JP7149273B2 - Ｃａｒおよび転写因子を発現する細胞、ならびにその使用 - Google Patents

Description

本発明の分野
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）および転写因子を共発現する細胞に関する。当該転写因子の発現は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよび／またはｉｎ ｖｉｖｏにおいて、細胞の分化および／または疲弊を防ぐか、あるいは低減し得る。

本発明の背景
キメラ抗原受容体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）の特異性をＴ細胞のエフェクター機能へと移植するタンパク質である。その通常の形は、抗原を認識するアミノ末端、スペーサー、膜貫通ドメイン、および細胞内Ｔ細胞シグナリングドメインを有するＩ型膜貫通ドメインタンパク質である。ＣＡＲ技術は、任意の表面抗原に対して特異的な多数のＴ細胞の生成を可能にする。細胞は、例えば末梢血Ｔ細胞集団の、ｅｘ ｖｉｖｏなウイルスベクター形質導入によって作られる。形質導入された細胞は、ＣＡＲを発現し、そして疾患の治療のための養子免疫治療のために用いられ得る。

臨床上有効な、治療量のＴ細胞を生成するためには、形質導入および拡張に先立ってＴ細胞の活性化が必要である。既存のＴ細胞の活性化／拡張法は通常、かなりのＴ細胞の分化を伴い、そして移植されたＴ細胞の、一時的な生存、持続性の欠如、およびｉｎ ｖｉｖｏでの拡張の欠如を含む一時的な効果をもたらし得る。これまで、ＣＡＲ－Ｔ細胞免疫治療の臨床上の有効性は、不十分なＴ細胞拡張、および患者内への注入後の不十分な持続性によって限定されている。したがって、ｉｎ ｖｉｖｏで生存し、拡張し、そして持続する、改善された治療用ＣＡＲ－Ｔ細胞組成物が必要とされている。

各細胞タイプと関連する発現マーカーを示す、Ｔ細胞分化の直線モデルを例示する模式図。ＡＰＣ－抗原提示細胞；ＴＣＭ－セントラルメモリーＴ細胞；ＴＥＦＦ－エフェクターＴ細胞；ＴＥＭ－エフェクターメモリーＴ細胞；ＴＮ－ナイーブＴ細胞；ＴＳＣＭ－Ｔメモリー幹細胞。 形質導入後（０日目）、およびＣＤ１９を発現する標的細胞との２４時間の共培養から６日後（７日目）での、エフェクター細胞、エフェクターメモリー（ＥＭ）細胞、セントラルメモリー（ＣＭ）細胞、およびナイーブ細胞の割合を示すグラフ。Ｔ細胞は、非形質導入（ＮＴ）であるか、ＣＡＲのみを発現するベクター（ＨＤ３７）を用いて形質導入されたか、またはＣＡＲおよび転写因子ＦＯＸＯ１を発現するベクター（ＨＤ３７－ＦＯＸＯ１）を用いて形質導入されたかのいずれか（ｗｉｔｈｅｒ）であった。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の部分集団が、別々に解析された。 ＣＤ１９を発現する標的細胞との２４時間の共培養から６日後での、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ２７およびＣＤ６２Ｌの発現を示すグラフ。Ｔ細胞は、非形質導入（ＮＴ）であるか、ＣＡＲのみを発現するベクター（ＨＤ３７）を用いて形質導入されたか、ＣＡＲおよび転写因子ＥＯＭＥＳを発現するベクター（ＨＤ３７－ＥＯＭＥＳ）を用いて形質導入されたか、またはＣＡＲおよび転写因子ＦＯＸＯ１を発現するベクター（ＨＤ３７－ＦＯＸＯ１）を用いて形質導入されたかのいずれか（ｗｉｔｈｅｒ）であった。 ＣＤ１９を発現する標的細胞との２４時間の共培養から６日後での、ＣＤ４＋Ｔ細胞およびＣＤ８＋Ｔ細胞における、ＣＤ６２Ｌの発現を示すグラフ。Ｔ細胞は、非形質導入（ＮＴ）であるか、ＣＡＲのみを発現するベクター（ＨＤ３７）を用いて形質導入されたか、またはＣＡＲと転写因子Ｒｕｎｘ３およびＣＢＦベータとを発現するベクター（ＨＤ３７－Ｒｕｎｘ３＿ＣＢＦベータ）を用いて形質導入されたかのいずれか（ｗｉｔｈｅｒ）であった。 形質導入後（０日目）、およびＣＤ１９を発現する標的細胞との２４時間の共培養から６日後（７日目）での、エフェクター細胞、エフェクターメモリー（ＥＭ細胞）、セントラルメモリー（ＣＭ）細胞およびナイーブ細胞の割合を示すグラフ。Ｔ細胞は、非形質導入（ＮＴ）であるか、ＣＡＲのみを発現するベクター（ＨＤ３７）を用いて形質導入されたか、ＣＡＲおよび転写因子ＢＡＣＨ２を発現するベクター（ＨＤ３７－ＢＡＣＨ２）を用いて形質導入されたか、またはＣＡＲおよび転写因子ＢＡＣＨ２の変異バージョンを発現するベクター（ＨＤ３７－ＢＡＣＨ２＿Ｓ５２０Ａ）を用いて形質導入されたかのいずれか（ｗｉｔｈｅｒ）であった。ＣＤ４＋およびＣＤ８＋の部分集団が、別々に解析された。

本発明の側面の要約
ＣＡＲ－Ｔ細胞を有効なものとするためには、当該細胞がｉｎ ｖｉｖｏで持続および拡張することと、過度に急速な分化および疲弊に抵抗することとが重要である。ＣＡＲ Ｔ細胞の持続性および生着性は、投与されるナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、およびＴ幹細胞様メモリーＴ細胞の割合と関連する。

本発明者らは、細胞内で転写因子とＣＡＲを共発現させることにより、細胞の分化および／または疲弊の予防あるいは低減が可能になるということを見出した。これは、免疫治療のための細胞組成物内でナイーブ細胞、セントラルメモリー細胞、および幹細胞様メモリー細胞の割合を増やすほど、ｉｎ ｖｉｖｏでの当該細胞の持続性および拡張がより有効になるという結果をもたらす。

したがって第１の側面において本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性核酸分子および転写因子をコードする第２の外因性核酸分子を含む細胞を提供する。

当該転写因子は、細胞の分化および／または疲弊を予防あるいは低減させ得る。

当該転写因子は、ＢＬＩＭＰ－１などのエフェクターメモリーリプレッサーであり得る。

代替として当該転写因子は、ＢＣＬ６またはＢａｃｈ２などのセントラルメモリーリプレッサーであり得る。

当該転写因子は、Ｂａｃｈ２、またはＡＬＫによってリン酸化される能力を減ぜられているか、もしくは取り除かれている改変されたバージョンのＢａｃｈ２であるか、あるいはこれらを含み得る。例えば改変Ｂａｃｈ２は、配列番号２で示されるアミノ酸配列を参照して次の位置：Ｓｅｒ－５３５、Ｓｅｒ－５０９、Ｓｅｒ－５２０のうちの１つまたはそれより多くにおいて変異を含み得る。

当該転写因子は、ＦＯＸＯ１であり得る。

当該転写因子は、ＥＯＭＥＳであり得る。

当該転写因子は、Ｒｕｎｘ３および／またはＣＢＦベータを含み得る。

第２の側面において本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列、および本発明の第１の側面において定義される転写因子をコードする第２の核酸配列を含む核酸コンストラクトを提供する。

当該核酸コンストラクトは、以下の構造：
ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ－ＴＦ；または
ＴＦ－ｃｏｅｘｐｒ－ＣＡＲ
を有し得、式中：
ＣＡＲが当該ＣＡＲをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒがＣＡＲおよび転写因子の共発現を可能にする核酸配列であり；そして
ＴＦが転写因子をコードする核酸配列である、核酸コンストラクトである。

核酸配列”ｃｏｅｘｐｒ”は、自己切断ペプチドを含む配列をコードし得る。

第３の側面において本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列、および本発明の第１の側面において定義される転写因子をコードする第２の核酸配列を含む核酸配列のキットを提供する。

第４の側面において本発明は、本発明の第２の側面に記載される核酸コンストラクトを含むベクターを提供する。

第５の側面において本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列を含む第１のベクターと；本発明の第１の側面において定義される転写因子をコードする第２の核酸配列を含む第２のベクターとを含む、ベクターのキットを提供する。

第６の側面において本発明は、本発明の第１の側面に記載の細胞を作るための方法であって、本発明の第２の側面に記載の核酸コンストラクトか、本発明の第３の側面に記載の核酸配列のキットか、本発明の第４の側面に記載のベクターか、または本発明の第５の側面に記載のベクターのキットを、細胞内に導入するステップを含む方法を提供する。

当該細胞は、被験体から単離される試料に由来し得る。

第７の側面において本発明は、本発明の第１の側面に記載の複数種の細胞を含む医薬組成物を提供する。

第８の側面において本発明は、疾患の処置および／または予防のための方法であって、本発明の第７の側面に記載の医薬組成物を被験体へと投与するステップを含む方法を提供する。

当該方法は、以下のステップを含み得る：
（ｉ）被験体から細胞を含む試料を単離することと；
（ｉｉ）本発明の第２の側面に記載の核酸コンストラクトか、本発明の第３の側面に記載の核酸配列のキットか、本発明の第４の側面に記載のベクターか、または本発明の第５の側面に記載のベクターのキットを用いて、細胞の形質導入またはトランスフェクションをすることと；
（ｉｉｉ）（ｉｉ）に由来する細胞を被験体に投与すること。

第９の側面において本発明は、疾患の処置および／または予防における使用のための、本発明の第７の側面に記載の医薬組成物を提供する。

第１０の側面において、疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、本発明の第１の側面に記載の細胞の使用が提供される。

本発明の第８、第９、第１０の側面に関して、当該疾患はがんであり得る。

詳細な記載
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）
本発明の細胞は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする外因性核酸分子を含む。

古典的なＣＡＲは、細胞外抗原認識ドメイン（バインダー）を細胞内シグナリングドメイン（エンドドメイン）へとつなぐ、キメラのＩ型膜貫通タンパク質である。バインダーは典型的に、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）であるが、抗体様の抗原結合部位を含む他の形式にも基づき得る。スペーサードメインは通常、バインダーを細胞膜から単離するために、そしてそれを適切に配向させるために必要である。一般的に用いられるスペーサードメインは、ＩｇＧ１のＦｃである。抗原に依っては、さらにコンパクトなスペーサー（例えば、ＣＤ８α由来の軸およびＩｇＧ１のヒンジのみ）が十分であり得る。膜貫通ドメインは当該タンパク質を細胞膜内に係留し、そしてエンドドメインにスペーサーをつなぐ。

初期のＣＡＲ設計は、ＦｃεＲ１またはＣＤ３ζいずれかのγ鎖の細胞内部分に由来するエンドドメインを有した。結果としてこれらの第１世代の受容体は、Ｔ細胞による同源の標的細胞の殺滅を誘発するに足るが、Ｔ細胞が増殖して生存するようにＴ細胞を完全には活性化できない免疫シグナル１を伝達した。この制限を克服するために、混成エンドドメインが構築された：Ｔ細胞共刺激分子の細胞内部位とＣＤ３ζの細胞内部位との融合体は、抗原認識後に活性化シグナルおよび共刺激シグナルを同時に伝達し得る第２世代の受容体をもたらす。もっとも一般的に用いられる共刺激ドメインは、ＣＤ２８のものである。これは、もっとも強力な共刺激シグナル－Ｔ細胞増殖を誘発するいわゆる免疫シグナル２を供給する。ＴＮＦ受容体ファミリー（生存シグナルを伝達し、密接に関係するＯＸ４０および４１ＢＢなど）のエンドドメインを含むいくつかの受容体も、記載されている。活性化シグナル、増殖シグナル、および生存シグナルを伝達し得るエンドドメインを有する、さらにいっそう強力な第３世代のＣＡＲも、現在記載されている。

ＣＡＲをコードする核酸は、例えばレトロウイルスベクターを用いて、Ｔ細胞に輸送され得る。レンチウイルスベクターも使用され得る。この方法において、多数のがん特異的Ｔ細胞が養子細胞移植のために生成され得る。ＣＡＲが標的抗原に結合すると、これは、ＣＡＲが発現されるＴ細胞への活性化シグナルの伝達をもたらす。したがってＣＡＲは、標的抗原を発現する腫瘍細胞に対するＴ細胞の特異性及び細胞傷害性を導く。

したがって、典型的にＣＡＲは、（ｉ）抗原結合ドメインと；（ｉｉ）スペーサーと；（ｉｉｉ）膜貫通ドメインと；（ｉｉｉ）シグナリングドメインを含むか、またはそれと関連する細胞内ドメインとを含む。

抗原結合ドメイン
抗原結合ドメインは、抗原を認識するＣＡＲの部分である。多数の抗原結合ドメイン（抗体、抗体模倣物、およびＴ細胞受容体の抗原結合部位に基づくものを含む）が本分野で既知である。抗原結合ドメインは例えば、モノクローナル抗体に由来する一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）か；標的抗原の天然リガンドか；標的に対して十分な親和性を有するペプチドか；シングルドメイン抗体か；Ｄａｒｐｉｎ（設計アンキリンリピートタンパク質）などの人工的なシングルバインダーか；またはＴ細胞受容体に由来する一本鎖を含み得る。

抗原結合ドメインは、抗体の抗原結合部位に基づかないドメインを含み得る。抗原結合ドメインは例えば、腫瘍細胞の表面受容体に対する可溶性リガンドであるタンパク質／ペプチド（例えば、サイトカインまたはケモカインなどの可溶性ペプチド）に基づくドメインか；膜に係留されるリガンドもしくは受容体の細胞外ドメインであって、これと結合するペア対応物が腫瘍細胞上で発現される細胞外ドメインを含み得る。

抗原結合ドメインは、抗原の天然リガンドに基づき得る。

抗原結合ドメインは、コンビナトリアルライブラリーに由来する親和性ペプチド、または新規に設計された親和性タンパク質／ペプチドを含み得る。

スペーサードメイン
ＣＡＲは、抗原結合ドメインを膜貫通ドメインとつなぎ、そして抗原結合ドメインをエンドドメインから空間的に分離するためのスペーサー配列を含む。柔軟なスペーサーは、結合を促進するために抗原結合ドメインが異なる方向に配位することを可能にする。

膜貫通ドメイン
膜貫通ドメインは、膜を渡るＣＡＲの配列である。

膜貫通ドメインは、膜内において熱力学的に安定な任意のタンパク質構造であり得る。典型的にこれは、いくつかの疎水性残基を含むアルファヘリックスである。任意の膜貫通タンパク質の膜貫通ドメインが、本発明の膜貫通部分を供給するために用いられ得る。タンパク質の膜貫通ドメインの存在および幅は、当業者によりＴＭＨＭＭアルゴリズム（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／ＴＭＨＭＭ－２．０／）を用いて判別され得る。さらに、タンパク質の膜貫通ドメインが相対的に単純な構造（すなわち、膜を渡るために十分な長さの疎水性アルファヘリックスを作ると予想されるポリペプチド配列）であるとすると、人工的に設計されたＴＭドメインも用いられ得る（米国特許第７０５２９０６Ｂ１号は、合成膜貫通コンポーネントについて記載している）。

膜貫通ドメインはＣＤ２８に由来し得、これは優れた受容体安定性を与える。

エンドドメイン
エンドドメインは、ＣＡＲのシグナル伝達部分である。それはＣＡＲの細胞内ドメインの一部であるか、またはそれと関連し得る。抗原認識後に受容体はクラスターを形成し、天然のＣＤ４５およびＣＤ１４８がシナプスから除外され、そして細胞にシグナルが伝達される。もっとも一般的に用いられるエンドドメインのコンポーネントは、３つのＩＴＡＭを含むＣＤ３ゼータのものである。これは抗原の結合後、活性化シグナルをＴ細胞へと伝達する。ＣＤ３ゼータは、完全に適格（ｃｏｍｐｅｔｅｎｔ）な活性化シグナルを提供し得ず、追加の共刺激シグナルが必要となり得る。例えば、キメラのＣＤ２８およびＯＸ４０が、ＣＤ３ゼータと共に増殖／生存シグナルを伝達するために用いられ得、または３つすべてが一緒に用いられ得る。

本発明のＣＡＲまたはＴａｎＣＡＲのエンドドメインは、ＣＤ２８のエンドドメインならびにＯＸ４０およびＣＤ３ゼータのエンドドメインを含み得る。

当該エンドドメインは：
（ｉ）ＣＤ３ゼータ由来のエンドドメインなどのＩＴＡＭを含むエンドドメイン；および／または
（ｉｉ）ＣＤ２８由来のエンドドメインなどの共刺激ドメイン；および／または
（ｉｉｉ）例えばＴＮＦ受容体ファミリー（ＯＸ－４０または４－１ＢＢなど）のエンドドメインといった生存シグナルを伝達するドメイン
を含み得る。

抗原認識部分がシグナル伝達部分とは別個の分子上にある、多数の系が記述されている（国際公開第０１５／１５０７７１号；国際公開第２０１６／１２４９３０号および国際公開第２０１６／０３０６９１号に記載のものなど）。したがって本発明の細胞に発現されたＣＡＲは、抗原結合ドメインおよび膜貫通ドメインを含む抗原結合コンポーネントを含み得る；この抗原結合コンポーネントは、シグナリグドメインを含む別個の細胞内シグナリングコンポーネントと相互作用し得る。本発明の細胞は、抗原結合コンポーネントおよび細胞内シグナリングコンポーネントなどを含むＣＡＲシグナリング系を含み得る。

シグナルペプチド
本発明の細胞はシグナルペプチドを含み得、そのためＣＡＲが細胞内で発現されるとき、新生タンパク質は小胞体へと、その後にその発現場所である細胞表面へと導かれる。

シグナルペプチドは、分子のアミノ末端にあり得る。

本発明のＣＡＲは、一般式：
シグナルペプチド－抗原結合ドメイン－スペーサードメイン－膜貫通ドメイン－細胞内Ｔ細胞シグナリングドメイン（エンドドメイン）
を有し得る。

転写因子
本発明の細胞は、転写因子をコードする外因性核酸分子を含む。

転写因子は特定のＤＮＡ配列に結合して、その配列を含むかまたは隣接する遺伝子の発現を調節することで、ＤＮＡからメッセンジャーＲＮＡへの遺伝情報の転写速度を制御するタンパク質である。

転写因子は、ＲＮＡポリメラーゼの動員を促進（アクチベーターとして）するか、または妨害（リプレッサーとして）することで働く。

転写因子は、ＤＮＡのエンハンサー領域またはプロモーター領域のいずれかに取りつく、少なくとも１つのＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）を含む。転写因子に依存して、隣接する遺伝子の転写が上方または下方調節される。転写因子は、他のタンパク質（転写コレギュレーターなど）のための結合部位を有するトランス活性化ドメイン（ＴＡＤ）も含む。

遺伝子発現の調節のために転写因子は様々な手段を用い、この手段としてＲＮＡポリメラーゼのＤＮＡへの結合の安定化もしくは妨害、またはヒストンタンパク質のアセチル化もしくは脱アセチル化の触媒が挙げられる。転写因子は、ヒストンタンパク質をアセチル化してＤＮＡとヒストンとの結合を弱め、そしてＤＮＡを転写しやすくし、これにより転写が上方調節される、ヒストンアセチル基転移酵素（ＨＡＴ）としての活性を有し得る。あるいは転写因子は、ヒストンタンパク質を脱アセチル化してＤＮＡとヒストンの結合を強め、そしてＤＮＡを転写しにくくし、これにより転写が下方調節される、ヒストン脱アセチル化酵素（ＨＤＡＣ）としての活性を有し得る。転写因子が機能し得る別の機構は、転写因子ＤＮＡ複合体へのコアクチベーターまたはコリプレッサータンパク質の動員による。

基本転写因子または上流転写因子という、２つの機構クラスの転写因子がある。

基本転写因子は、転写開始前複合体の形成にかかわる。もっとも一般的なものは、ＴＦＩＩＡ，ＴＦＩＩＢ，ＴＦＩＩＤ，ＴＦＩＩＥ，ＴＦＩＩＦ，およびＴＦＩＩＨと略される。これらは遍在し、全てのクラスＩＩ遺伝子の転写開始部位（複数可）を囲むコアプロモーター領域と相互作用する。

上流転写因子は、転写を刺激または抑制するために開始部位の上流に結合するタンパク質である。上流転写因子は、遺伝子の近くにどのような認識配列が存在するかに依存して相当に多様であるゆえに、これらは特定の転写因子と同義である。

特定の転写因子のいくつかの例を、以下の表において示す：

転写因子はしばしば、配列の類似性、およびこれによるそのＤＮＡ結合ドメインの三次構造に基づいて分類される。

ベーシックドメインを有する転写因子として、ロイシンジッパー因子（例えば、ｂＺＩＰ，ｃ－Ｆｏｓ／ｃ－Ｊｕｎ，ＣＲＥＢ，および植物のＧボックス結合因子）と；ヘリックスループヘリックス因子（例えば、ユビキタス（クラスＡ）因子；筋原性転写因子（ＭｙｏＤ）；Ａｃｈａｅｔｅ－ＳｃｕｔｅおよびＴａｌ／Ｔｗｉｓｔ／Ａｔｏｎａｌ／Ｈｅｎ）と；ヘリックスループヘリックス／ロイシンジッパー因子（例えば、ｂＨＬＨ－ＺＩＰ，ｃ－Ｍｙｃ，ＮＦ－１（Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｘ），ＲＦ－Ｘ（１，２，３，４，５，ＡＮＫ），およびｂＨＳＨ）とが挙げられる。

亜鉛配位ＤＮＡ結合ドメインを有する転写因子として、核内受容体型のＣｙｓ４ジンクフィンガー（ステロイドホルモン受容体および甲状腺ホルモン受容体類似因子など）と；ダイバースＣｙｓ４ジンクフィンガー（ＧＡＴＡ因子など）と；Ｃｙｓ２Ｈｉｓ２ジンクフィンガードメイン（ＴＦＩＩＩＡおよびＳｐ１を含むユビキタス因子など）と；Ｋｒｕｐｐｅｌを含む発生／細胞周期調節因子と；ＮＦ－６Ｂ類似結合特性を有する大型因子と；Ｃｙｓ６システイン－亜鉛クラスターおよび交互配置型ジンクフィンガーとが挙げられる。

ヘリックスターンヘリックスドメインを有する転写因子として、ホメオドメインを持つものと；ペアードボックスと；フォークヘッド／ウィングドヘリックスと；熱ショック因子と；トリプトファンクラスターと；ＴＥＡＤ１，ＴＥＡＤ２，ＴＥＡＤ３，ＴＥＡＤ４などのＴＥＡ（転写エンハンサー因子）ドメインとが挙げられる。

最後に、副構との接触を伴うベータスキャフォールド因子があり、ＲＨＲ（Ｒｅｌ相同領域）クラスと；ＳＴＡＴと；ｐ５３と；ＭＡＤＳボックスと；ベータバレルアルファヘリックス転写因子と；ＴＡＴＡ結合タンパク質と；ＨＭＧボックスと；ヘテロメリックＣＣＡＡＴ因子と；Ｇｒａｉｎｙｈｅａｄと；低温ショックドメイン因子と；Ｒｕｎｔとが挙げられる。

本発明の転写因子は、恒常的活性化型であるか、または条件的活性化型（すなわち、活性化を要する）であり得る。

転写因子は天然由来であるか、または人工的であり得る。

Ｔ細胞分化の抑制
活性化の後にＴ細胞は、図１に示す様々なＴ細胞サブタイプへと分化する。本発明者らは、ＣＡＲ Ｔ細胞の被験体内での持続性および生着性は、被験体へと投与されるナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、および幹細胞様メモリーＴ細胞の割合に関連する、ということを示す。

本発明の細胞は、患者へと投与するための組成物内におけるナイーブＴ細胞、セントラルメモリーＴ細胞、および／または幹細胞様メモリーＴ細胞の割合を効果的に増やす転写因子をコードする外因性核酸分子を含み得る。

当該転写因子は例えば、セントラルメモリーをリプレスする転写因子（ＢＣＬ６またはＢＡＣＨ２など）であり得る。セントラルメモリーリプレッサーは、Ｔ細胞のエフェクターメモリー細胞への分化を阻害し、そのためＴ細胞が、あまり分化していないＴ細胞サブタイプのもの（ナイーブＴ細胞および幹細胞様メモリーＴ細胞など）として残る。これらのリプレッサーは、図１に示す様々なステージを通してＴ細胞の分化速度を妨害または減少させ、Ｔ細胞集団をよりナイーブな表現型へとバイアスする。

あるいは、当該転写因子はエフェクターメモリーをリプレスする転写因子（ＢＬＩＭＰ－１など）であり得る。

ＢＣＬ６
Ｂ細胞リンフォーマタンパク質（ＢＣＬ６）は、Ｎ末にＰＯＺ／ＢＴＢドメインを含む、進化的に保存されたジンクフィンガー転写因子である。ＢＣＬ６は配列特異的な転写のリプレッサーとして働き、Ｂ細胞のＳＴＡＴ依存的なインターロイキン４（ＩＬ－４）応答を調整することが示されている。ＢＣＬ６は、いくつかのコリプレッサー複合体と相互作用して転写を阻害する。

ＢＣＬ６のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｐ４１１８２）から入手でき、配列番号１として以下に示す。
配列番号１－ＢＣＬ６

ＢＣＬ６は、以下のアミノ酸位置：５１８－５４１，５４６－５６８，５７４－５９６，６０２－６２４，６３０－６５２，６５８－６８１に、６つのジンクフィンガーを含む。

ＢＡＣＨ２
Ｂｒｏａｄ ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ ｃａｐ’ｎ’ｃｏｌｌａｒ ｈｏｍｏｌｏｇｙ（Ｂａｃｈ）２タンパク質は、ｂｒｉｃ－ａ－ｂｒａｃ ａｎｄ ｔｒａｍｔｒａｃｋとしても知られる、９２ｋＤａの転写因子である。Ｂａｃｈ２タンパク質はベーシックロイシンジッパードメインを介して、ｍｕｓｃｕｌｏａｐｏｎｅｕｒｏｔｉｃ ｆｉｂｒｏｓａｒｃｏｍａ（Ｍａｆ）ファミリーのタンパク質とヘテロ二量体を形成する。Ｂａｃｈ２の遺伝子座はスーパーエンハンサー（ＳＥ）内にあり、そしてＳＥに調節される遺伝子の発現を調節する。ＳＥは細胞系列遺伝子の発現に重要である。Ｔ細胞においては、ＳＥに調節される遺伝子の大部分が、サイトカインおよびサイトカイン受容体の遺伝子である。Ｂａｃｈ２は、全てのＴ細胞系列においてＳＥと関連する、主要な遺伝子である。

Ｂａｃｈ２タンパク質は、７２のリン酸化部位からなる。これらの部位のうちＳｅｒ－３３５は、Ａｋｔの標的となるコンセンサス配列（ＲＸＲＸＸ（Ｓ／Ｔ）Ｘ）からなる。１１の部位（Ｓｅｒ－２６０，Ｓｅｒ－３１４，Ｔｈｒ－３１８，Ｔｈｒ－３２１，Ｓｅｒ－３３６，Ｓｅｒ－４０８，Ｔｈｒ－４４２，Ｓｅｒ－５０９，Ｓｅｒ－５３５，Ｓｅｒ－５４７，およびＳｅｒ－７１８）は、ｍＴＯＲの標的コンセンサス配列（＋１位のプロリン）を生ずる。Ｓｅｒ－５３５およびＳｅｒ－５０９のＡｌａへの置換は、Ｂａｃｈ２の核局在を増やし、その標的遺伝子の下方調節を増強する。

Ｓｅｒ－５２０部位は、リン酸化についてのＡｋｔの基質として同定された。Ｓｅｒ－５２０のＡｌａへの置換は、Ｂａｃｈ２のリプレッサー能力も増加する。ＷＴまたは変異型Ｂａｃｈ２へのｅＧＦＰの融合により、Ｓ５２０Ａ Ｂａｃｈ２の核局在の増強が明らかになった。Ｔ細胞活性化の際のＢａｃｈ２のリン酸化は、細胞質へのＢａｃｈ２の分離をもたらす。リン酸化部位での変異は、このような分離に対してＢａｃｈ２に抵抗性を与え、したがって、その核への局在を増やす。

本発明の細胞は、野生型タンパク質と比較して核局在の増えたＢａｃｈ２バリアントを発現する、外因性核酸分子を含み得る。当該バリアントは、配列番号２で示される配列を参照してＳｅｒ－５３５，Ｓｅｒ－５２０，またはＳｅｒ－５０９において変異を有し得る。当該変異は、ＳｅｒからＡｌａへの置換などの置換であり得る。

Ｂａｃｈ２はコンセンサスモチーフ（５’－ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡＧＣ－３’）に結合し、このモチーフはＡＰ－１ファミリーによって認識されるモチーフ（５’－ＴＧＡ（Ｃ／Ｇ）ＴＣＡ－３’）の一部である。転写因子であるＡＰ－１ファミリーは、ＴＣＲ活性化の下流の遺伝子の発現の誘導に関与する。ＡＰ－１転写因子ファミリーとしてｃ－Ｊｕｎ，ＪｕｎＢおよびｃ－Ｆｏｓが挙げられる。ＡＰ－１因子は、ＴＣＲ活性化に際してリン酸化され、その後エフェクターへの分化に関与する遺伝子を調節する。Ｂａｃｈ２は、重複するモチーフへの結合についてＡＰ－１と競合することで、これらの遺伝子の活性化をリプレスする。

Ｂａｃｈ２のｍＲＮＡの発現はナイーブＣＤ８Ｔ細胞において高く、そしてセントラルメモリー細胞（ＣＤ６２Ｌ＋ＫＬＲＧ１－）、エフェクター細胞（ＣＤ６２Ｌ－ＫＬＲＧ１－）、および終末分化したエフェクター細胞（ＣＤ６２Ｌ－ＫＬＲＧ１＋）において、徐々に下方調節される。Ｂａｃｈ２の欠損は終末分化したＴ細胞をもたらし、アポトーシスを増加させる。

Ｂａｃ２のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｑ９ＢＹＶ９）から入手でき、配列番号２として以下に示す。
配列番号２－Ｂａｃｈ－２野生型

５２０位においてＳからＡへの置換を有する変異型Ｂａｃｈ２の配列を、配列番号３として示す。Ｓ５２０Ａ置換は、太字で下線を引かれている。
配列番号３－Ｓ５２０Ａ Ｂａｃｈ２変異体（ＡＫＴに対して非感受的）

ＢＬＩＭＰ－１
Ｂ－ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ－ｉｎｄｕｃｅｄ ｍａｔｕｒａｔｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ １（ＢＬＩＭＰ１）は、ベータインターフェロン（β－ＩＦＮ）遺伝子発現のリプレッサーとして働く。このタンパク質は、β－ＩＦＮ遺伝子プロモーターのＰＲＤＩ（ｐｏｓｉｔｉｖｅ ｒｅｇｕｌａｔｏｒｙ ｄｏｍａｉｎ Ｉ ｅｌｅｍｅｎｔ）と特異的に結合する。

Ｂリンパ球、Ｔリンパ球、ＮＫ細胞および他の免疫系細胞内でＢｌｉｍｐ－１タンパク質の発現が増加すると、抗体を分泌するプラズマ細胞の増殖および分化を介して免疫反応が起こる。Ｂｌｉｍｐ－１は、造血幹細胞の「マスターレギュレーター」であるとも考えられている。

ＢＬＩＭＰ－１は抗体分泌細胞（ＡＳＣ）の終末分化制御に関与し、エフェクターＴ細胞の恒常性の維持において重要な役割を果たす。

ＢＬＩＭＰ－１のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｏ７５６２６）から入手でき、配列番号４として以下に示す。
配列番号４－ＢＬＩＭＰ－１

ＦＯＸＯ１
フォークヘッドボックスタンパク質Ｏ１（ＦＯＸＯ１）は、横紋筋肉腫におけるフォークヘッドとしても知られ、ヒトにおいてはＦＯＸＯ１遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＦＯＸＯ１はインスリンシグナリングによる糖新生およびグリコーゲン分解の調節において重要な役割を果たす転写因子であり、そして前脂肪細胞の脂肪生成への関与決定の中心でもある。ＦＯＸＯ１は主に、複数の残基におけるリン酸化によって調節される；ＦＯＸＯ１の転写活性は、そのリン酸化状態に依存する。

ＦＯＸＯ１のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｑ１２７７８）から入手でき、配列番号５として以下に示す。
配列番号５－ＦＯＸＯ１

ＥＯＭＥＳ
ＥＯＭＥＳは、Ｅｏｍｅｓｏｄｅｒｍｉｎ、およびＴ－ｂｏｘ ｂｒａｉｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ２（Ｔｂｒ２）としても知られ、ヒトにおいてはＥＯＭＥＳ遺伝子によってコードされるタンパク質である。ＥＯＭＥＳは、共通したＤＮＡ結合ドメイン（Ｔボックス）を分け合う保存されたタンパク質ファミリーのメンバーである。Ｔボックス遺伝子は、発生プロセスの調節に関与する遺伝子発現を制御する転写因子をコードする。Ｅｏｍｅｓ自体は、放射状グリアおよび他の関連する細胞の調節を制御する。Ｅｏｍｅｓが免疫応答に関与することが見出されており、他の系における関連についていくつかの弱い証拠が存在している。

ＥＯＭＥＳのアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号０９５９３６）から入手でき、配列番号６として以下に示す。
配列番号６－ＥＯＭＥＳ

ＲＵＮＸ３
Ｒｕｎｘ３、またはＲｕｎｔ関連転写因子３は、ｒｕｎｔドメインを含む転写因子ファミリーのメンバーである。このタンパク質とベータサブユニットのヘテロ二量体は、多数のエンハンサーおよびプロモーター内に見いだされるコアＤＮＡ配列（５’－ＹＧＹＧＧＴ－３’）に結合して複合体を形成し、転写を活性化または抑制し得る。Ｒｕｎｘ３は他の転写因子とも相互作用する。Ｒｕｎｘ３は腫瘍の抑制因子として機能し、この遺伝子はがんにおいて頻繁に欠失するか、または転写をサイレンスされる。様々なアイソフォームをコードする複数種の転写バリアントが、この遺伝子について見出されている。

ＲＵＮＸ３のアミノ酸配列はＵｎｉＰｒｏｔ（アクセッション番号Ｑ１３７６１）から入手でき、配列番号７として以下に示す。
配列番号７－ＲＵＮＸ３

ＣＢＦベータ
コア結合因子サブユニットベータ（ＣＢＦベータ）はヘテロ二量体型コア結合転写因子のベータサブユニットであり、造血（例えばＲＵＮＸ１）および骨形成（例えばＲＵＮＸ２）に特異的な多数の遺伝子をマスターレギュレートするＰＥＢＰ２／ＣＢＦ転写因子ファミリーに属する。このベータサブユニットは、ＤＮＡ非結合調節サブユニットである；複合体が様々なエンハンサーおよびプロモーター（ネズミ白血病ウイルス、ポリオーマウイルスエンハンサー、Ｔ細胞受容体エンハンサー、およびＧＭ－ＣＳＦプロモーターが挙げられる）のコア部位に結合するときに、このベータサブユニットはアルファサブユニットによるＤＮＡ結合をアロステリックに増強する。選択的スプライシングにより、異なるカルボキシル末端をコードする２つのｍＲＮＡバリアントが生成される。

ＣＢＦベータのアミノ酸配列は（アクセッション番号Ｑ１３９５１）から入手でき、配列番号８として以下に示す。
配列番号８－ＣＢＦベータ

外因性核酸分子
本発明は、転写因子をコードする外因性核酸分子を含む細胞を提供する。用語「外因性」は、当該核酸分子が組換え手法によって作られ、ベクターを用いて細胞内に導入されるということを意味する。細胞は核酸分子を含み、そして転写因子を発現（または過剰発現）するために操作される。

核酸
本明細書において使用される場合、用語「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、および「核酸」は、互いに同義であるように意図される。

多数の異なるポリヌクレオチドおよび核酸が、遺伝子コードの縮退の結果として同一のポリペプチドをコードし得るということが、当業者により理解される。さらに、当業者が常用技術を用いて、ポリペプチドが発現される特定のホスト生物のコドン使用頻度を反映するために、本明細書中に記載されるポリヌクレオチドによってコードされるポリペプチドの配列に影響しないヌクレオチドの置換を作り得る、ということも理解される。

本発明による核酸は、ＤＮＡまたはＲＮＡを含み得る。この核酸は、一本鎖または二本鎖であり得る。この核酸は、その中に合成または改変されたヌクレオチドを含むポリヌクレオチドであり得る。オリゴヌクレオチドに対する多数の異なるタイプの改変が、本分野において知られている。この改変として、メチルホスホネートおよびホスホロチオエート骨格、当該分子の３’末端および／または５’末端におけるアクリジンまたはポリリジン鎖の付加が挙げられる。本明細書中に記載の使用目的のために、ポリヌクレオチドが本分野において利用できる任意の方法を用いて改変され得ることが理解される。このような改変は、対象ポリヌクレオチドのｉｎ ｖｉｖｏ活性または寿命を増強するために行われ得る。

用語「バリアント」、「ホモログ」、または「派生物」はヌクレオチド配列との関連において、配列からのまたは配列への、１つ（またはそれを超える）の核酸の任意の置換、バリエーション、改変、交換、欠失、または付加を含む。

核酸コンストラクト
本発明は、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列、および転写因子をコードする第２の核酸配列を含む核酸コンストラクトを提供する。

核酸コンストラクトは、２つ以上のタンパク質を発現できる核酸配列も含み得る。例えば核酸コンストラクトは、２つの核酸配列間に切断部位をコードする配列を含み得る。当該切断部位は自己切断性であり得、そのため、新生ポリペプチドが産生されると、このポリペプチドはただちに、いかなる外部の切断活性をも要さずに２つのタンパク質に切断される。

様々な自己切断部位が知られており、以下の配列を有する口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）２ａの自己切断ペプチドが挙げられる：
配列番号９
ＲＡＥＧＲＧＳＬＬＴＣＧＤＶＥＥＮＰＧＰ
または
配列番号１０
ＱＣＴＮＹＡＬＬＫＬＡＧＤＶＥＳＮＰＧＰ

あるいは共発現配列は、内部リボソーム侵入配列（ＩＲＥＳ）または内部プロモーターであり得る。

ベクター
本発明は、本発明による１つ以上の核酸配列（複数可）もしくはコンストラクト（複数可）を含む、ベクターまたはベクターのキットも提供する。このようなベクターは、核酸配列（複数可）またはコンストラクト（複数可）をホスト細胞内へと導入するために用いられ得、その結果、ホスト細胞は核酸配列またはコンストラクトによってコードされるタンパク質を発現する。

当該ベクターは例えば、プラスミド、ウイルスベクター（レトロウイルスベクターもしくはレンチウイルスベクターなど）、トランスポゾンベースのベクター、または合成ｍＲＮＡであり得る。

当該ベクターは、Ｔ細胞にトランスフェクションまたは形質導入し得る。

細胞
本発明は、ＣＡＲ、転写因子を共発現する細胞を提供する。

当該細胞は、細胞溶解性免疫細胞であり得る。

細胞溶解性免疫細胞は、細胞性免疫において中心的な役割を果たすタイプのリンパ球であるＴ細胞またはＴリンパ球であり得る。細胞溶解性免疫細胞は、細胞表面上のＴ細胞受容体（ＴＣＲ）の存在により、Ｂ細胞およびナチュラルキラー細胞（ＮＫ細胞）などの他のリンパ球から区別され得る。以下に要約するように、Ｔ細胞には様々なタイプがある。

ヘルパーＴヘルパー細胞（ＴＨ細胞）は、Ｂ細胞からのプラズマ細胞およびメモリーＢ細胞への成熟と、細胞傷害性Ｔ細胞およびマクロファージの活性化などの免疫プロセスにおいて、他の白血球を支援する。ＴＨ細胞はその表面にＣＤ４を発現する。ＴＨ細胞は、抗原提示細胞（ＡＰＣ）の表面上にあるＭＨＣクラスＩＩ分子によってペプチド抗原を提示されると、活性化状態になる。このＴＨ細胞は、ＴＨ１，ＴＨ２，ＴＨ３，ＴＨ１７，Ｔｈ９，またはＴＦＨを含むいくつかのサブタイプ（これらは、異なるタイプの免疫応答を促進するために異なるサイトカインを分泌する）のうちの１つへと分化し得る。

細胞溶解性Ｔ細胞（ＴＣ細胞またはＣＴＬ）は、ウイルスに感染された細胞および腫瘍細胞を破壊し、そして移植拒絶反応にも関与する。ＣＴＬはその表面にＣＤ８を発現する。この細胞は、ＭＨＣクラスＩ（すべての有核細胞の表面に存在する）に会合される抗原への結合により標的を認識する。レギュラトリーＴ細胞によって分泌されるＩＬ－１０，アデノシン，および他の分子によってＣＤ８＋細胞はアネルギー状態へと不活化され得、実験的自己免疫性脳脊髄炎などの自己免疫疾患を防ぐ。

メモリーＴ細胞は抗原特異的Ｔ細胞のサブセットであり、感染が回復した後であっても長期的に存続する。メモリーＴ細胞はその同種抗原への再暴露に際して、ただちに多数のエフェクターＴ細胞へと拡張し、したがって免疫系に、過去の感染に対する「メモリー」を提供する。メモリーＴ細胞は、３つのサブタイプを含む：セントラルメモリーＴ細胞（ＴＣＭ細胞）および２タイプのエフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ細胞およびＴＥＭＲＡ細胞）。メモリー細胞は、ＣＤ４＋またはＣＤ８＋のいずれかであり得る。典型的にメモリーＴ細胞は、細胞表面タンパク質ＣＤ４５ＲＯを発現する。

レギュラトリーＴ細胞（Ｔｒｅｇ細胞）は、以前はサプレッサーＴ細胞として知られており、免疫寛容の維持のために重要である。この細胞の主要な役割は、Ｔ細胞性免疫を免疫応答の終わりに向けてシャットダウンすることと、胸腺における負の選択のプロセスを逃れた自己反応性Ｔ細胞を抑制することである。

２つの主要なクラスのＣＤ４＋Ｔｒｅｇ細胞が、記載されている－内在性Ｔｒｅｇ細胞およびアダプティブＴｒｅｇ細胞。

内在性Ｔｒｅｇ細胞（ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦｏｘＰ３＋のＴｒｅｇ細胞としても知られる）は胸腺において生じ、成長途上のＴ細胞と、ＴＳＬＰによって活性化されている骨髄系（ＣＤ１１ｃ＋）および形質細胞様（ＣＤ１２３＋）樹状細胞の両方との間の相互作用に関連付けられる。内在性Ｔｒｅｇ細胞は、ＦｏｘＰ３と呼ばれる細胞内分子の存在により他のＴ細胞から区別され得る。ＦＯＸＰ３遺伝子の変異は、レギュラトリーＴ細胞の発生を防ぎ、致死的な免疫疾患であるＩＰＥＸを引き起こし得る。

アダプティブＴｒｅｇ細胞（Ｔｒ１細胞またはＴｈ３細胞としても知られる）は、通常の免疫応答の間に生じ得る。

ナチュラルキラー細胞（またはＮＫ細胞）は細胞溶解性細胞の１つのタイプであり、自然免疫系の一部を形成する。ＮＫ細胞は、ウイルスに感染した細胞からの自然シグナルに対する急速な応答を、ＭＨＣに依存しない様式により提供する。

ＮＫ細胞（自然リンパ球のグループに属する）は大顆粒リンパ球（ＬＧＬ）として定義され、Ｂリンパ球およびＴリンパ球を産生するリンパ系共通前駆細胞から分化する第３種の細胞を構成する。ＮＫ細胞は骨髄、リンパ節、脾臓、扁桃および胸腺において分化および成熟し、その後これらから循環内へと入ることが知られている。

本発明の細胞は、上記の細胞タイプのいずれかであり得る。

転写因子がＴ細胞の分化または疲弊を低減させるか、あるいは阻害する場合、当該細胞は優先的に、以下のＴ細胞サブタイプの１つであり得る：ナイーブＴ細胞；幹細胞様メモリーＴ細胞；およびセントラルメモリーＴ細胞。

本発明の細胞は、患者自身の末梢血（ファーストパーティー）からか、ドナー末梢血からの造血幹細胞移植の状況（セカンドパーティー）においてか、または縁故関係のないドナー由来の末梢血（サードパーティー）から、ｅｘ ｖｉｖｏに作られ得る。

あるいは細胞は、誘導前駆細胞または胚性前駆細胞から、例えばＴ細胞へのｅｘ ｖｉｖｏな分化に由来し得る。あるいは、溶解機能を維持して治療上の細胞として働き得る不死化細胞系列が用いられる。

これらすべての実施形態において細胞は、ＣＡＲおよび転写因子をコードするＤＮＡまたはＲＮＡの導入であって、ウイルスベクターを用いる形質導入、ＤＮＡまたはＲＮＡを用いるトランスフェクションを含む様々な手法の１つによる導入によって生成され得る。

本発明の細胞は、被験体由来のｅｘ ｖｉｖｏ細胞であり得る。当該細胞は末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）試料由来であり得る。細胞は、本発明の核酸配列またはコンストラクトで形質導入される前に、例えば抗ＣＤ３モノクローナル抗体を用いる処置によって活性化および／または拡張され得る。

本発明の細胞は：
（ｉ）被験体または上記の他の供給源から細胞を含む試料を単離することと；
（ｉｉ）本発明による核酸配列またはコンストラクトを用いて細胞の形質導入またはトランスフェクションすることと
によって作られ得る。

組成物
本発明は、本発明の複数種の細胞を含む医薬組成物にも関連する。当該医薬組成物はさらに、薬学的に許容されるキャリアー、希釈剤、または賦形剤を含み得る。当該医薬組成物は必要に応じて、１つ以上のさらなる医薬活性ポリペプチドおよび／または医薬活性化合物を含み得る。このような製剤は、例えば静脈内注入のために適した形態であり得る。

処置方法
本発明の細胞は、がん細胞などの標的細胞を殺す能力を有し得る。

本発明の細胞は、ウイルス感染などの感染の処置のために用いられ得る。

本発明の細胞は、病原となる免疫反応（例えば、自己免疫疾患、アレルギー、および移植片対ホスト拒絶反応）の制御にも用いられ得る。

本発明の細胞は、膀胱がん、乳がん、結腸がん、子宮内膜がん、腎臓がん（腎細胞）、白血病、肺がん、メラノーマ、非ホジキンリンパ腫、すい臓がん、前立腺がん、および甲状腺がんなどの、がん性疾患の処置にも用いられ得る

本発明の細胞は、以下の処置に用いられ得る：舌、口、および咽頭のがんを含む口腔ならびに咽頭のがん；食道、胃、および直腸結腸のがんを含む消化器系のがん；肝細胞癌および胆管癌を含む肝臓ならびに胆管（ｂｉｌｉａｒｙ ｔｒｅｅ）のがん；気管支がんおよび喉頭のがんを含む呼吸器系のがん；骨肉腫を含む骨および関節のがん；メラノーマを含む皮膚のがん；乳がん；女性において子宮、卵巣および子宮頸部のがん、男性において前立腺および精巣のがんを含む生殖器のがん；腎細胞癌、および子宮（ｕｔｔｅｒｅｒ）または膀胱の移行上皮細胞癌を含む腎尿路のがん；神経膠腫、多型膠芽腫、および髄芽腫を含む脳のがん；甲状腺がん、副腎がん、および多発性内分泌腫瘍症候群に関連するがんを含む内分泌系のがん；ホジキンリンパ腫および非ホジキンリンパ腫を含むリンパ腫；多発性骨髄腫および形質細胞腫；急性および慢性の両方の白血病（骨髄性またはリンパ性）；ならびに、他および部位不特定のがん（神経芽腫を含む）。

本発明は目下、実施例によってさらに記載される。実施例は、本発明を実施する当業者の支援に役立つことを意図し、いかなる方法においても本発明の範囲を限定することを意図しない。

実施例
実施例１－キメラ抗原受容体（ＣＡＲおよび転写因子（ＴＦ）の共発現
ＢＷ５Ｔ細胞内で、バイシストロニックコンストラクトを単一の転写物として発現した。この転写物は２Ａ部位において自己切断して、キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）；および転写因子（ＴＦ）を生み出す。２Ａ部位および転写因子を欠くか（「ＣＡＲのみ」）、またはＣＡＲおよび２Ａ部位を欠く（「ＴＦのみ」）コントロールコンストラクトも生成した。

当該ＣＡＲは、ＣＤ３ゼータおよび共刺激受容体４１ＢＢに由来するエンドドメインを含む抗ＣＤ１９ＣＡＲであった。

以下の表に示す転写因子を含むコンストラクトが試験された：

実施例２－表現型アッセイ
Ｔ細胞の表面上での様々なＣＡＲの発現は、ＣＡＲ抗原の非存在下におけるＴ細胞のメモリー状態に影響し得る。さらに、ＣＡＲがその同種抗原へと結合するとそのＴ細胞が活性化し、よりナイーブなセントラルメモリー表現型から、より分化したエフェクターメモリー表現型／エフェクター表現型へのさらなる分化をもたらす。適切な転写因子／リプレッサーの発現により、このＣＡＲを介する分化が様々な程度に防がれると予想される。

様々な組み合わせのＣＡＲ－ＴＦを発現するＴ細胞、ならびに関連するＣＡＲのみのコントロールおよびＴＦのみのコントロールを、２４時間に渡ってＣＤ１９陽性のＳＫＯＶ３標的細胞と共培養し、その後、当該Ｔ細胞を回収して７日目まで培養した。細胞をセントラルメモリーへとバイアスする因子を発現している細胞が、形質導入後によりナイーブであるか、そして抗原を有する標的細胞を用いた刺激に際してもよりナイーブなままであるかについて見るために、共培養から０日目、および７日目において、下記のメモリーマーカーをフローサイトメトリーによって解析した。
メモリーマーカー－ＣＣＲ７，ＣＤ４５ＲＡ，ＣＤ６２Ｌ，ＣＤ２７

ＦＯＸＯ１についてのデータを図２に示す。ＦＯＸＯ１とＣＡＲ（ＨＤ３７）の共発現により、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋部分集団の両方について０日目および７日目のいずれにおいても、ナイーブ細胞およびセントラルメモリー細胞（ＣＭ）の割合が増加した。これは、ＦＯＸＯ１が、形質導入後および標的細胞との共培養後のいずれにおいても、細胞をナイーブ表現型／セントラルメモリー表現型へとバイアスするということを示す。

図３は、標的細胞との２４時間の共培養から６日後における、ＣＤ２７およびＣＤ６２Ｌの発現についてのデータを示す。転写因子ＥＯＭＥＳは、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋Ｔ細胞部分集団の両方において、ＣＤ２７の有意な上方調節を引き起こした。ＦＯＸＯ１は、特にＣＤ８＋細胞において、ＣＤ２７の上方調節を引き起こした。転写因子ＦＯＸＯ１は、ＣＤ４＋およびＣＤ８＋部分集団の両方において、ＣＤ６２Ｌの有意な上方調節を引き起こした。ＣＤ６２Ｌはナイーブ細胞／セントラルメモリー細胞のマーカーであり、メモリーの表現型決定はＦＯＸ０１について、ＣＤ６２Ｌレベルと相関する：より多くのナイーブ細胞およびメモリー細胞。ＣＤ２７は完全に分化したエフェクター細胞以外のすべての細胞のマーカーであるため、ＥＯＭＥＳを発現する細胞は主に、ＣＤ６２Ｌの有意な上方調節を示さない、より分化していないエフェクターメモリーのサブタイプであり得る。

図４に示すように、形質導入後（０日目）および２４時間の共培養の６日後において、Ｒｕｎｘ３およびＣＢＦベータのいずれの存在もＣＤ６２Ｌの上方調節を引き起こした。

ＢＡＣＨ２およびＢＡＣＨ２変異体Ｓ５２０Ａについてのデータを図５に示す。ＢＡＣＨ２およびＢＡＣＨ２Ｓ５２０Ａのいずれも、０日目および７日目においてナイーブ細胞およびセントラルメモリー細胞（ＣＭ）の割合を増加させる。

別個のアッセイにおいて、様々な組み合わせのＣＡＲ－ＴＦを発現するＴ細胞、ならびに関連するＣＡＲのみを有するＴ細胞を、ＣＤ１９陽性のＳｕｐＴ１標的細胞と共培養した。刺激に際して細胞が、より弱い程度に「疲弊」マーカーを発現しているかについて見るために、下記の疲弊マーカーの発現を、フローサイトメトリーによって共培養から０日目、２日目、４日目、および７日目において解析した。
疲弊マーカー－ＰＤ１，Ｔｉｍ３，Ｌａｇ３

細胞を、ＣＡＲ発現（ＲＱＲ８形質導入マーカーを介して）、ならびに対象の部分集団に依存して、様々なＴ細胞およびＴ細胞サブセットのマーカー（ＣＤ３およびＣＤ８）によりゲートした。

実施例３－機能アッセイ
細胞は分化するにつれ、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいて標的細胞を溶解するより強力な能力を獲得し、そしてより多くのＩＦＮ－γを分泌するが、増殖能を失っていく。本研究は、表現型をバイアスすることがこれらの能力を変えるかどうかについて調べる。

ＳｕｐＴ１細胞（ＣＤ１９陰性である）をＣＤ１９陽性であるように操作し、標的の陰性細胞系列および陽性細胞系列とする。形質導入された、および形質導入されなかったＴ細胞、ならびにコントロールコンストラクトを形質導入されたＴ細胞を、ＳｕｐＴ１細胞またはＳｕｐＴ１．ＣＤ１９細胞のどちらかで１：１に暴露する。標的細胞の殺滅を、２４時間および７２時間後にＦＡＣＳにより解析する。殺滅はＩｎｃｕｃｙｔｅアッセイによってもモニターし、このアッセイは、それぞれのＣＡＲ抗原を発現している蛍光標識された接着細胞の単層上で、共培養している形質導入されたＴ細胞を伴う。ＣＡＲを介する細胞傷害は、蛍光を発する標的細胞（ＣＡＲを介する細胞傷害のキネティクスの測定を可能にするために、絶えず経時的にモニターされ得る）の数の減少をもたらす。

サイトカインの放出をモニターするために、暴露から４８時間後に上清を採取し、サイトカインのビーズアレイを用いて以下のサイトカインについてアッセイする：ＩＬ２，ＩＬ４，ＩＬ６，ＩＬ１０，ＴＮＦ－ａ，ＩＦＮ－ｇ，ＧｚｍＢ。

増殖を測定するために、Ｔ細胞を蛍光色素Ｃｅｌｌ Ｔｒａｃｅ Ｖｉｏｌｅｔで２０分間標識する。標識後、１：１（標的細胞：形質導入されたＴ細胞）の比率で共培養をセットアップする。連続した娘細胞生成の間に色素が分配されるため、ＣＡＲを介するＴ細胞の増殖はＣｅｌｌ Ｔｒａｃｅ ｖｉｏｌｅｔの蛍光の減少をもたらす。この希釈が起きる程度、したがって増幅の程度を、共培養から４日目および７日目におけるフローサイトメトリーによって測定し得る。

上記の明細書中に記載される刊行物のすべてが、参照により本明細書に援用される。本発明の記載の方法およびシステムの様々な改変およびバリエーションが、当業者にとって、本発明の範囲及び精神から離れることなく自明である。本発明は特定の好ましい実施形態と関連して記載されたが、請求される本発明は、このような特定の実施形態に過度に限定されてはならない、ということが理解されなければならない。実際、本発明を実施するための、記載の様式の、分子生物学または関連する分野における当業者にとって自明な様々な改変が、下記の請求項の範囲内であることが意図される。
本発明は、例えば、以下の項目を提供する。
(項目１)
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性核酸分子および転写因子をコードする第２の外因性核酸分子を含む、細胞。
(項目２)
前記転写因子が、前記細胞の分化および／または疲弊を防ぐか、あるいは低減させる、項目１に記載の細胞。
(項目３)
前記転写因子が、エフェクターメモリーリプレッサーである、項目１または２に記載の細胞。
(項目４)
前記転写因子が、ＢＬＩＭＰ－１である、項目３に記載の細胞。
(項目５)
前記転写因子が、セントラルメモリーリプレッサーである、項目１または２に記載の細胞。
(項目６)
前記転写因子が、ＢＣＬ６またはＢａｃｈ２である、項目５に記載の細胞。
(項目７)
前記転写因子が、Ｂａｃｈ２であるか、またはＢａｃｈ２を含む、項目６に記載の細胞。
(項目８)
前記転写因子が、ＡＬＫによってリン酸化される能力を、減ぜられているか、または取り除かれている、改変されたバージョンのＢａｃｈ２を含む、項目５に記載の細胞。
(項目９)
前記転写因子が、配列番号２で示されるアミノ酸配列を参照して次の位置：Ｓｅｒ－５３５、Ｓｅｒ－５０９、Ｓｅｒ－５２０のうちの１つまたはそれより多くにおいて変異を有する、改変されたバージョンのＢａｃｈ２を含む、項目８に記載の細胞。
(項目１０)
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列、および前記のいずれかの項目において定義される転写因子をコードする第２の核酸配列を含む、核酸コンストラクト。
(項目１１)
項目１０に記載の核酸コンストラクトであって、以下の構造：
ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ－ＴＦ；または
ＴＦ－ｃｏｅｘｐｒ－ＣＡＲ
を有し、式中：
ＣＡＲが前記ＣＡＲをコードする核酸配列であり；
ｃｏｅｘｐｒが該ＣＡＲおよび前記転写因子の共発現を可能にする核酸配列であり；そして
ＴＦが該転写因子をコードする核酸配列である、核酸コンストラクト。
(項目１２)
ｃｏｅｘｐｒが自己切断ペプチドを含む配列をコードする、項目１１に記載の核酸コンストラクト。
(項目１３)
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列、および項目１から９のいずれかにおいて定義される転写因子をコードする第２の核酸配列を含む、核酸配列のキット。
(項目１４)
項目１０から１２のいずれかに記載の核酸コンストラクトを含む、ベクター。
(項目１５)
キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列を含む第１のベクターと；項目１から９のいずれにおいて定義される転写因子をコードする第２の核酸配列を含む第２のベクターとを含む、ベクターのキット。
(項目１６)
項目１から９のいずれかに記載の細胞を作るための方法であって、項目１０から１２のいずれかに記載の核酸コンストラクトか、項目１３に記載の核酸配列のキットか、項目１４に記載のベクターか、または項目１５に記載のベクターのキットを、細胞内に導入するステップを含む、方法。
(項目１７)
前記細胞が、被験体から単離される試料に由来する、項目１６に記載の方法。
(項目１８)
項目１から９のいずれかに記載の複数種の細胞を含む、医薬組成物。
(項目１９)
疾患の処置および／または予防のための方法であって、項目１８に記載の医薬組成物を被験体へと投与するステップを含む、方法。
(項目２０)
以下のステップ：
（ｉ）被験体から細胞を含む試料を単離することと；
（ｉｉ）項目１０から１２のいずれかに記載の核酸コンストラクトか、項目１３に記載の核酸配列のキットか、項目１４に記載のベクターか、または項目１５に記載のベクターのキットを用いて、該細胞の形質導入またはトランスフェクションをすることと；（ｉｉｉ）（ｉｉ）に由来する該細胞を該被験体に投与することと
を含む、項目１９に記載の方法。
(項目２１)
前記疾患が、がんである、項目１９または２０に記載の方法。
(項目２２)
疾患の処置および／または予防における使用のための、項目１８に記載の医薬組成物。
(項目２３)
疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、項目１から９のいずれかに記載の細胞の使用。

Claims (23)

1. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の外因性核酸分子および転写因子をコードする第２の外因性核酸分子を含み、前記転写因子が、セントラルメモリー転写因子、エフェクターメモリーリプレッサー、またはセントラルメモリーリプレッサーである、細胞。
2. 前記転写因子が、前記細胞の分化および／または疲弊を防ぐか、あるいは低減させる、請求項１に記載の細胞。
3. 前記転写因子が、エフェクターメモリーリプレッサーである、請求項１または２に記載の細胞。
4. 前記転写因子が、ＢＬＩＭＰ－１である、請求項３に記載の細胞。
5. 前記転写因子が、セントラルメモリーリプレッサーである、請求項１または２に記載の細胞。
6. 前記転写因子が、ＢＣＬ６またはＢａｃｈ２である、請求項５に記載の細胞。
7. 前記転写因子が、Ｂａｃｈ２であるか、またはＢａｃｈ２を含む、請求項６に記載の細胞。
8. 前記転写因子が、ＡＬＫによってリン酸化される能力を、減ぜられているか、または取り除かれている、改変されたバージョンのＢａｃｈ２を含む、請求項５に記載の細胞。
9. 前記転写因子が、配列番号２で示されるアミノ酸配列を参照してＳｅｒ－５２０のＡｌａへの置換を有する、改変されたバージョンのＢａｃｈ２を含む、請求項８に記載の細胞。
10. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列、および請求項１から９のいずれかにおいて定義される転写因子をコードする第２の核酸配列を含む、核酸コンストラクト。
11. 請求項１０に記載の核酸コンストラクトであって、以下の構造：
    ＣＡＲ－ｃｏｅｘｐｒ－ＴＦ；または
    ＴＦ－ｃｏｅｘｐｒ－ＣＡＲ
    を有し、式中：
    ＣＡＲが前記ＣＡＲをコードする核酸配列であり；
    ｃｏｅｘｐｒが該ＣＡＲおよび前記転写因子の共発現を可能にする核酸配列であり；そして
    ＴＦが該転写因子をコードする核酸配列である、核酸コンストラクト。
12. ｃｏｅｘｐｒが自己切断ペプチドを含む配列をコードする、請求項１１に記載の核酸コンストラクト。
13. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列、および請求項１から９のいずれかにおいて定義される転写因子をコードする第２の核酸配列を含む、核酸配列のキット。
14. 請求項１０から１２のいずれかに記載の核酸コンストラクトを含む、ベクター。
15. キメラ抗原受容体（ＣＡＲ）をコードする第１の核酸配列を含む第１のベクターと；請求項１から９のいずれにおいて定義される転写因子をコードする第２の核酸配列を含む第２のベクターとを含む、ベクターのキット。
16. 請求項１から９のいずれかに記載の細胞を作るためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、請求項１０から１２のいずれかに記載の核酸コンストラクトか、請求項１３に記載の核酸配列のキットか、請求項１４に記載のベクターか、または請求項１５に記載のベクターのキットを、細胞内に導入するステップを含む、方法。
17. 前記細胞が、被験体から単離される試料に由来する、請求項１６に記載の方法。
18. 請求項１から９のいずれかに記載の複数種の細胞を含む、医薬組成物。
19. 疾患の処置および／または予防のための、請求項１８に記載の医薬組成物。
20. 請求項１９に記載の医薬組成物を調製するためのｅｘ ｖｉｖｏ方法であって、請求項１０から１２のいずれかに記載の核酸コンストラクトか、請求項１３に記載の核酸配列のキットか、請求項１４に記載のベクターか、または請求項１５に記載のベクターのキットを用いて、被験体から単離される細胞含有試料由来の細胞の形質導入またはトランスフェクションをすることを含む、方法。
21. 前記疾患が、がんである、請求項１９に記載の医薬組成物。
22. 疾患の処置および／または予防のための医薬の製造における、請求項１から９のいずれかに記載の細胞の使用。
23. 疾患の処置および／または予防のための、請求項１から９のいずれかに記載の細胞を含む組成物。

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