生体細胞及び媒質内からブリルアン散乱光が生成される。プロセッサが、各生体細胞内の複数の点においてブリルアン散乱スペクトルを計算する。測定されたブリルアン散乱スペクトルに基づいて、プロセッサによって、生体細胞内の異なる空間点における細胞内物理的特性に関連する１つ以上のブリルアン指標が計算される。さらに、プロセッサは、生体細胞内の異なる空間点における物理的特性に基づいて、生体細胞を分類する。一実施の形態において、細胞内物理的特性に関連する指標はブリルアン周波数シフトである。プロセッサは、生体細胞内の各測定点を含むブリルアン周波数シフトに関するヒストグラムを生成するように更に構成される。ヒストグラムを当てはめるために、プロセッサによって、ガウス分布の線形重ね合わせが適用される。次に、プロセッサはヒストグラム内の各ピークを特定し、ピークは、細胞内の異なる領域からの機械的シグネチャを表す。生体細胞内の異なる空間点における物理的特性は、特定された機械的シグネチャと相関がある。

本発明の更に別の態様において、核の機械的特性は、癌性である細胞をサンプル内で特定するために使用され得る。

本明細書に組み込まれ、明細書の一部を形成する添付の図面は、本開示の主題に関する種々の実施形態を示す。図面において、同じ参照符号は、同一の、又は機能的に類似の要素を示す。

逐点走査モードのためのブリルアン分光法構成を示す図である。 本発明の一実施形態による、多重化走査モードのためのブリルアン分光法構成を示す図である。 本発明の別の実施形態による、多重化走査モードのためのブリルアン分光法構成を示す図である。 図４ａ、図４ｂ、図４ｃ、図４ｄおよび図４ｅは、図２の構成を使用することによって取得されるスペクトルパターンの原画像を示す図であり、図４ｆは、図４ａ～図４ｅに関連付けられる測定値に関する空間分解能の特性評価を例示する図であり、正方形が測定データを表し、青線が直線当てはめデータを表す。 マイクロ流体チャネルを通って流れる２つの異なる液体に関連付けられるブリルアン周波数を例示する図である。 本発明による多重化ブリルアン分光法と、従来の逐点ブリルアン分光法との間の信号対雑音比（ＳＮＲ）の比較を示す図である。 本発明の一実施形態による、多重化走査モードのためのブリルアン分光法構成を示す図である。 図７の構成を使用することによって取得された空間領域内の単一のピクセルにおける推定ブリルアン周波数シフトの精度の特性評価を例示する図であり、 図８ａは、カメラによって取り込まれた元の分散パターンを例示する図、図８ｂは、単一の点におけるスペクトルパターンを例示する図、図８ｃは、ＳＮＲ対照明エネルギーの対数プロットを例示する図、図８ｄは、時間トレースデータの推定ブリルアン周波数の分布を例示する図である。 図７に従って取得された測定値に関する空間分解能の特性評価を例示する図であり、正方形は測定データを表し、赤線は直線当てはめデータを表す。 図１０ａは、キュベット内のポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）レンズの写真を例示する図であり、その写真はキュベットを屈折率整合液で満たす前に撮影されており、図１０ｂは、カメラによって取得されたブリルアンスペクトルパターンのスナップショットを例示する図であり、図１０ｃは、屈折率整合液のブリルアンスペクトルを例示する図であり、点及び実曲線はそれぞれ、測定データ及び当てはめデータを表し、図１０ｄは、ＰＭＭＡレンズのブリルアンスペクトルを例示する図である。 ＰＭＭＡレンズの２Ｄ及び３Ｄブリルアン画像を例示する図であり、図１１ａは、図７による構成によって走査されたＰＭＭＡレンズの断面を例示する図であり、図１１ｂは、図１０ａに点線によって示される場所におけるＰＭＭＡレンズの断面ブリルアン画像を例示する図であり、図１１ｃは、ＰＭＭＡレンズの３Ｄ走査の図解を例示する図であり、図１１ｄは、ＰＭＭＡレンズの３Ｄブリルアン結像を例示する図であり、各スライスは、ｚ軸に沿った場所におけるＰＭＭＡレンズの断面画像を表す。 本発明の一実施形態による、逐点走査モードのためのブリルアン分光法構成を示す図である。 図１２によるブリルアン分光法構成に関連付けられる制御インターフェースのスナップショットを示す図である。 図１４ａ、図１４ｂおよび図１４ｃは、異なる時点におけるブリルアン信号及び明視野像の両方のスナップショットを例示する図であり、図１４ｄ、図１４ｅおよび図１４ｆは、図１４ａの未処理のブリルアン信号から計算されたブリルアン周波数の時間トレースである。 図１５ａおよび図１５ｂは、ブリルアン周波数に及ぼすシースフローの影響を示す図である。 本発明による、流動する細胞をレーザービームの合焦スポットに位置合わせする原理を示す図である。 図１７ａ、図１７ｂおよび図１７ｃは、図１２によるブリルアン分光法構成を使用することによって実施される細胞スペクトル分析を示す図である。 図１８ａは、図１２によるブリルアン分光法構成を使用することによって取得された測定値から生じる細胞スペクトル分析を示す図であり、図１８ｂは、２Ｄブリルアン細胞画像から生じるスペクトル分析を示す図である。 図１９ａは、同じ細胞の明視野画像を示す図であり、図１９ｂは、同じ細胞の蛍光画像を示す図であり、図１９ｄは、同じ細胞のブリルアン画像を示す図であり、図１９ｃは、図１９ａの明視野画像及び図１９ｂの蛍光画像を融合した画像を示す図であり、図１９ｅは、図１９ｃの画像に基づいて一緒にプロットされた細胞核及び細胞質両方のヒストグラムを示す図である。 図２０ａ、図２０ｂ、図２０ｃ、図２０ｄおよび図２０ｅは、細胞核に及ぼすサイトカラシンＤ（Cytochalasyn D）の影響を示す細胞スペクトル分析を示す図である。 本発明の別の実施形態による、逐点走査モードのためのブリルアン分光法構成を示す図である。 図２１のブリルアン分光法構成によって取得された細胞画像を示す図であり、画像内の各点は細胞内の或る特定の領域において取り込まれた１つの測定値を表し、異なる濃淡はデータ点の相対密度を符号化する。 図２１のブリルアン分光法構成によって取得された、細胞核に及ぼすサイトカラシンＤの影響を示す図である。 図７のブリルアン分光法構成を使用することによって２Ｄ画像を取得する概念図である。 ルビジウムガスを含むガスチャンバーの測定された吸収スペクトルを例示する図である。 本発明の別の実施形態（例４において使用される）による、逐点走査モードのためのブリルアン分光法構成を示す図である。 図２７ａ、図２７ｂおよび図２７ｃは、異なる時点においてマイクロ流体チャネルを通って流れる細胞のスナップショットであり、スケールバーは３０μｍであり、図２７ｄは、対応するブリルアン信号の時間トレースを例示する図であり、点は測定データを表し、実線は見やすくするために引いた線である。 図２８ａは、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）及び細胞の両方のシグネチャを含む元のデータを例示する図であり、図２８ｂは、ＰＢＳ自体のシグネチャを例示する図であり、図２８ｃは、細胞のシグネチャを例示する図である。 図２９ａは、細胞集団（２９個の細胞）の２Ｄ画像を例示する図であり、図２９ｂは、２Ｄ画像からのデータ点の分布を示す図であり、図２９ｃは、細胞内の複数の点においてブリルアン周波数を取得することに基づく流動実験からのデータ点の分布を示す図である。 細胞の蛍光画像によって検証される細胞のブリルアンシグネチャを例示する図であり、ヒストグラムはそれぞれ細胞核及び細胞質からのブリルアンシグネチャを表し、挿入写真は、（ｉ）明視野画像、（ｉｉ）蛍光画像、（ｉｉｉ）（ｉ）及び（ｉｉ）の融合画像、（ｉｖ）ブリルアン画像である。 図３１ａ、図３１ｂおよび図３１ｃは、クロマチン脱凝縮による細胞核の軟化の実験的観測を例示する図である。 本発明の一実施形態によるシステムを示すブロック図である。 図３３Ａおよび図３３Ｂは、本発明の第１の実施形態の例示的な結果を示す図である。アクチンフィラメントの阻害が、核を軟化させることが示されている。その代わりに、微小管フィラメントの阻害は、核を硬化させることとなる。 本発明の第２の実施形態の例示的な結果を示す図である。核機構を癌の進行のグレード分けに使用し得ることが示されている。 本発明の第３の実施形態の例示的な結果を示す図である。ラミンＡ／Ｃノックダウンサンプルにおいては、細胞質特性は不変であるが、核の剛性は大幅により低い。 図３６Ａおよび図３６Ｂは、同一のパラメーターを使用して撮影された蛍光画像の例示的な結果を示す図である。ノックダウンサンプルにおいて、ラミンＡ／Ｃ発現は、はるかにより低いことが示されている。

本発明は幾つかの実施形態を有し、当該技術分野において既知の細部に関しては種々の特許、特許出願及び他の参考文献に頼る。それゆえ、本明細書において或る特許、特許出願又は他の参考文献が引用されるか、又は繰り返されるとき、その特許、特許出願又は他の参考文献は、あらゆる目的のために、そして説明される提案のために、引用することによりその全体が本明細書の一部をなすことは理解されたい。

本発明は、ブリルアン分光法に基づくラベルフリー細胞分析の方法及びシステムに関する。細胞サンプルから放射されるブリルアン散乱光によって、サンプルを特徴付ける物理的情報を取得できるようになる。本発明の一態様では、これを果たすために、サンプルが第１の方向に沿って光ビームによって照明され、サンプルによって放射されたブリルアン散乱光が第２の方向に沿って収集され、検出される。第１の方向に沿ったサンプルの複数の位置を同時に測定することができ、それにより、測定スループットを実効的に改善することができる。さらに、ブリルアンスペクトルから取得された細胞内情報に基づいて、サンプル内の生体細胞を分類することができる。

等方性物質のブリルアン周波数シフトｆ_ｂは以下のように表すことができる。

ただし、ｎは物質の屈折率であり、λはレーザーの波長であり、

は音響速度であり、Ｅは弾性率であり、ρは密度であり、θは散乱角（ここでは、θ＝９０度）である。

サンプル内の複数の点におけるブリルアン散乱スペクトルに関連付けられる１つ以上の指標を測定することによって、測定サンプルの機械的及び／又は物理的特性を直接読み出すことができる。一実施形態において、指標としてブリルアン周波数シフトが使用される。サンプルの機械的及び／又は物理的特性は、粘弾性率、密度、屈折率及び電歪を含むことができる。測定サンプルの機械的及び／又は物理的特性を特定するために、ブリルアンスペクトル線幅、ブリルアン利得又は損失スペクトル及びその組み合わせ等の他の指標を使用することができる。

図１は、マイクロ流体チャネル１１１とともにエピ検出を用いる逐点走査モードのためのブリルアン分光法構成を例示する。具体的には、到来するレーザービーム１１０が、最初に、ビームスプリッター１１３によって導光され、その後、対物レンズ１１２によってマイクロ流体チャネル１１１上に合焦する。励起されたブリルアン散乱光が、同じ対物レンズ１１２によって収集され、ビームスプリッター１１３及びミラー１１４によってコリメーター１１５に導光される。コリメーター１１５に後続するコリメートされたビームは、最初に、円柱レンズ１１６によって合焦し、その後、ＶＩＰＡ１１７に送り込まれる。到来する散乱光の異なるスペクトル成分がＶＩＰＡ１１７によって空間分離され、球面レンズ１１８によって合焦し、スペクトルパターンが生成される。スペクトルパターンは、その後、球面レンズ１１９によって検出ユニット１２０上に結像される。一例として、検出ユニット１２０はカメラとすることができる。幾つかの実施形態において、球面レンズ１１９は不要な場合があり、その場合、カメラ１２０は、球面レンズ１１８の前方焦点面に直接配置することができる。マイクロ流体チャネル１１１の中にサンプルが流されるとき、そのブリルアンシグネチャを識別し、その固有の物理的特性に相関させることができる。したがって、各時点において、対物レンズ１１２の焦点面において１つの点しか測定することができないので、結像のために逐点走査が必要とされる。

図２は、マイクロ流体チップとともに多重化ブリルアン分光法を用いる本発明の一実施形態に関連する。具体的には、到来する照明光ビーム２１０が対物レンズ２１１によって再整形され、サンプルを有するマイクロ流体チップ２１２内にペンシルビームが生成される。検出ユニット２２７に通じる検出経路（ｘ方向に沿っている）は、照明経路（ｙ方向に沿っている）に直交する。一例として、検出ユニット２２７はカメラとすることができる。チップ２１２内に生成される散乱光は、最初に、第２の対物レンズ２２０によって収集され、チューブレンズ２２１の焦点面において中間像が生成される。一実施形態において、中間像面内に空間フィルター又はアパーチャ２２８が位置決めされ、サンプルから到来する焦点外の光が除去される。中間像がその後方焦点面上にあるように球面レンズ２２２が配置され、それゆれ、光が球面レンズ２２２によってコリメートされる。コリメートされた光は、その後、円柱レンズ２２３によって、ｚ方向においてＶＩＰＡ２２４上に合焦する。到来する散乱光の異なるスペクトル成分がＶＩＰＡ２２４によって空間分離され、球面レンズ２２５によって合焦し、スペクトルパターンが生成される。スペクトルパターンは、その後、球面レンズ２２６によってカメラ２２７上に結像される。検出経路において、ビームラインの３つのグループが、サンプルの異なる位置を示す。対物レンズ２２０の視野内で、サンプルの複数の位置を同時に測定できることが、図２から明らかである。幾つかの実施形態において、カメラ２２７が球面レンズ２２５の前方焦点面に直接配置されるように、球面レンズ２２６を除くことができる。

照明ビームに沿った全ての測定位置から収集された散乱光が同じ球面レンズ２２２によってコリメートされるので、異なる位置からのコリメートされたビームは、ＶＩＰＡ２２４に関するｘｙ平面において異なる角度を有する。この結果として、軸上の点に対して、軸外の点に関するスペクトルに更なる空間的なシフトが生じることになり、それゆえ、空間次元（すなわち、ｙ方向）に沿ったスペクトルは、カメラ２２７において一直線ではなく、湾曲する。したがって、照明ラインを横切る異なる点からの散乱光の入射角は異なる。これは、サンプル内の異なる点からの散乱がＶＩＰＡエタロン内でわずかに異なる経路長及び分散を有することを意味する。角分散を、それゆえ、スペクトル線の曲がりを除去するために、レンズ２２１の中間結像面において生じる結像倍率が最小化された。ＶＩＰＡ２２４においてスペクトル分散が生じた後に、カメラ２２７上のスペクトル線の湾曲に影響を及ぼすことなく、結像倍率を復元することができる。

さらに、角分散を補償するために、スペクトル較正が必要とされる場合がある。カメラ２２７上で検出されたスペクトル内に照明ビームラインが存在するとき、ＶＩＰＡエタロンの種々の異なる回折次数におけるシフトされない照明ビームラインの場所を用いて、空間ラインの各ピクセル（サンプルの１つの点に対応する）においてスペクトル較正を実行することができる。照明ビームラインが利用できないとき、各空間点における較正のために必要とされる２つの未知のパラメーター、すなわち、自由スペクトル領域（ＦＳＲ）及びスペクトル分散係数がある。それゆえ、未知のパラメーターを求めるのに、２つ以上の既知のサンプルの結果を組み合わせれば十分である。

代替的には、図３において例示されるような多重化ブリルアン分光法に基づく本発明の別の実施形態を使用することによって、空間較正を回避することができる。

図３は、本発明の別の実施形態による、レンズアレイを使用する多重化ブリルアン分光法構成を示す。照明経路は図２に示される照明経路と同じである。対物レンズ３１１を用いて再整形された光３１０のビームによって、マイクロ流体チップ３１２が照明される。検出経路（ｘ方向に沿っている）は、照明経路（ｙ方向に沿っている）の法線方向にある。チップ３１２内に生成される散乱光は、最初に、第２の対物レンズ３２０によって収集される。チューブレンズ３２１の焦点面において中間像が生成される。一実施形態において、中間像面内に空間フィルター又はアパーチャ３３０が位置決めされ、サンプルから到来する焦点外の光が除去される。図２の球面レンズ２２２が、コリメーションのためのレンズアレイ３２２に置き換えられる。像全体が数多くの部分に分割され、それぞれがレンズレットによって独立してコリメートされるように、レンズアレイ３２２の各レンズレットが、中間像の小さな部分からの光のみを受光する。各小部分がレンズレットに対して軸上にあると近似され、全てのレンズレットが十分に位置合わせされるので、コリメートされたビーム全体が平行であり、対応するスペクトルは一直線になるであろう。コリメートされた光は、その後、ＶＩＰＡ２２４の中に送り込まれる。第２のレンズアレイ３２７のレンズレットの口径を適合させるために、一対の円柱レンズ３２５及び３２６を用いて、ＶＩＰＡ２２４の出力光を圧縮する。レンズアレイ３２７の前方焦点面においてスペクトルパターンが生成され、球面レンズ３２８によって検出ユニット３２９上に結像される。一例として、検出ユニット３２９はカメラとすることができる。幾つかの実施形態において、レンズアレイ３２７の前方焦点面にカメラ３２９を直接配置できるように、球面レンズ３２８を除くことができる。

例１
本発明の検証の一例として、図２の構成を用いて多重化ブリルアン分光法の空間分解能を実証するために実験が実施された。この実験において、光源として、単一モード５３２ｎｍ連続波レーザーが使用され、サンプルとして、メタノールを含むプラスチックキュベットが使用された。照明経路（ｙ軸に沿っている）内の対物レンズ２１１は、０．０１７５の開口数（ＮＡ）を有し、検出経路（ｘ軸に沿っている）内の対物レンズ２２０は０．１のＮＡを有する。ＶＩＰＡ２２４は、１７ＧＨｚの自由スペクトル領域（ＦＳＲ）と、２０ｍｍの入射窓とを有する。カメラ２２７は、電子増倍電荷結合素子（ＥＭＣＣＤ：electron multiplying coupled charge device）である。サンプル（プラスチックキュベット）と対物レンズ２２０との間にナイフエッジが配置された。ナイフエッジは、並進ステージを用いて、ｙ方向に沿って動かすことができる。ナイフエッジをｙ方向に向かって動かすとき、キュベットからの散乱信号が部分的に遮断される。ナイフエッジの変位と、カメラの記録された信号とを比較することによって、分光法の空間分解能を取得することができる。図４ａ～図４ｅは、ナイフエッジが異なる位置にあったときにカメラによって取り込まれた原画像を示す。これらの画像において、スペクトル領域内の複数のスペクトル次数が示された。各次数は３つの縞のグループを含み、両側に２つのブリルアン周波数（ストークス及び反ストークスシフト）と、その間にレーザー周波数とを有する。図４ｆは、ナイフエッジの動きと測定された変位との間の線形関係を示す。カメラの１ピクセルはサンプルの２．４５μｍのサイズに対応することが示された。また、図２に示されるような現在の構成は、８００μｍ程度の大きいサンプルを測定することができ、結果として、３００点より多くの点を同時に測定できることを示す。

図２に示されるような本発明の実施形態を使用するマイクロ流体チャネル内の流動液体の測定が図５において例示された。溶融石英ガラスから形成されるマイクロ流体チャネルは、１００μｍの幅と、２５０μｍの深さとを有する。チャネル層は、５００μｍの幅を有する２つのガラス窓によって挟持される。チャネルは、光ビームが通過できるようにするためのその両側が研磨された１インチ×２インチのチップの中央に位置した。測定中に、液体がｚ方向に沿ってチャネル内で流動できるように、チップは直立するように配置された。レーザービーム２１０が、チップの側方からチャネルを照明する。水（５．２ＧＨｚのブリルアン周波数シフトを有する）及びメタノール（３．９ＧＨｚのブリルアン周波数シフトを有する）が、ハンドヘルドシリンジによって管を通して交互にチャネルの中に注入された。カメラの積分時間は、測定シーケンスの時間でもある０．２秒であった。図５は、多重化ブリルアン分光法によって、マイクロ流体チャネル内の流動液体を明確に識別できることを示す。この実験は、フローサイトメトリーの適用例における本発明の能力を実証する。

図２において例示される実施形態による、本発明の利点の別の証拠として、本発明（図２）と従来のエピ検出構成（図１）との間の信号対雑音比（ＳＮＲ）が比較された。各構成のＳＮＲは、光の異なる入力電力密度及びカメラの異なる露光時間において測定された。図６は、本発明がショット雑音限界であり（理論的な当てはめ）、同じ入力エネルギー密度において従来のエピ検出よりはるかに高いＳＮＲを有することを示す。言い換えると、本発明によれば、同じＳＮＲレベルにおいて、従来のエピ検出より速く測定できるようになる。

上記の方法以外に、測定スループットを更に改善する他の方法がある。一実施形態において、マイクロ流体チャネルの真下に励起源としてトランスデューサーを配置し、サンプルによって生成される音響信号を高めることができる。さらに、刺激されたブリルアン散乱は、一般に、自然発生のブリルアン散乱よりはるかに強い。単波長光源を使用する代わりに、可変の波長を有する２つのレーザーを用いて、マイクロ流体チャネル内に刺激されたブリルアン散乱を生成し、信号を更に高めることができる。さらに、１つの超短パルスレーザーを用いて、インパルス性の刺激されたブリルアン散乱を生成することもできる。

例２
例２は、図７に示されるような本発明の実施形態による、多重化（ライン走査）ブリルアン分光法の特性評価に関連する。図７は、ミラー７２４と、対物レンズ７１１、７１３及び７１４と、ビームコリメーション用の球面レンズ７１５と、円柱レンズ７１６、７１８及び７１９と、結像用の球面レンズ７２２とを含む、ライン走査ブリルアン分光法構成を例示する。一実施形態において、中間像面内に空間フィルター又はアパーチャ７２５が位置決めされ、サンプルから到来する焦点外の光が除去される。

図７による分光計のスペクトル分解能が、この例において特性評価された。１つの非限定的な実施形態において、光源７１０は、単一モードの５３２ｎｍ ｃｗ（連続波）レーザー（Ｔｏｒｕｓ、LaserQuantum社）であった。レーザーヘッドからの光は対物レンズ７１１（ＮＡ＝０．０１７５）によって合焦し、サンプル７１２を照明するためのラインビームが生成された。９０度において、ビームラインに沿った散乱光が最初に、一対の対物レンズ７１３及び７１４（いずれも４Ｘ／０．１ＮＡであった）によって結像され、その後、球面レンズ７１５（ｆ＝４００ｍｍ）によってコリメートされた。コリメートされた光は、その後、円柱レンズ７１６（ｆ＝２００ｍｍ）によって、ＶＩＰＡ７１７（ＦＳＲ＝１７ＧＨｚ、フィネス＝３５）の入口において合焦した。ＶＩＰＡ７１７に後続する分散光は、一対の円柱レンズ７１８（ｆ＝１０００ｍｍ）及び７１９（ｆ＝４００ｍｍ）によってスリット７２０の平面上に結像された。この平面は、球面レンズ７２２（ｆ＝６０ｍｍ）によってカメラ７２３（ｉＸｏｎ、Andor社）上に再び結像された。スリット７２０の隙間を調整することによって、望ましくない周波数を遮断することができ、ブリルアン周波数成分のみを通過させることができた。

サンプルとして、純メタノールを含むプラスチックキュベット７１２が使用される。カメラ７２３によって取得された元の分散パターンが図８ａに示される。上側及び下側の２つのグレーラインは弾性散乱周波数（レーザーの周波数と同じ）であり、その間にある２つの明るいラインはブリルアン周波数（ストークス及び反ストークス成分）である。横軸及び縦軸はそれぞれ、空間領域及びスペクトル領域に対応する。

図８ｂは、図８ａにおいて点線によって示される場所におけるブリルアンスペクトルを示す。ＶＩＰＡの自由スペクトル領域は１７ＧＨｚであったので、スペクトル分解能がピクセルあたり０．１７７ＧＨｚであったと計算することができた。レーザー周波数の連続するピークと半値全幅との空間比を計算することによって、約３５のフィネスも確認された。推定ブリルアン周波数シフトの精度は、空間領域においてピクセルごとの信号対雑音比（ＳＮＲ)を計算することによって特性評価された。図８ｃは、ＳＮＲ対照明エネルギーの対数プロットを示す。図８ｃのＳＮＲは、異なる照明エネルギーで計算された。測定データは、概ね平方根依存性を示し、ショット雑音限界挙動を示した。図８ｄは、単一の点において１００回測定した場合の推定ブリルアン周波数の典型的な分布を示しており、その分布はガウス形状を有する。この分布の標準偏差を用いて、推定ブリルアン周波数の精度を推定した。この場合、それは８．５ＭＨｚであり、０．２２％の相対的不確実性に相当する。

空間分解能を特性評価するために、キュベット７１２に後続してすぐに、ただし検出対物レンズ７１３に先行して、ナイフエッジが配置される。一実施形態において、ナイフエッジを搬送する並進ステージが２５．４μｍのステップサイズでｘ方向に動かされ、ナイフエッジの対応する像が分光計のカメラ７２３によって監視された。その結果が図９に示される。測定データが直線に当てはめられ、それにより、空間分解能はピクセルあたり３．２９μｍと計算された。カメラ７２３は全部で５１２×５１２ピクセルを有し、それはサンプル面内の概ね１．６８ｍｍに対応する。図８ａに示されるように、スペクトル線は空間次元にわたって完全に一直線ではなく、ＶＩＰＡ７１７における軸外の点の入射角の偏差に起因してわずかな湾曲を有する。この湾曲の結果として、カメラにわたってスペクトル分解能が変動する場合があるが、その変動はピクセルあたり０．２ＭＨｚ未満まで、すなわち、１ｍｍの空間的視野を超える範囲内で１０ＭＨｚ以下まで最小化された。幾つかの実施形態において、この誤差は、必要な場合に各点においてスペクトル分解能を較正することによって回避することができる。

例３
２次元及び３次元結像
例３は、図７による多重化ブリルアン分光法に基づく２次元及び３次元結像の特性評価に関連する。

非球面ＰＭＭＡレンズのブリルアンシフトが、図１０ａに示される構成において測定された。図１０ａは、屈折率整合液でキュベットを満たす前に撮影されたＰＭＭＡレンズの写真を示す。下はＰＭＭＡレンズを拡大撮影した写真であり、スケールバーは５００μｍの長さを有する。ＰＭＭＡレンズはプラスチックキュベットの中に配置され、サンプルの表面における散乱を低減するために、キュベットは屈折率整合液であらかじめ満たされた。キュベットは、垂直に配置された電動並進ステージによって搬送され、その並進ステージによって、サンプルをｙ方向に走査できるようにした。一実施形態において、キュベット（図７のサンプル７１２）は、１０ｍｍ×１０ｍｍのサイズを有する。非球面ポリメチルメタクリレート（ＰＭＭＡ）レンズをキュベット７１２の中央領域に浮かせておくために、ＰＭＭＡレンズの縁が光学接着剤を用いて注射器の針の先端に取り付けられ、その後、針の端部がキュベットの壁に固定された。一例として、限定はしないが、電動並進ステージ（Ｔ－ＬＳＭ０２５Ａ、Zaber社）は、２５ｍｍ移動範囲とＲＳ－２３２制御とを有した。並進ステージの最大速度は７ｍｍ／ｓ程度に速くすることができる。

一実施形態において、走査を自動的に実行できるように、Ｌａｂ Ｖｉｅｗプログラムを用いて、ステージの移動とカメラによる取得とを同期させる。レーザー電力は７０ｍＷであり、カメラの露光時間は０．１秒であった。ステージの速度は、３０秒以内に３００フレームが取り込まれるように５０μｍ／ｓｅｃと設定され、それは全部で１．５ｍｍの変位に対応した。サンプル（ＰＭＭＡレンズ）が液体の中に浸漬されたとき、屈折率整合のために、裸眼ではほとんど見ることができなかった。しかしながら、サンプル及び整合液の剛性が異なったので、それらはブリルアンスペクトルによって容易に識別することができた。図１０ｂは、カメラ７２３によって取得された典型的な信号のスナップショットであり、スリット７２０によって弾性周波数が遮断されたために、ブリルアン周波数成分のみが示された。ＰＭＭＡレンズが整合液によって包囲されたことが図１０ｂにおいて明確に示される。図１０ｃ及び図１０ｄはそれぞれ、単一の点における屈折率整合液及びＰＭＭＡのブリルアンスペクトルを示す。点及び実線はそれぞれ、測定データ及び当てはめられたデータに対応する。スペクトル分解能の特性評価データを使用するとき、ＰＭＭＡ及び整合液のブリルアン周波数シフトはそれぞれ、１１．３２ＧＨｚ及び９．１１ＧＨｚと特定された。

図１１ａ～図１１ｄは、ＰＭＭＡレンズの２Ｄブリルアン画像及び３Ｄブリルアン画像を示す。図１１ａは、図１０ａ内の点線に沿って走査された断面を示す。矢印は、照明ビームを示す。図１１ｂは、測定されたブリルアン周波数シフトに基づく、整合液内に浸漬されたＰＭＭＡレンズの２Ｄ結像を示す。一実施形態において、画像の全体サイズは約１．１ｍｍ×１．５ｍｍであった。ＰＭＭＡレンズと整合液との界面は、画像から明確に確認することができ、ＰＭＭＡレンズの内側領域は極めて均一である。異なる物質の界面において、各物質に対応する２つのブリルアンシグネチャ間にクロストークがある。２つの物質が類似のブリルアンシフトを有する場合には、このクロストーク効果が界面において不明瞭な領域を導入することになる。この実験において、ＰＭＭＡレンズ及び屈折率整合液は異なるブリルアンシフトを有し、それにより、不明瞭な領域を、２ピクセル、すなわち、６．５８μｍ以内にあると定量化できるようになる。図１１ｃに示される走査方法を使用することによって、この分光法が迅速な３Ｄ結像を実施できることが実証された。図１１ｄは、別の並進ステージを用いてＰＭＭＡレンズがｚ軸に沿って動かされるときに取得された断面画像の５つのスライスを示す。

要するに、図１～図１１ｄを参照すると、本発明の一実施形態において、照明ビームはレーザービームとすることができ、検出ユニット１２０、２２７、３２９及び７２３は、ＣＣＤ、ＣＭＯＳカメラ、又は検出器のアレイとすることができる。更に別の実施形態において、照明光は、その中心値に固定されるか、又はその中心値付近において調整可能である、ＵＶ、可視光又はＩＲ方式における単一波長を有する照明源によって与えられる。各測定サンプル点において計算された１つ以上のブリルアン指標に基づいてサンプルの画像を生成するために、サンプルは、結像又は取得中に照明光ビームに対して移動する可動プラットフォーム上に配置することができる。更に別の実施形態において、照明光ビームは、結像中に静止したサンプルに対して移動している場合がある。一例として、限定はしないが、サンプルは、生物有機体、組織又は生体細胞を含む、生体サンプルとすることができる。一実施形態において、生体細胞は生細胞である。生体細胞は、ブリルアン指標を測定している間に、懸濁される場合があるか、２Ｄ基体に付着している場合があるか、又は３Ｄ細胞外マトリックス内で培養される場合がある。

一実施形態において、カメラ１２０、２２７、３２９及び７２３上で検出されたスペクトルは、ブリルアン散乱光の空間スペクトルパターンである。検出された空間スペクトルパターンに基づいて、各測定サンプル点において１つ以上のブリルアン指標を計算することができる。一例として、限定はしないが、ブリルアン指標はブリルアン周波数シフト、ブリルアンスペクトル線幅、ブリルアン利得又は損失スペクトル、及びその組み合わせとすることができる。サンプル点において測定されたブリルアン指標はそれぞれ、この時点におけるサンプルの物理的特性を示す。一例として、限定はしないが、サンプルの物理的特性は、粘弾性率、密度、屈折率、電歪及びその組み合わせとすることができる。一実施形態において、ブリルアン散乱光に関連付けられる指標は、ブリルアン周波数シフトである。

各測定サンプル点における１つ以上のブリルアン指標に基づいて、サンプルの画像を生成することができる。図２、図３及び図７は９０度の角度をなすように配置される照明経路及び検出経路を示すが、いずれの構成も、互いに対して０度より大きい任意の角度に配置される照明経路及び検出経路を用いて実現することができる。

図２、図３及び図７を参照すると、スペクトル分散を誘発する光学配置は、球面レンズ、円柱レンズ、ＶＩＰＡを備えることができる。具体的には、その光学配置は、図２の要素２２２、２２３、２２４、２２５及び２２６、図３の要素３２２、３２３、３２４、３２５、３２６、３２７及び３２８、並びに図７の要素７１５、７１６、７１７、７１９、７２０及び７２２を備える。一実施形態において、スペクトル分散を誘発する光学配置は、仮想画像化フェーズドアレイ（ＶＩＰＡ）、ファブリ－ペローエタロン又はエシェル格子を備える。更に別の実施形態において、光学配置は、サンプルから検出ユニットまでの光路内の空間スペクトルパターンのサイズ、形状及び／又は角度の広がりを変更する光学要素を更に備える。具体的には、照明光ビームは、サンプルを含む容器内にペンシルビームを生成するために、第１のレンズ２１１、３１１及び７１１によって再整形される。空間光変調器又は変形可能ミラー（図７、ミラー７２４）を用いて、第１のレンズ（図７、レンズ７１１）に入射する照明光ビームを再整形することができる。更に別の実施形態において、サンプル容器内で生成されるブリルアン散乱光は、第２のレンズ２２０、３２０、７１３を備え、第３のレンズ２２１、３２１、７１５の焦点面において中間像を生成する第１の結像系によって収集される。中間像の倍率は、ＶＩＰＡ２２４、３２４及び７１７における測定サンプル点の角分散を最小化するように最適化される。サンプルから到来する焦点外の光を除去するために、中間像面において空間フィルター又はアパーチャ２２８、３３０及び７２５を使用することができる。

図２の要素２２２、２２５、２２６、図３の要素３２２、３２６、３２７及び３２８、図７の要素７１５、７１８及び７２２の組み合わせである第２の結像系が中間像を検出ユニット２２７、３２９、７２３上に投影し、ＶＩＰＡを含む光学配置は、第２の結像系の無限遠空間（infinity space）内にある。本発明の更なる態様において、ブリルアン散乱光は、球面レンズ（図２、レンズ２２２；図７、レンズ７１５）によってコリメートされ、円柱レンズ（図２、レンズ２２３；図７、レンズ７１６）によってｚ方向においてＶＩＰＡ上に合焦し、異なる位置からのコリメートされたビームは、ＶＩＰＡに関するｘｙ平面において異なる角度を有する。ブリルアン空間スペクトルパターンの焦点を検出ユニット２２７、３２９、７２３上に厳密に合わせるために、ＶＩＰＡの出力光は幾つかの円柱レンズ及び球面レンズ２２５、２２６、７１８、７１９、７２２によって変更される。さらに、本発明の別の態様において、ブリルアン散乱光は第１のレンズアレイ３２２によってコリメートされ、第１のレンズアレイの各レンズレットが中間像の一部からの光のみを受光し、像全体は複数の部分に分割され、各部分はレンズレットによって独立してコリメートされる。ＶＩＰＡの出力光は、第２のレンズアレイ３２７のレンズレットの口径を適合させるために、一対の円柱レンズ３２５及び３２６によって補償される。ブリルアン空間スペクトルパターンは、第２のレンズアレイ３２７の前方焦点面において生成され、検出ユニット３２９上に結像される。

更に別の実施形態において、空間スペクトルパターン内のレーザーラインを吸収する狭帯域フィルターであり、狭帯域フィルターは吸収ガスセル及びファブリ－ペローエタロンデバイスからなる群から選択される。照明源の波長及び狭帯域フィルターによって吸収される波長は互いにロック（lock)される。

一実施形態において、ブリルアン空間スペクトルパターンは、光学配置の異なる回折次数によって生成される異なるレーザーライン又は弾性散乱ライン間の距離を検出ユニット２２７、３２９、７２３上で測定することによって較正される。更に別の実施形態において、レーザーラインが狭帯域フィルターによって吸収され、較正のために利用できないとき、既知のブリルアン特性の基準物質を用いて、光学配置のスペクトル分散特性を計算する。

図７において例示されるような構成の利点及び制約を理解するために、角度のある幾何学的配置のスペクトル効率が、図１において例示されるような共焦点エピ検出構成を使用する従来の構成と比較された。照明ビームが垂直偏光され、それゆえ、散乱面に対して垂直である場合には、微分断面積は散乱角から独立しており（非特許文献２８）、それゆえ、直交する照明経路－検出経路を備える構成は、エピ検出と同じ微分断面積を有する。しかしながら、角度のある幾何学的配置は結果として、単一の点あたりの幾何学的効率が減少することになる（すなわち、測定の実質的な並列化に起因する利点を排除する）。収集された散乱電力はＰ＝Ｉ_ｉｌｌ・Ｖ・Ω・Ｒと書くことができる。ただし、Ｉ_ｉｌｌは照明光の強度であり、Ｖは散乱の相互作用体積であり、Ωは収集立体角であり、Ｒは散乱係数であり、それはｍ^－１の単位を有し、ここでは定数と見なすことができる。直交構成において、相互作用体積は、半径ｒ＝０．６１λ／ＮＡ_ｃｏｌ及び長さｌ＝０．６１λ／ＮＡ_ｉｌｌを有する円柱形によって近似することができる。ただし、ＮＡ_ｃｏｌ及びＮＡ_ｉｌｌはそれぞれ、照明対物レンズ及び収集対物レンズのＮＡである。収集立体角は、収集開口数Ω＝πＮＡ_ｃｏｌ ^２によって決まる。それゆえ、収集散乱電力は、Ｐ_９０＝Ｉ_ｉｌｌ・Ｒ・π^２・０．６１^３・λ^３／ＮＡ_ｉｌｌである。エピ構成の場合、代わりに、相互作用体積は約０．６１^２・λ^３／ＮＡ_ｅｐｉ ^４である。ただし、ＮＡ_ｅｐｉは対物レンズのＮＡであり、収集立体角はΩ＝πＮＡ_ｅｐｉ ^２である。したがって、収集散乱電力は、Ｐ_ｅｐｉ＝Ｉ_ｉｌｌ・Ｒ・π^２・０．６１^２・λ^３／ＮＡ_ｅｐｉ ^２である。同じ照明強度の場合、２つの構成間の収集電力の比は、結局、η＝Ｐ_９０／Ｐ_ｅｐｉ＝０．６１・ＮＡ_ｅｐｉ ^２／ＮＡ_ｉｌｌになる。直交構成では、視野にわたって均一な長い照明ビームラインを生成するために、一般に低いＮＡ_ｉｌｌが好ましい。例えば、１．７３７ｍｍの使用可能なレイリー範囲に対応するＮＡ_ｉｌｌ＝０．０１７５が使用された。本発明による特定の実験構成をＮＡ_ｅｐｉ＝０．１を有するエピ構成（ｘ方向において同じ分解能を与える）と比較すると、その比は３４．８％である。この計算は、対物レンズの異なる組み合わせが使用された他の研究（Scarcelli, G.、Kim, P.及びYun, S.H.「In vivo measurement of age-related stiffening in the crystalline lens by Brillouin optical microscopy」Biophysical Journal 101, 1539-1545 (2011)）による予測と一致する。重要なことに、この計算は、図２の実験結果、そして他のエピ検出結果（Guilluy, C.ら「Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus」Nature Cell Biology 16, 376 (2014)）と一致する。直交及びエピ検出における散乱効率は、照明体積と検出体積との間の重なりによって決定され、それゆえ、並列化の利点を最大化するために、角度のある幾何学的配置を、単一点測定あたりエピ検出と同じ効率になるように設計することができる。ライン並列検出を含むとき、多重ブリルアン分光法は、エピ検出における１時間超の長さと比べて、数十秒内に数ミクロンの分解能でｍｍサイズのサンプルの走査を成し遂げることができる。ビームラインに沿って測定可能なサイズは、照明ＮＡと、カメラのピクセル数との両方によって決定される。空間分解能は、検出ＮＡ（ｘ方向、ビームラインに沿っている）及び照明ＮＡ（ｙ方向及びｚ方向）によって決定される。

背景除去に関して、角度のある構成は、エピ検出より本質的に低い背景雑音を有する。一般の共焦点構成では、照明光の後方反射が分光計の中に容易に結合され、背景雑音の一因になる。ライン走査構成では、照明経路及び検出経路が直交して配置されるので、後方反射を完全に回避することができる。さらに、ラインビームによって照明される領域のみが励起されるので、ライン走査構成は、光学的分割（optical sectioning）に関して、共焦点構成と類似の機能を有する。一方、１ステージＶＩＰＡのみが使用されるので、分光計の消光比は制限される。これは、界面、又はイントラリピッド媒質若しくは組織等の光学的に不透明なサンプルを測定するのを難しくする。機器の全体的な消光比を改善するために、ライン走査構成を、アポディゼーション、狭帯域バンドパスフィルタリング、及びガスチャンバー狭帯域吸収フィルタリング等の、背景雑音を抑圧することができる既存の方法と組み合わせることができる。

本発明の別の態様は、細胞内物理的（機械的）特性に基づいて、生細胞を分類するシステム及び方法に関する。一例として、限定はしないが、分類されることになる細胞は、ヒト細胞、動物細胞又は植物細胞とすることができる。細胞内物理的情報は、細胞内部の音響特性に関連するブリルアン光散乱のスペクトル分析から取得される。分類は、細胞集団又は個々の細胞のいずれかに基づくことができる。一実施形態において、細胞は、懸濁された状態で、及び／又は２Ｄ基体に付着している状態で、及び／又は３Ｄ合成／天然細胞外マトリックス内で培養された状態で分析することができる。更に別の実施形態において、細胞は、静止状態において、又は細胞流動を介して分析することができる。

一実施形態において、細胞はｉｎ ｖｉｔｒｏで培養及び調製することができ、マイクロ流体デバイスを用いてプローブビームに送達することができる。細胞の異なる領域における細胞内情報を、標準又はカスタムマイクロ流体デバイスを利用する幾つかの構成において取得することができる。細胞は、フローサイトメトリー又は他の細胞分析技法に関連付けられる概ね全ての構成において分析することができる。一例として、限定はしないが、細胞は、マイクロ流体チャネルの中を流れている間に、及び／又は細胞が懸濁液内に静止したままであるときにマップされた状態で、及び／又は既知の方法に従って３Ｄゲル又は他の細胞外マトリックスの小滴内に封入された状態で、及び／又は細胞凝集体を形成している間に測定することができる。代替的には、マイクロ流体デバイスを用いて、又は用いることなく、細胞は、基体上に付着している間に、又は３Ｄゲル内にある間に、又は凝集体を形成している間に、明視野若しくは共焦点結像手法で細胞内情報のブリルアン取得を誘導することによって、他の構成（皿、又はフラスコ、又はプレートアレイ内等）において分析することができる。取得された物理的フェノタイピングに基づいて、細胞周期の異なる段階における異なるタイプの細胞又は同じタイプの細胞を区別することができる。一実施形態において、薬物への細胞応答を分析することができる。分析は、細胞の集団、又は個々の細胞のいずれかにおいて実行することができる。

図１２は、ブリルアン信号を励起／収集するエピ検出経路、監視結像手法、マイクロ流体デバイス（又は他の細胞播種（cell plating）デバイス）、ブリルアン分光計、及びこれら全てのサブ構成要素をリンクする、ソフトウェアを備えるコンピューターの新規の組み合わせから生じる本発明の例示的な実施形態を示す。第１の到来する照明ビーム１２１０が、ビームスプリッター１２１１及び対物レンズ１２１２を使用することによって、マイクロ流体デバイス１２３０内部の１つにスポット上に合焦する。照明レーザービーム１２１０はレーザービームとすることができる。一実施形態において、第１の到来するレーザービーム１２１０は１μｍ～１０μｍのスポットの中に合焦する。後方ブリルアン散乱光が同じ対物レンズ１２１２によって収集され、ビームスプリッター１２１１、反射ミラー１２１３及びカップリングレンズ１２１４を介して、ブリルアン分光計１２１５に導光される。ブリルアン分光計１２１５は、ブリルアン周波数シフトを正確に測定することができるデバイスである。ブリルアン分光計１２１５の一例が非特許文献２９において開示されている。マイクロ流体デバイス１２３０の上方に、第２の光源１２２０（一般にレーザービーム１２１０とは異なる波長を有する）、ビームスプリッター１２２１、チューブレンズ１２２２、対物レンズ１２２４及び２Ｄ画像記録デバイス１２２５からなる明視野顕微鏡が存在する。この顕微鏡構成の目的は、マイクロ流体デバイス１２３０内部の細胞の流動状況を監視することである。一実施形態において、その顕微鏡構成はスペクトルフィルター１２２３を更に含み、スペクトルフィルターは、レーザービーム１２１０からの光を遮断するが、光源１２２０からの光が通過できるようにする。対物レンズ１２１２からの合焦スポットが対物レンズ１２２４の像面上にあるのを確実にするように、対物レンズ１２１２及び１２２４が調整される。

一実施形態において、ソフトウェアインターフェースを用いて、２Ｄ画像記録デバイス１２２５によって取得された明視野像と、ブリルアン分光計１２１５のブリルアン信号とを同期させることができる。これにより、ブリルアン信号を測定サンプルの正確な場所に割り当てることができる。

図１３は、図１２のブリルアン分光法構成とともに使用されるインターフェースのスナップショットを示す。インターフェースの主な機能は、その中に細胞を有するマイクロ流体デバイスの未処理のブリルアン信号１３１０（空間スペクトルパターン）及び明視野像１３２０を同時に記録することである。２つの白色の点１３１０はブリルアン信号（空間スペクトルパターン）であり、点間の距離はブリルアンピークを表す。レーザーラインからブリルアンピークまでの距離は、所望の周波数シフトである。この表現において、ここで適切な較正が行われた場合、２つのブリルアンピーク間の距離を計算することによって、ブリルアンシフトを測定することができる。この場合に、２つのピーク間の距離が短いほど、大きな周波数シフト、それゆえ、高い剛性に対応する。

図１４ａ～図１４ｆにおいて、ブリルアン信号検出を実際にいかに実施できるかについての非限定的な例が示される。具体的には、図１４ａ～図１４ｃはそれぞれ、０．８５ｓｅｃ、１．３５ｓｅｃ及び１．６５ｓｅｃにおいて同時に取得された未処理のブリルアン信号（空間スペクトルパターン）及び明視野像の両方のスナップショットである。そのスナップショットは、上から下にチャネル内部を流れる細胞を示す。丸１４０２は、細胞が横切っている照明（プローブ）ビームスポットの場所を示す。図１４ｄ～図１４ｆは、図１４ａ～図１４ｃの未処理のブリルアン信号から計算されたブリルアン周波数シフトの時間トレースを示す。図１４ａ～図１４ｃの同期した画像から、ブリルアン信号の元の場所を、曖昧にすることなく特定することができる。ブリルアン周波数シフトを特定の細胞内の場所に割り当てること以外に、画像処理技法を組み込むことと、細胞容器を並進させること、又はブリルアンプローブビームの位置を制御することのいずれかとによって、この能力を用いてブリルアンプローブビームを特定の場所に導光することもできる。

１つの非限定的な実施形態において、細胞を合焦したプローブビームスポットに位置合わせするために、図１２に示されるようなマイクロ流体デバイス１２３０を２Ｄ並進ステージ上に配置することができる。一例として、限定はしないが、マイクロ流体デバイス１２３０は、長方形の断面を有するか、又はフローサイトメータの大部分と同様に円形の断面を有する一直線のチャネルとすることができる。チャネルのサイズ（一例として、１００μｍ×１００μｍ）が、細胞のサイズ（一例として、直径が１０μｍ～２０μｍ）よりはるかに大きい場合には、細胞は、マイクロ流体デバイス１２３０を通ってランダムな場所に流れる場合があるので、測定精度、そして潜在的には測定スループットが減少する。一実施形態において、全ての細胞を照明ビーム１２１０によって探査できるように、細胞をチャネル内部の同じトレースに沿って位置合わせするために、シースフローと呼ばれる流体力学的合焦技法を実施することができる。これは、各細胞の中心がプローブビーム１２１０の合焦スポットに絶えず位置合されるのを確実にする実効的な方法である。

図１５ａ及び図１５ｂは、シースフロー技法を使用することによって取得された実験データ（図１５ｂ）と、シースフロー技法を使用することなく取得された実験データ（図１５ａ）との比較を示す。流量及び分光計１２１５の取得時間を調整することによって、細胞が光ビーム１２１０を横切って進むときに、１つの細胞の幾つかの場所を探査することができる。図１５ａ及び図１５ｂのプロットに関して、単一の細胞の平均剛性を記述するために、細胞内で取得された全てのブリルアン周波数シフトの平均が計算された。それゆえ、図１５ａ及び図１５ｂにおいて、ヒストグラムの各データ点は１つの細胞を表す。それらの結果は、非シースフローによって引き起こされる人工的な広がりが取り除かれるので、測定データの広がり（分布の線幅）が、シースフロー技法を使用することによって約４０％狭くされる。１つの非限定的な実施形態において、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞系統が実験において使用された。

更に別の実施形態において、画像誘導位置合わせ（image-guided alignment）と呼ばれる第２の手法を用いて、流動する細胞をレーザービーム１２１０の合焦スポットに位置合わせすることができる。その概念の概要が図１６に示される。この手法も図１２に示される構成内で実施することができるが、以下の変更が加えられる。図１２において、レーザービーム１２１０の合焦スポットは、顕微鏡１２１２の視野の中心に位置する。しかしながら、図１６において、合焦スポット１６２０は、マイクロ流体チャネル１６１０の底部に動かされ、ｘ方向に沿った中間点に、すなわち、ｘ_０に設定された。細胞１６３０がｙ方向に（上から下に）流れていると仮定して、細胞が視野内に現れると、その場所（ｘ_１）及び合焦スポット１６２０に対する水平シフト（ｘ_０－ｘ_１）を特定することができる。その後、マイクロ流体チャネル１６１０を搬送する並進ステージを自動的に、又は手動で動かして、細胞１６３０を合焦スポット１６２０に完全に位置合わせすることができる。代替的には、更に別の実施形態において、ブリルアンプローブビームは、レーザー走査補助部品（例えば、検流計スキャナー、ポリゴン）又は他の既知のビーム位置決め技法を用いて調整することができる。この手法の成功は、２つの条件に基づく。第一は、流動実験の全てが層流であることであり、それは、細胞がチャネルに入ると、横方向にドリフトするのではなく、そのトレースを維持するのを確実にする。第二は、細胞及びプローブの場所を調整するフィードフォワードアルゴリズムが、チャネルの位置調整を行うだけの十分な時間があるように流速より速いことである。図１２のブリルアン分光法構成を使用することによって取得された典型的な実験結果が、図１７ａに示される。細胞が培養され、実験直前に緩衝液の中に懸濁された。一実施形態において、緩衝液として、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）が使用された。流量を調整することによって、細胞が光ビームを横切って進むときに、各細胞内の５～１０の位置が探査される。この場合に、測定データ点の全てを用いて、図１７ａ内のヒストグラムグラフをプロットした。図１７ａのヒストグラムは３つの部分からなり、それらの部分の輪郭が３つの実曲線１７０２、１７０４及び１７０６によって描かれる。第１のピーク１７０４はＰＢＳのシグネチャであり、それは図１７ｂに示されるように、容易に認識し、位置を特定し、除去することができる。光ビーム１２１０は、２つの隣接する細胞間の時間間隔内でのみ緩衝液を探査することになるので、測定データ内のＰＢＳのシグネチャの出現が予想される。１つの非限定的な実施形態において、上記のように、細胞流動実験のために、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞系統が使用される場合がある。

細胞内情報を抽出するために、曲線当てはめ法を用いて、図１７ａから細胞のシグネチャを抽出することができる。３つのガウス分布１７０２、１７０４及び１７０６の線形重ね合わせを用いて、元のヒストグラムを当てはめた。ＰＢＳ溶液のシグネチャ１７０４は、図１７ｂのデータをあらかじめ当てはめることによって十分に特定することができるので、この情報は、当てはめの既知のパラメーターとして使用することができる。図１７ａの元のヒストグラムに最も適合するように破曲線を当てはめた後に、図１７ｃに示されるように、ＰＢＳ溶液１７０４のシグネチャを差し引くことによって、細胞の情報が取得された。図１７ｃのヒストグラムは２つのピークからなり、それらのピークは、２つのガウス分布１７０８及び１７１０の重ね合わせである。実際には、ガウス分布１７０８及び１７１０は、細胞内の異なる領域（すなわち、細胞質及び細胞核）からの機械的シグネチャを表す。

図１７ａ内のフローデータが、細胞集団の機構を正しく表すことを検証するために、細胞集団のフローデータと、細胞の組の２Ｄ画像とが直接比較された。最初に、細胞が図１２のマイクロ流体デバイス１２３０の中に送達され、その後、２～３分間、チャネル内部で細胞が懸濁されるのを確実にするために停止された。比較として、同じ細胞内の複数の場所において、同一の方法で調製された同じ細胞系統を用いてブリルアン周波数を取得することに基づく流動実験が、図１２のブリルアン分光法構成を使用することによって行われた。図１８ａは、チャネルを通って流れている細胞がレーザーを横切るラインに沿った一群の点に対して測定されたブリルアン周波数シフトの分布を示すヒストグラムである。一実施形態において、５７７個の細胞（３５４６個の細胞内の点）が測定された。図１８ａのヒストグラムは、２つのガウス分布１８０２及び１８０４の重ね合わせによって当てはめられる。図１８ｂは、２つのガウス分布１８０６及び１８０８の重ね合わせによって当てはめられた流動細胞の２Ｄブリルアン画像から生じるヒストグラムである。一実施形態において、全部で４３７８個の細胞内の点を含む、２９個の細胞が測定された。図１８ａ及び図１８ｂのヒストグラムは、２ピークプロファイル及び各ピークの周波数シフトを含む、同じ特徴を共有することがわかる。上記で規定されたような細胞及び測定値の数は、限定するものではなく、任意の数の細胞及び測定値を用いて、図１８ａ及び図１８ｂのヒストグラムを取得できることに留意されたい。

さらに、図１７ｃの２つのピークが、細胞質／細胞骨格及び細胞核の機械的シグネチャに対応することが検証された。細胞の細胞核のみを染色するために蛍光染料が使用され、その後、同じ細胞の明視野／蛍光画像（図１９ａ及び図１９ｂ）並びに２Ｄブリルアン画像（図１９ｄ）の両方が取得された。図１９ａ及び図１９ｂの画像を融合することによって取得された図１９ｃの画像を図１９ｄのブリルアン２Ｄ画像と比較することによって、細胞質から細胞核を分離することができる。細胞核及び細胞質の両方のヒストグラムが図１９ｅに合わせてプロットされており、ピーク１９０４は細胞核に由来し（図１９ｂの蛍光領域に対応する）、ピーク１９０２は細胞質に由来する（図１９ｂの非蛍光領域に対応する）。図１９ｅと図１７ｃとの間の比較に基づいて、細胞がプローブビームを横切るときに、図１２のブリルアン分光法構成を用いて細胞内の複数の点においてブリルアン周波数を取得する流動実験によって、細胞集団内で細胞核及び細胞質の機械的シグネチャを区別できると結論付けられる。蛍光／ブリルアンを組み合わせた構成を用いて、蛍光で標識される特定の細胞内成分のブリルアン取得を正確に割り当てることができるか、又は画像誘導することができる。

本発明の別の態様において、細胞内物理的（機械的）フェノタイピングに基づいて細胞を分類する能力が例示される。例えば、細胞に及ぼすサイトカラシンＤ（ＣｙｔｏＤ）の影響が分析された。細胞の全体剛性（変形能）は、細胞骨格及び細胞核の両方によって決まることが広く受け入れられている（Fletcher DA、Mullins RD「Cell mechanics and the cytoskeleton」Nature 463, 485-492 (2010)）。細胞骨格は３つの主な重合体、すなわち、アクチン、微小管及び中間径フィラメントからなる。Ｆ－アクチンはアクチンの重合した状態であり、細胞形状及び機械的特性を制御する際に主要な役割を有する。それゆえ、Ｆ－アクチンの重合及び解重合が、細胞形状及び剛性の変化を推進する有向力を生成する。ＣｙｔｏＤは、Ｆ－アクチンの重合を抑制する薬物である。Ｆ－アクチンはＣｙｔｏＤで処置された付着細胞において著しく低減されることになり、結果として、細胞全体がその剛性を低下させることが報告された（Wakatsuki T、Schwab B、Thompson NC、Elson EL.「Effects of cytochalasin D and latrunculin B on mechanical properties of cells.」J Cell Sci. 114, 1025-1036 (2001)）。細胞内レベルにおいて、細胞核及び細胞骨格はいずれも、その両方内にアクチンが存在するときに、剛性を低下させることになる。さらに、細胞核及び細胞骨格は機械的に接続されるので、細胞核は細胞骨格からのプレストレスを受ける（Wang N、Tytell JD、Ingber DE.「Mechanotransduction at a distance: mechanically coupling the extracellular matrix with the nucleus」Nat Rev Mol Cell Biol. 10, 75- 82 (2009)）。したがって、Ｆ－アクチンの崩壊は、最終的に細胞核を軟化させるようなプレストレスも低減するはずである（Chalut KJ、Hoepfler M、Lautenschlaeger F、Boyde L、Chan CJ、Ekpenyong A、Martinez-Arias A、Guck J.「Chromatin decondensation and nuclear softening accompany Nanog downregulation in embryonic stem cells」Biophys J. 103, 2060-2070 (2012)）。

一実施形態において、ＣｙｔｏＤは細胞上に塗布され、その後、トリプシンを用いて剥離される。その後、処置された細胞はＰＢＳに再懸濁され、図１２の構成において測定される。投与量依存性を観測するために、ＣｙｔｏＤの３つの投与量が使用された。一例として、限定はしないが、ＣｙｔｏＤ投与量は、０．５ｕｇ／ｍｌ、２ｕｇ／ｍｌ及び５ｕｇ／ｍｌであった。処置された細胞（２７９、２３２及び５７７）は投与量ごとに探査され、対照のために、処置されない細胞（２６８）が探査された。細胞全体にわたる平均値を用いて、細胞の機械的フェノタイピングを表した。図２０ａの結果は、細胞の剛性へのＣｙｔｏＤの投与量依存効果を示す。したがって、細胞全体にわたる平均ブリルアン周波数シフト値を用いて、高スループットの機械的フェノタイピングを取得することができる。１つの非限定的な実施形態において、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞系統を用いて、実験を実行した。

平均された細胞値の他に、図１７ａ～図１７ｃを参照しながら説明された方法は、細胞内情報を取得することができる。ＣｙｔｏＤの異なる投与量に対応する図２０ｂ～図２０ｅに示されるように、ピーク２００４、２００８、２０１２及び２０１６のブリルアン周波数シフトは小さくなり、それゆえ、図２０ｂから図２０ｅに左に移動した。これは、高い投与量のＣｙｔｏＤによる処置ほど細胞核が軟化していることを示している。一方、細胞質を表すピーク２００２、２００６、２０１０、２０１４は、この実験において概ね変化しないことに留意されたい。これは、フラスコ基体から細胞を剥離するために使用されるトリプシン処理ステップが全てのＦ－アクチンストレス線維を崩壊させるので、結果として、懸濁された細胞に関する細胞骨格に測定可能な影響をほとんど及ぼさないためである。付着細胞において、細胞骨格剛性が著しく低減されることが検証された。

図２１は、本発明の別の実施形態による、ブリルアン分光法構成を示す。この実施形態において、細胞がブリルアンビームによって探査されると同時に、一緒に記録される細胞の共焦点蛍光画像を取得するために、第２の光学手法が追加される。第２の光学手法は、ダイクロイックミラー２１２７と、チューブレンズ２１２２と、ピンホールマスク２１２６と、光検出器２１２５とを備えることができる。ダイクロイックミラー２１２７は、レーザービーム２１１０及びブリルアン信号を通過させるが、蛍光を反射する。図１２の明視野顕微鏡と比べて、共焦点構成は、焦点外れの面からの蛍光を除去することによって、より良好な横断及び横方向光学分解能を有する。実際には、蛍光標識された細胞を用いて、細胞のサブ領域（例えば、細胞核）を識別することができ、レーザービーム２１１０の合焦スポットを用いて、蛍光放射を直接励起することができる。その後、共焦点構成を用いて、カメラ２１２５によって蛍光放射光を検出する。蛍光放射光の強度に基づいて、ブリルアン信号を目標点に割り当てることができるように、細胞内部の合焦スポット（それゆえ、ブリルアン信号）の場所を正確に特定することができる。この手法を用いて、測定中にブリルアンビームを細胞の特定の領域に導光することもできる。更に別の実施形態において、反転構成に加えて、共焦点顕微鏡の直立構成を使用することもできる。この場合、共焦点構成は、マイクロ流体デバイス２１３０の上に存在することになる。また、蛍光情報を用いて、細胞の縁部における測定値を較正するために、３次元結像ボクセル内に存在する非細胞媒質（例えば、ＰＢＳ）の量を推定することができる。

図２２の画像は図２１の実施形態によるブリルアン分光法構成を使用することによって取得されたが、共焦点顕微鏡法ではなく、明視野蛍光が使用された。蛍光染料を用いて、マイクロ流体デバイス２１３０の中に後に送達される細胞の細胞核を染色した。細胞が懸濁液内に静止したままになると、マイクロ流体デバイスを動かすことによって、単一細胞の２Ｄマッピングが実行された。ブリルアンビームスポット及び蛍光が空間内で互いに重ね合わせられるので、ブリルアン信号を測定点ごとに蛍光強度に結び付けることができる。その結果を表現する１つの取り得る方法が図２２に示される。各点が細胞内の或る特定の領域において取り込まれた１つの測定値を表し、異なる色は、データ点の相対密度を符号化する。散乱スポットから、横軸上にプロットされた蛍光強度に従って、各ブリルアン信号の場所を明確に見定めることができる。例えば、破線の丸はそれぞれ、細胞核（蛍光領域）及び細胞質（非蛍光領域）からの測定点を示す。

図２１の実施形態を使用して細胞を分類する一例として、細胞に及ぼすＣｙｔｏＤの影響が分析された。処置する場合、及び処置しない場合の細胞のブリルアン及び蛍光両方の２Ｄ結像が行われ、図２２の方法を用いて、データを分析した。その結果が図２３ａ及び図２３ｂに示されており、（ａ）及び（ｂ）はそれぞれ、対照群及びＣｙｔｏＤ処置群の結果である。細胞がＣｙｔｏＤで処置された後に、細胞核ははるかに軟化することが観測された。

図１２及び図２１の実施形態において、ブリルアン信号が逐点走査モードにおいて取得され、そのモードは全体的なスループットの制限である。その場合に、個々の細胞を分析するのに十分な、細胞あたりの細胞内点を取得するのは難しい場合がある。したがって、図１２及び図２１の実施形態は、細胞集団分析に関して有用であるが、単一細胞の機械的フェノタイピングに関して強力というほどでない場合があり、それゆえ、細胞選別の適用例には適していない。この問題への１つの解決策は、単一の細胞を分析するのに十分な細胞内点を有するように流速を下げることである。別の解決策は、２つ以上の分光計を利用して、一度に２つ以上の場所を測定することである。代替的には、図７によるブリルアン分光法構成が、細胞の複数の点を同時に測定することができる。図７の光学配置は、図１２及び図２１の配置に比べて決定的に重要な変更を有する。この場合の主な変更は、ＣＣＤカメラによって記録された湾曲したブリルアンスペクトルパターンを一直線にするために、一対の対物レンズ７１３及び７１４が高分解能において利用されることである。これは、取得されたブリルアン信号が照明ラインビームに沿った対応する場所に正確に割り当てられるのを確実にするので決定的に重要である。具体的には、レーザー源７１０からのビームは最初にミラー７２４によって導光され、その後、ｘ方向において照明ラインビームになるように対物レンズ７１１によって合焦する。ラインビームは、マイクロ流体デバイス７１２の縁部から、そのチャネルの中に差し込む。細胞は、ｙ方向に沿って流動することによって、ラインビームを通り抜けることができる。ラインビームによって励起されたブリルアン散乱信号は、ブリルアン分光計の並列構成によって検出され、その構成は、一対の対物レンズ７１３及び７１４と、コリメートレンズ７１５と、円柱レンズ７１６と、分散デバイス（すなわち、ＶＩＰＡ）７１７と、円柱レンズ７１８及び７１９と、マスク７２０と、球面レンズ７２２と、高感度ＣＣＤカメラ７２３とからなる。

図１２及び図２１の分光計とは異なり、図７の多重化ブリルアン分光計は、照明ラインビームに沿って数多くの点からのブリルアン信号を同時に取得することができる。例えば、適切な対物レンズを選択し、分光計内の光学系を調整することによって、ｘ方向において１μｍ未満の分解能を達成することができる。細胞の通常のサイズは約１０μｍ～１５μｍであるので、細胞が流動しているときに、１ショットの場合に約１０個の点を、単一の細胞の場合に最大で１００個を超える点を取り込むことができる。このデータセットは、単一の細胞の細胞内機構を取得するのに十分な情報を確実に与えることになる。それゆえ、図７の実施形態は、その細胞内機械的フェノタイピングに基づいて、単一の細胞を分類する、より実効的な方法を提供する。幾つかの実施形態において、照明経路及び検出経路が直角に配置されることに加えて、図７の構成は、４５度及び６０度の配置角度を含む、０度より大きい任意の角度において機能することもできる。

図２４は、図７の実施形態の概念図を示す。照明レーザーライン２４１０は左縁部（ｘ方向）からマイクロ流体チャネル２４３０を照明し、細胞２４２０は、チャネルの内部をｙ方向に沿って流れる。細胞２４２０がレーザーライン２４１０に当たると、細胞２４２０の照明された領域からのブリルアン信号が同時に取得されることになる。細胞が通り抜けるとき、そのラインビームによって細胞体全体を走査することができる。最終的に、図２４に示されるように、細胞２４２０の２Ｄ画像２４４０を再構成することができる。

図７の実施形態は、細胞又はチャネルから反射されるか、又は散乱するレーザーからのスプリアス光を除去するために、フィルタリング要素を追加することによって更に改善することができる。このために、ファブリ－ペローフィルターを使用することができる。ファブリ－ペローフィルターは、実際には、選択された周波数を有する光が通過できるようにし、他の光を遮断できるようにするエタロンである。フィルターを適切に設計することによって、フィルターの透過ピークを、ブリルアン信号と重なり合うように調整することができる。スプリアス光は、ブリルアン信号とは異なる周波数を有し、抑圧されることになる。しかしながら、図７の方法は、位置合わせの問題及び潜在的なアーティファクトを導入する場合があり、正確に較正することによって解決されるべきである。

代替的には、吸収ガスチャンバーを使用することができる（Piironen P、Eloranta EW.「Demonstration of a high-spectral-resolution lidar based on an iodine absorption filter」Opt. Lett. 19, 234-236 (1994)）。ガスチャンバーは、ビームの方向変更（redirection）によるスペクトル分散を導入せず、それゆえ、並列分光計に極めて適している。ガスチャンバーは一般にガラスから製造され、明確に規定された吸収スペクトルを有する特定の原子元素からの蒸気を含む。光は入口を介してガスチャンバーを通り抜け、いかなる光学歪みも導入することなく、窓から出る。吸収ガスは、特定の光学波長において非常に狭い（１ＧＨｚ未満の）分子吸収スペクトルを有する。吸収ガスを適切に選択することによって、その吸収ラインが光源７１０の波長と完全に重なり合うガスチャンバーを設計することができる。例えば、ガスチャンバーは、レンズ７１２と７１３との間に配置することができ、ブリルアン信号が通り抜ける間に、スプリアス光（レーザー光源７１０と同じ波長を有する）が吸収されることになる。吸収スペクトルの線幅は非常に狭いので、レーザーの周波数の任意の小さなドリフトがあると、ガスチャンバーの実効性がなくなる。ガスチャンバーを図７の実施形態とともに十分に機能させるために、レーザー源の波長をガスチャンバーの吸収ラインにロックする必要がある。一例として、図２５は、ルビジウムガスを含む、ガスチャンバーの測定吸収スペクトルを示す。このガスチャンバーは７８０．２４ｎｍの波長において機能し、その結果は、チャンバーが９４．５℃まで加熱されたときに、ピーク吸収は約３４ｄＢであり、挿入損失が２ｄＢであることを示す。得られたスペクトル減衰によって、強い背景雑音を有する生体サンプルを測定できるようになる。

例４
本発明の例示的な構成が図２６に示される。垂直偏光レーザービーム２６２８が最初に偏光ビームスプリッター（ＰＢＳ）２６３４によって反射され、対物レンズ２６３２によって底部側からマイクロ流体チャネル２６２４の中央に合焦する。一実施形態において、ブリルアン散乱を励起するための光源として、１１ｍＷ単一モード直線偏光５３２ｎｍ ｃｗレーザー（Ｔｏｒｕｓ、Laser Quantum社）が使用された。４分の１波長板（ＱＷＰ）２６２６に起因して、合焦したビームは円偏光される。後方散乱光が同じ対物レンズ２６３２によって収集され、ＱＷＰ２６２６に再び通される。円偏光した光は最終的に、ＰＢＳ２６３４によって完全に透過する水平偏光した光に変換される。散乱光は、その後、ミラー２６３０によって導光され、ファイバーカップリングレンズ（ＦＣ）２６３６によってブリルアン分光計２６３８に結合される。ブリルアン分光計２６３８は、交差軸構成において、標準的な２ステージ仮想画像化フェーズドアレイ（ＶＩＰＡ）によって構成される。マイクロ流体チャネル２６２４の上側に、チャネル２６２４内部の細胞の流動状況を監視するために、明視野顕微鏡が構築された。破線矢印は、チャネル２６２４内部の細胞の流動方向を示す。照明のために赤色ＬＥＤ２６１６が使用され、ブリルアンビームを遮断するためにロングパスフィルターが使用された。一例として、限定はしないが、ＬＥＤ２６１６の波長は６６０ｎｍとすることができ、ロングパスフィルターはＦＥＬ０６００、Thorlabs社とすることができる。合焦したブリルアンビームの場所は、ロングパスフィルター（ＬＰ）２６１２を取り外すことによってあらかじめ決定された。ブリルアン信号に及ぼすＬＥＤ光２６１６の影響を排除するために、ブリルアン分光計２６３８の前方に狭帯域フィルターが配置された。一実施形態において、分光計のデータを測定サンプルの対応する場所に割り当てることができるように、ＣＣＤカメラ２６１０及びブリルアン分光計２６３８をＬａｂ ＶＩＥＷプログラムによって同期させた。一実施形態において、実験中に、分光計のサンプリング時間が５０ｍｓと設定された。図２７ａ～図２７ｄは、細胞内の複数の点においてブリルアン周波数を取得することに基づく、細胞流動実験の測定手順を示す。実験が行われているとき、ブリルアン分光計２６３８は絶えず信号を記録する。細胞がビームの場所を通り抜けるとき（矢印によって示される白色の点）、そのブリルアンシフトが測定される。

マイクロ流体デバイス
図２６の構成において使用されるチップは、入口においてシースフロー構成を備える単一の一直線のチャネル２６２４を有する。一実施形態において、チャネルの断面は１５０μｍ（幅）×５０μｍ（深さ）のサイズを有し、長さは約５０ｍｍである。チップは顕微鏡の２Ｄステージ上に組み付けられ、細胞懸濁液をチャネルの中に送り込むためのシリンジポンプに接続される。シースフロー技法を用いて、細胞をチャネルの中央に位置合わせすることができる。一実施形態において、流速は約２０μｍ／ｓ～４０μｍ／ｓである。全体的なスループットは一時間あたり細胞約１６０個から３００個まで変化し、平均では一時間あたり細胞２３０個である。

サンプル調製
細胞が培養され、Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋不含のリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の溶液内に再懸濁される。一実施形態において、最終的な細胞濃度は、１００万細胞／ｍｌ～１０００万細胞／ｍｌである。クロマチン脱凝縮実験の場合、古い培地が吸引され、完全な成長培地内の１００ｎｇ／ｍＬトリコスタチンＡ（ＴＳＡ）溶液と置き換えられる。その後、細胞は２時間、インキュベートされる。インキュベーション後に、細胞が、０．２５％トリプシンＥＤＴＡを用いて採取され、２５０×ｇにおいて５分間、遠心分離され、約２５０万細胞／ｍＬにおいて、Ｍｇ^２＋及びＣａ^２＋不含のＰＢＳに再懸濁された。細胞核を蛍光染色する場合、Ｖｙｂｒａｎｔ ＤｙｅＣｙｃｌｅ Ｒｕｂｙ染料（ThermoFisher社）が使用され、推奨プロトコルに従った。要するに、５０万細胞／ｍＬの濃度を有する細胞懸濁液に１μＬ染料が添加され、十分に混合される。最終的な染料濃度は５μＭである。その後、その混合物は３７℃で１５分～３０分間、インキュベートされ、光から保護される。その際、細胞は、洗浄することなく、蛍光実験の準備ができている。一実施形態において、実験のために、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞系統が使用される。

細胞の２次元画像
本発明の一実施形態において、細胞懸濁液が、シリンジポンプを用いて、マイクロ流体チャネルの中に徐々に送り込まれる。チャネル内に細胞が満たされると、ポンプが停止される。数分後に、細胞はチャネルの底部に沈殿するが、依然として、丸みを帯びた形状を保持する。その後、レーザービームスポットの高さが細胞の中心に調整され、顕微鏡のステージを走査することによって、水平面において２Ｄ走査が実行される。走査のステップサイズは、両方の次元において０．５μｍと設定される。一実施形態において、実験のために、ＮＩＨ ３Ｔ３細胞系統が使用される。

元のフローデータからの細胞のシグネチャの抽出
緩衝液内に懸濁された細胞は一般に丸い形状を有する。一実施形態において、細胞の直径は１０μｍから２０μｍに及ぶ。合焦したブリルアンビームは約０．５μｍのスポットサイズを有するので、細胞がビームスポットを横切って流れるときに複数の位置を測定することができる。一実施形態において、流動実験中に、ブリルアン分光計は、２０Ｈｚの速度において絶えずデータを取得する。図２７ａ～図２７ｄは、測定手順を例示する。具体的には、図２７ａ～図２７ｃは、異なる時点（ｔ１、ｔ２及びｔ３）において細胞がマイクロ流体チャネルを通って流れる場合を示す。スケールバーは３０μｍである。矢印によって示される白色の点は、レーザービームスポットの場所である。図２７ｄにおいて、ブリルアン信号の時間トレースが提示される。点は測定データであり、実線は見やすくするために引いた線である。

データの後処理において、明視野画像の助けを借りて、時間窓を用いて元のデータストリームから細胞事象を選出することができる。図２８ａ～図２８ｃは、５７７個の細胞について測定されたブリルアン周波数シフトの分布を表す。各データ点は、ブリルアン周波数シフトを測定するブリルアン分光計の１つの測定事象に対応する。細胞の機械的情報を保持するために、時間窓は一般に、各細胞事象の継続時間より広い。それゆえ、細胞及びＰＢＳ緩衝液両方の機械的シグネチャが記録され、図２８ａに示される。ヒストグラムの第１のピーク２８０２はＰＢＳ緩衝液のシグネチャであり、それは、そのブリルアン周波数シフトに基づいて容易に識別することができる。その際、このシグネチャは、ＰＢＳ緩衝液のみを流すことによって特徴付けられ、その結果が図２８ｂに示される。そのフローデータは正規分布に十分に当てはめることができ、それは、ブリルアンシフトが７．５１ＧＨｚであり、０．０４７ＧＨｚの幅を有することを示す。図２８ａからＰＢＳ緩衝液のシグネチャ２８０４を除去することにより、直接、細胞の機械的シグネチャを抽出することができ、その結果が図２８ｃに示される。細胞のシグネチャは２つのピークを明らかにする。測定データを当てはめるために、２つの正規分布２８０６及び２８０８の線形重ね合わせが使用された。それらの結果が図２８ｃにおいて実曲線２８０６及び２８０８によって示され、それぞれ７．５７ＧＨｚ及び７．８０ＧＨｚの中心周波数を有する。細胞核は細胞の最も剛性が高い細胞小器官であることが当該技術分野において既知である（非特許文献１０）；非特許文献２８）。それゆえ、実曲線はそれぞれ、細胞質及び細胞核のシグネチャである。これは、細胞核を染色し、蛍光画像をそのブリルアンデータと比較することによって確認することができる。さらに、３Ｔ３細胞の場合の細胞核の体積比は、３０％より大きいことが報告されており、それは、細胞質と細胞核との直径比が約３：７であることを意味する。それゆえ、細胞内の複数の点においてブリルアン周波数を取得することに基づく流動実験中に、細胞核のシグネチャは、細胞質より、ブリルアン分光計によって測定される機会が２倍より大きく、それも図２８ｃの２つのピーク２８０６及び２８０８の振幅によって確認される。

フローデータが細胞集団機構を表す
懸濁された細胞は丸みを帯びた形状を有し、それは簡単にするために球として近似することができる。シースフローの助けを借りて、細胞がマイクロ流体チャネルを通って流れるときに、細胞の中心を幅方向においてレーザービームスポットの場所に位置合わせすることができる。チャネルの深さが細胞サイズより大きいので、細胞の中心は、深さ方向において細胞ごとに異なることになる。このような場合には、細胞がレーザービームスポットを横切って進むときに、各単一細胞の直径を含む断面内の１つのラインがサンプリングされることになる。細胞流動中のブリルアン周波数シフトの測定値が、細胞集団の機構を表すのを確実にするために、それらの測定値が、細胞の中心を通る断面の画像と比較される。具体的には、細胞の２Ｄ画像が、図２９ａに示されるように取得された。図２９ｂは、２つの曲線２９０２及び２９０４の重ね合わせによって当てはめられる細胞集団の全体的な機構を表す、図２９ａの画像データの全ての分布を示す。細胞がレーザーを横切るラインに沿った一群の点に対応するブリルアンフローデータの分布が図２９ｃにプロットされ、曲線２９０８及び２９０６の重ね合わせによって当てはめられる。図２９ｂの２Ｄブリルアン画像データを図２７ｃのブリルアンフローデータと比較することによって、両方の分布が２ピークシグネチャを有することが観測される。より重要なことに、両方の分布に関するこれら２つのピークのブリルアンシフトは同じであり、すなわち、７．５７ＧＨｚ及び７．８０ＧＨｚである。したがって、フローデータが、細胞集団の機械的特性を正確に明らかにすると結論付けられる。

ブリルアンシグネチャが細胞核を細胞質から区別する
懸濁された細胞を球であると見なすと、固定されたビームスポットによって１つの直径が検知されるように、細胞がシースフローを介して位置合わせされる。しかしながら、実際の実験において、垂直方向における細胞の場所はわずかに上下変動するので、ビームスポットは実際には、その直径を通る断面をマッピングしている。図２８ｃの２ピークシグネチャを更に検証するために、蛍光染料を用いて、細胞の細胞核のみを染色した。図３０に示されるように、明視野（Ｉ）、蛍光（ＩＩ）及びブリルアン２Ｄ（ＩＶ）の画像が取得された。明視野画像及び蛍光画像を含む融合画像（ＩＩＩ）をブリルアン画像と比較することによって、ヒストグラム３００２及び３００４によってそれぞれ示されるように、細胞核のブリルアンシグネチャを細胞骨格のブリルアンシグネチャから容易に分離することができる。集団内の細胞間の小さな差を考えるとき、細胞内の複数の点においてブリルアン周波数を取得することに基づいて流動実験から取得されたデータの分布は、細胞結像からの分布に類似しているはずであり、それが、図３０と図２８ｃとの間の高い類似度によって確認される。したがって、図２８ｃの流動データの２つのピークがそれぞれ細胞核及び細胞骨格のシグネチャに対応することが検証される。

クロマチン脱凝縮が細胞核を軟化させる
クロマチンはＤＮＡ及びタンパク質の複合物であり、細胞核内に染色体を形成する。その機能は、細胞の細胞核に収まるように、かつＤＮＡ構造及び配列を保護するように、ＤＮＡを小さな体積の中に効率的に詰め込むことである。研究の積み重ねが、クロマチンの凝縮レベルが細胞核の剛性に密接に関連することを示唆する。例えば、クロマチン脱凝縮の結果として、細胞核の剛性が低下する。逆に、クロマチン凝縮の増加が、細胞核の硬化につながる。一実施形態において、機械的サイトメトリーを用いて、ＴＳＡ、ヒストンデアセチラーゼ阻害剤によって引き起こされるクロマチン脱凝縮の影響を特徴付けた。

図３１ａ～図３１ｃは、クロマチン脱凝縮による細胞核の軟化の実験的な観測結果を与える。１つの非限定的な実施形態において、３５６個及び３５３個の細胞が、ＴＳＡ処置群及び対照（非ＴＳＡ処置）群からそれぞれ収集される。図３１ａ及び図３１ｂに示されるように、細胞がＴＳＡで処置された後に、細胞核のブリルアンシフトが７．８０ＧＨｚ（曲線３１０８）から７．７１ＧＨｚ（曲線３１０４）に動かされ、それは細胞核の明確な軟化を示す。一方、細胞質のブリルアンシフトは概ね同じままであり（７．５６ＧＨｚ（曲線３１０２及び３１０６））、それは細胞質がＴＳＡによって影響を及ぼされなかったことを意味する。図３１ｃに示されるように、ＴＳＡ処置細胞及び対照細胞の細胞質に関する平均ブリルアンシフトにそれぞれ関連付けられる棒グラフ３１１０及び３１１２は、同じ高さを有し、ブリルアン周波数に変化がないことを示す。対照的に、ＴＳＡ処置細胞及び対照細胞の細胞核に関する平均ブリルアンシフトにそれぞれ関連付けられる棒グラフ３１１４及び３１１６は、異なる高さを有し、ブリルアン周波数に変化があることを示す。

したがって、本発明による機械的サイトメトリーは、オンチップブリルアン技法を用いて、細胞の細胞核シグネチャを識別することができる。それは、細胞集団の細胞核の機械的特性を測定するラベルフリーの非接触、非侵襲的方法を提供する。一実施形態において、総合スループットは一時間あたり約２３０細胞であり、それは、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）及びマイクロピペット吸引等の既存の技法よりはるかに効率的である。さらに、本発明による機械的サイトメトリーを用いて、細胞核の剛性に及ぼすクロマチン脱凝縮の影響を評価することができる。ＴＳＡ処置後に明確に軟化することがわかっている。細胞核剛性の変化は、遊走、分化及び悪性転換等の細胞の数多くの重要な活動に関与するので、本発明による機械的サイトメトリーは、細胞集団の細胞核機構の効率的で、ラベルフリーの特性評価が必要とされる場合に適用される可能性がある。

要するに、図１２～図３１ｃを参照すると、本発明による生体細胞を分類する方法は、各生体細胞内の複数の点においてブリルアン散乱スペクトルを測定することに基づく。測定されたブリルアン散乱スペクトルに基づいて、生体細胞内の異なる空間点において細胞内物理的特性に関連する１つ以上の指標が特定される。生体細胞は、生体細胞内の異なる空間点における細胞内物理的特性に基づいて分類される。

一実施形態において、生体細胞内の各測定点を含む、ブリルアン周波数シフトに関するヒストグラムが生成される。そのヒストグラムを当てはめるために、ガウス分布の線形重ね合わせが適用される。次に、ヒストグラム内の各ピークが特定され、各ピークは、細胞内の異なる領域からの機械的シグネチャを表す。生体細胞内の異なる空間点における物理的特性は、特定された機械的シグネチャと相関がある。

生体サンプルは、生物有機体、組織又は生体細胞を含むことができる。一実施形態において、生体細胞は生細胞である。更に別の実施形態において、指標としてブリルアン周波数シフトが選択される。さらに、一実施形態において、生体細胞内の異なる空間点において細胞内物理的特性を特定するステップは、画像を形成することと、特定された物理的シグネチャの空間による違いに基づいて、パラメーターを分割することとを含む。サンプルの物理的特性は、粘弾性率、密度、屈折率、電歪及びその組み合わせからなる群から選択される。

一実施形態において、生体サンプルを有する容器は、マイクロ流体デバイスのマイクロ流体チャネルである。生体細胞は、スペクトルが測定される間に、マイクロ流体チャネルを通って流れる。

一実施形態において、ブリルアン散乱の元の場所を識別するために、そして照明光ビームをマイクロ流体チャネル内の特定の場所に導光するために、ブリルアン光スペクトルパターンと同時に明視野２Ｄ画像が取得される。更に別の実施形態において、多次元ヒストグラムを作成して生体細胞を分類するために、蛍光散乱、ラマン散乱、前方散乱及び側方散乱とともに１つ以上のブリルアン指標が使用される。一実施形態において、細胞核を細胞質から分離するために、２Ｄ明視野細胞画像及び２Ｄ蛍光細胞画像を含む融合画像が、ブリルアン周波数シフトに基づく細胞画像と比較される。

ブリルアン周波数シフトは、点走査モードにおいて、又は多重化走査モードにおいて測定することができる。細胞内から取得された抽出された物理的特性は、単一の生体細胞又は生体細胞の集団の分析結果を指す場合がある。

一実施形態において、ブリルアンスペクトルを表すヒストグラムは、細胞質及び細胞核にそれぞれ対応する２つのピークを有する。更に別の実施形態において、ブリルアンスペクトルによって規定された細胞の細胞内機械的特性に基づいて、改変された生体細胞が無傷の生体細胞から区別され、細胞は、細胞骨格又は細胞核等の細胞内成分を標的にする薬物によって改変される。細胞内物理的特性を用いて、細胞を選別する。

図３２は、本発明の一実施形態によるシステムを示すブロック図である。ブリルアン分光計３２０２が、ブリルアン散乱光の空間スペクトルパターン３４０４と、ブリルアン光スペクトルとをユーザーインターフェース３２０８に与える。プロセッサ３２０６が、ブリルアン分光計３２０２、ユーザーインターフェース３２０８、及びメモリ３２１０と通信する。プロセッサ３２０６は、メモリ３２１０内の命令を実行するように構成される。一実施形態において、メモリ３２１０は、検出された空間スペクトルパターンに基づいて、各測定サンプル点における１つ以上のブリルアン指標を計算するための命令を含む。更に別の実施形態において、メモリ３２１０は、測定されたブリルアン散乱スペクトルに基づいて、生体細胞内の異なる空間点において細胞内物理的特性に関連する１つ以上の指標を抽出する命令と、生体細胞内の異なる空間点における物理的特性に基づいて、生体細胞を分類するための命令とを含む。さらに、メモリ３２１０は、ブリルアン周波数シフトに関するヒストグラムをプロットし、ヒストグラムをユーザーインターフェース３２０８に通信するための命令、ヒストグラムを当てはめるためにガウス分布の線形重ね合わせを適用するための命令、ヒストグラム内の各ピークを特定するための命令であって、ピークは細胞内の異なる領域からの機械的シグネチャを表す、命令、及び媒質に関連付けられるデータをヒストグラムから除去するための命令を含むことができる。

核の機械的特性
アクチンフィラメント、微小管及び中間径フィラメントから構成される細胞骨格は、核と機械的にしっかりと相互接続されている（Ingber DE, Wang N, Stamenovic D, "Tensegrity, cellular biophysics, and the mechanics of living systems", Rep Prog Phys. 77, 046603 (2014)）。アクチンフィラメントは、核に引張プレストレスを加えることで、核を硬くする。微小管フィラメントは、このプレストレスの釣り合いを保つために圧縮ストラットとして働く。したがって、核の剛性は、これらの２つの細胞骨格フィラメントの釣り合いによって取り持たれることとなる（Wakatsuki et al., J Cell Sci. 114, 1025-1036 (2001)、Chalut et al., Biophys J. 103, 2060-2070 (2012)）。

アクチン及び微小管の阻害を伴う細胞の特定
２つの薬物のサイトカラシンＤ（ｃｙｔｏＤ）及びノコダゾール（Ｎｏｃｏ）を３Ｔ３細胞に適用することで、アクチンフィラメント及び微小管フィラメントをそれぞれ阻害した。アメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ）から購入したＮＩＨ ３Ｔ３線維芽細胞を、全ての実験のために使用した。細胞を以下の標準的なプロトコルに従って培養した。微小管フィラメントの阻害のために、細胞をまず１ｕｇ／ｍＬのＮｏｃｏにより３０分間処置し、次いでトリプシン処理により回収し、測定前にＭｇ^２＋及びＣａ^２＋を有しないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の溶液内に１ｍＬ当たり約１０万個の細胞の濃度で再懸濁させた。濃度が低いため、流動により細胞は殆ど取り込まれなかった。その代わりに、懸濁液中の単一細胞は、それがマイクロ流体デバイス中に送達された後に結像された。図３３Ａに示されるように、棒グラフ３３１１及び３３１２は、それぞれ対照細胞及び処置細胞の核の平均ブリルアンシフトを表す。処置細胞のブリルアンシフト３３１２の方が０．２９ＧＨｚ高いことから、その核の明確な硬化が示される。機器の感度が約０．０１ＧＨｚであることを考慮して、微小管フィラメントが阻害された細胞は、核の機械的硬化に基づいて正常細胞から容易に特定された。

アクチンフィラメントの阻害のために、細胞をまず２ｕｇ／ｍＬのｃｙｔｏＤにより１０分間処置し、次いでトリプシン処理により回収し、測定前にＭｇ^２＋及びＣａ^２＋を有しないリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）の溶液内に１ｍＬ当たり約１００万個の細胞の濃度で再懸濁させた。ブリルアンに基づくラベルフリーフローサイトメトリーを使用して、それぞれ３６８個の細胞が対照群から取得され、２３２個の細胞が処置群から取得された。図３３Ｂは測定された結果を示し、棒グラフ３３２１及び３３２２は、それぞれ対照群及び処置群の核の平均ブリルアンシフトを表す。処置群３３２２は、対照群３３２１と比較して０．１２ＧＨｚの明確な減少を特徴とし、こうしてアクチンフィラメントの破壊による核の軟化が示される。

悪性細胞の特定
図３４は、第２の例示的な実施形態を示す。ブリルアンに基づくラベルフリーフローサイトメトリーを使用して、５種の癌関連細胞系統を試験した。その内の４種（バーバラアンカルマノス研究所から取得したＭ１、Ｍ２、Ｍ３、及びＭ４）は、ＭＣＦ１０Ａ細胞系統に由来する同種同系の腫瘍形成性が増している細胞系統であり、それはヒト乳癌の進行をモデル化するための標準的なアプローチである（Santner et al., Breast Cancer Res Treat. 65, 101-110 (2001)）。５つ目は、高転移性の乳癌細胞系統ＭＤＡ－ＭＢ－２３１（ＡＴＣＣから得られた）である。ＭＣＦ１０Ａ（Ｍ１）は、ヒト上皮の非腫瘍形成性の細胞系統である。ＭＣＦ１０ＡＴ１ｋ．ｃｌ２（Ｍ２）は、マウスに注射された場合に持続性の限局性良性病変を引き起こす前悪性細胞である。ＭＣＦ１０ＣＡ１ｈ（Ｍ３）細胞及びＭＣＦ１０ＣＡ１ａ．ｃｌ１（Ｍ４）細胞は、それらがマウスの尾静脈内に注射された場合に遠隔の肺に転移する能力を有する。実験により、Ｍ４細胞がＭ３細胞系統よりも素早く転移することも指摘される。それというのも、Ｍ４細胞はより素早く成長する腫瘍を形成し得るからである（Santner et al. (2001)）。

全ての細胞系統は、標準的なプロトコルに従って培養した。それらを、同じ培地（ＭＣＦ１０Ａ細胞系統（Ｍ１～Ｍ４）のための標準的な完全培地）内で増殖させた。細胞を、低濃度のトリプシンで培養物から回収し、それらを実験前にＭｇ^２＋及びＣａ^２＋を有しないＰＢＳ内に１ｍＬ当たり約２００万個の細胞の濃度で再懸濁した。細胞系統Ｍ１～Ｍ４及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１から、２２３個、３４３個、２３３個、５３８個及び４３０個の細胞が収集され、核の剛性の平均は、それぞれ棒グラフ３４２１、３４２２、３４２３、３４２４及び３４２５として示されている。棒グラフ３４２１、３４２２は、限局性腫瘍Ｍ２細胞系統が、ブリルアン周波数シフトの差（０．１６ＧＨｚ）に基づいて非腫瘍形成性の細胞系統Ｍ１と明らかに区別され得ることを示している。さらに、棒グラフ３４２３、３４２４及び３４２５は、転移性細胞系統Ｍ３、Ｍ４及びＭＤＡ－ＭＢ－２３１も、非転移性のＭ１及び限局性のＭ２の両方と統計学的有意差（ｐ値＜０．０１）をもって区別され得ることを示している。Ｍ３とＭ４との間に統計学的有意差は見出されなかった。それというのも、それらのブリルアンシフト測定値は互いに類似していたからである。しかしながら、Ｍ３（Ｍ４）とＭＤＡ－ＭＢ－２３１との間には統計学的有意差（ｐ値＜０．０１）が見出された。核の機械的シグネチャの測定に基づいて、正常細胞及び良性病変細胞は悪性癌細胞と区別されたため、癌の進行をグレード分けすることができる。

細胞内でのラミン発現の特定
図３５は、本発明の第３の例示的な実施形態を示す。核の主要な構造成分の１つは、ラミンとして知られるタンパク質群である。核ラミナの主要成分として、ラミンＡ／Ｃは、多数の機能、例えば核の構造的支持を与え、クロマチン構成、遺伝子調節並びにＤＮＡ複製及び修復を促進する（Ho and Lammerding, J Cell Sci. 125, 2087-2093 (2012)）。ラミンはまた、広範なヒト疾患につながることも分かっている。例えば、１０種を超える癌型からのエビデンスにより、ラミンは癌の進行の役割を担うか、又はそれに応答して変化することが示唆されている（Irianto et al., Cell Mol Bioeng. 9, 258-267 (2016)）。また、Ａ型ラミンにおける突然変異は、ハッチンソン・ギルフォード・プロジェリア症候群（ＨＧＰＳ）（Mounkes and Stewart, Current Opinion In Cell Biology. 16, 322-327(2004) (Butin-Israeli, Trends Genet. 28(9):464-71 (2012)）等の老化症の原因であることも分かっている。さらに、実験によって、ラミンＡ／Ｃの過剰発現が核の剛性を高める一方で、ノックダウンが剛性をより低くすることが示された（Pajerowski et al., Proc Natl Acad Sci USA 104, 15619-15624 (2007)、Lammerding et al., J Biol. Chem. 281, 25768-25780 (2006)、Davidson (2014)、Schaepe et al., Biophys. J 96, 4319-4325 (2009)、Swift et al., Science 341, 1240104 (2013)）。

ラミン発現の調整により生ずる核における機械的変化を測定するために必要とされる感度がこの方法を使用して可能であるため、それを細胞分類のために使用することができることを確認するために試験を行った。それを行うために、ＮＩＨ／３Ｔ３細胞を培養し、市販の脂質を基礎とするトランスフェクション試薬（Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔ）を使用して、ラミンＡ／Ｃ発現を選択的にノックダウンさせた。Ｄｈａｒｍａｆｅｃｔの溶液及びｓｉＲＮＡを事前に複合体化し、次いでトランスフェクション複合体を含む培地内で細胞をインキュベートした。１つはラミンＡ／Ｃをターゲティングするために知られており、１つは既知の細胞標的を有しないスクランブル配列である２種の市販のｓｉＲＮＡを使用した。ラミンＡ／ＣをターゲティングするｓｉＲＮＡに関しては、低効率のノックダウン及び高効率のノックダウンのそれぞれを達成するために２種の異なる用量（２５ｎＭ及び５０ｎＭ）を使用した。トランスフェクションを経なかった対照も含まれていた。７２時間のインキュベート後に、細胞をトリプシン処理により回収し、直ちにラベルフリーのブリルアンに基づくフローサイトメトリー構成を使用して分析した。図３５の３５１２、３５２２、３５３２、３５４２の棒グラフにそれぞれ示されるように、対照、スクランブル対照、低効率ノックダウン及び高効率ノックダウンのために、１２２個、１９５個、２０８個、１１４個の細胞を収集した。核の機械的特性は、スクランブル対照群３５２２において、非トランスフェクション対照群３５１２と比較してほぼ不変（０．０１ＧＨｚ未満）であったが、図３５の棒グラフ３５３２及び３５４２に示されるようにラミンＡ／ＣをターゲティングするｓｉＲＮＡでトランスフェクションされたサンプルにおいては、剛性に顕著な減少（０．０４ＧＨｚ及び０．０７ＧＨｚ）が観察された。他方で、３５１１、３５２１、３５３１及び３５４１の棒グラフに示されるように、細胞質の剛性には依然として影響はない。

並行してラミンＡ／Ｃ発現を可視化するために、標準的なプロトコルに従って免疫細胞化学を実施した。上記の７２時間のトランスフェクション後に、接着細胞を中性緩衝ホルマリンで固定化し、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００で透過処理を行い、ウシ血清アルブミンの溶液でブロッキングし、一次抗ラミン抗体と一緒に一晩インキュベートし、最後に蛍光体結合二次抗体と一緒に簡単にインキュベートした。各ステップ間にサンプルをＰＢＳで３回すすいだ。一定の結像条件（光強度、露光時間）で各サンプルの蛍光画像を撮影した。図３６に示されるように、図３６Ｂにおけるノックダウン群の蛍光強度は、図３６Ａにおけるスクランブル群の蛍光強度よりも大幅に弱いことから、ラミンＡ／Ｃ発現は、ラミンＡ／ＣをターゲティングするｓｉＲＮＡで処置されたサンプルにおいてスクランブルｓｉＲＮＡサンプルと比較してノックダウンされていることが指摘される。ラミンＡ／Ｃノックダウンを大まかに定量化するために、核タンパク質抽出物を、トランスフェクション後に全てのサンプルから採取した。

一実施形態において、サンプル内の少なくとも１つの細胞の核の機械的特性を測定する方法であって、ブリルアン分光法により可能となったラベルフリーサイトメトリーを使用して少なくとも１つの細胞の機械的シグネチャを取得することと、上記細胞の少なくとも１つの核の機械的シグネチャに基づいて細胞を分類することとを含む、方法が提供される。幾つかの実施形態において、ラベルフリーサイトメトリーは、ブリルアン走査を使用する本明細書において与えられる一連のステップのいずれかを含む。或る特定の実施形態において、上記ラベルフリーサイトメトリーは、第１の方向に沿って光ビームによって上記サンプルを照明するステップと、上記照明光ビームに応答して上記サンプルから放射されるブリルアン散乱光を収集するステップと、上記ブリルアン散乱光を、スペクトル分散を誘発する光学配置に送り、上記ブリルアン散乱光の空間スペクトルパターンを生成する検出ユニットに送るステップと、なお、上記光学配置及び上記検出ユニットは第２の方向に沿って位置決めされる；上記検出ユニット上で上記ブリルアン散乱光の上記空間スペクトルパターンを検出するステップと、なお、上記照明光ビームに沿った上記サンプルの複数の点が同時に測定され、上記サンプルの複数の点の少なくとも１つが細胞核である；上記検出ユニットにおいて、各空間点における上記スペクトルパターンを較正するステップと、上記検出された空間スペクトルパターンに基づいて、各測定サンプル点において上記１つ以上のブリルアン指標を計算するステップとを含む。幾つかの実施形態において、第１の方向と第２の方向との間の角度は０度より大きい任意の角度である。別の実施形態において、スペクトル分散を誘発する光学配置は、仮想画像化フェーズドアレイ（ＶＩＰＡ）、ファブリ－ペローエタロン又はエシェル格子を含む。他の実施形態において、スペクトル分散を誘発する光学配置は、サンプルから検出ユニットへの光路内の空間スペクトルパターンのサイズ、形状及び／又は角度の広がりを変更する光学要素を更に備える。

更なる実施形態において、上記サンプルは、生物有機体、組織又は生細胞を含む生体細胞を含む生体サンプルである。別の実施形態において、上記生体細胞は、懸濁されるか、２Ｄ基体に付着しているか、３Ｄ細胞外マトリックス内で培養されるか、又はマイクロ流体チップの１つ以上のチャネルを通って流れる。幾つかの実施形態において、上記少なくとも１つの細胞は、生きている真核細胞である。別の実施形態において、上記分類は、細胞集団又は単一細胞のいずれかに基づく。

幾つかの実施形態において、ブリルアン指標は、ブリルアン周波数シフト、ブリルアンスペクトル線幅、ブリルアン利得又は損失スペクトル、及びその組み合わせからなる群から選択される。更なる実施形態において、ブリルアン指標は、細胞核の機械的特性に関する情報を提供する。他の実施形態において、核の機械的特性は、弾性、粘性及び核の剛性である。幾つかの実施形態において、走査された細胞は、核の測定された機械的特性に基づいて分類される。別の実施形態において、走査された細胞は癌細胞として分類される。

別の実施形態において、サンプル内の少なくとも１つの細胞の核の機械的特性を測定する方法において使用するためのシステムが提供される。一実施形態において、該システムは、ブリルアン分光法により可能となったラベルフリーサイトメトリーを提供する。更なる実施形態において、該システムは、少なくとも１つの点がサンプル内の少なくとも１つの細胞の核内にある複数の点においてブリルアン散乱スペクトルに関連付けられる１つ以上のブリルアン指標を取得する。更なる実施形態において、該システムは、第１の方向に沿って光ビームによって上記サンプルを照明する照明源と、上記照明光ビームに応答して、上記サンプルから放射されるブリルアン散乱光を収集する１つ以上のレンズと、上記１つ以上のレンズから上記ブリルアン散乱光を受光する光学配置であって、該光学配置はスペクトル分散を誘発する、光学配置と、上記ブリルアン散乱光の空間スペクトルパターンを検出する検出ユニットであって、上記１つ以上のレンズ、上記光学配置及び上記検出ユニットは、第２の方向に沿って位置決めされ、上記照明光ビームに沿った上記サンプルの複数の点が同時に測定される、検出ユニットと、プロセッサであって、上記検出ユニットにおいて、（１）各空間点における上記スペクトルパターンを較正するための命令と、（２）上記検出された空間スペクトルパターンに基づいて、各測定サンプル点において上記１つ以上のブリルアン指標を計算するための命令とを実行する、プロセッサとを備える。

別の実施形態において、上記システムは、ブリルアン周波数シフト、ブリルアンスペクトル線幅、ブリルアン利得又は損失スペクトル、及びその組み合わせを含む１つ以上のブリルアン指標を取得する。更なる実施形態において、上記１つ以上のブリルアン指標は、少なくとも１つの細胞核の機械的特性を決定し、上記機械的特性は、弾性、粘性及び核の剛性を含む群から選択される。別の実施形態において、走査された細胞は、上記核の測定された機械的特性に基づいて分類される。更なる実施形態において、走査された細胞は、癌細胞として分類される。

更なる実施形態において、サンプル内の癌性細胞を特定する方法が提供される。一実施形態において、該方法は、本明細書に与えられるラベルフリーサイトメトリーを使用して細胞核の特性を測定することを含む。幾つかの実施形態において、該方法は、第１の方向に沿って光ビームによって上記サンプルを照明することと、上記照明光ビームに応答して上記サンプルから放射されるブリルアン散乱光を収集することと、上記ブリルアン散乱光を、スペクトル分散を誘発する光学配置に送り、上記ブリルアン散乱光の空間スペクトルパターンを生成する検出ユニットに送ることと、なお、上記光学配置及び上記検出ユニットは第２の方向に沿って位置決めされる；上記検出ユニット上で上記ブリルアン散乱光の上記空間スペクトルパターンを検出することと、なお、上記照明光ビームに沿った上記サンプルの複数の点が同時に測定され、上記サンプルの複数の点の少なくとも１つが細胞核である；上記検出ユニットにおいて、各空間点における上記スペクトルパターンを較正することと、上記検出された空間スペクトルパターンに基づいて、各測定サンプル点において上記１つ以上のブリルアン指標を計算することと、上記計算されたブリルアン指標と正常細胞のブリルアン指標とを比較することによって、上記サンプル内に存在する癌性細胞を特定することとを含む。

幾つかの実施形態において、１つ以上のブリルアン指標は、核の機械的特性に関する情報を提供する。別の実施形態において、該機械的特性は、弾性、粘性及び核の剛性を含む群から選択される。幾つかの実施形態において、癌性細胞は、その核の剛性を非癌性細胞の核の剛性と比較することにより特定される。

更なる実施形態において、サンプルは、生物有機体、組織又は生細胞を含む生体細胞を含む生体サンプルである。別の実施形態において、生体細胞は、懸濁されるか、２Ｄ基体に付着しているか、又は３Ｄ細胞外マトリックス内で培養されるか、又はマイクロ流体チップの１つ以上のチャネルを通って流れる。幾つかの実施形態において、少なくとも１つの細胞は、生きている真核細胞である。別の実施形態において、上記分類は、細胞集団又は単一細胞のいずれかに基づく。

別の実施形態においては、細胞がラミンＡ／Ｃ発現の抑制を伴うかどうかを判定する方法が提供される。更なる実施形態において、該方法は、ブリルアン分光法により可能となったラベルフリーサイトメトリーを使用して少なくとも１つの細胞の核の機械的シグネチャを取得することを含む。更なる実施形態において、細胞は、細胞の核の機械的シグネチャに基づいて、正常なラミンＡ／Ｃ発現を有する又はラミンＡ／Ｃ発現の抑制を伴うと分類される。別の実施形態において、ラベルフリーサイトメトリーは、本明細書に記載されるように実施される。

本発明を説明する文脈において（特に添付の特許請求の範囲の文脈において）「１つの（a、an）」及び「その（the）」という用語並びに類似の指示物を使用することは、本明細書において他に指示されない限り、又は文脈によって明確に否定されない限り、単数形及び複数形の両方を含むと解釈されるべきである。「備える」、「有する」「含む」及び「含有する」という用語は、他に言及されない限り、オープンエンドの用語（すなわち、「含むが、それに限定されない」を意味する）と解釈されるべきである。本明細書において値の範囲を列挙することは、本明細書において他に指示されない限り、その範囲内に入る別々の各値を個々に参照する簡潔な方法としての役割を果たすことを意図するにすぎず、本明細書において個々に列挙されたかのように、別々の各値が本明細書に組み込まれる。例えば、範囲１０～１５が開示される場合には、１１、１２、１３及び１４も開示される。本明細書において説明される全ての方法は、本明細書において他に指示されない限り、又は文脈によって明確に否定されない限り、任意の適切な順序において実行することができる。本明細書において与えられるありとあらゆる例、又は例示する用語（例えば、「～等の（such as）」）の使用は、本発明の理解をより容易にすることを意図するにすぎず、別に特許請求されない限り、本発明の範囲に制限を課すものではない。本明細書における文言は、任意の特許請求されない要素を、本発明を実施する上で不可欠であると示すものと解釈されるべきでない。

本発明の方法及び構成は、様々な実施形態の形で組み込むことができ、その幾つかのみが本明細書において開示されることは理解されよう。上記の説明を読むと、それらの実施形態の変形が当業者に明らかになる場合がある。本発明者らは、当業者が必要に応じてそのような変形を利用することを期待しており、本発明者らは、本発明が本明細書において具体的に説明されたのとは別のやり方で実施されることを意図している。

したがって、本発明は、適用法令によって許されるような添付の特許請求の範囲において列挙される主題の全ての変更及び均等物を含む。さらに、本明細書において他に指示されない限り、又はそうでなくても文脈によって明確に否定されない限り、本発明の全ての取り得る変形における上記の要素の任意の組み合わせが本発明によって包含される。

Claims (15)

1. サンプル内の癌性細胞を特定する方法であって、
   第１の方向に沿って光ビームによって前記サンプルを照明することと、
   前記照明光ビームに応答して前記サンプルから放射されるブリルアン散乱光を収集することと、
   前記ブリルアン散乱光を、スペクトル分散を誘発する光学配置に送り、前記ブリルアン散乱光の空間スペクトルパターンを生成する検出ユニットに送ることと、
   なお、前記光学配置及び前記検出ユニットは第２の方向に沿って位置決めされる；
   前記検出ユニット上で前記ブリルアン散乱光の前記空間スペクトルパターンを検出することと、
   なお、前記照明光ビームに沿った前記サンプルの複数の点が同時に測定され、前記サンプルの複数の点の少なくとも１つが細胞核である；
   前記検出ユニットにおいて、各空間点における前記スペクトルパターンを較正することと、
   前記検出された空間スペクトルパターンに基づいて、各測定サンプル点において前記１つ以上のブリルアン指標を計算することと、
   前記計算されたブリルアン指標と正常細胞のブリルアン指標とを比較することによって、前記サンプル内に存在する癌性細胞を特定することと、
   を含む、方法。
2. 細胞がラミンＡ／Ｃ発現の抑制を伴うかどうかを判定する方法であって、
   ブリルアン分光法により可能となったラベルフリーサイトメトリーを使用して細胞の機械的シグネチャを取得することと、
   なお、該取得することは、
   第１の方向に沿って光ビームによって前記サンプルを照明することと、
   前記照明光ビームに応答して前記サンプルから放射されるブリルアン散乱光を収集することと、
   前記ブリルアン散乱光を、スペクトル分散を誘発する光学配置に送り、前記ブリルアン散乱光の空間スペクトルパターンを生成する検出ユニットに送ることと、
   なお、前記光学配置及び前記検出ユニットは第２の方向に沿って位置決めされる；
   前記検出ユニット上で前記ブリルアン散乱光の前記空間スペクトルパターンを検出することと、
   なお、前記照明光ビームに沿った前記サンプルの複数の点が同時に測定され、前記サンプルの複数の点の少なくとも１つが細胞核である；
   前記検出ユニットにおいて、各空間点における前記スペクトルパターンを較正することと、
   前記検出された空間スペクトルパターンに基づいて、各測定サンプル点において前記１つ以上のブリルアン指標を計算することと、を含む；
   前記細胞の核の機械的シグネチャに基づいて、細胞を、正常なラミンＡ／Ｃ発現を有する又はラミンＡ／Ｃ発現の抑制を伴うと分類することと、
   を含む、方法。
3. 前記１つ以上のブリルアン指標は、ブリルアン周波数シフト、ブリルアンスペクトル線幅、ブリルアン利得又は損失スペクトル、及びその組み合わせからなる群から選択される、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記第１の方向と前記第２の方向との間の角度は０度より大きい任意の角度である、請求項１又は２に記載の方法。
5. スペクトル分散を誘発する前記光学配置は、仮想画像化フェーズドアレイ（ＶＩＰＡ）、ファブリ－ペローエタロン又はエシェル格子を含む、請求項１又は２に記載の方法。
6. スペクトル分散を誘発する前記光学配置は、前記サンプルから前記検出ユニットへの光路内の前記空間スペクトルパターンのサイズ、形状及び／又は角度の広がりを変更する光学要素を更に備える、請求項１又は２に記載の方法。
7. 前記サンプルは、生物有機体、組織又は生細胞を含む生体細胞を含む生体サンプルである、請求項２に記載の方法。
8. 前記生体細胞は、懸濁されるか、２Ｄ基体に付着しているか、３Ｄ細胞外マトリックス内で培養されるか、又はマイクロ流体チップの１つ以上のチャネルを通って流れる、請求項７に記載の方法。
9. 前記核の機械的特性は、弾性、粘性及び核の剛性を含む群から選択される、請求項２に記載の方法。
10. 走査された細胞は、前記核の測定された機械的特性に基づいて分類される、請求項９に記載の方法。
11. 走査された細胞は、癌細胞として分類される、請求項１０に記載の方法。
12. 前記１つ以上のブリルアン指標は、前記核の機械的特性に関する情報を提供し、前記機械的特性は、弾性、粘性及び核の剛性を含む群から選択される、請求項１に記載の方法。
13. 前記少なくとも１つの細胞は、生きている真核細胞である、請求項１に記載の方法。
14. 前記分類は、細胞集団又は単一細胞のいずれかに基づく、請求項１に記載の方法。
15. 前記少なくとも１つの細胞は、
    （ｉ）マイクロ流体チャネルの内を流れており、
    （ｉｉ）懸濁液内で不動であり、又は、
    （ｉｉｉ）３Ｄゲルの小滴内に封入されている、
    請求項１に記載の方法。

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